TWI276443B - Antibodies to OPGL - Google Patents

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TWI276443B
TWI276443B TW091114055A TW91114055A TWI276443B TW I276443 B TWI276443 B TW I276443B TW 091114055 A TW091114055 A TW 091114055A TW 91114055 A TW91114055 A TW 91114055A TW I276443 B TWI276443 B TW I276443B
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rti
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William J Boyle
Francis H Martin
Jose R Corvalan
C Geoffrey Davis
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Abgenix Inc
Amgen Inc
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1276443 A7 _______B7_ 五、發明説明（彳） 本申請案申稱美國暫時申請案序號60/301，172(申請日期 2001年6月26日）之優先權，該案全文在此倂入參考文獻。 發明領域 本發明係關於結合護骨素配位體（OPGL)之抗體。本發 明亦關於治療骨質疾病，例如：骨質疏鬆症、源自關節炎 之骨骼流失、變形性骨炎、及骨質減少之組成物及方法。 發明背景 骨組織係支持身體，其中包括礦物質（包括鈣及磷）、膠 原蛋白的基質以及非膠原蛋白的蛋白質及細胞。骨質形成（ 被稱爲儲存）與骨分解（被稱爲重吸收）會在活的骨組織中呈 現動態平衡。在骨中發現有三種細胞（骨細胞、成骨細胞及 破骨細胞）涉及此種平衡。成骨細胞會促進骨組織形成.，而 破骨細胞則與重吸收相關。相較於骨質形成，重吸收或者 骨基質及礦物質溶解是一種快速且高效率的過程，並可從 骨中釋放大量之礦物質。破骨細胞涉及正常骨骼組織重整 之調節及荷爾蒙誘發的重吸收。例如，回應細胞外液中鈣 離子濃度降低後之副甲狀腺素分泌可刺激重吸收。相反的 ，血鈣素之功能可抑制重吸收。此外，維生素D代謝物可 改變骨骼對副甲狀腺素以及降血鈣素之反應。 護骨素配位體（OPGL)，其爲細胞激動素TNF家族之一 員，經由結合至受體活化蛋白質NF-kB(RANK，亦稱爲破骨 細胞分化及活化受體，或ODAR)，可促進破骨細胞形成。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧財產局P'工消費合作社印製 -4- 1276443 A7 B7 五、發明説明（2) 另一方面護骨素（OPG)，經由隔離OPGL及預防OPGL與 ODAR結合，可抑制破骨細胞形成。因此，OPGL與ODAR 之結合量與骨質儲存及重吸收之間的平衡有關。 骨骼成熟之後，骨骼中骨之含量代表骨質形成及骨質 重吸收間之平衡（或失衡）。骨質高峰發生於骨骼成熟之後四 十歲之前。四十至五十歲之間，平衡位移至骨質重吸收。 隨著年齡的增長.(女性比男性早）骨質開始降低，一些女性在 停經之後骨質顯著地加速流失（主要是白種人及亞裔）。 一般而言，骨質減少係關於任何骨質降低至正常含量 以下的症狀。該症狀可緣起於骨合成速率降低或骨破壞速 率增加或以上二因素。一般骨質減少的形式是原發性骨質 疏鬆症，亦稱爲後更年期及老年骨質疏鬆症。此骨質疏鬆 症之形式，一般是因爲年齢增長之骨流失所造成的結果， 且經常是在增加骨質重吸收及正常骨質形成速率下所造成 的結果。在美國許多白人女性會發展出症候性的骨質疏鬆 症。在45歲及更年長的婦女中，骨質疏鬆症與髖部、股骨 、頸以及關節骨折的發病率有直接關聯。50至70歲之間的 老年男性可發展出症候性的骨質疏鬆症。在某些實例中， 骨質疏鬆症可起因於OPGL之含量或活性增加。因此，可使 用調控OPGL活性之分子調控破骨細胞之生成。 目前已確認許多因子可促成後更年期及老年骨質疏鬆 症。彼包括隨著老化改變激素之含量及歸因於腸對鈣及其 它礦物質的吸收減低所造成之鈣攝取量不足。某些治療方 式，包括激素治療或飮食補充均可延緩此過程。最近，已 才、紙張尺度適用—中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -5 - 1276443 A7 ____ B7 五、發明説明（3) 合倂使用抗重吸收劑，例如雙膦酸鹽與選擇的動情激素受 體修改劑（SERMs)，預防及治療骨質降低。因此，可結合此 類之治療方法以及調控OPGL活性之分子，治療某些骨質病 症。 本發明槪要 在某些具體實施例中，本發明提供一種包含重鏈及輕 鏈之抗體，其中重鏈包含序列確認號碼：2之胺基酸序列或 其斷片，且輕鏈包含序列確認號碼：4之胺基酸序列或其斷 片。 在某些具體實施例中，本發明提供一種包含重鏈及輕 鏈之抗體，其中重鏈包含內含序列確認號碼：13之胺基酸 序列或其斷片之變異區，且其中輕鏈包含內含序列確認號 碼· 14之胺基酸序列或其斷片之變異區。 在某些具體實施例中，本發明提供一種包含重鏈及輕 鏈之抗體，其中重鏈包含序列確認號碼：2之胺基酸序列或 其斷片。 在某些具體實施例中，本發明提供一種包含重鏈及輕 鏈之抗體，其中重鏈包含內含序列確認號碼：1 3之胺基酸 序列或其斷片之變異區。 在某些具體實施例中，本發明提供一種包含重鏈及輕 鏈之抗體，其中輕鏈包含序列確認號碼：4之胺基酸序列或 其斷片。 在某些具體實施例中，本發明提供一種包含重鏈及輕 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ,ιτ 經濟部智惡財產局8工消費合作社印製 -6 - 1276443 A7 B7 五、發明説明（ 鏈之抗體，其中輕鏈包含內含序列確認號碼：14之胺基酸 序列或其斷片之變異區。 請 先 閲 讀 背 之 注 意 事 項 再 在某些具體實施例中，本發明提供一種包含重鏈及輕 鏈之抗體，（a)其中重鏈包含第一變異區，其中第一變異區 包含一段與序列確認號碼：13之胺基酸序列至少有90%相同 之序列，及（b)其中輕鏈包含第二變異區，其中第二變異區 包含一段與序列確認號碼：14之胺基酸序列至少有90%相同 之序列，及⑷其中抗體可與護骨素配位體（OPGL)交互作用 〇 在某些具體實施例中，第一變異區包含一段與序列確 認號碼：13之胺基酸序列至少有95%相同之序列，以及第二 變異區包含一段與序列確認號碼：14之胺基酸序列至少有 95%相同之序歹!1。 在某些具體實施例中，第一變異區包含包含一段與序 列確認號碼：1 3之胺基酸序列至少有99%相同之序列，以及 第二變異區包含一段與序列確認號碼：14之胺基酸序列至 少有99%相同之序列。 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 在某些具體實施例中，本發明提供包含序列確認號碼 :2之胺基酸序列或其斷片之重鏈。在某些具體實施例中， 本發明提供包含變異區及恆定區之重鏈，其中變異區包含 序列確認號碼：13之胺基酸序列或其斷片。 在某些具體實施例中，本發明提供包含序列確認號碼 :4之胺基酸序列或其斷片之輕鏈。在某些具體實施例中， 本發明提供包含序列確認號碼：14之胺基酸序列或其斷片 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） -7- 1276443 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 A7 __B7_____五、發明説明（6) 調節劑、一氧化氮合成酶（NOS)調節劑、糖皮質激素受體調 節劑、麩胺酸鹽受體調節劑、脂多糖（LPS)含量之調節劑、 去甲腎上腺素、去甲腎上腺素模仿劑、及去甲腎上腺素調 節劑。 在本發明某些具體實施例中，提供治療骨質病症的方 法，包含投用醫藥學上有效量之抗體。在某些具體實施例 中，提供包含投用藥學組成物治療骨質病症的方法。 在某些具體實施例中，提供包含投用藥學組成物治療 具有骨骼流失性發炎症狀之病患的方法。 在某些具體實施例中，提供包含投用藥學組成物治療 具有骨骼流失性自體免疫症之病患的方法。 在某些具體實施例中，提供包含投用藥學組成物治療 具有類風濕性關節炎之病患的方法 .在本發明某些具體實施例中，提供包含接觸樣品與抗 體，在生物樣品中偵測OPGL含量之方法。 圖形簡短的描述 圖1爲編碼a〇PGL-l抗體重鏈之互補型DNA序列（序列 確認號碼：1)。 圖2爲a〇PGL-l.抗體重鏈之胺基酸序列（序列確認號碼： 2) 〇 圖3爲編碼a〇PGL-l抗體輕鏈之互補型DNA序列（序列 確認號碼：3)。 圖4爲a〇PGL-l抗體輕鏈之胺基酸序列（序列確認號碼： 本紙張尺度適用中國i家標準（CNS ) A4規格（2Κ)Χ297&ϋ ' ' -9 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（7) 4) 〇 圖5爲a〇PGL-l Kappa輕鏈表現質體a〇PGL-l-Kappa /pDSRal9的圖式。 圖6爲 a〇PGL-l IgG2重鏈表現質體a〇PGL小IgG2 /pDSRal9的圖式。 圖7顯示a〇PGL-l劑量依存的結合至塗覆〇PGL的EIA 平板。 圖8顯示a〇PGL-l專一結合於與膜結合的OPGL。 圖9顯示可溶解的〇PGL抑制a〇PGL-l結合於塗覆OPGL 的EIA平板。 圖10顯示a〇PGL-l專一的結合於塗覆OPGL的EIA板。 圖11顯示a〇PGL-l劑量依存的抑制破骨細胞形成。 圖12顯示a〇PGL-l劑量依存的抑制OPGL結合於〇DA 〇 圖13爲對獼猴投用單一劑量a〇PGL-l之後，平均血淸 濃度對時間之分佈圖。 圖14爲對獼猴投用單一劑量a〇PGL-l之後，血淸中 N-Tx濃度改變之平均百分比。 圖15爲對獼猴投用單一劑量a〇PGL-l之後，尿液中 N-Tx濃度改變之平均百分比。 圖16爲對獼猴投用單一劑量a〇PGL-l之後，抗體陽性 及陰性的血淸濃度對時間之分佈圖。 圖17爲a〇PGL-l抗體重鏈變異區之胺基酸序列（序列確 認號碼：13)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、tT -10 - 1276443 Α7 Β7 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 五、發明説明（8) 圖18爲a〇PGL-l抗體輕鏈變異區之胺基酸序列（序列確 認號碼：14)。 圖19爲產生a〇PGL-l之細胞培養方法。 圖20爲對獼猴投用單一劑量a〇PGL-l之後，血淸鈣之 變化百分比。 圖21爲對獼猴投用單一劑量a〇PGL-l之後，血淸中鹼 .性磷酯酶之平均變化百分比。 某些較佳的具體實施例之詳細描述 本節之標題僅用於作爲整理目的，而非限制描述之主 題。所有本申請案引用之參考文獻，全文在此并入參考文 獻。 定義 可使用標準技藝進行重組DNA、寡核苷酸合成、以及 組織培養及轉形作用（例如：電穿透作用、轉脂作用）。酶催 化反應及純化技藝可依據製造業者之說明或一般技藝或本 文描述之方法進行。前述技藝以及方法一般可依據技藝上 習見的方法及描述於本說明中引用及討論之各種一般及特 疋的參考文獻進行。參閱，例如：Samb rook et al. Molecular Cloning： A Laboratory Manual(2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor，Ν·Υ·( 1989))，全文在 此倂入參考文獻。除非另行定義，本文中與實驗室程序以 及技藝、分析化學、有機化學合成、以及藥用的以及醫藥 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） -11 - 1276443 A7 _____ B7_ 五、發明説明（9) 學的化學相關之術語均爲熟知及通常用於技藝中之名稱。 可使用標準技藝進行化學合成、化學分析、醫藥學製備、 調製及傳遞、及治療病患。 本揭示中，下列術語除非特別說明，其意義爲： 本文之術語π分離的多核苷酸''是指一種基因的多核苷酸 、互補型DNA、或源自合成的多核苷酸或其組合，根據其 起源"分離的多核苷酸"（1)與所有或部份多核苷酸（其中有自 然存在的"分離的多核苷酸M)並不相關，（2)係聯結至多核苷 酸（並非自然聯結的），或（3)在自然狀況下並不會存在於較 大序列之部份。 本文之術語"分離蛋白質π係指由互補型DN A、重組型 RNA、或源自合成或其組合所編碼之蛋白質，其係（1)至少 不含一些通常將被發現之蛋白質，（2)本質上不含相同來源（ 例如同種）之其它種蛋白質，（3)由不同種的細胞表現，或（4) 在天然狀況下不會發生。 本文之術語π多肽π意指天然的蛋白質，或經刪除、加 入、及/或取代天然序列中一個或多個胺基酸的序列。本文 之術語"多肽π亦包含a〇PGL-l(如下述之序列確認號碼：2及 序列確認號碼：4)，或經刪除、加入、及/或取代一個或多 個a〇PGL-l之胺基酸的序列。在某些具體實施例中，本發 明包含由圖2(序列確認號碼：2)代表之人類重鏈免疫球蛋白 分子以及由圖4(序列確認號碼：4)代表之人類輕鏈免疫球蛋 白分子，或斷片或其類似物。 本文之術語"天然發生"意指在天然中可發現之物。例如 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 f 經濟部智慧財產局g(工消費合作杜印製 -12- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（^ ，存在於生物體（包括病毒）其可分離自天然來源且未經實驗 室之人爲修飾之多肽或聚核苷酸序列或其它天然發生之多 肽或聚核苷酸序列。 本文之術語M操作性聯結”意指容許成份之間具有其預期 功能的關係。例如，將控制序列”操作性聯結”至編碼序列， 是指在該方式下連結後可在控制序列要求的相容條件下表 現編碼之序列。 本文之術語"控制序列”意指可有效表現及操作彼連結的 編碼序列之聚核苷酸序列。視宿主生物體而定該控制序列 可不同。依據某些具體實施例，原核生物之控制序列可包 括啓動子、核糖體的結合部位、及轉錄終止序列。依據某 些具體實施例，真核生物之控制序列可包括啓動子以及轉 錄終止序列。在某些具體實施例中，”控制序列"可包括前導 序列及/或融合伙伴序列。 本文之術語"多核苷酸”係指具有至少1 0個鹼基長度之聚 合核苷酸形式。在某些具體實施例中，鹼基可爲核糖核苷 酸或去氧核糖核苷酸或經修飾之任一類型的核苷酸形式。 本文之術語包括單一及雙股形式的DNA。 本文之術語"寡核苷酸"包括天然之核苷酸，及聯結天然 核苷酸之經修飾之核苷酸，及/或聯結非天然寡核苷酸之核 苷酸。寡核苷酸爲多核苷酸之次群，一般而言長度爲200個 驗基或200個驗基以下。在某些具體實施例中，寡核音酸的 長度爲10至60個鹼基。在某些具體實施例中，寡核苷酸的 長度爲 12、13、14、15、16、17、18、19、或 20 至 40 個鹼基 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-13- 1276443 A7 B7 五、發明説明（彳；| 。寡核苷酸可爲單股的或雙股的，例如應用於構築基因突 變。本發明之寡核苷酸可爲正股或反股之寡核苷酸。 本文之術語"天然核苷酸"包括去氧核糖核苷酸及核糖核 苷酸。本文之術語"經修飾之核苷酸”包括經修飾之或糖基經 取代的核苷酸等。本文之術語”寡核苷酸聯結”包括的寡核苷 酸聯結，例如：偶磷基硫代酸酯、偶磷基二硫代酸酯、偶 磷基硒酸酯、偶磷基二硒酸酯、偶磷基安尼硫代酸酯 (phosphor oanilothioate)、偶磷基安尼代酸酯（ phoshoraniladate)、偶磷基醢胺等。參閱例如：LaPlanche-et al.Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986) ;Stec et al.J· Am.Chem. Soc. 1 06:6077( 1984);Stein et al.Nucl. Acids Res. 1 6:3 209( 1 9 8 8); Zon et al.Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991);Zon et al.Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stec et al. U.S. Pat. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543(1990)，其揭示全文在 此并入參考文獻。寡核苷酸可包括標記以利於偵測。 多胜肽相關的特性以及相似性可用已知的方法計算。 該方法包括（但非限於）描述於 Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed·， Oxford University Press, New York( 1 988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects， Smith, D.W., ed., Academic Press, New York( 1 993); Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence ^^張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐1 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 -14- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7__五、發明説明（^ Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press( 1 987); Sequence Analysis Primer, Gribskov， M. and Devereux，J·，eds·，M. Stockton Press, New York(1991);以及 Carillo et al·，SIAM J. Applied Math·，48:1073( 1 988)。 測定相似性的較佳方法之設計原理係使測試序列之間 產生最大符合。測定相似性之方法描述於公開之計算機程 式。測定二種序列之間相似性的較佳電腦程式包括（但非限 於）：套裝的 GCG 程式，包括 GAP(Devereux et al·，Nucl. Acid. Res., 1 2:387( 1 984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI, BLASTP, BLASTN ， 及 FASTA(Altschul et al·，J. Mol. 8iol·，215:403-410(1990)) 。BLASTX程式爲公開的程式，可自 National Center for Biotechnology Information(NCBI)及其它來源取得（BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al·，supra(1990))。習知的 Smith Waterman 算則 亦可用以測定相似性。 校整二種胺基酸序列之某些校整圖解僅可在二種序列 之短區域產生符合之配對，即使二種全長序列之間並無顯 著關係，但此小校整區域仍具有非常高的序列相似性。因 此在某些具體實施例中，可選擇對目標多肽產生跨越至少 50個鄰近的胺基酸之校整方法（GAP程式）進行校整。 例如，使用電腦算貝[J GAP(Genetics Computer Group, University of Wisconsin，Madison，WI)時，二種多胜肽之序 列相似性百分比係由其各胺基酸最理想校整之配對加以決 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） -15- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（d 定（"配對跨度”由算則決定）。在某些具體實施例中’隙開口 處罰（以平均對角線的3倍計算；”平均對角線”是用於比對基 質之對角線的平均；π對角線"是符合特定比對基質的各理想 胺基酸所給的分數或數目）以及間隙延伸處罰（通常是間隙開 口處罰之1/10倍），與比對基質例如ΡΑΜ 250或BLOSUM 62 可在算則中合倂使用。在某些具體實施例中，算則中亦可 使用標準比對基質（ΡΑΜ 250比對基質可參閱Dayhoff et al·， Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3)( 1978)； BLOSUM 62 比對基質可參閱 Henikoff et al·，Proc. Natl· Acad. Sci USA，89 ·· 1091 5- 10919(1992))。 在某些具體實施例中，多肽序列比對之參數包括： 算貝[j : Needleman et al·，J. Mol· Biol·，48:443-453(1970) 9 比對基質：BLOSUM 62，來自 Henikoff et al·， supra(1992)； 問隙處罰：12 問隙長度處罰：4 相似性閾：0 GAP程式可適用上述參數。在某些具體實施例中，上 述參數爲使用GAP算則進行多肽比對之預設參數（端點間隙 無處罰）。 本文中二十種習見的胺基酸及其縮寫如習見的方式。 參閱 Inimunology-A Synthesis(2nd Edition，E.S.Golub and D.R.G re η，Eds·，Si nauei· Associates, Sun dei* land，Mass.(1991))， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -16- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（^ 全文在此倂入參考文獻。二十種習見胺基酸的立體異構物（ 例如，D-胺基酸）、非天然的胺基酸，例如：α -，α -二取代 胺基酸、Ν-烷基胺基酸、乳酸、以及其它非習見的胺基酸 亦可爲本發明多胜肽適當的成份。非習見胺基酸的實施例 包括：4-羥脯胺酸、γ-羧基麩胺酸鹽、ε-Ν，Ν，Ν-三甲基離胺 酸、ε-Ν-乙醯基離胺酸、鄰-磷絲胺酸、Ν-乙醯基絲胺酸、 Ν-甲醯基甲硫胺酸、3-甲基組織胺酸、5-羥基離胺酸、 σ-Ν-甲基精胺酸、及其它相似的胺基酸以及亞胺酸（例如， 4-羥脯胺酸）。依據標準用法及慣例，多肽記號法中，左手 方向是胺基端的方向，右手方向是羧基端方向。 同樣地，若無特定說明，單股聚核苷酸序列的左手端 是5’端；雙股的聚核苷酸序列的左手方向稱爲5’方向。新生 的RNA轉錄本從5’至3’方向加入稱爲轉錄方向；在DNA股 上位於RNA轉錄本5’端之5’端並與RNA具有相同序列之序 列區域稱爲”上游序列"；在DNA股上位於RNA轉錄本：Τ端 之3’端並與RNA具有相同序列之序列區域稱爲”下游序列” 〇 保留性胺基酸取代可包含非天然胺基酸殘基，其可經 化學的肽合成無須經生物系統的合成而倂入。此類取代包 括擬肽的以及其它逆轉或倒置形式的胺基酸部份。 基於一般的側鏈性質，天然殘基可分成： 1) 厭水性殘基：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ; 2) 中性的親水性殘基：Cys、Ser、Thr、Asn、Gin ; 3) 酸性殘基：Asp、Glu ; 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-17- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 ___B7_ 五、發明説明（^ 4) 鹼性殘基：His、Lys、Arg ; 5) 影響鏈定向之殘基：Gly、Pro ;以及 6) 芳香族殘基：Trp、Tyr、Phe。 例如，非保留性取代可包含將一類的殘基與另一類的 殘基交換。該經取代的殘基可引入與非人類抗體同源的人 類抗體區域，或引入分子之非同源的區域。 依據某些具體實施例製作該改變，可考慮基於各胺基 酸之拒水性及電價特性所指定之水徑指數（hydropathic index)。