EA021242B1 - Антитела к остеопротегерин лиганду (опгл) - Google Patents

Антитела к остеопротегерин лиганду (опгл) Download PDF

Info

Publication number
EA021242B1
EA021242B1 EA200400063A EA200400063A EA021242B1 EA 021242 B1 EA021242 B1 EA 021242B1 EA 200400063 A EA200400063 A EA 200400063A EA 200400063 A EA200400063 A EA 200400063A EA 021242 B1 EA021242 B1 EA 021242B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
sequence
antibody
ligand
amino acid
heavy chain
Prior art date
Application number
EA200400063A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200400063A1 (ru
EA021242B9 (ru
Inventor
Уилльям Дж. Бойль
Фрэнсис Х. Мартин
Хосе Р. Корвалан
Джеффри С. Дэвис
Original Assignee
Эмджен Фримонт Инк.
Эмджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23162250&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA021242(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Эмджен Фримонт Инк., Эмджен, Инк. filed Critical Эмджен Фримонт Инк.
Publication of EA200400063A1 publication Critical patent/EA200400063A1/ru
Publication of EA021242B1 publication Critical patent/EA021242B1/ru
Publication of EA021242B9 publication Critical patent/EA021242B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

Описаны антитела, которые взаимодействуют с ОПГ лигандом. Описаны способы лечения остеопении путем введения фармацевтически эффективного количества антител к ОПГ лиганду. Описаны способы определения количества ОПГ лиганда в образце с использованием антител к ОПГ лиганду.

