KR101038585B1 - Ｏｐｇｌ 에 결합하는 항체, 이의 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)와 상호작용하는 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 OPGL 에 결합하는 항체의 약학적 유효량을 투여함으로써 골감소증 장애를 치료하는 방법 및 OPGL 에 결합하는 항체를 사용하여 시료내에서 OPGL 의 양을 검출하는 방법에 관한 것이다.

Description

ＯＰＧＬ 에 결합하는 항체, 이의 조성물 및 이의 제조방법{ANTIBODIES TO OPGL, COMPOSITIONS AND PREPARATION METHOD THEREOF}
본 출원은 본원에서 참고문헌으로 인용된, 2001 년 6 월 26 일자로 제출된 미국 가출원 일련 번호 제 60/301,172 호를 우선권으로 주장하고 있다.
본 발명은 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)와 결합하는 항체에 관한 것이다. 관절염, 파제트병 및 골감소증으로부터 기인한 골손실, 골다공증과 같은 골질환을 치료하기 위한 조성물 및 상기 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
골조직은 신체를 지탱하며 무기질(칼슘과 인 포함), 콜라겐성 단백질 및 비콜라겐성 단백질로 이루어진 기질, 및 세포를 포함하고 있다. 생조직은 침착이라는 골형성과 흡수라는 골파괴 사이의 동적 평형을 나타낸다. 골(骨)에서는 세 가지 유형인 골세포, 조골세포 및 파골세포가 발견되었고 이들 모두는 상기 동적 평형에 관여한다. 조골세포가 골조직의 형성을 촉진시키는 반면에 파골세포는 흡수에 연관되어 있다. 골형성과 비교하여 골기질 및 무기질의 분해 또는, 흡수는 신속하고 능률적인 과정이며 골로부터 다량의 무기질을 방출시킬 수 있다. 파골세포는 골격조직의 정상적인 재형성(remodeling)을 조절하는데 관여하고 호르몬에 의해 유도되는 흡수에도 관여한다. 예를 들어, 흡수는 세포외액에서 칼슘 농도가 감소하는 것에 반응하여 부갑상선 호르몬의 분비로 인해 자극된다. 대조적으로, 흡수를 저해하는 것은 칼시토닌의 기능이다. 또한, 비타민 D 의 대사산물은 부갑상선 호르몬 및 칼시토닌에 대한 골 반응성을 변경시킨다.
시토킨류의 TNF 과의 요소인 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)는 NF-kB 의 수용체 활성화인자(RANK, 또는 파골세포 분화 및 활성 수용체 또는 ODAR 이라고도 명명함)와의 결합을 통해 파골세포의 형성을 촉진시킨다. 반면에, 오스테오프로테게린(OPG)은 OPGL 을 격리시키고 OPGL 과 ODAR 과의 결합을 저해함으로써 파골세포의 형성을 저해한다. 따라서, ODAR 과 결합하는 OPGL 의 양은 골흡수 및 침착 사이의 동적 평형과 관계되어 있다.
골격 완성 후에, 골격에 있어 골의 양은 골형성 및 골흡수의 균형(또는 불균형)에 영향을 미친다. 골부피는 골격이 완성된 후 40 세 이전에 최고치에 이른다. 40 세와 50 세 사이에, 동적 평형은 변경되어 골흡수가 우세해진다. 남성보다 여성에게서 보다 일찍 나이가 들어감에 따라 골부피가 필연적으로 감소하며 이는 일부 여성의 폐경기 이후(주로 백색 인종 및 아시아인)에 뚜렷하게 가속화된다.
골감소증은 골부피가 일반적으로 정상 수치 이하로 감소되는 것과 관련된 증상이다. 이러한 증상은 골합성률을 감소시키거나 골파괴율을 증가시키거나 이들 둘 다를 야기할 수 있다. 골감소증의 일반적 형태는 일차적으로 골다공증, 또는 폐경기 이후 및 노년기의 골다공증이라고도 명명한다. 이러한 골다공증의 형태는 연령에 따른 보편적인 골손실의 결과이고 종종 정상적인 골형성률에 대하여 골흡수의 증가로 인한 결과이기도 하다. 미국에서 많은 백인 여성들은 골다공증의 징후를 나타낸다. 45 세 및 그 이상의 여성에게서는 둔부, 대퇴부, 목 및 전자(轉子)간 골절의 발병과 골다공증 간의 직접적인 관계가 존재한다. 젊은 남성들은 50 세에서 70 세 사이에 골다공증의 징후를 나타낼 것이다. 특정한 경우에 있어서, 골다공증은 OPGL 의 활성도 또는 증가된 수치로 인해 생겨날 수 있다. 따라서, 파골세포형성(osteoclastogenesis)에 있어 OPGL 의 활성도를 조절할 수 있는 분자를 입수하는 것이 유용하다.
폐경기 이후 및 노년기의 골다공증을 유발할 수 있는 몇가지 요소를 확인하였다. 이러한 요소로는 노령화로 인한 호르몬 수치의 변화와 칼슘 및 그밖의 다른 무기질의 장내에 감소된 흡수작용으로 인한 불충분한 칼슘 소비가 포함된다. 특정 치료로는 과정을 저해하려는 의도에서 호르몬 치료 또는 식이성 보충물(dietary supplement)을 포함한다. 최근에는 비스포스포네이트(bisphosphonate) 및 선택적 에스트로겐 수용체 변경유전자(SERMs)와 같은 항 - 흡수제(anti-resorptive agent)가 감소된 골부피를 예방하고 치료하기 위해 대두되었다. 따라서, 특정 골감소증 장애 치료에서 OPGL 의 활성도를 조절할 수 있는 분자와 상기 치료법을 조합하는 것이 유용할 것이다.
발명의 요약
특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 중쇄와 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 중쇄는 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 가변 영역을 포함하고 있으며, 상기 경쇄는 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 가변 영역을 포함하고 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 중쇄는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 중쇄는 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 가변 영역을 포함하고 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 경쇄는 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하고 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공하며, 상기 경쇄는 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 가변 영역을 포함하고 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 하기의 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체를 제공한다 : (a) 상기 중쇄는 제 1 가변 영역을 포함하고, 이 제 1 가변 영역은 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열과 적어도 90 % 의 동일성을 갖는 서열을 포함하고 ; (b) 상기 경쇄는 제 2 가변 영역을 포함하며, 이 제 2 가변 영역은 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열과 적어도 90 % 의 동일성을 갖는 서열을 포함하며 ; 및 (c) 상기 항체는 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)와 상호작용한다.
특정 실시형태에서, 제 1 가변 영역은 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열과 적어도 95 % 의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 제 2 가변 영역은 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열과 적어도 95 % 의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 제 1 가변 영역은 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열과 적어도 99 % 의 동일성을 갖는 서열을 포함하며, 제 2 가변 영역은 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열과 적어도 99 % 의 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 중쇄를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 가변 영역과 불변 영역을 포함하는 중쇄를 제공하며, 상기 가변 영역은 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄를 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열 또는 이의 단편을 포함하는 경쇄를 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 단쇄(single chain)의 항체를 제공한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 단쇄 Fv 항체를 제공한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, Fab 항체를 제공한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, Fab' 항체를 제공한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, (Fab')2 항체를 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 OPGL 과 결합하는 항체의 치료학적 유효량을 포함한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 OPGL 과 결합하는 항체 및 다음 중에서 선택한 적어도 하나의 치료제를 포함한다 : 골형성인자, 형질전환 성장인자 - β(TGF-β), 인터루킨 - 1(IL-1) 저해제, IL-1ra, Kineret™, 아나킨라(anakinra), TNFα 저해제, 가용성 TNFα 수용체, Enbrel™, 에탄에르셉트(etanercept), 항 - TNFα 항체, Remicade™, 인플릭시맵(infliximab), D2E7 항체, 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬의 유사체, 부갑상선 호르몬 관련 단백질, 부갑상선 호르몬 관련 단백질의 유사체, 프로스타글란딘, 비스포스포네이트, 알렌드론에이트(alendronate), 불화물(fluoride), 칼슘, 비 - 스테로이달 항 - 염증성 약물(NSAID), COX-2 저해제, Celebrex™, 셀레콕시브(celecoxib), Vioxx™, 로페콕시브(rofecoxib), 면역억압약, 메토트랙사이트, 레플루노마이드(leflunomide), 세린 단백질분해효소 저해제, 분비성 백혈구 단백질분해효소 저해제(SLPI), IL-6 저해제, IL-6 에 결합하는 항체, IL-8 저해제, IL-8 에 결합하는 항체, IL-18 저해제, IL-18 결합 단백질, IL-18 항체, 인터루킨 - 1 전환효소(ICE) 조절인자, 섬유모세포 성장인자(FGF), FGF 조절인자, PAF 길항물질, 케라티노사이트 성장인자(KGF), KGF - 관련 분자, KGF - 조절인자, 기질 금속단백질분해효소(MMP) 조절인자, 산화질소 생성효소(NOS) 조절인자, 당질코르티코이드 수용체의 조절인자, 글루탐산염 수용체의 조절인자, 지질다당류(LPS) 수치의 조절인자, 노르아드레날린, 노르아드레날린 유사체(mimetic) 및 노르아드레날린 조절인자.
본 발명의 특정 실시형태에서, 약학적 유효량의 항체를 투여하여 골감소증 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물을 투여하여 골감소증 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물을 투여한 환자에게서 골손실을 수반하는 염증성 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물을 투여한 환자에게서 골손실을 수반하는 자가면역 증상을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물을 투여한 환자에게서 골손실을 수반하는 류마티스성관절염을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 특정 실시형태에서, 생물학적 시료와 항체를 접촉시켜서 상기 생물학적 시료내의 OPGL 수치를 검출하는 방법을 제공한다.
도 1 은 αOPGL-1 항체의 중쇄를 코드하는 cDNA 서열을 나타낸 것이다(SEQ ID NO : 1).
도 2 는 αOPGL-1 항체의 중쇄를 코드하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다(SEQ ID NO : 2).
도 3 은 αOPGL-1 항체의 경쇄를 코드하는 cDNA 서열을 나타낸 것이다(SEQ ID NO : 3).
도 4 는 αOPGL-1 항체의 경쇄를 코드하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다(SEQ ID NO : 4).
도 5 는 αOPGL-1 카파 경쇄 발현 플라스미드 αOPGL-1-카파/pDSRα19 의 구성도를 나타낸 것이다.
도 6 은 αOPGL-1 IgG2 중쇄 발현 플라스미드인 αOPGL-1-IgG2/pDSRα19 의 구성도를 나타낸 것이다.
도 7 은 OPGL - 코팅 EIA 플레이트에 αOPGL-1 의 투여량에 따른 결합을 나타낸 것이다.
도 8 은 막 - 결합 OPGL 에 αOPGL-1 의 특이적 결합을 나타낸 것이다.
도 9 는 가용성 OPGL 로 코팅시킨 OPGL - 코팅 EIA 플레이트에 αOPGL-1 결합의 저해를 나타낸 것이다.
도 10 은 OPGL - 코팅 EIA 플레이트에 αOPGL-1 의 특이적 결합을 나타낸 것이다.
도 11 은 αOPGL-1 에 의한 파골세포 형성에 있어 투여량에 따른 저해를 나타낸 것이다.
도 12 는 αOPGL-1 에 의해 ODAR 과 OPGL 과의 결합의 투여량에 따른 저해를 나타낸 것이다.