其爲：異白胺酸（ + 4.5);纈胺酸（ + 4.2);白胺酸 ( + 3.8);苯丙胺酸（ + 2.8);半胱胺酸/胱胺酸（ + 2.5);甲硫胺 酸（+1.9);丙胺酸（+1.8);甘胺酸（-0.4);蘇胺酸（-0.7);絲胺 酸（-0.8);色胺酸（-0.9);酪胺酸（-1.3);脯胺酸（-1.6);組織 胺酸（-3.2);麩胺酸鹽（-3.5);麩胺醯胺酸（-3.5);天門冬胺 酸酯（-3.5);天門冬醯胺酸（-3.5);離胺酸（-3.9);以及精胺 酸（-4.5) 〇 在此技藝中據暸解胺基酸水徑指數（hydropathic index) 的重要性與蛋白質交互作用性生物的功能相關。參見Kyte et al.，J. Mol. 8iol·，1 57: 1 05- 1 3 1 ( 1 982)。目前已知某些胺 基酸可經其它具有相似水徑指數（h y d r q p a t h i c i n d e x)或分數 的胺基酸取代仍且保有相似的生物活性。在某些具體實施 例中基於水徑指數（hydropathic index)所進行的改變，其取 代胺基酸之水徑指數（hydropathic index)在:^2之內。在某些 具體實施例中，在上1之內，以及在某些具體實施例中，在 ±_0.5之內。 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-18- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（以 據瞭解，在此技藝中類似胺基酸之取代可有效地以親 水性爲基礎，尤其是生物功能的蛋白質或肽，從而創造出 如本案中預期應用於免疫的具體實施例。在某些具體實施 例中，蛋白質最大的局部平均親水性，係由其相鄰胺基酸 的親水性決定，與基免疫產生性及抗原性相關，即與蛋白 質的生物性質相關。 此類胺基酸殘基之親水性値爲：精胺酸（ + 3.0);離胺酸 ( + 3.0);天門冬胺酸酯（+ 3.0±_1);麩胺酸鹽（ + 3.0+1);絲胺酸 ( + 0.3);天門冬醯胺酸（ + 0.2);麩胺醯胺酸（ + 0.2);甘胺酸（0) ;蘇胺酸（-0.4);脯胺酸（-〇.5上1);丙胺酸（-0.5);組織胺酸 (-0.5);半胱胺酸（1.0);甲硫胺酸（-1.3);纈胺酸（-1.5);白 胺酸（-1.8);異白胺酸（-1.8);酪胺酸（2.3);苯丙胺酸（-2.5) 以及色胺酸（-3 ·4)。在某些具體實施例中，基於相似的親水 性値所進行的改變，取代之胺基酸其親水性値在±2之內， 在某些具體實施例中，在之內，以及在某些具體實施例 中’在t〇. 5之內。亦可從一級胺基酸序列上以親水性確認抗 原決定部位。此類區域亦稱爲"抗原決定的核心區域"。 典型的胺基酸取代如表1. (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規袼（210X297公釐） -19- 1276443 7 Β 五、發明説明（〇表1 :胺基酸取代 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 原始的 殘基 典型取代 較佳 取代 Ala Val、Leu、lie Val Arg Lys ' Gin Λ Asn Lys Asn Gin Gin Asp Glu Glu Cys Ser、Ala Ser Gin Asn Asn Glu Asp Asp Gly Pro 、 Ala Ala His Asn、Gin、Lys、Arg Arg lie Leu、Va卜 Met、Ala、Phe、正白胺酸 Leu Leu 正白胺酸、lie、Val、Met、Ala、Phe lie Ly s A r g、1，4 -二胺基 丁酸、G1 n、A s n Arg Met Leu、Phe、lie Leu Phe Leu、Val、lie、Ala、Tyr Leu Pro Ala Gly Ser Thi.、Ala、Cys Thr Thr Ser Ser Trp Tyr、Phe Ty r Ty r Trp 、 Phe 、 Thr 、 Ser Phe Val lie、Met、Leu、Phe、Ala、正白胺酸 Leu (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -20- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（d 熟悉技藝的專業人士將能從該表中使用已知的技藝決 定多肽的適當變型。在某些具體實施例中，熟悉此技藝的 專業人士可確認分子適當的區域對不參與活性之目標區域 進行改變，而不破壞活性。在某些具體實施例中，可經多 胜肽之相似性確認分子守恆之殘基及部份。在某些具體實 施例中，即使在生物活性或結構上重要區域用保留性胺基 酸取代，仍不會破壞生物的活性或不會對多肽結構有不利 地影響。 此外，熟悉此技藝的專業人士可參閱結構功能硏究以 確認多胜肽中相關於活性或結構之重要的相似的殘基。基 於該比對，可預測蛋白質中相應於相似的蛋白質中相關於 活性或結構之重要的胺基酸殘基。熟悉此技藝的專業人士 可選擇化學上相似的胺基酸對預測的重要胺基酸殘基進行 取代。 熟悉此技藝的專業人士亦可分析相似多胜肽結構的三 維結構及胺基酸序列。基於該資料，熟悉此技藝的專業人 士可依據其胺基酸殘基之校整預測抗體之三維結構。在某 些具體實施例中，熟悉此技藝的專業人士可以不激烈的改 變經預測爲蛋白質表面之胺基酸殘基，因爲該殘基可能涉 及與其它分子之重要的交互作用。此外，熟悉此技藝的專 業人士可產生測試性變種，其中在各要求的胺基酸殘基上 內含單一的胺基酸取代。然後變種可使用熟悉此技藝的專 業人士習知的活性測定方法進行篩選。從該變種中可取得 適當的變種資料。例如，若發現改變特定的胺基酸殘基結 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） 21 - 1276443 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 ____ B7_五、發明説明（4 果會降低或造成不適當的活性，則應避免該改變之變種。 @言之’基於該例行的實驗程序取得之資料，熟悉此技藝 的專業人士可立即決定單獨或結合其它突變之進一步取代 應避免的胺基酸。 §午多科學文獻已可預報二級結構。參閱Moult J.，Curr. 〇P. in Biotech., 7(4):422-427(1996), Chou et al·， Biochemistry, 1 3 (2): 222-245 ( 1 974); Chou et al·， Biochemistry, 1 1 3(2): 21 1 -222( 1 974); Chou et al·， Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47:45- 148( 1978); Chou et al.，Ann. Rev. Biochem·，47:25 1 -276 以及 Chou et al., Biophys. J.，26:367-384( 1 979)。此外，目前之計算機程式可 輔助預測二級結構。預測二級結構之方法是基於同源現象 模型化。例如，二種多胜肽或蛋白質其帶有之序列相似性 大於30%，或相似性大於40%經常會有相似的拓撲學構造。 最近不斷擴大的蛋白質構造資料庫（PDB)可增強二級結構之 預測能力，包括多肽或蛋白質的結構內可能產生的折疊數 目。參閱 Holm et al·，Nucl. Acid· Res·，27(1):244-247(1999) 。據建議（Brenner et al·, Curr. Op. Struct· Biol，7(3): 369-376( 1997))多肽或蛋白質中只有限數目之折疊，一旦解 析關鍵性的構造數目，構造的預報將會更精確。 預測二級結構的額外方法，包括"threading"(Jones，D·， Curr. Opin. Struct. Biol, 7(3) *.377-87(1997); Sippl et al., Structure, 4( 1):1 5- 19(1996)) ' "profile analysis "(Bowie et al., Science, 253:164-170(1991); Gribskov et al., Meth. Enzym., (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -22- 1276443 A7 _^____B7 ____ 五、發明説明（d 1 83:146- 1 59( 1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13)··4355-4358( 1987))、及"evolutionary linkage”（參見 Holm， supra(1999)， and Brenner， supra(1997)) o 在某些具體實施例中，抗體變種包括糖基化作用變種 ，相較於母體多肽的胺基酸序列，其糖基化作用位點之數 目及/或類型已改變。在某些具體實施例中，蛋白質變種比 天然蛋白質包含較多或較少數目之N-聯結的糖基化作用位 點。N-聯結的糖基化作用位點之特徵在於：Asn-X-Ser或 Asn-X-Thr序列，其中胺基酸殘基X可爲脯胺酸之外的任 何胺基酸殘基。創造此序列之胺基酸殘基取代可提供加入 N-聯結的碳水化合物鏈可能的新位點。此外，排除此序列 之取代，將移除原本存在的N -聯結的碳水化合物鏈。移 除一個或多個N-聯結的糖基化作用位點（天然的位點）並創 造一個或多個新的N-聯結位點，亦可重排排列N-聯結的碳 水化合物鏈。較佳的抗體變種包括半胱胺酸變種，當相較 於母體的胺基酸序列，其中刪除一個或多個半胱胺酸殘基 或經另一胺基酸（例如絲胺酸）取代。半胱胺酸變種必須在重 新折疊成生物活性的構像後（例如分離自不溶的包涵體之後） 才可爲適用的抗體。半胱胺酸變種，一般而言其半胱胺酸 殘基比天然的蛋白質少，一般有偶數之數目以使起因於不 成對半胱胺酸的交互作用減到最少。 依據某些具體實施例，胺基酸之取代可：（1)降低蛋白 質水解之敏感性、（2)降低氧化反應之敏感性、（3)改變形成 蛋白質複合物之結合親和力、（4)改變結合親和力、及/或（4) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -23- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（ 賦予或修飾該多胜肽其它物理化學的或功能上的性質。依 據某些具體實施例，天然序列（在某些具體實施例中，爲形 成分子間接觸結構區以外之多肽部份）可進行單一的或多重 胺基酸取代（在某些具體實施例中，爲保留性胺基酸取代）。 在某些具體實施例中，保留性胺基酸取代一般不會在實質 上改變母體序列的構造特性（例如，代替的胺基酸不會打斷 母體序列的螺旋，或破壞其它母體序列特有的二級結構類 型。多肽二級及三級結構之確認技藝的實施例描述於 Proteins, Structures and Molecular Principles(Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York(1984)); Introduction to Protein Structure(C. Branden and J. Tooze，eds., Garland Publishing，New York，Ν·Υ·(1991));及 Thornton et at. Nature 3 54:105( 199 1)，全文在此倂入參考文獻。 本文之術語”多肽斷片"意指缺少胺基端及/或羧基端的 多肽。在某些具體實施例中，斷片至少有5至467個胺基酸 長。在某些具體實施例中，斷片至少有5、6、8、10、14、 20、50、70、100、150、200、250、300、3 50、400、或 450 個胺基酸長。 通常用於藥物工業之肽類似物爲具有模版肽類似性質 之非肽藥物。此類型之非肽化合物稱爲〃模仿肽"或"擬肽" 〇 Fauchere， J. Adv. Drug Res. 15:29(1 986); Veber and Freidinger TINS p.392(1985);及 Evans et al. J. Med. Chem. 30:1229( 1 987)，全文在此倂入參考文獻。該化合物經常借 助於電腦化分子模式化進行發展。結構上相似的於治療上 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐1 ~~ -24 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 _B7 五、發明説明（2 適用肽類的模仿肽可用以產生相似的治療或預防性的效應 。一般而言，擬肽與範例多肽（即，具有生化性質或醫藥活 性之多肽），例如人類抗體，在結構上具有相似的，但有一 個或多個肽鍵合可視需要的用技藝上已知的方法經一種聯 結取代，取代的聯結係選自·· --CH2 NH--、…CH2 S-- 、 --CH2 -CHa -- 、 --CH = CH-(順及反式） 、一C〇CH2…、--CH(〇H)CH2…、以及--CHaSO·。在某些具 體實施例中可使用一個或多個保留性序列之胺基酸，系統 性的經相同類型之D-胺基酸取代（例如，D-離胺酸代替L-離胺酸）以產生更穩定的肽類。此外，可用技藝上已知的方 法產生包含保留性序列或實質上與保留性序列變異相同之 限制性肽類（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:3 87( 1 992)，全文在此倂入參考文獻）；例如，加入內部的 半胱胺酸殘基形成分子內雙硫橋以使肽環代。 ”抗體”或”抗體肽”意指完整的抗體，或可與完整的抗 體進行專一性結合競爭之結合斷片。在某些具體實施例中 ，結合斷片可經重組D N A技藝製作。在某些具體實施例中 ’結合斷片可經酵素的或化學的方法切除完整的抗體而加 以製作。結合斷片包括（但非限於）：F a b、F a b ’、F (a b ’）2、 Fv、以及單鏈抗體。 本文之術語"重鏈”包括任何具有充分的變異區序列以賦 予〇PGL專一性之多肽。本文之術語"輕鏈"包括任何具有 充分的變異區序列以賦予OPGL專一性之多肽。全長之重鏈 包括：變異結構區、VH、以及三個恆定區結構區、CHi、 本纸張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210X 297公釐) " -25- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1276443 Α7 A / B7 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（d Ch2、以及Ch3。VH結構區位於多肽之胺基端，以及Ch3 結構區位於羧基端。本文之術語"重鏈"包含全長之重鏈以及 其斷片。全長之輕鏈包括變異結構區、Vp及一個恆定區 結構區（^。與重鏈相同，輕鏈之變異結構區始於多肽之胺 基端。本文之術語π輕鏈"包含全長之輕鏈以及其斷片。Fab 斷片包含一個輕鏈以及一個重鏈之ChI及變異區。Fab分子 之重鏈不能與另一重鏈分子形成二硫化物鍵結。Fab’斷片 含有一個輕鏈及一個重鏈，該重鏈在ChI以及Ch2結構區 之間含有更多的恆定區，因此在二個重鏈之間可經鏈間的 二硫化物鍵結以形成F(ab’）2分子。Fv區域包含重鏈以及 輕鏈之變異區，但缺少恆定區。單鏈抗體爲Fv分子，其 中重鏈及輕鏈變異區係經彈性的連結子連接形成單一的多 胜鍵，其可形成抗原結合區域。單鏈抗體詳細地討論於 W〇88/01649及美國專利第4,946,778以及5,260,203號。 除了 ”多重專一性"或π多功能的”抗體之外，在某些具體 實施例中，雙價抗體一般具有相同的結合部位。 實質上可抑制配位體與受體黏連之抗體，在當抗體過 量時可降低受體結合的反受體的量至少約 20%、40%、60% 、80%、85%、或更多（經活體外競爭性的結合測定加以測量 )0 本文之術語"抗原決定部位"包括任何能專一性的結合免 疫球蛋白或Τ-細胞受體之多肽決定子。在某些具體實施例 中，抗原決定部位決定子包括化學活性的表面基團分子， 例如：胺基酸、糖側鏈、磷醯基、或磺醯基，以及在某些 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -26- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 __________B7___五、發明説明（2) 具體實施例中’可帶有特定的三度空間構造的特性，及/或 比電荷特性。抗原決定部位是抗原與抗體結合的區域。在 某些具體實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子複合混合 物中確認其目標抗原後，即可說抗體專一性地與抗原結合 。在某些具體實施例中，當離解常數i 1微莫耳濃度時，即 可說抗體專一性地與抗原結合，在某些具體實施例中，當 離解常數i 1〇〇毫微莫耳濃度，以及在某些具體實施例中， 當離解常數i 1毫微莫耳濃度時，即可說抗體專一性地與抗 原結合。 本文之術語π藥劑π是一種化學化合物，化學化合物之 混合物、生物性的大分子、或產自生物材料的萃取物。 本文之術語"標記Μ或"標記的”意指倂入可偵測的標識 ，例如倂入放射性標記之胺基酸或可用標記的卵白素（例如 ，內含螢光標識之抗生蛋白鏈菌素或可用光學或比色法的 方法偵測之酵素活性）偵測之附著至多肽的生物素部份。在 某些具體實施例中，標記或標識物亦可用於治療。多胜肽 及醣蛋白之各種標記方法爲已知的技藝。標記多胜肽之實 施例包括（但非限於）：放射性同位素或放射性核素（例如， 3Η、14C、15Ν、35S、90Υ、99Tc、111 In、1251、1 311)、螢 光標記（例如，FITC、若丹明、鑭系元素磷光劑）、酵素的標 記（例如，辣根過氧化酶、/3 -半乳糖苷酶、虫螢光素酶、鹼 性磷酯酶）、化學冷光、生物素基團、經二級報導者（例如， 白胺酸拉鍊對序列、二級抗體之結合部位、金屬結合結構 區、抗原決定部位標記）確認之預定的多肽抗原決定部位。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -27- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（ 在某些具體實施例中，標記上附著各種長度的間隔臂以降 低可能產生的位阻。 本文之術語”生物樣品”包括（但並非限於）任何來自生物 (或前生物）的物質。該生物包括（但非限於）：人類、老鼠、 猴子、老鼠、兔子、及其它動物。該物質包括（但非限於）： 血液、血淸、尿液、細胞、器官、組織、骨、骨髓、淋巴 結、及皮膚。 本文之術語”骨質病症''包括（但並非限於）：骨質疏鬆症 、骨質減少、變形性骨炎、溶解性骨腫瘤移轉、牙周炎、 類風濕性關節炎、及由於不動造成之骨骼流失。除了此類 骨病症之外，已知某些癌症可增加破骨細胞活性及誘發骨 質重吸收，例如：乳房、前列腺、及多發性骨髓瘤。目前 習知此類癌症可產生導致骨中〇PGL過度表現之因子，以及 導致破骨細胞數目及活性增加。 本文之術語"醫藥學藥劑或藥物"意指投用至病患能誘發 所要求的治療效果之適當的化學化合物或組成物。 本文之術語"調節劑π意指改變或改變分子活性或功能之 化合物。例如，相較於缺少調節劑時觀察到的活性或功能 的大小，調節劑可增加或降低某些分子之活性或功能的大 小。在某些具體實施例中，調節劑是抑制劑，其可減低至 少一個活性或功能分子之含量。某些分子典型的活性以及 功能包括（但非限於）：結合親和力、酵素的活性、及訊息傳 遞。某些典型的抑制劑包括（但非限於）··蛋白質、肽類、抗 體、肽體、碳水化合物或小有機分子。肽體則描述於例如 ^紙張尺度適用中國國家標準（〇奶）八4規格（210父297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-28- 經濟部智懇財產局貞工消費合作社印製 1276443 A7 B7 五、發明説明（ W001/83525 〇 本文之"相當純”係指目標物種爲存在的主要物種（即以 莫耳濃度爲計在組成物中其含量比任何其它個別物種都更 豐富）。在某些具體實施例中，相當純的溶析份是組成物中 目標物種包含至少約所有存在的所有大分子物種中的50%( 以莫耳濃度爲計）。在某些具體實施例中，相當純組成物將 包含存在於組成物中大於約80%、85%、90%、95%、或99% 之巨莫耳濃度物種。在某些具體實施例中，目標物種被純 化至本質上的均一性（組成物中之污染物種無法用習見的偵 測方法加以偵測），本質上組成物由單一的大分子物種組成 〇 本文之術語病患包括人類及動物病患。 本申請案中，使用之單數形式，除非特別說明，包括 複數形式。本申請案中除非特別說明”或”係指"及/或"。此 外，本文之術語M包括"，以及其它形式，例如"包括”以及" 包括"亦未加限制。同時，除非特別說明，術語例如單數之" 元件"或"成份"包括包含一個單元之元件及成份，複數之元 件以及成份包含一個以上之次單體。 護骨素配位體（OPGL)，是涉及破骨細胞形成的細胞激 動素中腫瘤壞死因子（TNF)家族的成員。增加破骨細胞活性 與許多骨質病症相關，包括後-更年期的骨質疏鬆症、變形 性骨炎、溶解性骨腫瘤移轉、及類風濕性關節炎。因此， 降低OPGL活性可降低破骨細胞活性並可降低骨質病症之嚴 重性。依據某些本發明之具體實施例，直接對抗OPGL的抗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-29- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2) 體可用於治療骨質病症，包括（但非限於）上述的骨質病症。 在本發明某些具體實施例中，提供對抗人類護骨素配 位體（OPGL)完整的人類單株抗體。在某些具體實施例中， 提供編碼包含免疫球蛋白分子重鏈及輕鏈，尤其是對應至 變異區序列之核苷酸序列，以及胺基酸序列。在某些具體 實施例中，提供對應至互補性決定區域（CDR’s)，特別是 CDR1至CDR3，之序列。依據某些具體實施例中，亦提供表 現該免疫球蛋白分子以及單株抗體之融合瘤細胞株。在某 些具體實施例中，提供對抗人類OPGL之純化的人類單株抗 體。 能將巨大鹼基之人類基因座選殖及再建築進入人造酵 母菌染色體（YACs)並將彼引進老鼠之種系，可對非常大的 或粗略圖示的基因座之功能性成份加以說明，並可產生用 於人類疾病的模式。此外，利用該技藝以人類的基因座取 代老鼠的基因座可了解於發生期間人類基因產物之表現以 及調節，彼與其它系統之聯絡、及彼在疾病誘發及進展上 所扮演之角色。 該策略在實行上重要的之用途是"人類化"老鼠體液的免 疫系統。將人類免疫球蛋白（Ig)基因座引入內生性Ig基因 已去活化的老鼠，以硏究構成程式化表現及抗體組裝，與 彼在B-細胞發生上所伴演之角色等機制的基礎。此外，該 策略可提供產生完整人類單株抗體（MAbs)的來源。在某些 具體實施例中，完整的人類抗體預期可使老鼠內在的或老 鼠-衍生的Mabs產生免疫的及過敏.性的反應減到最少，因 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-30- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（2¾ 此，在某些具體實施例中，可增加投用抗體之功效以及安 全性。在某些具體實施例中’完整的人類抗體可用於治療 包含重覆抗體投藥之慢性及重覆發生的人類疾病，例如： 骨質疏鬆症、發炎、自體免疫性、及癌症。 目前可將缺乏抗體產生之老鼠品系殖入人類Ig基因座 大的斷片並使該老鼠在沒有老鼠抗體的情況下產生人類抗 體。大的人類Ig斷片可保存大量可變的基因之多樣性，與 抗體產生及表現之適當的調節。經由探討老鼠抗體之多樣 化及選擇以及缺少對人類蛋白質之免疫耐受性等機構，此 ，類老鼠品系中複製的人類抗體庫可產生高親和性抗體對抗 任何重要的抗原（包括人類抗原）。使用融合瘤技藝，可製作 及選擇具有特定抗原專一性的人類MAbs。 在某些具體實施例中，在人類變異區之後可使用非人 類的恆定區。 天然抗體結構 天然抗體構造單位通常包含一個四合體。該四合體一 般由兩對相同的多胜鍵組成，一對爲全長的"輕"鏈（在某些 具體實施例中，約25kDa)，另一對全長的”重"鏈（在某些具 體實施例中，約 50-70 kDa)。各鏈的胺基端部份包括約100 至110或更多個胺基酸之變異區，其可辨視抗原。各鏈的羧 基端部份爲恆定區，其具有致效劑功能。人類輕鏈一般可 分成κ以及λ·輕鏈。重鏈一般可分成//、5、γ、α、或ε， 並分別將抗體之同功型定義成免疫球蛋白Μ、免疫球蛋白 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -31 - 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7__五、發明説明（ D、免疫球蛋白G、免疫球蛋白A、及免疫球蛋白E。免疫 球蛋白G有許多次群，包括（但非限於）：IgGl、IgG2、IgG3 、以及IgG4。