Description

Настоящее изобретение относится к антителам, которые связывают остеопротегерин лиганд (далее ОПГ лиганд). Описаны также составы и способы лечения костных болезней, таких как остеопороз, потеря костной ткани из-за артрита, болезнь Паджета и остеопения.
Предпосылки создания изобретения
Костная ткань обеспечивает поддержку тела и включает минералы (включая кальций и фосфор), матрицу коллагеновых и неколлагеновых белков и клеток. Для живой костной ткани характерно динамическое равновесие между образованием костной ткани, которое называют депонированием, и разрушением костной ткани, которое называют резорбцией. В это равновесие вовлечены три типа клеток, обнаруженных в костной ткани: остеоциты, остеобласты и остеокласты. Остеобласты поддерживают формирование костной ткани, тогда как остеокласты связаны с резорбцией. Резорбция, или растворение матрицы костной ткани и минерала, является быстрым и эффективным процессом по сравнению с остеогенезом и может высвободить из костной ткани большие количества минерала. Остеокласты вовлечены в регуляцию нормального процесса повторного построения ткани скелета и в резорбцию, вызываемую гормонами. Например, резорбция стимулируется секрецией гормона околощитовидной железы в ответ на снижение концентрации ионов кальция во внеклеточных жидкостях. Напротив, ингибирование резорбции является функцией кальцитонина. Кроме того, метаболиты витамина Ό изменяют чувствительность костной ткани к гормону околощитовидной железы и кальцитонину.
ОПГ лиганд, который относится к семейству цитокинов ΤΝΡ, поддерживает формирование остеокластов через образование связи с рецептором активатором ΝΡ-кВ (сокращенно ΚΑΝΚ, называемый также рецептором дифференцирования и активации остеокласта, сокращено - ΟΌΑΚ). С другой стороны, остеопротегерин (ОПГ) замедляет формирование остеокластов, изолируя ОПГ лиганд и предотвращая связывание ОПГ лиганда с ΟΌΑΚ. Таким образом, количество ОПГ лиганда, связанного с ΟΌΑΚ, коррелирует с равновесием между депонированием костной ткани и резорбцией.
После созревания скелета количество костной ткани в скелете отражает баланс (или дисбаланс) между формированием и резорбцией костной ткани. Масса костной ткани максимальна после созревания скелета перед четвертым десятилетием. Между четвертым и пятым десятилетиями равновесие сдвигается и доминирует резорбция костной ткани. Неизбежное уменьшение костной массы с годами начинается раньше у женщин, чем у мужчин, и отчетливо ускоряется после менопаузы у некоторых женщин (особенно кавказского и азиатского происхождения).
Остеопения является состоянием, относящимся, вообще, к любому уменьшению массы костной ткани до уровней ниже нормальных. Такое состояние может явиться результатом уменьшения скорости синтеза костной ткани или увеличения скорости разрушения костной ткани или того и другого. Часто встречающейся формой нарушения остеогенеза является первичный остеопороз, также называемый постменопаузным и сенильным остеопорозом. Эта форма остеопороза является последствием всеобщей потери костной ткани с возрастом и часто является результатом увеличения резорбции костной ткани при нормальной скорости формирования костной ткани. У многих белых женщин в США развивается симптоматический остеопороз. Существует прямая зависимость между остеопорозом и частотой перелома бедра, шейки бедра и внутривертельным переломом у женщин 45 лет и старше. У пожилых мужчин остеопороз может развиваться в возрасте от 50 до 70 лет. В некоторых случаях остеопороз может быть причиной повышенного содержания или активности ОПГ лиганда. Таким образом, было бы полезно иметь молекулы, которые могут регулировать активность ОПГ лиганда в остеокластогенезисе.
Было идентифицировано несколько факторов, которые могут внести вклад в постменопаузный и сенильный остеопороз. Они включают изменение содержания гормонов с возрастом и неадекватный расход кальция в результате снижения кишечного поглощения кальция и других минералов. В попытке замедлить процесс некоторые виды лечения включают гормональную терапию или пищевые добавки. Совсем недавно для профилактики и лечения сниженной массы костной ткани появились антирезорбенты такие, как бисфосфонаты и селективные модуляторы эстрогеновых рецепторов (δΕΚΜδ). Таким образом, может быть полезно совмещать эти виды лечения с приемом молекул, которые могут регулировать активность ОПГ лиганда при лечении некоторых нарушений остеогенеза.
Краткое изложение сущности изобретения
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается антитело, в состав которого входит тяжелая цепь и легкая цепь, причем в состав тяжелой цепи входит аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности № 2, или ее фрагмент, а в состав легкой цепи входит аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности № 4, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается антитело, в состав которого входит тяжелая цепь и легкая цепь, причем в состав тяжелой цепи входит вариабельная область, включающая аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности № 13, или ее фрагмент, а в состав легкой цепи входит вариабельная область, включающая аминокислотную последова- 1 021242 тельность, соответствующую последовательности № 14, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается антитело, в состав которого входит тяжелая цепь и легкая цепь, причем в состав тяжелой цепи входит аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности № 2, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается антитело, в состав которого входит тяжелая цепь и легкая цепь, причем в состав тяжелой цепи входит вариабельная область, включающая аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности № 13, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается антитело, в состав которого входит тяжелая цепь и легкая цепь, причем в состав легкой цепи входит аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности № 4, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается антитело, в состав которого входит тяжелая цепь и легкая цепь, причем в состав легкой цепи входит вариабельная область, включающая аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности № 14, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается антитело, в состав которого входит тяжелая цепь и легкая цепь, причем (а) в состав тяжелой цепи входит первая вариабельная область, и первая вариабельная область включает последовательность, которая по крайней мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности № 13, (Ь) в состав легкой цепи входит вторая вариабельная область, и вторая вариабельная область включает последовательность, которая по крайней мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности №: 14, (с) антитело, причем антитело взаимодействует с ОПГ лигандом.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения первая вариабельная область включает последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности № 13, и вторая вариабельная область включает последовательность, которая по крайней мере на 95% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности № 14.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения первая вариабельная область включает последовательность, которая по крайней мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности № 13, и вторая вариабельная область включает последовательность, которая по крайней мере на 99% идентична аминокислотной последовательности, соответствующей последовательности № 14.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается тяжелая цепь, в состав которой входит аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности № 2, или ее фрагмент. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается тяжелая цепь, в состав которой входит вариабельная область и постоянный участок, причем вариабельная область включает аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности № 13, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается легкая цепь, в состав которой входит аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности № 4, или ее фрагмент. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается легкая цепь, в состав которой входит аминокислотная последовательность, соответствующая последовательности № 14, или ее фрагмент.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются антитела, состоящие из одной цепи. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются антитела, состоящие из единственной цепи Ρν. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются РаЬ антитела. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются РаЬ' антитела. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются (РаЬ')2 антитела.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается фармацевтический состав, включающий антитело по настоящему изобретению. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается фармацевтический состав, включающий терапевтически эффективное количество антитела к ОПГ лиганду.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается фармацевтический состав, включающий антитело к ОПГ лиганду и по крайней мере одно терапевтическое средство, выбираемое из группы средств, в состав которой входит морфогенный фактор костной ткани, трансформирующий фактор роста β (ΤΟΡ-β), ингибитор интерлейкина-1 (1Ь-1), 1Ь-1та, анакинра Кшете!™, ингибитор ΤΝΡα, растворимый рецептор ΤΝΡα, этанерсепт ЕиЬге1™, антитело к ΤΝΡα, инфликсимаб Кеш1сабе™, антитело Ό2Ε7, гормон паращитовидной железы, аналог гормона паращитовидной железы, белок, родственный гормону паращитовидной железы, аналог белка, родственного гормону паращитовидной железы, простагландин, бисфосфонат, алендронат, фторид, кальций, нестероидное противовоспалительное лекарственное средство (ΝδΆΣΌ), ингибитор СОХ-2, селекоксиб Се1еЬгех™, рофекоксиб νίοχχ™; иммунодепрессант, метотрексат, лефлуномид, ингибитор сериновой протеазы, секреторный ингибитор лейкоцитарной протеазы (§ЬР1), ингибитор 1Ь-6, антитело к 1Ь-6, ингибитор 1Ь-8, антитело к 1Ь-8, ингибитор 1Ь- 2 021242
18, 1Ь-18-связывающий белок, антитело к ЕС-18, модулятор интерлейкин-1-конвертирующего энзима (1СЕ), фактор роста фибробластов (РСР), модулятор РСР, антагонист РАЕ, фактор роста кератиноцитов (КОР), родственная КСР молекула, модулятор КСР; модулятор матриксной металлопротеиназы (ММР), модулятор синтазы оксида азота (N08), модулятор рецептора глюкокортикоида, модулятор глутаматного рецептора, модулятор уровней липополисахарида (ЛПС), норадреналин, миметик норадреналина, и модулятор норадреналина.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается способ лечения нарушения остеогенеза, включающий введение фармацевтически эффективного количества антитела. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается способ лечения нарушения остеогенеза, включающий применение фармацевтического состава.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается способ лечения воспалительного состояния, сопровождающегося потерей костной ткани у пациента, включающий применение фармацевтического состава.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается способ лечения аутоиммунного состояния, сопровождающегося потерей костной ткани у пациента, включающий применение фармацевтического состава.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается способ лечения ревматоидного артрита у пациента, включающий применение фармацевтического состава по настоящему изобретению.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается способ определения содержания ОПГ лиганда в биологическом образце, включающий контактирование образца с антителом.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 показана последовательность кДНК, кодирующая тяжелую цепь антитела к аОПГ лиганду-1 с (последовательность № 1).
На фиг. 2 показана аминокислотная последовательность тяжелой цепи антитела к аОПГ лиганду-1 (последовательность № 2).
На фиг. 3 показана последовательность кДНК, кодирующая легкую цепь антитела к аОПГ лиганду1 (последовательность № 3).
На фиг. 4 показана аминокислотная последовательность легкой цепи антитела к аОПГ лиганду-1 (последовательность № 4).
На фиг. 5 показана схема плазмида экспрессии легкой каппа-цепи аОПГ лиганда-1- аОПГ лиганд1 -каппа/ρΌ 8Ка19.
На фиг. 6 показана схема плазмида экспрессии тяжелой цепи 1дО2 аОПГ лиганда-1, аОПГ лиганд1-Ι§Ο2/ρΌδΚα19.
На фиг. 7 показано зависимое от дозы связывание аОПГ лиганда-1 с планшетами Е1А, покрытыми ОПГ лигандом.
На фиг. 8 показано специфическое связывание аОПГ лиганда-1 с мембраносвязанным ОПГ лигандом.
На фиг. 9 показано ингибирование связывания аОПГ лиганда-1 с планшетами Е1А, покрытыми ОПГ лигандом, с помощью растворимого ОПГ лиганда.
На фиг. 10 показано специфическое связывание аОПГ лиганда-1 с планшетами Е1А, покрытыми ОПГ лигандом.
На фиг. 11 показано зависимое от дозы ингибирование образования остеокластов с помощью аОПГ лиганда-1.
На фиг. 12 показано зависимое от дозы ингибирование связывания ОПГ лиганда с 0ΌΑΚ с помощью аОПГ лиганда-1.
На фиг. 13 показаны временные зависимости средних сывороточных концентраций после введения единичной дозы аОПГ лиганда-1 обезьянам Суиото1ди8.
На фиг. 14 показаны средние относительные изменения концентрации Ν-Τχ в сыворотке после введения единичной дозы аОПГ лиганда-1 обезьянам Суиото1ди8.
На фиг. 15 показаны средние относительные изменения концентрации Ν-Τχ в урине после введения единичной дозы аОПГ лиганда-1 обезьянам Суиото1ди8.
На фиг. 16 показаны временные зависимости положительных и отрицательных концентраций антител в сыворотке после введения единичной дозы аОПГ лиганда-1 обезьянам Суиото1ди8.
На фиг. 17 показана аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела к аОПГ лиганду-1 (последовательность № 13).
На фиг. 18 показана аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи антитела к аОПГ лиганду-1 (последовательность № 14).
На фиг. 19 показана схема обработки клеточной культуры для получения аОПГ лиганда-1.
На фиг. 20 показаны относительные изменения концентрации кальция в сыворотке после введения единичной дозы аОПГ лиганда-1 обезьянам Суиото1ди8.
- 3 021242
На фиг. 21 показаны средние изменения концентрации щелочной фосфатазы в сыворотке после введения единичной дозы аОПГ лиганда-1 обезьянам Суиото1ди8.
Детальное описание некоторых предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения
Заголовки частей используются здесь только в организационных целях и не должны рассматриваться как ограничение описываемого предмета. Все библиографические ссылки, приводимые в данном изобретении, могут использоваться с любой целью.
Определения.
Для синтеза рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидов, и культуры клеток тканей и трансформации могут применяться стандартные методики (например, электропорация, липофекция). Ферментативные реакции и способы очистки могут применяться согласно техническим требованиям изготовителя, или обычными способами, или так, как описано в данной работе. Упомянутые выше методики и процедуры могут применяться в соответствии с известными способами и в соответствии с описаниями в различной общей и более специальной литературе, которая приводится в данном случае в виде ссылок. См., например, работу авторов Самбрука (ЗатЬгоок) и др. Молекулярное клонирование: Лабораторное Руководство (2-я редакция, Колд Спринг Харбор Лаборатори Пресс, Колд Спринг Харбор, Нью-Йорк, США (1989), которая включена в данном случае в качестве ссылки и может использоваться в любых целях. Если не даны специальные определения, это означает, что применяемая здесь терминология и упоминаемые здесь лабораторные процедуры и методики по аналитической химии, синтетической органической химии и лекарственной и фармацевтической химии хорошо известны. Для химического синтеза, химических исследований, приготовления фармацевтических препаратов, составов, доставки и лечения пациентов могут использоваться стандартные методики.
Если не определено иначе, то в соответствии с настоящим описанием следующие термины должны пониматься следующим образом.
В соответствии с настоящим описанием под термином выделенный полинуклеотид следует понимать полинуклеотид геномных кДНК, или синтетического происхождения или их комбинацию, при этом по своему происхождению выделенный полинуклеотид (1) не ассоциируется со всем полинуклеотидом или его частью, в которой выделенный полинуклеотид обнаружен в природе, (2) связан с полинуклеотидом, который не связан с ним в природе, или (3) не встречается в природе как часть более длинной последовательности.
Под термином выделенный белок следует понимать белок, кодированный кДНК, рекомбинантной РНК, или синтетического происхождения или их комбинацию, который (1) не содержит, по крайней мере, некоторые белки, с которыми он обычно обнаруживается, (2) по существу, не содержит другие белки из того же самого источника, например от тех же самых видов, (3) экспрессируется клеткой от различных видов или (4) не встречается в природе.
Термин полипептид используется здесь как родовой для обозначения природных белков (т.е. белков естественного происхождения), или последовательностей, в которых имеются делеции, дополнения, и/или замещения одной или большего числа аминокислот природной последовательности. Термин полипептид также охватывает аОПГ лиганд-1 (что описано ниже, последовательность № 2 и последовательность № 4), или последовательности, которые имеют делеции, дополнения, и/или замещения одной или большего числа аминокислот аОПГ лиганда-1. Согласно некоторым вариантам осуществления настоящее изобретение включает молекулу иммуноглобулина тяжелой цепи человека, представленную на фиг. 2 (последовательность № 2), и молекулу иммуноглобулина легкой цепи человека, представленную на фиг. 4 (последовательность № 4), или их фрагменты или аналоги.
Термин естественного происхождения в данном контексте применительно к объекту следует относить к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептид или полинуклеотидная последовательность, которая присутствует в организме (включая вирусы), который может быть выделен из источника в природе и который не был преднамеренно изменен человеком в лаборатории или другим способом является объектом природного происхождения.
Термин оперативно связанный в данном контексте относится к компонентам, с которыми имеется какое-то взаимодействие, обеспечивающее их функционирование должным образом. Например, управляющая последовательность, оперативно связанная с кодирующей последовательностью, сшита таким образом, что экспрессия кодирующей последовательности достигается при условиях, совместимых с условиями управляющих последовательностей.
Термин управляющая последовательность в данном контексте относится к последовательностям полинуклеотида, которые могут влиять на экспрессию и обработку кодирующих последовательностей, с которыми они сшиты. Такие управляющие последовательности могут иметь разную природу в зависимости от организма-хозяина. В соответствии с некоторыми воплощениями настоящего изобретения управляющие последовательности для прокариотов могут включить промотор, рибосомный сайт связывания и последовательность завершения считывания генетического кода. В соответствии с некоторыми воплощениями настоящего изобретения управляющие последовательности для эукариотов могут включать
- 4 021242 промоторы и последовательность завершения считывания генетического кода. В некоторых воплощениях настоящего изобретения управляющие последовательности могут включать последовательности лидера и/или последовательности партнера слияния.
Под термином полинуклеотид в данном контексте следует понимать полимерную форму нуклеотидов по крайней мере 10 оснований по длине. В некоторых воплощениях настоящего изобретения основания могут быть рибонуклеотидами, или деоксирибонуклеотидами, или модифицированной формой любого типа нуклеотида. Под данным термином понимаются одноцепочечные формы ДНК и ДНК с двойной цепью.
Под термином олигонуклеотиды в данном контексте следует понимать модифицированные нуклеотиды природного происхождения, связанные вместе олигонуклеотидными связями природного происхождения, и/или искусственного происхождения. Олигонуклеотиды являются полинуклеотидной субпопуляцией, длина которой в общем случае составляет 200 оснований или меньше. В некоторых воплощениях настоящего изобретения длина олигонуклеотида составляет от 10 до 60 оснований. В некоторых воплощениях настоящего изобретения длина олигонуклеотида составляет 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20-40 оснований. Олигонуклеотиды могут быть одноцепочечные или с двойной цепью, например для использования в построении мутанта гена. Олигонуклеотиды по настоящему изобретению могут быть восприимчивыми или невосприимчивыми.
Под термином нуклеотиды природного происхождения следует понимать деоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды. Под термином модифицированные нуклеотиды следует понимать нуклеотиды с модифицированными или замещенными сахарными группами и подобные им. Под термином олигонуклеотидные связи следует понимать олигонуклеотидные связи типа фосфоротиоат, фосфородитиоат, фосфороселеноат, фосфородиселеноат, фосфороанилотиоат, фосфороаниладат, фосфороамидат и т.п. См., например, ЛаПланше (ЬаИаисЬе) и др. Исследования нуклеиновых кислот (Νιιοί. Аабк Кек.), 14:9081 (1986); Стек (З1ес) и др. Журнал американского химического общества (1. Сйет. Зос.), 106:6077 (1984); Штейн (31етп) и др. Исследования нуклеиновых кислот (№с1. Аабк Кек.), 16:3209 (1988); Зон (Ζοη) и др. Разработка противораковых лекарственных средств (Аий-Саисег Огид Эекщп). 6:539 (1991); Зон (Ζοη) и др. Олигонуклеотиды и клоны: Практический подход (О11доиис1еойбек апб Апа1одиек: А Ргасбса1 Арргоасй, с. 87-108 (под ред. Экштейна Ф. (Р. Ескк1еш), Оксфорд Юниверсити Пресс, Оксфорд, Англия (1991)); Стек (З1ес) и др. Патент США № 5151510; Химические Обзоры Улмана и Пеймана (ИЫтапи и Реутаи Сйетюа1 КеОе\ук) 90:543 (1990), которые приводятся в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях. Олигонуклеотид может содержать меченый атом для обнаружения.
Идентичность и подобие соответствующих соединений и полипептидов могут быть рассчитаны известными способами. К числу таких способов, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся способы, описанные в Вычислительной Молекулярной Биологии (Сотри1а1юиа1 Мо1еси1аг Вю1оду) под ред. Леска А.М. (Ьекк А.М.), Оксфорд Юниверсити Пресс, НьюЙорк (1988); Биовычисление: Информатика и Проекты Генома (Вюсотрибид: 1иаогтайск аиб Сеиоте Рго_]ес1к), под ред. Шмита Д.У. (Зтйй ϋ.ν.), Академик Пресс, Нью-Йорк (1993); Компьютерный Анализ Данных Последовательности (Сотри1ег Аиа1ук1к оГ Зесщеисе Оа1а), ч. 1, под ред. Гриффина А.М. и Гриффина Х.Г. (СпГГт А.М, СпГГт Н.С.), Хьюмана Пресс, Нью-Джерси (1994); Анализ Последовательности в Молекулярной Биологии (Зециеисе Аиа1уык ш Мо1еси1аг Вю1оду), фон Хайнье Г. (уои Неш)е, С.), Академик Пресс (1987); Праймер анализа последовательности (Зесщеисе Аиа1ук1к Праймер), под ред. Грибскова М. и Девере Дж. (СпЬккоу М, Оеуегеих 1.). Стоктон Пресс, Нью-Йорк (1991); и Карилло и др. (Сап11), СИАМ, Журнал прикладной математики (1. Аррйеб Ма1й.), 48:1073(1988).
Для обеспечения наилучшего согласования испытываемых последовательностей разработаны предпочтительные способы определения идентичности последовательностей. Способы определения идентичности представлены в доступных для широкой публики компьютерных программах. К числу предпочтительных способов компьютерных программ по определению идентичности двух последовательностей, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится пакет программ ССС, включая САР (Девере (Оеуегеих) и др. Исследования нуклеиновых кислот (Νυο1. Ааб. Кек.), 12:387 (1984); Компьютерная Группа по Генетике, Университет Висконсина, Мадисона, шт. Висконсин, США, ВЬАЗТР, ΒΚΛ3ΤΝ и РАЗТА (Альтшул и др. (Айксйи1), Журнал молекулярной биологии (I. Мо1. Вто1.), 215:403-410 (1990)). Программа ВЬАЗТХ доступна для широкой публики из Национального Центра Информации по Биотехнологии (ΝΟΕΙ) и из других источников (ВЬАЗТ Руководство, Альтшул и др. (Айксйи1). Ж.’В^ЙМ/№Н Ве1йекба, МО 20894; Альтшул и др. (Айксйи1), тот же источник, что и выше (1990)). Для определения идентичности последовательностей может применяться известный алгоритм Смита Ватермана.
При использовании некоторых схем выравнивания двух аминокислотных последовательностей можно получить совпадение только коротких участков этих двух последовательностей, при этом идентичность, полученная при таком выравнивании небольших участков, может быть очень высокой даже при том, что нет никакого сколько-нибудь существенного сродства между двумя полномерными последовательностями. Соответственно, в некоторых воплощениях настоящего изобретения выбранный спо- 5 021242 соб выравнивания (программа САР) приводит к выравниванию, которое охватывает по крайней мере 50 соседних аминокислот целевого полипептида.
Например, используя компьютерный алгоритм САР (Компьютерная Группа по Генетике, Университет Висконсина, Мадисон, шт. Висконсин, США), два полипептида, для которых должна определяться относительная идентичность, совмещались для оптимального совпадения их соответствующих аминокислот (совпавший участок, определенный по алгоритму). В некоторых воплощениях настоящего изобретения вместе с алгоритмом используется санкция за открытие делеции (который рассчитывается как 3Х средняя диагональ; средняя диагональ является усредненным значением диагонали используемой матрицы сравнения; диагональ - число баллов или просто число, присваиваемое специфической матрицей сравнения каждому безупречному совпадению аминокислот) и санкция за удлинение делеции (который составляет обычно 1/10 санкции за открытие делеции), а также матрица сравнения типа РАМ 250 или ВЬО8иМ 62. В некоторых воплощениях настоящего изобретения алгоритмом используется также стандартная матрица сравнения (см. Дайхофф и др. (ΌανΗοΓΓ). Атлас Последовательности Белка и Структуры (АИа8 оГ Рто1еш зсциспес апб 8пис1иге), 5 (3) (1978) для матрицы сравнения РАМ 250; Хеникофф и др. (НешкоГГ), Труды Академии естественных наук США, 89:10915-10919 (1992) для матрицы сравнения ВЬО8иМ 62).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения приняты следующие параметры для сравнения полипептидной последовательности:
Алгоритм: Нидлман (№еб1етап) и др., Журнал молекулярной биологии (1. Мо1. Вю1.), 48:443-453 (1970);
Матрица сравнения: ВЬО8иМ 62 авторов Хеникоф (НешкоГГ) и др., см. тот же источник, что и выше (1992);
Санкция за делецию: 12;
Санкция за длину делеции: 4;
Порог сходства: 0.
Программа САР может применяться с описанными выше параметрами. В некоторых воплощениях настоящего изобретения вышеупомянутые параметры являются параметрами, используемыми по умолчанию при сравнении полипептидов (безо всякой санкции за конечные делеции) с использованием алгоритма САР.
В данном контексте двадцать обычных аминокислот и их сокращения используются обычным образом. См. книгу Иммунология - Синтез (1ттипо1оду - А 8уп1Ье818) (2-е издание, под ред. Е.С. Голуба и Д.Р. Грена (Е.8. Со1иЬ и Ό.Κ. Сгеп), Сина Ассошиэйтс (8шаиет А88ос1а1е8), Сандерленд, шт. Массачусетс, США (1991)), которая включена в данном случае в качестве ссылки и может использоваться в любых целях. В качестве компонентов для полипептидов по настоящему изобретению также могут подходить стереоизомеры (например, Ό-аминокислоты) двадцати обычных аминокислот, аминокислоты неприродного происхождения такие, как α-, α-двузамещенные аминокислоты, Ν-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие нетрадиционные аминокислоты. Примеры нетрадиционных аминокислот включают 4гидроксипролин, γ-карбоксиглутамат, ε-Ν,Ν,Ν-триметилизин, ε-Ν-ацетилизин, О-фосфосерин, Νацетилсерин, Ν-формилметионин, 3-метилгистидин, 5-гидроксилизин, σ-Ν-метиларгинин и другие подобные аминокислоты и иминокислоты (например, 4-гидроксипролин). В соответствии с принятыми обозначениями в используемых здесь обозначениях полипептида влево идет аминоконцевое направление, а вправо - карбоксиконцевое направление.
Точно так же, если не определено иначе, левый конец однонитевых полинуклеотидных последовательностей является концом 5'; левое направление двунитевых полинуклеотидных последовательностей называется направлением 5'. Направление 5'>3' наращивания начинающихся генетических кодов РНК называется направлением считывания генетических кодов; области последовательности на нити ДНК, имеющей ту же самую последовательность, что и РНК, и которые являются 5'-5' концом генетического кода РНК, называются вышерасположенными последовательностями; области последовательности на нити ДНК, имеющей ту же самую последовательность, что и РНК, и которые являются 3'-3' концом генетического кода РНК, называются нижерасположенными последовательностями.
Консервативные замещения аминокислот могут охватывать аминокислотные остатки неприродного происхождения, которые обычно внедряются путем химического синтеза пептида, а не синтезом в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие реверсивные или инвертированные формы аминокислотных областей.
Остатки природного происхождения могут быть объединены в классы на основе общих свойств боковой цепи:
1) гидрофобные: норлейцин, Ме1, А1а, Уа1, Ьеи, 11е;
2) нейтральные гидрофильные: Су8, 8ег, ТЬг, Акп, С1п;
3) кислые: А8р, С1и;
4) основные: Ηΐ8, Ьу8, Агд;
5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: С1у, Рго;
- 6 021242
6) ароматические: Тгр, Туг, РЬе.
Например, неконсервативные замещения могут включать замену звена одного из этих классов на звено другого класса. Такие замещенные остатки могут внедряться в участки антитела человека, которые гомологичны антителам нечеловека, или в негомологичные области молекулы.
При выполнении таких замен в соответствии с некоторыми воплощениями настоящего изобретения можно учитывать показатель гидропатии аминокислот. Каждой аминокислоте на основе ее гидрофобности и характеристик заряда был приписан показатель гидропатии. К ним относятся: изолейцин (+4,5); валин (+4,2); лейцин (+3,8); фенилаланин (+2,8); цистеин/цистин (+2,5); метионин (+1,9); аланин (+1,8); глицин (-0,4); треонин (-0,7); серин (-0,8); триптофан (-0,9); тирозин (-1,3); пролин (-1,6); гистидин (-3,2); глутамат (-3,5); глутамин (-3,5); аспартат (-3,5); аспарагин (-3,5); лизин (-3,9); аргинин (-4,5).
Понятна важность индекса гидропатии аминокислот при обсуждении интерактивного биологического воздействия на белок. Кайт (Ку1е) и др., Журнал молекулярной биологии (1. Μοί. Βίοί.), 157:105131 (1982). Известно, что некоторые аминокислоты могут замещаться на другие аминокислоты со сходным показателем гидропатии или баллом и все еще удерживают такую же биологическую активность. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения при замещениях на основе показателя гидропатии включено замещение аминокислот, показатели гидропатии которых находятся в пределах ±2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения включены те из них, показатели гидропатии которых находятся в пределах ±1, и в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения включены те из них, показатели гидропатии которых находятся в пределах ±0,5.
Понятно также, что замещение подобных аминокислот может быть выполнено эффективно на основе гидрофильности, особенно тогда, когда биологически функциональный белок или пептид, полученный таким образом, предназначены для использования в иммунологических воплощениях настоящего изобретения, как и в настоящем случае. В некоторых воплощениях настоящего изобретения самая большая локальная средняя гидрофильность белка, контролируемая гидрофильностью его соседних аминокислот, коррелирует с его иммуногенностью и антигенностью, т.е. с биологическим свойством белка.
Этим аминокислотным остаткам были приписаны следующие значения гидрофильности: аргинин (+3,0); лизин (+3,0); аспартат (+3,0±1); глутамат (+3,0±1); серин (+0,3); аспарагин (+0,2); глутамин (+0,2); глицин (0); треонин (-0,4); пролин (-0,5±1); аланин (-0,5); гистидин (-0,5); цистеин (-1,0); метионин (-1,3); валин (-1,5); лейцин (-1,8); изолейцин (-1,8); тирозин (-2,3); фенилаланин (-2,5) и триптофан (-3,4). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения при замещениях на основе подобных значений гидрофильности включено замещение аминокислот, значения гидрофильности которых находятся в пределах ±2. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения включены те из них, значения гидрофильности которых находятся в пределах ±1, и в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения включены те из них, значения гидрофильности которых находятся в пределах ±0,5. На основе гидрофильности можно также идентифицировать эпитопы из первичных аминокислотных последовательностей. Эти области называются также эпитопными центральными областями.
В табл. 1 представлены типичные замещения аминокислот.
- 7 021242
Таблица 1
Замещения аминокислот
Оригинальные остатки Типичные замещения Предпочтительные замещения
А1а Уа1, Ьеи, Пе Уа1
Аг§ Ьуз, О1п, Азп Ьуз
Азп С1п О1п
Азр С1и О1и
Суз Зег, А1а Зег
О1п Азп Азп
О1и Азр Азр
О1у Рго, А1а А1а
ΗΪ5 Азп, О1п, Ьуз, Аг§ Аг§
Не Ьеи, Уа1, Ме1, А1а, РЬе, Норлейцин Ьеи
Ьеи Норлейцин, Пе, Уа1, Ме1, А1а, РЬе Пе
Ьуз Аг§. 1,4-диами номасляная кислота, О1п, Азп Аг£
Ме1 Ьеи, РЬе, Пе Ьеи
РЬе Ьеи, Уа1, Пе, А1а, Туг Ьеи
Рго А!а О1у
Зег ТЬг, А1а, Суз ТЬг
ТЬг Зег Зег
Тгр Туг, РЬе Туг
Туг Тгр, РЬе, ТЬг, Зег РЬе
Уа1 Пе, Мег, Ьеи, РЬе, А1а, Норлейцин Ьеи
С использованием известных способов квалифицированный специалист в состоянии определить рассмотренные здесь подходящие варианты полипептида. В некоторых воплощениях настоящего изобретения квалифицированный специалист может идентифицировать подходящие области молекулы, которые могут быть замещены без нарушения активности целевыми участками, кажущимися не важными для активности. В некоторых воплощениях настоящего изобретения можно идентифицировать остатки и части молекул, которые сохранены у подобных полипептидов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения даже области, которые могут быть важны для биологической активности или для структуры, могут подвергаться консервативным замещениям аминокислот без нарушения биологической активности или без неблагоприятного влияния на структуру полипептида.
Кроме того, квалифицированный специалист может провести структурно-функциональное исследование, идентифицирующее остатки подобных полипептидов, которые важны для активности или структуры. При таком сравнении можно предсказать значимость аминокислотных остатков белка, которые соответствуют аминокислотным остаткам, которые важны для активности или структуры в подобных белках. Для таких предсказанных важных аминокислотных остатков квалифицированный специалист может подобрать химически подобные замещения для аминокислот.
Квалифицированный специалист может также анализировать пространственную структуру и аминокислотную последовательность относительно структуры сходных полипептидов. Обладая такой информацией, квалифицированный специалист может предсказывать выравнивание аминокислотных остатков антитела по его трехмерной структуре. В некоторых воплощениях настоящего изобретения квалифицированный специалист может не делать радикальных замещений в аминокислотных остатках, которые по предсказаниям находятся на поверхности белка, так как такие остатки могут вовлекаться в важные взаимодействия с другими молекулами. Кроме того, квалифицированный специалист может выполнять тестовые варианты, включающие одно замещение аминокислоты в каждом необходимом аминокислотном остатке. Затем эти варианты могут пройти отбор с помощью хорошо известной пробы на активность. Такие варианты могут использоваться для сбора информации о подходящих вариантах. Например, если будет обнаружено, что замещение на определенный аминокислотный остаток привело к нарушению, нежелательному снижению активности или вызвало неподходящий вид активности, то варианты с таким замещением могут быть исключены. Другими словами, на основе информации, получен- 8 021242 ной в таких экспериментах, квалифицированный специалист может с легкостью обнаружить аминокислоты, замещения в которых необходимо исключить либо сами по себе, либо в комбинации с другими мутациями.
Предсказанию вторичной структуры посвящено множество научных публикаций. См. Моулт Дж. (МоиЙ 1.), Обзор статей в биотехнологии (Сигг. Ор. ίη ΒίοΙοοΠ.). 7 (4); 422-427 (1996), Чоу (Сйои) и др., Биохимия (ВюсЬеш181гу), 13 (2):222-245 (1974); Чоу (Сйои) и др., Биохимия (Вюсйетшйу), 113 (2):211222 (1974); Чоу (Сйои) и др., Исследования ферментов, относящиихся к области молекулярной биологии (Αάν. Еп/уто1. Ке1а1. Лгеак Мо1. Вю1), 47:45-148 (1978); Чоу (Сйои) и др., Ежегодное обозрение по биохимии (Αηη. Кеу. Вюсйет.), 47:251-276 и Чоу (Сйои) и др., Биофизический журнал (Вюрйук. 1.), 26:367384 (1979). Кроме того, в настоящее время для оказания помощи в предсказании вторичных структур существуют компьютерные программы. Один способ предсказания вторичной структуры основан на моделировании гомологии. Например, два полипептида или белка, последовательности которых идентичны более чем на 30%, или подобны более чем на 40%, часто имеют сходную структурную топологию. Рост структурной базы данных по белкам (РИВ) в последнее время обеспечил увеличенную предсказуемость вторичной структуры, включая потенциальное количество укладок в пределах структуры полипептида или белка. См. Холм (Но1т)и др., Исследования нуклеиновых кислот (ΝιιΟ. Кислота. Кек.), 27 (1):244-247 (1999). Высказывалось предположение (Бреннер (Вгеппег) и др., Расчет оптических структур в биологии (Сигг. Ор. §1гис1. В1о1), 7 (3):369-376, 1997 г., что в данном полипептиде или белке существует ограниченное число укладок и что, после пептизации критического количества структур структурное предсказание становится значительно более точным.
К числу дополнительных способов предсказания вторичной структуры относится сшивка (Джонс Д. (1опек, И.), Расчет оптических структур в биологии (Сигг. Ορίη. §1гис1. Вю1, 7 (3):377-87 (1997); Сиппл и др. (δίρρ1), Структура (БйисЩге), 4 (1):15-19 (1996)), профильный анализ (Бови (Во\\!е) и др., Наука (БОе^е), 253:164-170 (1991); Грибсков (ΟΛκ^ν) и др., Ферменты (Ме1й. Еηζут), 183:146-159 (1990); Грибсков (Οπ№ν) и др., Труды академии естественных наук США (Ргос. ΝαΙ. Асаб. 8сг), 84 (13):43554358 (1987)), и эволюционное сцепление (см. Холм (Но1т) и др., тот же источник, что и выше (1999), и Бреннер (Вге1тег). тот же источник, что и выше (1997)).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения варианты антитела включают варианты гликозилирования, в которых количество сайтов гликозилирования и/или их тип были изменены по сравнению с аминокислотной последовательностью материнского полипептида. В некоторых воплощениях настоящего изобретения варианты белка включают большее или меньшее количество сайтов гликозилирования в Ν-концевой части, чем природный белок. Сайт гликозилирования в Ν-концевой части характеризуется наличием последовательности: Ακη-Χ-Бег или Ακη-Χ-Тйг, в которой аминокислотный остаток, обозначенный как X, может быть любым аминокислотным остатком кроме пролина. Замещение аминокислотных остатков для создания этой последовательности обеспечивает потенциально новый сайт для присоединения углеводородной цепи в Ν-концевой части. В другом случае при замещении, при котором эта последовательность выделяется, удаляется существующая углеводородная цепь в Ν-концевой части. Кроме того, предусмотрена перегруппировка углеводородных цепей в Ν-концевой части, где выделен один сайт или большее число сайтов гликозилирования (обычно природного происхождения), и в Νконцевой части создан один сайт или большее число новых сайтов. Дополнительные предпочтительные варианты антитела включают варианты цистеина, в котором один или большее число цистеиновых остатков удаляются или замещаются другой аминокислотой (например, серином) по сравнению с материнской аминокислотной последовательностью. Варианты цистеина могут использоваться тогда, когда антитела должны быть повторно уложены в биологически активную конформацию также как и после выделения нерастворимых тел включения. Вообще варианты цистеина имеют меньше цистеиновых остатков, чем природный белок, и обычно их число четно, что обеспечивает минимизацию взаимодействия по причине наличия непарных цистеинов.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения замещениями аминокислот считаются такие замещения, которые (1) снижают восприимчивость к протеолизу, (2) снижают восприимчивость к окислению, (3) изменяют связывающее сродство для формирования белковых комплексов, (4) изменяют связывающее сродство и/или (4) придают другие физико-химические или функциональные свойства таким полипептидам или изменяют эти свойства. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения в последовательности природного происхождения (в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения - в части полипептида вне домена(ов), формирующего межмолекулярные контакты) могут быть выполнены одиночные или многократные замещения аминокислот (в некоторых воплощениях настоящего изобретения - консервативные замещения аминокислот). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения консервативное замещение аминокислоты обычно не может, по существу, изменить структурные характеристики материнской последовательности (например, аминокислота замещения не должна иметь тенденцию к нарушению спирали, которая встречается в материнской последовательности, или нарушать другие типы вторичной структуры, характерной для материнской последовательности). В работах (Белки, структуры и молекулярные принципы (Р^οΐе^ηκ, 81гис1игек αηά Мо1еси1аг
- 9 021242
Ргтшр1ек (под ред. Крейтона (Сте1дй1оп), в. X. Фриман и Компани, Нью-Йорк, США (1984)); Введение в структуру белка (1п1тобисйоп Ю Рто1ет §1гис1иге) (под ред. Ц. Брандена и Дж. Туза (С. Вгапбеп и 1. Тоо/е), Гарланд Паблишинг, Нью-Йорк, США (1991)); и Торнтон (ТогпЮп) и др., Природа (Ха1ите) 354:105 (1991)), которые приводятся в данном случае в качестве ссылок, описаны примеры известных вторичных и третичных полипептидных структур.
Термин фрагмент полипептида в данном контексте относится к полипептиду, который имеет аминоконцевую и/или карбоксиконцевую делецию. В некоторых воплощениях настоящего изобретения длина фрагментов составляет по крайней мере от 5 до 467 аминокислот. Следует учитывать, что в некоторых воплощениях настоящего изобретения длина фрагментов составляет по крайней мере 56, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 или 450 аминокислот.
Часто аналоги пептида используются в фармацевтический промышленности как непептидные препараты со свойствами, аналогичными свойствам матричного пептида. Такие типы непептидного состава называются пептидомиметиками. См. работы авторов - Фуше (Еаисйеге), Журнал исследований перспективных лекарственных средств (1. Αάν. Ότ мкг Кек.) 15:29 (1986); Вебер и Фрайдингер (УеЬег и РгеШпдег) ΤΙΝδ с.392 (1985); и Эванс (Емапк) и др., Журнал медицинской химии (1. Меб. Сйет.) 30:1229 (1987), которые приводятся в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях. Такие составы часто разрабатываются с помощью автоматизированного молекулярного моделирования. Пептидомиметики, структура которых подобна структуре пептидов, имеющих терапевтическое применение, могут использоваться для того, чтобы оказывать сходное терапевтическое или профилактическое воздействие. Вообще, структура пептидомиметиков подобна структуре образцового полипептида (т.е. структуре полипептида, который обладает биохимическим свойством или фармакологической активностью) типа антитела человека, но имеет одну или большее число пептидных связей, произвольно замененных хорошо известными способами связью, выбираемой из группы, в состав которой входят -ΠΗ2ΝΗ-, -СН28-, -СН2-СН2-, -СН=СН-(цис и транс), -СОСН2-, -СН(ОН)СН2- и -СН28О-. Для получения более стабильных пептидов в определенных воплощениях настоящего изобретения может использоваться систематическое замещение одной аминокислоты или большего числа аминокислот согласованной последовательности Ό-аминокислотой того же самого типа (например, Ό-лизин замещается Ь-лизином). Кроме того, хорошо известными способами могут быть получены ограниченные пептиды, включающие согласованную последовательность или в значительной степени идентичную согласованную вариацию последовательности (работа авторов Ризо и Гираш (Ρί/о и С1етаксй) Ежегодное обозрение по биохимии (Апп. Кем. Вюсйет.) 61:387 (1992), которая приводится в данном случае в качестве ссылки); например, путем добавления внутренних цистеиновых остатков, способных образовывать внутримолекулярные дисульфидные мостики, которые формируют циклическую структуру пептида.
Антитело или пептид(ы) антитела называется целым антителом или его связывающим фрагментом, который конкурирует с целым антителом за специфическое связывание. В некоторых воплощениях настоящего изобретения связывающие фрагменты получены с использованием способов производства рекомбинантных ДНК. В некоторых воплощениях настоящего изобретения связывающие фрагменты получены путем ферментативного или химического гидролиза целых антител. К числу связывающих фрагментов, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения относятся фрагменты РаЬ, РаЬ1, Е(аЬ')2, Εν и одноцепочечные антитела.
Под термином тяжелая цепь подразумевается любой полипептид, имеющий достаточную последовательность с вариабельной областью, чтобы придать специфичность ОПГ лиганду. Под термином легкая цепь подразумевается любой полипептид, имеющий достаточную последовательность с вариабельной областью, чтобы придать специфичность ОПГ лиганду. Тяжелая полномерная цепь включает домен с вариабельной областью, УН, и три домена с постоянными областями, СН1, СН2, и СН3. Домен УН находится в аминоконцевой области полипептида, а домен СН3 - в карбоксиконцевой области. Термин тяжелая цепь в данном контексте охватывает полномерную тяжелую цепь и ее фрагменты. Полномерная легкая цепь включает домен с вариабельной областью Уъ и домен с постоянной областью Сь. Как и в случае с тяжелой цепью, домен с вариабельной областью легкой цепи находится на аминоконцевом участке полипептида. Термином легкая цепь в данном контексте охватывает полномерную легкую цепь и ее фрагменты. Фрагмент ЕаЬ состоит из одной легкой цепи и СН1 и вариабельных областей одной тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы ЕаЬ не может образовывать дисульфидную связь с другой молекулой тяжелой цепи. Фрагмент ЕаЬ' содержит одну легкую цепь и одну тяжелую цепь, которая содержит большую часть постоянного участка между СН1 и СН2 доменами так, что для образования молекулы Е(аЬ')2 между двумя тяжелыми цепями может образовываться дисульфидная связь. Участок Εν включает вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей, но отсутствуют постоянные участки. Молекулы Εν, в которых вариабельные области тяжелых и легких цепей были соединены гибкими связями с образованием цепи, состоящей из одного полипептида, которая образует антиген-связывающий участок, являются одноцепочечными антителами. Одноцепочечные антитела подробно рассмотрены в \УО 88/01649 и патентах США № 4946778 и 5260203.
Обычно в некоторых воплощениях настоящего изобретения термин двухвалентное антитело в отличие от мультиспецифичного или многофункционального антитела, понимают как антитело, все
- 10 021242 связывающие сайты которого идентичны.
Антитело в существенной степени замедляет сцепление лиганда с рецептором, когда избыток антитела уменьшает количество рецептора, связанного с противорецептором по крайней мере приблизительно на 20, 40, 60, 80, 85% или больше (что измеряется методом конкурентного связывания ίη νίΐΓο).
Под термином эпитоп понимается любая полипептидная детерминанта, способная к специфическому связыванию с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором. В некоторых воплощениях настоящего изобретения детерминанты эпитопа включают химически активное поверхностное группирование молекул типа аминокислот, боковых цепей сахаров, фосфорила или сульфонила и в некоторых воплощениях настоящего изобретения могут иметь специфические трехмерные структурные характеристики, и/или специфические характеристики заряда. Эпитоп - это участок антигена, который связан антителом. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело, как говорят, специфически связывает антиген, когда он преференционно распознает его целевой антиген в сложной смеси белков и/или макромолекул. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело, как говорят, специфически связывает антиген, когда константа диссоциации <1 мкМ, в некоторых воплощениях настоящего изобретения, когда константа диссоциации <100 нМ, и в некоторых воплощениях настоящего изобретения, когда константа диссоциации <10 нМ.
Под термином средство следует понимать химический состав, смесь химических составов, биологическую макромолекулу или экстракт из биологических материалов.