도 13 은 사이노몰구스 원숭이에게 αOPGL-1 의 단일 투여량을 투여한 후에 시간에 따른 평균 혈청 농도의 프로필을 나타낸 것이다.
도 14 는 사이노몰구스 원숭이에게 αOPGL-1 의 단일 투여량을 투여한 후에 혈청 N-Tx 농도에서의 평균 변화율(%)을 나타낸 것이다.
도 15 는 사이노몰구스 원숭이에게 αOPGL-1 의 단일 투여량을 투여한 후에 뇨 N-Tx 농도에서의 평균 변화율(%)을 나타낸 것이다.
도 16 은 사이노몰구스 원숭이에게 αOPGL-1 의 단일 투여량을 투여한 후에 시간에 따른 항체 양성 및 음성 혈청 - 농도의 프로필을 나타낸 것이다.
도 17 은 αOPGL-1 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 13)을 나타낸 것이다.
도 18 은 αOPGL-1 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열(SEQ ID NO : 14)을 나타낸 것이다.
도 19 는 αOPGL-1 을 생산하기 위한 세포 배양 과정을 나타낸 것이다.
도 20 은 사이노몰구스 원숭이에게 αOPGL-1 의 단일 투여량을 투여한 후에 혈청내 칼슘 변화율(%)을 나타낸 것이다.
도 21 은 사이노몰구스 원숭이에게 αOPGL-1 의 단일 투여량을 투여한 후에 혈청내 알칼리포스파타제 변화율(%)을 나타낸 것이다.
본원에 사용된 전면 기호 [] 는 구조적 목적으로 사용된 것이지 기술된 주요 내용을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 출원에서 인용된 모든 참고문헌은 모든 목적에서 본원에서 참고문헌으로 널리 인용되었다.
정의
재조합 DNA, 올리고누클레오티드 합성 및 조직 배양과 형질전환(예를 들어, 일렉트로포레이션, 리포펙션)에 표준 기술을 사용할 수 있다. 본원에 기재되어 있거나 본 분야에서 일상적으로 시행할 수 있는 것처럼, 또는 제조자의 설명서에 따라 효소 반응 및 정제 기술을 시행할 수 있다. 상기 기술 및 과정은 본 분야에 널리 공지되어 있는 통상적인 방법에 따라 일반적으로 시행할 수 있고 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의되어 있는, 다양한 일반적이고 좀 더 상세한 참고문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, 모든 목적으로 본원에서 참고문헌으로 인용되어 있는 Sambrook 등의 Molecular Cloning : A Laboratory Manual(2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)) 참조하라. 특정하게 정의되어 있지 않다면, 본원에 기재되어 있는 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의화학과 약화학의 실험 과정 및 기술과 관련하여 사용된 명명법은 널리 공지된 것이고 본 분야에서도 일반적으로 사용되고 있다. 화학 합성, 화학 분석, 제제, 제제화 및 수송, 및 환자 치료에도 표준 기술을 사용할 수 있다.
본 출원서에 따라 사용된 바와 같이, 그밖에 달리 지정하지 않는다면, 하기 용어는 다음의 의미를 갖도록 이해되어야 한다.
본원에 사용된 "분리된 폴리누클레오티드" 란 용어는 게놈, cDNA 또는 합성원(synthetic origin) 이나 이의 일부 조합물의 폴리누클레오티드를 의미하며, 기원(origin)에 의해 "분리된 폴리누클레오티드" 는 (1) 천연에서 발견된 "분리된 폴리누클레오티드" 에서의 폴리누클레오티드 전체 또는 일부와는 관련이 없고, (2) 천연에서 발견된 폴리누클레오티드와 결합하지 않는 폴리누클레오티드에 결합되며, 또한 (3) 대형 서열의 일부로서 천연에서 발생하지 않는다.
본원에서 언급되어 있는 "분리된 단백질" 이란 용어는 cDNA, 재조합 RNA 또는 합성원이나 이의 일부 조합물에 의해 코드되는 단백질을 의미하며, (1) 일반적으로 발견되는 단백질과 비교하여 적어도 일부 단백질이 없으며, (2) 동일한 원(source)(예를 들어, 동일한 종)으로부터 그밖의 다른 단백질이 필수적으로 존재하지 않으며 (3) 상이한 종으로부터 세포에 의해 발현되거나, 또는 (4) 천연에서는 발생하지 않는다.
"폴리펩티드" 란 용어는 천연 단백질 또는, 천연 단백질 서열 중 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 부가 및/또는 치환된 서열을 언급하는 속명으로 본원에서 사용되었다. "폴리펩티드" 란 용어는 αOPGL-1(하기에 언급되어 있는 SEQ ID NO : 2 및 SEQ ID NO : 4), 또는 αOPGL-1 의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 결실, 부가 및/또는 치환된 서열을 포함한다. 특정 실시형태에 따라, 본 발명은 도 2(SEQ ID NO : 2)에 나타나있는 인체 중쇄의 면역글로불린 분자 및 도 4(SEQ ID NO : 4)에 나타나있는 인체 경쇄의 면역글로불린 분자, 또는 이의 단편이나 유사체를 포함한다.
본원에서 사용된 "자연적으로 - 발생한(naturally-occurring)" 이란 용어는 자연에서 발견할 수 있는 대상에 적용할 수 있는 것을 의미한다. 예를 들어, 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리누클레오티드 서열은 천연원으로부터 분리할 수 있으며, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않거나 그렇지 않으면 자연적으로 - 발생한 것을 의미한다.
본원에서 사용된 "조작가능하게 결합된(operably linked)" 이란 용어는 의도된 방법으로 작용가능케 하는 관계에서 존재하는 성분을 언급한 것이다. 예를 들어, 코딩 서열에 "조작가능하게 결합된" 조절 서열(control sequence)이 조절 서열과 양립할 수 있는 조건 하에서 코딩 서열이 발현될 수 있도록 결합되는 것이다.
본원에서 사용된 "조절 서열(control sequence)" 이란 용어는 이들이 결합된 코딩 서열의 발현 및 프로세싱에 영향을 미칠 수 있는 폴리누클레오티드 서열을 말한다. 상기 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 달라질 수 있다. 특정 실시형태에 따라, 원핵 생물에 대한 조절 서열은 포로모터, 리보솜 결합 부위 및 전사 종결 서열을 포함할 것이다. 특정 실시형태에 따라, 진핵 생물에 대한 조절 서열은 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함할 것이다. 특정 실시형태에서, "대조 서열" 은 선도 배열(leader sequence) 및/또는 융합 파트너 서열(fusion partner sequence)을 포함할 수 있다.
본원에서 언급된 "폴리누클레오티드" 란 용어는 적어도 10 개의 염기 길이로 이루어진 누클레오티드의 중합성 형태(polymeric form)를 의미한다. 특정 실시형태에서, 염기는 리보누클레오티드 또는 데옥시리보누클레오티드 또는 누클레오티드 각각의 형태의 변형된 형태일 것이다. 상기 용어는 DNA 의 단일 및 이중 가닥의 형태를 포함한다.
본원에서 언급한 "올리고누클레오티드" 란 용어는 자연적으로 발생하고/하거나 비 - 자연적으로 발생하는 올리고누클레오티드 결합에 의해 함께 결합된 자연적으로 발생하고 변형된 누클레오티드를 포함한다. 올리고누클레오티드는 200 개의 염기 또는 그보다 적은 염기의 길이를 일반적으로 포함하는 폴리누클레오티드 부분집합(subset)이다. 특정 실시형태에서, 올리고누클레오티드는 10 내지 60 개의 염기 길이로 이루어져 있다. 특정 실시형태에서, 올리고누클레오티드는 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 내지 40 개의 염기 길이로 이루어져 있다. 올리고누클레오티드는 예를 들어, 유전자 돌연변이체 구성에 사용하기 위해 단일 가닥 또는 이중 가닥의 형태일 것이다. 본 발명의 올리고누클레오티드는 센스 또는 안티센스의 올리고누클레오티드일 것이다.
"자연적으로 발생한 누클레오티드" 란 용어는 디옥시리보누클레오티드 및 리보누클레오티드를 포함한다. "변형된 누클레오티드" 란 용어는 변형되거나 치환된 당류(sugar group)등이 있는 누클레오티드를 포함한다. "올리고누클레오티드 결합" 이란 용어는 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 포스포로디티오에이트(phosphorodithioate),포스포로셀레노에이트(phosphoroselenoate), 포스포로디셀레노에이트(phosphorodiselenoate), 포스포로아닐로티오에이트(phosphoroanilothioate), 포스포로아닐라데이트(phosphoroaniladate), 포스포로아미데이트(phosphoroamidate) 등과 같은 올리고누클레오티드 결합을 포함한다. 예를 들어, 하기의 문헌들은 모든 목적에 적합하도록 본원에서 참고문헌으로 인용하였다 : LaPlanche 등의 Nucl. Acids Res. 14 : 9081(1986) ; Stec 등의 J. Am. Chem. Soc. 106 : 6077(1984) ; Stein 등의 Nucl. Acids Res. 16 : 3209(1988) ; Zon 등의 Anti-Cancer Drug Design 6 : 539(1991) ; Zon 등의 Oligonucleotides 및 Analogues ; A Practical Approach, pp. 87-108(F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991) ; Stec 등의 미국 특허 번호 제 5,151,510 호 ; Uhlmann 및 Peyman Chemical Reviews 90 : 543(1990). 올리고누클레오티드는 탐지용 표지를 포함할 수 있다.
폴리펩티드 및 관련된 동일성과 유사성은 공지된 방법에 의해 용이하게 계산할 수 있다. 상기 방법은 하기에 기재되어 있으며 이것으로 제한되지는 않는다 : Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York(1988) ; Biocomputing : Informatics 및 Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York(1993) ; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey(1994) ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press(1987) ; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York(1991) ; 및 Carillo 등의 SIAM J. Applied Math., 48 : 1073(1988).
동일성을 측정하기 위한 바람직한 방법은 시험된 서열 사이의 최적의 매치(match)를 수득하도록 설계되어 있다. 동일성을 측정하기 위한 방법은 공식적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 기재되어 있다. 두 개의 서열 사이의 동일성을 측정하기 위한 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 다음을 포함하지만 이것으로 한정되는 것은 아니다 : GAP 를 포함하는 GCG 프로그램 패키지(Devereux 등의 Nucl. Acid. Res., 12 : 387 1984), 미국 위스콘신주 매디슨에 소재하는 위스콘신 대학의 Genetics Computer Group, BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul 등의 J. Mol. Biol., 215 : 403-410 1999). BLASTX 프로그램은 내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션(National Center for Biotechnology Information, NCBI) 및 그밖의 다른 원(BLAST Manual, Altschul 등의 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894 ; Altschul 등의 상기문헌 1990 참조하라)으로부터 공식적으로 이용가능하다. 공지된 스미스 워터만 알고리즘(Smith Waterman algorithm) 또한 동일성을 측정하기 위해 사용될 것이다.
두 아미노산 서열을 정렬하기 위한 특정한 정렬 도식(scheme)으로 두 서열 중 짧은 영역에서만 매칭이 되었고, 전장의 두 서열 사이에서는 유의한 상관관계가 존재하지 않지만 정렬된 작은 영역에서만 서열의 매우 높은 동일성을 갖게 되었다. 따라서, 특정 실시형태에서, 선택한 정렬 방법(GAP 프로그램)으로 표적 폴리펩티드의 적어도 50 개의 인접한 아미노산이 정렬되었다.