免疫球蛋白Μ之次群包括（但非限於）：免疫 球蛋白Ml以及免疫球蛋白M2。免疫球蛋白A同樣地可細 分成次群，包括（但非限於）：免疫球蛋白A1以及免疫球蛋 白A2。全長的輕鏈及重鏈內，可變及恆定區用大約12個或 更多個胺基酸之"Γ區域相聯，重鏈亦包括約多10個胺基酸 之 nD"區域。參閱例如，Fundamental Immunology Ch. 7(Paul， W.，ed·，2nd ed. Raven Press，Ν·Υ·(1 989))(全文在此并入參考 文獻）。各輕/重鏈對之變異區可形成抗原結合部位。 變異區所展現之一般結構如同聯結著三個高變異區之 相對守恆架構區域（FR)相同，亦稱爲互補性決定區域或 CDR。各對來自二個鏈的CDR可經架構區域校準，其可結 合於專一性抗原決定部位。從N-端至C-端，此輕及重鏈變 異區一般包含 FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3 以及 FR4結構區。各結構區指派之胺基酸一般係依據Kabat Sequences of Proteins of Immunological Inter est(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987及 1991))、或 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917(1987); Chothia et al. Nature 342:878-883(1989)之定義。 雙專一性的或雙功能抗體 雙專一性的或雙功能抗體是人造的雜化抗體，其具有 二種不同的重鏈/輕鏈對，及二種不同的結合部位。雙專一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-32- 1276443 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 A7 B7___五、發明説明（3¾ 性的抗體可用各種方法製作。 製備抗體 依據某些具體實施例，本發明包含某些專一性結合於 〇PGL的抗體。在某些具體實施例中，可藉由用全長OPGL 、可溶解形式之OPGL、或其斷片免疫以製作該抗體。在某 些具體實施例中，本發明抗體可爲多株的或單株的、及/或 可爲重組抗體。在某些具體實施例中，本發明抗體是以（例 如）對能產生人類抗體基因的轉殖動物進行免疫而製備成的 人類抗體（參閱，例如，PCT公佈的申請案第W09 3/1 2227號 )° 在某些具體實施例中，a〇PGL-i的輕鏈及重鏈變異區之 互補性決定區域（CDRs)可接上同種、或另一物種之架構區 域（FRs)。在某些具體實施例中，a0PGL-l的輕鏈及重鏈變 異區之CDRs可接上一致的人類FR。爲了創造一致的人類 FR ’在某些具體實施例中，校準來自數個人類重鏈或輕鏈 胺基酸序列之FR以確認一致的胺基酸序列。在某些具體實 施例中，將a〇PGL-l之重鏈或輕鏈的FRs用不同的重鏈或 輕鏈之FR取代。在某些具體實施例中，a〇PGL-l之重鏈或 輕鏈的FR中少見的胺基酸則不經取代，而其他之FR胺基 酸則®取代。少見的胺基酸是指在FR之特定位置上通常不 會出現的特定胺基酸。在某些具體實施例中，接上 aOPGL-Ι變異區後可使用相異於a〇PGL-l恆定區之恆定區。 在某些具體實施例中，所接上的變異區是單鏈Fv抗體的一本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-33- 1276443 A7 B7 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（3) 部份。CDR之移植描述於例如美國專利第6，1 80,37〇、 5,693,762、5,693,761、5,585,089 及 5,530，101 號，全文在此 并入參考文獻。 依據某些具體實施例，本發明抗體之製備方法係利用 具有貫質上插入人類抗體產生基因組部份、但缺乏產生內 生性（鼠科動物）抗體之導入外來基因的老鼠。該老鼠能產生 人類免疫球蛋白分子及抗體而不能產生鼠科動物免疫球蛋 白分子及抗體。用以達成此結果之技藝已揭示於本文揭示 之專利、申請案、及參考文獻。在某些具體實施例中，可 使用之方法例如揭示於PCT公佈的申請案第W098/24893號 ’全文在此并入參考文獻。亦可參閱Mendez et al. Nature Genetics 1 5:146-156(1997)，全文在此并入參考文獻。 依據某些具體實施例，具OPGL專一性的完整人類單株 抗體其製作如下。將已導入內含人類免疫球蛋白基因之外 來基因的老鼠用所要的抗原進行免疫。從表現抗體的老鼠 身上取得淋巴細胞（例如B-細胞）。將該細胞與骨髓型細胞 株融合以製備成不死的融合瘤細胞株，篩選該融合瘤細胞 株並選擇確認對重要抗原產生專一性抗體的融合瘤細胞株 。在某些具體實施例中，提供可對OPGL產生專一性抗體的 融合瘤細胞株。 在某些具體實施例中，本發明抗體係由融合瘤細胞株 AMG6.1、AMG6.4、AMG6.5、AMG7.1、以及 AMG7.2製作。 在某些具體實施例中，本發明抗體係由融合瘤細胞株 AMG6.1、AMG6.4、以及AMG6.5製作。在某些具體實施例 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210 X 297公釐） -34- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 B7五、發明説明（d 中，本發明抗體結合於〇PGL之離解常數（kD)介於大約0.23 以及0.29毫微莫耳濃度之間。在本發明某些具體實施例中， 抗體結合於OPGL之kD少於0.23毫微莫耳濃度。 在某些具體實施例中，本發明抗體爲IgG2同功型。在 本發明某些具體實施例中，抗體包含人類κ輕鏈及人類 IgG2重鏈。在某些具體實施例中，本發明抗體已選殖入哺 乳動物的細胞進行表現。在某些具體實施例中，抗體變異 區係連結IgG2同功型恆定區以外之恆定區。 在某些具體實施例中，對a〇PGL-l之重鏈及輕鏈進行 保留性修飾（以及編碼核苷酸對應的修飾）將可產生功能上及 化學特性與a0PGL-l相似的OPGL抗體。相反的，將對於維 持（a)取代區域分子骨幹結構（例如··薄板狀或螺旋狀的構像 )' (b)目標位點之分子電價或拒水性、或（c)側鏈團塊之效應 顯著不同的重鏈及輕鏈之胺基酸序列選擇性取代，可對 a〇PGL-l之功能及/或化學特性進行實質性修飾。 例如，”保留性胺基酸取代"可涉及將天然的胺基酸殘基 用非天然的殘基取代而對該位置之胺基酸殘基的極性或電 價不具效應。此外，多肽上任何天然的殘基亦可經丙胺酸 取代’即先前已描述之”丙胺酸掃描誘變"。 所要的胺基酸取代（不論爲保留性或非保留性）可經熟悉 此技藝的專業人士在進行取代時決定。在某些具體實施例 中’胺基酸取代可用以確認a〇PGL-l上的重要殘基，或增 加或降低抗體對〇PGL之親和力。 在某些具體實施例中，本發明抗體可用融合瘤細胞株 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) μ規格（210X297公釐） 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ____ B7五、發明説明（ 以外的細胞株表現。在某些具體實施例中，編碼特定抗體 的序列可轉形入適當的哺乳動物宿主細胞。依據某些具體 實施例，轉形作用可用任何已知的方法將多核苷酸引入宿 主細胞’包括（例如：）將多核苷酸包入病毒（或病毒性的載 體）中並用病毒（或載體）轉導入宿主細胞，或經技藝上已知 的轉染程序轉染入宿主細胞，例如美國專利第4,399,21 6、 4,912,040、4,740,461、及4,959,455號（全文在此倂入參考文 獻）。在某些具體實施例中，轉形步驟取決於轉形的宿主。 將異性多核苷酸引入哺乳動物的細胞的方法爲已知的技藝 ’包括（但非限於）：右旋聚醣-調節的轉染作用、磷酸鈣沉 澱、聚本（polybrene)調節的轉染作用、原生質體融合、電穿 透作用、封包多核苷酸之脂球體、及直接地顯微注射DNA 進入細胞核。 可作爲表現宿主之哺乳動物的細胞株爲技藝上已知的 細胞株，包括（但非限於）許多永生的細胞株，其可購自 American Type Culture Collection(ATCC)，包括（但非限於）·· 中國倉鼠卵巢（CHO)細胞、HeLa細胞、嬰兒倉鼠腎臟（BHK) 細胞、猴子腎臟細胞（COS)、人類肝細胞的癌細胞（例如Hep G2)、及許多其他細胞株。在某些具體實施例中，可選擇高 表現量及產生具有組成性OPGL結合性質之抗體的細胞株。 依據某些具體實施例，本發明抗體可用於偵測生物樣 品中的OPGL。在某些具體實施例中，其能確認產生蛋白質 之細胞或組織。在某些具體實施例中，結合於OPGL並阻塞 與其它結合化合物交互作用之抗體具有調控破骨細胞分化 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -36- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7五、發明説明（j 及骨質重吸收之治療用途。在某些具體實施例中，OPGL抗 體可阻擾OPGL與ODAR結合，而阻擾訊息傳遞串聯反應並 喪失經NF-kB調節的轉錄活化。測量經NF-kB-調節的轉錄 活化可使用，例如：虫螢光素酶報導測定法，其爲熟悉此 技藝的專業人士所熟知。 在某些具體實施例中，提供包含投用有效治療量OPGL 抗體之治療骨病症的方法。在某些具體實施例中，提供包 含投用有效治療量之OPGL抗體及另一治療劑以治療骨質病 症的方法。在某些該具體實施例中，額外的投用有效治療 量之治療劑。在某些具體實施例中，骨質病症之特徵在於 骨骼淨流失，包括但非限於：骨質減少以及骨質溶解。在 某些具體實施例中，用OPGL抗體治療係用以抑制骨質重吸 收之速率。因此，在某些具體實施例中，當重吸收速率比 正常高時，此治療可降低骨質重吸收之速率，而當骨質形 成低於正常値時，則可降低骨質重吸收以彌補。在某些具 體實施例中，可在OPG存在或不存在下測試抗體與OPGL 之結合並檢查其抑制OPGL-調節的骨質形成及/或骨質重吸 收之能力。 依據某些具體實施例可治療的症狀包括（但非限於）： 骨質疏鬆症，包括（但非限於）：原發性骨質疏鬆症、內 分性泌骨質疏鬆症（包括，但非限於：甲狀腺機能亢進、副 甲狀腺機能亢進、庫欣氏症、及肢端肥大症）、遺傳性及先 天性的骨質疏鬆症形式（包括，但非限於：成骨不全、高胱 胺酸尿症、Menke氏症候群、家族性自主神經機能異常）、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-37- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（^ 及由於四肢不動造成之骨質疏鬆症； 成人及幼兒變形性骨炎（骨炎性變形）； 骨髓炎，即骨的感染性損害導致骨骼流失； 高鈣血症，包括（但非限於）：起因於固體腫瘤之高鈣血 症（包括，但非限於：乳房、肺臟及腎臟）以及血癌（包括’ 但非限於··多發性骨髓瘤、淋巴癌及白血病）、原發的高齡 血症、及與甲狀腺機能亢進和腎功能病症相關的高鈣血症 骨質減少，包括（但非限於）：外科手術後之骨質減少、 因投用類固醇而誘發的骨質減少、相關於小腸及大腸病症 之骨質減少、及相關於慢性肝臟及腎臟疾病之骨質減少； 骨壞死，即骨細胞死亡，包括（但非限於）：相關於創傷 性損傷的骨壞死、相關於高雪氏病的骨壞死、相關於鐮刀 細胞貧血的骨壞死、相關於全身性紅斑狼瘡的骨壞死、相 關於類風濕性關節炎的骨壞死、相關於牙週病的骨壞死、 相關於溶骨的腫瘤移轉的骨壞死、及相關於其他疾病的骨 壞死；以及相關於類風濕性關節炎的軟骨流失及關節腐鈾 〇 在某些具體實施例中、OPGL抗體可單獨使用或與至少 一個額外的治療劑共同使用以治療骨質病症。在某些具體 實施例中，OPGL抗體可合倂使用有效治療量之額外治療劑 。可與〇PGL抗體共同投用的治療劑包括（但非限於）：骨形 態發生因子，BMP-1至BMP-12;轉形生長因子-P(TGF-P)以 及TGF-β家族成員；第一型白細胞介素（IL-1)抑制劑，包括 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X29*7公釐） -38- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 _________B7___ 五、發明説明（d 中，此藥劑可爲相同調配物內之共同內含物。在某些具體 實施例中，此藥劑以及OPGL抗體可爲同一調配物內之共同 內含物。在某些具體實施例中，此藥劑可爲治療組套內之 共同內含物。在某些具體實施例中，此藥劑及OPGL抗體可 爲治療組套內之共同內含物。在某些具體實施例中，此藥 劑可分別提供。在某些具體實施例中，在進行基因療法時 ’編碼蛋白質藥劑及/或OPGL抗體之基因可包括在相同載 體內。在某些具體實施例中，編碼蛋白質藥劑及/或OPGL 抗體的基因可用相同啓動子區域控制。在某些具體實施例 中，編碼蛋白質藥劑及/或OPGL抗體基因可位於不同的載 體。 在某些具體實施例中，本發明係關於包含〇PGL抗體以 及至少一個第一型白細胞介素（IL-1)抑制劑之療法，以及使 用該療法之治療方法。在某些具體實施例中，描述包含 〇PG抗體及IL-1抑制劑以及至少一個其它分子的治療。在 某些具體實施例中，使用IL-1抑制劑及/或TNF-α抑制劑合 倂OPGL抗體之治療方法。在某些具體實施例中，可使用 〇PGL抗體結合IL-1抑制劑及/或TNF-a抑制劑治療症狀， 例如：氣喘、類風濕性關節炎、及多發性硬化。 第一型白細胞介素（IL-1)是消炎性細胞激動素。在某些 實例中，IL-1爲許多疾病及醫學症狀的中介物。在某些實例 中，IL-1由巨噬細胞/單核白血球細胞株製作。在某些實例 中，IL-1 有二種形式：IL-la(IL-la)以及 IL-IP(IL-IP)。 若自發性或實驗性疾病或醫學症狀係與體液或組織中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-40- 1276443 A7 B7 五、發明説明（3¾ IL-1含量升高相關及/或若身體細胞或組織在培養時IL-1的 含量升高，即視其爲”經第一型白細胞介素調節的疾病”之疾 病或醫學症狀。在某些具體實施例中，該經第一型白細胞 介素調節的疾病亦可由以下另外的二種症狀確認：（1)在對 動物投用IL-1或向上調節IL-1表現之模擬實驗中可發現與 疾病或醫學症狀相關的病理現象及/或(2)在病理誘發的實驗 動物模式中投用抑制IL-1作用之藥劑可抑制或終止疾病或 醫學症狀。在某些具體實施例中，IL-1-調節的疾病有一種 或多種上述之症狀。在某些具體實施例中，IL-1-調節的疾 病有所有種症狀。 急性以及慢性經第一型白細胞介素（IL-1)-調節的疾病 包括（但非限於）：急性胰腺炎；側索硬化性肌肉萎縮症（ALS ，或Lou Gehrig’s疾病）；阿茲海默氏症；惡病質/神經性厭 食症，包括（但非限於）：因愛滋病-誘發的惡病質；氣喘以 及其它肺部的疾病；動脈粥樣硬化；自體免疫脈管炎；慢 性疲勞症候群；與梭菌屬相關的疾病，包括（但非限於）：與 梭菌屬相關的腹瀉；冠狀動脈症狀以及適應症，包括（但非 限於）··充血性心臟衰竭、冠狀動脈再狹窄症、心肌梗塞、 心肌官能障礙（例如相關的敗毒病）、及冠狀動脈繞道移植； 癌症，包括（但非限於）白血病，包括（但非限於）：多發性骨 髓瘤白血病以及起自骨髓的骨髓瘤（例如·· AML以及CIVIL) 、及腫瘤移轉；糖尿病（包括，但非限於’胰島素-依存的糖 尿病）；子宮內膜異位；發燒；纖維肌風濕病；腎小球性腎 炎；移植之宿主疾病及/或移植排斥；出血性休克；痛覺過 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 -41 - A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 B7 五、發明説明（扃 IL-1受體單株抗體（參閱例如EP 623674,全文在此并入參考 文獻）；IL-1結合蛋白質，包括（但非限於）：可溶解的IL-1 受體（參閱例如，美國專利第5,492,888號、美國專利第 5,488,032號、及美國專利第5,464,937號、美國專利第 5,319,071號、及美國專利第5，180,812號，全文在此并入參 考文獻）；抗-IL-1單株抗體（參閱例如：WO9501997、 WO9402627、W09006371、美國專利第 4,935,343 號、 EP36477 8、EP26761 1以及EP220063，全文在此并入參考文 獻）；IL-1受體附件蛋白質以及其抗體（參閱例如， WO96/23067以及W099/37773，全文在此并入參考文獻）；第 一型白細胞介素β轉換酵素（ICE)或卡斯酶（caspase)I抑制劑 (參閱例如，W099/46248、W099/47545、及 W099/47154， 全文在此并入參考文獻），其可用以抑制IL-1 β產生以及分 泌；第一型白細胞介素β蛋白酶抑制劑；以及其它阻塞活 體內合成或細胞外釋放IL-1之化合物以及蛋白質。 典型的IL-1抑制劑揭示於例如：美國專利第5,747,444 ；5,359,032 ； 5,608,035 ； 5,843,905 ； 5,359,032 ； 5,866,576 ；5,869,660 ； 5,869,3 1 5 ； 5,872,095 ； 5,955,480 ； 5,965,564 號；國際（WO)專利申請案 98/21957、96/09323、91/17184、 96/40907 、 98/32733 、 98/42325 、 98/44940 、 98/47892 、 98/56377 、 99/03837 、 99/06426 、 99/06042 、 91/17249 、 98/32733 、 98/17661 、 97708174 、 95/34326 、 99/36426 、 99/3 64 1 5 ;歐洲（EP)專利申請案534978以及894795 ;以及法 國專利申請案FR2762514。所有揭示全文在此并入參考文獻 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公ϋ ~_ -43- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1276443 A7 __ B7 五、發明説明（4) 〇 第一型白細胞介素受體拮抗劑（IL-Ira)是人類蛋白質， 其爲第一型白細胞介素的天然抑制劑且爲IL-1家族之一員 ，其係包括IL-Ισ及IL-Ιβ。某些受體拮抗劑，包括iL-lra 以及其變種及衍生物，以及製作與使用彼之方法已描述於 美國專利第 5,075,222 號；WO9 1/08285 ; W091/17184 ; AU9 1 73636 ； W092/16221 ； W093/21946 ； WO94/06457 ； W094/21275 ； FR2706772 ； W094/21235 ； DE42 1 9626，WO94/205 17 ; W096/22793 ; W097/28828 ;以及 W〇99/3 6541，全文在此倂入參考文獻。在某些具體實施例 中，IL-1受體拮抗劑可糖基化。在某些具體實施例中，IL-1 受體拮抗劑可爲非糖基化。 美國專利第5,075,222(’222專利）號描述三種形式之 IL-lra及其變種。在’222專利中，第一種形式稱爲”IL-li”， 其特徵在於3103-?八0£下22-231^之分子，等電點接近4.8 ，在52毫莫耳濃度NaCl之三羥甲基胺基甲烷緩衝液，酸鹼 度7.6下溶析自“〇11〇(3??1^管柱。第二種形式，11^11：邛 ，其特徵爲22-23kD之蛋白質，在48毫莫耳濃度NaCl下溶 析自Mono Q管柱。IL - Ira α以及IL - IraP均爲糖基化。第 三種形式，IL-1 rax，其特徵爲20 kD之蛋白質，在48毫莫耳 濃度NaCl下溶析自Mono Q管柱並爲非糖基化。’222專 利亦描述某些分離編碼抑制劑基因、選殖基因入適當的載 體，轉形及轉染基因入某些細胞型態、及表現基因產生抑 制劑之方法。 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -44- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（j 在某些具體實施例中，可在IL-Ira之胺基酸序列內進 行刪除、插入、及/或取代（個別地或統稱爲"變種”）。在某 些具體實施例中，IL-Ira變種具有生物活性（例如具有抑制 江-1之能力）。 在某些具體實施例中，本發明係關於包含OPGL抗體及 至少一個TNFa抑制劑之療法，以及使用該療法治療之方法 。在某些具體實施例中，包含OPG抗體以及TNFa抑制劑 以及至少一個在此描述的額外分子進行治療。 經TNF調節的某些疾病及醫學病症可列入發炎病症的 範疇。本文中"經TNF-調節的疾病”包括（但並非限制於）·· 相關於體液或組織中TNF之含量升高及/或來自身體之細胞 或組織在培養中TNF之含量升高的疾病或醫學症狀。在某 些具體實施例中，若（1)在對動物投用或向上調節TNF表現 之模仿實驗中可發現與疾病或醫學症狀相關的病理現象及/ 或（2)在病理誘發的實驗動物模式中投用抑制TNF作用之藥 劑可抑制或終止疾病或醫學症狀，則該疾病是經TNF-調節 的疾病。 某些經TNF-調節的急性以及慢性疾病，包括（但非限於 ):惡病質以及神經性厭食症；癌症，包括（但非限於）：白 血病；慢性疲勞症候群；冠狀動脈症狀及/或適應症，包 括（但非限於）：充血性心臟衰竭、冠狀動脈再狹窄症、心 肌梗塞、心肌的官能障礙（包括，但非限於，與敗毒病相關 的症狀）、及冠狀動脈繞道移植；沮喪；糖尿病，包括（但非 限於）：幼年型開始作用之第1型糖尿病、糖尿病、及胰島 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -45- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（d 素抗性（包括，但非限於，與肥胖相關的胰島素抗性）；子宮 內膜異位、子宮內膜炎、及相關的症狀；纖維肌風濕病以 及痛覺缺失；移植物/宿主排斥；痛覺過敏；發炎性腸道 疾病，包括（但非限於）：局部性迴腸炎以及與相關梭桿菌的 難治腹瀉；局部缺血，包括（但非限於）：大腦局部缺血，包 括（但非限於）：創傷造成之腦損傷、癲癇、出血、及/或中 風；肺臟疾病，包括（但非限於）：成年人呼吸窘迫徵候群、 氣喘、及肺部的纖維變性；多發性硬化；神經發炎性的疾 病；眼睛的疾病以及症狀，包括（但非限於）：角膜移植、眼 睛退化及葡萄膜炎；疼痛，包括（但非限於）：與癌症相關的 疼痛；胰腺炎；牙週病；蛇皮癬（PRP);前列腺炎，包括細 菌以及非細菌性前列腺炎、及相關症狀；牛皮癖及相關症 狀；肺部纖維變性；再灌流損傷；風濕疾病，包括（但非限 於）：類風濕性關節炎、骨關節炎、幼年型關節炎（包括（但 非限於）：幼年類風濕性關節炎）、血淸陰性的多發性關節炎 、類風濕性脊椎炎、賴特爾綜合症以及反應性的關節炎、 Still氏疾病、牛皮癖性關節炎、小腸病性關節炎、多肌炎 、皮膚肌炎、硬皮病、全身硬化、脈管炎（例如、Kawasaki 氏疾病）、大腦的脈管炎、萊姆關節炎、葡萄球菌誘發的（” 敗血症的"）關節炎、Sjogren氏症候群、風濕熱、多軟骨炎 以及風濕性多肌痛以及巨細胞動脈炎）·，敗血性休克；輻射 線治療之副作用；全身性紅斑狼瘡（SLE);顳骨頜骨的關節 疾病；甲狀腺炎；以及組織移植及/或例如起因於拉傷、扭 傷、軟骨損害、創傷、整形外科、感染（例如，人類免疫不 請 先 閱 讀 背 'Sj 之 注 意 事 項 再