В данном контексте термин метка или меченый относится к включению обнаруживаемого маркера, например, при включении меченной радиоактивным изотопом аминокислоты или прикреплении к полипептиду частей биотина, которые могут быть обнаружены меченым авидином (например, стрептавидином, содержащим флуоресцентный маркер или обладающим ферментативной активностью, которая может быть обнаружена оптическими или колориметрическими способами). В некоторых воплощениях настоящего изобретения метка или маркер могут быть также терапевтическими. Известны и могут использоваться различные способы мечения полипептидов и гликопротеинов. К числу примеров меток для полипептидов, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся: радиоизотопы или радионуклиды (например, 3Н, 14С, 15Ν, 35δ, 90Υ, 99Тс, 'ίη. 125Ι, 131Ι), флуоресцентные метки (например, Р1ТС, родамин, лантанидные люминофоры), ферментативные метки (например, пероксидаза хрена, (β-галактозидаза, люцифераза, щелочная фосфатаза), хемилюминесцентные, биотинильные группы, заданные полипептидные эпитопы, распознаваемые вторичным репортером (например, последовательностями пары застежки-молнии лейцина, связывающими сайтами для вторичных антител, металлсвязывающими доменами, эпитопными метками). В некоторых воплощениях настоящего изобретения метки присоединяются плечами спейсерной области различной длины, что уменьшает возможность появления стерических несоответствий.
Под термином биологический образец в данном контексте следует понимать (хотя и не только это) любое количество вещества живого существа или бывшего живого существа. К числу таких живых существ, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся люди, мыши, обезьяны, крысы, кролики и другие животные. К числу таких веществ, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится кровь, сыворотка, моча, клетки, органы, ткани, кость, костный мозг, лимфатические узлы и кожа.
Термин нарушения остеогенеза включает (хотя не только это) остеопороз, остеопению, болезнь Паджета, литические метастазы костной ткани, периодонтит, ревматоидный артрит и потерю костной ткани вследствие фиксации. Известно также, что помимо этих расстройств костной ткани, некоторые виды рака увеличивают активность остеокласта и вызывают резорбцию костной ткани, к ним относится рак груди, простаты и множественная миелома. Известно, что эти виды рака продуцируют факторы, которые приводят к сверхэкспрессии ОПГ лиганда в костной ткани, и приводят к увеличению количества остеокласта и активности.
Термин фармацевтическое средство или лекарственное средство в данном контексте относится к химическому составу или составу, способному стимулировать желательный терапевтичесий эффект при правильном введении пациенту.
Под термином модулятор в данном контексте следует понимать состав, который изменяет активность или функцию молекулы или меняет ее на другую активность или функцию. Например, модулятор может вызвать увеличение или уменьшение величины некоторой активности или функции молекулы по сравнению с величиной активности или функции, наблюдаемой в отсутствии модулятора. В некоторых воплощениях настоящего изобретения модулятор является ингибитором, который уменьшает величину по крайней мере одного вида активности или функции молекулы. К числу некоторых типичных видов активности и функций молекулы, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся связывающее сродство, ферментативная активность и трансдукция сигнала. К числу некоторых типичных ингибиторов, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся, белки, пептиды, антитела, пептидные тела, углеводороды или малые органические молекулы. Пептидные тела описаны, например, в работе \УО 01/83525.
- 11 021242
В данном контексте выражение в значительной степени чистый означает, что целевой вид является преобладающим видом (т.е. на молярной основе его содержание превышает содержание любого другого отдельного вида в составе). В некоторых воплощениях настоящего изобретения в значительной степени очищенная фракция является составом, в котором целевой вид составляет по крайней мере приблизительно 50% (на молярной основе) всех имеющихся видов макромолекул. В некоторых воплощениях настоящего изобретения в значительной степени чистый состав будет составлять приблизительно больше чем 80, 85, 90, 95 или 99% от всех видов макромолекул, имеющихся в составе. В некоторых воплощениях настоящего изобретения целевой вид очищается до существенной гомогенности (примесные виды не могут быть обнаружены в составе обычными способами обнаружения), причем состав состоит, по существу, из одного вида макромолекул.
Под термином пациент следует понимать как человека, так и животное.
В данном изобретении единственное число включает и множественное, если специально не оговорено иначе. В данном изобретении использование или означает и/или, если специально не оговорено иначе. Кроме того, использование слова включающий, а также других его форм, таких как включает и включено, не ограничивается. Кроме того, такие термины, как элемент или компонент, охватывают как элементы, так и компоненты, включающие одну единицу, и элементы и компоненты, которые включают больше чем одну подъединицу, если специально не оговорено иначе.
В формировании остеокластов принимает участие ОПГ лиганд - член семейства фактора некроза опухоли (ΤΝΡ) цитокинов. Увеличение активности остеокласта коррелирует с рядом нарушений остеогенеза, включая постменопаузный остеопороз, болезнь Паджета, литические метастазы костной ткани, и ревматоидный артрит. Поэтому сокращение активности ОПГ лиганда может привести к уменьшению активности остеокласта и может снизить тяжесть нарушений остеогенеза. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антитела, направляемые к ОПГ лиганду, могут использоваться для лечения нарушений остеогенеза, включая упомянутые выше, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения.
В соответствии с некоторыми воплощения настоящего изобретения предлагается полностью человеческое моноклональное антитело против ОПГ лиганда человека. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются нуклеотидные последовательности кодирующие, и аминокислотные последовательности, включающие молекулы тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, в частности, последовательности, соответствующие вариабельным участкам. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются последовательности, соответствующие гипервариабельной области (СОК), особенно от СЭК1 до СЭК3. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения предлагается линия клеток гибридомы, экспрессирующая такую молекулу иммуноглобулина и моноклональное антитело. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается очищенное моноклональное антитело человека против ОПГ лиганда человека.
Способность клонировать и реконструировать генные локусы человека в искусственных хромосомах дрожжей (УЛС) и вводить их в зародышевую линию мыши обеспечивает подход к объяснению функциональных составляющих очень больших или грубо картрированных локусов, а также к получению полезных моделей болезни человека. Кроме того, использование такой технологии для замещения локусов мыши эквивалентными локусами человека могло бы обеспечить уникальное проникновение в суть экспрессии и регуляции генетических продуктов человека во время развития, в их коммуникацию с другими системами, и их участие в индукции и развитии болезни.
Важное практическое применение такой стратегии состоит в гуманизации гуморальной иммунной системы мыши. Введение локуса иммуноглобулина (1д) человека мышам, у которых эндогенные гены 1д были инактивированы, дает возможность изучения механизмов, лежащих в основе запрограммированной экспрессии и сборки антител, а также их роли в развитии В-клеток. Кроме того, такая стратегия могла бы обеспечить источник продуцирования полностью человеческих моноклональных антител (МАЬ). Как ожидается, в некоторых воплощениях настоящего изобретения полностью человеческие антитела минимизируют иммуногенные и аллергические реакции, свойственные мышам или антителам (МаЬ), полученным у мыши, и таким образом, в некоторых воплощениях настоящего изобретения увеличивается эффективность и безопасность вводимых антител. В некоторых воплощениях настоящего изобретения полностью человеческие антитела могут использоваться для лечения хронических и рецидивирующих болезней человека, таких как остеопороз, воспаление, автоиммунитет и рак, что может приводить к повторному введению антител.
С помощью генной инженерии можно создать штаммы мыши с дефицитом продуцирования антител мыши с большими фрагментами локуса 1д человека, ожидая при этом, что такие мыши будут вырабатывать антитела человека в отсутствии антител мыши. Большие фрагменты 1д человека могут сохранять большое изменчивое генное многообразие, а также соответствующую регуляцию продуцирования антител и экспрессии. При использовании аппарата мыши для диверсификации и выбора антител, и отсутствие иммунологической толерантности к белкам человека, воспроизведенный спектр антител человека в этих штаммах мыши может привести к получению антител против любого антигена, включая антигены человека, обладающие высоким сродством. При использовании технологии гибридомы можно продуци- 12 021242 ровать и отбирать антиген-специфические человеческие антитела (МаЬ) с заданной специфичностью.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения наряду с вариабельной(ыми) областью(ями) человека можно использовать постоянные области из видов, отличных от видов человека.
Структура антитела природного происхождения.
Структурные единицы антитела природного происхождения обычно включают тетрамер. Каждый такой тетрамер обычно составлен из двух идентичных пар полипептидных цепей, при этом каждая пара имеет одну полномерную легкую (в некоторых воплощениях настоящего изобретения массой приблизительно 25 кДа) и одну полномерную тяжелую цепь (в некоторых воплощениях настоящего изобретения массой приблизительно 50-70 кДа). Аминоконцевая часть каждой цепи обычно включает вариабельную область длиной приблизительно 100-110 или больше аминокислот, который обычно отвечает за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть каждой цепи обычно задает постоянный участок, который может отвечать за функцию эффектора. Легкие цепи человека обычно классифицируются как каппа- и лямбда- легкие цепи. Тяжелые цепи обычно классифицируются как мю-, дельта-, гамма-, альфа- или эпсилон- и задают изотип антитела как 1§М, 1§О, 1§С, 1дА, и 1дЕ соответственно. 1§О имеет несколько подклассов, включая 1дС1, 1дС2, 1дС3, и 1дС4, которыми, однако, число подклассов не ограничивается. 1дМ имеет подклассы, включая 1§М1 и 1дМ2, которыми, однако, число подклассов не ограничивается. 1§А также включает подклассы 1дА1 и 1дА2, которыми, однако, число подклассов не ограничивается. Обычно в пределах полномерных легкой и тяжелой цепей вариабельные и постоянные участки соединены участком 1, состоящим приблизительно из 12 аминокислот или большего числа аминокислот с тяжелой цепью, также включающей участок Ό, состоящий приблизительно из 10 аминокислот. См., например, Фундаментальную иммунологию, Гл. 7 (под ред. Пауль У. (Рои1 V.). 2-е издание, Равен Пресс, НьюЙорк, США (1989)), которая приводится в данном случае в качестве ссылки и может использоваться в любых целях. Вариабельные области каждой легкой/тяжелой пары цепей обычно образуют антигенсвязывающий сайт.
Вариабельные области обычно показывают ту же самую общую структуру относительно сохранившихся участков каркаса (РК), соединенных тремя гиперпеременными участками, также называемыми гипервариабельными областями или СОК. СОК двух цепей каждой пары обычно выравниваются по участкам каркаса, которые могут обеспечить связывание со специфическим эпитопом. От Ν-концевого участка до С-концевого участка вариабельные области как легкой, так и тяжелой цепи обычно включают домены РК1, СОК1, РК2, СОК2, РК3, СОК3 и РК4. Присваивание аминокислот каждому домену обычно происходит в соответствии с определениями Кабата, представленными в работе Последовательности белков для иммунологии (Национальные Институты Здоровья, Бетесда, (1987 и 1991 гг.)), или Хотя и Леск (СНоОиа и Ьекк), Журнал молекулярной биологии (1. Мо1. Вю1.),196:901-917 (1987); Хотя и др. (С1ю1Ыа). Природа (№1иге), 342:878-883 (1989).
Биспецифичные или бифункциональные антитела.
Биспецифичное или бифункциональное антитело обычно является искусственным гибридным антителом с двумя различными парами тяжелых/легких цепей и двумя различными связывающими сайтами. Биспецифичные антитела могут быть получены рядом способов, включая следующие, которыми, однако не ограничивается список применяемых способов: слияние гибридом или связывание фрагментов РаЬ'. См., например, работу авторов Сонгсивилай и Лачманна (БоидкМШ и РаеЬтаии), Клиническая и экспериментальная иммунология (С1ш. Ехр. 1ттипо1.),79: 315-321 (1990), Костельни и др. (Ко81е1иу), Журнал по иммунологии (1. 1ттиио1.) 148:1547-1553 (1992).
Приготовление антител.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения представлены некоторые антитела, специфически связанные с ОПГ лигандом. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела могут быть получены путем иммунизации полномерным ОПГ лигандом, растворимыми формами ОПГ лиганда или его фрагментом. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела могут быть поликлональными или моноклональными и/или могут быть рекомбинантными антителами. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антителами являются антитела человека, приготовленные, например, путем иммунизации трансгенных животных, способных к продуцированию антител человека (см., например, заявку РСТ № \УО 93/12227).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения гипервариабельные области (СОК) вариабельных областей легких и тяжелых цепей аОПГ лиганда-1 могут прививаться участкам каркаса (РК) от того же самого или другого вида. В некоторых воплощениях настоящего изобретения СОК вариабельных областей легких и тяжелых цепей аОПГ лиганда-1 могут прививаться согласованным РК человека. В некоторых воплощениях настоящего изобретения для создания согласованных участков РК человека участки РК нескольких аминокислотных последовательностей тяжелой цепи или легкой цепи человека выравниваются с целью проведения идентифицикации согласованной аминокислотной последовательности. В некоторых воплощениях настоящего изобретения участки РК тяжелой цепи или легкой цепи аОПГ лиганда-1 замещаются участками РК другой тяжелой цепи или легкой цепи. В некоторых воплощениях настоящего изобретения редкие аминокислоты на участках РК тяжелых и легких цепей аОПГ лиганда-1
- 13 021242 не замещаются, в то время как остальные аминокислоты РК замещены. Редкие аминокислоты являются специфическими аминокислотами, которые находятся на таких позициях, на которых они обычно не встречаются на участках РК. В некоторых воплощениях настоящего изобретения привитые вариабельные области аОПГ лиганда-1 могут использоваться с постоянным участком, который отличается от постоянного участка аОПГ лиганда-1. В некоторых воплощениях настоящего изобретения привитые вариабельные области являются фрагментом Ρν одноцепочечного антитела. Прививка СЭР описана, например, в патентах США № 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 и 5530101, которые приводятся в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях.
В соответствии с некоторыми воплощениями настоящего изобретения антитела готовятся путем использования трансгенной мыши, у которой имеется существенная часть антител человека, обеспечивающих встраивание генома, но это создает дефицит продуцирования эндогенных антител мыши. Затем такие мыши могут продуцировать молекулы иммуноглобулина и антитела человека и испытывают дефицит продуцирования молекул иммуноглобулина и антител мыши. Технологии, используемые для достижения этого результата, описаны в патенте, заявках и библиографии, приводимых в данном описании. В некоторых воплощениях настоящего изобретения можно использовать способы, описанные в заявке РСТ \νϋ 98/24893, которая приводится в данном случае в качестве ссылки и может использоваться в любых целях. См. также работу авторов Мендез и др. (Мепйе/). Природная генетика (ЯаШге Оепейск), 15:146156 (1997), которая приводится в данном случае в качестве ссылки и может использоваться в любых целях.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения полностью человеческие моноклональные антитела, специфические для ОПГ лиганда, получают следующим образом. Трансгенные мыши, содержащие гены иммуноглобулина человека, иммунизируются нужным антигеном. Получают лимфатические клетки (такие как В-клетки) мышей, которые экспрессируют антитела. Такие восстановленные клетки сливаются с линией клеток миелоидного типа для приготовления бессмертных клеточных линий гибридомы, и такие клеточные линии гибридомы сортируются и отбираются с целью идентификации клеточных линий гибридомы, которые продуцируют антитела, специфичные к нужному антигену. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается получение клеточных линий гибридомы, которые продуцируют антитела, специфичные к ОПГ лиганду.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела продуцируются линиями гибридомы АМО 6.1, АМО 6.4, АМО 6.5, АМО 7.1 и АМО 7.2. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела продуцируются линиями гибридомы АМО 6.1, АМО 6.4 и АМО 6.5. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела связываются с ОПГ лигандом при константе диссоциации (Кй), равной приблизительно 0,23-0,29 нМ. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела связываются с ОПГ лигандом при Кй меньше 0,23 нМ.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела имеют изотип 1дО2. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела включают легкую каппа цепь человека и тяжелую цепь 1дО2 человека. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела клонировались для экспрессии в клетках млекопитающих. В некоторых воплощениях настоящего изобретения вариабельные области антител сшиваются с постоянным участком, который, однако, не является постоянным участком для изотипа 1дО2.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения консервативные модификации тяжелых и легких цепей аОПГ лиганда-1 (и соответствующие модификации кодирующих нуклеотидов) продуцируют антитела к ОПГ лиганду с функциональными и химическими характеристиками, подобными характеристикам аОПГ лиганда-1. Напротив, существенные модификации функциональных и/или химических характеристик аОПГ лиганда-1 могут достигаться путем подбора замещений в аминокислотной последовательности тяжелых и легких цепей, которые отличаются значительно по их влиянию на сохранение (а) структуры молекулярной основы в области замещения, например, в виде пластовой или спиральной структуры, (Ь) заряда или гидрофобности молекулы на целевом сайте, или (с) основной массы боковой цепи.
Например, консервативное замещение аминокислоты может включать замену природного аминокислотного остатка неприродным остатком таким образом, чтобы не было никакого влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка на этой позиции или чтобы это влияние было небольшим. Кроме того, любой природный остаток в полипептиде может также замещаться аланином, что было описано ранее для аланин-сканирующего мутагенеза.
Требуемые замещения аминокислоты (либо консервативные, либо неконсервативные) могут определяться специалистами тогда, когда такие замещения необходимы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения замещения аминокислоты могут использоваться с целью идентификации важных остатков аОПГ лиганда-1 или для увеличения или уменьшения сродства антител с описанным здесь ОПГ лигандом.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела могут экспрессироваться в клеточных линиях отличных от клеточных линий гибридомы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения
- 14 021242 последовательности, кодирующие определенные антитела, могут использоваться для трансформации подходящей клетки-хозяина млекопитающего. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, трансформация может выполняться любым известным способом с целью введения полинуклеотидов в клетку хозяина, включая, например, упаковку полинуклеотида в вирус (или в вирусный вектор) и трансдукцию клетки хозяина вирусом (или вектором) или с помощью известных способов трансфекции, примеры которых приводятся в патентах США № 4399216, 4912040, 4740461 и 4959455, которые приводятся в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях. В некоторых воплощениях настоящего изобретения используемая процедура трансформации может зависеть от подлежащего трансформации хозяина. Известны следующие способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: опосредованная декстраном трансфекция, осаждение фосфорно-кислого кальция, опосредованная полибреном трансфекция, протопластное слияние, электропорация, инкапсуляция полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомах и направленная микроинъекция ДНК в ядра.
Известны клеточные линии млекопитающих, доступные в качестве хозяев, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: многие иммортализованные клеточные линии можно получить из Американской коллекции тканевых культур (АТТС), включая клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки НеЬа, клетки почек детеныша хомяка (ВНК), клетки почек обезьяны (СО8), клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека (например, Нер 02) и множество других клеточных линий. В некоторых воплощениях настоящего изобретения клеточные линии могут отбираться с помощью определения клеточных линий, имеющих высокие уровни экспрессии и продуцирующих антитела с существенными связывающими свойствами ОПГ лиганда.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения антитела используются для обнаружения ОПГ лиганда в биологических образцах. В некоторых воплощениях настоящего изобретения это позволяет выполнить идентификацию клеток или тканей, которые продуцируют белок. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела, которые образуют связи с ОПГ лигандом и блокируют взаимодействие с другими связывающими составами, могут иметь терапевтическое применение при модуляции дифференцирования (видоизменения) остеокласта и резорбции костной ткани. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела к ОПГ лиганду могут блокировать ОПГ лиганд, образующий связь с ΟΌΑΚ, что может привести к образованию блока в каскаде трансдукции сигнала и потере активации считывания генетического кода, стимулируемой ΝΡ-кВ. Известны, например, анализы для измерения активации считывания генетического кода, стимулируемой ΝΡ-кВ, где используется, например, анализ репортера люциферазы.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются способы лечения заболеваний костной ткани, включая введение терапевтически эффективного количества антител к ОПГ лиганду. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается лечение заболеваний костной ткани, включая введение терапевтически эффективного количества антител к ОПГ лиганду и другого терапевтического средства. В некоторых воплощениях настоящего изобретения вводится дополнительное терапевтическое средство в терапевтически эффективном количестве. В некоторых воплощениях настоящего изобретения заболевание костной ткани является заболеванием, характеризующимся чистой потерей костной ткани, и включает остеопению, остеолиз и другие заболевания. В некоторых воплощениях настоящего изобретения обработка антителом к ОПГ лиганду используется для подавления темпа резорбции костной ткани. Поэтому в некоторых воплощениях настоящего изобретения лечение может использоваться для уменьшения темпа резорбции костной ткани, если темп резорбции выше нормы, или для уменьшения резорбция костной ткани до уровней ниже нормы с целью компенсации уровней остеогенеза, значение которых ниже нормы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитела могут быть проверены на образование связи с ОПГ лигандом при отсутствии или наличии ОПГ и исследованы на их способность замедлять остекластогенезис, стимулированный ОПГ лигандом, и/или резорбцию костной ткани.
К числу состояний, которые можно лечить в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения и которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся:
остеопороз, включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: первичный остеопороз, эндокринный остеопороз (включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: гипертиреоз, гиперпаратиреоз, синдром Кушинга и акромегалия), наследственные и врожденные формы остеопороза (включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: несовершенное костеобразование, гомоцистинурия, синдром Менкеса, Синдром Райли-Дея) и остеопороз вследствие неподвижности конечностей;
болезнь Паджета (деформирующий остит) у взрослых и подростков;
остеомиелит, т.е. инфекционное поражение костной ткани, ведущее к потере костной ткани; гиперкальцемия, включая следующие ее разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: гиперкальцемия в результате солидных опухолей (включая
- 15 021242 следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: груди, легкого и почек) и гематологические злокачественные образования (включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: множественная миелома, лимфома и лейкемия), идиопатическая гиперкальцемия и гиперкальцемия, связанная с гипертиреозом и почечными функциональными расстройствами;
остеопения, включая следующие ее разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: остеопения, возникающая после хирургической операции, остеопения, вызванная введением стероида, остеопения, связанная с заболеваниями тонкой и толстой кишки, и остеопения, связанная с хроническими заболеваниями печени и почек;
остеонекроз, т.е. гибель клеток костной ткани, включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: остеонекроз, связанный с травматическим повреждением, остеонекроз, связанный с Болезнью Гоше, остеонекроз, связанный с анемией серповидных клеток, остеонекроз, связанный с системной красной волчанкой, остеонекроз, связанный с ревматоидным артритом, остеонекроз, связанный с периодонтальным заболеванием, остеонекроз, связанный с остеолитическим метастазом, и остеонекроз, связанный с другим состоянием;
потеря хрящевой ткани и эрозия сустава, связанная с ревматоидным артритом.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может использоваться само по себе или по крайней мере с одним дополнительным терапевтическим средством для лечения заболеваний костной ткани. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду используется вместе с терапевтически эффективным количеством дополнительного терапевтического средства. К числу типичных терапевтических средств, которые могут применяться с антителом к ОПГ лиганду и которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся морфогенные факторы костной ткани, обозначаемые как ВМР-1 - ВМР-12; трансформирующий фактор роста β (ΤΟΡ-β) и члены семейства ΤΟΡ-β; ингибиторы на основе интерлейкина-1 (1Ь-1), включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: 1Ь-1га и его производные и анакинру Кшеге)™; ингибитор ΤΝΡα, включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: растворимый рецептор ΤΝΡα, этанерсепт ЕпЬге1™, антитела к ΤΝΡα, инфликсимаб Венйеабе™. и антитела Ό2Ε7; гормон паращитовидной железы и его аналоги; белок, родственный гормону паращитовидной железы, и его аналоги; простагландины серии Е; бисфосфонаты (такие, как алендронат и другие); усиливающие костную ткань минералы такие, как фторид и кальций; нестероидные противовоспалительные препараты (ΝδΆΣΌδ), включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ингибиторы на основе СОХ-2, такие как селекоксиб Се1еЬгех™ и рофекоксиб νίοχχ™; иммунодепрессанты, такие как метотрексат или лефлуномид; ингибиторы на основе сериновой протеазы, включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: секреторный ингибитор лекоцитарной протеазы (8ЬР1); 1Ь-б ингибиторы (включая антитела к 1Ь-б, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения:), 1Ь-8 ингибиторы (включая антитела к 1Ь-8, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения:); 1Ь-18 ингибиторы (включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: 1Ь-18 связывающий белок и антитела к 1Ь-18); модуляторы интерлейкин-1-конвертирующего энзима (1СЕ); факторы роста фибробласта ΡΟΡ-1 - ΡΟΡ-10 и модуляторы ΡΟΡ; РАР антагонисты; кератиноцитный фактор роста (КОР), молекулы, относящиеся к КОР, и модуляторы КОР; модуляторы матричной металлопротеиназы (ММР); модуляторы синтазы оксида азота (N08), включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: модуляторы индуцибельных N08; модуляторы рецептора глюкокортикоида; модуляторы глутаматного рецептора; модуляторы уровней липополисахарида (ЛПС); и норадреналин и его модуляторы и миметики.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду используется с определенными терапевтическими средствами с целью лечения различных воспалительных состояний, аутоиммунных состояний или других состояний, сопровождаемых потерей костной ткани. В некоторых воплощениях настоящего изобретения, принимая во внимание состояние и уровень необходимого лечения, может применяться два, три или большее число лекарственных средств. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие лекарственные средства могут применяться вместе путем включения в один и тот же состав. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие лекарственные средства и антитело к ОПГ лиганду могут применяться вместе путем включения в один и тот же состав. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие лекарственные средства могут применяться вместе путем включения в набор для лечения. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие лекарственные средства и антитело к ОПГ лиганду могут применяться вместе путем включения в набор для лечения. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие лекарственные средства могут применяться отдельно. В некоторых воплощениях настоящего изобретения, когда лекарственные средства вводятся путем генной терапии, гены, кодирующие средства на основе белка и/или антитело к ОПГ лиганду,
- 1б 021242 могут быть включены в один и тот же вектор. В некоторых воплощениях настоящего изобретения гены, кодирующие лекарственные средства на основе белка и/или антитело к ОПГ лиганду, могут контролироваться одинаковой областью промотора. В некоторых воплощениях настоящего изобретения лекарственные средства на основе белка, кодирующего гены, и/или антитело к ОПГ лиганду могут находиться в отдельных векторах.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения рассматриваются терапевтические методы, включающие применение антитела к ОПГ лиганду и по крайней мере одного ингибитора на основе интерлейкиа-1 (1Ь-1), и способы лечения с использованием таких терапевтических методов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения терапевтический метод включает применение антитела к ОПГ лиганду и ингибитора 1Ь-1 и по крайней мере одну дополнительную рассматриваемую здесь молекулу. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются способы лечения с использованием ингибиторов 1Ь-1 и/или ТОТа ингибиторы в соединении с антителом к ОПГ лиганду. В некоторых воплощениях настоящего изобретения для лечения таких состояний как астма, ревматоидный артрит и множественный склероз может использоваться антитело к ОПГ лиганду в сочетании с ингибиторами 1Ь-1 и/или ингибиторами ΤΝΕα.
Интерлейкин-1 (1Ь-1) является противовоспалительным цитокином. Согласно некоторым примерам 1Ь-1 является посредником при многих заболеваниях и болезненных состояниях. Согласно некоторым примерам 1Ь-1 вырабатывается клеточной линией макрофага/моноцита. Согласно некоторым примерам 1Ь-1 вырабатывается двух видов: альфа 1Ь-1 (1Ь-1а) и бета 1Ь-1 (ЕС-1 β).
Как полагают, болезнь или болезненное состояние является заболеванием, стимулированным интерлейкином-1, если спонтанно или в экспериментах болезнь или болезненное состояние связаны с повышенными уровнями ЕЬ-1 в жидкостях или тканях тела и/или если клетки или ткани, взятые из тела, продуцируют повышенные уровни ЕС-1 в культуре. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такое заболевание, стимулированное интерлейкином-1, также распознается по следующим двум дополнительным условиям: (1) данные патологических исследований, связанные с болезнью или болезненным состоянием, могут быть имитированы экспериментально на животных путем введения ЕС-1 или увеличением экспрессии 1Ь-1; и (2) патология, вызванная в экспериментах на животных с помощью модельных болезней или болезненных состояний, может замедляться или прекращаться путем лечения с помощью лекарственных средств, которые замедляют действие 1Ь-1. В некоторых воплощениях настоящего изобретения один или большее число описанных выше состояний встречаются при заболеваниях, стимулированных 1Ь-1. В некоторых воплощениях настоящего изобретения все три состояния встречаются при заболеваниях, стимулированных 1Ь-1.
К числу острых и хронических заболеваний, стимулированных интерлейкином-1 (ЕС-1), которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся острый панкреатит; амиотрофический боковой склероз (АЬ§, или болезнь Лу Джехрига); болезнь Алжеймера; кахексия/анорексия, включая кахексию, вызванную СПИДом, которой, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения; астма и другие легочные болезни; атеросклероз; аутоиммунный васкулит; хронический синдром усталости; болезни, связанные с С1о8йтйшт, включая понос, связанный с С1о8йтйшт, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения; коронарные состояния и признаки, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: застойная сердечная недостаточность, коронарный рестеноз, инфаркт миокарда, миокардиальная дисфункция (например, связанная с сепсисом), и шунтирование трансплантатом коронарной артерии; рак, включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: лейкозы, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: множественная миеловидная лейкемия и миелогенез (например, АМЛ и СМЛ), и метастаз опухоли; диабет (включая инсулин-зависимый диабет, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения); эндометриоз; лихорадка; фибромиальгия; гломерулонефрит; реакция - трансплантат против реципиента и/или отторжение трансплантата; геморрагический удар; гипералгезия; воспалительное заболевание кишки; воспалительные состояния сустава, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: остеоартрит, псориатический артрит и ревматоидный артрит; воспалительное заболевание глаз, включая связанное, например, с трансплантацией роговицы, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения; ишемия, включая ишемию головного мозга (включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: повреждение головного мозга в результате, например, травмы, эпилепсии, кровотечения или удара, каждый из которых может приводить к нейродегенерации), которой, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения; болезнь Кавасаки; ухудшение обучаемости; болезни легких (включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: синдром острого респираторного заболевания, или ОРЗ); множественный склероз; миопатии (например, белковый обмен в мышцах, включая белковый обмен в мышцах при сепсисе, которым, однако, не ограничивается область применения на- 17 021242 стоящего изобретения:); нейротоксичность (включая такое состояние, вызванное ВИЧ, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения:); остеопороз; боль, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: боль, связанная с раком; болезнью Паркинсона; периодонтальным заболеванием; преждевременными родами; псориаз; реперфузионное повреждение; септический шок; побочные эффекты лучевой терапии; заболевание височно-нижнечелюстного сустава; нарушение сна; увеит; и воспалительное состояние в результате, например, напряжения, растяжения связок, повреждения хряща, травмирования, ортопедической операции, инфекции или других болезненных процессов.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения 1Ь-1 ингибитором может быть любой белок или молекула, способные специфически предотвращать активацию клеточных рецепторов к 1Ь-1, в основе чего могут лежать любые механизмы. К числу типичных механизмов, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся, снижение продуцирования 1Ь-1, связывание свободного 1Ь-1, препятствование связыванию 1Ь-1 с его рецептором, препятствование образованию комплекса рецептора 1Ь-1 (т.е. связь 1Ь-1 рецептора с дополнительным белком рецептора 10-1), и препятствование модуляции сигнализации 10-1 после связывания с его рецептором.
К числу некоторых ингибиторов интерлейкина-1, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения относится анакинра Ииете!™, 1Ь-1га, варианты 101та, и 1Ь-1та производные, которые все вместе называются белки 1Ь-1та; моноклональные антитела против рецептора 10-1 (см., например, патент ЕР 623674, который приводится в данном случае в качестве ссылки); белки, связывающие 1Ь-1, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: растворимые 10-1 рецепторы (см., например, патенты США № 5492888, 5488032, 5464937, 5319071 и 5180812, которые приводятся в данном случае в качестве ссылки); моноклональные антитела к 10-1 (см., например, АО 9501997, АО 9402627, АО 9006371, патент США № 4935343, ЕР 364778, ЕР 267611 и ЕР 220063, которые приводятся в данном случае в качестве ссылки); дополнительные белки рецептора 10-1 и антитела к ним (см., например, АО 96/23067 и АО 99/37773, которые приводятся в данном случае в качестве ссылки); ингибиторы интерлейкин-1-бетаконвертирующего энзима (1СЕ) или каспаза 1 (см., например, АО 99/46248, АО 99/47545 и АО 99/47154, которые приводятся в данном случае в качестве ссылки), который может использоваться для замедления продуцирования и секреции 1Ь-1-бета; ингибитор интерлейкин-1-бета протеазы; и другие составы и белки, которые блокируют ίη νίνο синтез или внеклеточное выделение 1Ь-1.
Типичные ингибиторы 10-1 раскрыты, например, в патенте США № 5747444; 5359032; 5608035; 5843905; 5359032; 5866576; 5869660; 5869315; 5872095; 5955480; 5965564; международных заявках (АО) 98/21957, 96/09323, 91/17184, 96/40907, 98/32733, 98/42325, 98/44940, 98/47892, 98/56377, 99/03837, 99/06426, 99/06042, 91/17249, 98/32733, 98/17661, 97/08174, 95/34326, 99/36426, 99/36415; европейских заявках (ЕР) 534978 и 894795; и французской заявке РК 2762514. Все вышеупомянутые источники приводятся в данном случае в качестве ссылки и могут использоваться в любых целях.
Антагонист рецептора интерлейкина-1 (10-1га) является белком человека, который действует как естественный ингибитор интерлейкина-1 и является членом семейства 1Ь-1, которое включает 1Ь-1а и 10-1 β. Некоторые антагонисты рецептора, включая 1Ь-1та и его варианты и производные, а также способы их получения и использования описаны в патенте США № 5075222; заявке АО 91/08285; заявке АО 91/17184; АИ 9173636; заявке АО 92/16221; заявке АО 93/21946; заявке АО 94/06457; заявке АО 94/21275; РК 2706772; заявке АО 94/21235; ΌΕ 4219626, АО 94/20517; заявке АО 96/22793; заявке АО 97/28828 и заявке АО 99/36541, которые приводятся в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антагонист рецептора 10-1 может быть гликозилированным. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антагонист рецептора 10-1 может быть негликозилированным.
В патенте США № 5075222 (далее - патент '222) описаны три формы 1Ь-1та и варианты. Для первой формы под названием Σ0-1Ϊ в патенте '222 характерна молекула массой 22-23 кДа, выделенная методом δΌδ-РАОЕ с изоэлектрической точкой приблизительно в районе 4,8, которая выделяется из колонки Моно β РРЬС приблизительно при 52 мМ ЫаС1 в буфере Трис, рН 7,6. Для второй формы 1Ь1гав характерен белок массой 22-23 кДа, который выделяется из колонки Моно β приблизительно при 48 мМ ЫаС1. Как 1Ь-1таа, так и 1Ь-1гав гликозилированы. Для третьей формы 1Ь-1гах характерен белок массой 20 кДа, который выделяется из колонки моно β приблизительно при 48 мМ ЫаС1 и не гликозилирован. В патенте '222 также описаны некоторые способы выделения генов, которые кодируют ингибиторы, клонирования этих генов в подходящих векторах, трансформирования и трансфекции этих генов в некоторые типы клеток, и экспрессии этих генов для получения ингибиторов.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения делеции, вставки и/или замещения (по отдельности или все вместе называемые вариантом (вариантами)) выполняются в пределах аминокислотных последовательностей 1Ь-1та. В некоторых воплощениях настоящего изобретения вариант 1Ь-1та биологически активен (например, обладает способностью подавлять 10-1).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложен терапевтический метод, включаю- 18 021242 щий применение антитела к ОПГ лиганду и по крайней мере одного ингибитора ΤΝΡα, и способы лечения, в которых применяется этот терапевтический метод. В некоторых воплощениях настоящего изобретения терапевтический метод включает применение антитела к ОПГ лиганду и ингибитора ΤΝΡα и по крайней мере одной описываемой здесь дополнительной молекулы.
Некоторые заболевания и болезненные состояния стимулированы ΤΝΡ и могут классифицироваться как воспалительные состояния. В данном контексте под выражением заболевание, стимулированное ΤΝΡ следует понимать болезнь или болезненное состояние, которое связано с повышенными уровнями ΤΝΡ в жидкостях или тканях организма и/или, если клетки или ткани, взятые из тела, продуцируют повышенные уровни ΤΝΡ в культуре. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такое заболевание, стимулированное ΤΝΡ, распознается по следующим двум условиям (1), патологические результаты, связанные с болезнью или болезненным состоянием могут быть имитированы экспериментально на животных путем введения ΤΝΡ или повышения экспрессии ΤΝΡ и/или (2), патология, вызванная в экспериментах на животных с помощью модельных болезней или болезненных состояний, может замедляться или прекращаться путем лечения с помощью лекарственных средств, которые замедляют действие ΤΝΡ.
К числу некоторых острых и хронических заболеваний, стимулируемых ΤΝΡ, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся: кахексия и анорексия; рак, включая лейкоз, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения; хронический синдром усталости; коронарные состояния и/или признаки, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: застойная сердечная недостаточность, коронарный рестеноз, инфаркт миокарда, миокардиальная дисфункция (включая состояние, связанное с сепсисом, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения), и шунтирование трансплантатом коронарной артерии; депрессия; диабет, включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ювенильный диабет типа 1, сахарный диабет, и резистентность к инсулину (включая резистентность к инсулину, связанную с ожирением, которой, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения); эндометриоз, эндометрит и связанные состояния; фибромиальгия и аналгезия; реакция - трансплантат против хозяина; гипералгезия; воспалительные болезни кишки, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: болезнь Крона и С1о51пбшт бгГйсйе - связанная диарея; ишемия, включая следующие ее разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ишемия головного мозга, включая следующие ее разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: повреждение головного мозга в результате травмы, эпилепсии, кровотечения, и/или шока; болезнь легкого, включая следующие ее разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: острое респираторное заболевание взрослых, астма, и легочный фиброз; множественный склероз; нейровоспалительные болезни; глазные болезни и состояния, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: трансплантат роговицы, дегенерация глаз и увеит; боль, включая следующие ее разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: боль, связанная с раком; панкреатит; периодонтальные болезни; РйупаЧх гиЬга рпагго (РРР); простатит, включая бактериальный и небактериальный простатит, и связанные состояния; псориаз и связанные состояния; легочный фиброз; реперфузионное повреждение; ревматизмы, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ревматоидный артрит, остеоартрит, ювенальный артрит (включая ювенальный ревматоидный артрит, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения:), серонегативный полиартрит, анкилозирующий спондилит, синдром Рейтера и реактивный артрит, болезнь Стилла, псориатический артрит, энетропатический артрит, многомиозит, дерматомиосит, склеродермия, системный склероз, васкулит (например, болезнь Кавасаки), васкулит головного мозга, болезнь Лима, артрит, вызываемый стафилококком (септический), синдром Сджагрена, ревматическая лихорадка, полихондрит и ревматоидная полимиалгия и узелковый периартериит); септический шок; побочные эффекты от лучевой терапии; системная красная волчанка (8ЬЕ); заболевание височно-нижнечелюстного сустава; тиреоидит; и трансплантация ткани и/или воспалительное состояние, например, в результате напряжения, растяжения связок, повреждения хряща, травмы, ортопедической операции, инфекции (например, ВИЧ, С1о51пб1ит бГйсйе и связанные виды) или процесса другой болезни.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения ингибиторы ΤΝΡ могут действовать по крайней мере одним из перечисленных ниже способов: путем понижения продуцирования или ингибирования ΤΝΡ, связывания свободного ΤΝΡ, препятствования связыванию ΤΝΡ с его рецептором и препятствования модулированию сигнализации ΤΝΡ после связывания с его рецептором. Под термином ингибитор ΤΝΡ следует понимать растворимые рецепторы ΤΝΡ, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: растворимый рецептор фактора некроза опухоли типа I (δΤΝΡΚ1; называемый также рецептором р55), растворимый рецептор фактора некроза опухоли типа II (называемый также рецептором р75), и этанерсепт ЕиЬге1™; антитела к ΤΝΡ,
- 19 021242 включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: инфликсимаб Кешюабе™ и Ό2Ε7 (см., например, патент США № 6090382 и 6258562); антитела к рецептору ΤΝΕ; δΤΝΡΚΙ (см., например, \О 98/24463), этанерсепт (ЕпЬге1™), Ауакше™; ингибиторы ΤΝΡα-конвертирующего энзима (ТАСЕ); другие молекулы, которые влияют на активность ΤΝΡ.
Типичные ингибиторы ΤΝΡα описаны, например, в европейских заявках ЕР 308378; ЕР 422339; ЕР
393438; ЕР 398327; ЕР 412486; ЕР 418014; ЕР 417563; ЕР 433900; ЕР 464533; ЕР 512528; ЕР 526905; ЕР
568928; ЕР 607776, в которых описано использование лефлуномида для ингибирования ΤΝΡα; ЕР 663210; ЕР 542795; ЕР 818439; ЕР 664128; ЕР 542795; ЕР 741707; ЕР 874819; ЕР 882714; ЕР 880970; ЕР
648783; ЕР 731791; ЕР 895988; ЕР 550376; ЕР 882714; ЕР 853083; ЕР 550376; ЕР 943616; ЕР 939121; ЕР
614984; ЕР 853083; патентах США № 5136021; 5929117; 5948638; 5807862; 5695953; 5834435; 5817822; 5830742; 5834435; 5851556; 5853977; 5359037; 5512544; 5695953; 5811261; 5633145; 5863926; 5866616; 5641673; 5869677; 5869511; 5872146; 5854003; 5856161; 5877222; 5877200; 5877151; 5886010; 5869660; 5859207; 5891883; 5877180; 5955480; 5955476; 5955435; 5994351; 5990119; 5952320; 5962481; международных заявках \О 90/13575, \\'О 91/03553, \\'О 92/01002, \\'О 92/13095, \\'О 92/15221, \\'О 93/07863, \\'О 93/21946, \\'О 93/19777, \\'О 95/34326, \\'О 96/28546, \\'О 98/27298, \\'О 98/30541, \\'О 96/38150, \\'О 96/38150, \О 97/18207, \О 97/15561, \О 97/12902, \О 96/25861, \О 96/12735, \О 96/11209, \О
98/39326, \О 98/39316, \О 98/38859, \О 98/39315, \О 98/42659, \О 98/39329, \О 98/43959, \О
98/45268, \О 98/47863, \О 96/33172, \О 96/20926, \О 97/37974, \О 97/37973, \О 97/47599, \О
96/35711, \О 98/51665, \О 98/43946, \О 95/04045, \О 98/56377, \О 97/12244, \О 99/00364, \О
99/00363, \О 98/57936, \О 99/01449, \О 99/01139, \О 98/56788, \О 98/56756, \О 98/53842, \О
98/52948, \О 98/52937, \О 99/02510, \О 97/43250, \О 99/06410, \О 99/06042, \О 99/09022, \О
99/08688, \О 99/07679, \О 99/09965, \О 99/07704, \О 99/06041, \О 99/37818, \О 99/37625, \О
97/11668, \О 99/50238, \О 99/47672, \О 99/48491; японских заявках 10147531, 10231285, 10259140, и 10130149, 10316570, 11001481, и 127,800/1991; немецкой заявке № 19731521; и британских заявках № 2218101, 2326881, 2246569. Все библиографические ссылки, приводимые в данном изобретении, могут использоваться для любой цели.
В европейских заявках ЕР 393438 и ЕР 422339 описывается аминокислота и последовательности нуклеиновой кислоты растворимого рецептора ΤΝΡ типа I (известного также как δΤΝΡΚ-Ι или ингибитор ΤΝΡ массой 30 кДа) и растворимого рецептора ΤΝΡ типа II (известного также как δΤΝΡΚ-ΙΙ или ингибитор ΤΝΡ массой 40 кДа), которые все вместе называются δΤΝΡΚ. В заявках ЕР 393438 и ЕР 422339 также описываются модифицированные формы δΤΝΡΚ-Ι и δΤΝΡΚ-ΙΙ, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: фрагменты, функциональные производные и варианты. Кроме того, в заявках ЕР 393438 и ЕР 422339 описаны некоторые способы выделения генов, которые кодируют ингибиторы, клонирования этих генов в подходящих векторах, трансформирования и трансфекции этих генов в некоторые типы клеток, и экспрессии этих генов для получения ингибиторов.