예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP(미국 위스콘신 매디슨에 소재하는 위스콘신 대학의 제네틱스 컴퓨터 그룹)을 이용하여 측정하려는 서열의 동일성(%)에 관한 두 폴리펩티드를 각각의 아미노산의 최적의 매칭을 위해 정렬시켰다[알고리즘에 의해 측정된 바와 같이 "매치된 범위(matched span)"]. 특정 실시형태에서, PAM 250 또는 BLOSUM 62 와 같은 비교 매트릭스 뿐만 아니라, 갭 오프닝 페널티(gap opening penalty, 3X 평균 다이아고날로 계산하였으며 ; "평균 다이아고날" 은 사용되는 비교 매트릭스의 평균 다이아고날이고 ; "다이아고날" 은 특정한 비교 매트릭스에 의해 각각의 이상적인 아미노산이 매치되도록 지정된 스코어 또는 숫자임) 및 갭 익스텐션 페널티(gap extension penalty, 일반적으로 갭 오프닝 페널티의 1/10 배임) 를 알고리즘과 함께 사용하였다. 특정 실시형태에서, 표준 비교 매트릭스 또한 알고리즘에 의해 사용되었다(Dayhoff 등의 Atlas of Protein Sequence 및 Structure, 5(3)(1978) for the PAM 250 comparison matrix ; Henikoff 등의 Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89 : 10915-10919(1992) for the BLOSUM 62 comparison matrix 참조하라).
특정 실시형태에서, 폴리펩티드 서열 비교에 대한 파라미터는 다음을 포함한다 :
알고리즘 : Needleman 등의 J. Mol. Biol., 48 : 443-453(1970) ;
비교 매트릭스(Comparison Matrix) : BLOSUM 62 from Henikoff 등의
상기문헌(1992) ;
갭 페널티(Gap Penalty) : 12
갭 길이 페널티(Gap Length Penalty) : 4
유사성 한계치(임계) : 0.
상기 파라미터를 갖는 GAP 프로그램은 유용할 것이다. 특정 실시형태에서, 상기 언급한 파라미터는 GAP 알고리즘을 이용한 폴리펩티드 비교에 관한 [최종 갭(end gap)에 있어 페널티가 존재하지 않음] 애초(default) 파라미터이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 20 개의 통상적인 아미노산 및 이들의 약어는 통상적으로 사용가능하다. 모든 목적으로 본원에서 참고문헌으로 인용되어 있는 Immunology--A Synthesis(2nd Edition, E.S. Golub 및 D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.(1991)) 참조하라. 20 개의 통상적인 아미노산, α-, α- 이치환된 아미노산과 같은 비 - 천연 아미노산, N - 알킬 아미노산, 젖산 및 그밖의 다른 비 - 통상적인 아미노산의 입체이성질체(예를 들어, D - 아미노산) 또한 본 발명의 폴리펩티드에 대한 적절한 구성요소이다. 비 - 통상적인 아미노산의 예로는 다음을 포함한다 : 4 - 히드록시프롤린, γ - 카르복시글루타메이트, ε - N, N, N - 트리메틸리신, ε - N - 아세틸리신, O - 포스포세린, N - 아세틸세린, N - 포르밀메티오닌, 3 - 메틸히스티딘, 5 - 히드록시리신, σ - N - 메틸아르기닌, 및 그밖의 다른 유사한 아미노산과 이미노산(예를 들어, 4 - 히드록시프롤린). 본원에서 사용된 폴리펩티드 표기에 있어서, 표준 사용과 관례에 따라 왼쪽 방향이 아미노 말단 방향이고 오른쪽 방향이 카르복시 - 말단 방향이다.
유사하게, 특정하게 지정하지 않는다면, 단일 - 가닥의 폴리누클레오티드 서열의 왼쪽 말단이 5' 말단이고 ; 이중 - 가닥의 폴리누클레오티드 서열의 왼쪽 방향이 5' 방향으로 언급되어 있다. 신생(nascent) RNA 전사의 5' 에서 3' 으로의 방향은 전사 방향을 나타내고 ; RNA 와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 RNA 전사의 5' 말단 쪽의 5' 이고 이들 영역을 "상류 서열(upstream sequence)" 이라 명명하고 ; RNA 와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥 상의 서열 영역은 RNA 전사의 3' 말단 쪽의 3' 이고 이들 영역을 "하류 서열(downstream sequence)" 이라 명명한다.
보존적 아미노산 치환은 비 - 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기를 포함하며, 이들은 생물학적 시스템에서의 합성에 의해서 보다는 화학적 펩티드 합성에 의해 전형적으로 삽입된다. 이러한 치환은 펩티도유사체(peptidomimetics) 및 아미노산 성분의 그밖의 다른 역 또는 반전된(inverted) 형태를 포함한다.
천연적으로 발생하는 잔기는 통상적인 측쇄 특성을 근거로 다음과 같이 분류하였다 :
1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, Ile ;
2) 중성의 친수성 : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ;
3) 산성 : Asp, Glu ;
4) 염기성 : His, Lys, Arg ;
5) 사슬 방향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro ; 및
6) 방향족 : Trp, Tyr, Phe.
예를 들어, 비 - 보존적 치환에는 상기 분류한 것 중 하나의 요소를 그밖의 다른 류의 요소로 교환하는 것이 포함될 것이다. 이렇게 치환된 잔기는 비 - 인체 항체와 상동적인 인체 항체의 영역 또는 분자의 비 - 상동적 영역내로 도입될 것이다.
상기 치환에 있어 특정 실시형태에 따라, 아미노산의 수치료법 지표(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 각각의 아미노산은 이들의 소수성 및 전하 특성을 근거로 수치료법 지표를 지정하였다. 상기 지표는 다음과 같다 : 이소루이신(+4.5) ; 발린(+4.2) ; 루이신(+3.8) ; 페닐알라닌(+2.8) ; 시스테인/시스틴(+2.5) ; 메티오닌(+1.9) ; 알라닌(+1.8) ; 글리신(-0.4) ; 트레오닌(-0.7) ; 세린(-0.8) ; 트립토판(-0.9) ; 티로신(-1.3) ; 프롤린(-1.6) ; 히스티딘(-3.2) ; 글루타민산염(-3.5) ; 글루타민(-3.5) ; 아스파라진산염(-3.5) ; 아스파라긴(-3.5) ; 리신(-3.9) ; 및 아르기닌(-4.5).
단백질에 상호작용의 생물학적 기능을 부여하는 것에 있어서 수치료법의 아미노산 지표의 중요성은 본 분야에서 공지되어 있다. Kyte 등의 J. Mol. Biol., 157 : 105-131(1982) 참조하라. 특정 아미노산이 유사한 수치료법 지표 또는 스코어를 갖는 그밖의 다른 아미노산으로 치환되며 유사한 생물학적 활성도를 여전히 보유하고 있음이 공지되어 있다. 특정 실시형태에서 수치료법 지표를 기초로 한 치환에 있어서, 아미노산 치환의 수치료법 지표는 ±2 이내에 포함된다. 특정 실시형태에서는 ±1 이내에 포함되며 다른 특정 실시형태에서는 ±0.5 이내에 포함된다.
비슷한 아미노산의 치환은, 특히 생성된 것에 의한 생물학적으로 기능적인 단백질 또는 펩티드를 본 발명의 경우와 마찬가지로 면역학적 실시형태에서 사용하고자 할 경우에, 친수성을 기초로 하여 효과적으로 상기 아미노산 치환이 일어날 수 있음이 본 분야에서 또한 공지되어 있다. 특정 실시형태에서, 인접한 아미노산의 친수성에 의해 결정되는 것과 같이 단백질의 최대 국소적 평균(greatest local average) 친수성은 단백질의 면역원성 및 항원성(즉, 단백질의 생물학적 특성)과 연관되어 있다.
하기의 친수성 값은 다음의 아미노산 잔기로 지정되었다 : 아르기닌(+3.0) ; 리신(+3.0) ; 아스파라진산염(+3.0 ± 1) ; 글루타민산염(+3.0 ± 1) ; 세린(+0.3) ; 아스파라긴(+0.2) ; 글루타민(+0.2) ; 글리신(0) ; 트레오닌(-0.4) ; 프롤린(-0.5 ± 1) ; 알라닌(-0.5) ; 히스티딘(-0.5) ; 시스테인(-1.0) ; 메티오닌(-1.3) ; 발린(-1.5) ; 루이신(-1.8) ; 이소루이신(-1.8) ; 티로신(-2.3) ; 페닐알라닌(-2.5) 및 트립토판(-3.4). 특정 실시형태의 유사한 친수성 값을 기초로 한 치환에 있어서, 아미노산 치환의 친수성 값의 범위는 ±2 이내이고 특정 실시형태에서는 ±1 이내에 포함되며 특정 실시형태에서는 ±0.5 이내에 포함된다. 친수성을 기초로 한 제 1 아미노산 서열로부터 에피토프를 또한 확인할 수 있다. 이러한 영역을 또한 "에피토프 코어 영역(epitopic core regions)" 이라고 언급한다.
전형적인 아미노산 치환은 다음 표 1 에 기재되어 있다.
Figure 112010006156193-pat00001
널리 - 공지된 기술을 사용하여 본원에 기재되어 있는 것 같이 본 분야의 숙련자들은 폴리펩티드의 적절한 변이체를 결정할 수 있을 것이다. 특정 실시형태에서, 본 분야의 숙련자들은 활성도에는 중요하지 않다고 여겨지는 영역을 표적으로 삼음으로써 활성도를 파괴하지 않으면서 치환할 수 있는 분자의 적절한 영역(area)을 확인 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 유사한 폴리펩티드 사이에서 보존된 분자의 부분 및 잔기를 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서는, 생물학적 활성도를 파괴하지 않거나 폴리펩티드 구조에 가역적으로 영향을 미치지 않으면서 생물학적 활성도나 구조에 중요할 수 있는 영역(area) 까지도 보존적으로 아미노산이 치환되었다.
부가적으로, 본 분야의 숙련자들은 활성도나 구조에 중요한 유사 폴리펩티드에서 잔기를 확인하는 구조 - 기능(structure-function) 연구를 재검토할 수 있다. 상기 비교를 고려하여, 유사 단백질에서 활성도나 구조에 중요한 아미노산 잔기와 상응하는 단백질에서 아미노산 잔기의 중요성을 예측할 수 있다. 본 분야의 숙련자들은 상기 예측된 중요 아미노산 잔기에 대해 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택할 수 있다.
본 분야의 숙련자는 또한 유사한 폴리펩티드의 구조와 관련하여 3 차원 구조 및 아미노산 서열을 분석할 수 있다. 상기 정보를 고려하여, 본 분야의 숙련자들은 항체의 3 차원 구조에 관해서는 항체의 아미노산 잔기의 정렬을 예측할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 분야의 숙련자들은 라디칼 변화가 단백질의 표면 상에서 예측되는 아미노산 잔기로 되지 않도록 선택할 것이며, 이는 상기 잔기가 그밖의 다른 분자와의 중요한 상호작용에 관여하기 때문일 것이다. 더욱이, 본 분야의 숙련자들은 각각의 바람직한 아미노산 잔기에서 단일 아미노산의 치환을 함유하는 시험 변이체를 생성할 수 있다. 그리고나서 본 분야의 숙련자들에게 공지된 활성도 검정법을 사용하여 상기 변이체를 스크리닝할 수 있다. 상기 변이체는 적절한 변이체에 대한 정보를 수집하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 아미노산 잔기의 치환으로 인해 활성도가 파괴되고 바람직하지 않게 감소되거나 적절하지 않게됨이 발견된다면, 상기와 같은 치환이 일어난 변이체는 피해야 할 것이다. 바꾸어 말하면, 이러한 일상적인 실험으로부터 수집한 정보를 기초로 하여 본 분야의 숙련자들은, 또다른 치환이 단독으로 또는 다른 돌연변이와의 조합을 피해야하는 아미노산을 용이하게 측정할 수 있다.