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -46- 1276443 A7 B7 五、發明説明（4έ 5,807,862 ； 5,695,953 ； 5,834,435 ； 5,8 17,822 ； 5830742 5,834,435 5,695,953 5,641,673 5,856,161 5,869,660 5,955,476 5,851,556 ； 5,853,977 ； 5,359,037 5,811,261 ； 5,633,145 ； 5,863,926 5,869,677 ； 5,869,511 ； 5,872,146 5,877,222 ； 5,877,200 ； 5,877,151 5,859,207 ； 5,891,883 ； 5,877,180 5,955,435 ； 5,994,351 ； 5,990,119 5,512,544 5,866,616 5,854,003 5,886,010 5,955,480 5,952,320 5,962,48 1號；國際性的專利申請案 WO 90/1 3575 91/03553 93/07863 96/28546 96/38150 96/25861 98/39316 98/39329 96/33172 97/47599 95/04045 W〇 92/01002 WO 93/21946 W〇 98/27298 WO 97/1 8207 WO 96/12735 W〇 98/3 8859 W〇 98/43959 WO 96/20926 WO 92/1 3095 WO 93/19777 W〇 98/3054 1 W〇 97/1 556 1 W〇 96/1 1 209 WO 98/393 1 5 W〇 98/45268 WO 97/37974 WO 98/5 1 665 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 W〇 96/357 1 1 W〇 98/56377、WO 97/12244 W099/00363、WO 98/57936、WO99/01449 W〇 98/56788、WO 98/56756、WO 98/53842 W〇 98/52937、W099/025 10、WO 97/43250 W099/06042、W099/09022、WO99/08688 WO99/09965、W0 99/07704、W099/06041 W0 99/37625、W〇 97/1 1 668、WO99/50238 WO 92/16221 WO 95/34326 W〇 96/38 1 50 WO 97/12902 W〇 98/39326 WO 98/42659 W〇 98/47863 W〇 97/37973 WO 98/43946 W099/00364 WO99/01139 WO 98/52948 W099/06410 WO99/07679 W099/3781 8 W099/47672
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本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -48- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7___五、發明説明（4 W0 99/48491 ;日本專利申請案 1014753 1、1 023 1 285、 10259140，以及 10130149 、 10316570 、 11001481 、及 1 27,800/199 1 ;德國申請案第1 973 1 521號；以及英國申請案 第2 218101、2 326 881、2 246 569號。上述參考文獻的所 有揭示全文在此并入參考文獻。 EP 39 3 43 8以及EP 422 3 39描述可溶解的第I型TNF受 體（亦爲習知的sTNFR-I或30kDaTNF抑制劑）以及可溶解的 第II型TNF受體（亦爲習知的sTNFR-II或40kDaTNF抑制劑 )，統稱爲"sTNFRs"之胺基酸及核酸序列。EP 393 438以及 EP 422 339亦描述sTNFR-I以及sTNFR-II經修飾之形式， 包括（但非限於）斷片、功能性衍生物、及變種。此外，EP 393 438以及EP 422 339描述分離編碼抑制劑基因、選殖基 因入適當的載體、轉形或轉染基因進入某些細胞類型、及 表現基因產生抑制劑之方法。 sTNFR-I及sTNFR-II爲神經生長因子/TNF受體超級受 體家族之成員，該家族包括神經生長因子受體（NGF)、B細 胞抗原CD40、4-1 BB、老鼠T-細胞抗原 MRC 0X40、fps 抗原、及 CD27 以及 CD30 抗原（Smith et al. ( 1 990) Science., 248 : 1019- 1023)。該細胞表面受體之守恆特色爲富含半胱 胺酸之細胞外的配位體結合結構區，其可分成四個約40個 胺基酸在守恆位置含有4-6個半胱胺酸殘基之重覆基元 (motif)(Smith et al.( 1990),supra)。 EP 393 438中教示一個40kDaTNF抑制劑Δ51以及40kDa 之TNF抑制劑△ 53，其爲全長重組型40kDaTNF抑制劑蛋白 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2I〇X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-49- 1276443 A7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 B7_五、發明説明（4) 質之縮短版。△ 51以及△ 53分別有51或53個胺基酸’自成熟 的蛋白質的羧基端進行刪除° PCT申請案第W〇9 8/0 1 5 55號已發表描述縮短形式的 sTNFR-I以及sTNFR-II，其係不含有第四個結構區（sTNFR-I 之胺基酸殘基Thr127-Asn161，sTNFR-II之胺基酸殘基Pro141-Thr179);部份之第三結構區（sTNFR-I之胺基酸殘基Asn111-Cys126 ，sTNFR-II 之胺基酸殘基 Pro123-Lys14Q);以及，可視 需要不含有部份之第一結構區（TNFR-I之胺基酸殘基人3?1-Cys19，sTNFR-II之胺基酸殘基Leu1-Cys32)。在某些具體實 施例中，縮短的sTNFRs包括由式Ri-[Cys19-Cys1Q3]-R2以及 R4-[Cys32-Cys115]-R5代表之蛋白質。此類蛋白質分別是 sTNFR-I以及sTNFR_II的縮短形式。 本文中’•只1-[〇7819-〇¥51°3]-1^2"代表一種或多種蛋白質， 其中[Cys19-Cys1()3]是sTNFR-I上19至103之殘基，如 W〇 98/0 1 555中圖1提供之序列；其中R!代表Cys19之甲硫（丁）胺 醯化或非甲硫（丁）胺醯化之胺基團或一種或多種胺基端的胺 基酸殘基，其係選自Cys18至Asp1 ;以及其中R2代表Cys1Q3 之羧基團或一種或多種羧基端之胺基酸殘基，其係選自 Phe1。4至 Leu110。 本發明典型的縮短的sTNFR-I包括（但非限於）： sTNFR-I 2.6D/C105 、 sTNFR-I 2.6D/C106 、 sTNFR-I 2.6D/N105、sTNFR-I 2·3D/d8、sTNFR-I 2·3D/d 18、sTNFR-I 2.3D/dl5，可爲甲硫（丁）胺醯化或非甲硫（丁）胺醯化、及其 變種及衍生物。某些典型的縮短的sTNFR-I描述於例如，發 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -50- 1276443 經濟部智慧財產局8工消費合作杜印製 A7 __B7_五、發明説明（4¾ 表的PCT申請案第W0 98/01555號。 本文之代表一種或多種蛋白質， 其中[Cys32-Cys115]是 sTNFR-II 上之殘基 Cys32至 Cys115,參 見WO 98/01 555圖8提供之序列；其中R3代表Cys32上甲硫（ 丁）胺醯化或非甲硫（丁）胺醯化之胺基團或一種或多種胺基 端之胺基酸殘基，其係選自Cys31至Leu1 ;以及其中R4代 表Cys115之羧基團或一種或多種羧基端上之胺基酸殘基，其 係選自 Ala116至 Arg122。 在某些具體實施例中，本發明係關於包含OPGL抗體以 及至少一個絲胺酸蛋白酶抑制劑療法，以及使用該療法之 治療方法。在某些具體實施例中，包含OPG抗體以及絲胺 酸蛋白酶抑制劑以及至少一個本文描述之額外分子進行治 療。 內生性蛋白質分解酵素可降解入侵的生物體、抗原抗 體複合物、以及某些不再必須或適用的組織蛋白。感染劑 中可引進額外的蛋白質分解酵素進入生物體。蛋白酶抑制 劑可調控內生性及入侵性之蛋白質分解酵素。 在某些具體實施例中，天然蛋白酶抑制劑可經限制其 反應的空間及時間，控制內生性蛋白酶。在某些具體實施 例中，蛋白酶抑制劑可抑制蛋白酶經感染劑引入身體。在 某些實例中，尤其是易受蛋白質水解攻擊及感染的組織中 均富含蛋白酶抑制劑，包括（但非限於）：呼吸道。 蛋白酶抑制劑包含大約10%之人類血漿蛋白。至少八種 抑制劑已分離自此一來源，其特徵可參見文獻。此類抑制 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-51 - 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（4 劑包括（但非限於）：α2-巨球蛋白（α2Μ)、α卜蛋白酶抑制劑 (αΙΡΙ)、α卜抗胰凝乳蛋白酶（otlAchy)、α卜抗膠原酶（alAC) 、以及介- a-膜蛋白抑制因子（Ι-α-Ι)。 在某些實例中，干擾蛋白酶/蛋白酶抑制劑之平衡可導 致受到蛋白酶調節的組織之破壞，而發生包括（但非限於）： 肺氣腫、關節炎、腎小球性腎炎、牙周炎、肌肉萎縮、腫 瘤侵入、及各種其它病理的狀況。在某些情況下，例如嚴 重的病理狀況，例如敗毒病或急性的白血病，由於從分泌 的細胞釋放酵素，自由的蛋白質分解酵素之含量可增加。 此外，在某些實例中，生物體中縮小調節抑制劑容量 亦可引起蛋白酶/蛋白酶抑制劑平衡之改變。該縮小調節抑 制劑容量之非限制實施例是缺乏a 1 -蛋白酶抑制劑，其與 肺部肺氣腫的發展相關。 在某些實例中，除非控制蛋白質分解酵素之含量，否 則該異常的症狀會對生物體產生嚴重損害。因此，蛋白酶 抑制劑可投用於生物體內以控制蛋白質分解酵素。 白血球彈性蛋白酶、胰蛋白酶、組織蛋白酶G，以及 胰臟的彈性蛋白酶爲習知的絲胺酸蛋白酶群之蛋白酶的非 限制性實施例。 在某些實例中，當白血球彈性蛋白酶釋出細胞外後， 可降解結締組織及其它有用的蛋白質。而進行正常功能之 生物體可降解某些量的結締組織以及其它蛋白質，存在過 度量的白血球彈性蛋白酶可與各種病理狀態相關，包括（但 非限於）：肺氣腫以及類風濕性關節炎。在某些具體實施例 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -52- 1276443 A7 B7 五、發明説明（5¾ 中，當白血球彈性蛋白酶之含量高於正常量時，可用專一 的白血球彈性蛋白酶抑制劑阻礙白血球彈性蛋白酶之效應 。若該蛋白酶抑制劑能分離或製備成純化的形式並有充分 的含量，即可具有醫藥學用途。 某些白血球彈性蛋白酶抑制劑描述於例如，Schiessler et al., M Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral
Proteases in Human Mucous Secretions: Biochemistry and Possible Biological Function", in Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes, Havemann et al.(eds)，Urban and Schwarzenberg，Inc.(1978)、以及 Travis and Salvesen, Ann. Rev. Biochem. 52: 655-709(1983) ° 在某些實例中，胰蛋白酶可啓動某些柔軟器官組織（例 如胰臟組織）於各種急性症狀（包括（但非限於）：胰腺炎）期間 之降解。若可分離及製備胰蛋白抑制因子純化的形式並有 充分的含量，則可適用於醫藥學上的用途。 組織蛋白酶G是另一種存在於白血球之蛋白酶。在某 些具體實施例中，組織蛋白酶G能在活體外降解各種蛋 白質，包括補體路徑之蛋白質。胰臟的彈性蛋白酶是可在 胰腺炎中伴演一個角色的另一種蛋白酶。因此，抑制劑此 類蛋白酶亦有醫藥學的價値。 在某些具體實施例中，不同的絲胺酸蛋白酶抑制劑其 受質專一性以及敏感度據相信僅係起因於少數胺基酸殘基 之改變。經由類比，在絲胺酸蛋白酶抑制劑中改變較少的 胺基酸將會產生不同的抑制蛋白酶。在某些具體實施例中 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局ai工消費合作社印製 -53- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（5) ’此家族之成員可抑制每一個絲胺酸蛋白酶。 典型的絲胺酸蛋白酶抑制劑是分泌型白血球蛋白酶抑 制劑（SLPI)以及斷片及其類似物。典型的絲胺酸蛋白酶抑制 劑亦包括（但非限於）：抗白蛋白酶（ALP)、黏液蛋白酶抑制 劑（MPI)、人類精液抑制劑-I(HUSH)、支氣管的黏液抑制劑 (BMI)、及子宮頸的黏液抑制劑（CUSI)。在某些具體實施例 中，絲胺酸蛋白酶抑制劑亦可爲LPS調節劑。參閱例如， Jin et al.( 1997)，Ceil 88(3): 417-26。在某些具體實施例中 ，此類分子適用於造成骨骼流失之症狀，因爲彼可優先直 接的作用在軟骨。 典型的絲胺酸蛋白酶抑制劑描述於例如，美國專利第 4,760,1 30號；美國專利第5,900,400號；以及美國專利第 5,63 3,227號；全文在此倂入參考文獻。揭示於前述參考文 獻的分子與其任何變種或類似物統稱爲"絲胺酸蛋白酶抑制 劑丨丨。 IL-18爲前-發炎性的細胞激動素，可誘發干擾素-γ，先 前稱爲干擾素Y誘導因子（IGIF)。在某些實例中，IL-1可向 上調控IL-18之產生，IL18可誘發許多前發炎性的細胞激動 素之產生，包括IL-6以及MMP-1。參閱例如，Dinarello et ii.( 1 998)，J. Leukoc a Biol. 63: 658-64。在某些實例中，卡 斯酶（caspase)I對IL-18之產生亦很重要。實驗亦顯示TNF-α 可調控IL-18產生，同時抑制TNF-α以及IL-18可保護肝臟 對抗肝臟毒性。參閱例如，hggioni et al.(2000)， PNAS 97: 2367-72 〇 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（cns )A4規格（210x297公釐） -54- A7 B7 1276443 五、發明説明（d 活體內IL-18之作用可能係透過IL-1之系統。IL-18可與 細胞表面受體（IL-18R)交互作用，其可與附件蛋白質 (IL-18RAcP)交互作用。IL-18_調節的信號，其進行時形成 IL-18、IL-18R、以及IL-18RAcP複合體。IL-18天然的抑制 劑爲ILA 18bp。在某些具體實施例中，ILA 18bp可作爲" 誘餌受體”，其可結合於IL-18分子並預防彼與IL18R之交 互作用。 在某些具體實施例中，本發明係關於包含” OPGL抗體 以及至少一個IL-1 8抑制劑之療法，以及使用該療法之治療 方法。在某些具體實施例中，包含OPG抗體以及IL-18抑 制劑以及至少一個額外的描述於此之分子進行治療。依據 某些具體實施例可治療的典型症狀，包括（但非限於）：發炎 、自體免疫疾病、IL-1調節的疾病、及TNF-調節的疾病。 據某些具體實施例，OPGL抗體以及至少一個IL-18抑制劑 可治療的典型的症狀，包括（但非限於）：關節炎、包括，但 非限於：類風濕性關節炎；全身性紅斑狼瘡（SLE);移植對 宿主之疾病（GvHD);肝炎；敗毒病；以及此類疾病伴隨的 骨質及軟骨的流失。 典型的IL-18抑制劑，包括（但非限於）：結合於IL-18之 抗體；結合於IL-18R之抗體；結合於IL-18RAcP之抗體； IL-18bp ; IL-18R斷片（例如，IL-18受體溶解的細胞外結構 區）；結合於IL-18並降低或預防與IL-18R交互作用之肽類 ;結合於IL-18R並降低或預防與IL-18或IL-18RAcP交互作 用之肽類；結合於IL-18RacP並降低或預防與IL-18R交互 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -55- 1276443 A7 B7 五、發明説明（d 作用之肽類；以及降低或預防IL-18產生或任何IL-18、 IL-18R、以及IL18RAcP之間交互作用的小分子。 某些 IL-18抑制劑描述於例如，美國專利第5,912,324 號，頒佈日期7月14日，1994 ; EP 0 962 531，發表於12月8日 ，1 999 ; EP 7 1 2 93 1，發表於11月15日，1994 ;美國專利第 5,9 14,253號，頒佈日期 7月 14 日，1 994 ; W0 97/24441 日，發 表於7月10日，1997 ;美國專利第6,060,2 83號，頒佈日期5月 9 曰，2000 ; EP 850 952，發表於 12 月 26 日，1996; EP 8 64 585 ，發表於9月16日，1 99 8 ; WO 9 8/4 1 232，發表於9月24曰， I 998 ;美國專利第6,054,487號，頒佈日期4月25日，2000 ; W09 9/09063 號，發表 8 月 14 日，19 97; WO99/227 60，發表於 II 月 3 日，1 997 ; W099/37772，發表於 1 月 23 日，1998 ; W099/37773，發表於 3月 20 日，199 8 ; EP 0 974 600，發表於 1月26日，2000 ; W〇00/1 2555，發表於3月9曰，2000 ;日本 專利申請案 JP 111，399/94，發表於10月31日，1 997 ;以色 列專利申請案IL 1 2 1 554 A0，發表於2月8日，1 998 ;全文在 此倂入參考文獻。 在某些具體實施例中，OPGL抗體可至少與一個治療發 炎的治療劑共同使用。在某些具體實施例中，OPGL抗體可 至少與一個治療免疫病症的治療劑共同使用。典型治療發 炎及免疫病症的治療劑，包括（但非限於）：皮質類固醇’包 括（但非限於）：脫氫皮（甾）醇；非類固醇的消炎的藥物 (NSAIDs)，包括（但非限於）：環氧合酶第1型（COX-1)以及環 氧合酶第2型（COX2 )抑制劑；疾病修飾抗風濕藥物 本紙張尺度適用中.國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
訂 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 -56 - 1276443 Α7 _____Β7_ 五、發明説明（d (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (DMARDs)，包括（但非限於）：甲胺蝶呤、羥基氯奎寧、氯 奎寧、環孢子菌素、金化合物（例如：金諾芬、金硫蘋果 酸鹽以及金硫葡萄糖）、及力夫諾賣（leflunoniide);第IV型 磷酸雙酯酶抑制劑，包括（但非限於）：羅力旁（r 〇 1 i p r a m)以 及本西法林（pentoxifyline);他克莫司（FK-506) ; Sirolimus( 納巴黴素）；麥考酚酸；5-脂肪加氧酶抑制劑，包括（但非限 於）：齊力同（Zileut0n);介白素_6(11^6)調節劑；38kDa有 絲分裂原-活化的蛋白質激酶（P38-MAPK)之小分子調節劑； 涉及發炎路徑之細胞內的分子的小分子調節劑，其中該細 胞內的分子包括（但非限於）：jnk、IKK、NF-kB、ZAP70,以 及Ick。某些治療發炎典型的治療劑描述於例如，C.A. D i n a r e 11 o and L.L. Molda wer Proinf lammatory and
Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis: A
Primer for Clinicians T h i r d Edition(2001)Amgen Inc. Thousand Oaks, CA。某些治療發炎及自體免疫疾病典型的 治療劑，包括（但非限於）：干擾素-γ(干擾素-γ)調節劑； OX40/OX40L調節劑（包括 0X40可溶解的形式）； 4-1 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 ΒΒ/4-1 ΒΒ配位體調節劑（包括4-1 ΒΒ可溶解的形式）；以及 Β-細胞細胞共同刺激路徑之調節劑，包括（但非限於）： CD28/B7 、 CD40/CD40L 、 IC0S/B7RP1 、及 AGP- 3/TACI/BAFFR(AGP-3可結合於TACT以及BAFFR受體）受體 配位體對之調節劑。某些B-細胞-T-細胞共同刺激路徑典型 的調節劑，包括（但非限於）：CD28、B7.1、及Β7·2(包括 Β7.1或Β7.2可溶解的形式，以及CTLA4可溶解的形式，二 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -57- 1276443 A7 B7 五、發明説明（5¾ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 者均可爲融合至異性的肽或蛋白質，經增加溶解度或循環 的半生期以降低或防止降解及/或增加半生期、降低毒性 、降低免疫產生性、或增加治療蛋白質的生物活性）之抑制 劑；CD40及CD40L(包括CD40可溶解的形式，其可融合至 異性的肽或蛋白質）抑制劑；ICOS以及B7RP1 (包括ICOS可 溶解的形式，其可融合至異性的肽或蛋白質）抑制劑、以及 AGP-3、TACT及BAFFR(包括TACT以及BAFFR可溶解的形 式）抑制劑。ICOS、B7RP1以及其抑制劑描述於例如 WO0 0/4 6 240。AGP-3、TACT 以及 BAFFR 以及其抑芾！j 齊！1 ，描 述於例如，WO00/47740、W00 1/85 872、W002/1 5273、 W098/39361 、以及 von Bulow and Bram( 1997) Science 278:138140 。 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 在某些具體實施例中，使用〇PGL抗體治療之骨骼流失 ，包括（但非限於）：起因於惡性或遷移性的腫瘤骨引起的溶 骨破壞之骨骼流失。在某些具體實施例中，可使用OPGL抗 體治療與癌症相關的骨骼流失。典型的癌症，包括（但非限 於）：乳房、前列腺、甲狀腺、腎臟、肺、食道、直腸、膀 胱、子宮頸、卵巢、以及肝癌、與胃腸道癌症。在某些具 體實施例中，OPGL抗體可用於治療相關於，例如某些血液 的惡性腫瘤，包括（但非限於）：多發性骨髓瘤及淋巴癌，包 括何傑金病，之骨骼流失。 在某些具體實施例中，可單獨投用OPGL抗體。在某些 具體實施例中，可投用OPGL抗體與至少一個其它的治療劑 ，包括（但非限於）：至少一個其它癌症治療劑。典型的癌症 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -58- 1276443 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 A7 B7 一___五、發明説明（5¾ 治療劑包括（但非限於）：輻射線治療以及化學治療。在某些 具體實施例中，化學治療可包含一種或多種以下之治療： 蒽土黴素、紅豆杉醇、他莫息芬、14-羥柔紅霉素、5-氟尿 嘧啶、及其它技藝上已知的藥物。在某些具體實施例中， 癌症治療劑是促黃體生成激素-釋放荷爾蒙（LHRH)拮抗劑。 在某些具體實施例中，LHRH拮抗劑是肽拮抗劑。 在某些具體實施例中，LHRH 拮抗劑包含肽： Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr )41-〇-0-八：^-1^}12(序列確認號碼：20)，其中仏1是3-(2-萘基） 丙胺醯基；4-Cl-Plie是（4’-氯苯基）丙胺醯基；Pal是3-(3'-吡 啶基）丙胺醯基；以及Lys(iPr)是Ν-ε-2丙基-離胺醯基。 在某些具體實施例中，LHRH拮抗劑是LHRH拮抗劑 十肽。某些典型的十肽類描述於例如，美國專利第 5,843,901號，全文在此倂入參考文獻。 依據某些具體實施例，典型的治療抗體包括（但非限於） :老鼠、老鼠-人類嵌合的、CDR-接枝、人類化的以及完整 的人類抗體、及合成的抗體，包括（但非限於）：篩選自抗體 基因庫之選擇的抗體。典型的抗體包括（但非限於）：結合於 細胞表面蛋白質Her2、CDC20、CDC33、類黏蛋白糖蛋白質 、及存在於腫瘤之細胞表皮生長因子受體（EGFR)、及在腫 瘤細胞上顯示可視需要誘發抑制細胞的及/或細胞毒性效應 蛋白質之抗體。典型的抗體亦包括 HERCEPTINtm (trastuzumab)，其可用以治療乳癌以及其它形式之癌症、及 RITUXANtm(里突西馬（rituximab))、ZEVALINTM(ibritumomab 本紙張尺度適用中.國國家標準(CNS ) A4規格（210Χ297ϋ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