δΤΝΡΚ-Ι и δΤΝΡΚ-ΙΙ являются членами суперсемьи рецепторов фактора роста нервов/рецептора ΤΝΡ, которая включает рецептор фактора роста нервов (ΝΟΡ), антиген В-клеточный СЭ40, 4-1 ВВ, Тклеточный антиген крысы МКС ОХ40, антиген фас, и антигены СЭ27 и СЭ30 (Смит и др. (διηίΐΐι), (1990), Наука (8с1епсе). 248:1019-1023). Сохраняемой особенностью этой группы рецепторов поверхности клетки является домен, связывающий богатый цистеином внеклеточный лиганд, который может быть разделен на четыре повторяемых участка, состоящих приблизительно из сорока аминокислот, которые содержат от 4 до 6 цистеиновых остатков в позициях, которые хорошо сохраняются (Смит и др. (διηίΐΐι) (1990), см. выше).
В заявке ЕР 393438 предложен Δ51 ингибитора ΤΝΡ массой 40 кДа и Δ53 ингибитора ΤΝΡ массой 40 кДа, которые являются усеченными версиями полномерного рекомбинантного белка ингибитора ΤΝΡ массой 40 кДа. Δ51 и Δ53 имеют соответственно 51 или 53 аминокислоты, удаленные из карбоксиконцевого участка зрелого белка.
В опубликованной заявке РСТ \О 98/01555 описаны усеченные формы δΤΝΡΚ-Ι и δΤΝΡΚ-ΙΙ, которые не содержат четвертый домен (аминокислотные остатки ΤΗτ127-Αδη161 δΤΝΡΚ-Ι и аминокислотные остатки Ργο141-ΤΡγ179 δΤΝΡΚ-ΙΙ); часть третьего домена (аминокислотные остатки Αδη111-Суδ126 δΤΝΡΚ-Ι и аминокислотные остатки Рго123-Р\ъ14° δΤΝΡΚ-ΙΙ); и, произвольно, не содержат часть первого домена (аминокислотные остатки Αδρ1-Суδ19 δΤΝΡΚ-Ι и аминокислотные остатки ^еи1-Суδ32 δΤΝΡΚ-ΙΙ). В некоторых воплощениях настоящего изобретения усеченные δΤΝΡΚ включают белки, представленные формулой Κι-|0δ -ί’νδ ]-Κ2 и Κ,|-|€?νδ -Суδ ]-Κ5. Эти белки являются усеченной формой δΤΝΡΚ-Ι и δΤΝΡΚ-ΙΙ соответственно.
В данном контексте Κ1-[Суδ19-Суδ1СI3]-Κ2 представляет один или большее число белков, при этом [Суδ19-Суδ103] представляют с 19-го по 103-й остаток δΤΝΡΚ-Ι, последовательность которых показана на фиг. 1 заявки \О 98/01555; при этом Κ1 представляет метионилированную или неметионилированную аминогруппу остатка Суδ19 или один остаток или большее число аминокислотных остатков аминоконце- 20 021242 вых участков, выбираемых из группы остатков, в состав которой входят остатки от Су818 до Л8р'; а К2 при этом представляет карбоксильную группу остатка Су8103 или один остаток или большее число аминокислотных остатков карбоксиконцевого участка, выбираемых из группы остатков, в состав которой входят остатки от РЬе104 до Ьеи110.
Типичные усеченные 8ΤΝΡΚ-Ι по настоящему изобретению, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, включают 8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Э/С105, 8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Э/С106, 8ΤΝΡΚ-Ι 2.6Ό/Ν105, 8ΤΝΡΚ-Ι 2.3Ό/68, 8ΤΝΡΚ-Ι 2.3Ό/618, 8ΤΝΡΚ-Ι 2.3Ό/615 либо метионилированные, либо неметионилированные, и их варианты и производные. Некоторые типичные усеченные 8ΤΝΡΚ-Ι описаны, например, в опубликованной заявке РСТ \УО 98/01555.
В данном контексте К3-[Су832-Су8115]-К4 представляет один или большее число белков, при этом [Су8 -Су8 ] представляют остатки Су8 -Су8 8ΤΝΡΚ-ΙΙ, последовательность которого показана на фиг. 8 заявки \УО 98/01555; при этом К3 представляет метионилированную или неметионилированную аминогруппу Су832 или один остаток или большее число аминокислотных остатков аминоконцевого участка, выбираемых из группы остатков, в состав которой входят остатки от Су831 до Ьеи1; а К4 при этом представляет карбоксильную группу Су8115 или один остаток или большее число аминокислотных остатков карбоксиконцевого участка, выбираемых из группы остатков, в состав которой входят остатки от А1а116 до Агд122.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложен терапевтический метод, включающий применение антитела к ОПГ лиганду и по крайней мере одного ингибитора на основе протеазы серина, и предложены способы лечения, использующие такие терапевтические методы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения терапевтический метод включает применение антитела к ОПГ лиганду и ингибитора протеазы серина и по крайней мере одной описываемой здесь дополнительной молекулы.
Эндогенные протеолитические ферменты могут разлагать внедренные организмы, комплексы антиген-антитело и некоторые белки ткани, которые больше не являются необходимыми или полезными. Дополнительные протеолитические ферменты в организм можно ввести с помощью инфекционных средств. Ингибиторы протеазы могут регулировать как эндогенные, так и внедренные протеолитические ферменты.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения ингибиторы протеазы природного происхождения служат для контроля за эндогенными протеазами путем локального и временного ограничения их реакций. В некоторых воплощениях настоящего изобретения ингибиторы протеазы могут подавлять протеазы, введенные в тело инфекционными агентами. Согласно некоторым примерам ткани, которые являются особенно склонными к протеолитической атаке и инфекции, включая инфекции, поступающие из дыхательного тракта, которыми, однако, не ограничивается список инфекций, богаты ингибиторами протеазы.
Ингибиторы протеазы содержат приблизительно 10% белков плазмы человека. Из этого источника было выделено не менее восьми ингибиторов и их характеристики приведены в литературе. К числу этих ингибиторов, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся альфа 2-макроглобулин (альфа 2М), ингибитор альфа 1-протеаза (альфа №Ι), альфа 1антихимотрипсин (альфа 1АсЬу), альфа-1-антиколлагеназа (альфа 1АС) и ингибитор интер-альфатрипсин (Ι-альфа-!).
Согласно некоторым примерам нарушение баланса между протеазой и ингибитором протеазы может приводить к разрушению ткани, стимулированной протеазой, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается список разрушений: эмфизема, артрит, гломерулонефрит, периодонтит, мышечная дистрофия, прорастание опухолью и различные другие патологические состояния. В некоторых ситуациях, например, при тяжелых патологических процессах таких, как сепсис или острый лейкоз, наличие определенного количества свободных протеолитических ферментов может увеличиваться вследствие выделения фермента из секреторных клеток.
Кроме того, согласно некоторым примерам пониженная способность организма к регуляции ингибитора также может вызывать изменения баланса между протеазой и ингибитором протеазы. Примером такой пониженной способности к регуляции ингибитора, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, является дефицит ингибитора альфа 1-протеазы, который коррелируется с развитием эмфиземы легких.
Согласно некоторым примерам серьезное повреждение организма может происходить тогда, когда до принятия мер по контролю за протеолитическими ферментами существуют такие аберрантные условия. Поэтому было обнаружено, что ингибиторы протеазы могут вводиться в организм для контроля за протеолитическими ферментами.
К числу примеров класса протеаз, известных как протеазы серина, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится эластаза лейкоцита, трипсин, катепсин С и панкреатическая эластаза.
Согласно некоторым примерам при внеклеточном выделении эластаза лейкоцитов разлагает соединительную ткань и другие ценные белки. В случае нормальным образом функционирующего организма
- 21 021242 разлагается некоторое количество соединительной ткани и других белков, в то время как наличие чрезмерного количества эластазы лейкоцитов может быть связано с различными патологическими состояниями, включая эмфизему и ревматоидный артрит, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения. В некоторых воплощениях настоящего изобретения для противодействия влиянию эластазы лейкоцитов, если она присутствует в количествах превышающих нормальный уровень, был найден ингибитор протеазы, который является специфическим для эластазы лейкоцитов. Такой ингибитор протеазы может использоваться, если его можно выделить или приготовить в очищенном виде и в количествах, достаточных для фармацевтического использования.
Некоторые ингибиторы эластазы лейкоцитов описаны, например, в работе Шислерета и др. (8сЫекк1ете1) а1., Кислотоустойчивые ингибиторы нейтральных протеаз гранулоцитов в секретах слизистой человека: биохимия и возможная биологическая функция, в книге Нейтральные протеазы полиморфнонуклеарных лейкоцитов человека, ред. Хавеман и др. (Науетапп), Компания Урбан и Шварценберг (ИтЬап апЛ 8с11\уаг/епЬегд. 1пс) (1978), и в работе Трависа и Салвесена (Ттау15 и 8а1уекеп), Ежегодное обозрение по биохимии, 52: 655-709 (1983).
Согласно некоторым примерам трипсин инициирует разложение некоторой мягкой ткани органа, например, панкреатической ткани, во время разных острых состояний, включая панкреатит, которым, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения. Ингибитор трипсина может применяться, если его можно выделить и приготовить в очищенном виде и в количествах, достаточных для фармацевтического использования.
Катепсин 0 является еще одной протеазой, присутствующей в лейкоцитах. В некоторых воплощениях настоящего изобретения катепсин О способен разлагать разные белки ш νίίτο, включая белки комплементарного пути. Панкреатическая эластаза является еще одной протеазой, которая может играть определенную роль при панкреатите. Таким образом, ингибиторы для этих протеаз также могут иметь фармацевтическое значение.
Как полагают, в некоторых воплощениях настоящего изобретения специфичность субстрата и чувствительность к различным ингибиторам протеаз серина возникает вследствие замещений только нескольких аминокислотных остатков. Точно так же можно полагать и о классе ингибиторов протеазы серина, в которых замещение относительно небольшого числа аминокислот приводит к подавлению различных протеаз. В некоторых воплощениях настоящего изобретения член этого класса подавляет каждую протеазу серина.
Типичным ингибитором протеазы серина является секреторный ингибитор лейкоцитарной протеазы (8ЬР1) и его фрагменты и аналоги. К числу типичных ингибиторов сериновой протеазы, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся, антилейкопротеаза (АЬР), ингибитор слизистой протеазы (ΜΡΙ), ингибитор семенной жидкости человека I (НИ81-1), ингибитор бронхиальной слизи (ΒΜΙ) и ингибитор цервикальной слизи (СИ81). В некоторых воплощениях настоящего изобретения ингибиторы сериновой протеазы также могут быть модулятором ЛПС. См., например, работу авторов Джин и др. (Еп). (1997), Клетка (Се11) 88 (3): 417-26. В некоторых воплощениях настоящего изобретения эти молекулы хорошо подходят для использования в условиях, приводящих к потере костной ткани, потому что они предпочтительно направляются к хрящу.
Типичные ингибиторы сериновой протеазы описаны, например, в патентах США № 4760130; 5900400 и 5633227; которые представлены в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях. Молекулы, раскрытые в предшествующих источниках, а также любые их варианты или аналоги называются ингибиторами сериновой протеазы.
1Ь-18 является провоспалительным цитокином, который, как оказалось, индуцирует интерферон-γ, и ранее назывался гамма интерферон индуцирующим фактором (Ι0ΙΕ). Согласно некоторым примерам 1Ь-1 повышает продуцирование 1Ь-18, а 1Ь-18 индуцирует продуцирование целого ряда провоспалительных цитокинов, включая 1Ь-6 и ММР-1. См., например, работу авторов Динарелло и др. (ОтатеШ), (1998), Журнал биологии лейкоцитов (ί. Ьеикосу1е Βίο1.), 63: 658-64. Согласно некоторым примерам для продуцирования 1Ь-18 важна также каспаза I. Экспериментальным путем показано, что ΤΝΕα регулирует продуцирование 1Ь-18 и что одновременное ингибирование ΤΝΕα и 1Ь-18 обеспечивает защиту от токсичности печени. См., например, авторов Фаджони и др. (Раддюш), (2000), ΡΝΑ8 97:2367-72.
1Ь-18 действует ш νίνο через систему рецептора, напоминающую о 1Ь-1 системе. 1Ь-18 взаимодействует с рецептором поверхности клетки (1Ь-18К), который взаимодействует с дополнительным белком (1Ь-18КАсР). После образования комплекса 1Ь-18, 1Б-18К и 1Ь-18КасР продолжается сигнализация, стимулированная 1Ь-18. Природным ингибитором для 1Ь-18 является 1Ь-18Ьр. В некоторых воплощениях настоящего изобретения 1Ь-18Ьр действует как рецептор приманки с образованием связи с 1Ь-18 молекулами, предотвращая взаимодействие с 1Ь-18К.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предложен терапевтический метод, включающий применение антитела к ОПГ лиганду и по крайней мере одного ингибитора 1Ь-18, и способ лечения, использующий такие терапевтические методы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения терапевтический метод включает применение антитела к ОПГ лиганду и 1Ь-18 ингибитора и по крайней мере
- 22 021242 одной описываемой здесь, дополнительной молекулы. К числу типичных состояний, которые могут лечиться в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения и которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся воспаление, аутоиммунные болезни, болезни, стимулируемые 1Ь-1, и болезни, стимулируемые ΤΝΡ. К числу типичных состояний, которые могут лечиться антителом к ОПГ лиганду и по крайней мере одним 1Ь-18 ингибитором в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения и которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится артрит, включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ревматоидный артрит; системная красная волчанка (8ЬЕ); реакция - трансплантат против хозяина (ΟνΗΌ); гепатит; сепсис; потеря костной и хрящевой ткани, сопровождающая эти болезни.
К числу типичных 1Ь-18 ингибиторов, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся, антитела, которые образуют связи с 1Ь-18; антитела, которые образуют связи с 1Ь-18К; антитела, которые образуют связи с 1Ь-18КАсР; 1Ь-18Ьр; 1Ь-18К фрагменты (например, растворяемый внеклеточный домен рецептора 1Ь-18); пептиды, которые образуют связи с 1Ь-18 и снижают или предотвращают его взаимодействие с 1Ь-18К; пептиды, которые образуют связи с 1Ь-18К и снижают или предотвращают его взаимодействие с 1Ь-18 или с 1Ь-18КАсР; пептиды, которые образуют связи с 1Ь-18КАсР и снижают или предотвращают его взаимодействие с 1Ь-18К; и малые молекулы, которые снижают или предотвращают продуцирование 1Ь-18 или взаимодействие между любыми из 1Ь-18, 1Ь-18К и 1Ь-18КАсР.
Ингибиторы 1Ь-18 описаны, например, в патенте США № 5912324, опубликованном 14 июля 1994 г.; заявке ЕР 0962531, опубликованной 8 декабрь 1999 г.; заявке ЕР 712931, опубликованной 15 ноября 1994 г.; патенте США № 5914253, опубликованном 14 июля 1994 г.; заявке АО 97/24441, опубликованной 10 июля 1997 г.; патенте США № 6060283, опубликованном 9 мая 2000 г.; заявке ЕР 850952, опубликованной 26 декабря 1996 г.; заявке ЕР 864585, опубликованной 16 сентября 1998 г.; заявке АО 98/41232, опубликованной 24 сентября 1998 г.; патенте США № 6054487, опубликованном 25 апреля 2000 г.; заявке АО 99/09063, опубликованной 14 августа 1997 г.; заявке АО 99122160, опубликованной 3 ноября 1997 г.; заявке АО 99/37772, опубликованной 23 января 1998 г.; заявке АО 99/37773, опубликованной 20 марта 1998 г.; заявке ЕР 0974600, опубликованной 26 января 2000 г.; заявке АО 00/12555, опубликованной 9 марта 2000 г.; японской заявке 1Р 111399/94, опубликованной 31 октября 1997 г.; израильской заявке 1Ь 121554 А0, опубликованной 8 февраля 1998 г.; которые приводятся в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может использоваться по крайней мере с одним терапевтическим средством от воспаления. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может использоваться по крайней мере с одним терапевтическим средством от иммунных заболеваний. К числу типичных терапевтических средств от воспаления и иммунных заболеваний, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся, кортикостероиды, включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: преднизолон; нестероидные противовоспалительные препараты (ΝδΑΙΌδ), включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ингибиторы циклооксигеназы типа 1 (СОХ 1), и циклооксигеназы типа 2 (СОХ 2); изменяющие болезнь противоревматические препараты (ΌΜΑΚΌδ), включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: метотрексат, гидроксихлорохин, хлорохин, циклоспорин, золотосодержащие составы (такие как аурофин, ауротималат и ауротиоглюкоза), и лефлуномид; ингибиторы фосфодистеразы типа IV, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ролипрам и пентоксифилин; такролимус (РК-506); сиролимус (рапамицин); микофенольная кислота; ингибиторы 5-липоксигеназы, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: зилеутон; модуляторы интерлейкина 6 (1Ь-6); малые модуляторы молекулы активизированной митогеном протеинкиназы массой 38 кДа (р38ΜΑРК); малые модуляторы внутриклеточных молекул, вовлеченных в пути воспаления, причем к числу таких внутриклеточных молекул, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся _)пк, 1КК, ΝΡ-кВ, ΖΑР70 и 1ск. Некоторые типичные терапевтические средства против воспаления описаны, например, в книге авторов С.А. Динарелло и Л.Л. Молдавера (СА ΌίηαΓοΙΙο и Ь.Ь. Мо1ба\усг), Провоспалительные и противовоспалительные цитокины при ревматоидном артрите: учебник для клинических врачей, третье издание (2001), компания Амген (Απίβοη 1пс) Тоузанд Оукс, США. К некоторым типичным терапевтическим средствам от воспаления и аутоиммунных болезней, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся модуляторы гамма интерферона (ΙΡΝ-γ); модуляторы ОХ40/ОХ40Ь (включая растворимые формы ОХ40); модуляторы лиганда 4-1ВВ/4-1ВВ (включая растворимые формы 4-1ВВ); и модуляторы В-клеточных-Тклеточных костимулирующих путей, включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: модуляторы пар лиганда рецептора СО28/В7, СО40/СО40Р 1СО8/В7РР1, ΑСР-3/ΤΑС1/ВΑΡΡΚ ^ОР-3, образующий связи как с рецепторами ΤΑΟ,
- 23 021242 так и ΒΑΡΡΚ). К некоторым типичным модуляторам В-клеточных-Т-клеточных костимулирующих путей, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся ингибиторы СЭ28, В7.1 и В7.2 (включая растворимые формы В7.1 или В7.2 и растворимые формы СΤ^Λ4. которые могут сливаться с гетерологичным пептидом или белком, который уменьшает или предотвращает деградацию и/или увеличивает период полураспада, уменьшает токсичность, уменьшает иммуногенность или увеличивает биологическую активность терапевтического белка путем увеличения растворимости или периода полувыведения при циркуляции); ингибиторы ί'.Ό40 и СО40Б (включая растворимые формы СЭ40, которые могут сливаться с гетерологичным пептидом или белком); ингибиторы 1СО8 и В7КР1 (включая растворимые формы 1СО8, которые могут сливаться с гетерологичным пептидом или белком) и ингибиторы АОР-3, ΤΑί',Ί и ΒΑΡΡΚ (включая растворимые формы ΤΑΟ и ΒΑΡΡΚ). 1СО8, В7КР1 и их ингибиторы описаны, например, в заявке \УО 00/46240. АОР-3, ΤΑΟ и ΒΑΡΡΚ и их ингибиторы описаны, например, в заявках \УО 00/47740, \УО 01/85872, \УО 02/15273, \УО 98/39361 и в работе авторов фон Булоу и Брама (νοη Βιι1ο\ν и Βπιιη) (1997), Наука 278:138-140.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду используется с целью лечения потери костной ткани, включая, но не только, потерю костной ткани в результате остеолитической деструкции костной ткани, вызванной злокачественными или метастатическими опухолями. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может использоваться с целью лечения потери костной ткани, связанной с раком. К числу типичных видов рака, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится рак груди, простаты, щитовидной железы, почек, легких, пищевода, прямой кишки, мочевого пузыря, шейки матки, яичников и печени, а также рак пищеварительного тракта. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может использоваться с целью лечения потери костной ткани, связанной, например, с некоторыми злокачественными болезнями крови, включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: множественную миелому и лимфому, включая болезнь Ходжкина.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения применяется только антитело к ОПГ лиганду. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду применяется по крайней мере с одним отличным от упомянутых, терапевтическим средством, включая, но не только по крайней мере одно отличное от упомянутых, средство для терапии рака. К числу типичных средств для терапии рака, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится метод лучевой терапии и метод химиотерапии. В некоторых воплощениях настоящего изобретения химиотерапевтический метод может включать применение одного или большего числа следующих средств: антрациклины, таксол, тамоксифен, доксорубицин, 5-фторурацил, другие известные препараты. В некоторых воплощениях настоящего изобретения средством для терапии рака является антагонист лютеинизирующего гормон-высвобождающего гормона (ЬНКН). В некоторых воплощениях настоящего изобретения антагонистом ЬНКН является антагонист пептида.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антагонист ЬНКН включает следующий пептид: Αс-^-Nа1-4-С1-РЬе-^-Ра1-δе^-N-Ме-Τу^-^-Α8η-^еи-^у8(^Р^)-Р^ο-^-Α1а-NН2 (последовательность № 20), где №1 является 3-(2-наптил)аланинилом; 4-С1-РНе является (4'-хлорофенил)аланинилом; Ра1 является 3-(3'-пиридил)аланинилом; а Ьу8 (1Рг) является ^эпсилон-2-пропил-лизинилом.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антагонистом ЬНКН является декапептид антагониста ЬНКН. Некоторые типичные декапептиды описаны, например, в патенте США № 5843901, который приводится в данном случае в качестве ссылки и может использоваться в любых целях.
К числу типичных терапевтических антител в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся антитела мыши, химерные антитела человека и мыши, СОК-привитые, гуманизированные и полностью человеческие антитела, и синтетические антитела, включая, но не только, антитела отобранные из библиотек диагностических антител. К числу типичных антител, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся, такие антитела, которые образуют связи с белками поверхности клеток Нег2, СЭС20, СЭС33, муцин-подобным гликопротеидом, и эпидермальным рецептором фактора роста (ΈΟΡΡ), присутствующим на клетках опухоли, и антитела, которые произвольно индуцируют цитостатический и/или цитотоксический эффект на клетках опухоли, обозначающий эти белки. Типичные антитела также включают НΕΚСΕРΤIN™ (трастузумаб), который может использоваться с целью лечения рака груди и других форм рака, и ΡΙΤυΧΑΝ™ (ритуксимаб), ΖΕνΑΜΝ™ (ибритумомаб тиуксетан), ЬУМРНОСШЕ™ (эпратузумаб), которые могут использоваться с целью лечения лимфомы, не являющейся лимфомой Ходжкина, и других форм рака. Некоторые типичные антитела также включают ΕΡΒΙΤυΧ™ (1МС-С225), ΒΕXXΑΚ™ (тоситумомаб йод 131), и СашраПт
В некоторых воплощениях настоящего изобретения средствами терапии рака являются полипептиды, которые селективно вызывают апоптоз в клетках опухоли, включая относящийся к ΤΝΡ полипептид ΤΡΑΙΗ которым, однако, список полипептидов не исчерпывается. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может вводиться, по крайней мере, до лечения, одновременно с
- 24 021242 лечением и после лечения с помощью средства терапии рака. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может применяться в профилактических целях для предотвращения или смягчения начала потери костной ткани при метастатическом раке. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может вводиться для лечения существующего состояния, вызванного потерей костной ткани вследствие метастаз.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может использоваться для предотвращения и/или лечения потери костной ткани, связанной с множественной миеломой, и/или для предотвращения и/или лечения болезни непосредственно. Множественная миелома - опухоль, вызываемая В-клетками, которая может привести к серьезной болезни и/или летальному исходу. Согласно некоторым примерам клиническое проявление множественной миеломы - очаговая потеря костной ткани, которая может происходить вследствие повышенной активации остеокласта в ограниченных областях. Многие больные миеломой с поражениями костной ткани, видимыми при радиологическом анализе, страдают от боли в костях скелета. Согласно некоторым примерам больные миеломой склонны к патологическим переломам пораженной костной ткани, что может происходить либо спонтанно, либо вследствие ранений. Согласно некоторым примерам поражения костей скелета, которые встречаются при миеломе, ведут не только к переломам костной ткани, но также и к ее деформации и иногда к зажатию нерва, в частности, в позвоночном столбе. У некоторых пациентов происходит патологическое увеличение содержания кальция в сыворотке (гиперкальцемия), что может вызывать значительные проблемы во время лечения болезни. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду может вводиться пациентам для уменьшения или блокировки резорбции костной ткани и высвобождения кальция, что может снизить риск возникновения переломов и деформаций позвоночника.
Согласно некоторым примерам клетки миеломы непосредственно не участвуют в деструкции костной ткани, но вместо этого производят внеклеточные сигналы, что приводит к дифференцированию остеокласта и активации. Согласно некоторым примерам остеокласты создают высокие уровни содержания цитокина 1Ь-6, особенно после активизации. 1Ь-6 является В-клеточным фактором роста и вносит вклад в рост как мышиных клеток миеломы, так и клеток миеломы человека ίη νίίΓΟ Клетки миеломы также могут либо непосредственно, либо косвенно продуцировать ОПГ лиганд, что может приводить к местному повреждению костной ткани вокруг клеток миеломы, имплантированных в участки костного мозга. Согласно некоторым примерам нормальные остеокласты, расположенные рядом с клеткой миеломы, в свою очередь продуцируют 1Ь-6, что может приводить к местному распространению клеток опухоли. Клетки миеломы распространяются клональным способом и могут занимать участки костной ткани, которые созданы несоответствующей резорбцией костной ткани.
Было замечено, что введение ОПГ грызунам вызывает быструю гибель популяции остеокласта (см., например, авторов Лацей (Ьасеу) и др., 2000 г., Журнал патологии (ί. ΡαίΗοΙ.) 157:435-448). Сокращение количества остеокластов может противодействовать эффекту увеличения продуцирования 1Ь-6 этими клетками и может, поэтому, воздействовать на рост и выживание клеток миеломы в пределах трабекулярной костной ткани. Таким образом, в некоторых воплощениях настоящего изобретения введение антитела к ОПГ лиганду больному миеломой может не только блокировать гиперрезорбцию костной ткани, но может также воздействовать на распространение и выживание самой опухоли.
В-клетки экспрессируют рецептор для ОПГ лиганда, ΘΌΆΡ. Клетки миеломы также экспрессируют ΘΌΛΡ и, кроме того, могут продуцировать ОПГ лиганд. Согласно некоторым примерам экспрессия как ОПГ лиганда, так и ОПАР в той же самой популяции клеток может создать аутокринный стимул, который действует на выживание клетки миеломы. Таким образом, в некоторых воплощениях настоящего изобретения введение антитела к ОПГ лиганду может снизить выживание клеток опухоли, уменьшая, таким образом, или исключая тяжесть опухоли, что характерно для больных миеломой.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются фармацевтические составы, включающие терапевтически эффективное количество антитела к ОПГ лиганду вместе с фармацевтически приемлемым растворителем, носителем, солюбилизатором, эмульгатором, консервантом и/или иммуностимулятором.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются фармацевтические составы, включающие терапевтически эффективное количество антитела к ОПГ лиганду и терапевтически эффективное количество по крайней мере одного дополнительного терапевтического средства, вместе с фармацевтически приемлемым растворителем, носителем, солюбилизатором, эмульгатором, консервантом и/или иммуностимулятором. В некоторых воплощениях настоящего изобретения по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство выбирается из морфогенных факторов костной ткани, обозначаемых как ВМР-1 - ВМР-12; трансформирующих факторов роста β (ТОР-β) и членов семейства ТОР-β; ингибиторов интерлейкина-1 (1Ь-1), включая следующие его разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: 1Ь-1га и его производные и анакинра Ктеге!™; ингибиторы ΤΝΡα, включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: растворимый рецептор ΤΝΡα, этанерсепт ЕпЬге1™, антитела к ΤΝΡα, инфликсимаб Решкайе™ и антитело Ό2Ε7; гормона паращитовидной железы и его аналогов; бел- 25 021242 ка, родственного гормону паращитовидной железы, и его аналогов; простагландинов серии Е; бисфосфонатов (таких, как алендронат и другие); усиливающих костную ткань минералов таких, как фторид и кальций; нестероидных противовоспалительных препаратов (ΝδΑΙΌδ), включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: ингибиторы на основе СОХ-2, такие как селекоксиб Се1еЪгех™ и рофекоксиб νίοχχ™; иммунодепрессанты, таких как метотрексат или лефлуномид; ингибиторов на основе сериновой протеазы, включая следующие их разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: секреторный ингибитор лекоцитарной протеазы (§ЬР1); 1Ь-б ингибиторы (включая антитела к 1Ь-6, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения:), 1Ь-8 ингибиторы (включая антитела к 1Ь-8, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения:); 1Ь18 ингибиторы (включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: 1Ь-18 связывающий белок и антитела к 1Ь-18); модуляторов интерлейкин-1-конвертирующего энзима (1СЕ); факторов роста фибробласта РСР-1 - РСР-10 и модуляторов РСР; РАР антагонистов; фактора роста кераноцитов (КСР), молекула, родственная КСР, и модуляторов КСР; модуляторов матричной металлопротеиназы (ММР); модуляторов синтазы оксида азота (ΝΟδ), включая следующие разновидности, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения: модуляторы индуцибельных ΝΘδ; модуляторы рецептора глюкокортикоида; модуляторы глутаматного рецептора; модуляторы уровней липополисахарида (ЛПС); норадреналина и его модуляторов и миметиков.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения к числу предпочтительных материалов фармацевтического состава относятся материалы нетоксичные для реципиента в применяемых дозировках и концентрациях.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаемый фармацевтический состав может содержать материалы для модификации, сохранения или консервации, например, рН, осмотического давления, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, аромата, стерильности, стабильности, скорости растворения или выхода, адсорбции или проникновения в состав. В некоторых воплощениях настоящего изобретения к числу подходящих материалов фармацевтического состава, которыми, однако, этот список не ограничивается, относятся, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин); антимикробные препараты; антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфат натрия или водородный сульфат натрия); буферные растворы (такие как борат, бикарбонат, Трис-НС1, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты); наполнители (такие как маннит или глицин); агенты для образования хелатных соединений (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК)); комплексообразующие реагенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета- циклодекстрин); наполнители; монозы; дисахариды; и другие углеводороды (такие как глюкоза, манноза или декстрины); белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины); красители, ароматизирующие добавки и разбавители; эмульгаторы; гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон); низкомолекулярные полипептиды; солеобразующие противоионы (такие как натрий); консерванты (такие как бензалкония хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенетиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода); растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль); сахарные спирты (такие как маннит или сорбит); суспендирующие агенты; поверхностно-активные вещества или смачивающие вещества (такие как плюроникс, РЕС, сложные эфиры сорбита, полисорбаты такие, как полисорбат 20, полисорбат 80, тринитротолуол, трометамин, лецитин, холестерин, тилоксапал); средства, усиливающие стабильность, (такие как сахароза или сорбит); средства, усиливающие тоничность (такие как галоидные соединения щелочного металла, предпочтительно натрий или хлористый калий, сорбит маннита); носители; растворители; инертные наполнители и/или фармацевтические иммуностимуляторы. (Фармацевтические Науки Ремингтона, 18-е издание, А.К Дженнаро, редактор, Компания (1990), Мак Паблишинг Компани.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду и/или терапевтической молекуле связано с известным носителем, увеличивающим период полураспада. К числу таких носителей, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относится домен Рс, полиэтиленгликоль и декстран. Такие носители описаны, например, в патенте США № 09/428082 и в заявке РСТ \УО 99/25044, которые приводятся в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения оптимальный фармацевтический состав определяется квалифицированными специалистами в зависимости, например, от планируемого маршрута введения, формата доставки и необходимой дозировки. См., например, Фармацевтические Науки Ремингтона, выше. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие составы могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость ίη νίνο выделения и скорости ίη νίνο выведения антител по настоящему изобретению.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения первичное средство доставки или носитель в фармацевтическом составе может быть либо водным, либо неводным по природе. Например, в некото- 26 021242 рых воплощениях настоящего изобретения подходящим средством доставки или носителем может быть вода для инъекции, физиологический раствор или искусственная цереброспинальная жидкость, возможно с добавками других материалов, составы которых являются общими для парентерального введения. В некоторых воплощениях настоящего изобретения нейтральный забуференный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с сывороточным альбумином, также является типичным носителем. В некоторых воплощениях настоящего изобретения фармацевтические составы включают буфер Трис, уровень кислотности которого составляет приблизительно рН 7,0-8,5, или ацетатный буфер, уровень кислотности которого составляет приблизительно рН 4,0-5,5, который может также содержать сорбит или подходящий его заместитель. В некоторых воплощениях настоящего изобретения состав, включающий антитело к ОПГ лиганду, включающий или не включающий по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство, может быть приготовлен для хранения, путем смешивания отобранного состава, имеющего желательную степень чистоты, с применяемыми по усмотрению средствами фармацевтического состава (Фармацевтические Науки Ремингтона, см. выше) в виде лиофилизированного слоя осадка клеток или водного раствора. Кроме того, в некоторых воплощениях настоящего изобретения состав, включающий антитело к ОПГ лиганду, включающий или не включающий по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство, может быть составлен в виде лиофилизата с использованием адекватных инертных наполнителей типа сахарозы.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения фармацевтические составы по настоящему изобретению могут быть отобраны для парентеральной доставки. В некоторых воплощениях настоящего изобретения составы могут выбираться для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например, перорально. Приготовление таких фармацевтически приемлемых составов могут обеспечить квалифицированные специалисты.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения компоненты состава присутствуют в концентрациях, которые являются приемлемыми для места введения. В некоторых воплощениях настоящего изобретения буферные растворы используются для того, чтобы сохранить состав на физиологическом уровне рН или на немного более низком уровне рН, обычно в пределах диапазона, составляющего от рН 5 до 8.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения, когда предполагается парентеральное введение, терапевтический состав может быть в виде апирогенного, парентерально приемлемого водного раствора, включающего необходимое антитело к ОПГ лиганду, в состав которого входят или не входят дополнительные терапевтические средства в фармацевтически приемлемом средстве доставки. В некоторых воплощениях настоящего изобретения средством доставки для парентеральной инъекции является стерильная дистиллированная вода, в который антитело к ОПГ лиганду, с включением или невключением по крайней мере одного дополнительного терапевтического средства, приготавливается в виде стерильного, изоосмотического раствора, сохраняемого должным образом. В некоторых воплощениях настоящего изобретения приготовление может включать составление желательной молекулы с добавлением средства типа вводимых инъекцией микросфер, частиц, подвергаемых биоэрозии, полимеров (таких как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), гранул или липосом, которые могут затем обеспечить управляемое или длительно сохраняемое выделение продукта, который может доставляться путем инъекции веществ замедленного всасывания. В некоторых воплощениях настоящего изобретения может также использоваться гиалуроновая кислота, обеспечивающая продолжительность действия в системе кровообращения. В некоторых воплощениях настоящего изобретения для введения необходимой молекулы могут использоваться имплантируемые средства доставки лекарственного средства.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается фармацевтический состав, который может быть составлен для ингаляции. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду с включением или невключением по крайней мере одного дополнительного терапевтического средства, может приготавливаться в виде сухого порошка для ингаляции. В некоторых воплощениях настоящего изобретения раствор для ингаляции, включающий антитело к ОПГ лиганду, в состав которого входит или не входит по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство, может включать газ-вытеснитель для доставки аэрозоля. В некоторых воплощениях настоящего изобретения растворы могут распыляться. Введение через легкие описано в заявке РСТ/иЗ94/001875, в которой описана доставка химически модифицированных белков через легкие.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предполагается, что составы могут применяться перорально. В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду, с включением или невключением по крайней мере одного вводимого таким образом дополнительного терапевтического средства, может готовиться с использованием носителей или без использования носителей, обычно применяемых при составлении твердых форм дозировки таких как таблетки и капсулы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения капсула может предназначаться для выделения активной части состава в желудочно-кишечном тракте в тот момент, когда биоаккумулирование максимально и предсистемное разложение минимизировано. В некоторых воплощениях настоящего изобретения для облегчения абсорбции антитела к ОПГ лиганду и/или любого дополнительного терапевтического средства может быть включено по крайней мере одно дополнительное средство. В некоторых воплощениях
- 27 021242 настоящего изобретения могут также применяться растворители, ароматизаторы, легкоплавкие воски, растительные масла, смазки, суспендирующие агенты, таблетки, средства, обеспечивающие распад и связующие.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения фармацевтический состав может включать эффективное количество антител к ОПГ лиганду, а также включать или не включать по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство в смеси с нетоксичными инертными наполнителями, которые подходят для производства таблеток. В некоторых воплощениях настоящего изобретения путем растворения таблетки в стерилизованной воде или другом адекватном средстве доставки, растворы могут готовиться в виде унифицированной дозы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения к числу подходящих инертных наполнителей, которыми, однако, не ограничивается область применения настоящего изобретения, относятся инертные растворители, такие как углекислый кальций, углекислый натрий или бикарбонат, лактоза или фосфорно-кислый кальций; или связующие вещества, такие как крахмал, желатин или акация; или смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк.
Очевидно, что квалифицированным специалистам известны дополнительные фармацевтические составы, включая составы, содержащие антитела к ОПГ лиганду, включающие или не включающие по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство, в фармацевтических составах длительной или контролируемой доставки. В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагаются известные способы приготовления других средств продленной или контролируемой доставки, таких как липосомные носители, микрочастицы, подверженные биоэрозии или пористые гранулы и инъекции вещества замедленного всасывания. См., например, заявку РСТ/И893/00829, в которой описывается управляемое выделение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических составов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения препараты продленного выделения могут включать полупроницаемые полимерные матрицы в виде компонент определенной формы, например, пленок или микрокапсул. Матрицы продленного выделения могут включать полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919 и заявка ЕР 058481), сополимеры Ь-глутаминовой-кислоты и гамма-этил-Ьглютамата (авторы Сидман (δίάιηηη) и др., Биополимеры (Вюройтегк), 22:547-556 (1983)), поли(2гидроксиэтил-метакрилат) (Ланже (Ьамдег) и др., Журнал исследований биомедицинских материалов (1. Вютеб. Ма!ег. Кек.), 15:167-277 (1981) и Ланже (Ьа^е!-), Химические методы (Сйет. Тесй.), 12:98-105 (1982)), этиленвинилацетат (Ланже и др. (Ьа^е!-), см. выше) или поли-Э(-)-3-гидроксимасляная кислота (ЕР 133988). В некоторых воплощениях настоящего изобретения составы продленного выделения также могут включать липосомы, которые могут быть приготовлены любым из нескольких известных способов, см., например, работу авторов Эпштейна (Еррк!ет) и др., Труды Академии естественных наук США, 82:3688-3692 (1985); заявку ЕР 036676; заявки ЕР 088046 и ЕР 143949.
Фармацевтический состав, используемый для ίη νί\Ό введения, обычно стерилен. В некоторых воплощениях настоящего изобретения это может быть достигнуто фильтрацией через стерильные фильтрационные мембраны. В некоторых воплощениях настоящего изобретения, где состав является лиофилизированным, стерилизация с использованием этого способа может проводиться либо до, либо во время лиофилизации и реконструкции. В некоторых воплощениях настоящего изобретения состав для парентерального введения может храниться в лиофилизированном виде или в растворе. В некоторых воплощениях настоящего изобретения парентеральные составы обычно помещаются в емкость, имеющую стерильное горлышко для доступа, например мешок с внутривенным раствором или ампулу, имеющую пробку, прокалываемую иглой для подкожной инъекции.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения однажды приготовленный фармацевтический состав может храниться в стерильных ампулах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества или в виде дегидратированного или лиофилизированного порошка. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие составы могут храниться либо в готовом виде, либо в таком виде (например, лиофилизированном), который позволяет восстанавливать состав перед введением.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения предлагается комплект для получения единичной одноразовой дозы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения каждый такой комплект может содержать как первую емкость с высушенным белком, так и вторую емкость с водным составом. В некоторых воплощениях настоящего изобретения рассмотрены комплекты, содержащие одно- и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы для жидкости и лиофилизированных составов).
В некоторых воплощениях настоящего изобретения эффективное количество фармацевтического состава, включающего антитело к ОПГ лиганду, в состав которого входит или не входит по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтического контекста и целей. Квалифицированный специалист понимает, что адекватные уровни дозировки для лечения в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения меняются в зависимости, в частности, от доставляемой молекулы, показаний, для которых используется антитело к ОПГ лиганду, в состав которого входит или не входит по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство, маршрута введения, и размера (массы тела, поверхности тела или размера органа) и/или состояния (возраста и общего здоровья) пациента. В некоторых воплощениях
- 28 021242 настоящего изобретения клинический врач может титровать дозировку и изменять маршрут введения с целью получения оптимального терапевтического эффекта.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения типичная дозировка может находиться в диапазоне приблизительно от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг или больше, в зависимости от факторов, упомянутых выше. В некоторых воплощениях настоящего изобретения дозировка может быть в диапазоне приблизительно от 0,1 мкг/ кг до 100 мг/кг; или приблизительно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг; или приблизительно от 5 мкг/кг до 100 мг/кг.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения при назначении дозировки учитываются фармакокинетические параметры антитела к ОПГ лиганду и/или любого дополнительного терапевтического средства в используемом составе. В некоторых воплощениях настоящего изобретения клинический врач назначает состав до тех пор, пока не будет получена такая дозировка, которая обеспечивает желательный эффект. Поэтому в некоторых воплощениях настоящего изобретения состав может назначаться как единичная доза, или как две или большее число доз (которая может или не может содержать то же самое количество нужной молекулы) через какое-то время или в режиме непрерывного введения через имплантируемое устройство или катетер. Дальнейшая доводка адекватной дозировки обычно производится специалистами в пределах поставленных задач, выполняемых ими в обычном режиме. В некоторых воплощениях настоящего изобретения адекватные дозировки могут быть установлены путем использования соответствующих данных по реакции дозы.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения маршрут введения фармацевтического состава согласуется с известными способами, и препарат может вводиться, например, перорально, внутривенно, интраперитонеально, внутрицеребрально (внутрипаренхиматозно), интрацеребровентикулярно, внутримышечно, внутриглазно, внутриартериально, внутрипортально или в место поражения; с помощью системам продленного выделения или имплантируемых устройств. В некоторых воплощениях настоящего изобретения составы могут вводиться введением шарика или непрерывным вливанием, или с помощью имплантируемого устройства.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения состав может применяться локально через имплантацию мембраны, губки или другого адекватного материала, на котором была абсорбирована или в который была инкапсулирована нужная молекул. В некоторых воплощениях настоящего изобретения с использованием имплантируемого устройства, это устройство может имплантироваться в любую подходящую ткань или орган, и доставка нужной молекулы может происходить с использованием механизма диффузии, шарика с продленным выделением или с помощью непрерывного введения.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения может быть желательно способом ех νίνο использовать фармацевтический состав, включающий антитело к ОПГ лиганду, в состав которого входит или не входит по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство. В таких примерах клетки, ткани и/или органы, которые были удалены у пациента, подвергаются воздействию фармацевтического состава, включающего антитело к ОПГ лиганду, в состав которого входит или не входит по крайней мере одно дополнительное терапевтическое средство, после чего клетки, ткани и/или органы впоследствии имплантируются обратно пациенту.
В некоторых воплощениях настоящего изобретения антитело к ОПГ лиганду и/или любое дополнительное терапевтическое средство доставляться путем внедрения некоторых клеток, которые подвергались изменениям методами генной инженерии, используя способы типа описанных здесь для экспрессии и секретирования полипептидов. В некоторых воплощениях настоящего изобретения такие клетки могут быть клетками животных или человека и могут быть аутогенными, гетерологичными или ксеногенными. В некоторых воплощениях настоящего изобретения клетки могут быть иммортализованы. В некоторых воплощениях настоящего изобретения для уменьшения шанса на иммунологическую реакцию клетки могут инкапсулироваться во избежание инфильтрации окружающих тканей. В некоторых воплощениях настоящего изобретения материалы инкапсулирования обычно являются биологически совместимыми, полупроницаемыми полимерными оболочками или мембранами, которые позволяют выделяться компонентам белка, но предотвращают разрушение клеток иммунной системой пациента или другими вредными факторами окружающих тканей.
Примеры
Следующие примеры, включающие проводимые эксперименты и достигнутые результаты, представлены только для иллюстративных целей и не должны рассматриваться как ограничение настоящего изобретения.
Пример 1.