다양한 과학문헌들이 2 차 구조를 예측하는데 공헌하였다. Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4) : 422-427(1996), Chou 등의 Biochemistry, 13(2) : 222-245(1974) ; Chou 등의 Biochemistry, 113(2) : 211-222(1974) ; Chou 등의 Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47 : 45-148(1978) ; Chou 등의 Ann. Rev. Biochem., 47 : 251-276 및 Chou 등의 Biophys. J., 26 : 367-384(1979)를 참조하라. 더욱이, 컴퓨터 프로그램은 2 차 구조를 예측하는데 일반적으로 이용가능하다. 2 차 구조를 예측하는 한 가지 방법은 상동성 모형을 기초로 하는 것이다. 예를 들어, 30 % 보다 큰 동일성이나 40 % 보다 큰 유사성의 서열을 갖는 두 폴리펩티드나 단백질은 일반적으로 유사한 구조적 토폴로지(topology)를 갖는다. 최근 단백질 구조 데이터베이스(PDB)의 발달로 폴리펩티드나 단백질의 구조 내에서 접힘(fold)의 가능한 수를 포함한 2 차 구조의 예측성이 강화되었다. Holm 등의 Nucl. Acid. Res., 27(1) : 244-247(1999) 참조하라. 특정 폴리펩티드나 단백질내에서 접힘은 제한되고 일단 구조의 임계수(critical number)가 해결되면, 구조 예측은 좀 더 정확해질 것이다.
2 차 구조를 예측하는 또다른 방법은 다음을 포함한다 : "스레딩(threading)" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3) : 377-87(1997) ; Sippl 등의 Structure, 4(1) : 15-19(1996), "프로필 분석(profile analysis)" (Bowie 등의 Science, 253 : 164-170(1991) ; Gribskov 등의 Meth. Enzym., 183 : 146-159(1990) ; Gribskov 등의 Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13) : 4355-4358(1987), 및 "진화 결합(evolutionary linkage)" (Holm, 상기문헌(1999), 및 Brenner, 상기문헌(1997)) 참조하라.
특정 실시형태에서, 항체 변이체는 글리코실화 반응을 포함하며, 여기에서 글리코실화 반응 부위의 수 및/또는 유형은 모폴리펩티드(parent polypeptide)의 아미노산 서열과 비교하여 변형된 것이다. 특정 실시형태에서, 천연 단백질보다 단백질 변이체는 N - 결합 글리코실화 부위의 수가 크거나 적음을 포함한다. N - 결합 글리코실화 부위의 서열은 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr 로 특정되며, X 로 표기된 아미노산 잔기는 프롤린을 제외한 모든 아미노산 잔기가 가능하다. 이러한 서열을 만들기 위한 아미노산 잔기의 치환으로 N - 결합 탄수화물쇄를 부가하는데 적합한 가능한 신규 부위(potential new site)를 제공한다. 선택적으로, 이러한 서열을 삭제한 치환으로 N - 결합 탄수화물쇄가 제거될 것이다. N - 결합 탄수화물쇄가 재배열되면, 하나 또는 그 이상의 N - 결합 글리코실화 부위(자연적으로 발생하는 것임)는 제거되고 하나 또는 그 이상의 신규한 N - 결합 부위가 형성된다. 또다른 바람직한 항체 변이체는 시스테인 변이체를 포함하며, 여기에서 모아미노산 서열과 비교하여 하나 또는 그 이상의 시스테인 잔기는 다른 아미노산(예를 들어, 세린)으로 치환되거나 결실된다. 불용성 봉입체 분리 후에 항체가 생물학적으로 활성인 입체구조내로 재접힘되는 경우에 시스테인 변이체는 유용할 것이다. 시스테인 변이체는 일반적으로 천연 단백질보다 적은 시스테인 잔기를 가지고 있으며, 전형적으로 짝안지은 시스테인으로 인한 상호작용을 최소화하기 위해 짝수로 존재한다.
특정 실시형태에 따라, 아미노산 치환은 다음의 특성을 갖는다 : (1) 단백질 분해에 대한 민감성 감소 ; (2) 산화에 대한 민감성 감소 ; (3) 단백질 복합체 형성을 위한 결합 친화력의 변화 ; (4) 결합 친화력 변화 ; 및/또는 (5) 다른 물리화학적 성질 또는 기능성 성질을 이러한 폴리펩티드 상에 부여 또는 변형. 특정 실시형태에 따라, 단일 아미노산 또는 다중 아미노산이(특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환) 자연적으로 발생하는 서열(특정 실시형태에서, 분자 내 접촉을 형성하는 도메인(류) 밖의 폴리펩티드 부분 내)에서 치환될 수 있다. 특정 실시형태에서, 보존적 아미노산 치환은 일반적으로 모서열의 구조적 특성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다(예를 들어, 치환 아미노산은 모서열에서 발생하는 헬릭스를 깨뜨리지 않거나 또는 모서열의 특성을 나타내는 다른 유형의 2 차 구조를 부수지 않음). 본 분야에서 인식되는 폴리펩티드의 2 차 구조 및 3 차 구조의 예는 본원에서 참고문헌으로 인용된 다음 문헌에 기술되어 있다 : Proteins, Structures 및 Molecular Principles[뉴욕(1994)에 소재하는 Creighton, Ed, W.H. Freeman 및 Company 로 부터 입수] ; Introduction to Protein Structure[뉴욕(1991)에 소재하는 C. Branden 및 J. Tooze, eds, Garland Publishing 으로 부터 입수] ; 및 Thornton 등의 Nature 354 : 105(1991) 참조.
본원에서 사용된 용어 "폴리펩티드 단편" 은 아미노 - 말단 결실 및/또는 카르복시 - 말단 결실을 갖는 폴리펩티드를 나타낸다. 특정 실시형태에서, 단편의 길이는 적어도 5 내지 467 개의 아미노산을 갖는다. 특정 실시형태에서, 단편의 길이가 적어도 5, 6, 8, 10, 14, 20, 50, 70, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 또는 450 개의 아미노산임을 이해할 것이다.
펩티드 유사체(peptide analogs)를 이들의 주형 펩티드와 유사한 성질을 갖는 비 - 펩티드 약물로서 약학적 산업에 일반적으로 사용했다. 이런 유형의 비 - 펩티드 화합물을 "펩티드 유사체(peptide mimetics)" 또는 "펩티도유사체(peptidomimetics)" 로 명명했다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15 : 29(1986) ; Veber 및 Freidinger TINS p.392(1985) ; 및 Evans 등의 J. Med. Chem. 30 : 1229(1987)을 참조하라. 이러한 화합물은 종종 전산화된 분자 모델링의 도움으로 발달한다. 구조적, 치료학적으로 유용한 펩티드와 유사한 펩티드 유사체(peptide mimetics)를 유사한 치료 효과 또는 예방 효과를 일으키기 위해 사용할 것이다. 일반적으로, 펩티도유사체는 인체 항체와 같은 전형적인 폴리펩티드(즉, 생화학적 특성 또는 약리학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와는 구조적으로 유사하나, 본 분야에서 널리 공지된 방법에 의해 다음 중에서 선택한 결합에 의해 선택적으로 치환된 하나 또는 그 이상의 펩티드 결합을 갖는다 : --CH2NH--, --CH2S--, --CH2-CH2--, --CH=CH-(cis 및 trans), --COCH2--, --CH(OH)CH2-- 및 --CH2SO--. 특정 실시형태에서 좀 더 안정한 펩티드를 생성하기 위해 동일한 유형의 D - 아미노산(예를 들어, L - 리신 대신에 D - 리신)을 갖는 공통 서열의 하나 또는 그 이상의 아미노산의 체계적인 치환을 사용할 수 있다. 더욱이, 공통 서열 또는 실질적으로 동일한 공통 서열 변이를 포함하는 제한 펩티드를 본 분야에서 공지된 방법 예를 들어, 펩티드를 고리화하는 이황화물 다리를 분자 내에 형성할 능력이 있는 내부 시스테인 잔기를 부가함으로써 생성할 수 있다[본원에서 참고문헌으로 인용한 Rizo 및 Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61 : 387(1992)을 참조].
"항체" 또는 "항체 펩티드(류)" 는 원항원 또는 특이적 결합에 대한 원항원과 견줄 만한 이의 결합 단편을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 재조합 DNA 기술로 결합 단편을 생산했다. 특정 실시형태에서 원항원의 효소적 절단 또는 항원적 절단으로 결합 단편을 생산했다. 결합 단편으로는 Fab, Fab', F(ab')2, Fv 및 단쇄 항원을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
"중쇄" 라는 용어는 OPGL 에 대해 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 어떤 폴리펩티드를 포함한다. "경쇄" 라는 용어는 OPGL 에 대해 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변 영역 서열을 갖는 어떤 폴리펩티드를 포함한다. 전장 중쇄는 가변 영역 도메인 VH 및 3 개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3 을 포함한다. VH 도메인은 폴리펩티드의 아미노 - 말단에 존재하며, CH3 도메인은 카르복시 - 말단에 존재한다. 본원에 사용된 것처럼, "중쇄" 라는 용어는 전장 중쇄 및 이의 단편을 포함한다. 전장 경쇄는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL 을 포함한다. 중쇄와 같은 경쇄의 가변 영역 도메인은 폴리펩티드의 아미노 - 말단에 존재한다. 본원에 사용된 것처럼, "경쇄" 라는 용어는 전장 경쇄 및 이의 단편을 포함한다. Fab 단편은 하나의 경쇄와 CH1 및 하나의 중쇄의 가변 영역을 포함한다. Fab 분자의 중쇄는 또 다른 중쇄 분자와 이황화물 결합을 형성할 수 없다. Fab' 단편은 하나의 경쇄 및 CH1 및 CH2 도메인 사이에 불변 영역을 좀 더 포함하는 하나의 중쇄를 함유하므로, 쇄간 이황화물 결합이 F(ab')2 분자를 형성하기 위해 2 개의 중쇄 사이에서 형성될 수 있다. Fv 영역은 중쇄 및 경쇄 둘 다의 가변 영역을 포함하나, 불변 영역은 결핍되어 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역이 플랙시블(flexible) 링커로 결합된 단쇄 항체는 Fv 이며, 이는 항원 결합 영역을 형성하는 단쇄 폴리펩티드를 형성한다. 단쇄 항체를 제 WO 88/01649 호 및 미국 특허 번호 제 4 946 778 호 및 제 5 260 203 호에서 상세히 기술하고 있다.
특정 실시형태에 있어서, 일반적으로, "다특이성" 항체 또는 "다기능성" 항체 보다는 다른 2 가 항체가 이것의 각각의 결합 부위와 동일할 것으로 이해된다.