-59- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（d tiuxetan)、及 LYMPH〇CIDETM(epratuzumab)，其可用以治療 非郝氏（Hodgkin’s)淋巴癌以及其它形式之癌症。某些抗體 之實例亦包括 ERBITUXtm(IMCC225)、BEXXARTM(碘 131 tositumomab)、及 Campath 〇 在某些具體實施例中，癌症治療藥劑爲多胜肽，其可 選擇性地誘發腫瘤細胞之細胞凋亡，包括（但非限於）：與 TNF-相關的多肽TRAIL· 〇在某些具體實施例中，可在投用 癌症治療藥劑之前、同時及之後投用OPGL抗體進行治療。 在某些具體實施例中，可預防性的投用OPGL抗體以預防或 減輕遷移性的癌症造成之骨骼流失的開始作用。在某些具 體實施例中，可投用OPGL抗體治療由於腫瘤移轉而存在的 骨骼流失症狀。 在某些具體實施例中，可使用OPGL抗體預防及/或治 療相關於多發性骨髓瘤之骨骼流失及/或爲預防及/或治療疾 病本身。多發性骨髓瘤是源自B細胞的腫瘤，可導致顯著 的發病率及/或死亡率。在某些實例中，多發性骨髓瘤的臨 床表現形式爲病灶性骨骼流失，其係起因於在病灶區域增 加破骨細胞活化。許多骨髓癌病人具有輻射分析可見的骨 頭損害以及經歷骨骼疼痛。在某些實例中，骨髓癌病人涉 及的骨頭易患有自發性或由損傷引起之病理性骨折。在某 些實例中，發生於骨髓癌期間之骨骼（尤其是脊椎骨）損害不 僅會導致骨折，且亦導致畸形狀態並偶爾會神經壓縮。在 一些病患中，會發生病理性的血鈣增加（高鈣血症），並可於 疾病治療期間引起顯著的問題。在某些具體實施例中，可 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -60- 經濟部智慧財產局g(工消費合作杜印製 276443 A7 A7 B7五、發明説明（5¾ 對病人投用OPGL抗體以降低或阻塞骨質重吸收並釋放鈣， 其可降低骨折風險及脊髓的畸形狀態。 在某些實例中，骨髓癌細胞不會直接的破壞骨頭，但 會產生細胞外的信號導致破骨細胞分化及活化。在某些實 例中，破骨細胞會產生高含量之細胞激動素IL-6，尤其是 當彼被活化時。IL-6爲B-細胞生長因子，並在活體外可促 使鼠科動物以及人類骨髓癌細胞生長。骨髓癌細胞亦可直 接或間接的產生OPGL，其可導致骨髓細胞癌周圍包埋在骨 髓空間的局部骨質溶解。在某些實例中，相鄰骨髓癌細胞 的正常的破骨細胞可產生IL-6，其可導致腫瘤細胞局部 的擴張。骨髓癌細胞係以株系的方式擴張並可占領因不適 當的骨質重吸收所產生的骨空間。 目前已觀察到對齧齒動物投用OPG破骨細胞族群可誘 發快速死亡（參閱例如，Lacey et al.(2000)Am. J. Pathol.. 1 57:435-448)。降低破骨細胞之數目可阻礙鈾骨細胞增加 IL-6產生之效應，並可因此影響小樑骨內骨髓癌細胞之生長 及倖存。因此，在某些具體實施例中，對骨髓癌病患投用 OPGL抗體不僅可阻塞骨質過度之重吸收，且亦可影響腫瘤 本身之擴張及倖存。 B-細胞可表現OPGL、ODAR受體。骨髓癌細胞亦可表 現ODAR，並可產生OPGL。在某些實例中，同時表現 OPGL及ODAR的細胞族群可產生影響骨髓癌細胞倖存之自 分泌刺激。因此，在某些具體實施例中，投用OPGL抗體可 降低腫瘤細胞倖存，從而降低或排除骨髓癌病患之腫瘤。 請 先 閲 面 之 注 意 事 項 再
頁 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -61 - 1276443 ΑΊ
蛋白酶（MMP)調節劑；一氧化氮合成酶（N〇s)調節劑，包括 誘發性NOS的調節劑；糖皮質激素受體調 ^ 〜，楚胺酸鹽 受體調節劑；脂多糖（LPsm量之調節劑；以 請 先 閱 讀 背 之 注 意 事 項 再i 填< 舄 本 頁 a〒w上腺 素以及調節劑以及其模仿劑。 在某些具體實施例中，可接受的調配物材料較佳者爲 在使用劑量及濃度下無毒性的接受者。 訂
經濟部智慧財產局a(工消費合作社印製 在某些具體實施例中，藥學組成物可含有修飾、維持 或防腐之調配物材料，例如：酸鹼度、體積莫耳滲透濃度 、黏度、透明、著色、等張性、氣味、殺菌、穩定、溶解 或釋放速率、組成物吸附或穿透劑。在某些具體實施例中 ，適用之調配物材料，包括（但非限於）：胺基酸（例如：甘 胺酸、麩胺醯胺酸、天門冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸）；抗 菌劑；抗氧化劑（例如：抗壞血酸、硫酸氫鈉或氫_亞硫酸鈉 )，緩衝丨谷液（例如·棚酸鹽、重碳酸鹽、T r i s - H C1、棒樣酸 鹽、磷酸鹽或其它有機酸）；膨脹劑（例如：甘露糖醇或甘胺 酸）；螯合劑（例如：乙二胺四乙酸（EDTA));複合劑（例如·· 咖啡因、聚乙烯基吡咯烷酮、β _環糊精或羥基丙基-p _環糊 精）；填充劑；單糖；雙糖類；以及其它碳水化合物（例如： 葡萄糖、甘露糖或糊精）；蛋白質（例如··血淸白蛋白、明膠 或免疫球蛋白）；著色劑、矯味劑以及稀釋藥劑；乳化劑 ;親水性的聚合物（例如聚乙烯基吡咯烷酮）；低分子量多 胜肽；形成鹽之反離子（例如鈉）；防腐劑（例如：氯化苄烷 銨、苯甲酸、水楊酸、局部抗菌劑、苯乙醇、仲班烯、仲 班烯、氯己定、己二烯酸或過氧化氫）；溶劑（例如：甘油、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X297公釐） -63- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ 丙二醇或聚乙二醇）；糖醇類（例如：甘露糖醇或山梨糖醇） ;懸浮劑；表面活性劑或溼化劑（例如：聚醣醛酸、PEG、 山梨糖醇酐酯類、聚山梨酸酯，例如：聚山梨酸酯20、聚 山梨酸酯80、（表面活化劑，商品名、多米胺（tromethamine) 、卵磷脂、膽固醇、tyloxapal);穩定性促進劑（例如：蔗糖 或山梨糖醇）；張力促進劑（例如：鹼金屬鹵化物，較佳者爲 氯化鈉或氯化鉀，甘露糖醇山梨糖醇）；傳遞載劑；稀釋 劑；賦形劑及/或醫藥學的佐劑。Remington’s Pharmaceutical Sciences,18th Edition,A.R.Gen n aro,ed.,Mack Publishing Company(1990) o 在某些具體實施例中，OPGL抗體及/或治療分子可聯 結於技藝上已知的半生期延續載劑。該載劑包括（但非限於） :Fc結構區、聚乙二醇、及右旋聚醣。該載劑描述於例如 ，美國申請案序號 〇9/428,082以及發表的PCT申請案 WO99/2 5 044，全文在此并入參考文獻。 在某些具體實施例中，取決於例如，預期的投藥路徑 、傳遞形式及所要求的劑量，熟悉此技藝的專業人士可測 定最理想的藥學組成物。參閱例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences，supra。在某些具體實施例中，該組 成物可影響本發明抗體之物理狀態、穩定性、活體內釋放 速率及活體內淸除率速率。 在某些具體實施例中，藥學組成物中之一級載劑或載 體可具有水溶性或非水溶性之本質。例如，在某些具體實 施例中，適當的載劑或載體可爲注射用水、生理鹽水溶液 本紙張尺度適用中國國家標準( CNS ) A4規格（210x297公釐） " ~ -64 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 ______B7__五、發明説明（d 或人造的腦脊髓液，可能在組成物中補充不經腸道的給藥 方法之其它共同的材料。在某些具體實施例中，混合血淸 白蛋白之中性緩衝的生理食鹽水或生理食鹽水是進一步典 型的載劑。在某些具體實施例中，藥學組成物包含三羥甲 基胺基甲烷緩衝液（酸鹼度約7.0-8.5)，或乙酸鹽緩衝液（酸 鹼度約4.0-5.5)，可進一步的包括山梨糖醇或其適當的取代 物。在某些具體實施例中，包含〇PGL抗體、含或不含至少 一個額外治療劑之組成物，可經攪拌具有所要求之純度的 選擇組成物與選擇性的調配物藥劑（Remington，s Pharmaceutical Sciences，supra)以冷凍乾燥的糕餅或水溶液 的形式加以製備貯藏。此外，在某些具體實施例中，包含 OPGL抗體、含或不含至少一個額外治療劑的組成物，可使 用適當的賦形劑，例如蔗糖，調製成冷凍乾燥物。 在某些具體實施例中，本發明藥學組成物可選擇性的 進行非經腸的傳遞。在某些具體實施例中，組成物可選擇 性的進行吸氣傳遞或經由消化道例如口服地傳遞。製備該 醫藥學上可接受的組成物爲熟知的技藝。 在某些具體實施例中，調配物成份是以投藥位點可接 受的濃縮形式存在。在某些具體實施例中，緩衝溶液係用 於使組成物維持在生理的酸鹼度之下（或稍低的酸鹼度），典 型地酸鹼度範圍約5至8。 在某些具體實施例中，當考慮不經腸道的方法給藥時 ，治療的組成物可爲不含熱原、包含所要求的OPGL抗體（ 含或不含額外的治療劑）非經腸地可接受的水溶液、內含醫 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁}
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -65- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（d 藥學上可接受的載劑形式。在某些具體實施例中，非經腸 注射的載劑爲滅菌之蒸餾水，其中〇pGL抗體（含或不含至 少一個額外的治療劑）係調製成滅菌、等張、適於保存之溶 液。在某些具體實施例中，製劑可包含所要求的分子調配 物與藥劑’例如：注射微球體、生物腐鈾性顆粒、聚合的 化合物（例如聚乳酸或聚乙醇酸）、圓珠或脂球體，其可於儲 藏處注射運送後控制產物釋放或延釋。在某些具體實施例 中，亦可用玻尿酸，以及延長循環中之效應。在某些具體 實施例中，可使用可植入的藥物傳遞裝置引進所要求的分 子。 在某些具體實施例中，藥學組成物可調製成吸入形式 。在某些具體實施例中，OPGL抗體（含或不含至少一個額 外的治療劑）可調製成進行吸氣之乾燥粉末。在某些具體實 施例中，包含OPGL抗體（含或不含至少一個額外的治療劑） 之吸氣溶液可與進行氣溶膠傳遞之推進劑共同調製。在某 些具體實施例中，溶液可爲霧化的溶液，肺部的投藥進一 步的描述於PCT申請案PCT/US94/001 875，該案描述經化 學修飾之蛋白質的肺部傳遞。 在某些具體實施例中，調配物可口服投用。在某些具 體實施例中，用此方式投用的OPGL抗體（含或不含至少一 個額外的治療劑），可與或不與慣常用於固體劑量形式（例如 藥片及膠囊）之配料載體調製。在某些具體實施例中，膠囊 可設計成在生物效性最適化及前全身性降解最小化之胃腸 道釋放活性部份的調配物。在某些具體實施例中，至少一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -66- 276443 A7 B7 五、發明説明（d 個額外的藥劑可包括增進〇PGL抗體吸收及/或任何額外的 治療劑。在某些具體實施例中，亦可使用稀釋劑、調味劑 、低熔點蠟、植物油、潤滑劑、懸浮劑、藥片崩解劑及結 合劑。 在某些具體實施例中，包含有效量的OPGL抗體（含或 不含至少一個額外的治療劑）之藥學組成物，可混合適用於 藥片製作之無毒的賦形劑。在某些具體實施例中，將藥片 溶解於滅菌水，或另一適當的載劑，可製備單位-劑量形式 之溶液。在某些具體實施例中，適當的賦形劑包括（但非限 於）：惰性稀釋劑，例如：碳酸鈣、碳酸鈉或重碳酸鹽、乳 糖、或磷酸鈣；或黏結劑，例如：澱粉、明膠、或阿拉伯 膠；或潤滑的藥劑，例如：硬脂酸鎂、硬脂酸、或滑石粉 請 先 閱 背 之 注 意 事 項 再 填 寫 本 頁 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 額外的藥學組成物則爲熟悉此技藝的專業人士所熟知 ，包含OPGL抗體（含或不含至少一個額外的治療劑）之調配 物內可包括長效-或控制傳遞之調配物。在某些具體實施例 中，調製各種其它長效-或控制-傳遞裝置，例如脂球體載體 、生物腐蝕性的微顆粒或多孔的圓珠以及儲藏處注射劑之 技藝亦爲熟悉此技藝的專業人士習知的技藝。參閱例如， PCT申請案PCT/US93/00829，其係描述以多孔的聚合微顆 粒控制釋放藥學組成物之傳遞。在某些具體實施例中，長 效-釋放製劑可包括使物品定形之半滲透聚合物基質，例如 膜、或微膠囊。延釋基質可包括：聚酯、水凝膠、聚丙內 酯（美國專利3,773,9 19及EP 058,48 1)、L-麩胺酸以及Y-乙 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X29*7公釐） -67- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（ 基-L 麩胺酸鹽共聚物（Sidman et al.，Biopolymers，22: 547-556( 1983))、聚（2-羥基乙基異丁烯酸酯）（Langer et al·， J· Biomed. Mater. Res·，15:167-277( 198 1)及 Langer，Chem· Tech·，1 2:98- 105( 1 982))、乙烯醋酸乙烯酯（Langer et al·， supra)或聚_D(-)-3-羥基丁酸（EP 1 33,988)。在某些具體實施 例中，延釋組成物亦可包括脂球體，其可用任何技藝上已 知的方法製備。參閱例如，Eppstein et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688-3692( 1 985) ; EP 036,676 ； EP 088,046以 及 EP 143,949。 活體內投藥的藥學組成物一般爲滅菌之藥學組成物。 在某些具體實施例中，此可經滅菌之過濾膜過濾完成。在 某些具體實施例中，組成物可爲冷凍乾燥之組成物，使用 此方法之滅菌可在冷凍乾燥法及重新調製之前或之後進行 。在某些具體實施例中，不經腸道的給藥方法的組成物可 以冷凍乾燥或溶液的形式儲存。在某些具體實施例中，非 經腸組成物一般係置於具有滅菌入口之容器，例如：具有 皮下注射針可穿刺的塞子之靜脈溶液袋或管形瓶。 在某些具體實施例中，一旦調製藥學組成物，彼可爲 溶液、懸浮液、凝膠、乳劑、固體、或作爲脫水或冷凍乾 燥的粉末儲存於滅菌之管形瓶。在某些具體實施例中，該 調配物可儲存成即用形式或在投藥之前重組的形式（例如： 冷凍乾燥的形式）。 在某些具體實施例中，本發明係關產生單一劑量投藥 單位之組套。在某些具體實施例中，組套可各自含有具有 ^紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇><297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
-68- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（4 乾燥蛋白質之第一容器及具有水溶性調配物之第二容器。 在本發明某些具體實施例中，組套中可包含內含單一及多 室的預裝入注射器（例如，液體注射器及乾粉注射器）。 在某些具體實施例中，包含OPGL抗體（含或不含至少 一個額外的治療劑）之藥學組成物，其治療上之有效量視治 療的內容及目標而定。熟悉此技藝的專業人士將認知依據 某些具體實施例治療的適當劑量，將（部份地）視運送的分子 、OPGL抗體（含或不含至少一個額外的治療劑）治療的適應 症、投藥路徑、及病患之大小（體重、身體表面或器官之大 小）及/或條件（年齡及一般的健康狀況）而變化。在某些具體 實施例中，醫師可效價劑量及修飾投藥路徑以取得最理想 的治療效果。在某些具體實施例中，取決於上述的因子， 有代表性的劑量介於約0.1微克/公斤至約100毫克/公斤或 更多。在某些具體實施例中，劑量可介於0.1微克/公斤至 約 100毫克/公斤；或1微克/公斤至約 100毫克/公斤；或5 微克/公斤至約 100毫克/公斤。 在某些具體實施例中，投服頻率將視調配物中〇PGL抗 體及/或任何額外的治療劑之藥物動力學參數而定。在某 些具體實施例中，醫師將可操作組成物直到劑量達成所要 求的效應。在某些具體實施例中，組成物可在一段時間內 以單一劑量，或兩種或多種劑量的形式投用（可含或不含有 相同量的所要求的分子），或經植入裝置或導管連續灌入。 熟悉此技藝的專業人士可例行的進一步的定義適當的劑量 ，且此爲其工作之範圍。在某些具體實施例中，經由使用 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐) ' -69- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1276443 A7 _____ B7_ 五、發明説明（& 適當的劑量反應數據可確定適當的劑量。 在某些具體實施例中，藥學組成物之投藥路徑可依據 已知方法’例如口服、經由靜脈內的、腹腔內的、大腦內 的（薄壁組織內的）、腦室內的、肌肉內的、眼睛內的、動脈 內的、門靜脈內的、或損害內的路徑注射；經延釋系統或 經植入裝置投用。在某些具體實施例中，組成物可經大量 注射或連續地灌入、或植入裝置投用。 在某些具體實施例中，組成物可經已吸收或封包所要 求的分子植入膜、海綿或另一適當的材料局部的投用。在 某些具體實施例中，使用植入裝置時，裝置可植入任何適 當的組織或器官，並經擴散、時間性的釋放團塊、或連續 投藥，以傳遞所要求的分子。 在某些具體實施例中，可爲令人滿意的以體外的方法 使用包含OPGL抗體（含或不含至少一個額外的治療劑）之藥 學組成物。在該實例中，從病患移除之細胞，組織及/或器官 可暴露至包含OPGL抗體（含或不含至少一個額外的治療劑) 之藥學組成物，之後將細胞，組織及/或器官植回病患。 經濟部智慧財1局W工消費合作社印製 在某些具體實施例中，OPGL抗體及/或任何額外的治 療劑可植入某些使用本文描述之方法遺傳工程構建的表現 及分泌多胜肽之細胞，加以運送。在某些具體實施例中， 該細胞可爲動物或人類細胞，以及可爲自體移植的，異性 的，或異種的細胞。在某些具體實施例中，細胞可爲永生的 細胞。在某些具體實施例中，爲了降低偶然性免疫反應的 機會，可封包細胞避免其滲入周圍的組織。在某些具體實 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -70 - 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _____ B7五、發明説明（ 施例中’封包材料一般爲允許蛋白質產物釋放，但可預防 病人的免疫系統或周圍組織的其它有害因子破壞細胞之生 物相容的，半滲透的聚合性外膜或膜。 實施例 下列實施例，包括進行之實驗以及結果係用以說明而 非限制本發明。 實施例1選殖aOPGL-Ι重鏈及輕鏈 用表現全長人類OPGL互補型DNA之CHO細胞來對內 含人類免疫球蛋白基因之導入外來基因的老鼠進行免疫。 將免疫老鼠的淋巴結與鼠科動物骨髓癌細胞融合產生融合 瘤。將融合瘤細胞株之懸浮液進行酵素聯結免疫抗體檢測 法，測定可與人類OPGL反應之抗體。表現抗-OPGL抗體之 融合瘤細胞株AMG6.5、AMG6.4、及AMG6.1可表現高親和 性之抗OPGL抗體（Kd’s分別爲0.28毫微莫耳濃度、0.29毫微 莫耳濃度、以及0.23毫微莫耳濃度），選擇AMG6.5進行選殖 。AMG6.5及AMG6.4選殖之重鏈及輕鏈互補型DNA倶爲相 同，用 AMG6.5選殖a〇PGL-l輕鏈互補型DNA，而用 AMG6.4選殖a〇PGL-l重鏈互補型DNA。 選殖a〇PGL-l輕鏈 使用PCR放大方法，從AMG6.5之總RNA製備的第一 股互補型DNA得到a〇PGL-l κ輕鏈變異區。使用具有延伸 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -71 _ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 [276443 A7 B7 __五、發明説明（^ 的5’-接合器之隨機引子 (5.-GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT-3,（序歹!J 確認號碼： 15))以及 Gibco Superscript II TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis kit(cat. no. 1 8089-01 1)提供之材 料及方法，從AMG6.5之總RNA製備第一股互補型DNA。 PCR係使用以下之寡核苷酸： 5’kRACE 引子： 5’-GAT GAC CCA GTC TCC AGC CAC CCT G - 3,（序歹!J確言忍 號碼：5) 3，kRACE 引子： 5，-AAG GGT CAG AGG CCA AAG GAT GG - 3’（序歹!1 確言忍號石馬 ••6) 將放大的DNA選殖入pCRII-T〇P〇（Inviti-〇gen)，並對產 生的質體進行定序。使用κ鏈之保留性序列設計引子進行 PCR，放大全長之a〇PGL-l κ鏈。在5，a〇PGL-1 κ引子上 加上Xbal位點（TCTAGA)以進行選殖以及在起始子Met密 碼子之前加上一個"CCACC” Kozak序列。在3· a〇PGL-l κ 引子上之終止密碼子之後加上一個Sa/I位點（GTCGAC)以進 行選殖。 5’a〇PGL-lK 弓[子： 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 5'-CAA CTC TAG A CC ACC ATG GAA ACC CCA GCG-3' (SEQ ID NO: 7) X6al 位點 Kozak ΜΕΤΡΑ (SEQ ID NO: 16) 3, a〇PGL-l κ 弓| 子： 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -72- 經濟部智慈財產局Μ工消費合作社印製 1276443A7_B7_ 五、發明説明（ 5，-丁丁丁 GAC GTC GAC TTA TCA ACA CTC TCC CCT GTT GAA G -3/ (SEQ ID NO: 8) Sa/I 位點 * ★ C E G R N F (SEQIDN〇：17) 使用AMG6.5第一股互補型DNA依上述之說明，用5’及 3’ a〇PGL-l κ引子進行PCR放大，得到全長a〇PGL-lK鏈互 補型DNA之選殖株。PCR反應產生編碼aOPGL-Ικ鏈之235 個胺基酸殘基（包括20個胺基酸之κ鏈信號序列）之738個鹼 基對的斷片（圖4，序列確認號碼：4)。使用QIAquick PCR Purification kit(Qiagen cat. ηο·28104)純化後，用此斷片建築 κ輕鏈表現載體。 將上述產生之73 8個鹼基對的全長1<斷片用\631及33/1 水解，使用 Pjomega Wizard DNA Clean-Up System(Promega cat.no.A7100)純化，一倂選殖入 pDSRal9產生質體 a〇PGL-l-K/pDSRal9(圖5)。pDSRot 19已描述於前（參閱 W〇 90/14363，全文在此倂入參考文獻，（參閱例如圖12))。簡言 之，爲了製作pDSRal9，先將pDSRa2以下方式修飾··將 FSH poly A縮短約1400鹼基對至8 85鹼基對，並終止於Ndel 位點；將雙氫葉酸還原酶（DHFR)啓動子從5’端縮短約1仟鹼 基至209鹼基對；並從DHFRpoly A序列刪除大約550鹼基對 之Bglll斷片。 定序以證實表現aOPGL-Ικ輕鏈之選殖菌落與AMG6.5 融合瘤編碼相同的肽。最終表現載體（a〇PGL-l-K/pDSRal9) 具有5476個鹼基對，並含有7個功能的區域，如表2。 本纸張尺度適用中國國家標準（cns ) A4規格（210X 297公釐） -73- 1276443 A7 B7 五、發明説明（71 表2: a〇PGL-l-lK/pDSRal9之特色 質體之鹼基 對數目 2至881 來自牛腦下垂體糖蛋白質激素a-次單體 (a-FSH)之轉錄終止/聚腺苷酸化作用信號 (Goodwin, et al, Nucleic Acids Res. 1983 1 1: 6873-82; Genbank 寄存編號 X〇〇〇〇4) 882至2027 內含內生性老鼠DHFR啓動子、互補型DNA 編碼序列、及DHFR轉錄終止/聚腺苷酸化作 用信號（Gasser et al，Proc Natl Acad Sci U S A. 1982 79:6522-6.; Nunberg et al, Cell 1980 19:355-64; Setzer et al, J Biol Chem. 1982 257: 5143-7; McGrogan et al, J Biol Chem. 1985 260: 2307-14)之老鼠雙氫葉酸還原酶（DHFR)迷 你基因。 203 1至3947內含抗氨比西林標識基因以及大腸桿菌質體 複製起點之PBR322序列（Genbank寄存編號 J01749) 3949至4292 SV40早期啓動子、強化子以及複製起始點 (Takebe et al，Mol Cell Biol. 19888: 466-72， Genbank 寄存編號 102400)。 (請先閲讀背面之注意事項再瑣寫本頁) 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 4299至4565來自人類促Τ淋巴球增生病毒-1 LTR結構區 的轉譯強化子元件（Seiki et al，Proc Natl Acad Sci U S A. 1 983 80: 361 8-22，Genbank 寄存 編號：T02029) 4574至4730來自SV40 16S之內子，19S接合供體/受體 信號（Okayama and Berg，Mol Cell Biol. 1983 3:280-9，Genbank 寄存編號 J02400)