Клонирование тяжелой и легкой цепей аОПГ лиганда-1.
Для иммунизации трансгенных мышей, содержащих гены иммуноглобулина человека, используются СНО-клетки, экспрессирующие полномерную кДНК ОПГ лиганда человека. Для получения гибридомы лимфатические узлы иммунизированных мышей сливаются с клетками миеломы мышы. Супернатанты из линий гибридомы проверены методом ЕЫ8А на антитела, которые вступают в реакцию с ОПГ лигандом человека. Оказалось, что анти-ОПГ лиганд, экспрессирующий линии гибридомы АМО б.5, АМО б.4, и АМО б.1, экспрессирует антитела с высоким сродством к ОПГ лиганду (Кб 0,28, 0,29 и 0,23 нМ
- 29 021242 соответственно), и для клонирования была выбрана линия АМО 6.5. Аналоги тяжелой и легкой цепей кДНК из АМО 6.5 и АМО 6.4 идентичны, и АМО 6.5 используется для клонирования легкой цепи кДНК аОПГ лиганда-1, в то время как АМО 6.4 используется для клонирования тяжелой цепи кДНК аОПГ лиганда-1.
Клонирование легкой цепи аОПГ лиганда-1.
Вариабельная область легкой каппа-цепи аОПГ лиганда-1 получена при использовании способа амплификации РСК из первой нити кДНК, полученной из всей РНК АМО 6.5. Сначала нить кДНК получали из всей РНК АМО 6.5 с использованием случайного праймера с расширенным 5'-адаптором (5'ООССООΑΤΑООССΤСΑСNNNNNNΤ-3' (последовательность № 15)) и материалов и способов, предложенных системой предварительной амплификации О1Ьсо Зиреткспр!™ для комплекта синтеза первой нити кДНК (кат. № 18089-011). В способе РСК используются следующие олигонуклеотиды:
праймер 5’ каппа КАСЕ;
5-САТ САС ССА СТС ТСС АСС САС ССТ С-3' (Последовательность № 5) праймер 3' каппа КАСЕ;
5-ААС ССТ САС АСС ССА ААС САТ 00-3' (Последовательность № 6)
Амплифицированные ДНК клонируются в рСКН-ТОРО (инвитроген), и получаемые плазмиды секвенируются. Последовательность согласованной каппа-цепи используется для проектирования праймеров для РСК-амплификации полномерной каппа-цепи аОПГ лиганда-1. Праймер 5' каппа-цепи аОПГ лиганда-1 включает сайт ХЬа1 (ТСТАОА) для клонирования и последовательность ССАСС Ко/ак перед инициирующим кодоном Ме!. Праймер 3' каппа-цепи аОПГ лиганда-1 включает сайт 8а/1 (ОТСОАС) перед терминирующим кодоном клонирования.
праймер 5' каппа-цепи аОПГ лиганда-1:
5’-САА СТС ТАО А СС АСС АТС ОАА АСС ССА ОСО-31 (Последовательность Ка 7)
ХЬа! Сайт Когак МЕТРА (Последовательность № 16) праймер 3' каппа-цепи аОПГ лиганда-1 ’-ТТТСАС ОТС САС ΊΤΑТСА АСА СТС ТСС ССГ 01 1 САА С-3' (Последовательность №8)
ЙаДСайт * * С Е О К N Г (Последовательность № 17)
Полномерный аналог каппа-цепи кДНК аОПГ лиганда-1 получен с использованием АМО 6.5 первой нити кДНК, описанной выше, путем РСК-амплификации праймерами каппа-цепи 5' и 3' аОПГ лиганда-1. РСК реакция дает фрагмент из 738 пар оснований кодирующих 235 аминокислотных остатков (включая сигнальную последовательность каппа-цепи из 20 аминокислот) каппа-цепи аОПГ лиганда-1 (Фиг. 4, Последовательность № 4). После очистки с использованием РСК-комплекта очистки 01Ас.|шск (Ц1адеп кат. № 28104), этот фрагмент используется для построения вектора экспрессии легкой каппацепи.
Фрагмент из 738 пар оснований полномерной каппа-цепи, полученный выше, урезается с помощью ХЬа1 и 8а/1, очищается с использованием системы Рготеда νί/агб ДНК С1еап-ир 8ук1ет (Промега кат. № А7100), и клонируется в рЭБКа19 для получения плазмида аОПГ лиганд-1-каппа/рО8Ка19 (Фиг. 5). рЭБКа19 был описан ранее (см. заявку νθ 90/14363, которая приводится в данном случае в качестве ссылки (см., например, фиг. 12)). Короче говоря, для получения рО8Ка19, рЭБКа2 меняется следующим образом: Е8Н полиА урезается приблизительно на 1400 пар азотистых оснований до 885 пар азотистых оснований и теперь заканчивается на сайте №е1; промотор дигидрофолатредуктаза (ЭНЕК) теперь содержит 209 пар оснований, будучи сокращенным с конца 5' приблизительно на 1 тысячу гетероциклических оснований нуклеиновой кислоты; и из последовательности ЭНЕК полиА удален фрагмент В§Ш, состоящий приблизительно из 550 пар оснований.
Клон экспрессии легкой каппа-цепи аОПГ лиганда-1 секвенируется для подтверждения того, что он закодирован для того же самого пептида, который идентифицирован в АМО 6.5 гибридоме. Заключительный вектор экспрессии, аОПГ лиганд-1-каппа/рО8Ка19, состоит из 5476 пар оснований и содержит 7 функциональных областей, показанных в табл. 2.
- 30 021242
Таблица 2
Особенности аОПГ лиганд-1-каппа/рЭ8Ка19
Число пар оснований плазмида
2-881 Сигнал завершения считывания генетического кода/полиаденилирование от сс-субединицы бычего гормона гликопротеида гипофиза (а-Р8Н) (Гудвин и др. (Οοοάννίη), Исследование нуклеиновых кислот (ЫисЫс АсИз Кез. 198311: 6873-82; номер доступа в банк генов Х00004)
882 - 2027 Миниген дигидрофолатредуктазы (ϋΗΡΚ) мыши, содержащий промотор эндогенной ОНРК мыши, кДНК кодирующие последовательности, и сигналы завершения считывания генетического кода ГЛ1РК /полиаденилирование (Газзер и др. (Оаззег), Труды Академии естественных наук США. 198279:6522-6.; Нанберг и др. (МипЬсгд), Клетка (Се11) 198019:355-64; Сельцер и др, (ЗеСгег), Журнал биологической химии (3 ΒίοΙ СЬет.) 1982257: 5143-7; МкГроган и др. (МсОгодап), Журнал биологической химии (ί ΒίοΙ СЬет.) 1985 260: 2307-14)
2031 -3947 рВК322 последовательности, содержащие ген маркера устойчивости ампициллина и начало для репликации плазмида в Е, соН (номер доступа в байк генов 101749)
3949 - 4292 ранний промотор 5У40, энхансер и начало репликации (Такебе и др. (ТакеЬе), Биология молекулярной клетки (Мо1 Се11 ΒίοΙ.) 19888: 466-72., номер доступа в банк генов ГО2400)
4299 - 4565 элемент трансляционного энхансера из домена ТТПЛМ ЬТК (Сейки и др. (8е1кГ), Труды Академии естественных наук США. 1983 80: 3618-22, номер доступа в банк генов .102029)
4574 - 4730 интрон из 8У40165, 198 сигналы сплайсирования донор/акцептор (Окаяма и Берг Окауата апй Вегд), Биология молекулярной клетки (Мо1 СеИ ΒίοΙ.) 19833: 280-9, номер доступа в банк генов 102400)
4750 - 5476 кДНК легкой каппа-цепи аОПГ лиганда-1 между сайтами ХЬа! и 8а/1
На фиг. 5 показана карта кольцевого плазмида вектора.
Клонирование тяжелой цепи аОПГ лиганда-1.
Тяжелая цепь 1дО2 аОПГ лиганда-1 клонируется из АМО 6.4 гибридомы двухцепочечной кДНК, полученной с помощью комплекта амплификации кДНК С1оп1ссЬ МагаШоп™ (кат. № К1802-1). Амплификация АМО 6.4 тяжелых цепей кДНК осуществляется с помощью методики быстрой амплификации 5' и 3' концевых участков кДНК (КАСЕ), выполняемой с помощью специфических праймеров постоянной области тяжелой цепи зародышевой линии 1дО2 человека (показана ниже) и праймеров КАСЕ и других материалов и способов, предусмотренных в комплекте амплификации кДНК МагаШоп™.
Праймер 5' ΐ£02 КАСЕ:
5’-СОС АСО ОТС АСС АСС СТО СТО АО-3' (Последовательность Ка 9)
Праймер 3' 1дО2 КАСЕ:
5’-ССТ ССА ССА АОО ССС САТ СОО ТСТ-3' (Последовательность № 10)
Компонент 5'КАСЕ, состоящий из 600 пар оснований, и компонент 3'КАСЕ, состоящий из 1200 пар оснований, клонируются в рСК2.1 (Инвитроген) и секвенируются. Эта информация о последовательности используется для разработки специфических праймеров тяжелой цепи аОПГ лиганда-1 с целью клонирования полномерной последовательности. Праймер 5' тяжелой цепи (праймер 5' аОПГ лиганда-1 1дО2) направлен против смысловой нити и имеет сайт ΗίηάΙΙΙ и согласованную последовательность Ко/ак перед естественным сайтом инициации. Праймер 3' тяжелой цепи (праймер 3' аОПГ лиганда-1 1дО2) являются невосприимчивым праймером, который содержит сайт 8а/1 и терминирующий кодон после последней аминокислоты тяжелой цепи последовательности 1дО2.
- 31 021242
Праймер 5' аОПГ лиганда-1 1дС2:
5’-САО ААОСТТОАССАСС АТС ОАО ТТГ ООО СТО АОС ТОО СТГТТТСТТ ОТО ОС-3' (Последовательность № 11)
ΗίηάΙΙΙ Когак МЕ Р О Ь δ XV Ь Р Ь V А (Последовательность № 18) праймер 3' «ОПТ лиганда-1 1§О2:
5'-0СА ТОТССАС ТГА ТСА ТТГ АСС СОО АОА САО ООА ОАО-3' (Последовательность № 12)
5а/1 * * К О Р 5 Ь 5 Ь .
А (Последовательность № 19)6
Двойная цепь кДНК, описанная вьше, используется для получения полномерной тяжелой цепи кДНК путем РСК-амплификации с помощью праймеров 1дС25'-и 3' аОПГ лиганда-1. РСК производит фрагмент, состоящий из 1433 пар оснований, кодирующих 467 аминокислотных остатков (включая сигнальную последовательность 1дС, состоящую из 19 аминокислот) аОПГ лиганда-1 1дС2 тяжелой цепи белка (фиг. 2, последовательность № 2). После очистки, используя комплект очистки О1Ас|шск РСК (Οίадеи кат. № 28104), этот фрагмент применяется для создания вектора экспрессии тяжелей цепи следующим образом.
ДНК, кодирующая полномерный тяжелый фрагмент 1дС2, полученный выше, рассекается с помощью ΗίηάΙΙΙ и 8а/1, очищается с использованием комплекта экстракции геля 01Ас.цйск (О1адеи кат. № 28704) и этот фрагмент клонируется в рЭ8Ка19.
Получаемая плазмида экспрессии называется аОПГ лиганд-1-1дС2/рЭ8Ка19 (фиг. 6).
Все векторные компоненты идентичны вектору аОПГ лиганд-1-каппа/рО8Ка19, описанному выше, кроме кДНК тяжелой цепи 1дС2 аОПГ лиганда-1 замещает кДНК легкой каппа-цепи аОПГ лиганда-1 между сайтами ХЬа1 и 8а11. Клон экспрессии тяжелой цепи 1дС2 аОПГ лиганда-1 секвенируется для подтверждения того, что он закодирован для того же самого полипептида, который идентифицирован в АМС 6.4 гибридоме.
Пример 2.
Экспрессия аОПГ лиганда-1 в клетках СНО.
Устойчивая экспрессия антитела аОПГ лиганда-1 достигается котрансфекцией плазмидов аОПГ лиганда-1-каппа/рЭ8Ка19 и аОПГ лиганда-1-1дС2/рЭ8Ка19 в клетки яичника китайского хомяка (СНО АМ-1/ϋ, патент США № 6210924) с дефицитом дигидрофолатредуктазы (ЭНРК-), после чего следует выделение и испытание индивидуальных аналогов.
За день до трансфекции (день 0) кювета размером 100 мм с культурой тканей покрывается клетками АМ-1/ϋ плотностью 1,5х106, выращенными в среде СНО б-(глюкоза с высоким содержанием ЭМЕМ, 10%-я эмбриональная бычая сыворотка, 1%-й пенициллин/стрептомицин/глутамин, IX М-^угиуаЮ, 1%ые заменимые аминокислоты (ΝΕ^Ά)) (СЬсо®) и 1% Ы добавок (СЬсо®)). В день один, 400 мкл бессывороточной среды КРМ1 1640 (СЬсо®) вводится в полипропиленовую трубку размером 12x75 мм. 24 мкл реактива Тгаи81Т®-ЬТ1 (Корпорация МиЙ5) добавляется по каплям к этой среде, и эта смесь выдерживается при комнатной температуре в течение 10 мин. Затем к этой смеси по каплям добавляется и выдерживается при комнатной температуре в течение 10 мин линеаризованный плазмид ДНК общим количеством 15 мкг (7,5 мкг аОПГ лиганда-1-каппа/рЭ8Ка19 и 7,5 мкг аОПГ лиганда-1-1дС2/рО8Ка19, усвоенного Руц1).
Из клеток удаляется среда СНО б и клетки промываются 10 мл забуференного солевого раствора Эи1Ьессо (СЬсо®). 6 мл бессывороточной среды МЕМ, с добавкой НТ, Ь-глю, №)АА, и Ν;·ι пирувата (СкЬсо®) вводится в клетки. В планшеты по каплям добавляется комплекс ДНК/ЬТ1, затем для равномерного распределения ДНК по клеткам планшеты аккуратно покачиваются взад вперед. После 6 ч в термостате с культурой тканей среда заменяется на новую среду СНО б. 48 ч спустя клетки разливаются по десяти чашкам для культивирования емкостью 100 мм в избирательную среду СНО (ЭМЕМ с высоким содержанием глюкозы, 10% диализированной эмбриональной бычьей сывороткой (РВ8), 1%-й пенициллин/стрептомицин/глутамин, 1%-е заменимые аминокислоты и 1Х Ν;·ι пируват) (СЬсо®). Среда заменялась дважды в неделю, пока не появились колонии.
После 10-14 дней колонии подбираются с использованием клонирующих дисков размером 5 мм (ЪаЬсоге®), пропитанных 1х трипсин-ЭДТК (СЬсо®), и культивируются в 24 луночных планшетах с культурой тканей с избирательной средой СНО. После слияния клеток добавляется бессывороточная среда (избирательная среда СНО минус РВ8) и затем спустя 48 ч производится сбор. Эти кондиционированные среды анализируются на экспрессию антитела с помощью Вестерн-блоттинга в связанном пероксидазой хрена иммуноглобулине 1дС антител козла против человека (Пиерс, Рокфорд, шт. Иллинойс США) для обнаружения тяжелой цепи аОПГ лиганда-1, и антитело каппа-цепи козла против человека
- 32 021242 (Пиерс, Рокфорд, шт. Иллинойс США) после чего следует связанный пероксидазой хрена иммуноглобулин Ι§0 (Н+Ь) антител кролика против козла (Пиерс, Рокфорд, шт. Иллинойс США) с целью обнаружения легкой цепи аОПГ лиганда-1. Клоны с самой высокой экспрессией расширяются и хранятся в жидком азоте.
Пример 3.
Получение аОПГ лиганда-1.
Приготовление и создание клеточной линии 1250.
Клетки СНО, производящие аОПГ лиганд-1, клонируются в течение двух циклов конечного разбавления в 96 луночных планшетах без сыворотки. Клоны отбираются на основе характеристик продуцирования и роста в различных сосудах со взвесью. Для отбора клона, который продуцирует аОПГ лиганд-1 на самом высоком уровне, выполняются ΕΙΑ. Затем путем выращивания клонов в центрифужных колбах емкостью 100 мл, 250 мл, 500 мл, 1 л, и 3 л, а также в биореакторах Арйкоп емкостью 3 л измеряются характеристики роста, включая время удвоения и плотность. Клон, обладающий самым малым временем удвоения, который достигает самой высокой плотности в культуре, отбирается и ему дается обозначение - клеточная линия 1250. Когда клон расширяется, чтобы выдать достаточное число клеток и обеспечить заморозку 360 ампул с плотностью приблизительно 1x10 клеток на 1 мл, клетки ресуспендируются в криоконсервирующей, бессывороточной среде (90%-я среда УМ-Зоу (см. табл. 3) с добавками 10 мл/л заменимых аминокислот и 10 мл/л Ь-глютамина (01Ьсо/ЬТ1/Инвитроген), и 10%-го диметилсулфоксида (Дж.Т Бейкер (ЛТ Вакег)) и замораживаются. Ампулы хранятся в установке ограниченного доступа и погружаются в сосуд Дьюара с жидким азотом.
В результате выращивания в небольших центрифугах и больших биореакторах клеточная линия 1250 выбирается как клеточная линия, способная производить аОПГ лиганд-1.
Клеточная культура.
аОПГ лиганд-1 получают путем экспрессии в клеточной линии 1250 клональной линии клеток СНО, которая экспрессирует аОПГ лиганд-1 из плазмидов аОПГ лиганд-1-каппа/рО8Ка19 и аОПГ лиганд-1-1§О2/рО8Ка19. На фиг. 19 показан процесс получения клеточной культуры для аОПГ лиганда-1. В каждом производственном цикле клетки из ампулы с клеточной линией 1250 сначала выращиваются в 50 мл среды УМ-8оу (см. табл. 3) с добавками 10 мл/л заменимых аминокислот и 10 мл/л Ь-глютамина (О1Ьсо/ЬТ1/Инвитроген) (с добавкой УМ-8оу) в шейкере Эрленмайера емкостью 125 мл при 100 об/мин в течение 5 дней. Затем вся культура используется для того, чтобы засеять добавку УМ-8оу в центрифужную колбу емкостью 500 мл до плотности 3х105 жизнеспособных клеток на 1 мл (3Е5 жизнеспособных клеток на 1 мл), и выращивается при вращении 70 об/мин в течение 3-4 дней. Затем вся культура из центрифужной колбы емкостью 500 мл используется для того, чтобы засеять добавку УМ-8оу в центрифужную колбу емкостью 3 л до плотности 3Е5 жизнеспособных клеток на 1 мл, и выращивается при вращении 70 об/мин в течение 3-4 дней.
Затем культура из центрифужной колбы емкостью 3 л разливается в две центрифужные колбы емкостью 3 л до плотности ЗЕ5 жизнеспособных клеток на 1 мл добавки УМ-8оу без фенолового красного и выращивается при тех же самых условиях. Затем эти культуры центрифужной колбы используются для того, чтобы засеять четыре дополнительных центрифужных колбы до плотности ЗЕ5 жизнеспособных клеток на 1 мл УМ-8оу без фенолового красного и выращиваются при тех же самых условиях. Четыре литра культуры из четырех центрифужных колб емкостью 3 л каждая используются для того, чтобы засеять 10 л УМ-8оу без фенолового красного в биореактор емкостью 20 л, и биореактор начинает работать в режиме периодической загрузки в течение 7-10 дней. При режиме периодической загрузки для поддержания роста клеток и жизнеспособности культуры добавляется исходный материал, содержащий компоненты концентрированной среды (Исходный материал представлен в табл. 3).
Затем вся культура из биореактора емкостью 20 л используется для того, чтобы засеять 70 л УМ8оу без фенолового красного в биореактор емкостью 150 л, и биореактор начинает работать в режиме периодической загрузки в течение 9-10 дней. Наконец, вся культура из биореактора емкостью 150 л используется для того, чтобы засеять приблизительно 880 л УМ-8оу (без добавки или фенолового красного) в биореактор емкостью 2000 л, и биореактор начинает работать в режиме периодической загрузки. Скорость подачи в режиме периодической загрузки задается такой, чтобы содержание глюкозы в культуре поддерживалось на уровне 0,6 г/л в каждом биореакторе. Плотность клеток и концентрация глюкозы измеряются ежедневно, и скорость подачи регулируется соответствующим образом.
Работа биореактора емкостью 2000 л длится приблизительно две недели, в течение которых аОПГ лиганд-1 продуцируется клетками и секретируется в среду клеточной культуры.
В работающем реакторе регулируется уровень рН, температура, и уровень растворенного кислорода: уровень рН равен 7,0 и регулируется подачей диоксида углерода и углекислого натрия; содержание растворенного кислорода поддерживается на уровне 120 мм рт. ст. и регулируется подачей воздуха, азота и кислорода. Во время всего процесса температура клеток поддерживается на уровне 37°С. Все газы проходят через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм или меньше.
В конце производственного цикла бульон из клеток подают в дисковую центрифугу, и супернатант
- 33 021242 культуры отделяется от клеток. Затем концентрат осветляется на фильтре глубокой очистки Сиио 90ЗР, а затем на фильтре Роыбуие с размером ячейки 0,2 мкм (компания Ра11). Затем осветленная кондиционированная среда концентрируется с помощью тангенциальной ультрафильтрации потока (ИР) с использованием мембраны 50 кДа NМV^ (МПНроге Вютах 50). Кондиционированная среда концентрируется в 1530 раз. Затем получаемая концентрированная кондиционированная среда (ССМ) обрабатывается либо путем очистки, либо заморозки с последующей очисткой. Процесс получения показан на фиг. 19. Среда клеточной культуры
Основой для клеточной среды, используемой на протяжении всего процесса обработки клеточной культуры, является среда (Модифицированная по способу Дульбекко среда Игла)/(Питательное вещество Хама Р12) (ОМЕМ/Р12, 1:1), которая содержит дополнительное количество аминокислот, дополнительные питательные вещества и соли, продукт гидролиза сои и рекомбинантный человеческий инсулин (Νιιсе11^η®Ζη. Эли Лиллай). Компоненты среды перечислены в табл. 3. Эта среда называется УМ-Зоу. Перед использованием растворы среды фильтруются через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм.
Таблица 3
Компоненты среды клеточной культуры Компоненты базальной питательной среды и питательные вещества
Компонент Периодическая среда УМ-Зоу (мг/л) Питательное вещество (мг/л)
Компоненты ОМЕМ/Р12
Неорганические соли СаСР (безводный состав) 116,60 233,2
СиЗО45Н2О 0,0026 0,0052
Ρβ(ΝΟ3)39Η2Ο 0,1000 0,2
Ре8О47Н2О 0,8340 1,668
КС1 311,80 623,6
МуС)2 (безводный состав) 57,280 114,56
Μ(ξ8Ο4 (безводный состав) 97,680 195,36
№С1 905,990 1811,98
НаН2РО4Н20 125,00 250
Ν3ιΙΙΡΟ4 142,040 284,08
ΖηδΟ47Η2Ο 0,8640 1,728
Другие компоненты
ϋ-Глюкоза 3151,00 12302
Гипоксантин натрия 5,40 10,8
Линолиевая кислота 0,090 0,18
Липоевая кислота 0,2060 0,412
Фенол красный 8,10 16,2
Путресцин 2НС1 0,1620 0,324
Пуриват натрия 110,00 220
- 34 021242
Аминокислоты Ь-Аланин 26,70 53,4
Ь-Агринин НС1 295,00 590
Ь-Аспарагин Н2О 45,00 90
Ь-Азрагцс кислота 39,90 79,8
[.-Цистеин НС1Н2О 35,120 70,24
[.-Цистин 2НС1 62,580 125,16
Ь-Глютаминовая кислота 44,10 88,2
1.-Глютамин 657,00 1314
Глицин 52,50 105
Ь-Гистидин НС1 Н2О 62,950 125,9
Ь-Изолейцин 108,940 217,88
Ь-Лейцин 118,10 236,2
Ь-Лизин НС1 182,50 365
Ь-Метионин 34,480 68,96
Ь-Фенилаланин 70,960 141,92
Ь-Пролин 57,50 115
I,-Серин 73,50 147
Ь-Треонин 106,90 213,8
[.-Триптофан 18,040 36,08
Ь-Тирозин 2Эа 2Н2О 111,580 223,16
Е-Валин 105,70 211,4
Витамины
Биотин 0,0073 0,0146
ϋ-Са Пантофенат 4,480 8,96
Холинхлорид 17,960 35,92
Фолиевая кислота 5,30 10,6
ί-Инозитол 25,20 50,4
Ниацинамид 4,040 8,08
Пиридоксал НС1 4,00 8
Пиридоксин НС1 0,0620 0,124
Рибофлавин 0,4380 0,876
Тиамин НС1 4,340 8,68
Тимидин 0,3635 0,727
Витамин В12 1,360 2,72
- 35 021242
Дополнительные компоненты Нуцеллин Ζη, <ру инсулин) 5,00 15
Селениевая кислота 0,0050 0,015
Этаноламин 0,0012 0,0037
Трийодотиранин 0,000040 0,00012
Гидрокортизон 0,020 0,06
Цитрат железа 122,450 122,450
Плуроник Р-68 1000,00 500
Продукт гидролиза сои 6000,00 6000,00
ИаНСОз 3000,00 3000,00
№С1 3500,00
Процесс очистки.
аОПГ лиганд-1, выделяемый в клетках СНО, секретируется во внеклеточную среду. Для получения чистого материала необходимо пройти целый ряд этапов. В процессе используется индукция гидрофобной партии, катионный обмен и гидрофобная хроматография наряду с этапом низкого уровня рН и вирусным фильтром. Эти процедуры описаны ниже.
A. Гидрофобная хроматография с индукцией заряда (НС1С).
На этом этапе с помощью хроматографии удаляется большинство белков клетки-хозяина и ДНК. Концентрированная кондиционированная среда (ССМ) фильтруется через фильтр Сипо 308Р и затем через заряженный фильтр Сипо νΚ07 на основе целлюлозы, и затем выгружается на смолу МЕР НурегСе1. После загрузки колонка промывается равновесным буфером (20 мМ Трис рН 7,2). Антитело элюируется из смолы с использованием буфера с низким уровнем рН (20 мМ ацетата натрия, рН 5,0). По мере элюирования из колонки продукт собирается с помощью абсорбции эффлюента колонки с длиной волны 280 нм.
B. Инактивация вируса.
Пул МЕР титруется до рН 3,7 и выдерживается приблизительно в течение 60 мин с целью инактивации потенциально загрязняющего ретровируса. После этапа выдержки рН регулируется приблизительно до б,0.
C. Фильтрация вируса.
Пул с отрегулированным уровнем рН фильтруется через фильтр МПИроге ^гекоке ΝΡΚ или ему подобный. Антитело проходит через фильтр в то время, как потенциально загрязняющие вирусы с длиной волны >50 нм удерживаются.
Ό. Катионообменная хроматография (СЕХ).
Затем антитело очищается с помощью катионообменной хроматографии с использованием 8Р 8ерйагоке НР (Атегкйат Рйагтааа) или ему подобного. На этапе катионообменной хроматографии удаляются дополнительные белки клеток СНО, ДНК, белки более низкой молекулярной массы, и аггрегированные формы аОПГ лиганда-1. Вирусный отфильтрованный пул загружается на катионообменную смолу. После загрузки колонка промывается равновесным буфером (20 мМ NаМΕ8, рН 6,2). Затем антитело элюируется при линейном градиенте увеличивающейся концентрации соли (20 мМ NаМΕ8, рН 6,2, 0 М, Ν;·ιΟ до 20 мМ NаМΕ8, рН 6,2, 0,3 М, №С1). По мере элюирования из колонки продукт собирается с помощью абсорбции эффлюента колонки с длиной волны 280 нм.
Е. Хроматография гидрофобного взаимодействия (Н1С).
Затем антитело очищается с помощью хроматографии гидрофобного взаимодействия с использованием Рйепу1 ^уореай 6508 (Докой Вюкер) или его эквивалента. Этап хроматографии гидрофобного взаимодействия используется в качестве этапа тонкой очистки, на этом этапе удаляются дополнительные белки клеток СНО, ДНК, белки более низкой молекулярной массы, и аггрегированные формы аОПГ лиганда-1. Перед загрузкой в колонку катионообменный пул кондиционируется до удельной электропроводности >105 мСм/см при 15-25°С путем добавления сульфата аммония. После загрузки колонка промывается равновесным буфером (1 М фосфорно-кислого калия, рН 8). Затем антитело элюируется при линейном градиенте уменьшающейся концентрации соли (1 М фосфорно-кислого калия, 0 мМ Трис рН 8 до 0 М фосфорно-кислого калия, 20 мМ Трис рН 8). По мере элюирования из колонки продукт собирается с помощью абсорбции эффлюента колонки с длиной волны 280 нм.
Ρ. Концентрация и фильтрация путем диализа.
Пул колонки Н1С концентрируется и фильтруется путем диализа с получением рецептурного буфера с помощью ультрафильтрации тангенциальным потоком с использованием мембран 50 кДа ΝΜνΤ (Мййроге Вютах 50). Рецептурный буфер включает 10 мМ ацетата, 5% сорбитол, рН 5,2 и аОПГ лиганд1 концентрацией 30 мг/мл.
- 36 021242
Заключительная фильтрация и хранение.
Очищенный объем пропускается через фильтр РУЭР с порами размером 0,22 мкм (МПНроге), отбирается и хранится приблизительно при 30°С в закрытом морозильнике.
Пример 4.
Специфическое связывание аОПГ лиганда-1.
Антитела, которые продуцируются в клетках СНО, которые трансфицированы двумя векторами экспрессии, что рассматривалось в примерах 1 и 2, могут использоваться в примерах 4-6.
ОПГ человека образует связи с ОПГ лигандом крыс, мышей, обезьян Супото1ди8, а также людей и нейтрализует его. аОПГ лиганд-1 связывает ОПГ лиганд человека при высоком сродстве, но не образует существенных связей с мышиным ОПГ лигандом (табл. 4).
Таблица 4
Сродство аОПГ лиганда-1 с экспрессированным клеточным мембранным ОПГ лигандом последовательности человека, обезьяны Супото1§и8, или мыши
Виды ОПГ лиганда аОПГ лиганд-1 Εϋίο, нг/мл
Человек 16
Обезьяна СупотоЦиз 19
мышь нет специфического связывания
ОПГ лиганд этих веществ экспрессируется в клетках СНО в виде полномерного, мембраносвязанного белка. Связывание аОПГ лиганда-1 с ОПГ лигандом, экспрессированным клеточной поверхностью, оценивается РАС8 анализом клеток, выдерживаемых с аОПГ лигандом-1 и РПС-меченым вторичным антителом к человеческому ^С2. аОПГ лиганд-1 образует связи с ОПГ лигандом человека и обезьяны Супото1ди8, но не существует специфического связывания с ОПГ лигандом мыши.
Кроме того, сообщалось, что ОПГ человека показывал слабое связывание с относящимся к фактору некроза опухоли, вызывающим апоптоз лигандом (УМАР) (Труне и др. (Τηκ^ΐι), 2000), родственным членом семейства ΤΝΡ, который демонстрирует гомологиность ДНК и аминокислотной последовательности к ОПГ лиганду (Лацей (Ьасеу) и др., 1998). Однако ОПГ не явно связывается с другими, относящимся к ΤΝΡ белками типа ΤΝΕ», ΤΝΡβ или лигандом СЭ40.
аОПГ лиганд-1 на планшетах ЕМ специфически связывается с ОПГ лигандом (фиг. 7). Рекомбинантным растворимым ОПГ лигандом (2 мкг/мл) покрывают 96 -луночные планшеты ЕМ при комнатной температуре на 16-24 ч. После блокирования 1%-м раствором альбумина бычьей сыворотки (В8А) в физиологическом растворе с фосфатным буфером (РВ8) аОПГ лиганд-1 (приблизительно 2-1000 нг/мл) разной концентрации, разбавленный в 1%-м растворе альбумина бычьей сыворотки в физиологическом растворе с фосфатным буфером, добавляется в лунки, и планшеты выдерживаются в течение приблизительно 2 ч при комнатной температуре. Связанное антитело обнаруживают с помощью связанного пероксидазой хрена иммуноглобулина ЦС антител козла против человека (РаЬ') с использованием коктейля из субстрата ТМВ-Н2О2 (тетраметилбензидин - перекись водорода). Поглощение считывается при длине волны 450 нм и 650 нм.
аОПГ лиганд-1 специфически связывается с ОПГ лигандом, экспрессированным на поверхности трансфицированных клеток (фиг. 8). аОПГ лиганд-1 (100 нг/мл) разбавляется в буфере РАС8 (физиологический раствор с фосфатным буфером, 0,1% В8А, 0,01% азид натрия), предварительно выдерживается при разных концентрациях ОПГ лиганда/ΤNРα, ТОРа, ΤΝΡΡ таАМ или СЭ40 лиганда (приблизительно 0,1-1000 нг/мл), и затем добавляется приблизительно к 200000 клеток СНО ΚΕΝ 218-9, которые являются клетками СНО, стабильно экспрессирующими мембраносвязанный ОПГ лиганд на поверхности клетки. После выдержки в течение 1 ч при 2-8°С несвязанное антитело удаляется центрифугированием и промывается. Затем клетки выдерживаются в течение 30 мин при 2-8°С с меченым РИС Р(аЬ')2 иммуноглобулином ЦС козла против человека (специфический Рсγ фрагмент). После центрифугирования и промывки с помощью цитометрии потока измеряется флюоресценция поверхности клетки. На фиг. 8 показано, что связывание аОПГ лиганда-1 с клетками СНО ΚΕΝ 218-9 является специфическим и конкурентно уменьшается путем дополнения растворимого ОПГ лиганда, но не путем дополнения ΤΝΡα, ΤΝΡβ, ΤΚΜΡ или СЭ40 лиганда.
В экспериментах на конкуренцию, аОПГ лиганд-1, образующий связи с ОПГ лигандом на планшетах ЕМ, подавлялся при добавках экзогенного ОПГ лиганда (фиг. 9), но не при добавках ΤΝΕσ, ΤΝΡβ, ΤΡΜΡ или СЭ40 лиганда (фиг. 10). Эта процедура выполняется в значительной степени таким же образом, что и описанная выше, для связывания аОПГ лиганда-1 с ОПГ лигандом на планшетах ЕМ, за исключением того случая, когда аОПГ лиганд-1 (100 нг/мл) постоянной концентрации предварительно выдерживается с растворимым ОПГ лигандом или другими лигандами переменной концентрации (приблизительно 1-1000 нг/мл для каждого из них) до того, как он будет добавлен к планшетам, покрытым ОПГ лигандом.
- 37 021242
Пример 5.
Активность, нейтрализующая аОПГ лиганд-1.
Замедление образования остеобласта.
РАV 264.7 (АТСС № ΤΙΒ-71, Манас, УА) является мышиной клеточной линией макрофага, которая была получена из опухоли, индуцированной вирусом мышиного лейкоза АЬекоп. В присутствии ОПГ лиганда клетки РАV 264.7 дифференцируются в остеокласт-подобные клетки. Основной анализ для генерации остеокластов в культуре из клеток РАV в присутствии ОПГ лиганда был подробно описан в работах авторов Симоне (5>ипопе1) и др. (1997), Клетка (Се11) 89 с. 309, и Лаци (Ьасеу) и др. (1998) Клетка (Се11) 93 с. 165, которые представлены в данном случае в качестве ссылок и могут использоваться в любых целях.
РАV клетки стимулируются лигандом для дифференцирования в остеокласт-подобные клетки, и эта дифференцирование может измеряться активностью ТРАР, которая свойственна остеокластам. Таким образом, может быть измерено влияние аОПГ лиганда-1 на остеокластогенез.
РАV клетки выдерживались в течение 4 дней при постоянной концентрации ОПГ лиганда (40 нг/мл) и переменной концентрации аОПГ лиганда-1 (6,3-200 нг/мл) в среде клеточной культуры (ЭМЕМ, 10% РВ§, 0,292 мг/мл Ь-глютамина, пенициллина 100 единиц/мл, 100 мкг/мл сульфата стрептомицина). По окончении 4 дней клетки окрашиваются на активность тартрат-устойчивой кислой фосфатазы (ТРАР) путем пермибилизации и подкисления, после чего следует обработка паранитрофенилфосфатом в течение 5 мин. Короче говоря, среда из клеток удаляется, и 100 мкл лимонно-кислого буфера (410 мл 0,1 М лимонной кислоты, 590 мл 0,1 М соли лимонной кислоты, трехнатриевой соли, 1 мл Тритона Х-100) добавляется в каждую лунку, и планшеты выдерживаются в течение 3-5 мин при комнатной температуре. Затем добавляются 100 мкл раствора ΡΝΡΡ (157,8 мг кислой фосфатазы (Сигма 104-100), 7,2 мл раствора тартрата (Сигма кат. № 387-3), и 22,8 мл лимонно-кислого буфера), и планшеты выдерживаются в течение 3-5 мин при комнатной температуре. Реакция завершается добавкой 50 мкл 0,5 М раствора №ЮН.
ТР1Р преобразует паранитрофенилфосфат в паранитрофенол, количество которого можно определить по измерению оптической плотности на длине волны 405 нм. Активность ТР1Р, которая является маркером-имитатором развития остеокласта, коррелирует с оптической плотностью на длине волны 405 нм. На фиг. 11 показана зависимость оптической плотности от концентрации аОПГ лиганда-1, и продемонстрировано, что аОПГ лиганд-1 замедляет образование остеокласта в этом анализе. Замедление связывания ОПГ лиганда с его рецептором.
Возможности аОПГ лиганда-1 демонстрируются его способностью блокировать связывание ОПГ лиганда с его родственным рецептором, рецептором дифференцирования и активации остеокласта (ОПАР, известного также как РАМ<). Этот анализ использует гомогенный времяразрешающий флуоресцентный резонанс (НТРР) для обнаружения связывания аОПГ лиганда-1 с сопряженным с европием ОПГ лигандом (Еи-ОПГ лиганд). Если аОПГ лиганд-1 замедляет связывание Еи-ОПГ лиганда с ОПАР, то выход флуоресценции уменьшается, и концентрация аОПГ лиганда-1 будет обратно пропорциональна флюоресценции.
ОПГ лиганд метится европием, который испускает свет на длине волны 620 нм при возбуждении светом длиной волны 337 нм. ОЭАР сливается с РЬАО и Рс, и слитый белок Рс-ОПАР-РРАО метится антителом против РЬАО, связанным с аллофикоцианином (АРС), фторофором, который испускает свет на длине волны 665 нм при возбуждении светом на длине волны 620 нм. Поэтому, когда меченый Ей ОПГ лиганд связывается с комплексом Ρс-О^ΆР-Ρ^АО/анти-Ρ^АО-ΆΡС, третичный комплекс будет испускать свет на длине волны 665 нм при возбуждении светом длиной волны 337 нм.
При комнатной температуре в образце буфера в течение приблизительно 1 ч (смесь предварительной инкубации) предварительно выдерживается Еи-ОПГ лиганд концентрацией 0,05 мкг/мл с аОПГ лигандом-1 различных концентраций (0,1-150 нг/мл) (50 мм Тгк рН 8, 100 мм №С1, 0,05% №N3, 0,1% В8А, и 0,05% Т\уееп 20). Смесь Рс-ОПАР-РРАО (1 мкг/мл) и анти-ГРАО-АРС (2,5 мкг/мл) также готовится в образце буфера и выдерживается при комнатной температуре в течение одного часа (смесь флуорохрома). Затем равные объемы смеси предварительной инкубации и смеси флуорохрома объединяются и выдерживаются при комнатной температуре в течение 3 ч. Флюоресценция измеряется считыванием планшетов на анализаторе микропланшет Раскагй Эксоуегу НТРР с использованием возбуждения на длине волны 337 нм и длины волны испускания 665 нм.
Во время предварительной выдержки аОПГ лиганда-1 с Еи-ОПГ лигандом с дальнейшим смешиванием с Ρс-О^ΆР-Ρ^АО/анти-Ρ^АО-ΆΡС интенсивность флюоресценции на длине волны 665 нм уменьшается в зависимости от дозы, как показано на фиг. 12, где продемонстрировано, что аОПГ лиганд162 может эффективно замедлять связывание ОПГ лиганда с ОЭАР.
Пример 6.
Фармакокинетика у обезьян Супошо1дик.
Шесть мужских и шесть женских особей обезьян Супошо1дик в возрасте до 4,5 лет и весящих от 2 до 4 кг были разделены на 4 группы по дозам. Группа 1 состояла из 3 мужских и 3 женских особей. Каж- 38 021242 дая из групп 2, 3, и 4 состояла из 1 мужской и 1 женской особи. Животным в группе 1 вводили подкожно единичную дозу, составляющую 1 мг/кг аОПГ лиганда-1, в то время как животным в группах 2, 3 и 4 вводили единичные дозы внутривенно, равные 0,1, 1,0, или 10,0 мг/кг аОПГ лиганда-1 соответственно.
Животным давали дозы аОПГ лиганда-1, выделенного из трансфецированной клетки яичника китайского хомяка (СНО). Для определения концентрации аОПГ лиганда-1, анализа антител, и анализа Νтелопептида (сыворотка Ν-Τχ) сыворотки маркера обновления костной ткани, щелочной фосфатазы (АЬР), и кальция в сыворотке отбирались образцы сыворотки. Для анализа Ν-телопептида (урина Ν-Τχ) и креатинина также отбиралась урина.
Временные зависимости концентрации сыворотки при внутривенном введении характеризуются трехфазным распределением (фиг. 13). Сначала проходит фаза быстрого распределения, затем фаза более медленного наклона, который очевидно зависит от концентрации. Третья фаза является фазой быстрой элиминации.
Для исследования фармакокинетики аОПГ лиганда-1 у обезьян применялся некамерный анализ временных зависимостей концентрации сыворотки с использованием Ρ^οίе55^οпа1 (ν 1.5), и показательный анализ данных, полученных до 14 дней после введения испытуемых компонент, а при концентрациях выше 10000 нг/мл с использованием 8ΑΑΜ (ν 1.1.2). Среднее значение начального объема распределения всех внутривенных доз составляет 28,9 мл/кг, так же как и объем плазмы. Установившийся объем (Укк) распределения составляет в среднем 39 мл/кг по всем внутривенным дозам. В соответствии с показательным анализом средний полупериод распределения (ί1/2α) аОПГ лиганда-1 составляет 6,02 ч, полупериод 11/2р) удлиненной второй фазы увеличивается с дозой и составляет от 86,9 ч при дозе 0,1 мг/кг и доходит максимально до 444 ч при дозе 10,0 мг/кг. Конечный полупериод элиминации (ίι/2ζ), оцененный с использованием некамерного анализа, составляет в среднем 31 ч по группам для всех внутривенных доз. Было обнаружено, что клиренс (СЬ, СЬ/Р) аОПГ лиганда-1 не линеен у животных, принимавших внутривенные дозы, равные 10 мг/кг, при средних значениях клиренса (0,120 мл/ч/кг) в 3,3 раза меньше значений у животных, принимавших 0,1 мг/кг (0.401 мл/ч/кг).
После введения подкожно абсорбция протекает медленно со средними пиковыми концентрациями (Стах), равными 11600 нг/мл через 132 ч. Характерна высокая изменчивость диапазона экспонирования после подкожного введения со средним значением клиренса, равным 0,387±0,281 мл/ч/кг, и средним временем пребывания 202±80,1 ч. Среднее значение биодоступности составляет 89%.
Приведенные ранее данные сведены в табл. 5.
Таблица 5
Средние (± стандартное отклонение) некамерные фармакокинетические параметры3 у обезьян Суηοтο1ди5 после введения единичной дозы аОПГ лиганда-1 внутривенно (ВВ) и подкожно
Оценки некамерных параметров
Параметр Единица измерения 1,0 мг/кг 0,1 мг/кг 1,0 мг/кг 10 мг/кг
Подкожно (п = 6) ВВ (п=2) ВВ (п=2) ВВ (п=2)
Среднее значение Среднее значение Среднее значение Среднее значение Среднее значение
Тгпах ч 132 60,2 0 0 0
Стах нг/мл 11600 3410 4330 38200 326000
Τ|,2ζ ч 34,9 11,1 30,7 31,4 Н/Оь
Аис,0-„) мкг*ч/мл 3520 1750 253 3950 99900
СЬ, СЬ/Р мл/ч/кг 0,387 0,281 0,401 0256 0,120
мкт ч 202 80,1 84,8 124 519
ν85 мл/кг н/пс н/п 33,7 31,7 55,9
3 Значения представлены тремя значащими цифрами.
Ь Не определено. Фармакокинетические образцы закончились в фазе β (плато), поэтому конечная фаза не наблюдалась. с Не применимо.
аОПГ лиганд-1 вызывает быстрое уменьшение концентрации в сыворотке Ν-Τχ в течение 24 ч после введения дозы (фиг. 14). Среднее время максимального воздействия составляло от 12 ч до 7 дней после внутривенного введения доз, которые составляли от 0,1 до 10 мг/кг и от 12 ч до 11 дней после подкожного введения животным дозы 1,0 мг/кг. Максимальное воздействие увеличивается в зависимости от дозы и составляет приблизительно от 80 до 91% при диапазоне дозы от 0,1 до 1 мг/кг. Однако при более высоких дозах больше не наблюдалось никакого подавления с максимальным ингибированием, составляющим 91%. Средние концентрации в сыворотке Ν-Τχ возвращались обратно на базовую линию на 28
- 39 021242 день после внутривенного введения дозы 0,1 мг/кг и на 70 день после подкожного введения дозы 1 мг/кг. Концентрация в урине Ν-Тх показала тенденции сходные с тенденциями для сыворотки Ν-Тх, за исключением того, что все группы возвращаются на базовую линию на 105 день исследований (фиг. 15).
Подавление концентрации кальция в сыворотке увеличивается с дозой до среднего значения надира 31,6% ниже базовой линии спустя семь дней после внутривенного введения 10,0 мг/кг. Для всех других групп по дозам отмечалось в среднем снижение концентрации кальция в сыворотке до 26,4% от базовых средних значений. На 17 день все концентрации кальция у обработанных животных вовращались обратно к среднему базовому значению с отклонениями в пределах 10% (фиг. 20).
Поскольку резорбция и образование костной ткани тесно связаны, изменения, наблюдаемые для маркеров остеогенеза (АЬР), наблюдались также при значительно более медленных спадах концентраций АЬР и при более длительном подавлении, характерном для маркера остеогенеза, Ν-Тх (фиг. 21). Наблюдаемое уменьшение концентрации маркеров резорбции костной ткани до концентраций маркеров остеогенеза (АЬР) после дозы аОПГ лиганда-1 подтверждает, что аОПГ лиганд-1 является средством от резорбции костной ткани.
Большинство животных (9 из 12) выработало антитела к аОПГ лиганду-1. Столкновение антител с аОПГ лигандом-1 не зависит от дозы или маршрута введения. Невозможно оценить воздействие антител к аОПГ лиганду-1 на фармакокинетику аОПГ лиганда-1 при концентрациях выше 0,1 мг/кг, когда никакая группа по дозам не имеет животных ни с негативной реакцией на антитело, ни с позитивной реакцией. При внутривенном введении 0,1 мг/кг, большая часть аОПГ лиганда-1 выводится до выработки антитела и поэтому воздействие на аОПГ лиганд-1 не наблюдается (фиг. 16).
- 40 021242
Перечень последовательностей <110> Бойл Уильям Дж. (Воу1е, ИПНат Л)
Мартин Францис X. (МагДдп, Ггапстз Н)
Хосе Корвалан Р. (Лозе, СсгсаДэп Е)
Дэвис Ц. Джеффри (08νί3, С. СеоГГгеу) <120> Антитела к ОПГ лиганду <130> 06643.0049-00000 <150> 60/301,172 <151> 2001-06-26 <160> 20 <170> Патент - версия 3.1 <210> 1 <211> 1426 <212> ДНК <213> Миз гаизси1из <400> 1
аадсДДдасс ассаДддадД ДДдддсДдад сДддсДДДДД сДДдДддсДа ДДдДаааадд 60
ДдДссадДдД даддДдсадс ДдДДддадДс Ддддддаддс ίДддДасадс сДддддддДс 120
ссДдадасДс ДссДдДдсад ссДсДддадД сассДДДадс адсДаДдсса ДдадсДдддД 180
ссдссаддсД ссадддаадд ддсДддадДд ддДсДсаддД аДДасДддда дДддДддДад 240
ДасаДасДас дсадасДссд Ддаадддссд дДДсассаДс Дссададаса аДДссаадаа 300
сасдсДдДаД сДдсаааДда асадссДдад адссдаддас асддссдДаД аДДасДдДдс 360
дааадаДсса дддасДасдд ДдаДДаДдад ДДддДДсдас сссДддддсс адддаасссД 420
ддДсассдДс ДссДсадссД ссассааддд сссаДсддДс ДДсссссДдд сдсссДдсДс 480
саддадсасс Дссдададса садсддсссД дддсДдссДд дДсааддасД асДДссссда 540
ассддДдасд дДдДсдДдда асДсаддсдс ДсДдассадс ддсдДдсаса ссДДсссадс 600
ДдДссДасад ДссДсаддас ДсДасДсссД садсадсдДд дДдассдДдс ссДссадсаа 660
сДДсддсасс садассДаса ссДдсаасдД адаДсасаад сссадсааса ссааддДдда 720
саадасадДД дадсдсаааД дДДдДдДсда дДдсссассд Ддсссадсас сассДдДддс 780
- 41 021242
аддассдЕса дЕсЕЕссЕсЕ Ессссссааа асссааддас асссЕсаЕда ЕсЕсссддас 840
сссЕдаддЕс асдЕдсдЕдд ЕддЕддасдЕ дадссасдаа дассссдадд ЕссадЕЕсаа 900
сЕддЕасдЕд дасддсдЕдд аддЕдсаЕаа Едссаадаса аадесасддд аддадсадЕЕ 960
саасадсасд ЕЕссдЕдЕдд ЕсадсдЕссЕ сассдЕЕдЕд сассаддасЕ ддсЕдаасдд 1020
сааддадЕас аадЕдсаадд ЕсЕссаасаа аддссЕссса дсссссаЕсд адаааассаЕ 1080
сЕссаааасс ааадддсадс сссдадаасс асаддЕдЕас асссЕдсссс саЕсссддда 1140
ддадаЕдасс аадаассадд ЕсадссЕдас сЕдссЕддЕс аааддсЕЕсЕ ассссадеда 1200
саЕсдссдЕд дадЕдддада дсааЕдддса дссддадаас аасЕасаада ссасассЕсс 1260
саЕдсЕддас ЕссдасддсЕ ссЕЕсЕЕссЕ сЕасадсаад еЕсассдЕдд асаададсад 1320
дЕддсадсад дддаасдЕсЕ ЕсЕсаЕдсЕс сдЕдаЕдсаЕ даддсЕсЕдс асаассасЕа 1380
сасдсадаад адссЕсЕссс ЕдЕсЕссддд ЕаааЕдаЕаа дЕсдас 1426
<210> 2
<211> 467
<212> РЕТ
<213> Миз тизсиЬиз
<40 0 2 С1у Ьеи 5 Зег Тгр Ьеи РЬе Ьеи 10 Уа1 А1а Не Ьеи Ьуз 15 С1у
МеЕ С1и 1 РЬе
Уа1 С1п Суз С1и 20 Уа1 61п Ьеи Ьеи С1и 25 Зег 61у С1у СЬу Ьеи 30 Уа1 С1п
Рго С1у С1у 35 Зег Ьеи Агд Ьеи Зег 40 Суз А1а А1а Зег С1у 45 РЬе ТЬг РЬе
Зег Зег 50 Туг А1а НеЬ Зег Тгр 55 Уа1 Агд С1п А1а Рго 60 С1у Ьуз 51у Ьеи
С1и Тгр 65 УаЬ Зег С1у Ые 70 ТНг С1у Зег СЬу С1у 75 Зег ТЬг Туг Туг А1а 80
- 42 021242
- 43 021242
61и Азр Рго 21и Уа1 С1п РНе Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у Уа1 С1и Уа1 290 295 300
Шз Азп А1а Ьуз ТНг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п РНе Азп Зег ТНг РЬе
305 310 315 320
Агд Уа1 Уа1 Зег Уа1 Ьеи ТНг Уа1 Уа1 Ше С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у
325 330 335
Ьуз <31и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Зег Азп Ьуз С1у Ьеи Рго А1а Рго Не 340 345 350
С1и Ьуз ТНг 11е Зег Ьуз ТЬг Ьуз С1у С1п Рго Агд 61и Рго 61п Уа1 355 360 365
Туг ТНг Ьеи Рго Рго Зег Агд 61и С1и Мер ТНг Ьуз Азп С1п Уа1 Зег 370 375 380
Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РНе Туг Рго Зег Азр 11е А1а Уа1 С1и
385 390 395 400
Тгр 61и Зег Азп С1у Е1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТНг Рго Рго
405 410 415
МеС Ьеи Азр Зег Азр С1у Зег РНе РЬе Ьеи Туг Зег Ьуз Ьеи ТНг Уа1 420 425 430
Азр Ьуз Зег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РНе Зег Суз Зег Уа1 МеС 435 440 445
Шз С1и А1а Ьеи Шз Азп Шз Туг ТНг С1п Ьуз Зег Ьеи Зег Ьеи Зег 450 455 460
Рго С1у Ьуз 465
- 44 021242
<210> 3
<211> 728
<212> ДНК
<213> Миз лидзсиТиг
<400> 3
ЕсЕадассас саЕддааасс ссадсдсадс ЕЕсЕсЕЕссЕ ссЕдсЕасЕс ЕддсЕсссад 60
аЕассассдд адаааЕЕдЕд ЕЕдасдсадЕ сЕссаддсас ссЕдЕсЕЕЕд ЕсЕосадддд 120
ааададссас ссЕсЕссЕдЕ адддссадЕс ададЕдЕЕсд сддсаддЕас ЕЕадссЕддЕ 180
ассадсадаа ассЕддссад дсЕсссаддс ЕссЕсаЕсЕа ЕддЕдсаЕсс адсадддсса 240
сЕддсаЕссс адасаддЕЕс адЕддсадЕд ддЕсЕдддас адасЕЕсасЕ сЕсассаЕса 300
дсадасЕдда дссЕдаадаЕ ЕЕЕдсадЕдЕ ЕЕЕасЕдЕса дсадЕаЕддЕ адЕЕсассЕс 360
ддасдЕЕедд ссаадддасс ааддЕддааа Есаааедаас ЕдЕддсЕдса ссаЕсЕдЕсЕ 420
ЕсаЕсЕЕссс дссаЕсЕдаЕ дадсадЕЕда ааЕсЕддаас ЕдссЕсЕдЕЕ дЕдЕдссЕдс 480
ЕдааЕаасЕЕ сЕаЕсссада даддссааад ЕасадЕддаа ддЕддаЕаас дсссЕссааЕ 540
сдддЕаасЕс ссаддададЕ дЕсасададс аддасадсаа ддасадсасс ЕасадссЕса 600
дсадсасссЕ дасдсЕдадс ааадсадаеЕ асдадаааса сааадЕсЕас дссЕдсдаад 660
ЕсасссаЕеа дддссЕдадс ЕсдсссдЕса сааададсЕЕ саасадддда дадЕдЕЕдаЕ 720
аадЕсдас 728
<210> 4
<211> 235
<212> РКТ
<213> Миз
<4 00> 4
МеЕ 1 С1и ТЬг Рго А1а 5 С1п Ьеи Ьеи РЬе Ьеи 10 Ьеи Ьеи Ьеи Тгр Ьеи 15 Рго
Азр ТЬг ТЬг С1у С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго С1у ТЬг Ьеи Зег
20 25 30
Ьеи Зег Рго <31у С1и Агд А1а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег 61п Зег
35 40 45
- 45 021242
Уа1 Агд 01у Агд Туг Ьеи А1а Тгр 50 55
Рго Агд Ьеи Ьеи Не Туг 61у А1а 65 70
Азр Агд РЬе Зег С1у Зег С1у Зег 65
Зег Агд Ьеи С1и Рго С1и Азр РЬе 100
С1у Зег Зег Рго Агд ТЬг РЬе С1у 115 120
Агд ТЬг Уа1 А1а А1а Рго Зег Уа1 130 135
С1п Ьеи Ьуз Зег С1у ТЬг А1а Зег 145 150
Туг Рго Агд С1и А1а Ьуз Уа1 С1п 165
Зег 61у Азп Зег 61п С31и Зег Уа1 180
ТЬг Туг Зег Ьеи Зег Зег ТЬг Ьеи 195 200
Ьуз Шз Ьуз Уа1 Туг А1а Суз С1и 210 215
Рго Уа1 ТЬг Ьуз Зег РЬе Азп Агд 225 230
Туг С1п С1п Ьуз Рго С1у С1п А1а
Зег Зег Агд А1а ТЬг С1у Не Рго 75 80
С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг Не 90 95
А1а Уа1 РЬе Туг Суз С1п С1п Туг 105 НО
С1п С1у ТЬг Ьуз Уа1 С1и Не Ьуз 125
РЬе Не РЬе Рго Рго Зег Азр 61и 140
Уа1 Уа1 Суз Ьеи Ьеи Азп Азп РЬе 155 160
Тгр Ьуз \7а1 Азр Азп А1а Ьеи С1п 170 175
ТЬг С1и С1п Азр Зег Ьуз Азр Зег 185 190
ТЬг Ьеи Зег Ьуз А1а Азр Туг С1и 205
Уа1 ТЬг ΗΪ5 С1п С1у Ьеи Зег Зег
220
С1у С1и Суз 235
- 46 021242 <210> 5 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственая последовательность <220>
<223> праймер 5’ каппа КАСЕ <400> 5 даПдасссад СсСссадсса сссСд 25 <210> 6 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственая последовательность <220>
<223> праймер 3' каппа ВАСЕ <400> 6 ааддд!сада ддссааадда Едд 23 <210> Ί <2Х1> 30 <212> ДНК <213> Искусственая последовательность <220>
<223> праймер 5' анти-ОПГ лиганд-1 каппа
- 47 021242 <400> 7 саасбсДада ссассаДдда аассссадсд 30 <210> е <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственая последовательность <220>
<223> праймер 3' анти-ОПГ лиганд-1 каппа <400> 8
ЬДСдасдЪсд асЪЪаСсаас асДсДссссЪ дЬЬдаад 37 <210> 9 <211> 23 <212> ДНК <213> Искусственая последовательность <22О>
<223> праймер 5’ 1дС2 КАСЕ <400> 9 ддсасддИса ссасдсбдсЕ дад 23 <210> 10 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственая последовательность
- 48 021242 <220>
<223? праймер 3' 1д32 КАСЕ
<400> 10
ссРссассаа дддсссаГсд дРсН 24
<210> 11
<211> 51
<212> ДНК
<213> Искусственая последовательность
<220>
<223> праймер 5' анти-ОПГ лиганд-1 1дС2
<4 00> 11
садаадсРРд ассассаРдд адрРРдддсД дадсрддсРР РРРсРРдРдд с 51
<210> 12
<211> 37
<212> ДНК
<213> Искусственая последовательность
<220>
<223> праймер 3' анти-ОПГ лиганд-1 1дО2
<4 00> 12
дсаРдРсдас РРаПсаРРЛа сссддадаса дддадад 37
<210> 13
<211> 122
<212> РКТ
<213> Мну тизсиГиз
- 49 021242 <400> 13
С1и Уа1 С1п Ьеи Ьеи С1и Зег 51 у 51у 61 у Ьеи Уа1 С1п Рго С1у С1у
1 5 10 15
Зег Ьеи Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег 61 у РЬе ТЬг РЬе Зег Зег Туг
20 25 30
А1а МеС Зег Тгр Уа1 Агд 51 п А1а Рго 61у Ьуз СЬу Ьеи С1и Тгр Уа1
35 40 45
Зег 61у Не ТЬг 51 у Зег С1у 51у Зег ТЬг Туг Туг АЬа Азр Зег Уа1
50 55 60
Ьуз С1у Агд РЬе ТЬг 11е Зег Агд Азр Азп Зег Ьуз Азп ТЬг Ьеи Туг
65 70 75 80
Ьеи С1п МеС Азп Зег Ьеи Агд А1а СЬи Азр ТЬг АЬа Уа1 Туг Туг Суз
85 90 95
А1а Ьуз Азр Рго С1у ТЬг ТЬг Уа1 11е МеС Зег Тгр РЬе Азр Рго Тгр
100 105 110
01у С1п С1у ТЬг Ьеи νβΐ ТЬг Уа1 Зег Зег
115 120
<210> 14
<211 > 108
<212> РКТ
<213> Миз глизси1из
<4 00> 14
С1и Не Уа1 Ьеи ТЬг С1п Зег Рго С1у ТЬг Ьеи Зег Ьеи Зег Рго С1у
1 5 10 15
51и Агд А.а ТЬг Ьеи Зег Суз Агд А1а Зег СЬп Зег Уа1 Агд СЬу Агд
20 25 30
- 50 021242
Туг Ьеи А1а 35 Тгр Туг С1п С1п Ьуз 40 Рго С1у С1п А1а Рго 45 Агд Ьеи Ьеи
Не Туг С1у А1а Зег Зег Агд А1а ТЬг С1у 11е Рго Азр Агд РЬе Зег
50 55 60
С1у Зег С1у Зег С1у ТЬг Азр РЬе ТЬг Ьеи ТЬг 11е Зег Агд Ьеи С1и
65 70 75 80
Рго С1и Азр РЬе А1а Уа1 РЬе Туг Суя С1п С1п Туг 61у Зег Зег Рго
85 90 95
Агд ТЬг РЬе С1у С1ь 51у ТЬг Ьуз Уа1 31и 11е Ьуз
100 105
<210> 15
<211> 24
<212> ДНК
<213> Искусственая последовательность
<220>
<223> случайный праймер <220>
<221> ηιΐεο ТеаЬиге <222> (18)..(23) <223> N - это А, С, С, или Т <400> 15 ддссддаЬад дссЬсасппп ηηηΐ 24 <210> 16 <211> 5 <212> РКТ <213> Искусственая последовательность <220>
<223> трансляция участка праймера 5' анти-ОПГ лиганда-1 каппа
- 51 021242 <400> 16
МеС С1и ТЬг Рго А1а
5 <210> 17 <211> 6 <212> РКТ <213> Искусственая последовательность <220>
<223> трансляция участка праймера 3’ анти-ОПГ лиганд-1 каппа <400> 17
Суз С1и С1у Агд Авп РЬе
5 <210 18 <211> 12 <212> РКТ <213> Искусственая последовательность <220>
<223> трансляция участка праймера 5' анти-ОПГ лиганд-1 1дС2 <400> 18
Ме! С1и РЬе С1у Ьеи Зег Тгр Ьеи РЬе Ьеи 7а1 А1а
10 <210> 19 <211> 7 <212> РКТ <213> Искусственая последовательность <220>
<223> трансляция участка праймера 3’ анти-ОПГ лиганд-1 1д62
- 52 021242 <400> 19
Ьуз С1у Рго Зег Ьеи Зег Ьеи
5 <210> 20 <211> 10 <212> РКТ <213> Искусственая последовательность <220>
<22 3> ЬНКН антагонист пептида <220>
<221> М15С_РЕАТиКЕ <222> (1)..(1) <223> Хаа это Αο-ϋ-ΝθΙ, где ΝθΙ это 3-(2-наптил)аланинил <220>
<221> М13С_ГЕАТОКЕ <222> (2)..(2) <223> Хаа это (4’-хлорофенил)аланинил <220>
<221> М15С_ГЕАТиКЕ <222> (3)..(3) <223> Хаа это Р-Ра1, где Ра1 это 3-(3'-пиридил)аланинил <220>
<221> ШЗСГЕАТиКЕ <222> (5) .. (5) <223> Хаа это Ν-метилтирозин <220>
<221> МГЗСГЕАТЦКЕ <222> (6)..(6) <223> Хаа это Ь-аспарагин <220>
<221> М15С_ГЕАТиКЕ <222> (8)..(8) <223> Хаа это Н-эпсилон-2-пропиллизиниил <220>
<221> Н13С_РЕАТиКЕ <222> (10)..(10) <223> Хаа это Ц-аланин-ЫН2 <400> 20
Хаа Хаа Хаа Зег Хаа Хаа Ьеи Хаа Рго Хаа
10