실질적으로, 잉여 항체가 역수용체에 대한 수용체의 결합량을 적어도 약 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % 또는 그 이상까지 감소시킬 경우 항체는 수용체에 대한 리간드의 부착을 저해한다(생체외 경합적 결합 검정으로 측정됨).
"에피토프" 라는 용어는 면역글로불린 또는 T - 세포 수용체에 특이적으로 결합할 능력이 있는 모든 폴리펩티드 결정기를 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 에피토프 결정기는 아미노산, 당곁사슬, 포스포닐 또는 술포닐과 같은 화학적으로 활성 표면인 분자의 그룹을 포함하며, 특정 실시형태에서는 특이적인 3 차원 구조적 특성 및/또는 특이적인 전하 특성을 갖을 것이다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원 영역이다. 특정 실시형태에서, 단백질 및/또는 거대분자 복합체의 혼합물에서 항체의 표적 항원을 우선적으로 인지할 경우, 항체가 항원에 특이적으로 결합한다고 표현한다. 특정 실시형태에서, 해리상수가 ≤1μM, 특정 실시형태에서, 해리상수가 ≤100nM 및 특정 실시형태에서, 해리상수가 ≤10nM 인 경우, 항체가 항원에 특이적으로 결합한다고 표현한다.
"제제" 라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로 만들어진 추출물을 나타내기 위해 본원에 사용했다.
본원에 사용된 것처럼, "표지" 또는 "표지된" 이라는 용어는 예를 들어, 방사능 표지된 아미노산의 삽입 또는 마커된 아비딘(예를 들어, 광학법 또는 비색법으로 검출될 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타비딘)으로 검출될 수 있는 폴리펩티드의 비오틴 성분에 부착함으로써 검출할 수 있는 마커의 삽입을 나타낸다. 특정 실시형태에서, 또한 표지 또는 마커는 치료용일 수 있다. 폴리펩티드 및 당단백질을 표지하는 다양한 방법들이 본 분야에 공지되어 있으며, 이들을 사용할 것이다. 폴리펩티드에 대한 표지의 예로는 다음을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다 : 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예를 들어 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I), 형광 표지(예를 들어, 고추냉이의 퍼옥시다제, β - 갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광, 비오티닐 그룹, 2 차 수용체에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프(예를 들어, 루이신 지퍼 쌍 서열, 2 차 항원에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 특정 실시형태에서, 표지는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위한 다양한 길이의 스페이서 암(spacer arm)으로 부착된다.
본원에서 사용된 것처럼, "생물학적 시료" 라는 용어는 생물 또는 이전 생물로 부터 다량의 물질을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 생물은 인체, 마우스, 원숭이, 랫, 토끼 및 다른 동물들을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 물질은 혈액, 혈청, 뇨, 세포, 기관, 조직, 골, 골수, 림프절 및 피부를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
"골감소증 장애" 라는 용어는 골다공증, 골감소증, 파제트질환, 용해골전이, 치주염, 류마티스성관절염 및 부동화로 인한 골손실을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 이러한 골장애에 더하여, 특정 암은 파골세포의 활성을 증가시키며 흉부, 전립선 및 다발성 골수종과 같은 골흡수를 유도하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 암은 현재, 골에서 OPGL 의 과발현을 야기하는 제제를 생산하며 파골세포의 수 및 활성을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.
본원에 사용된 것처럼, "약학적 제제 또는 약물" 이라는 용어는, 환자에게 적당하게 투여될 경우 바람직한 치료 효과를 유도할 수 있는 능력이 있는 화학적 화합물 또는 조성물을 나타낸다.
본원에 사용된 것처럼, "조절인자" 라는 용어는 분자의 활성 또는 기능을 변경하거나 또는 바꾸는 화합물을 나타낸다. 예를 들어, 조절인자는 조절인자가 존재하지 않을 경우 관찰되는 활성 또는 기능의 크기와 비교하여 분자의 특정 활성 또는 특정 기능의 크기가 증가되거나 또는 감소될 수 있다. 특정 실시형태에서, 조절인자는 분자의 활성 또는 기능 중 적어도 하나의 크기를 감소시키는 저해제이다. 분자의 활성 또는 기능의 특정 예로는 결합 친화력, 효소 활성 및 시그널 트랜스덕션을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 저해제의 특정 예로는 단백질, 펩티드, 항체, 펩티바디, 탄수화물 또는 소유기 분자를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 펩티바디는 예를 들어 제 WO 01/83525 호에 기술되어 있다.
본원에 사용된 것처럼, "실질적인 순도(pure)" 는 현 우세종인 대상 종을 의미한다(즉, 몰을 기준으로, 구성원 중 어떤 다른 종 보다 좀 더 풍부함). 특정 실시형태에서, 실질적으로 정제된 분획은 현재의 모든 거대분자 종 중 적어도 약 50 %(몰 기준으로)을 포함하는 대상 종의 구성원이다. 특정 실시형태에서, 실질적으로 순수한 구성원은 현재 모든 거대분자 종의 구성원 중 약 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는 99 % 이상을 포함할 것이다. 특정 실시형태에서, 대상 종을 완전한 균일성을 위해 정제하였으며(오염물 종이 통상적인 검출 방법으로 구성원에서 검출되지 않음), 구성원은 본질적으로 단일 거대분자 종으로 이루어져 있다.
"환자" 라는 용어는 인체 피실험자 또는 동물 피실험자를 포함한다.
이러한 적용에 있어서, 단독의 용도는, 만약 다른 방법으로는 명확하게 나타낼 수 없다면 복수를 포함한다. 이러한 적용에 있어서, "또는" 의 용도는 만약 다른 방법으로는 나타낼 수 없다면 "및/또는" 을 의미한다. 더욱이, "포함하다" 및 "포함되다" 와 같은 형태 뿐만 아니라 "포함하는" 이라는 용어의 사용을 제한하지 않는다. 또한, "요소" 또는 "성분" 과 같은 용어는, 만약 다른 방법으로는 명확하게 나타낼 수 없다면 요소 및 하나의 단위와 요소를 포함하는 성분과 하나 이상의 소단위를 포함하는 성분을 포함하는 성분 둘 다를 포함한다.
시토킨의 종양 괴사 인자(TNF : tumor necrosis factor) 과 요소인 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)는 파골세포 형성에 포함된다. 상승된 파골세포 활성은 폐경기후골다공증, 파제트 질환, 용해골전이 및 류마티스성관절염을 포함한 수 많은 골감소증 장애와 관련이 있다. 그러므로, OPGL 활성의 감소는 파골세포 활성을 감소시킬 것이며 골감소증 장애로 인한 피해를 감소시킬 것이다. 본 발명의 특정 실시형태에 따라, OPGL 에 결합하는 항체를 상기 언급한 장애를 포함한 골감소증 장애를 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 실시형태에서는, 인체 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)에 결합하는 완전 인체 모노클로날 항체를 제공한다. 특정 실시형태에서는, 누클레오티드 서열을 코딩하며 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 분자, 특히 가변 영역에 부합하는 서열을 포함하는 아미노산 서열을 제공한다. 특정 실시형태에서는, 상보성 결정 영역(CDR's : complementarity determining regions) 특히 CDR1 부터 CDR3 까지에 부합하는 서열을 제공한다. 특정 실시형태에서 따라, 또한 면역글로불린 분자 및 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 특정 실시형태에 있어서, 인체 OPGL 에 결합하는 정제된 인체 모노클로날 항체를 제공한다.
효모 인공 염색체(YACs : yeast artificial chromosomes)에서 메가염기 크기의 인체 좌위를 클론하고 재구성하며 이들을 마우스 생식계열 내로 삽입하기 위한 능력은 인체 질환의 유용한 모델을 생성할 뿐만 아니라 매우 크거나 또는 있는 그대로 지도 작성된 좌위의 기능성 성분을 설명하기 위한 접근을 제공한다. 더욱이, 이들의 인체 당량을 갖는 마우스 좌위의 치환을 위한 이러한 기술의 이용은 발달 동안의 인체 유전자 산물의 발현 및 조절, 다른 시스템과 이들의 통신 및 질환 유도와 진행에 있어서 이들의 연좌에 대한 유일한 통찰을 제공할 수 있다.
이런 전략을 실제적으로 적용하기 위해서는 마우스 체액성 면역계의 "인체화(humanization)" 가 중요하다. 내인성 Ig 유전자가 불활성화되는 마우스로 인체 면역글로불린(Ig) 좌위를 도입하는 것은 B - 세포 발달시 이들의 역활 뿐만 아니라 항체의 예정된 발현 및 집합의 기초가 되는 메카니즘을 연구하기 위한 기회를 제공한다. 더욱이, 이러한 전략은 완전 인체 모노클로날 항체(MAbs) 생산에 대한 원천을 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 완전 인체 항체는 마우스 또는 마우스 - 유도화 지도에 대한 내재성의 면역원성 반응 및 알레르기 반응을 최소화할 것으로 기대되며, 그러므로 특정 실시형태에서, 투여된 항체의 효력 및 안전성을 증가시킬 것이다. 특정 실시형태에서, 완전 인체 항체를 골다공증, 염증, 자가면역 및 암과 같은 만성 및 재발 인체 질환을 치료하는 데 사용할 수 있으며, 이는 항체의 반복 투여를 포함한다.
마우스 항체가 존재하지 않을 경우 인체 항체를 생산할 것으로 기대되는, 인체 Ig 좌위의 대형 단편을 갖는 마우스 항체를 생산하는 데 결손이 있는 마우스 계통을 설계할 수 있다. 대형 인체 Ig 단편은 항체 생산 및 발현을 적절히 조절할 뿐만 아니라 대형 가변 유전자의 다양성을 보존할 것이다. 항체를 다양화하며 선택하기 위한 마우스 장치 및 인체 단백질에 대한 면역 내성의 결핍을 활용함으로써, 이러한 마우스 계통에서 재생산된 인체 항체 레퍼토리는 인체 항원을 포함한 어떤 목적 항원에 대해 고친화성의 항체를 수득할 것이다. 하이브리도마 기술을 사용함으로써, 바람직한 특이성을 갖는 항원 - 특이 인체 MAbs 을 생산할 수 있으며 선택할 수 있다.
특정 실시형태에서, 인체 가변 영역(류)과 함께 인체 보다는 다른 종으로부터의 불변 영역을 사용할 것이다.
자연적으로 발생하는 항체 구조
자연적으로 발생하는 항체 구조 단위는 일반적으로 사량체를 포함한다. 이러한 각각의 사량체는 일반적으로 두개의 동일한 폴리펩티드쇄 쌍으로 구성되어 있는데, 각각의 쌍은 하나의 전장 "경" 쇄(특정 실시형태에서, 약 25 kDa) 및 하나의 전장 "중" 쇄(특정 실시형태에서, 약 50 - 70 kDa)를 갖는다. 전형적으로 각 쇄의 아미노 - 말단 부분은 일반적으로 항원을 인식할 능력이 있는 가변 영역의 약 100 내지 110 또는 그 이상의 아미노산을 포함한다. 일반적으로 각 쇄의 카르복시 - 말단 부분은 작동 기능에 책임이 있는 불변 영역을 정의한다. 일반적으로 인체 경쇄를 κ 및 γ 경쇄로 분류한다. 일반적으로 인체 경쇄를 μ, δ, γ, α 또는 ε 으로 분류하며, 항체의 동위체를 각기 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE 로 정의한다. IgG 는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 를 포함한 몇개의 서브클라스를 갖으나 이에 한정되지는 않는다. IgM 은 IgM1 및 IgM2 를 포함한 몇개의 서브클라스를 갖으나 이에 한정되지는 않는다. IgA 도 마찬가지로 IgA1 및 IgA2 를 포함하는 서브클라스로 세분화되나 이에 한정되지는 않는다. 일반적으로, 전장의 경쇄 및 중쇄 내의 가변 영역 및 불변 영역은 "J" 영역의 약 12 또는 그 이상의 아미노산에 의해 결합되며 또한 "D" 영역의 약 10 이상의 아미노산을 포함하는 중쇄에 의해 결합된다. 예를 들어 Fundamental Immunology Ch.7[뉴욕(1989)에 소재하는 Paul, W, ed, 2nd ed Ravan Press 에서 입수]를 참조하라(전적으로 참고문헌으로 반영됨). 일반적으로 각각의 경쇄/중쇄 쌍의 가변 영역은 항원 결합 부위를 형성한다.