4750至5476介於Xbal以及Sa/I位點間之a〇PGL-l K輕 鏈互補型DNA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -74 [276443 Μ Β7 五、發明説明（72> 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 圓形的質體圖譜載體展示於圖5.。 選殖a〇PGL-l重鏈 用取自 Clontech MarathonTM cDNA Amplification Kit(cat. no· K1 802- 1)製作之AMG 6.4融合瘤雙股互補型DNA選殖 a〇PGL-l IgG2重鏈。用互補型DNA端5’及3’快速放大技 藝（RACE)、人類生殖株IgG2重鏈恆定區專一的引子（展示於 下）以及RACE引子以及其它材料以及Marathon TM互補型 DNA放大組套提供之方法，放大AMG 6.4之重鏈互補型 DNA。 5，IgG2RACE 弓丨子 5，-GGC ACG GTC ACC ACG CTG CTG AG -3’（序歹!1 確 |忍號石馬 :9) 3，IgG2RACE 弓丨子 5，-CCT CCA CCA AGG GCC CAT CGG TCT -3,（序歹[J 確認號碼 :10) 將600個鹼基對之5’ RACE產物以及1 200個鹼基對之3’ RACE產物選殖入pCR2.1(Invitrogen)及定序。此序列資料可 用以設計選殖a〇PGL-l重鏈全長序列的專一性引子。重鏈 之Y引子^ a〇PGL-l IgG2引子）爲同義股並具有Hind/II位 點，並在天然的起始位點之前有一致性的Kozak序列。重 鏈之3’引子（3’ a〇PGL-l IgG2引子）是反股引子，含有Sa/I 位點並在重鏈IgG2序列的最後一個胺基酸之後含有終止密
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇>< 297公釐） -75- 1276443 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 A7 B7__五、發明説明（73、 碼子。 S’aOPGL-l IgG2弓[子： 5'- CAGAAGCTTGAg£ACC ATG GAG 丁丁丁 GGG CTG AGC 丁GG CTT TTT CT丁 G丁G GC _ 3， (SEQIDNO: 11) Hind\\\ Kozak Μ E F G L SWLFLVA (SEQIDNO: 18) 3’ a〇PGL-l IgG2引子： 5，- GCA TGTCGAC TTA TCA TTT ACC CGG AGA CAG GGA GAG - 3，（SEQ ID NO: 12) Sail * ★ K G P S L S L (SEQ ID NO: 19) 用上述雙股的互補型DNA，以5’-以及3’-a〇PGL-l IgG2 引子經PCR放大產生全長重鏈互補型DNA。PCR產生一個 編碼a〇PGL-l IgG2重鏈蛋白質467個胺基酸殘基（包括19個 胺基酸之IgG信號序列）（圖2，序列確認號碼：2)之1433個 驗基對的斷片。使用 QIAquickPCRPurification kit(Qiagen cat. no.28 1 04)純化後，用此斷片建築以下之重鏈表現載體 〇 將上述產生之編碼全長 IgG2重鏈之DNA斷片用 Hind/II 以及 SaH 水解，使用 QIAquick Gel Extraction 1^((^&£611〇&^〇.287〇4)純化，並將此斷片選殖入0〇3&〇(19 。產生的表現質體名稱爲a〇PGL-l-IgG2/pDSRal9(圖6)。除 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 76- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 __ B7___五、發明説明（74 1 了 a〇PGL-l IgG2重鏈互補型DNA在Xbal及Sa/I位點之間 代替aOPGL-Ικ輕鏈互補型DNA之外，所有載體之成份與 a〇PGL-l-K/pDSRal9載體相同。將a〇PGL-l IgG2重鏈表現 選殖菌落株系定序，證實與AMG6.4融合瘤編碼的多肽相同 實施例2 於CH〇細胞中表現a〇PGL_l 將 a〇PGL-l-K/pDSRal9及 a〇PGL-l -IgG2/pDSRa 19質體 共同轉染入缺乏雙氫葉酸還原酶（DHFIO的中國倉鼠卵巢細 胞（(：11〇八]\4-1/〇，美國專利第6,210,924號），分離及測試各個 菌落後，穩定的表現a〇PGL-l抗體。 在轉染之前（第0天），將100毫米之組織培養盤中種植入 1·5χ106之AM-1/D細胞，並生長於 CHOd·培養液（DMEM-高 葡萄糖、10%胎牛血淸、1%青黴素/鏈黴素/麩胺醯胺酸、IX 丙酮酸鈉、1%非必需胺基酸（NEAA))(Gibco®)以及l%ht補 充劑（Gibco®))。於第一天，將400微升不含血淸的RPMI 1 640培養液（GibcoO)等量分裝於12x75亳米之聚丙烯管。在 培養液中逐滴加入24微升之 TransIT®-LTl試劑（Mirus Corporation)，混合物在室溫下反應10分鐘。.在混合物中逐 滴加入總共15微克之線性化質體DNA(7.5微克之a〇PGL-1-|</口03尺〇(19以及7.5微克之〇(〇？〇乙-1-12〇2/?0311〇(19，？7111 水解），在室溫下反應1 0分鐘。 移除CH0d_培養液，將細胞用1〇毫升Dulbecco’s磷酸 鹽緩衝的生理食鹽水（Gibco®)淸洗。細胞培養液中加入6毫 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X297公釐） -77- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 B7 五、發明説明（75、 升不含血清補充 HT、L-glu、NEAA、以及丙酮酸鈉 (Gibco®)的MEM培養液。平板中逐滴加入DNA/LT1複合物 ，前後輕柔的搖動以均勻地分散細胞上之DNA。置於組織 培養培養箱6小時之後，培養液用新鮮的CHOcT培養液取代 。5 8小時後，將細胞分入十個內含CH〇選擇培養液（DME^I 高葡萄糖，10%透析的胎牛血淸（FIBS)，1%青黴素/鏈黴素/ 麩胺醯胺酸，1%非必需胺基酸及IX丙酮酸鈉）（Gibco®)之 100毫米培養盤。每週更換培養液兩次，直到出現株系爲 止。 於10-14天之後，使用浸泡lx胰蛋白酶-EDTA(Gibco®) 之5毫米之選殖盤（Labcore®)挑選株系並用內含CH〇選擇培 養液之24孔組織培養板培養。當細胞長滿後，加入不含血 淸的培養液（不含FBS之CH0選擇培養液），於48小時後收 集。用西方轉漬法以辣根過氧化酶（HRP)共軛結合的山羊抗-人類IgG Fc抗體（Pierce，Rockford，IL)分析此類條件化的培 養液中抗體之表現，偵測a〇PGL-l重鏈、及山羊抗-人類κ 鏈抗體（Pierce，Rockford，IL)，接著用HRP-共軛結合的兔子 抗-山羊免疫球蛋白克（H + L)抗體（Pierce，Rockford, IL)偵測 aOPGL-1輕鏈。挑出表現最高的株系進行生長及及儲存於 液態氮。 實施例 3產生a〇PGL-l 製備及創造細胞株125Q 在96孔測試盤中於不含血淸的條件下，經二次限制稀 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -78- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（作、 釋，選殖產生a〇PGL-l之CHO細胞。株系的選擇係基於彼 可各種懸浮容器中生產及生長之特性。進行EIA以選擇 a〇PGL-l產量最高之株系。然後將株系生長在1〇〇毫升、250 毫升、500毫升、1升、及3升旋轉燒瓶、與3升Aplikon生 物反應器中，測量生長特性，包括倍增時間及密度。選擇 加倍時間最快到達最高密度之株系，稱爲細胞株1 25Q。當 株系擴增至產生足以將大約1 X 107細胞/毫升之數目的細胞冷 凍於 360個注射液瓶之數目時，將細胞再懸浮於防凍劑、 不含血淸的培養液（90% VM大豆批次培養液（參閱表3)，補 充1 0毫升/升非必需胺基酸及10毫升/升L-麩胺醯胺酸 (Gibco/LTI/Invitrogen)，及 10%二甲（基）亞颯（JT Baker))並加 以冷凍。將注射液瓶授權使用之設備中並浸在內含液態氮 之液態氮杜瓦瓶。 以小量旋轉瓶及大量生物反應器中之生長及產量爲計 ，選擇細胞株125Q製造a〇PGL-l。 細胞培養 用細胞株 125Q(從質體 a〇PGLl-K/pDSRal9及 a〇PGL-l -IgG2/pDSRal9 表現 a〇PGL-l 之 CH0 細胞株系）表 現及製作a〇PGL-l。製作a〇PGL-l之細胞培養方法展示於 圖19。每次生產時將來自管形瓶之細胞株125Q在lOOrpm下 先於內含補充10毫升/升非必需胺基酸及10毫升/升L-麩胺醯 胺酸（Gibco/LTI/Invitrogen)(VM 大豆 Supp)的 50 毫升 VM 大豆 批次培養液（組成物參閱表3)之1 25毫升歐尼麥爾搖動器中生 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中，國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -79- 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 [276443 A7 __B7_ __五、發明説明（77、 長5天。然後將全部的培養細胞種入內含vm大豆Supp之 5 0 0晕；升旋轉燒瓶（3 X 1 05活細胞/毫升（3 E 5 v c /毫升）），在 7〇rpm旋轉下生長3-4天。然後將500毫升旋轉燒瓶內全部的 培養細胞種入內含VM大豆Supp之3L旋轉燒瓶（3E5 vc/毫 升），在70rpm旋轉下生長3-4天。 然後將3L旋轉燒瓶內之培養細胞，分裝到兩個內含 VM大豆Supp(不含酚紅）之3升旋轉燒瓶（3E5 vc/毫升），在 相同的條件下生長。然後將此類旋轉燒瓶之培養細胞種入 內含 VM大豆Supp(不含酚紅）之四個額外的旋轉燒瓶 (3E5vc/毫升），在相同的條件下生長。將從4個3L旋轉燒瓶 得到的4公升培養細胞種入內含10升VM大豆Supp(不含酚 紅）之20升的生物反應器，生物反應器以進料-批次模式運轉 7-10天。在進料-批次模式中，加入內含濃縮培養液成份之 營養素進料（"進料"如以下之表3)以維持細胞生長及培養細 胞之存活力。 然後將20升生物反應器中全部的培養細胞種入內含70 升VM大豆Supp(不含酚紅）之150升生物反應器，生物反應 器以進料-批次模式運轉9-10天。最後，將150升生物反應器 中全部的培養細胞種入內含大約880升VM大豆Supp(不含 酚紅）之2000升生物反應器，生物反應器以進料-批次模式運 轉。進料-批次模式期間進料之速率由各生物反應器中葡萄 糖含量是否維持0.6克/升加以測定。每日測量細胞密度及葡 萄糖濃度，並據此調整進料速率。 2000升生物反應器中生產a〇PGL-l進行時間約二週 ， 請 先 閱 讀 背 面 之 注 意
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） - 80- 1276443 經濟部智慧財產局g(工消費合作杜印製 A7 __B7_五、發明説明（78〗 其間細胞組成地製作a〇PGL-l並分泌至細胞培養液。 設定酸鹼度、溫度、及溶氧量控制生產反應器：酸鹼 度爲7.0並用加入二氧化碳氣體及碳酸鈉控制；溶氧爲120毫 米汞柱並用通入空氣、氮、及氧氣加以控制。細胞全程維 持在37 °C。所有氣體均用孔隙度0.22微米或更低之濾膜過濾 〇 生產結束時，將細胞液體培養液送入圓錠堆疊離心機 ，分離細胞與上淸液。離心物進一步的用Cuno 90SP深濾 器、0.2微米之Posidyne濾器（Pall Co.)過濾。然後將澄淸的 條件化培養液使用50kD NMWL細胞膜（Millipore Biomax 50) 之正切的流動超過濾（UF)濃縮。條件化的培養液可濃縮15至 30倍。然後產生的條件化的培養液濃縮物（CCM)可純化加工 或冷凍後在以後純化。生產的過程總結於圖19。 細胞培養液 整個細胞培養過程使用的細胞培養液是以Dulbecco’s 經修飾之Eaglet培養培養液/Ham’s營養素F12(DMEM/F12 ，1 : 1)爲主，並含有補充量之胺基酸、額外的營養物以及 鹽類、大豆水解產物以及重組人類胰島素（Nucellin®Zn，Eli Lilly)。成份列於表3。此培養液稱爲VM-大豆。培養液在 使用之前經0.2微米孔隙度之濾膜過濾。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -81 - 1276443
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7 B 五、發明説明（79\ 表3.細胞培養液之成份 經濟部智態財產局員工消費合作社印製 基本培養液及FEEDS之成份 成份 VM大豆批次培養液 (毫克/升） FEED (毫克/升） DMEM/F12 成份 無機鹽類 CaCh(無水） 116.60 233.2 CUS〇4.5H2〇 0.0026 0.0052 Fe(N〇3)3.9H2〇 0.1000 0.2 FeS〇4.7H2〇 0.8340 1.668 KC1 311.80 623.6 MgCl2(無水） 57.280 114.56 MgSCM無水） 97.680 195.36 NaCl 905.990 1811.98 NaH2P〇4.H2〇 125.00 250 Na2HP〇4 142.040 284.08 ZnS〇4.7H2〇 0.8640 1.728 其它成份 D-葡萄糖 3151.00 1 2302 次黃_哈鈉 5.40 10.8 亞麻油酸 0.090 0.18 硫辛酸 0.2060 0.412 酚紅 8.10 16.2 腐胺.2HC1 0.1620 0.324 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210><297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再热馬本頁)
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-82- 1276443 A7 B7 五、發明説明（8一 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 丙酮酸鈉 110.00 220 胺基酸 L-丙胺酸 26.70 53.4 L-精胺酸HC1 295.00 590 L-天門冬醯胺酸.H2〇 45.00 90 L-天門冬胺酸 39.90 79.8 L-半胱胺酸.HC1.H2〇 35.120 70.24 L-胱胺酸.2HC1 62.580 125.16 L-麩胺酸 44.10 88.2 L-麩胺醯胺酸 657.00 1314 甘胺酸 52.50 105 L-組織胺酸.HC1.H2〇 62.950 125.9 L-異白胺酸 108.940 217.88 L-白胺酸 118.10 236.2 L-離胺酸HC1 182.50 365 L-甲硫胺酸 34.480 68.96 L-苯丙胺酸 70.960 141.92 L-脯胺酸 57.50 115 L -絲胺酸 73.50 147 L-蘇胺酸 106.90 213.8 L-色胺酸 18.040 3 6.08 L-酪胺酸.2Na.H2〇 111.580 223.16 L-纈胺酸 105.70 211.4 維生素 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐）
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7 B 五、發明説明（81, 經濟部智慈財產局員工消費合作社印製 生物素 0.0073 0.0146 D-泛酸鈣 4.480 8.96 膽鹼氯化物 17.960 35.92 葉酸 5.30 10.6 異-肌醇 25.20 50.4 菸醯胺 4.040 8.08 吡多醛HC1 4.00 8 吡多醇HC1 0.0620 0.124 核黃素 0.4380 0.876 噻胺鹽酸鹽 4.340 8.68 胸腺嘧u定 0.3635 0.727 維生素B12 1.360 2.72 額外的成份 Nucellin Zn，（rhu 胰島素） 5.00 15 亞硒酸 0.0050 0.015 乙醇胺 0.0012 0.0037 三碘甲狀腺胺酸 0.000040 0.00012 氫皮質酮 0.020 0.06 三價鐵檸檬酸鹽 122.450 122.450 聚醣醛酸F_68 1000.00 500 大豆水解產物 6000.00 6000.00 NaHCCh 3000.00 3000.00 NaCl 3500.00 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -84- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _B7___五、發明説明（阳、 純化方法 CHO細胞表現的a〇PGL-l係分泌至細胞外的培養液。 可使用一系列純化步驟產生純物質。使用之方法爲厭水性 的電價誘發、陽離子交換、及忌水性交互作用色層分析法 與低酸鹼度溶析之步驟以及病毒性的濾器。此類程序描述 如下。 A. 厭水性的電價誘發色層分析法（HCIC) 此色層分析法步驟可移除大多數的宿主細胞蛋白質及 DNA。將濃縮條件化的培養液（CCM)經由Cuno 30SP瀘器、 Cuno VR07帶電價的纖維素濾器過濾，然後載入MEP HyperCel樹脂。於荷載之後，管柱用平衡緩衝液（20毫莫耳 濃度三羥甲基胺基甲烷，酸鹼度7.2)淸洗。使用低酸鹼度 緩衝液（20毫莫耳濃度乙酸鈉，酸鹼度5.0)從樹脂溶析抗體 。從管柱溶析後，以280亳微米吸光度爲基礎收集會柱排放 之產物。 B. 病毒性的去活化 集中MEP溶析物，滴定至酸鹼度 3.7並保持大約60分 鐘去活化可能之反轉錄病毒。此步驟之後將酸鹼度調回至 大約6.0。 C. 病毒性的過濾 將調回酸鹼度之產物經由Millipo^ Viresolve NFR濾器 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） -85- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局Κ工消費合作社印製 五、發明説明（ 或當量的材料過濾。濾除抗體溶液中可能地^5〇亳微米之病 毒。 D·陽離子交換色層分析法（CEx) 抗體可進一步的使用 SP瓊脂糖 HP(Amersham Pharmacia)或相當的材料以陽離子交換色層分析法純化。陽 離子交換色層分析法步驟可移除額外的CHO細胞蛋白質、 DNA、較低的分子量蛋白質、及聚集形式的a〇pGL-1。將 集中的病毒過濾液裝入陽離子交換樹脂。於載入之後，管 柱用平衡緩衝液（20毫莫耳濃度NaMES，酸鹼度6.2)淸洗。 然後抗體用線性梯度增加的鹽溶液（20毫莫耳濃度NaMES， 酸鹼度6.2，〇莫耳濃度NaCl至20毫莫耳濃度NaMES，酸鹼 度6.2 ’ 0.3莫耳濃度NaCl)溶析。自管柱溶析後，以280亳微 米吸光度爲基礎收集管柱排放之產物。 E·忌水性交互作用色層分析法（HIC) 抗體進一步的使用苯基Toyopearl 650S(Tosoli Biosep)或 相當的材料以忌水性交互作用色層分析法純化。忌水性交 互作用色層分析法步驟是精鍊的步驟並可移除額外的CH〇 細胞蛋白質、DNA、較低的分子量蛋白質、以及聚集形式 之a〇PGL-l。荷載入管柱前，在集中的陽離子交換之溶析 物中於15-25°C下、加入硫酸銨使傳導度>105 mS/公分條件 化。於荷載之後用平衡緩衝液（1莫耳濃度磷酸鉀，酸鹼度8) 淸洗管柱。然後用線性的梯度降低鹽濃度（1莫耳濃度磷酸 (請先閲讀背面之注意事項再_馬本頁) I·
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本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 86- 1276443 A7 B7 五、發明説明（84\ 鉀，〇毫莫耳濃度三羥甲基胺基甲烷，酸鹼度8至0莫耳濃 度憐酸鉀，20毫莫耳濃度三羥甲基胺基甲烷，酸鹼度8)溶 析抗體。自管柱溶析後，以280亳微米吸光度爲基礎收集 管柱排放之產物。 F·濃縮及透析過濾 將集中的HIC管柱溶析物使用50kD NMWL細胞膜 (Millip〇re Biomax 50)經正切的流動超過濾濃縮及透析過濾 成調配緩衝液。調配緩衝液包括10毫莫耳濃度乙酸鹽、5% 山梨糖醇、酸鹼度5.2以及aOPGL-Ι爲30毫克/毫升。 最終之過濾及貯藏 純化的產物通過0.22微米之PVDF瀘器（Millipore)，採 樣並儲存於大約-30°C下之安全的冰箱內。 實施例 4 a〇PGL-l之結合特異性 轉染實施例1及2的二種表現載體之CHO細胞製作之抗 體，可用於以下之實施例4、5及6。 人類0PG可結合及中和大白鼠、小鼠及獼猴、與人類 的0PGL。a〇PGL-l可高親和性的結合人類〇PGL，但不會 顯著的結合鼠科動物之OPGL(表4)。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公羞） (請先閲讀背面之注意事項再 _寫本頁) 、11