Claims (92)

1. Выделенное антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, причем легкая цепь содержит:
(а) вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности ЗЕО ГО NО:
4 или (б) аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО: 14;
при этом антитело взаимодействует с остеопротегерин лигандом (ОПГЛ).
2. Антитело по п.1, содержащее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ИО: 14.
3. Антитело по п.1, содержащее легкую цепь, содержащую вариабельную область и константную область последовательности ЗЕО ГО NО: 4.
4. Антитело по п.1, содержащее легкую цепь, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности ЗЕО ГО NО: 4.
5. Выделенное антитело, содержащее легкую цепь и тяжелую цепь, причем тяжелая цепь содержит:
(а) вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности ЗЕО ГО NО:
2 или (б) аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО: 13;
при этом антитело взаимодействует с остеопротегерин лигандом.
6. Антитело по п.5, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ИО: 13.
7. Антитело по п.5, содержащее тяжелую цепь, содержащую вариабельную область и константную область последовательности ЗЕО ГО NО: 2.
8. Антитело по п.5, содержащее тяжелую цепь, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности ЗЕО ГО NО: 2.
9. Антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем:
(а) тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности ЗЕО ГО NО: 2, а легкая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности ЗЕО ГО NО: 4; или (б) тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО: 13, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО: 14;
при этом антитело взаимодействует с остеопротегерин лигандом.
10. Антитело по п.9, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО ИО: 13.
11. Антитело по п.9, содержащее тяжелую цепь, содержащую вариабельную область и константную область последовательности ЗЕО ГО NО: 2.
12. Антитело по п.9, содержащее тяжелую цепь, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности ЗЕО ГО NО: 2.
13. Антитело по любому из пп.9-12, содержащее легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО: 14.
14. Антитело по любому из пп.9-12, содержащее легкую цепь, содержащую вариабельную область и константную область последовательности ЗЕО ГО NО: 4.
15. Антитело по любому из пп.9-12, содержащее легкую цепь, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности ЗЕО ГО NО: 4.
16. Антитело по п.9, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО: 13 и легкая цепь содержит аминокислотную последовательность ЗЕО ГО NО: 14.
17. Антитело по п.9, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности ЗЕО ГО NО: 2, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности ЗЕО ГО NО: 4.
18. Антитело по п.9, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь состоит из вариабельной области и константной области последовательности ЗЕО ГО NО: 2, и при этом легкая цепь состоит из вариабельной области и константной области последовательности ЗЕО ГО NО: 4.
19. Выделенное антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности ЗЕО ГО NО: 2, имеющей одну или более делеций, дополнений и/или замещений аминокислот, и при этом тяжелая цепь содержит три гипервариабельные области (СИК) последовательности ЗЕО ГО NО: 2, и где легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности ЗЕО ГО NО: 4, имеющей одну или более делеций, дополнений и/или замещений аминокислот, и при этом легкая цепь содержит три гипервариабельные области (СИК) последовательности ЗЕО ГО NО: 4, при этом антитело связывается с остеопротегерин лигандом человека и ингибирует связывание ОПГЛ с рецептором дифференцирования и активации остеокластов (О^ΑΚ).
20. Антитело по п.19, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную об- 54 021242 ласть последовательности 8ЕЦ ΙΌ ΝΌ: 2, имеющей делецию, дополнение и/или замещение одной аминокислоты, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ΙΌ ЫО: 4, имеющей делецию, дополнение и/или замещение одной аминокислоты.
21. Антитело по п.19, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ΙΌ МО: 2, имеющей одну или более карбоксиконцевые делеции аминокислот, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ΙΌ НО: 4, имеющей одну или более карбоксиконцевые делеции аминокислот.
22. Антитело по п.19, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ΙΌ КО: 2, имеющей карбоксиконцевую делецию одной аминокислоты, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 4, имеющей карбоксиконцевую делецию одной аминокислоты.
23. Выделенное антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 2, имеющей одну или более делеций, дополнений и/или замещений аминокислот, и при этом тяжелая цепь содержит три гипервариабельные области (СОК) последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, и где легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 4, при этом антитело связывается с остеопротегерин лигандом человека и ингибирует связывание ОПГЛ с рецептором дифференцирования и активации остеокластов (ООАК).
24. Антитело по п.23, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей делецию, дополнение и/или замещение одной аминокислоты.
25. Антитело по п.23, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей одну или более карбоксиконцевые делеции аминокислот.
26. Антитело по п.23, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей карбоксиконцевую делецию одной аминокислоты.
27. Выделенное антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей одну или более делеций, дополнений и/или замещений аминокислот, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности 8ЕЦ Ш NО: 4, имеющей одну или более делеций, дополнений и/или замещений аминокислот, и при этом антитело связывается с остеопротегерин лигандом при константе диссоциации меньше или равной 0,29 нМ и ингибирует связывание ОПГЛ с рецептором дифференцирования и активации остеокласта (ООАК).
28. Антитело по п.27, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей делецию, дополнение и/или замещение одной аминокислоты, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 4, имеющей делецию, дополнение и/или замещение одной аминокислоты.
29. Антитело по п.27, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей одну или более карбоксиконцевые делеции аминокислот; и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 4, имеющей одну или более карбоксиконцевые делеции аминокислот.
30. Антитело по п.27, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей карбоксиконцевую делецию одной аминокислоты, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ΙΌ NО: 4, имеющей карбоксиконцевую делецию одной аминокислоты.
31. Выделенное антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей одну или более делеций, дополнений и/или замещений аминокислот, и при этом легкая цепь содержит вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности 8ЕЦ Ш NО: 4, при этом антитело связывается с остеопротегерин лигандом при константе диссоциации меньшей или равной 0,29 нМ и ингибирует связывание ОПГЛ с рецептором дифференцирования и активации остеокласта (ООАК).
32. Антитело по п.31, причем тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей делецию, дополнение и/или замещение одной аминокислоты.
33. Антитело по п.31, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей одну или более карбоксиконцевые делеции аминокислот.
34. Антитело по п.31, в котором тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ Ш NО: 2, имеющей карбоксиконцевую делецию одной аминокислоты.
35. Выделенное антитело, полученное выращиванием клетки-хозяина, содержащей первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, отличающееся тем, что первый полинуклеотид кодирует тяжелую
- 55 021242 цепь, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь и при этом тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 13, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 14; и антитело связывается с остеопротегерин лигандом человека и ингибирует связывание ОПГЛ с рецептором дифференцирования и активации остеокласта (0ΌΛΡ).
36. Антитело по п.35, причем первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 2, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 4.
37. Антитело по п.35, причем первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 2, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 4.
38. Антитело по п.35, причем первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь, содержащую вариабельную область и константную область последовательности 8Е0 ГО N0: 2, и при этом второй полинуклеотид кодирует легкую цепь, содержащую вариабельную область и константную область аминокислотной последовательности 8Е0 ГО N0: 4.
39. Антитело по п.35, причем первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности 8Е0 ГО N0: 2, и при этом второй полинуклеотид кодирует легкую цепь, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности 8Е0 ГО N0: 4.
40. Антитело по любому из пп.35-39, причем первый и второй полинуклеотиды являются частью отдельных молекул нуклеиновой кислоты.
41. Антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем:
(а) тяжелая цепь содержит три гипервариабельные области (СОР) последовательности 8Е0 ГО N0:
13, (б) легкая цепь содержит три гипервариабельные области (СОР) последовательности 8Е0 ГО N0:
14, при этом антитело связывается с остеопротегерин лигандом человека и ингибирует связывание ОПГЛ с рецептором дифференцирования и активации остеокласта (0ΌΛΡ).
42. Антитело по п.41, в котором первая вариабельная область имеет по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 13 и вторая вариабельная область имеет по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 14.
43. Антитело по п.41, в котором первая вариабельная область имеет по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 13 и вторая вариабельная область имеет по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 14.
44. Антитело по п.41, в котором первая вариабельная область имеет по крайней мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 13 и вторая вариабельная область имеет по крайней мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 14.
45. Антитело по любому из пп.41-44, которое связывается с остеопротегерин лигандом при константе диссоциации меньше или равной 0,29 нМ.
46. Антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, причем:
(а) тяжелая цепь содержит первую вариабельную область, имеющую по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 13, и (б) легкая цепь содержит вторую вариабельную область, имеющую по крайней мере 90%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 14, при этом антитело связывается с остеопротегерин лигандом человека при константе диссоциации меньше или равной 0,29 нМ и ингибирует связывание ОПГЛ с рецептором дифференцирования и активации остеокласта (0ΌΛΡ).
47. Антитело по п.46, в котором первая вариабельная область имеет по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 13 и вторая вариабельная область имеет по крайней мере 95%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 14.
48. Антитело по п.46, в котором первая вариабельная область имеет по крайней мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 13 и вторая вариабельная область имеет по крайней мере 99%-ную идентичность с аминокислотной последовательностью 8Е0 ГО N0: 14.
49. Антитело по любому из пп.1, 5, 9-14, 16, 17 и 19-48, являющееся одноцепочечным антителом.
50. Антитело по п.49, представляющее собой антитело Ρν.
51. Антитело по любому из пп.1, 5, 9-14, 16, 17 и 19-48, которое является РаЬ, РаЬ' или (РаЬ')2.
52. Антитело по любому из пп.1-48, которое является полностью человеческим.
53. Антитело по любому из пп.1-18, которое ингибирует связывание остеопротегерин лиганда с рецептором дифференцирования и активации остеокласта.
54. Фармацевтический состав, содержащий антитело по любому из пп.1-53.
55. Способ определения содержания остеопротегерин лиганда в биологическом образце, включающий контактирование образца с антителом по любому из пп.1-53.
- 56 021242
56. Способ лечения потери костной ткани у пациента, содержащий введение пациенту антитела по любому из пп.1-53 или фармацевтического состава по п.54.
57. Способ по п.56, причем потеря костной ткани связана по крайней мере с одним состоянием, выбранным из остеопороза, болезни Паджета, остеомиелита, гиперкальцемии, остеопении, остеонекроза, воспалительного состояния, аутоиммунного состояния, ревматоидного артрита и рака.
58. Способ по п.57, причем рак выбран из рака молочной железы, простаты, щитовидной железы, почки, легких, пищевода, прямой кишки, мочевого пузыря, шейки матки, яичников, печени, желудочнокишечного тракта, множественной миеломы, лимфомы и болезни Ходжкина.
59. Способ по п.56, далее включающий введение по крайней мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из группы, включающей морфогенный фактор костной ткани, трансформирующий фактор роста β (ТСР-β), гормон паращитовидной железы, аналог гормона паращитовидной железы, белок, родственный гормону паращитовидной железы, аналог белка, родственного гормону паращитовидной железы, простагландин, бисфосфонат, алендронат, фторид, кальций, фактор роста фибробластов (РСР), модулятор РСР.
60. Способ по п.57, причем потеря костной ткани связана с раком, и при этом способ далее включает введение связанного с ТОТ1 полипептида (ТКА1Ь).
61. Способ по п.57, причем потеря костной ткани связана с воспалительным состоянием, и при этом способ далее включает введение по крайней мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из ингибитора интерлейкина-1 (1Ь-1), например 1Ь-1га или анакинры Кшеге!™, ингибитора ЮТа, например, растворимого рецептора ЮТа или этанерсепта ЕпЬге1™, антитела к анти-ТОТа, например, инфликсимаба Кетюабе™ или антитела Э2Е7, нестероидного противовоспалительного средства (N8.0), ингибитора СОХ-2, например, селекосиба Се1еЬгех™, рофекоксиба Уюхх™ или лефлуномида.
62. Способ по п.57, причем потеря костной ткани связана с аутоиммунным состоянием, при этом способ далее включает введение по крайней мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из ингибитора интерлейкина-1 (1Ь-1), например 1Ь-1га или анакинры Кшеге!™, ингибитора ЮТа, например, растворимого рецептора ЮТа или этанерсепта ЕпЬге1™, антитела к анти-ТОТа, например инфликсимаба Кетюабе™ или антитела Э2Е7, метотрексата, растворимой формы СТЬА4 и модулятора рецептора глюкокортикоида.
63. Способ по п.57, причем потеря костной ткани связана с ревматоидным артритом, и при этом способ далее включает введение по крайней мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из ингибитора интерлейкина-1 (1Ь-1), например 1Ь-1га или анакинры Кшеге!™, ингибитора ЮТа, например, растворимого рецептора ЮТа или этанерсепта ЕпЬге1™, антитела к анти-ТОТа, например инфликсимаба Кетюабе™ или антитела Э2Е7, нестероидного противовоспалительного средства (N80), ингибитора СОХ-2, например, селекосиба Се1еЬгех™, рофекоксиба Уюхх™ или лефлуномида, метотрексата, растворимой формы СТЬА4 и модулятора рецептора глюкокортикоида.
64. Способ по п.57, причем потеря костной ткани связана с раком, и при этом способ далее включает введение по крайней мере одного дополнительного терапевтического агента, выбранного из фактора роста кератиноцита (КСР), родственной КСР молекулы, модулятора КСР, антитела против Нег2, антитела против СЭС20, антитела против ЕСРК, антагониста РАР.
65. Способ по п.57, причем потеря костной ткани связана с раком, и при этом способ далее включает проведение по крайней мере одного способа, выбранного из лучевой терапии или химиотерапии.
66. Способ по п.65, причем химиотерапия включает в себя лечение по крайней мере одним из агентов, выбранных из антрациклина, таксола, тамоксифена, доксорубицина, 5-фтороурацила и антагониста рилизинг-лютеинизирующего гормона (ЬНКН).
67. Способ по любому из пп.64-66, причем рак выбран из рака молочной железы, простаты, щитовидной железы, почки, легких, пищевода, прямой кишки, мочевого пузыря, шейки матки, яичников, печени, желудочно-кишечного тракта, множественной миеломы, лимфомы и болезни Ходжкина.
68. Способ по п.56, причем он включает введение антитела, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь, при этом тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 13, а легкая цепь содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 14.
69. Способ по п.56, причем он включает введение антитела, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь, при этом тяжелая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8Е0 ГО N0: 2, а легкая цепь содержит вариабельную область и константную область последовательности 8Е0 ГО N0: 4.
70. Способ по п.56, причем он включает введение антитела, содержащего тяжелую цепь и легкую цепь, при этом тяжелая цепь состоит из вариабельной области и константной области последовательности 8Е0 ГО N0: 2, а легкая цепь состоит из вариабельной области и константной области последовательности 8Е0 ГО N0: 4.
71. Выделенный полинуклеотид, который кодирует легкую цепь антитела по любому из пп.1-4.
72. Выделенный полинуклеотид по п.71, содержащий нуклеотидную последовательность 8Е0 ГО N0: 3.
- 57 021242
73. Выделенный полинуклеотид, кодирующий тяжелую цепь антитела по любому из пп.5-8.
74. Выделенный полинуклеотид по п.73, содержащий нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1.
75. Выделенная клетка-хозяин, содержащая первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, причем первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь антитела, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь антитела, и при этом первый и второй полинуклеотиды кодируют антитело по любому из пп.1-53.
76. Выделенная клетка-хозяин, содержащая первый полинуклеотид и второй полинуклеотид, в которой первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 13, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 14, причем антитело, содержащее тяжелую цепь и легкую цепь, взаимодействует с остеопротегерин лигандом.
77. Клетка-хозяин по п.76, в которой первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь антитела, содержащую аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4.
78. Клетка-хозяин по п.76, в которой первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь антитела, состоящую из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь антитела, состоящую из аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4.
79. Клетка-хозяин по п.76, причем первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь антитела, содержащую вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь, содержащую вариабельную область и константную область последовательности 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4.
80. Клетка-хозяин по п.76, причем первый полинуклеотид кодирует тяжелую цепь антитела, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности 8ЕЦ ГО ΝΟ: 2, а второй полинуклеотид кодирует легкую цепь, состоящую из вариабельной области и константной области последовательности 8ЕЦ ГО ΝΟ: 4.
81. Клетка-хозяин по п.76, в которой первый полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 1, а второй полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО ΝΟ: 3.
82. Клетка-хозяин по любому из пп.75-81, причем первый и второй полинуклеотиды являются частью одной молекулы нуклеиновой кислоты.
83. Клетка-хозяин по любому из пп.75-81, в которой первый и второй полинуклеотиды являются частью разных молекул нуклеиновой кислоты.
84. Клетка-хозяин по п.82, в которой молекула нуклеиновой кислоты является вектором.
85. Клетка-хозяин по п.83, в которой первый полинуклеотид является частью первого вектора, а второй полинуклеотид является частью второго вектора.
86. Клетка-хозяин по п.84, причем вектор является вирусным вектором.
87. Клетка-хозяин по п.85, причем по крайней мере один из первого вектора и второго вектора является вирусным вектором.
88. Клетка-хозяин по любому из пп.75-87, которая является прокариотической клеткой-хозяином или эукариотической клеткой-хозяином.
89. Клетка-хозяин по п.88, которая является клеткой-хозяином млекопитающего.
90. Клетка-хозяин по п.89, причем клетка-хозяин выбрана из овариальной клетки китайского хомячка, клетки НеЬа, почечной клетки детеныша хомячка, почечной клетки обезьяны и человеческой гепатоцеллюлярной клетки карциномы.
91. Способ получения антитела, взаимодействующего с остеопротегерин лигандом, включающий культивирование клетки-хозяина по любому из пп.75-90 и выделение антитела.
92. Антитело, полученное способом по п.91.
- 58 021242 кДНК тяжелой цепи аОПГ лиганда-1
Последовательность ДНК плазмида экспрессии тяжелой цепи от сайта ΗίηάΙΙΙ до сайта ЗаН. Инициирующий кодон начинается на п! 14, терминирующий кодон начинается на п11415.
1 ААбСТТбАСС АССДТОбАбТ ТТбСбСГОАб СТббСТТГТТ СТТСТбССГА ТТТГААААСб 61 тетссАСТот ОАсетесАсс тсттоддстс тссссадссс ттсотасасс стссссеетс · 121 сстсасастс тсстстосас сстстссдтт сассггтасс асстдтссса ТСАССТСССТ 181 СССССАСССТ ССАСССААСС СССТССАСТС ССТСТСАССТ АГГАСТСССА ОТССТССТАС 243 ТДСДТАСТАС ССЛСАСТССб ТбААбССССС СТТСАССАТС ТССАСАСАСА АТТССААОАА
301 САСССТСТАТ СТССАААТбА АСАбССТбАС АбССбАббАС АСббСССТАТ АТТАСТбТбС 361 ОАААбАТССА СббАСТАСбб ТСАТТАТбАС ТТббТТСОАС СССТСбббСС АбббААСССТ 421 ббТСАСССТС ТССТСАбССТ ССАССААббб СССАТСбСТС ТТСССССТОС СССССТбСТС 481 САССАССАСС ТСССАСАССА САСССССССТ ССССТСССТС СТСААССАСТ АСТТСССССА 541 АССССТСАСС СТСТССТССА АСГСАСССбС ТСТ6АССА6С 66С6Т6САСА ССТТСССА6С 601 ТСТССТАСАС ТССТСАССАС ТСТАСТСССТ САССАСССТС СТСАСССТСС ССТССАОСАА 661 СТТСбССАСС САбАССТАСА ССТбСААСбТ АбАТСАСААб СССАбСААСА ССААбСТббА 721 СААбАСАетТ САССССАААТ СТТСТСТССА СТССССАССб ТССССАбСАС САССТСТССС 781 АббАССбТСА бТСТТССТСТ ТССССССААА АСССААССДС АСССТСАТбА ТСТСССССДС 841 СССТСАССТС АССТСССТСС ТССТССАССТ САСССАССАА САСССССАСС ТССАСТГСАА 901 СТССГАССТС САСССССТСС АССТССАТАА ТСССААСДСА ААСССАСССС АССАССАСТТ 961 САДСАССАСС ТТСССТСТСС ТСАСССТССТ САСССТТСТС САССАббАСТ СбСТСААСбб 1021 СААССАСТАС ААСТССААСС ТСТССААСАА АССССТСССА ССССССАТСб ДбААААССАТ 1081 СТССААААСС АААССССАСС СССбАбААСС АСАССТСТАС АСССТССССС САТССССССА 1141 ССАСАТСАСС ААСААССАбб ТСАСССТбАС СТбССТбСТС АААСбСТТСТ АССССАСССА 1201 САТСССССТС САСТбббАСА бСААТббССА ОССббАСААС ААСГАСААбА ССАСАССТСС 1261 САТССТССАС ТСССАССбСТ ССТТСТТССТ СТАСАССААС СТСАСССТСС АСААСАССАС 1321 СТСССЛССДС бСбААССТСТ ТСТСДТССТС ССТСАТССАТ САСССТСТСС АСААССАСТА 1381 САСССАСААС ДСССТСТССС ТОТСТССССС ТАААТбАТАА 6ТС6АС Последовательность № 1
Фиг. 1
Аминокислотная последовательность тяжелой цепи аОПГ лиганда-1
Подчеркнут сигнальный пептид 1д62, вариабельная область обозначена заглавными буквами и не подчеркнута, а постоянная область обозначена строчными буквами,
1 ΜΕΡ6ί5ΜίΡί УАИ-КбУОСЕ У0ЬЬЕ5бСбЬ У0РССЗХЯХ5 САА5СРТР53 УАМЗМУКОАР 61 6К6ХЕМУ5С1 Τ63663ΤΥΥΑ ОЗУКСКГПЗ ΚΟΝ5ΚΝΤΙ.ΥΙ. ОМНЗЬКАЕОТ АУУУСАКОРО 121 ττνίΜδΜΡΟΡ Μ606τι_ντν5 зазхкдрзгР рТарсзгзхз езхаа1дс1у кдуХреруху 181 зилздаТхзд уКхГрауТчз здТузТззуу хурззп^дхч ХухспУЙЬкр зпхкубкхуе 241 гксо/есррс рарруадрзу бТРрркркйх Тппзгхреух суууйузьеб ρβνς·ίη«γνά 301 дуеуКпакхк ρΓββηίπϊτΐ гуузуТхууЬ чбиТпдкеук скУзпкдТра ртекхлзкхк 361 ддргердуух Тррзгеешхк пцуз1хс1ук д'Рур^гИаче иезпддрепп укххррпПск
421 Сдз-ГПузк! Ху4кзг«чдд ιινί565νιι>ίιβ аТЬпЬуХдкз ТзТзрдк ПоследовательностьΝ»2 Фиг. 2
- 59 021242 кДНК легкой каппа-цепи ОПГ лиганда-1
Последовательность ДНК плазмида экспрессии тяжелой цепи от сайта ХЬа! до сайта 5а11. Инициирующий кодон начинается на ηί 12, терминирующий кодон начинается на Ш 717.
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
ТСТАСАССАС САТеСАААСС ССАССОСАСС АТАССАССОО АСАААТТСТС ТТСАСССАСТ АААСАСССАС ССТСТССТСТ АСССССАСТС АССАССАСАА АССТССССАС ССТСССА&ЗС СТОССАТССС АСАСАОСГГС АСТСССАСТС ССАСАСТССА СССТСААСАТ ТТТССАСТСТ ССАССТТССС ССААСССАСС ААССТССААА ТСАТСТТССС СССАТСТСАТ САССАСТТСА ТСААТДАСТТ СТАТСССАСА САССССАААС ССССТААСТС ССАССАСАСТ СТСАСАСАСС ССАССАСССТ САСССТСАОС АААССАСАСТ ТСАСССАТСА СССССТСАСС ТССССССТСА ААСТССАС Последовательность № 3
ТТСТСГГССТ ССТССТАСТС ТОССТСССАС СТССАСССАС ССТСТСТТТС ТСТССАСССС АСАСТСТТСС ССССАССТАС ТТАСССГССТ ТССТСАТСТА ТССТССАТСС АССАСССССА СОТСТСССАС АСАСТТСАСТ СТСАССАТСА ТТТАСТОТСД ССАСТАТССТ АСТТСАССТС ТСАААССААС ТСТСССТССА ССАТСТСТСТ ДАТСТССААС ТбССТСТСТТ СТОТСССТСС ТАСАСТССАА ССТССАТААС ССССТССААТ АССАСАССАА ССАСАССАСС ТАСАСССГСА АССАСАААСА СААЛСТСТАС 5ССТСССААС САААСАССТТ СААСАОСССА САСТСТТСДТ
Фиг. 3
Аминокислотная последовательность легкой каппа-цепи аОПГ лиганда-1
Подчеркнут сигнальный пептид каппа, вариабельная область обозначена заглавными буквами и не подчеркнута, а постоянная область обозначена строчными буквами
1 МЕТРАОПП И.1Ш-РРТТС Е1У1.ТО5РСТ 1Л1.5РСЕЙАТ ЬЗСЙАЗДЗУК 51 СЙУЦМЛЧЮК РСОАРЙЦЫУ СА55КАТС1Р ОКР5С5С5СТ ЦГП.Т15К1.Е 101 ΡΕϋΡΑνΡΥΟΟ 0УС55РКТРС осткуе1кгг уаарзуПГр р5бед1к5дг 151 а5УУсПплГ ургеакудик ус1па1д5дп5 дезУТеябзк йгтуэТвзг!
201 т15кабуекЬ кууасеУСЬЧ д155рУТкзГ пгдес Последовательность № 4
Фиг. 4
Фиг. 5
- 60 021242
4эи - нм
Фиг. 6 αΟΠΓ лигаид-1 образует связь с растворимым ОПТ лигандом, нанесенным на планшету Е1А, дозозависимым образом αΟΠΓ лиганд-1, нг/мл
Рекомбинантным растворимым ОПГ лигандом покрывают 96 -луночные планшеты Е1А. В лунки вводится αΟΠΓ лиганд-1 разной концентрации и выдерживается в течение 2 ч при комнатной температуре. Связанное антитело обнаруживают с помощью связанного пероксидазой хрена иммуноглобулина 1§О антител козла против человека (ГаЬ'). Поглощение считывается при длине волны 450 нм и 650 нм.
Фиг. 7
- 61 021242 аОПГ лиганд-1 специфически связывается с мембраносвязанным ОПГ лигандом
Средняя интенсивность флуоресценции
ОПГ лиганд .ΤΝΡ альфа ΤΝΡ бета
ТКАН
СО401_
ОПГ лиганд-1, нг/мл аОПГ лиганд-1 специфически связывается с ОПГ лигандом, экспрессированным на поверхности клеток, трансфицированных СНО Κ.ΕΝ 218-9, дозозависимым образом. Это связывание выполняется путем экзогенного введения ОПГ лиганда человека, но не ΤΝΡα, ΤΝΡα, ΤΝΡ1>, ТКА1Б, или Οϋ40 лиганда. аОПГ лиганд-1 (100 нг/мл) предварительно выдерживается с растворимым ОПГ лигандом ли другими лигандами разных концентраций, и затем выдерживается с клетками СНО' ΚΕΝ 218-9, экспрессирующими ОПГ лиганд на поверхности клетки. Затем клетки выдерживаются в течение 30 минут при 2-8 °С с меченым Р1ТС Р(аЬ')2 иммуноглобулином 1§О козла против человека (специфический Рсу фрагмент). После центрифугирования и промывки с помощью цитометрии потока измеряется флюоресценция поверхности клетки.
Фиг. 8
- 62 021242 аОПГ лиганд-1 не связывается с членами семейства ΤΝΡ - ΤΝΡα, ΤΝΡβ, ТКА1Ь, или СО40 лигандом нг/мл 4 ΤΝΡα/αΟΠΓ лиганд-1 а ΤΚΑΙί/αΟΠΓ лиганд-1 * ΤΝΡβ/αΟΠΓ лиганд-1 о С040иаОПГ лиганд-1
Связывание аОПГ лиганда-1 с ОПГ лигандом на планшете Е1А не подавляется при экзогенных добавках ΤΝΡα, ΤΝΡβ, ΤΚΑΙΕ или СО40Е лиганда.
Фиг. 10
- 63 021242
Кривые временных завсимостей средних (± стандартное отклонение) сывороточных концентраций после введения обезьянам Супото)£и$ единичной дозы аОПГ лиганда-1 внутривенно 0,1, 1 и 10,0 мг/кг (п = 2/доза) и подкожно 1,0 мг/кг (п = б/доза) с
оооом |
Ой С 14 28 43 » то «4 »8 112 128
0 юооооо
Время, сут.
Фиг. 13
- 64 021242
Фиг. 14
Средние относительные отклонения (± стандартное отклонение) концентраций в урине Ν-Τχ после введения обезьянам Супото1£и$ единичной дозы аОПГ лиганда-1 внутривенно 0,1,1 и 10,0 мг/кг (п = 2/доза) или подкожно 1,0 мг/кг (п = 6/доза) σ
ГС
Ок
X ф
σ х
о ф
X
Ф
X о
о £ ф 2 5 ° ί ГС
О ф
X х
о.
Фиг. 15
- 65 021242
Временные зависимости положительных (открытые черные символы) и отрицательных (закрытые красные символы) концентраций антител в сыворотке после внутривенного введения единичной дозы αΟΠΓ лиганда-1 обезьянам Супото1£Ц$ при при дозировке 0,1 мг/кг.
Время, сут.
Фиг. 16
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи αΟΠΓ лиганда-1
1 ЕУСИЛЕЗССС 1_УС}РСС51_К.1_ 5САА5СРТР5 5ΥΑΜ5ΜΛ/Κ0Α
41 РСКС1Е№/2С 1ТС5СС5ТУУ АОЗУКСКРТС 5ΚΟΝ5ΚΝΠΥ
81 1_СММ$1.КАЕО ТАУУУСАКОР СТГУ1М5МРО РИСОСПЛТУ
121 25 (Последовательность № 13)
Фиг. 17
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи αΟΠΓ лиганда-1
1 ЕП/1_Т(35РСТ 1.51.5РСЕКАТ 1_5СКА505УК СКУЦЗДУСЮК 41 РСОАРК1_|_1У СА55КАТС1Р ОКР5С5С5СТ йРТ1.Т12К|_Е 81 РЕйРАУРУСО 0УС22РНТРС ОСТКУЕ1К Последовательность № 14
Фиг. 18
- 66 021242
Схема обработки клеточной культуры
| Ампула | Размораживание ампулы с клеточной линией 1259 ▼ Шейкеры, центрифуги ] Размножение клеток I Биореактор, емкостью 20 л 1 Размножение клеток V ! Биореактор, емкостью 150 л 1 Размножение клеток
Биореактор, емкостью 150 л Реактор для продуцирования V Дисковая центрифуга Урожай: удаление клеток из кондиционированной среды Фильтр Осветление продукта центрифугирования
Фильтрация в поперечном потоке: концентрирование кондиционированной среды
Продолжение очистки или хранение с заморозкой до
EA200400063A 2001-06-26 2002-06-25 Антитела к остеопротегерин лиганду (опгл) EA021242B9 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30117201P 2001-06-26 2001-06-26
PCT/US2002/020181 WO2003002713A2 (en) 2001-06-26 2002-06-25 Antibodies to opgl