일반적으로 가변 영역은 3 개의 고도 가변 영역에 의해 연결되는 상대적으로 보존된 외각구조 영역이 일반적으로 동일한 구조를 나타내며, 또한 이를 상보성 결정 영역 또는 CDRs(complementarity determining regions)로 부른다. 일반적으로, 각 쌍의 2 개의 쇄로부터의 CDRs 는 특이 에티토프에 결합할 수 있는 외각구조 영역에 의해 정렬된다. N - 말단에서 C - 말단까지, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 일반적으로 도메인 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4 를 포함한다. 각 도메인에 대한 아미노산의 할당은 일반적으로 Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest[메릴랜드에 소재하는 National Institutes of Health, Bethesda(1987 및 1991)에서 입수] 또는 Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196 : 901-917(1987) ; Chothia 등의 Nature 342 : 878-883(1989)의 정의와 일치한다.
이중특이성 또는 이중기능성 항체
일반적으로 이중특이성 또는 이중기능성 항체는 2 개의 다른 중쇄/경쇄 쌍 및 2 개의 다른 결합 부위를 갖는 인공적인 하이브리드 항체이다. 이중특이성 항체를 하이브리도마 융합 또는 Fab' 단면 결합을 포함한 다양한 방법들로 생산할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, Songsivilai & Lachmann Clin. Exp. Immunol. 79 : 315-321(1990), Kostelny 등의 J. Immunol. 148 : 1547-1553(1992)을 참조하라.
항체 제조
특정 실시형태에 따라, OPGL 에 특이적으로 결합하는 특정 항체는 본 발명에 의해 포함된다. 특정 실시형태에 있어서, 항체를 가용성 형태의 OPGL 또는 이의 단편인 전장의 OPGL 로 면역화함으로써 생산할 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 다클론성이거나 또는 단일클론성일 수 있으며/있거나 재조합 항체일 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, 본 발명의 항체는 예를 들어, 인체 항체를 생산할 능력이 있는 형질전환 동물의 면역화(예를 들어, PCT 공개 출원 번호 제 WO 93/12227 호를 참조)에 의해 제조된 인체 항체이다.
특정 실시형태에 있어서, αOPGL-1 의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 상보성 결정 영역(CDRs)을 동일종이나 또는 다른 종의 외각구조 영역(FRs: framework regions)에 결합시킬 수 있다. 특정 실시형태에 있어서, αOPGL-1 의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 CDRs 를 공통 인체 FRs 에 이식할 수 있다. 공통 인체 FRs 를 만들기 위해, 특정 실시형태에서, 몇개의 인체 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 FRs 을 공통 아미노산 서열과 동일하게 배열했다. 특정 실시형태에서, αOPGL-1 중쇄 또는 경쇄의 FRs 를 다른 중쇄 또는 경쇄의 FRs 로 치환하였다. 특정 실시형태에서, αOPGL-1 의 중쇄 또는 경쇄의 FRs 의 천연 아미노산은 치환되지 않는 반면에 잔여 FR 아미노산은 치환된다. 천연 아미노산은 FRs 에서 일반적으로 이들이 발견되지 않는 위치에서의 특이 아미노산이다. 특정 실시형태에 있어서, 이식된 가변 영역은 단쇄 Fv 항체의 부분이다. CDR 이식은 본원에서 참고문헌으로 인용한 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6 180 370 호, 제 5 693 762 호, 제 5 693 761 호, 제 5 585 089 호 및 제 5 530 101 호에 기술되어 있다.
특정 실시형태에 따라, 본 발명의 항체를 삽입된 게놈(genome)을 생산하는 인체 항체의 실질적인 부분을 갖으나 내인성 마우스 항체를 생산할 경우에는 결함이 있는 형질전환 마우스를 이용하여 제조하였다. 그 다음, 이러한 마우스는 인체 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 수 있는 능력이 있으며 마우스 면역글로불린 분자 및 항체를 생산할 경우에는 결함이 있다. 이러한 결과를 달성하기 위해 이용된 기술들은 본 명세서에 나타낸 특허, 출원 및 참고문헌에 나타나 있다. 특정 실시형태에서, 그러므로 본원에서 참고문헌으로 인용한 PCT 공개 출원 번호 제 WO 98/24893 호에서 나타낸 것과 같은 방법들을 이용할 것이다. 또한 본원에서 참고문헌으로 인용한 Mendez 등의 Nature Genetics 15 : 146-156(1997)를 참조하라.
특정 실시형태에 따라, OPGL 에 결합하는 특이적인 완전 인체 모노클로날 항체를 다음과 같이 생산했다. 인체 면역글로불린 유전자를 함유한 형질전환 마우스를 목적 항원으로 면역화 하였다. 항체를 발현하는 마우스에서 림프 세포(B - 세포와 같음)를 수득하였다. 이러한 수득 세포를 불사화 하이브리도마 세포주를 제조하기 위해 골수 - 유형의 세포주와 융합하였으며, 이러한 하이브리도마 세포주를 스크린하였으며, 목적 항원에 특이적인 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 식별하기 위해 선택하였다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 생산했다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 하이브리도마 계통의 AMG 6.1, AMG 6.4, AMG 6.5, AMG 7.1 및 AMG 7.2 로 생산했다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 하이브리도마 계통의 AMG 6.1, AMG 6.4 및 AMG 6.5 로 생산했다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 약 0.23 및 0.29 nM 사이의 해리상수(kd)를 갖는 OPGL 에 결합한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 항체는 0.23 nM 보다 적은 kd 를 갖는 OPGL 에 결합한다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체는 IgG2 동위형이다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 항체는 인체 카파 경쇄 및 인체 IgG2 중쇄를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 포유동물 세포에서 발현하기 위해 클론하여 왔다. 특정 실시형태에서, 항체의 가변 영역을 IgG2 동위형에 대한 불변 영역 보다는 다른 불변 영역에 결찰했다.
특정 실시형태에서, αOPGL-1 의 중쇄 및 경쇄의 보존적 변형(및 코딩 뉴크레오티드에 대한 변형과 일치함)이 이들의 αOPGL-1 과 유사한 기능적 특성 및 화학적 특성을 갖는 OPGL 에 결합하는 항체를 생산할 것이다. 대조적으로, αOPGL-1 의 기능적 특성 및/또는 화학적 특성의 실질적인 변형은 (a) 예를 들어, 시트 입체구조 또는 헬릭스 입체구조와 같은 치환부위 분자골격 구조 (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성 또는 (c) 집단 곁사슬을 유지하는 이들의 효과에 있어서, 상당히 다른 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열의 치환을 선택함으로써 달성될 수 있다.
예를 들어, "보존적 아미노산 치환" 은 비천연 잔기로 천연 아미노산 잔기의 치환을 포함할 것이며 이는 그 위치에서 아미노산 잔기의 극성 또는 전하상 효과가 거의 없기 때문이다. 더욱이, 폴리펩티드의 어떤 천연 잔기를 또한 이전 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" 에 대해 설명해왔던 것처럼 알라닌으로 치환할 것이다.
바람직한 아미노산 치환(보존적 이든지 또는 비 - 보존적)을 이러한 치환이 요구되는 시점에서 본 분야의 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 특정 실시형태에서, 아미노산 치환을 αOPGL-1 의 중요 잔기를 식별하거나 또는 본원에 기술된 OPGL 에 결합하는 항체의 친화력을 증가시키거나 또는 감소시키기 위해서 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 항체를 하이브리도마 세포주 보다는 다른 세포주에서 발현시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, 특정 항체를 코드하는 서열을 적절한 포유동물 숙주 세포의 형질전환을 위해 사용할 수 있다. 특정 실시형태에 따라, 예를 들어, 폴리누클레오티드를 바이러스 내로(또는 바이러스성 벡터 내로) 충전 및 바이러스(또는 벡터)를 숙주세포로의 형질도입을 포함한 폴리누클레오티드를 숙주세포 내로 도입하기 위한 어떤 공지된 방법으로 형질전환 할 수 있거나 또는 미국 특허 번호 제 4 399 216 호, 제 4 912 040 호, 제 4 740 461 호 및 제 4 959 455 호(본원에서 참고문헌으로 인용됨)에 의해 예시된 것처럼 본 분야에 공지된 트랜스펙션 과정에 의해 형질전환 할 수 있다. 특정 실시형태에서, 사용된 형질전환 과정은 형질전환될 수 있는 숙주세포에 달려 있다. 포유동물 세포 내로 비상동성 폴리누클레오티드를 도입하기 위한 본 분야에 공지된 방법으로는 덱스트란 - 매개 트랜스펙션, 인산 칼슘 침전, 폴리브렌 - 매개 트랜스펙션, 원형질체 융합, 일렉트로포레이션, 리포솜 내 폴리누클레오티드의 캡슐화 및 핵 내로 DNA 의 직접현미주사를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
발현을 위한 숙주로서 이용 가능한 본 분야에 공지된 포유동물 세포주로는 차이니즈 햄스터 난소(CHO : chinese hamster ovary) 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장(BHK : baby hamster kidney) 세포, 원숭이 신장 세포(COS : monkey kidney cells), 인체 간세포 종양(예를 들어, Hep G2) 및 다른 많은 세포주를 포함하나 이에 한정되지 않는 아메리칸 타입 컬처 콜렉션(ATCC : American Type Culture Collection)으로부터 이용 가능한 많은 불사화된 세포주를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 고도의 발현 수치를 가지며 구성 OPGL 결합 성질을 갖는 항체를 생산하는 세포주의 결정을 통해 세포주를 선택할 수 있다.