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 -87- 1276443 A7 __ B7_五、發明説明（85) 表4 : a〇PGL-l對人類獼猴、或老鼠序列表現的細胞膜 0PGL之親和力。 0PGL ρσρ % a〇PGL- ED50毫微克/毫升 人類 16 獼猴 19 老鼠 無特定的結合 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 CH〇細胞表現的此類OPGL爲全長、膜結合的蛋白質 。a〇PGL-l結合至表現在細胞表面的OPGL係用FACS分析 評估，其係將細胞與a〇PGL-l及FITC-標記的對抗人類IgG2 之二次抗體反應。a〇PGL-l可結合至人類以及獼猴之〇PGL ，但結合至老鼠OPGL則具專一性。 此外，人類OPG與腫瘤壞死因子相關的細胞凋亡誘導 配位體（TRAIL ，相關於TNF家族的一員）有弱的結合 (Truneh et al，2000)已報導，顯示其DNA及胺基酸序列與 〇PGL有同源現象（Lacey et al·，1 998)。然而，0PG無法結合 至其它TNF-相關的蛋白質，例如TNFa、TNF卢、或CD40 配位體。 a〇PGL-l可專一結合於EIA板上之0PGL(圖7)。將重 組可溶解的〇PGL(2微克/毫升）在室溫下塗覆在96孔之EIA 板，16至24小時。於1%BSA之PBS阻塞之後，各孔中加入 以1%BSA/PBS稀釋之各種濃度的a〇PGL-l(大約2毫微克/毫 升至1000毫微克/毫升），平板在室溫下反應約2小時。結合 的抗體用山羊抗-人類IgG(Fab’）-HRP以TMB-H2〇2(四甲基聯 (請先閲讀背面之注意事項再势寫本頁) -Π-势寫木 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -88- 1276443 A7 B7 五、發明説明（86 經濟部智慧財產局Μ工消費合作社印製 苯胺及過氧化氫）受質混合物偵測。在450亳微米以及650亳 微米之吸光度下記讀。 a〇PGL-l專一的結合於表現在轉染細胞表面之〇PGL(圖 8)。將？八03緩衝液（？33、0.1%33八、0.01%疊氮化鈉）稀釋 的a〇PGL-l(100毫微克/毫升）與各種濃度之〇PGL、TNFa、 TNFb、TRAIL、或CD40配位體（大約〇·1毫微克/毫升至1000 毫微克/毫升）預反應，然後加入大約200、000個CHOREN 218-9細胞，其爲細胞表面上穩定表現膜結合的OPGL之 CHO細胞，在2-8 °C下、1小時之後，離心移除未結合的抗 體並清洗。然後細胞在2-8°C下與FITC-標記的F(ab’）2山羊 抗-人類IgG(具Fey斷片專一性）反應30分鐘。於離心及淸洗 之後，使用流式細胞儀測量細胞表面螢光。圖8顯示 a〇PGL-l專一的結合於CHOREN 218-9細胞，加入可溶解的 0PGL可競爭性的降低結合，但加入TNFa、TNFb、TRAIL 、或CD40配位體則不會。 在競爭實驗中，加入外生性0PGL會抑制a〇PGL-l結合 於EIA板上之0PGL(圖9)，但力口入TNFa、TNFP ' TRAIL或 CD40配位體貝[]不會（圖10)。進行此程序，除了固定濃度的 a〇PGL-l(100毫微克/毫升）在加入塗覆〇PGL的平板之前與 各種濃度之可溶解的0PGL或其它配位體（各大約1毫微克/ 毫升至1000毫微克/毫升）預反應之外，實質上與上述 a〇PGL-l結合於EIA板上0PG之方法相同。 實施例5 a〇PGL-l之中和活性 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） 請 閲 讀 背 面 之 注 意 事 項 再 t -89- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 276443 A7 _B7 _五、發明説明（87> 抑制破骨細胞形成 RAW 264.7(ATCC No. TIB-7 1，Manassas，VA)是源自 Abelson鼠科動物白血病病毒誘發的腫瘤之鼠科動物巨噬細 胞細胞株。在OPGL存在下，RAW 264.7細胞可分化成類破 骨細胞。在OPGL存在下，從培養RAW細胞產生破骨細胞 之基本測定已詳細描述於S i m ο n e t e t a 1 (19 9 7) C e 11 8 9 p · 3 0 9 、以及Lacey et al( 1998)Cell 93 p. 165，全文在此倂入參考 文獻 。 用配位體刺激RAW細胞使其分化成類破骨細胞，並用 TRAP活性（破骨細胞之性質）測量分化狀況。因此，可測量 a〇PGL-l對破骨細胞生成之效應。 於細胞培養液（DMEM、10%FBS、0.292毫克/毫升L-Glut 、100單位/毫升青黴素克、100微克/毫升鏈黴素硫酸鹽）中 ，在固定量的〇PGL(40毫微克/毫升）以及變化量之 a〇PGL-l(6.3毫微克/毫升至200毫微克/毫升）存在下，將 RAW細胞反應4天。4天後將細胞通透及酸化以進行抗酒石 酸鹽酸性磷酯酶活性之染色，接著用對-硝基苯基磷酸鹽反 應5分鐘。簡言之，從細胞中吸出培養液，在各孔中加入 100微升之檸檬酸鹽緩衝液（410毫升0.1莫耳濃度檸檬酸、 590毫升0.1莫耳濃度檸檬酸三鈉、1毫升triton X-100)，將 平板在室溫下反應3至5分鐘。然後加入10微升之PNPP溶液 (157.8毫克酸性磷酯酶試劑（Sigma 104100)、7.2毫升酒石 酸鹽溶液（Sigma cat.No. 3 87-3)、及22.8毫升檸檬酸鹽緩衝液） ，平板在室溫下反應3至5分鐘。加入50微升之0.5莫耳濃度 請 先 閲 讀 背 τέ 之 注 意 事 項 再 $ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X297公釐） -90- 1276443 A7 ____ B7 五、發明説明（明、
NaOH溶液終止反應。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) TRAP可將對-硝基苯基磷酸鹽轉化成對硝基酚，其可 在405亳微米下測量光密度定量的。TRAP活性（破骨細胞發 生的替代標識）與405亳微米下之光密度相關。將光密度對 〇〇？〇1^1濃度作圖示於圖11，此測定顯示0(〇?〇1^1可抑制破 骨細胞形成。 抑制OPGL結合至其受體 a〇PGL-l藥效說明其能阻塞OPG配位體結合於其同源 的受體，破骨細胞分化以及活化受體（ODAR，亦爲習知的 RANK)。此測定使用均質的時間解析螢光共振（HTRF)偵測 a〇PGL-l結合於銪-共軛結合的護骨素配位體（Eu-OPGL)。若 a〇PGL-l抑制Eu-OPGL結合於0DAR，則螢光輸出將降低 ，且a〇PGL-l之存在量將與螢光量成反比。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 將OPGL用銪標記，於337亳微米激發下會在620亳微米 下發出放射光。將0DAR融合標誌及Fc，再將此Fc-ODAR-標誌-融合型蛋白用聯結別藻青色素（APC，在620亳微 米激發下會在665亳微米下發出放射光）之抗-標誌抗體標記 。因此，當Eu-標記的OPG配位體結合於Fc-ODAR標誌/ 抗·標誌-APC複合體時，當在337亳微米激發下會在665亳微 米下發出放射光。 將0.05毫微克/毫升Eu-〇PGL與各種濃度（〇.1至150毫 微克/毫升）之a〇PGL-l在測定緩衝液（50毫莫耳濃度三羥甲 基胺基甲烷，酸鹼度8、100毫莫耳濃度NaCl、0.05%NaN3、 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -91 - 1276443 A7 B7 五、發明説明（89、 0.1%BSA、以及0.05%Tween 20)、室溫下預反應約一小時（預 反應混合物）。亦用測定緩衝液製備FcODAR-標誌（1微克/毫 升）以及抗-標誌-APC(2.5微克/毫升）之混合物，在室溫下反 應一小時（氟鉻混合物）。然後合倂等體積之預反應混合物及 氟鉻混合物，在室溫下反應3小時。用微板分析器Packard Discovery HTRF計讀平板在337亳微米下激發測量665亳微米 下發出之螢光。 當 a〇PGL-l與Eu-〇PG配位體預反應後與Fc-ODAR-標 誌/抗-標誌-APC混合，665亳微米之螢光強度會以劑量依存 的方法減低，如圖12，展現 aOPGL 162 可有效地抑制 0PGL結合於0DAR。 實施例 6獼猴之藥物動力學 將六隻雄性以及六隻雌性獼猴，年齡不大於4.5歲，體 重2至4公斤分成4個劑量組。第1組由3隻雄性以及3隻雄性 組成。第2、3、及4組各自由1隻雄性以及1隻雌性組成。對 第1組動物投用單一 SC劑量的1毫克/公斤a〇PGL-l，而對 第2、3以及4組動物分別投用單一 IV劑量的0.1、1.0、或 10.0毫克 /公斤 a〇PGL-l。 動物投用的a〇PGL-l係由轉染的中國倉鼠卵巢（CH0)細 胞所表現。採取血淸樣品測定a〇PGL-l之含量、抗體分析 、及分析骨轉換率標識：血淸N-端肽（血淸N-Tx)、鹼性磷 酯酶（ALP)、及血鈣（血Ca)。亦收集尿液分析N-端肽（尿液 N-Tx)及肌酸酐。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 請 先 閲 讀 背 之 注
I 經濟部智慧財產局工消費合作社印製 -92- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（90 ) IV投藥後血淸之濃度-時間分佈圖，其特徵爲三相分佈 (圖1 3)。最初，是快速分佈相，接著是顯著較低的濃度依存 之平台相。最後觀察到快速除去的第三相。 完整的血淸濃度-時間分佈圖之非隔間性分析係使用 WinNonlin專業版（vl.5)，數據的指數分析則多至測試物品 投藥後14天，猴子之藥物動力學硏究則使用1〇,〇〇〇毫微克/ 毫升以上之a〇PGL-l並利用SAAM II(vl.l.2)分析。所有IV 投藥之起始體積分佈平均爲28.9毫升/公斤，與血漿體積相 似。所有IV投藥之恆定狀態體積（Vss)分佈爲平均39毫升/ 公斤。指數分析顯示a〇PGL-l之平均分佈半生期（t^a)爲 6.02小時，延伸的二級相之半生期（h/w)從劑量爲0.1毫克/ 公斤時的86.9小時增加到劑量10.0毫克/公斤下的極大値444 小時。所有IV投藥組之末端除去半生期（h/2 a)估計的非隔 間性平均爲31小時。a〇PGL-l之淸除率（CL，CL/F)爲非線性 之淸除率，動物接受10毫克/公斤IV劑量時之平均淸除率 (0.1 20毫升/小時/公斤）比接受0.1毫克/公斤（0.401毫升/小時/ 公斤）時低3.3倍。 於皮下投用之後，吸收緩慢，在1 32 hr之平均尖峰濃 度（Cmax)爲11，600毫微克/毫升。於SC投藥之後有高變異性 之暴露，造成平均淸除率爲〇.3 87上0.281毫升/小/公斤，平均 駐留時間爲202：t80.1小時。平均生物效性爲89%.。 以上的數據總結於表5。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -93- 1276443 A7 B7 五、發明説明（91x 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 。^«德_/¥藏鬆激#1酲_哉03)驭^。鹚1-10&10^_蘅丨酹旺^08^>1骠藤^:5嗽 非隔間性參數估計量 10毫克/公斤 IV(n=2) 平均 〇 326000 NDb 99900 0.120 519 〇\ ν/Ί 1.0毫克/公斤 IV(n=2) 平均 〇 38200 寸 1—i CO 3950 0.256 124 r- 1-< CO 0.1毫克/公斤 IV(n=2) 平均 〇 4330 Γ- ο cn 253 0.401 〇〇 寸 oo r- cn c〇 1.0毫克/公斤 SC(n=6) Q 00 60.2 3410 I i t—< τ—H 1750 0.281 80.1 N/A 平均 132 11600 34.9 3520 0.387 202 N/Ac 單位 小時 毫微克/毫升 1 小時 微克*小時/毫升 毫升/小時/公斤 小時 毫升/公斤 參數 K (¾ E Η Κ (¾ ε 〇 ΓΝ 4—> A U C (〇 ~ «〇) IX Ο J' u MRT CO oo > 旺镯伥0 要龌伥丽嫵鼸|驾0 ·要(_£nsffa>4nIlz^qr 燊ng· SPLH。伥 q 蛔}鐮^_鑼揆擗摩00迄»瓏^ 請 閱 讀 背 & 之 注 意 事 項 本 頁 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -94 - 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 __B7___五、發明説明（92、 a〇PGL-l可在投用後24小時內導致血淸N-Tx之含量快 速降低（圖14)。從0.1至10毫克/公斤增加劑量之IV投用後， 觀察到極大效應之平均時間介於12小時至7天之間，SC投用 1.0毫克/公斤至動物後極大效應之平均時間介於12小時至11 天。劑量範圍0.1至1毫克/公斤時，極大値效應隨劑量增加 大約80至9 1 %。然而在較高的劑量下無進一步的抑制，觀察 到之極大抑制爲91%。於IV投用〇.1毫克/公斤之後28天， 血淸N-Tx之平均含量回復基線，於SC投用1毫克/公斤之 後7 0天，血淸N-Tx之平均含量回復基線。除了所有組在硏 究之第105天回復基線値之外，尿液之N-Tx與血淸N-Tx 顯示相似的趨勢（圖1 5)。 IV投藥10.0毫克/公斤之後平均七天，抑制血Ca隨劑 量增加至平均谷底之基線下3 1.6%。所有其它劑量組血Ca 之平均減低少於基線平均之26.4%。第17天所有處理動物的 血Ca含量回復至其基線平均的10%之內（圖20)。 骨質重吸收以及形成係緊密地聯結，改變骨質形成標 識（ALP)時亦可觀察到ALP之含量緩慢的下降，且比形成標 識（N-Tx)的抑制長（圖21)。投服a〇PGL-l後觀察到骨質重吸 收標識的降低係在骨質形成標識（ALP)的降低之前，因此證 實a〇PGL-l爲骨頭之抗重吸收劑。 多數的動物（12隻中之9隻）發展出a〇PGL-l抗體。發展 出a〇PGL_l抗體之發生率與劑量或路徑無關。當劑量在〇.1 毫克/公斤以上，不可能評估a〇PGL-l抗體對a〇PGL-l之藥 物動力學效應，因爲無任何劑量組中有抗體陰的及陽性的 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
^ -95- 1276443 A7 _B7_ 五、發明説明（93) 動物。在0.1毫克/公斤IV時，多數的a〇PGLl在發展出抗體 之前已被淸除，因此無法觀察到a〇PGL-l堆積之效應（圖16) 經濟部智慧財產局S工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -96- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 _____ B7五、發明説明（94) 〇PGL抗體序列表 <1 10>Boyle，William J Martin，Erancis Η Corvalan,Jose R Davis, C. Geoffrey <120〉 〇PGL抗體 <130>06843.0049-00000 <M150>60/301,172 <151>2001-06-26 <160>20 <170>PatentIn 版本 3.1 <210>1 <211>1426 <212>DNA <213>家鼠 <400>1 aagcttgacc accatggagt ttgggctgag ctggcttttt cttgtggcta ttttaaaagg 60 tgtccagtgt gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc 120 cctgagactc tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt 180 ccgccaggct ccagggaagg ggctggagtg ggtctcaggt attactggga gtggtggtag 240 tacatactac gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa 300 cacgctgtat ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc 360 r ANTIBODIES TO OPGL SEQ LISTING.txt gaaagatcca gggactacgg tgattatgag ttggttcgac ccctggggcc agggaaccct 420 ggtcaccgtc tcctcagcct ccaccaaggg cccatcggtc ttccccctgg cgccctgctc 480 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -97- 1276443 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明（95,、 caggagcacc tccgagagca cagcggccct gggctgcctg gtcaaggact acttccccga 540 accggtgacg gtgtcgtgga actcaggcgc tctgaccagc ggcgtgcaca ccttcccagc 600 tgtcctacag tcctcaggac tctactccct cagcagcgtg gtgaccgtgc cctccagcaa 660 cttcggcacc cagacctaca cctgcaacgt agatcacaag cccagcaaca ccaaggtgga 7 20 caagacagtt gagcgcaaat gttgtgtcga gtgcccaccg tgcccagcac cacctgtggc 780 aggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac 840 ccctgaggtc acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tccagttcaa 900 ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccacggg aggagcagtt 960 ycaacagcacg ttccgtgtgg tcagcgtcct caccgttgtg caccaggact ggctgaacgg 1020 caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa aggcctccca gcccccatcg agaaaaccat 1080 ctccaaaacc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga 1140 ggagatgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct accccagcga 1200 catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacacctcc 1260 catgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag 1320 gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta 1380 cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgataa gtcgac 1426 <210>2 <211>1467 <212>DNA < 21 3 >家鼠 <400>2 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu 1 5 Phe Leu Val 10 Ala lie Leu Lys Gly 15 Val Gin Cys Glu Val Gin Leu Leu 20 Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser 35 40 Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 45
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -98-
五、發明説明（96 J
Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60
Glu Trp Val Ser Gly lie Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala * 65 Ί0 7 5 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val 工le Met Ser Trp Phe 115 120 125
Asp Pro Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 130 135 140
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser 145 150 155 160
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 165 170 175
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His 180 185 190
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 195 200 205
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gin Thr Tyr Thr Cys 210 215 220 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu 225 230 235 240
Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala * 245 250 255
Glv Pro Ser Ve.1 Ph6 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 260 265 270
He Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -99 - 1276443 A7 A7 B7 經濟部智慧財產局0(工消費合作社印製 五、發明説明（97 ) 275 280 285
Glu Asp Pro Glu Val Gin Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 290 295 300
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gin Phe Asn Ser Thr Phe 305 310 315 320
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gin Asp Trp Leu Asn Gly 325 330 335
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie 340 345 350
Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val 355 360 365
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gin Val Ser 370 375 380
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Val Glu 385 390 395 400
Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 405 410 415
Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 420 425 430
Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 435 440 445
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser 450 455 460 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項本頁)
、1T -100- 1276443 A7 _________ B7 五、發明説明（98) <210>3 <211>728 <212>DNA <213> 家鼠 <4〇〇> 3 tctagaccac catggaaacc ccagcgcagc ttctcttcct cctgctactc tggctcccag ataccaccgg agaaattgtg ttgacgcagt ctccaggcac cctgtctttg tctccagggg aaagagccac cctctcctgt agggccagtc agagtgttcg cggcaggtac ttagcctggt accagcagaa acctggccag gctcccaggc tcctcatcta tggtgcatcc agcagggcca ctggcatccc agacaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca gcagactgga gcctgaagat tttgcagtgt tttactgtca gcagtatggt agttcacctc ggacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgaac tgtggctgca ccatctgtct tcatcttccc gccatctgat gagcagttga aatctggaac tgcctctgtt gtgtgcctgc tgaataactt ctatcccaga gaggccaaag tacagtggaa ggtggataac gccctccaat cgggtaactc ccaggagagt gtcacagagc aggacagcaa ggacagcacc tacagcctca gcagcaccct gacgctgagc aaagcagact acgagaaaca caaagtctac gcctgcgaag tcacccatca gggcctgagc tcgcccgtca caaagagctt caacagggga gagtgttgat aagtcgac