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200400063A1 EA200400063A1 (ru) 2005-02-24
EA021242B1 true EA021242B1 (ru) 2015-05-29
EA021242B9 EA021242B9 (ru) 2015-11-30

Family

ID=23162250

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200400063A EA021242B9 (ru) 2001-06-26 2002-06-25 Антитела к остеопротегерин лиганду (опгл)

Country Status (33)

Country Link
US (8) US7364736B2 (ru)
EP (5) EP2295081B1 (ru)
JP (13) JP4212470B2 (ru)
KR (2) KR101038585B1 (ru)
CN (2) CN1547486A (ru)
AR (1) AR034637A1 (ru)
AT (1) ATE464068T1 (ru)
AU (2) AU2002320157C1 (ru)
BR (1) BRPI0210579B8 (ru)
CA (1) CA2451955C (ru)
CY (5) CY1110196T1 (ru)
DE (2) DE60235989D1 (ru)
DK (4) DK2270052T3 (ru)
EA (1) EA021242B9 (ru)
ES (5) ES2675735T3 (ru)
FR (1) FR10C0050I2 (ru)
HK (1) HK1187932A1 (ru)
IL (3) IL159512A0 (ru)
LU (1) LU91757I2 (ru)
ME (2) ME00232B (ru)
MX (1) MXPA04000134A (ru)
MY (1) MY143582A (ru)
NO (5) NO345566B1 (ru)
NZ (4) NZ530765A (ru)
PL (1) PL222211B1 (ru)
PT (4) PT1409016E (ru)
RS (1) RS54274B1 (ru)
SG (3) SG10201603108QA (ru)
TR (3) TR201900581T4 (ru)
TW (2) TWI276443B (ru)
WO (1) WO2003002713A2 (ru)
YU (1) YU103003A (ru)
ZA (1) ZA200400521B (ru)

Families Citing this family (200)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL117175A (en) * 1995-02-20 2005-11-20 Sankyo Co Osteoclastogenesis inhibitory factor protein
DE69738841D1 (de) 1996-12-23 2008-08-28 Immunex Corp Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie
KR100496063B1 (ko) 1997-04-15 2005-06-21 산쿄 가부시키가이샤 신규단백질 및 그 제조방법
US6316408B1 (en) 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
DK0975754T4 (en) * 1997-04-16 2016-03-21 Amgen Inc Osteoprotegerin binding proteins and their receptors
EP2009025B1 (en) 1998-05-14 2011-07-27 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
US20030103978A1 (en) * 2000-02-23 2003-06-05 Amgen Inc. Selective binding agents of osteoprotegerin binding protein
US6884598B2 (en) 2000-09-22 2005-04-26 Immunex Corporation Screening assays for agonists and antagonists of receptor activator of NF-κB
CN1854157B (zh) * 2001-01-05 2013-01-02 辉瑞大药厂 胰岛素样生长因子i受体的抗体
JP4212470B2 (ja) * 2001-06-26 2009-01-21 アムジェン フレモント インク． Ｏｐｇｌへの抗体
JP4761710B2 (ja) * 2002-04-05 2011-08-31 アムジェン インコーポレイテッド 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
SI2261230T1 (sl) 2002-09-11 2017-08-31 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Postopek čiščenja proteinov
ATE458006T1 (de) * 2003-05-14 2010-03-15 Kenta Biotech Ag Humaner monoklonaler antikörper spezifisch für lipopolysacchariden (lps) des serotyps iats o6 von pseudomonas aeruginosa
US7318925B2 (en) * 2003-08-08 2008-01-15 Amgen Fremont, Inc. Methods of use for antibodies against parathyroid hormone
EP1659918B1 (en) 2003-08-08 2009-01-14 Amgen Fremont Inc. Antibodies directed to parathyroid hormone (pth) and uses thereof
CA2544146C (en) * 2003-11-05 2012-10-02 Ares Trading S.A. Process for the purification of il-18 binding protein
TWI359026B (en) 2004-02-12 2012-03-01 Sankyo Co Pharmaceutical composition for the osteoclast rela
US7709611B2 (en) 2004-08-04 2010-05-04 Amgen Inc. Antibodies to Dkk-1
US20060115901A1 (en) * 2004-10-22 2006-06-01 Bahram Valamehr Method and media for single cell serum-free culture of CHO cells
TW200714289A (en) * 2005-02-28 2007-04-16 Genentech Inc Treatment of bone disorders
NZ562949A (en) * 2005-04-11 2009-05-31 Medarex Inc Protein purification using HCIC and ion exchange chromatography
EP1909831A4 (en) 2005-06-14 2013-02-20 Amgen Inc PREPARATIONS OF SPONTANEOUS TAMPING PROTEINS
AU2015242973C1 (en) * 2005-06-14 2018-07-05 Amgen Inc. Self-buffering protein formulations
WO2007016562A2 (en) * 2005-07-29 2007-02-08 Amgen Inc. Formulations that inhibit protein aggregation
PE20070684A1 (es) 2005-11-14 2007-08-06 Amgen Inc MOLECULAS QUIMERICAS DE ANTICUERPO RANKL-PTH/PTHrP
US8168181B2 (en) 2006-02-13 2012-05-01 Alethia Biotherapeutics, Inc. Methods of impairing osteoclast differentiation using antibodies that bind siglec-15
DK1994155T4 (da) 2006-02-13 2022-07-25 Daiichi Sankyo Co Ltd Polynukleotid- og polypeptidsekvenser involveret i fremgangsmåden med knogleremodellering
WO2007125605A1 (ja) * 2006-04-28 2007-11-08 Kyoritsu Seiyaku Corporation 動物由来蛋白なしで培養可能な猫の細胞、これを用いたウイルスの生産方法、及びワクチンの生産方法
ES2755386T5 (es) 2006-08-28 2023-04-05 Ares Trading Sa Proceso para la purificación de proteínas que contienen fragmentos Fc
BRPI0809112A2 (pt) * 2007-03-22 2014-08-26 Imclone Llc Formulações estáveis de anticorpos
NZ581097A (en) * 2007-05-24 2012-03-30 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against rank-l and polypeptides comprising the same for the treatment of bone diseases and disorders
CA2696761C (en) 2007-08-21 2017-02-14 Amgen Inc. Human c-fms antigen binding proteins
MX2010002683A (es) * 2007-09-14 2010-03-26 Amgen Inc Poblaciones de anticuerpos homogeneos.
CA2701032C (en) 2007-09-27 2021-01-26 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations
PL2206727T3 (pl) 2007-10-11 2015-08-31 Daiichi Sankyo Co Ltd Przeciwciało skierowane na białko Siglec-15 związane z osteoklastami
WO2009064838A1 (en) 2007-11-15 2009-05-22 Amgen, Inc. Aqueous formulation of erythropoiesis stimulating protein stablised by antioxidants for parenteral administration
US8883146B2 (en) 2007-11-30 2014-11-11 Abbvie Inc. Protein formulations and methods of making same
EP2250251B1 (en) 2008-01-09 2017-11-22 Sartorius Stedim Cellca GmbH Improved culture media additive and process for using it
BRPI0908361A2 (pt) * 2008-02-07 2015-04-07 Amgen Inc Seringas previamente cheias contendo composição e métodos de preparação das mesmas e de estabilização de agente de ligação específico em composição.
AR073072A1 (es) * 2008-08-19 2010-10-13 Regeneron Pharma Anticuerpos humanos para el ligando del activador del receptor de nf-kb (rankl) humano
EP2401298A1 (en) 2009-02-24 2012-01-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
EP2401297A1 (en) * 2009-02-24 2012-01-04 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
WO2010097394A1 (en) 2009-02-24 2010-09-02 Glaxo Group Limited Multivalent and/or multispecific rankl-binding constructs
JP5653909B2 (ja) * 2009-04-09 2015-01-14 第一三共株式会社 抗Ｓｉｇｌｅｃ−１５抗体
US9662271B2 (en) 2009-10-23 2017-05-30 Amgen Inc. Vial adapter and system
AU2011209940B2 (en) 2010-02-01 2015-08-20 Mikrobex Inc. Bacteriotherapy for clostridium difficile colitis
EP2575935B2 (en) 2010-06-07 2023-08-23 Amgen Inc. Drug delivery device
JP5699030B2 (ja) * 2010-07-05 2015-04-08 Ａｘｉｓ株式会社 エタネルセプトを含む線維筋痛症の治療剤
KR20130066682A (ko) 2010-10-05 2013-06-20 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체 표적 파골세포－관련 단백질 ｓｉｇｌｅｃ－１５
ES2911505T3 (es) 2010-10-06 2022-05-19 Inst Catalana Recerca Estudis Avancats Método para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de la metástasis de cáncer de mama
CA2831100C (en) 2011-03-31 2020-02-18 Mark Dominis Holt Vial adapter and system
CA3021845C (en) 2011-04-20 2022-03-29 Amgen Inc. Autoinjector apparatus
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
RU2661677C2 (ru) 2011-05-27 2018-07-18 Аблинкс Нв Ингибирование резорбции кости с помощью связывающих rank-l пептидов
IL301153B2 (en) 2011-10-14 2024-05-01 Amgen Inc Syringe and assembly method
CN104023743B (zh) 2011-10-25 2017-05-03 普罗西纳治疗有限公司 抗体制剂和方法
US9353153B2 (en) 2012-02-09 2016-05-31 Riken Cyclic RNA and protein production method
TW201343672A (zh) 2012-03-30 2013-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Ｃｄｒ經修飾之抗ｓｉｇｌｅｃ－１５抗體
EP2650682A1 (en) 2012-04-09 2013-10-16 Fundació Privada Institut de Recerca Biomèdica Method for the prognosis and treatment of cancer metastasis
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158279A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Protein purification methods to reduce acidic species
WO2013176754A1 (en) 2012-05-24 2013-11-28 Abbvie Inc. Novel purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography
US9695244B2 (en) * 2012-06-01 2017-07-04 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to denosumab
ES2705237T3 (es) 2012-06-06 2019-03-22 Fundacio Inst De Recerca Biomedica Irb Barcelona Método para el diagnóstico y el pronóstico de metástasis del cáncer de pulmón
WO2014012165A1 (en) 2012-07-19 2014-01-23 Alethia Biotherapeutics Inc. Anti-siglec-15 antibodies
WO2014035475A1 (en) 2012-09-02 2014-03-06 Abbvie Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
KR102362829B1 (ko) 2012-09-07 2022-02-15 코히러스 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 아달리무맙의 안정한 수성 제형
ES2744244T3 (es) 2012-10-12 2020-02-24 Inbiomotion Sl Método para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento de metástasis de cáncer de próstata usando c-MAF
US10119171B2 (en) 2012-10-12 2018-11-06 Inbiomotion S.L. Method for the diagnosis, prognosis and treatment of prostate cancer metastasis
EP4234694A3 (en) 2012-11-21 2023-09-06 Amgen Inc. Drug delivery device
EP2948553B1 (en) 2013-01-25 2020-04-01 Baylor College Of Medicine A helper-dependent adenoviral gene therapy delivery and expression system
AU2013381687A1 (en) 2013-03-12 2015-09-24 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human TNF-alpha and methods of preparing the same
US9499614B2 (en) 2013-03-14 2016-11-22 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
WO2014149067A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to ctla4-fc fusion proteins
TWI580452B (zh) 2013-03-15 2017-05-01 安美基公司 用於注射器之匣盒、注射器及使用包括自動注射器及匣盒之設備之方法
CA2906394A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Fundacio Institut De Recerca Biomedica (Irb Barcelona) Method for the prognosis and treatment of cancer metastasis
JP6336564B2 (ja) 2013-03-15 2018-06-06 アムゲン・インコーポレーテッド 薬物カセット、自動注入器、および自動注入器システム
US20160032399A1 (en) 2013-03-15 2016-02-04 Inbiomotion S.L. Method for the Prognosis and Treatment of Renal Cell Carcinoma Metastasis
CN105377327B (zh) 2013-03-22 2021-06-22 安姆根有限公司 注射器及装配方法
US10464996B2 (en) 2013-05-13 2019-11-05 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of neurodegeneration
US9481901B2 (en) 2013-05-30 2016-11-01 Amgen Inc. Methods for increasing mannose content of recombinant proteins
US9782445B2 (en) 2013-06-05 2017-10-10 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture
US10383901B2 (en) 2013-06-05 2019-08-20 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture
US9511100B2 (en) 2013-06-05 2016-12-06 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture
JP6330032B2 (ja) 2013-06-05 2018-05-23 レビオティクス インコーポレイテッドＲｅｂｉｏｔｉｘ，Ｉｎｃ． 微生物叢回復療法組成物を製造、処理、および梱包するための方法
US9694039B2 (en) 2013-06-05 2017-07-04 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture
US9511099B2 (en) 2013-06-05 2016-12-06 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT), compositions and methods of manufacture
WO2015018421A1 (en) 2013-08-07 2015-02-12 Rigshospitalet Copenhagen University Hospital Antibodies, compounds and derivatives thereof for use in the treatment of male infertility
TW201605896A (zh) 2013-08-30 2016-02-16 安美基股份有限公司 Gitr抗原結合蛋白
US20160207988A1 (en) * 2013-09-24 2016-07-21 The Board Of Regents Of The University Of Texas System A novel hormone that promotes bone resorption and uses thereof
US9598667B2 (en) 2013-10-04 2017-03-21 Abbvie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US20170101683A1 (en) 2013-10-09 2017-04-13 Fundació Institut De Recerca Biomèdica (Irb Barcelona) Method for the Prognosis and Treatment of Cancer Metastasis
US20160257754A1 (en) 2013-10-16 2016-09-08 Momenta Pharmaceuticals Inc. Sialylated glycoproteins
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
SG11201602876WA (en) 2013-10-24 2016-05-30 Amgen Inc Injector and method of assembly
EP3060281B1 (en) 2013-10-24 2019-01-30 Amgen Inc. Drug delivery system with temperature-sensitive control
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
WO2015087187A1 (en) 2013-12-10 2015-06-18 Rinat Neuroscience Corp. Anti-sclerostin antibodies
EP3083697B1 (en) * 2013-12-20 2019-04-17 Development Center for Biotechnology Alpha-enolase specific antibodies and methods of uses in cancer therapy
CN103965357B (zh) * 2013-12-31 2016-08-17 嘉和生物药业有限公司 一种抗人rankl抗体
WO2015119906A1 (en) 2014-02-05 2015-08-13 Amgen Inc. Drug delivery system with electromagnetic field generator
HUE048782T2 (hu) 2014-03-10 2020-08-28 Richter Gedeon Nyrt Immunoglobulin tisztítása elõtisztítási lépések alkalmazásával
US10722655B2 (en) 2014-05-07 2020-07-28 Amgen Inc. Autoinjector with shock reducing elements
CN106470716B (zh) 2014-06-03 2020-07-17 安姆根有限公司 可控制药物递送系统和使用方法
ES2709994T3 (es) * 2014-06-04 2019-04-22 Amgen Inc Métodos de recolección en cultivos de células de mamífero
CA2957960C (en) 2014-10-14 2023-08-22 Amgen, Inc. Drug injection device with visual and audible indicators
JP2017538412A (ja) 2014-12-11 2017-12-28 インバイオモーション エセ．エレ． ヒトｃ−ｍａｆに対する結合メンバー
EP3233159B1 (en) 2014-12-19 2020-03-04 Amgen Inc. Drug delivery device with live button or user interface field
ES2898469T3 (es) 2014-12-19 2022-03-07 Amgen Inc Dispositivo de administración de medicamentos con sensor de proximidad
JP6484345B2 (ja) 2015-02-17 2019-03-20 アムジエン・インコーポレーテツド 固定及び／または戻りが真空によって支援された薬物送達装置
US10111928B1 (en) * 2015-02-25 2018-10-30 Saint Louis University Pulsed introduction of low-dose RANKL as a therapy for osteogenesis imperfecta
US10328123B2 (en) 2015-02-25 2019-06-25 Saint Louis University Pulsed introduction of low-dose RANKL as a therapy for atherosclerosis
US10745461B2 (en) 2015-02-25 2020-08-18 Saint Louis University Pulsed introduction of low-dose RANKL as a therapy for diet-induced atherosclerosis
US11806509B2 (en) 2015-02-27 2023-11-07 Amgen Inc. Drug delivery device having a needle guard mechanism with a turnable threshold of resistance to needle guard movement
IL297369B1 (en) 2015-04-29 2024-02-01 Radius Pharmaceuticals Inc RAD for use in a method to treat mutant estrogen receptor positive breast cancer or mutant estrogen receptor positive ovarian cancer
US10828340B2 (en) 2015-06-09 2020-11-10 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture
US10905726B2 (en) 2015-06-09 2021-02-02 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture
US10799539B2 (en) 2015-06-09 2020-10-13 Rebiotix, Inc. Microbiota restoration therapy (MRT) compositions and methods of manufacture
IL281424B2 (en) 2015-06-09 2023-10-01 Rebiotix Inc Microbiota restoration treatment preparations and production methods
HU231463B1 (hu) 2015-08-04 2024-01-28 Richter Gedeon Nyrt. Módszer rekombináns proteinek galaktóz tartalmának növelésére
JP6889149B2 (ja) 2015-08-13 2021-06-18 アムジエン・インコーポレーテツド 抗原結合タンパク質の荷電深層ろ過
WO2017039786A1 (en) 2015-09-02 2017-03-09 Amgen Inc. Syringe assembly adapter for a syringe
US11229702B1 (en) 2015-10-28 2022-01-25 Coherus Biosciences, Inc. High concentration formulations of adalimumab
US11351308B2 (en) 2015-12-09 2022-06-07 Amgen Inc. Auto-injector with signaling cap
US11154661B2 (en) 2016-01-06 2021-10-26 Amgen Inc. Auto-injector with signaling electronics
BR112018068103A2 (pt) 2016-03-08 2019-01-15 Janssen Biotech Inc anticorpos gitr, métodos e usos
EP4035711A1 (en) 2016-03-15 2022-08-03 Amgen Inc. Reducing probability of glass breakage in drug delivery devices
WO2017184880A1 (en) 2016-04-20 2017-10-26 Coherus Biosciences, Inc. A method of filling a container with no headspace
US11541168B2 (en) 2016-04-29 2023-01-03 Amgen Inc. Drug delivery device with messaging label
US11389588B2 (en) 2016-05-02 2022-07-19 Amgen Inc. Syringe adapter and guide for filling an on-body injector
US10988284B2 (en) 2016-05-13 2021-04-27 Amgen Inc. Vial sleeve assembly
EP3458988B1 (en) 2016-05-16 2023-10-18 Amgen Inc. Data encryption in medical devices with limited computational capability
CN117230193A (zh) 2016-05-25 2023-12-15 生物运动有限公司 基于c-maf状态的乳腺癌治疗性治疗
EP3465124A1 (en) 2016-06-03 2019-04-10 Amgen Inc. Impact testing apparatuses and methods for drug delivery devices
EP3478342A1 (en) 2016-07-01 2019-05-08 Amgen Inc. Drug delivery device having minimized risk of component fracture upon impact events
US20190328965A1 (en) 2016-08-17 2019-10-31 Amgen Inc. Drug delivery device with placement detection
US20180110856A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Amgen Inc. Pharmaceutical Formulations and Methods of Making the Same
US20200261643A1 (en) 2016-10-25 2020-08-20 Amgen Inc. On-body injector
KR102322802B1 (ko) 2017-01-05 2021-11-04 래디어스 파마슈티컬스, 인코포레이티드 Rad1901-2hcl의 다형 형태
AU2018210301A1 (en) 2017-01-17 2019-08-01 Amgen Inc. Injection devices and related methods of use and assembly
MX2019009625A (es) 2017-02-17 2019-10-09 Amgen Inc Dispositivo de administracion de farmacos con trayectoria de flujo de fluido esteril y metodo relacionado de ensamblaje.
US11369736B2 (en) 2017-02-17 2022-06-28 Amgen Inc. Cannula insertion and retraction mechanisms
WO2018165143A1 (en) 2017-03-06 2018-09-13 Amgen Inc. Drug delivery device with activation prevention feature
EP3592402A1 (en) 2017-03-07 2020-01-15 Amgen Inc. Needle insertion by overpressure
MX2019010671A (es) 2017-03-09 2019-10-21 Amgen Inc Mecanismo de insercion para dispositivo de administracion de farmacos.
BR112019020053B1 (pt) 2017-03-28 2023-10-10 Amgen Inc Máquina para acoplar uma haste de êmbolo a um conjunto de seringa e método de utilização da referida máquina
JOP20190255A1 (ar) 2017-04-28 2019-10-27 Amgen Inc صيغ أجسام مضادة لـ rankl بشري، وطرق لاستخدامها
JOP20190260A1 (ar) 2017-05-02 2019-10-31 Merck Sharp & Dohme صيغ ثابتة لأجسام مضادة لمستقبل الموت المبرمج 1 (pd-1) وطرق استخدامها
RU2019138507A (ru) 2017-05-02 2021-06-02 Мерк Шарп И Доум Корп. Составы антител против lag3 и совместные составы антител против lag3 и антител против pd-1
AU2018280054B2 (en) 2017-06-08 2023-07-13 Amgen Inc. Syringe assembly for a drug delivery device and method of assembly
US11904143B2 (en) 2017-06-08 2024-02-20 Amgen Inc. Torque driven drug delivery device
CA3063920A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Amgen Inc. Device activation impact/shock reduction
US11395880B2 (en) 2017-06-23 2022-07-26 Amgen Inc. Electronic drug delivery device
MA49562A (fr) 2017-07-14 2020-05-20 Amgen Inc Système d'insertion-rétractation d'aiguille présentant un système à ressort en double torsion
EP3655063A1 (en) 2017-07-21 2020-05-27 Amgen Inc. Gas permeable sealing member for drug container and methods of assembly
EP4085942A1 (en) 2017-07-25 2022-11-09 Amgen Inc. Drug delivery device with gear module and related method of assembly
US11484648B2 (en) 2017-07-25 2022-11-01 Amgen Inc. Drug delivery device with container access system and related method of assembly
MA49838A (fr) 2017-08-09 2020-06-17 Amgen Inc Systèm de administration de médicaments avec pression hydraulique-pneumatique de chambre
EP3668567A1 (en) 2017-08-18 2020-06-24 Amgen Inc. Wearable injector with sterile adhesive patch
US11103636B2 (en) 2017-08-22 2021-08-31 Amgen Inc. Needle insertion mechanism for drug delivery device
MA50611A (fr) 2017-10-04 2020-08-12 Amgen Inc Adaptateur d'écoulement destiné à un dispositif d'administration de médicament
WO2019070552A1 (en) 2017-10-06 2019-04-11 Amgen Inc. DRUG DELIVERY DEVICE COMPRISING A LOCKOUT ASSEMBLY AND ASSOCIATED ASSEMBLY METHOD
US11464903B2 (en) 2017-10-09 2022-10-11 Amgen Inc. Drug delivery device with drive assembly and related method of assembly
EP3703778A1 (en) 2017-11-03 2020-09-09 Amgen Inc. System and approaches for sterilizing a drug delivery device
CA3079197A1 (en) 2017-11-06 2019-05-09 Amgen Inc. Drug delivery device with placement and flow sensing
US20200338271A1 (en) 2017-11-06 2020-10-29 Amgen Inc. Fill-finish assemblies and related methods
CN116832271A (zh) 2017-11-10 2023-10-03 安进公司 用于药物递送装置的柱塞
CN111263651B (zh) 2017-11-16 2022-06-17 安进公司 具有停顿和终点检测的自动注射器
MX2020004996A (es) 2017-11-16 2020-08-27 Amgen Inc Un mecanismo de pestillo de puerta para un dispositivo de administracion de farmacos.
EP3713581A1 (en) 2017-11-22 2020-09-30 Inbiomotion S.L. Therapeutic treatment of breast cancer based on c-maf
US10835685B2 (en) 2018-05-30 2020-11-17 Amgen Inc. Thermal spring release mechanism for a drug delivery device
US11083840B2 (en) 2018-06-01 2021-08-10 Amgen Inc. Modular fluid path assemblies for drug delivery devices
US11643385B2 (en) 2018-07-04 2023-05-09 Radius Pharmaceuticals, Inc. Polymorphic forms of RAD1901-2HCl
WO2020023451A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Delivery devices for administering drugs
US20210260279A1 (en) 2018-07-24 2021-08-26 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with optional grip portion and related method of preparation
MA53379A (fr) 2018-07-24 2021-06-02 Amgen Inc Dispositifs d'administration pour l'administration de médicaments
WO2020023336A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Amgen Inc. Hybrid drug delivery devices with grip portion
US20210228797A1 (en) 2018-07-31 2021-07-29 Amgen Inc. Fluid path assembly for a drug delivery device
AU2019347710A1 (en) 2018-09-24 2021-02-04 Amgen Inc. Interventional dosing systems and methods
CA3110371A1 (en) 2018-09-28 2020-04-02 Amgen Inc. Muscle wire escapement activation assembly for a drug delivery device
MA53815A (fr) 2018-10-02 2022-01-05 Amgen Inc Systèmes d'injection pour administration de médicament avec transmission de force interne
US20210338936A1 (en) 2018-10-05 2021-11-04 Amgen Inc. Drug delivery device having dose indicator
US20200114082A1 (en) 2018-10-15 2020-04-16 Amgen Inc. Drug delivery device having damping mechanism
TW202031306A (zh) 2018-10-15 2020-09-01 美商安進公司 用於藥物遞送裝置之平台組裝方法
WO2020091981A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
TWI831847B (zh) 2018-11-01 2024-02-11 美商安進公司 部分針頭縮回之藥物遞送裝置及其操作方法
WO2020091956A1 (en) 2018-11-01 2020-05-07 Amgen Inc. Drug delivery devices with partial drug delivery member retraction
HUP1800376A2 (hu) 2018-11-07 2020-05-28 Richter Gedeon Nyrt Sejttenyészetben elõállított rekombináns glikoprotein glikozilációs-mintázatának megváltoztatására szolgáló módszer
HU231498B1 (hu) 2019-04-04 2024-05-28 Richter Gedeon Nyrt Immunglobulinok affinitás kromatográfiájának fejlesztése kötést megelõzõ flokkulálás alkalmazásával
AU2020263289A1 (en) 2019-04-24 2021-09-16 Amgen Inc. Syringe sterilization verification assemblies and methods
US20220195059A1 (en) 2019-04-30 2022-06-23 Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes Rank Pathway Inhibitors in Combination with CDK Inhibitors
US20220273887A1 (en) 2019-08-23 2022-09-01 Amgen Inc. Drug delivery device with configurable needle shield engagement components and related methods
WO2021149012A1 (en) 2020-01-24 2021-07-29 Radius Health, Inc. Methods of stimulating bone growth with abalopartide and denosumab
CN113621060B (zh) * 2020-05-07 2023-07-04 浙江瑞硕生物技术有限公司 一种opg抗体对及其应用
EP4341161A1 (en) 2021-05-21 2024-03-27 Amgen Inc. Method of optimizing a filling recipe for a drug container
WO2024064878A1 (en) 2022-09-23 2024-03-28 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and compositions for the treatment of melanoma

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5866152A (en) * 1995-12-13 1999-02-02 Sumitomo Chemical Company, Limited Shampoo composition
US5891438A (en) * 1992-10-30 1999-04-06 The Regents Of The University Of California Method for stimulating production of variable region gene family restricted antibodies through B-cell superantigen vaccination
WO2000037504A2 (en) * 1998-12-23 2000-06-29 Pfizer Inc. Human monoclonal antibodies to ctla-4
US20020015055A1 (en) * 2000-07-18 2002-02-07 Silicon Graphics, Inc. Method and system for presenting three-dimensional computer graphics images using multiple graphics processing units