특정 실시형태에 따라, 본 발명의 항체는 생물학적 시료에서 OPGL 을 검정하는데 유용하다. 특정 실시형태에서, 이것으로 단백질을 생산하는 세포 또는 조직을 식별 할 수 있다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하며 다른 결합 화합물과의 상호작용을 방해하는 항체는 파골세포 분화 및 골흡수를 조절하여 치료하는 용도로 사용될 것이다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 ODAR 에 OPGL 의 결합을 방해하며, 이는 신호전달 캐스케이드를 방해하며 NF-kB 매개 전사 활성의 손실을 야기할 것이다. 예를 들어, 루시퍼아제 수용체 검정을 사용한 NF-kB 매개 전사 활성을 측정하는 검정은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체의 치료학적 유효량의 투여를 포함하는 골장애를 치료하는 방법들을 제공한다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체의 치료학적 유효량 및 또 다른 치료제의 투여를 포함하는 골장애를 치료하는 방법들을 제공한다. 이러한 특정 실시형태에 있어서, 부가적인 치료제는 치료학적 유효량으로 투여된다. 특정 실시형태에서, 골장애는 골감소증 및 골용해를 포함하나 이에 한정되지는 않는 순(net) 골손실의 특징이 있는 장애이다. 특정 실시형태에서 OPGL 에 결합하는 항체에 의한 치료는 골흡수율을 억제하는데 사용된다. 그러므로, 특정 실시형태에 있어서, 치료는 흡수율이 정상보다 높을 경우 골흡수율을 감소시키기 위해서 사용되거나 또는 정상 수준 이하의 골형성을 보충하기 위해 정상 수준 이하로 골흡수를 감소시키기 위해서 사용될 것이다. 특정 실시형태에서, OPG 가 존재하지 않거나 또는 존재할 경우에, OPGL 에 대한 항체의 결합을 실험할 수 있으며 OPGL - 매개 파골세포발생(osteclastogenesis) 및/또는 골흡수를 억제하는 이들의 능력을 시험할 수 있다.
특정 실시형태에 따라 치료될 수 있는 증상으로는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : ㆍ원발성 골다공증, 내분비성 골다공증(갑상선항진증, 부갑상선항진증, 쿠싱증후군 및 말단거대증을 포함하나 이에 한정되지는 않음), 유전성 골다공증 및 선천성 형태의 골다공증[불완전골형성증, 호모시스틴뇨증, 멘케스(Menkes) 증후군, 릴리 - 테이 증후군] 및 사지의 부동화로 인한 골다공증을 포함하나 이에 한정되지 않는 골다공증 ; ㆍ성인 및 유년기의 골 파제트 질환(변형성골염) ; ㆍ골수염, 즉 골손실을 일으키는 골에서의 감염성 병변 ; ㆍ고형 종양(유방, 폐 및 신장을 포함하나 이에 한정되지는 않음) 및 간질환성 악성종양(다발성 골수종, 림프종 및 백혈병을 포함하나 이에 한정되지는 않음)으로부터 야기되는 칼슘과잉혈증, 특발성 칼슘과잉혈증 및 갑상선항진증 및 신장 장애와 관련된 칼슘과잉혈증을 포함하나 이에 한정되지 않는 칼슘과잉혈증 ; ㆍ다음 외과적 골감소증, 스테로이드 투여로 유도되는 골감소증, 대장 및 소장의 장애와 관련된 골감소증 및 만성 간 질환 및 신장 질환과 관련된 골감소증을 포함하나 이에 한정되지 않는 골감소증 ; ㆍ상해성 외상과 관련된 골괴사, 고셰 질환과 관련된 골괴사, 낫형 적혈구 빈혈증과 관련된 골괴사, 전신성 홍반성 루푸스와 관련된 골괴사, 류마티스성관절염과 관련된 골괴사, 치주 질환과 관련된 골괴사, 골용해 전이와 관련된 골괴사 및 다른 증상과 관련된 골괴사를 포함하나 이에 한정되지 않는 골세포 사멸 골괴사 ; 및 ㆍ류마티스성관절염과 관련된 연골 손실 및 관절 침식.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체를 골장애 치료를 위해 단독으로 사용하거나 또는 하나 또는 그 이상의 부가적인 치료제와 함께 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체를 치료학적 유효량의 부가적인 치료제와 함께 사용한다. OPGL 에 결합하는 항체와 함께 투여될 수 있는 치료제의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : ㆍBMP-1 내지 BMP-12 로 제조된 골형성인자 ; ㆍ형질전환 성장인자 - β(TGF-β : transforming growth factor-β) 및 TGF-β 과 요소 ; ㆍIL-1ra 와 이의 유도체 및 Kineret™, 아나킨라를 포함하나 이에 한정되지 않는 인터루킨 - 1(IL-1 : interleukin-1) 저해제; ㆍ가용성 TNFα 수용체, Enbrel™, 에탄에르셉트, 항 - TNFα 항체, Remicade™, 인플릭시맵 및 D2E7 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 TNFα 저해제 ; ㆍ부갑상선 호르몬 및 이의 유사체 ; ㆍ부갑상선 호르몬 관련 단백질 및 이의 유사체 ; ㆍE 계열 프로스타글란딘 ; ㆍ비스포스네이트(이를테면 알렌드론에이트 및 그밖의 것) ; ㆍ불화물 및 칼슘과 같은 골 - 증강 무기질(bone-enhancing mineral) ; ㆍCelebrex™, 셀레콕시브 및 Vioxx™, 로페콕시브와 같은 COX-2 저해제를 포함하나 이에 한정되지 않는 비 - 스테로이달 항 - 염증성 약물(NSAIDs ; non-steroidal anti-inflammatory drugs) ; ㆍ메토트랙사이트 또는 레플루노마이드(leflunomide)와 같은 면역억압약 ; ㆍ분비성 백혈구 단백질분해효소 저해제(SLPI : secretory leukocyte protease inhibitor)를 포함하나 이에 한정되지 않는 세린 단백질분해효소 저해제 ; ㆍIL-6 저해제(IL-6 에 결합하는 항체를 포함하나 이에 한정되지 않음), IL-8 저해제(IL-8 에 결합하는 항체를 포함하나 이에 한정되지 않음), IL-18 저해제(IL-18 결합 단백질 및 IL-18 항체를 포함하나 이에 한정되지 않음) ; ㆍ인터루킨 - 1 전환 효소(ICE : interleukin-1 converting enzyme) 조절인자 ; ㆍ섬유모세포 성장인자(FGF : fibroblast growth factor) FGF-1 내지 FGF-10 및 FGF 조절인자 ; ㆍPAF 길항물질 ; ㆍ케라티노사이트 성장인자(KGF : keratinocyte growth factor), KGF - 관련 분자 및 KGF 조절인자 ; ㆍ기질 금속단백질분해효소(MMP : matrix metalloproteinase) 조절인자 ; ㆍ산화질소 생성효소(NOS : nitric oxide synthase) 유도 조절인자를 포함하나 이에 한정되지 않는 산화질소 생성효소(NOS) 조절인자 ; ㆍ당질코르티코이드 수용체의 조절인자 ; ㆍ글루탐산염 수용체의 조절인자 ; ㆍ지질다당류(LPS : lipopolysaccharide) 수치의 조절인자 ; 및 ㆍ노르아드레날린과 조절인자 및 이의 유사체.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체를 다양한 염증 증상, 자가면역 증상 또는 골손실을 수반하는 다른 증상들을 치료하기 위해서 특정 치료제와 함께 사용한다. 특정 실시형태에서, 증상 및 바람직한 치료 단계를 고려하여 둘, 셋 또는 그 이상의 제제를 투여할 것이다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제들을 동일한 제형에 봉입함으로써 함께 제공될 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제 및 OPGL 에 결합하는 항체를 동일한 제형에 봉입함으로써 함께 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제들을 치료 키트 내에 봉입함으로써 함께 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제 및 OPGL 에 결합하는 항체를 치료 키트에 봉입함으로써 함께 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제제들을 따로 제공할 것이다. 특정 실시형태에서, 유전자 치료 요법으로 투여할 경우, 단백질 제제 및/또는 OPGL 에 결합하는 항체를 코드하는 유전자가 동일한 벡터 내에 포함될 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질 제제 및/또는 OPGL 에 결합하는 항체를 코드하는 유전자는 동일한 프로모터 영역의 조절하에 있다. 특정 실시형태에서, 단백질 제제 및/또는 OPGL 에 결합하는 항체를 코드하는 유전자를 벡터에서 분리할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명을 OPGL 에 결합하는 항체 및 하나 또는 그 이상의 인터루킨 - 1(IL-1) 저해제를 포함하는 치료 요법 및 이러한 치료 요법을 사용한 치료 방법으로 조작했다. 특정 실시형태에서, 치료 요법은 OPGL 에 결합하는 항체와 IL-1 저해제 및 본원에서 기술하고 있는 하나 또는 그 이상의 부가적인 분자를 포함한다. 특정 실시형태에서, 치료 방법으로 OPGL 에 결합하는 항체와 함께 IL-1 저해제 및/또는 TNF-α 저해제를 사용한다. 특정 실시형태에서, IL-1 저해제 및/또는 TNF-α 저해제와 결합할 경우 OPGL에 결합하는 항체를 천식, 류마티스성관절염 및 다발성 경화증과 같은 증상을 치료하는데 사용할 것이다.
인터루킨 - 1(IL-1)은 항 - 염증성 시토킨이다. 특정 사례에 있어서, IL-1 은 많은 질환 및 의학적 증상의 매개물질이다. 특정 사례에 있어서, 대식세포/단핵세포 계통의 세포에서 IL-1 을 제조하였다. 특정 사례에 있어서, IL-1 을 다음 2 가지 형태로 생산했다 : IL-1 알파(IL-1α) 및 IL-1 베타(IL-1β).
만약 자발적 질환 또는 실험적 질환 또는 의학적 증상이 체액 또는 조직에서 상승된 수치의 IL-1 과 관련이 있다면/있거나 만약 인체로부터 얻은 세포 또는 조직이 배지에서 상승된 수치의 IL-1 을 제시한다면, 질환 또는 의학적 증상을 "인터루킨 - 1 매개 질환" 으로 간주한다. 특정 실시형태에서, 이러한 인터루킨 - 1 매개 질환 또한 다음 부가적인 2 가지 증상에 따라 인지될 수 있다 : (1) 질환 또는 의학적 증상과 관련된 병리학적 발견물은 IL-1 을 투여하거나 또는 IL-1 의 발현을 상향조절함으로써 동물에서 실험적 으로 모사할 수 있다 ; 및 (2) 질환 또는 의학적 증상의 실험용 동물 모델에서 유도되는 병변을 IL-1 의 활동을 억제하는 제제로 치료함으로써 저해할 수 있거나 또는 파괴할 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 증상 중 하나 또는 그 이상은 IL - 1 - 매개 질환에 부합한다. 특정 실시형태에서, 모두 세개의 증상은 IL - 1 - 매개 질환에 부합한다.