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -101 - 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _________B7_五、發明説明（99) <210>4 <211>235 <212>PRT <213>家鼠 <400>4 Met Glu Thr Pro Ala Gin Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro 1 5 10 15 Asp Thr Thr Gly Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser 20 25 30 Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser 35 40 45 Val Arg Gly Arg Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala 50 55 60 Pro Arg Leu Leu lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro 65 70 75 80 Asp Arg Fhe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He 85 90 95 Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gin Gin Tyr 100 105 110 Gly Ser Ser Pro Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 115 120 125 Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe He Phe Pro Pro Ser Asp Glu 130 135 140 Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160 y ---_________ 本紙張尺度適财關家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐)" ---- -102 - (請先閲讀背面之注意事項再本頁)
訂
1276443 A7 _B7_ _ 五、發明説明（七〇
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin 165 170 175 (請先閱讀背面之注意事項
Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 180 185 190
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 195 200 205
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser 210 215 220
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235 訂 <210>5 <211>25 <212>DNA <213>人造的序列 <220>
<223>5’κ品種引子 <400>5 gatgacccag tctccagcca ccctg 經濟部智慧財產局員工消黄合作社印製 <210>6 <211>23 <212>DNA <213>人造的序列 <220> <223> 31品種引子 <400>6 aagggtcaga ggccaaagga tgg 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -103- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 _ B7___五、發明説明（‘ <210>7 <211>30 <212>DNA <213>人造的序列 <220> <223> 5’抗-0PGL-1 κ 引子 <400>7 caactctaga ccaccatgga aaccccagcg 3〇 <210>8 <211>37 <212>DNA <213>人造的序列 <220> <223>3’抗-0PGL-1 κ 引子 <400>8 tttgacgtcg acttatcaac actctcccct gttgaag 37 <210>9 <211>23 <212>DNA <213>人造的序列 <220> <223> 5’IgG2品種引子 <400>9 ggcacggtca ccacgctgct gag (請先閱讀背面之注意事項再IPk本頁) I, 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -104- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7五、發明説明（士 <210>10 <211>24 <212>DNA <213>人造的序列 <220> <223>3’ IgG2品種引子 <400>10 cctccaccaa gggcccatcg gtct 24 <210>11 <211>51 <212>DNA <213>人造的序列 <220> <223>5丨抗-OPGL-l IgG2弓ί 子 <400>11 cagaagcttg accaccatgg agtttgggct gagctggctt tttcttgtgg c 51 <210>12 <211>37 <212〉DNA <213>人造的序列 <220> <223>3’抗-OPGL-1 IgG2引子 <400〉12 gcatgtcgac ttatcattta cccggagaca gggagag 37 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -105- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A7 ____ B7_五、發明説明（▲ <210>13 <211>122 <212>PRT <213>家鼠 <400>13 Glu Val Gin Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly lie Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val He Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp 100 105 HO Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210>14 <211>108 <212>PRT <213>家鼠 <400>14 Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X：297公釐） -106- 1276443 A7 B7五、發明説明（▲ Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Arg Gly Arg 20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 lie Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly lie Pro Asp Arg Phe Ser , 50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gin Gin Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95
Arg Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 請 先 閱 τδ 之 注 意 事 項 經濟部智慧財產局8工消費合作社印製 <210>15 <211>24 <212>DNA <213>人造的序列 <220〉 <223>隨機引子 <220> <221 > misc_ 特色 <222>18··· (23) <223>N 爲 A，C，G，或 T <400>15 ggccggatag gcctcacnnn nnnt <210>16 <211>5 <212>prt 24 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ；297公釐） -107- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（ <213>人造的序列 <220> <223>轉譯一部份y抗-0PGL-1 κ引子 <400〉1 6 Met Glu Thr Pro Ala 1 5 <210>17 <211>6 <2 1 2>prt <213>人造的序列 <220> <223>轉譯一部份3’抗-OPGL-lK引子 <400>17 Cys Glu Gly Arg Asn Phe 1 5 <210>18 <211>12 <21 2>prt <213>人造的序列 <220> <223>轉譯一部份5’抗-OPGL-l IgG2引子 <400>18 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala 15 10 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -108- 1276443 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（士 <210>19 <211>7 <21 2>prt <213>人造的序列 <220> <223〉轉譯一部份3’抗-OPGL-l IgG2引子 <400>19 J Lys Gly Pro Ser Leu Ser Leu 1 5 <210>20 <211〉10 < 21 2>prt <213>人造的序列 <220> <223>LHRH拮抗劑肽 <220〉 <221>MISCj寺色 <222>(1)··· (1) <223>Xaa爲 Ac-D-Na：l，其中Nal爲3-(2-萘基）丙胺醯基 <220〉 <221>MISC 特色 <222>(2)…（2 ) <223>Xaa 爲（4'-氯 Phenul)丙胺醯基< 2 2 0 > 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -109- 1276443 經濟部智慧財產局g(工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（士 <221>MISC 特色 <222>(3)··. (3) <223>Xaa爲 D-Pal，其中Pal爲3-(3'-吡啶基）丙胺醯基 <220> <221>MISC 特色 <222〉(5)…（5) <223>Xaa爲 N-甲基酪胺酸 <220> <221>MISC 特色 <222〉（6)··· (6) <223>Xaa爲 D-天門冬醯胺酸 <220> <221〉MISC 特色 <222>(8)··· (8) <223>Xaa爲 Ν-ε-2-丙基-離胺醯基 <220> <221>MISC 特色 <222>(10)…（10) <223〉 Xaa 爲 D-丙胺酸-NH2 <400>20 Xaa Xaa Xaa Ser Xaa Xaa Leu Xaa Pro Xaa 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） -110-

Claims (1)

  1. 7 12
    i L 「本 六、申請專利範圍1 附件2A : 第9 1 1 1 4055號專利申請案 中文申請專利範圍替換本 請先聞讀背面之注意事寫本頁 民國95年1月9 日修正 1·一種抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中 (a) 該重鏈包含 (1) SEQ ID NO : 2所示之胺基酸序列；或 (2) SEQ ID NO : 13所示之胺基酸序列；或 (3) 包含SEQ ID NO : 13之至少1個互補性決定區 (CDR)之胺基酸序列；且 (b) 該輕鏈包含 (1) SEQ ID NO : 4所示之胺基酸序列；或 訂 (2) SEQ ID NO : 14所示之胺基酸序列；或 (3) 包含SEQ ID NO: 14之CDR1和CDR3的至少1個 之胺基酸序列；且 其中該抗體與護骨素配位體（OPGL)交互作用。 2. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該重鏈和輕鏈係 經可塑連結子連接以形成單鏈抗體。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3. 如申請專利範圍第2項之抗體，其係爲單鏈Fv抗體。 4. 如申請專利範圍第1項之抗體，其係爲Fab抗體。 5. 如申請專利範圍第1項之抗體，其係爲Fab·抗體。 6. 如申請專利範圍第1項之抗體，其係爲（Fab’）2抗體。 7. 如申請專利範圍第1項之抗體，其係爲完整的人類抗 體。 8. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該抗體抑制OPGL 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1276443 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 .六、申請專利範圍2 ‘與破骨細胞的分化及活化受體（ODAR)結合。 .· 9.一種重鏈，其包含 :· (a)SEQ ID NO : 2所示之胺基酸序列；或 (b) SEQ ID NO : 13所示之胺基酸序列；或 (c) 包含SEQ ID NO: 13之至少1個CDR之胺基酸序 列； 其中包含（i)該重鏈和（Π)包含SEQ ID NO : 14所示之胺 基酸序列的輕鏈之抗體與OPGL交互作用。 . 10. 如申請專利範圍第9項之重鏈，其包含SEQ ID NO :13所示之胺基酸序列。 11. 一種輕鏈，其包含 (a) SEQ ID NO : 4所示之胺基酸序列；或 (b) SEQ ID NO : 14所示之胺基酸序列；或 (c) 包含 SEQ ID NO: 14之 CDR1和 CDR3的至少1個 之胺基酸序列； 其中包含（i)該輕鏈和（ii)包含SEQ ID NO : 13所示之胺 , 基酸序列的重鏈之抗體與0PGL交互作用。 12. 如申請專利範圍第11項之輕鏈，其包含SEQ ID NO : 14所示之胺基酸序列。 13. —種抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中該重鏈包含 (a) SEQ ID NO : 2所示之胺基酸序列；或 (b) SEQ ID NO : 13所示之胺基酸序列；或 (c) 包含SEQ ID NO : 13之至少1個CDR之·胺基酸序 列； 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項β寫本頁) •裝· 訂 -線· 1276443 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 t、申請專利範圍3 其中該抗體與〇PGL交互作用。 14. 如申請專利範圍第1 3項之抗體，其中該重鏈包含 SEQ ID NO : 13所示之胺基酸序列。 15. —種抗體，其包含重鏈和輕鏈，其中該輕鏈包含 (a) SEQ ID NO : 4所示之胺基酸序列；或 (b) SEQ ID NO : 14所示之胺基酸序列；或 (c) 包含 SEQ ID NO: 14之CDR1和CDR3的至少1個 之胺基酸序列； （ 其中該抗體與OPGL交互作用。 16. 如申請專利範圍第15項之抗體，其中該輕鏈包含 SEQ ID NO : 14所示之胺基酸序列。 Π.—種抗體，其包含重鏈和輕鏈， (a) 其中該重鏈包含第一變異區，且其中該第一變異區 包含與SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列具有至少90%相 同性之序列，且 (b) 其中該輕鏈包含第二變異區，且其中該第二變異區 •包含與SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列具有至少90%相 同性之序列，且 (〇其中該抗體與〇PGL交互作用。 18. 如申請專利範圍第17項之抗體，其中該第一變異區 包含與SEQ ID NO: 13所示之胺基酸序列具有至少95%相 .同性之序列。 19. 如申請專利範圍第17項之抗體，其中該第.一變異區 包含與SEQ ID NO : 13所示之胺基酸序列具有至少99 %相同 請 先 聞 面 之 注 裝 頁 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 1276443 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍4 性之序列。 20. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該重鏈包含 SEQ ID NO ： 13之至少 2個 CDR。 21. 如申請專利範圍第1或20項之抗體，其中該輕鏈包 含SEQIDNO: 14之至少2個CDR。 22. 如申請專利範圍第1項之抗體，其中該重鏈包含 SEQ ID NO: 13之胺基酸序列且該輕鏈包含SEQ ID NO: 14之胺基酸序列。 23·如申請專利範圍第9項之重鏈，其包含胺基酸序列 ，該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 13之至少2個CDR。 24·如申請專利範圍第11項之輕鏈，其包含胺基酸序 列，該胺基酸序列包含SEQ ID NO : 14之至少2個CDR。 25·如申請專利範圍第π項之抗體，其包含胺基酸序列 ，該胺基酸序列包含SEQ ID NO : 13之至少2個CD R。 26·如申請專利範圍第15項之抗體，其包含胺基酸序列 ’該胺基酸序列包含SEQ ID NO: 14之至少2個CD R。 27.如申請專利範圍第17或18項之抗體，其中第二變異 區包含與SEQ ID NO: 14所示之胺基酸序列具有至少95% 相同性之序列。 28·如申請專利範圍第17或丨9項之抗體，其中第二變異 區包含與SEQ ID NO ·· 14所示之胺基酸序列具有至少99%相 同性之序列。 29·如申請專利範圍第1項之抗體，其中該重鏈包含 SEQ ID NO·· 2所示之胺基酸序列且其中該輕鏈包含SEQ 本紙張尺度適用中國國家樣準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項寫本頁) 裝· 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1276443 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 •六、申請專利範圍5 ID NO : 4所示之胺基酸序列。 * 30·—種用於抑制骨骼流失之藥學組成物，其包含申請 專利範圍第1、2至8、13至19、20至22及25至29項中任一項 之抗體。 3 1.如申請專利範圍第30項之藥學組成物，其進一步包 至少一種治療劑，該治療劑選自骨形態發生因子、轉形 生長因子j(TGF-p)、第一型白細胞介素（IL-1)抑制劑、11^ lra、KineretTM、anakinra、TNFa 抑制劑、可溶性 TNFa 受體 、· EnbrelTM、etanercept、抗-TNFa 抗體、RemicadeTM、 • infliximab、D2E7抗體、副甲狀腺素、副甲狀腺素類似物、 副甲狀腺素相關蛋白質、副甲狀腺素相關蛋白質類似物、 前列腺素、雙膦酸鹽、阿多那酸鹽（alendronate)、氟化物、 鈣、非類固醇性抗發炎藥物（NSAID)、C〇X_2抑制劑、 CelebrexTM、celecoxib、VioxxTM、rofecoxib、免疫抑制劑、 甲胺蝶呤、力夫諾賣（leflunomide)、絲胺酸蛋白酶抑制劑、 分泌型白血球蛋白酶抑制劑（SLPI)、IL-6抑制劑、IL-6抗體 ' IL-8抑制劑、IL-8抗體、IL-18抑制劑' IL-18結合蛋白質 ..、IL-18抗體、OX40/OX40L 調節劑、4-1BB/4-1BB 配位體調 •節劑、CD28/B7調節劑、CD40/CD40L 調節劑、IC0S/B7RP1 調節劑、AGP-3/TACI/BAFFR調節劑、第一型白細胞介素轉 換酶（ICE)調節劑、纖維母細胞生長因子（FGF)、FGF調節劑 β ·、PAF拮抗劑、角質細胞生長因子（KGF)、KGF相關分子、 KGF調節劑、基質金屬蛋白酶（ΜΜΡ)調節劑、一氧.化氮合成 p(NOS)調節劑、糖皮質激素受體調節劑、麩胺酸鹽受體調 本k張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公楚) 77^ ： (請先閲讀背面之注意事寫本頁) .裝. 訂 線 1276443 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 六、申請專利範圍6 節劑、脂多糖（LPS)含量調節劑' 去甲腎上腺素、去甲腎上 腺素模仿劑或去甲腎上腺素調節劑。 3 2.如申請專利範圍第3丨項之藥學組成物，其中該至少 種治療劑遣自 KineretTM、anakinra、EnbrelTM、etanercept 、RemicadeTM、infiixirnab、D7E7抗體或甲胺蝶呤。 33.—種偵測生物樣品中0PGL含量之方法，其包含令 該樣品與申請專利範圍第22項之抗體接觸。 34·—種如申請專利範圍第30項之藥學組成物於製造藥 劑以治療病患之骨質病症上之用途。 35·—種如申請專利範圍第31項之藥學組成物於製·造藥 劑以治療病患之骨質病症上之用途。 36 · —種如申請專利範圍第3彳項之藥學組成物於製造藥 劑以治療病患之伴隨骨骼流失的發炎症狀上之用途。 37·—種如申請專利範圍第31項之藥學組成物於製造藥 劑以治療病患之伴隨骨骼流失的自體免疫症狀上之用途。 38·—種如申請專利範圍第31項之藥學組成物於製造藥 劑以治療病患之類風濕性關節炎上之用途。 39. 如申請專利範圍第30項之藥學組成物，其更包含至 少一種癌症治療劑。 40. 如申請專利範圍第39項之藥學組成物，其中該至少 一種癌症治療劑係選自放射線治療或化學治療。 41. 如申請專利範圍第30項之藥學組成物，其更包含至 少一種治療性抗體。 42. 如申請專利範圍第41項之藥學組成物，其中該至少 (請先閲脅背面之注意事¥ •裝-- W寫本頁) 訂 線 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2〗0X297公釐） -6 - 1276443 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍7 一種治療性抗體係選自抗He「2抗體、抗CDC20抗體或抗 EGFR抗體。 43·—種如申請專利範圍第30項之藥學組成物於製造藥 劑以治療與癌症有關之骨骼流失上之用途。 44 · 一種如申請專利範圍第3 9項之藥學組成物於製造藥 劑以治療與癌症有關之骨骼流失上之用途。 45. —種如申請專利範圍第40項之藥學組成物於製造藥 劑以治療與癌症有關之骨骼流失上之用途。 46. —種如申請專利範圍第4 1項之藥學組成物於製造藥 劑以治療與癌症有關之骨骼流失上之用途。 47·—種如申請專利範圍第42項之藥學組成物於製造 藥劑以治療與癌症有關之骨骼流失上之用途。 (請先閎讀背面之注意事 -裝-- :寫本頁} 線 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家摞準（CNS ) A4規格（210X297公釐） -7-
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