Family Cites Families (286)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4474893A (en) 1981-07-01 1984-10-02 The University of Texas System Cancer Center Recombinant monoclonal antibodies
DE3374837D1 (en) 1982-02-17 1988-01-21 Ciba Geigy Ag Lipids in the aqueous phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4755465A (en) * 1983-04-25 1988-07-05 Genentech, Inc. Secretion of correctly processed human growth hormone in E. coli and Pseudomonas
US4710457A (en) 1983-06-29 1987-12-01 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Monoclonal antibody for human hematopoietic glycoproteins and method
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
EP0143949B1 (en) 1983-11-01 1988-10-12 TERUMO KABUSHIKI KAISHA trading as TERUMO CORPORATION Pharmaceutical composition containing urokinase
US4740461A (en) 1983-12-27 1988-04-26 Genetics Institute, Inc. Vectors and methods for transformation of eucaryotic cells
US4699880A (en) 1984-09-25 1987-10-13 Immunomedics, Inc. Method of producing monoclonal anti-idiotype antibody
US4760130A (en) 1984-12-06 1988-07-26 Synergen Biologicals, Inc. Serine protease inhibitors and methods for isolation of same
US5900400A (en) 1984-12-06 1999-05-04 Amgen Inc. Serine protease inhibitor analogs
JPS6291197A (ja) 1985-10-17 1987-04-25 Dainippon Pharmaceut Co Ltd 抗ヒトインタ−ロイキン１抗体，その製法及びその使用法
US4959455A (en) 1986-07-14 1990-09-25 Genetics Institute, Inc. Primate hematopoietic growth factors IL-3 and pharmaceutical compositions
US4935343A (en) 1986-08-08 1990-06-19 Syntex (U.S.A.) Inc. Monoclonal antibodies for interleukin-1β
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
ATE87659T1 (de) 1986-09-02 1993-04-15 Enzon Lab Inc Bindungsmolekuele mit einzelpolypeptidkette.
DK590387A (da) 1986-11-13 1988-05-14 Otsuka Pharma Co Ltd Antistoffer mod interleukin-1
US4912040A (en) 1986-11-14 1990-03-27 Genetics Institute, Inc. Eucaryotic expression system
US5359032A (en) 1987-08-26 1994-10-25 Biogen Inc. Interkeukin-1 inhibitor
IL83878A (en) 1987-09-13 1995-07-31 Yeda Res & Dev Soluble protein corresponding to tnf inhibitory protein its preparation and pharmaceutical compositions containing it
IL98078A0 (en) 1991-05-07 1992-06-21 Yeda Res & Dev Pharmaceutical compositions comprising an anticytokyne
US5512544A (en) 1987-09-13 1996-04-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Pharmaceutical compositions comprising an anticytokine
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
WO1989004838A1 (en) 1987-11-25 1989-06-01 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US4968607A (en) 1987-11-25 1990-11-06 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors
US5319071A (en) 1987-11-25 1994-06-07 Immunex Corporation Soluble interleukin-1 receptors
US5846534A (en) 1988-02-12 1998-12-08 British Technology Group Limited Antibodies to the antigen campath-1
US4942184A (en) * 1988-03-07 1990-07-17 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Water soluble, antineoplastic derivatives of taxol
GB8807803D0 (en) 1988-03-31 1988-05-05 Glaxo Group Ltd Biochemical product
US5075222A (en) 1988-05-27 1991-12-24 Synergen, Inc. Interleukin-1 inhibitors
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
US5359037A (en) 1988-09-12 1994-10-25 Yeda Research And Development Co. Ltd. Antibodies to TNF binding protein I
US5811261A (en) 1988-09-12 1998-09-22 Yeda Research And Development Co. Ltd. Expression of the recombinant tumor necrosis factor binding protein I (TBP-I)
IL94039A (en) 1989-08-06 2006-09-05 Yeda Res & Dev Antibodies to tbp - 1 and their use
EP0364778B1 (en) 1988-10-01 1996-03-13 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Antibody against interleukin-1beta
FR2640146B1 (fr) 1988-12-08 1993-12-24 Commissariat A Energie Atomique Anticorps monoclonaux anti-interleukines 1(alpha) et 1(beta), leur procede de production et applications desdits anticorps a la detection des interleukines 1(alpha) et 1(beta) et en therapeutique
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
EP0393438B1 (de) 1989-04-21 2005-02-16 Amgen Inc. TNF-Rezeptor, TNF bindende Proteine und dafür kodierende DNAs
DE3922089A1 (de) 1989-05-09 1990-12-13 Basf Ag Neue proteine und ihre herstellung
IL107267A (en) 1993-10-12 2009-07-20 Yeda Res & Dev Ligand to a member of the tnf/ngf receptor family
ATE119942T1 (de) 1989-05-18 1995-04-15 Yeda Res & Dev Tumor-nekrosefaktor-bindungsprotein ii, seine reinigung und spezifische antikörper.
JP2877509B2 (ja) 1989-05-19 1999-03-31 アムジエン・インコーポレーテツド メタロプロテイナーゼ阻害剤
US5627262A (en) 1989-07-05 1997-05-06 The Board Of Regents Of The University Of Oklahoma Method and composition for the treatment of septic shock
IL95031A (en) 1989-07-18 2007-03-08 Amgen Inc A method of producing a recombinant human necrotic factor absorber
US5395760A (en) 1989-09-05 1995-03-07 Immunex Corporation DNA encoding tumor necrosis factor-α and -β receptors
WO1991003553A1 (en) 1989-09-05 1991-03-21 Immunex Corporation TUMOR NECROSIS FACTOR-α AND -β RECEPTORS
DK0417563T3 (da) 1989-09-12 2000-11-06 Hoffmann La Roche TNF-bindende proteiner
JPH03127800A (ja) 1989-10-13 1991-05-30 Teijin Ltd 腫瘍壊死因子活性抑制物質
EP0502956B1 (en) 1989-11-29 1997-04-23 Amgen Boulder Inc. Production of recombinant human interleukin-1 inhibitor
ATE128184T1 (de) 1989-12-13 1995-10-15 Yeda Res & Dev Expression des rekombinanten tumor-nekrosisfaktor-bindungsproteins i (tbp-i).
US5136021A (en) 1990-02-27 1992-08-04 Health Research, Inc. TNF-inhibitory protein and a method of production
AU649245B2 (en) 1990-04-02 1994-05-19 Amgen, Inc. Methods for treating interleukin-1 mediated diseases
US6552170B1 (en) 1990-04-06 2003-04-22 Amgen Inc. PEGylation reagents and compounds formed therewith
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
WO1991017184A1 (en) 1990-04-27 1991-11-14 The Upjohn Company Modified interleukin-1 inhibitors
DE69131044T2 (de) 1990-05-01 1999-11-18 Chiron Corp Interleukin-i antagonist und seine verwendung
US5872095A (en) 1990-05-01 1999-02-16 Chiron Corporation IL-1 receptor antagonists medicaments
US5350683A (en) 1990-06-05 1994-09-27 Immunex Corporation DNA encoding type II interleukin-1 receptors
GB2246569A (en) 1990-06-15 1992-02-05 Charing Cross Sunley Research Tumour necrosis factor - alpha binding protein
EP0464533B1 (de) 1990-06-28 1998-07-29 Hoechst Aktiengesellschaft Fusionsproteine mit immunglobulinanteilen, ihre Herstellung und Verwendung
WO1992001002A1 (fr) 1990-07-11 1992-01-23 Teijin Limited Inhibiteur de l'activite du facteur de la necrose tumorale et son procede de preparation
CA2088352A1 (en) 1990-08-03 1992-02-04 Klaus M. Esser Tnf inhibitors
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5840496A (en) 1990-10-09 1998-11-24 Chiron Corporation Method for diagnosing endometrial cancer
GB9022648D0 (en) 1990-10-18 1990-11-28 Charing Cross Sunley Research Polypeptide and its use
US5858355A (en) 1990-12-20 1999-01-12 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education IRAP gene as treatment for arthritis
NZ241311A (en) 1991-01-17 1995-03-28 Gen Hospital Corp Rna sequence having trans-splicing activity, plant strains
RU2166955C2 (ru) 1991-01-18 2001-05-20 Эмген Инк. Способ лечения и профилактики заболеваний, обусловленных повышением уровня фактора, вызывающего некроз опухолевых клеток
SG89295A1 (en) 1991-03-15 2002-06-18 Amgen Inc Pegylation of polypeptides
IL99120A0 (en) 1991-08-07 1992-07-15 Yeda Res & Dev Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them
JP3122139B2 (ja) 1991-10-15 2001-01-09 マラーキー，ミッシェル，エフ． 後期段階炎症反応の治療用組成物
US5961974A (en) 1991-10-25 1999-10-05 Immunex Corporation Monoclonal antibodies to CD40 ligand, pharmaceutical composition comprising the same and hybridomas producing the same
ES2038546B1 (es) 1991-11-08 1994-02-16 Andromaco Lab Procedimiento de obtencion de un producto de naturaleza polipeptidica con actividad inhibidora de la hiperproduccion del factor de necrosis tumoral.
JPH05244982A (ja) * 1991-12-06 1993-09-24 Sumitomo Chem Co Ltd 擬人化ｂ−ｂ１０
IL104369A0 (en) 1992-01-13 1993-05-13 Smithkline Beecham Corp Novel compounds and compositions
DK0584347T3 (da) 1992-03-04 2003-02-24 Cell Therapeutics Inc Enantiomere hydroxylerede xanthinforbindelser
WO1993019777A1 (en) 1992-03-30 1993-10-14 Immunex Corporation Fusion proteins comprising tumor necrosis factor receptor
EP0639079B1 (en) 1992-04-30 2000-01-12 Amgen Inc. Methods for treating interleukin-1 and tumor necrosis factor mediated diseases
JPH05312248A (ja) 1992-05-08 1993-11-22 Nissan Motor Co Ltd シフトレバー装置
DE4219626A1 (de) 1992-06-16 1993-12-23 Wehling Peter Priv Doz Dr Med Methode zur Einschleusung therapeutisch relevanter Gene in Körperzellen
JPH0630788A (ja) 1992-07-16 1994-02-08 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ヒトインターロイキン−１に対する組換え抗体
US5545716A (en) 1992-09-08 1996-08-13 University Of Florida Superantigen agonist and antagonist peptides
EP0661992B1 (en) 1992-09-17 2004-01-07 Amgen Inc. Pharmaceutical formulations of interleukin-1 inhibitors
JPH06111399A (ja) 1992-09-30 1994-04-22 Sony Corp 光磁気記録媒体及びその製造方法
US5646154A (en) 1992-10-07 1997-07-08 Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd. Pharmaceutical compositions for inhibiting the formation of tumor necrosis factor
US5866576A (en) 1992-12-16 1999-02-02 Cell Therapeutics, Inc. Epoxide-containing compounds
EP0607776B1 (de) 1993-01-08 1998-12-09 Hoechst Aktiengesellschaft Verwendung von Leflunomid zur Hemmung von Tumornekrosefaktor alpha
PT614984E (pt) 1993-03-05 2001-12-28 Bayer Ag Anticorpos humanos anti-tnf
EP0701563A4 (en) 1993-03-08 1997-07-02 Univ Pittsburgh GENE TRANSFER FOR THE TREATMENT OF CONNECTIVE TISSUES IN A HOST MAMMAL
EP0689449B1 (fr) 1993-03-19 2002-10-30 Vacsyn S.A. Compositions pour l'application en therapeutique humaine, caracterisees par l'association d'un muramyl-peptide a une cytokine
US6326353B1 (en) 1993-03-23 2001-12-04 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Enhanced circulation effector composition and method
US5843905A (en) 1993-06-04 1998-12-01 Vertex Pharmaceuticals, Incorporated Peptidic phosphinyloxymethyl ketones as interleukin-1β-converting enzyme inhibitors
FR2706772A1 (en) 1993-06-22 1994-12-30 Vacsyn Sa Prevention and treatment of septic syndrome with an immunosuppressant, in particular cyclosporin.
US5698579A (en) 1993-07-02 1997-12-16 Celgene Corporation Cyclic amides
WO1995001997A1 (en) 1993-07-09 1995-01-19 Smithkline Beecham Corporation RECOMBINANT AND HUMANIZED IL-1β ANTIBODIES FOR TREATMENT OF IL-1 MEDIATED INFLAMMATORY DISORDERS IN MAN
EP0711282B1 (en) 1993-07-28 2002-06-05 Aventis Pharma Limited Compounds as pde iv and tnf inhibitors
CN1044116C (zh) 1993-11-29 1999-07-14 默里尔药物公司 用作il－1作用抑制剂的苯磺酰亚胺衍生物及其用途
CA2138305A1 (en) 1993-12-28 1995-06-29 Naohito Ohashi Tumor necrosis factor production inhibitors
GB9401460D0 (en) 1994-01-26 1994-03-23 Rhone Poulenc Rorer Ltd Compositions of matter
US5608035A (en) 1994-02-02 1997-03-04 Affymax Technologies N.V. Peptides and compounds that bind to the IL-1 receptor
WO1995022546A1 (en) 1994-02-18 1995-08-24 Cell Therapeutics, Inc. Intracellular signalling mediators
NZ278667A (en) 1994-03-09 2000-12-22 Pfizer Use of isoxazoline derivatives to inhibit TNF production
US5708142A (en) 1994-05-27 1998-01-13 Genentech, Inc. Tumor necrosis factor receptor-associated factors
US5817822A (en) 1994-06-24 1998-10-06 Novartis Corporation Certain alpha-azacycloalkyl substituted arylsulfonamido acetohydroxamic acids
IL114417A0 (en) 1994-07-07 1995-10-31 Res Dev Foundation Tumor necrosis factor receptor-I associated proteins and protein kinase and methods for their use
US5877180A (en) 1994-07-11 1999-03-02 University Of Virginia Patent Foundation Method for treating inflammatory diseases with A2a adenosine receptor agonists
EP0692536B1 (en) 1994-07-14 2000-11-22 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo IFN-Y production inducing protein and monoclonal antibody of the same
US5641747A (en) 1994-07-25 1997-06-24 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Treatment of osteopetrotic diseases
US5633227A (en) 1994-09-12 1997-05-27 Miles, Inc. Secretory leukocyte protease inhibitor as an inhibitor of tryptase
IT1269989B (it) 1994-09-21 1997-04-16 Dompe Spa Antagonisti recettoriali di il-1 ad aumentata attivita' inibitoria
HUT77282A (hu) 1994-10-05 1998-03-30 Darwin Discovery Limited Peptidvegyületek és gyógyászati alkalmazásuk metalloproteáz inhibitorokként
US5852173A (en) 1994-10-19 1998-12-22 Genetics Institute, Inc. TNF receptor death ligand proteins and inhibitors of ligand binding
TW581771B (en) 1994-11-15 2004-04-01 Hayashibara Biochem Lab Recombinant production of a polypeptide for inducing interferon-gamma production, and monoclonal antibody against the polypeptide
JPH10511398A (ja) 1994-12-23 1998-11-04 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション ４，４−（二置換）シクロヘキサン−１−カルボキシレート単量体および関連する化合物
ZA9510826B (en) 1994-12-23 1996-06-20 Smithkline Beecham Corp 3,3-(disubstituted)cyclohexan-1-ol monomers and related compounds
US6323201B1 (en) 1994-12-29 2001-11-27 The Regents Of The University Of California Compounds for inhibition of ceramide-mediated signal transduction
US6429221B1 (en) 1994-12-30 2002-08-06 Celgene Corporation Substituted imides
EP0802793A1 (en) 1995-01-09 1997-10-29 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Use of carbostyril compounds for inhibition of tnf-alpha
PE64396A1 (es) 1995-01-23 1997-01-28 Hoffmann La Roche Proteina accesoria del receptor de la interleucina 1
ATE191615T1 (de) 1995-02-23 2000-04-15 Novartis Nutrition Ag Aminosäurenzusammensetzungen und verwendung derselben klinischen nährung
WO1996028546A1 (en) 1995-03-15 1996-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor
EP0737471A3 (fr) 1995-04-10 2000-12-06 L'oreal Utilisation d'un sel d'une métal alcalino-terreux comme inhibiteur de TNF-alpha dans une composition unique et composition obtenue
DE69519751T2 (de) 1995-04-20 2001-04-19 Pfizer Arylsulfonamido-substituierte hydroxamsäure derivate als inhibitoren von mmp und tnf
AU706064B2 (en) 1995-05-10 1999-06-10 Darwin Discovery Limited Peptide compounds which inhibit metalloproteinase and TNF liberation, and their therapeutic use
AR004471A1 (es) 1995-05-31 1998-12-16 Smithkline Beecham Corp Compuestos de ciclohexan-1-ol-4,4-disustituidos, utiles en el tratamiento de enfermedades alergicas e inflamatorias y composiciones farmaceuticas que lascontienen
US5817476A (en) 1995-06-07 1998-10-06 Genetics Institute, Inc. Polynucleotides encoding interleukin-1 receptor intracellular ligand proteins
US5843901A (en) 1995-06-07 1998-12-01 Advanced Research & Technology Institute LHRH antagonist peptides
US5739143A (en) 1995-06-07 1998-04-14 Smithkline Beecham Corporation Imidazole compounds and compositions
US5830742A (en) 1995-06-08 1998-11-03 Immunex Corporation TNF-α converting enzyme
DK0835305T3 (da) 1995-06-29 2006-02-13 Immunex Corp Cytokin som inducerer apoptose
US6127977A (en) 1996-11-08 2000-10-03 Cohen; Nathan Microstrip patch antenna with fractal structure
ZA966663B (en) 1995-08-17 1998-02-06 Genentech Inc Traf Inhibitors.
US5728844A (en) 1995-08-29 1998-03-17 Celgene Corporation Immunotherapeutic agents
WO1997008174A1 (en) 1995-08-31 1997-03-06 Smithkline Beecham Corporation Interleukin converting enzyme and apoptosis
IL115245A (en) 1995-09-11 2002-12-01 Yissum Res Dev Co Tumor necrosis factor inhibiting pharmaceuticals
WO1997012244A1 (en) 1995-09-27 1997-04-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for determining t-cell profiles of immunocompromised subjects
IL123430A (en) 1995-10-05 2001-04-30 Darwin Discovery Ltd Theo-converted peptides as inhibitors for metallic proteinases and TNF release
DE19540475A1 (de) 1995-10-20 1997-04-24 Schering Ag Chirale Methylphenyloxazolidinone
US6281352B1 (en) 1995-11-14 2001-08-28 Dupont Pharmaceuticals Company Macrocyclic compounds as metalloprotease inhibitors
EP0863885A2 (en) 1995-11-14 1998-09-16 The Du Pont Merck Pharmaceutical Company Novel macrocyclic compounds as metalloprotease inhibitors
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5869315A (en) 1995-12-18 1999-02-09 Basf Aktiengesellschaft Modified interleukin-1β converting enzyme with increased stability
US5990119A (en) 1995-12-21 1999-11-23 Smithkline Beecham Corporation 1,4,4-(trisubstituted)cyclohexane monomers and related compounds
US5869677A (en) 1995-12-21 1999-02-09 Smithkline Beecham Corporation 3,3-(disubstituted)cyclohexan-1-carboxylate monomers and related compounds
US5891883A (en) 1995-12-21 1999-04-06 Smithkline Beecham Corporation 4,4-(disubstituted)cyclohexan-1-ols monomers and related compounds
US6369027B1 (en) 1995-12-22 2002-04-09 Amgen Inc. Osteoprotegerin
US6613544B1 (en) * 1995-12-22 2003-09-02 Amgen Inc. Osteoprotegerin
CA2238885A1 (en) 1995-12-29 1997-07-10 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Nucleic acids encoding interferon gamma inducing factor-2
US6046048A (en) 1996-01-09 2000-04-04 Genetech, Inc. Apo-2 ligand
BR9707325A (pt) 1996-02-09 1999-04-13 Amgen Inc Processo para o tratamento de um paciente afetado com uma doença mediada por il-1, composição farmacéutica e uso da mesma
BRPI9715219B8 (pt) 1996-02-09 2015-07-07 Abbvie Biotechnology Ltd Vetor recombinante de expressão, e célula hospedeira procariótica.
US5994351A (en) 1998-07-27 1999-11-30 Pfizer Inc. Arylsulfonylamino hydroxamic acid derivatives
US5981220A (en) 1996-03-27 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Epidermal differentiation factor
GB9607119D0 (en) 1996-04-04 1996-06-12 Chiroscience Ltd Compounds
GB9607120D0 (en) 1996-04-04 1996-06-12 Chiroscience Ltd Compounds
GB9607249D0 (en) 1996-04-04 1996-06-12 Chiroscience Ltd Compounds
US5710013A (en) 1996-04-19 1998-01-20 Tularik Inc. Tumor necrosis factor receptor associated factor 6 (TRAF6)
GB9609795D0 (en) 1996-05-10 1996-07-17 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
AUPO048296A0 (en) 1996-06-14 1996-07-11 Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. New compound and its preparation
EP0816499A3 (en) 1996-06-27 1999-10-27 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Genomic DNA encoding a polypeptide capable of inducing the production of interferon-gamma
DE69700616T2 (de) 1996-07-02 2000-03-16 Nisshin Flour Milling Co Imid derivate
TW555765B (en) 1996-07-09 2003-10-01 Amgen Inc Low molecular weight soluble tumor necrosis factor type-I and type-II proteins
JPH10130149A (ja) 1996-07-12 1998-05-19 Sankyo Co Ltd Ｔｎｆ産生抑制剤
US5853977A (en) 1996-07-12 1998-12-29 Schering Corporation Mammalian TNF-α convertases
US5877222A (en) 1996-07-19 1999-03-02 The Regents Of The University Of California Method for treating aids-associated dementia
GB9616643D0 (en) 1996-08-08 1996-09-25 Chiroscience Ltd Compounds
WO1998006692A1 (en) 1996-08-12 1998-02-19 Celgene Corporation Novel immunotherapeutic agents and their use in the reduction of cytokine levels
US6069132A (en) 1996-08-14 2000-05-30 Revanker; Ganapathi R. Phosphazole compounds
US5935977A (en) 1996-09-25 1999-08-10 Ss Pharmaceutical Co., Ltd. Substituted vinyl pyridine derivative and drugs containing the same
US5962481A (en) 1996-10-16 1999-10-05 American Cyanamid Company Preparation and use of ortho-sulfonamido heteroaryl hydroxamic acids as matrix metalloproteinase and tace inhibitors
GB9621859D0 (en) 1996-10-21 1996-12-11 Xenova Ltd Cytokine production inhibitors
GB9712761D0 (en) 1997-06-17 1997-08-20 Chiroscience Ltd Quinolines and their therapeutic use
JPH10147531A (ja) 1996-11-19 1998-06-02 Otsuka Pharmaceut Co Ltd ＴＮＦ−α産生抑制剤
WO1998021957A1 (en) 1996-11-20 1998-05-28 Merck & Co., Inc. Triaryl substituted imidazoles, compositions containing such compounds and methods of use
US5955480A (en) 1996-11-20 1999-09-21 Merck & Co., Inc. Triaryl substituted imidazoles, compositions containing such compounds and methods of use
US5834435A (en) 1996-11-27 1998-11-10 Slesarev; Vladimir I. Inhibition of TNF-α pleiotropic and cytotoxic effects
ATE387495T1 (de) 1996-12-03 2008-03-15 Amgen Fremont Inc Vollkommen humane antikörper die egfr binden
EP0942740B1 (en) 1996-12-06 2003-08-27 Amgen Inc., Combination therapy using a tnf binding protein for treating tnf-mediated diseases
DE19652227A1 (de) 1996-12-16 1998-06-18 Bosch Gmbh Robert Verfahren und Vorrichtung zum Zuordnen einer Fernbedienung zu einer Basisstation
JPH10231285A (ja) 1996-12-17 1998-09-02 Ishihara Sangyo Kaisha Ltd フタルイミド誘導体又はその塩、それらの製造方法及びそれらを含有する医薬組成物
US6271349B1 (en) 1996-12-23 2001-08-07 Immunex Corporation Receptor activator of NF-κB
DE69738841D1 (de) 1996-12-23 2008-08-28 Immunex Corp Ligand für rezeptor aktivator of nf-kappa b, ligand ist mitglied der tnf superfamilie
US7141393B2 (en) 1996-12-26 2006-11-28 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Interleukin-18-receptor proteins
PT853083E (pt) 1997-01-06 2001-12-28 Pfizer Composto de piridilfurano e piridiltiofeno e sua utilizacao farmaceutica
ZA9818B (en) 1997-01-07 1998-07-02 Abbott Lab C-terminal ketone inhibitors of matrix metalloproteinases and tnf alpha secretion
US5952320A (en) 1997-01-07 1999-09-14 Abbott Laboratories Macrocyclic inhibitors of matrix metalloproteinases and TNFα secretion
US6054559A (en) 1997-01-28 2000-04-25 Smithkline Beecham Corporation Interleukin-1 receptor antagonist beta (IL-1raβ)
CA2279186C (en) 1997-01-29 2004-02-24 Pfizer Inc. Sulfonyl urea derivatives and their use in the control of interleukin-1 activity
JP3955352B2 (ja) * 1997-02-25 2007-08-08 株式会社林原生物化学研究所 破骨細胞形成阻害剤
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
WO1998039316A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Monsanto Company N-hydroxy 4-sulfonyl butanamide compounds
DE69819878T2 (de) 1997-03-04 2004-04-22 Monsanto Co. Divalente sulfonyl-aryl-oder heteroaryl hydroxamsäureverbindungen
US6638952B1 (en) 1997-03-04 2003-10-28 Pharmacia Corporation Aromatic sulfonyl alpha-cycloamino hydroxamic acid compounds
WO1998039326A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Monsanto Company Aromatic sulfonyl alpha-hydroxy hydroxamic acid compounds
ATE283848T1 (de) 1997-03-04 2004-12-15 Pharmacia Corp Thiarylsulfonamid-hydroxamsäurederivate
US6087116A (en) 1997-03-12 2000-07-11 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Interleukin-18 (IL-18) receptor polypeptides and their uses
US6054487A (en) 1997-03-18 2000-04-25 Basf Aktiengesellschaft Methods and compositions for modulating responsiveness to corticosteroids
JPH10259140A (ja) 1997-03-18 1998-09-29 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd 腫瘍壊死因子産生抑制剤
CN1269722A (zh) 1997-03-18 2000-10-11 Basf公司 调节对皮质类固醇反应的方法及组合物
AU6769298A (en) 1997-03-21 1998-10-20 Cistron Biotechnology, Inc. Method for inhibiting cleavage of precursor il-1beta
GB9706255D0 (en) 1997-03-26 1997-05-14 Smithkline Beecham Plc Novel compounds
WO1998043946A1 (en) 1997-03-28 1998-10-08 Zeneca Limited Process for the preparation of n-(3-hydroxy-succinyl)-amino acid derivatives
EP0971895A1 (en) 1997-03-28 2000-01-19 AstraZeneca AB Hydroxamic acids substituted by heterocycles useful for inhibition of tumor necrosis factor
YU49899A (sh) 1997-04-04 2002-09-19 Pfizer Products Inc. Nikotinamidni derivati
CN1262625A (zh) 1997-04-10 2000-08-09 阿吉尼克斯股份有限公司 乳铁蛋白在治疗过敏原诱发疾病中的应用
KR100496063B1 (ko) 1997-04-15 2005-06-21 산쿄 가부시키가이샤 신규단백질 및 그 제조방법
US5843678A (en) 1997-04-16 1998-12-01 Amgen Inc. Osteoprotegerin binding proteins
DK0975754T4 (en) * 1997-04-16 2016-03-21 Amgen Inc Osteoprotegerin binding proteins and their receptors
US6316408B1 (en) * 1997-04-16 2001-11-13 Amgen Inc. Methods of use for osetoprotegerin binding protein receptors
FR2762315B1 (fr) 1997-04-22 1999-05-28 Logeais Labor Jacques Derives d'amino-acides inhibiteurs des metalloproteases de la matrice extracellulaire et de la liberation du tnf alpha
AU7138298A (en) 1997-04-24 1998-11-13 Ortho-Mcneil Corporation, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
FR2762514B1 (fr) 1997-04-29 1999-10-22 Sanofi Sa Utilisation de derives de la tetrahydropyridine pour la preparation de medicaments pour le traitement des maladies entrainant une demyelinisation
JP3776203B2 (ja) 1997-05-13 2006-05-17 第一製薬株式会社 Ｉｃａｍ−１産生阻害剤
EP0983260A2 (en) 1997-05-22 2000-03-08 G.D. Searle & Co. 3(5)-HETEROARYL SUBSTITUTED PYRAZOLES AS p38 KINASE INHIBITORS
US6265535B1 (en) 1997-05-30 2001-07-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Peptides and peptide analogues designed from binding sites of tumor necrosis factor receptor superfamily and their uses
JPH111481A (ja) 1997-06-10 1999-01-06 Sumitomo Pharmaceut Co Ltd ピペリジニルフタラジン誘導体
JP4380803B2 (ja) 1997-06-12 2009-12-09 アベンテイス・フアルマ・リミテツド イミダゾリル−環式アセタール
KR19990001101A (ko) 1997-06-12 1999-01-15 손경식 캐테콜 아미노산 유도체, 이의 제조방법 및 그를 함유한 약제 조성물
AU7966198A (en) 1997-06-13 1998-12-30 Smithkline Beecham Corporation Novel pyrazole and pyrazoline substituted compounds
GB9713732D0 (en) 1997-06-27 1997-09-03 Pharmacia & Upjohn Spa Substituted triazinic compounds
GB9713733D0 (en) 1997-06-27 1997-09-03 Pharmacia & Upjohn Spa Poly-branched polycarboxamido compounds
KR20010014288A (ko) 1997-06-30 2001-02-26 오르토-맥네일 파마슈티칼, 인코퍼레이티드 염증성 질환의 치료에 유용한 2-치환된 이미다졸
US6235787B1 (en) 1997-06-30 2001-05-22 Hoffmann-La Roche Inc. Hydrazine derivatives
GB9713726D0 (en) 1997-06-30 1997-09-03 Ciba Geigy Ag Organic compounds
US5843721A (en) 1997-07-03 1998-12-01 Tularik Inc. Nucleic acids encoding human NIK protein
WO1999001139A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 Thomas Jefferson University An improved method for design and selection of efficacious antisense oligonucleotides
AU8858398A (en) 1997-07-10 1999-02-08 Pharmacia & Upjohn S.P.A. Matrix metalloproteinase inhibitors
DE19731521A1 (de) 1997-07-23 1999-01-28 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Budipin bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen des Nervensystems
FR2766822B1 (fr) 1997-07-30 2001-02-23 Adir Nouveaux derives de benzimidazole, de benzoxazole et de benzothiazole, leur procede de preparation et les compositions pharmaceutiques qui les contiennent
AR016551A1 (es) 1997-07-30 2001-07-25 Smithkline Beecham Corp Derivados de 2-oxindol, composiciones farmaceuticas que los comprenden y el uso de los mismos para la manufactura de medicamentos
KR100716475B1 (ko) 1997-07-31 2007-05-10 셀진 코오퍼레이션 치환된 알카노하이드록삼산 및 ＴＮＦα 농도 감소화 방법
JP2003524572A (ja) 1997-08-04 2003-08-19 アムジエン・インコーポレーテツド ヒドロキサム酸置換縮合複素環メタロプロテイナーゼ阻害剤
WO1999006426A1 (en) 1997-08-04 1999-02-11 Millennium Biotherapeutics, Inc. Novel molecules of the tango-77 related protein family and uses thereof
CN1158281C (zh) 1997-08-06 2004-07-21 第一三得利制药株式会社 作为iv型磷酸二酯酶抑制剂的1-芳基-1,8-二氮杂萘-4-酮衍生物
WO1999007679A1 (en) 1997-08-08 1999-02-18 Chiroscience Limited Peptidyl compounds having mmp and tnf inhibitory activity
ATE217863T1 (de) 1997-08-08 2002-06-15 Pfizer Prod Inc Arylsulfonylaminohydroxamsäurederivate
IL121860A0 (en) 1997-08-14 1998-02-22 Yeda Res & Dev Interleukin-18 binding proteins their preparation and use
US5994396A (en) 1997-08-18 1999-11-30 Centaur Pharmaceuticals, Inc. Furansulfonic acid derivatives and pharmaceutical compositions containing the same
EP1007038A2 (en) 1997-08-21 2000-06-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Anti-inflammatory agent
CA2308438A1 (en) 1997-11-03 1999-05-14 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Method and compositions for inhibiting angiogenesis and treating cancer
US5955476A (en) 1997-11-18 1999-09-21 Celgene Corporation Substituted 2-(2,6-dioxo-3-fluoropiperidin-3-yl)-isoindolines and method of reducing inflammatory cytokine levels
WO1999029865A2 (en) 1997-12-12 1999-06-17 The Rockefeller University A protein belonging to the tnf superfamily, nucleic acids encoding same, and methods of use thereof
AU742768B2 (en) 1998-01-16 2002-01-10 Renovis, Inc. Thioether furan nitrone compounds
DK1049703T3 (da) 1998-01-20 2003-06-02 Abbott Gmbh & Co Kg N-[2-(5-benzyloxycarbonyl-amino-6-oxo-2--(4-fluorphenyl)-1,6-dihydro-1-pyrimidinyl)acetoxyl]-L-asparaginsyrealdehyd som en in vivo inhibitor af interleukin-1beta konverterende enzym
ATE301195T1 (de) 1998-01-23 2005-08-15 Immunex Corp Acpl dna und polypeptide
NZ505880A (en) 1998-01-23 2003-06-30 Immunex Corp IL-18 receptor polypeptides
CN1293663A (zh) 1998-01-27 2001-05-02 美国氰胺公司 为基质金属蛋白酶抑制剂的2,3,4,5－四氢－1h－[1,4]苯并二氮杂䓬－3－异羟肟酸
CA2318743A1 (en) 1998-01-27 1999-07-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Novel molecules of the tnf receptor superfamily and uses therefor
ATE296812T1 (de) 1998-03-09 2005-06-15 Vertex Pharma 1,2-diazepanderivate als inhibitoren des interleukin-1beta umwandelnden enzyms
AU755273B2 (en) 1998-03-16 2002-12-05 Cytovia, Inc. Dipeptide caspase inhibitors and the use thereof
IL126024A0 (en) 1998-03-19 1999-05-09 Yeda Res & Dev Modulators of the function of receptors of the tnf/ngf receptor family and other proteins
EP1064298B1 (en) 1998-03-19 2008-10-08 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Inhibitors of caspases
ATE317691T1 (de) 1998-03-20 2006-03-15 Daiichi Asubio Pharma Co Ltd Benzochinonderivate enthaltende hemmer von nf-kb
WO1999050238A1 (fr) 1998-03-26 1999-10-07 Santen Pharmaceutical Co., Ltd. Nouveaux derives d'uree
EP2009025B1 (en) 1998-05-14 2011-07-27 Immunex Corporation Method of inhibiting osteoclast activity
CA2276216A1 (en) 1998-06-24 1999-12-24 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo An artificial peptide capable of neutralizing the biological activity of interleukin-18
US6210924B1 (en) 1998-08-11 2001-04-03 Amgen Inc. Overexpressing cyclin D 1 in a eukaryotic cell line
CA2340579A1 (en) 1998-09-01 2000-03-09 Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo Interleukin 18-binding protein
AU754971B2 (en) 1998-09-15 2002-11-28 Pharmexa A/S Method for down-regulating osteoprotegerin ligand activity
US6660843B1 (en) * 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
KR20010101987A (ko) 1999-02-03 2001-11-15 스티븐 엠. 오드레 면역 반응과 관련된 신규한 폴리펩티드
WO2000047740A2 (en) 1999-02-12 2000-08-17 Amgen Inc. Tnf-related proteins
AUPQ314799A0 (en) 1999-09-29 1999-10-21 University Of Western Australia, The Bone cell factor
JP2004500063A (ja) 1999-12-16 2004-01-08 アムジェン　インコーポレイテッド Ｔｎｆｒ／ｏｐｇ様分子およびその使用
MXPA02008144A (es) † 2000-02-23 2002-11-29 Amgen Inc Agentes de enlace selectivos antagonistas de la proteina de enlace de osteoprotegerina.
CA2407956A1 (en) 2000-05-03 2001-11-08 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7102050B1 (en) 2000-05-04 2006-09-05 Exxonmobil Chemical Patents Inc. Multiple riser reactor
JP2003534022A (ja) * 2000-05-26 2003-11-18 スミスクライン・ビーチャム・コーポレイション Ｒａｎｋリガンド介在障害の治療に有用な抗−ｒａｎｋリガンドモノクローナル抗体
DE10039710B4 (de) 2000-08-14 2017-06-22 United Monolithic Semiconductors Gmbh Verfahren zur Herstellung passiver Bauelemente auf einem Halbleitersubstrat
AU2001286586A1 (en) * 2000-08-18 2002-03-04 University Of Massachusetts Medical Center Trance regulation of chondrocyte differentiation
WO2002015846A2 (en) 2000-08-21 2002-02-28 Smithkline Beecham Corporation Anti-rank ligand monoclonal antibodies useful in treatment of rank ligand mediated disorders
CN1854157B (zh) * 2001-01-05 2013-01-02 辉瑞大药厂 胰岛素样生长因子i受体的抗体
ES2212930T1 (es) 2001-05-17 2004-08-16 Immunex Corporation Uso terapeutico de antagonistas de rank.
CA2449658A1 (en) 2001-06-06 2002-12-12 Immunex Corporation Use of rank antagonists to treat cancer
JP4212470B2 (ja) 2001-06-26 2009-01-21 アムジェン フレモント インク． Ｏｐｇｌへの抗体
JP4761710B2 (ja) † 2002-04-05 2011-08-31 アムジェン インコーポレイテッド 選択的ｏｐｇｌ経路インヒビターとしてのヒト抗ｏｐｇｌ中和抗体
JP5782185B2 (ja) 2012-06-01 2015-09-24 日本電信電話株式会社 パケット転送処理方法およびパケット転送処理装置
US9300829B2 (en) 2014-04-04 2016-03-29 Canon Kabushiki Kaisha Image reading apparatus and correction method thereof

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5891438A (en) * 1992-10-30 1999-04-06 The Regents Of The University Of California Method for stimulating production of variable region gene family restricted antibodies through B-cell superantigen vaccination
US5866152A (en) * 1995-12-13 1999-02-02 Sumitomo Chemical Company, Limited Shampoo composition
WO2000037504A2 (en) * 1998-12-23 2000-06-29 Pfizer Inc. Human monoclonal antibodies to ctla-4
US20020015055A1 (en) * 2000-07-18 2002-02-07 Silicon Graphics, Inc. Method and system for presenting three-dimensional computer graphics images using multiple graphics processing units

Also Published As

Publication number Publication date
US20140134157A1 (en) 2014-05-15
ES2675735T3 (es) 2018-07-12
ME00232B (me) 2011-02-10
NZ616594A (en) 2015-06-26
BRPI0210579B1 (pt) 2019-05-14
JP2015078205A (ja) 2015-04-23
NO2019048I1 (no) 2019-12-20
US20200131271A1 (en) 2020-04-30
EP3492100A1 (en) 2019-06-05
RS20120347A2 (en) 2013-04-30
CY2010016I1 (el) 2012-01-25
KR20040023630A (ko) 2004-03-18
JP2009022280A (ja) 2009-02-05
PT2295081T (pt) 2019-02-01
YU103003A (sh) 2006-05-25
CA2451955A1 (en) 2003-01-09
JP5065529B2 (ja) 2012-11-07
JP2015057408A (ja) 2015-03-26
TR201900581T4 (tr) 2019-02-21
PT2270052T (pt) 2018-07-04
EP1409016A4 (en) 2005-11-09
CA2451955C (en) 2015-09-29
ES2706902T3 (es) 2019-04-01
JP4212470B2 (ja) 2009-01-21
DK2087908T3 (en) 2018-07-23
DK1409016T4 (da) 2020-09-14
US7364736B2 (en) 2008-04-29
NZ581637A (en) 2012-05-25
DE60235989D1 (de) 2010-05-27
JP2005506963A (ja) 2005-03-10
EP2087908B1 (en) 2018-05-30
JP2022000424A (ja) 2022-01-04
DK2270052T3 (en) 2018-07-02
DK2295081T3 (en) 2019-02-18
US20120087923A1 (en) 2012-04-12
DE122010000047I1 (de) 2011-05-05
EP2270052A2 (en) 2011-01-05
MY143582A (en) 2011-05-31
WO2003002713A2 (en) 2003-01-09
IL235116A0 (en) 2014-11-30
LU91757I2 (fr) 2011-01-24
JP4927910B2 (ja) 2012-05-09
EA200400063A1 (ru) 2005-02-24
JP2018154614A (ja) 2018-10-04
PT2087908T (pt) 2018-07-16
RS20120347A3 (en) 2013-10-31
PL371915A1 (en) 2005-07-11
EP1409016B1 (en) 2010-04-14
MXPA04000134A (es) 2005-06-06
ZA200400521B (en) 2005-07-27
RS54274B1 (en) 2016-02-29
TWI276443B (en) 2007-03-21
HK1187932A1 (en) 2014-04-17
IL159512A (en) 2014-12-31
JP4358282B2 (ja) 2009-11-04
NO20190456A1 (no) 2004-03-10
US20200354464A1 (en) 2020-11-12
JP2019214563A (ja) 2019-12-19
TR201809008T4 (tr) 2018-07-23
NZ530765A (en) 2006-11-30
ES2674888T3 (es) 2018-07-04
EP1409016B2 (en) 2020-07-15
CN103232539B (zh) 2015-06-03
PT1409016E (pt) 2010-06-11
FR10C0050I1 (ru) 2011-01-14
CY2010016I2 (el) 2012-01-25
TR201809678T4 (tr) 2018-07-23
TWI326285B (en) 2010-06-21
JP2012153701A (ja) 2012-08-16
EP2270052B1 (en) 2018-03-28
JP2009273466A (ja) 2009-11-26
MEP32608A (en) 2011-02-10
NO20041018L (no) 2004-03-10
BR0210579A (pt) 2005-05-10
JP2016216464A (ja) 2016-12-22
EP2295081B1 (en) 2018-10-31
JP2020073518A (ja) 2020-05-14
JP5576903B2 (ja) 2014-08-20
AU2008261137A1 (en) 2009-01-15
JP2012140430A (ja) 2012-07-26
ES2342820T5 (es) 2021-04-14
AU2008261137C1 (en) 2023-08-31
NZ547695A (en) 2008-09-26
CN1547486A (zh) 2004-11-17
NO345566B1 (no) 2021-04-19
EP1409016B9 (en) 2020-10-28
PL222211B1 (pl) 2016-07-29
AR034637A1 (es) 2004-03-03
EA021242B9 (ru) 2015-11-30
US8409578B2 (en) 2013-04-02
EP3492100B1 (en) 2021-12-08
US20090274688A1 (en) 2009-11-05
NO343687B1 (no) 2019-05-06
CN103232539A (zh) 2013-08-07
DK1409016T3 (da) 2010-06-21
ATE464068T1 (de) 2010-04-15
NO344842B1 (no) 2020-05-25
TW200630107A (en) 2006-09-01
ES2907826T3 (es) 2022-04-26
LU91757I9 (ru) 2019-01-03
FR10C0050I2 (fr) 2011-12-30
CY1110196T1 (el) 2012-01-25
EP2295081A1 (en) 2011-03-16
SG173211A1 (en) 2011-08-29
NO2019039I1 (no) 2019-11-05
SG2011076551A (en) 2015-08-28
JP2012229236A (ja) 2012-11-22
KR20100041797A (ko) 2010-04-22
WO2003002713A3 (en) 2003-08-14
EP2087908A1 (en) 2009-08-12
CY1121151T1 (el) 2020-05-29
ES2342820T3 (es) 2010-07-15
US20040033535A1 (en) 2004-02-19
CY1120658T1 (el) 2019-12-11
US20170183417A1 (en) 2017-06-29
AU2002320157C1 (en) 2023-09-21
IL159512A0 (en) 2004-06-01
SG10201603108QA (en) 2016-05-30
AU2008261137B2 (en) 2012-10-04
AU2002320157B2 (en) 2008-10-16
US8058418B2 (en) 2011-11-15
NO20200535A1 (no) 2004-03-10
US20150266952A1 (en) 2015-09-24
EP2270052A3 (en) 2011-03-02
EP1409016A2 (en) 2004-04-21
EP2270052B8 (en) 2018-05-02
BRPI0210579B8 (pt) 2021-05-25
KR101038585B1 (ko) 2011-06-03
CY1120656T1 (el) 2019-12-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA021242B1 (ru) Антитела к остеопротегерин лиганду (опгл)
AU2002320157A1 (en) Antibodies to OPGL
AU2018202668A1 (en) Antibodies to OPGL
AU2012216429A1 (en) Antibodies to OPGL

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KG TJ TM

ND4A Extension of term of a eurasian patent