급성 및 만성 인터루킨 - 1(IL-1) - 매개 질환으로는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : 급성 췌장염 ; 근위축성측삭경화증(ALS 또는 루 게릭병) ; 알쯔하이머병 ; AIDS - 유도 악액질을 포함하나 이에 한정되지는 않는 악액질/식욕부진 ; 천식 및 다른 폐질환 ; 죽상동맥경화증 ; 자가면역 맥관염 ; 만성 피로 증후군 ; 클로스트리듐 - 관련 설사를 포함하나 이에 한정되지 않는 클로스트리듐 관련 병 ; 울혈성 심부전, 관상 재발협착증, 심근경색, 심근기능부전(예를 들어, 패혈증과 관련됨) 및 관상 동맥 바이패스 이식편을 포함하나 이에 한정되지 않는 관상 증상 및 징후 ; 다발성 골수성 백혈병과 골수성(예를 들어, AML 및 CML) 및 종양 전이를 포함하나 이에 한정되지 않는 백혈병을 포함하나 이에 한정되지 않는 암 ; 당뇨병(인슐린 - 의존성 당뇨병을 포함하나 이에 한정되지 않음) ; 자궁내막증 ; 열 ; 섬유근육통 ; 사구체신염 ; 이식편대숙주질환(GvHD : graft versus host disease) 및/또는 이식조직 거부반응 ; 헤모호르라직(hemohorragic)쇽 ; 통각과민 ; 염증성 장 질환 ; 골관절염, 건선성 관절염 및 류마티스성관절염을 포함하나 이에 한정되지 않는 관절 염증성 증상 ; 예를 들어, 각막 이식과 관계된 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는 염증성 눈 질환 ; 뇌성허혈(예를 들어, 신경변성에 원인이 될 수 있는 외상, 간질, 출혈 또는 발작으로 인한 뇌손상을 포함하나 이에 한정되지는 않음)을 포함하나 이에 한정되지 않는 국소빈혈 ; 가와사키병 ; 학습 장애 ; 폐 질환(급성 호흡 곤란 증후군 또는 ARDS 를 포함하나 이에 한정되지는 않음) ; 다발성 경화증 ; 근증(예를 들어, 패혈증의 근육 단백질 대사를 포함하나 이에 한정되지는 않는 근육 단백질 대사) ; 신경독성(HIV 에 의해 유도되는 증상을 포함하나 이에 한정되지는 않음) ; 골다공증 ; 암 - 관련 동통을 포함하나 이에 한정되지는 않는 동통 ; 파킨슨병 ; 친근막 질환 ; 조기 분만 ; 건선 ; 재관류 손상 ; 패혈증성쇽 ; 방사선 치료의 부작용 ; 측두 하학골 관절 질환 ; 수면 장애 ; 포도막염 ; 및 예를 들어 균주, 염좌, 연골 손상, 외상, 정형외과 수술, 감염 또는 다른 질환 과정으로 야기되는 염증 증상.
특정 실시형태에서, IL-1 저해제는 IL-1 에 대한 세포성 수용체의 활성을 특이적으로 막을 수 있는 어떤 단백질 또는 분자일 수 있으며, 이들은 수많은 메카니즘으로부터 야기될 수 있다. 메카니즘의 예로는 다음을 포함하나 이에 한정되지는 않는다 : IL-1 생산 하향조절 ; IL-1 결합 유리 ; IL-1 수용체에 IL-1 의 결합을 방해 ; IL-1 수용 복합체의 형성을 방해(즉, IL-1 수용체와 IL-1 수용 보조 단백질의 결합) ; 및 IL-1 수용체에 결합한 후 IL-1 신호전달(signaling)의 조절을 방해.
특정 인터루킨 - 1 저해제는 Kineret™, 아나킨라, IL-1ra, IL-1ra 변이체 및 IL-1ra 유도체를 포함하나 이에 한정되지는 않는 IL-1 수용체 길항물질을 포함하나 이에 한정되지는 않으며, 이들 모두를 "IL-1ra 단백질" 로 명명한다 : 항 - IL - 1 수용체 모노클로날 항체(본원에서 참고문헌으로 인용한 예를 들어, 제 EP 623674 호를 참조) ; 가용성 IL-1 수용체를 포함하나 이에 한정되지 않는 IL-1 결합 단백질(본원에서 참고문헌으로 인용한 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5 492 888 호, 미국 특허 번호 제 5 488 032 호 및 미국 특허 번호 제 5 464 937 호, 미국 특허 번호 제 5 319 071 및 미국 특허 번호 제 5 180 812 호를 참조) ; 항 - IL - 1 모노클로날 항체(본원에서 참고문헌으로 인용한 제 WO 9501997 호, 제 WO 9402627 호, 제 WO 9006371 호, 미국 특허 번호 제 4 935 343 호, 제 EP 364778 호, 제 EP 267611 호 및 제 EP 220063 호를 참조) ; IL-1 수용 보조 단백질 및 이의 항체(본원에서 참고문헌으로 인용한 제 WO 96/23067 호 및 제 WO 99/37773 호 참조) ; IL-1β 의 생산 및 분비를 저해하기 위해 사용될 수 있는 인터루킨 - 1β 전환 효소(ICE :interleukin-1 beta converting enzyme) 또는 케스파제 Ⅰ 의 저해제(본원에서 참고문헌으로 인용한 제 WO 99/46248 호, 제 WO 99/47545 호 및 제 WO 99/47154 호를 참조) ; 인터루킨 - 1β 단백질분해효소 저해제 ; 및 생체 내에서 IL-1 의 생성 또는 IL-1 의 세포외 방출을 막는 다른 화합물 및 단백질.
IL-1 저해제의 예들은 다음에 나타나 있다 : 예를 들어 미국 특허 번호 제 5,747,444 호 ; 제 5,359,032 호 ; 제 5,608,035 호 ; 제 5,843,905 호 ; 제 5,359,032 호 ; 제 5,866,576 호 ; 제 5,869,660 호 ; 제 5,869,315 호 ; 제 5,872,095 호 ; 제 5,955,480 호 ; 제 5,965,564 호 ; 국제(WO) 특허 출원 제 98/21957 호, 제 96/09323 호, 제 91/17184 호, 제 96/40907 호, 제 98/32733 호, 제 98/42325 호, 제 98/44940 호, 제 98/47892 호, 제 98/56377 호, 제 99/03837 호, 제 99/06426 호, 제 99/06042 호, 제 91/17249 호, 제 98/32733 호, 제 98/17661 호, 제 97/08174 호, 제 95/34326 호, 제 99/36426 호, 제 99/36415 호 ;. 유럽(EP) 특허 출원 제 534978 호 및 제 894795 호 ; 및 프랑스 특허 출원 제 FR 2762514 호를 참조. 앞서 기술된 참고문헌 전부가 본 명세서에 참고문헌으로 인용되었다.
인터루킨 - 1 수용체 길항물질(IL-1ra : interleukin-1 receptor antagonist)은 인터루킨 - 1 의 천연 저해제로서 작용하는 인체 단백질이며 IL-1α 및 IL-1β 을 포함한 IL-1 과의 요소이다. 특정 수용체 길항물질은 이들을 만드는 방법 및 사용하는 방법 뿐만 아니라 IL-1ra 와 이들의 변이체 및 유도체를 포함하며, 이는 본원에서 참고문헌으로 인용한 다음에 기재되어 있다 : 미국 특허 번호 제 5,075,222 호 ; 제 WO 91/08285 호 ; 제 WO 91/17184 호 ; 제 AU 9173636 호 ; 제 WO 92/16221 호 ; 제 WO 93/21946 호 ; 제 WO 94/06457 호 ; 제 WO 94/21275 호 ; 제 FR 2706772 호 ; 제 WO 94/21235 호 ; 제 DE 4219626 호, 제 WO 94/20517 호 ; 제 WO 96/22793 호 ; 제 WO 97/28828 호 ; 및 제 WO 99/36541 호를 참조. 특정 실시형태에서, IL-1 수용체 길항물질을 글리코실화했다. 특정 실시형태에서, IL-1 수용체 길항물질을 비 - 글리코실화했다.
IL-1ra 의 3 가지 형태 및 이들의 유도체는 미국 특허 제 5 075 222 호('222 특허)에 기재되어 있다. '222 특허에서 "IL-1i" 로 불리는 첫번째 형태는 약 4.8 의 등전점을 갖는 SDS-PAGE 상에서 22-23 kD 분자로 규정하며, 이를 pH 7.6 의 트리스 완충용액의 52 mM NaCl 부근에서 Mono Q FPLC 컬럼으로 용출한다. 두번째 형태인 IL-1raβ 는, 22-23kD 단백질로 규정하며, 이를 48 mM NaCl 에서 Mono Q 컬럼으로부터 용출한다. IL-1raα 및 IL-1raβ 둘 다를 글리코실화하였다. 세번째 형태인 IL-1rax 는 20 kD 단백질로 규정하며, 이를 48 mM NaCl 의 Mono Q 컬럼으로부터 용출하고 비 - 글리코실화하였다. 또한 '222 특허에서는 저해제를 코드하는 유전자를 분리하는 방법, 적절한 벡터 내 이들 유전자를 클로닝하는 방법, 이들 유전자를 특정 세포형에 형질전환하며 트렉스펙션하는 방법 및 저해제를 생성하기 위해 이들 유전자를 발현시키는 방법들을 기술하고 있다.
특정 실시형태에서, 결실, 삽입 및/또는 치환(각각 또는 모두를 "변이체(류)" 로 나타냈음)은 IL-1ra 의 아미노산 서열 내에서 만들어진다. 특정 실시형태에서, IL-1ra 변이체는 생물학적 활성을 갖는다(예를 들어, 저해제 IL-1 에 결합할 수 있는 진행 능력).
특정 실시형태에서, 본 발명은 OPGL 에 결합하는 항체 및 하나 또는 그 이상의 TNFα 저해제를 포함하는 치료 요법 및 이러한 치료 요법을 이용한 치료 방법과 관련이 있다. 특정 실시형태에서, 치료 요법은 OPGL 에 결합하는 항체와 TNFα 저해제 및 본원에 기술된 하나 또는 그 이상의 부가적인 분자를 포함한다.
특정 질환 및 의학적 증상은 TNF 로 매개되며, 염증 증상으로 분류될 것이다. 본원에 사용된 것처럼, "TNF - 매개 질환" 은 체액 또는 조직 및/또는 배지에서 상승된 수치의 TNF 를 생산하는 체(body)로부터 얻은 세포 또는 조직에서 상승된 수치의 TNF 와 관련이 있는 질환 및 의학적 증상을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시형태에서, 만약 (1) 질환 또는 의학적 증상과 관련된 병리학적 발견물이 TNF 를 투여하거나 또는 TNF 의 발현을 상향조절 함으로써 동물에서 실험적으로 모사할 수 있다면/있거나 (2) 질환 또는 의학적 증상의 실험 동물 모델에서 유도되는 병상을 TNF 의 활동을 저해하는 치료제로 저해할 수 있거나 또는 막을 수 있다면, 질환은 TNF - 매개 질환이다.
특정의 급성 및 만성 TNF-매개 질환은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 악액질 및 식욕부진 ; 백혈병을 포함하나 이에 한정되지 않는 암 ; 만성 피로증후군 ; 울혈성심부전, 관상재발협착증, 심근경색, 심근기능부전(패혈증에 관련된 증상 등을 포함하나 이에 한정되지 않음) 및 관상동맥회로조성술을 포함하나 이에 한정되지 않는 관상 증상 및/또는 징후 ; 우울증 ; 제 1 형 연소성당뇨병, 진성당뇨병 및 인슐린내성(비만증과 관련된 인슐린내성을 포함하나 이에 한정되지 않음)을 포함하나 이에 한정되지 않는 당뇨병 ; 자궁내막증, 자궁내막염 및 관련 증상 ; 섬유근육통 및 무통각증 ; 이식편대숙주거부반응 ; 통각과민 ; 크론병 및 클로스트리듐 다이피셀 - 관련 설사를 포함하나 이에 한정되지 않는 염증성장질환 ; 외상, 간질, 출혈 및 발작으로 인한 뇌손상을 포함하나 이에 한정되지 않는 대뇌국소빈혈을 포함하나 이에 한정되지 않는 국소빈혈 ; 성인성호흡곤란증후군, 천식 및 폐섬유증을 포함하나 이에 한정되지 않는 폐질환 ; 다발성경화증 ; 신경염증성질환(neuroinflammatory disease) ; 각막이식, 안변성(ocular degeneration) 및 포도막염을 포함하나 이에 한정되지 않는 안질환 및 증상 ; 암 - 관련 동통을 포함하나 이에 한정되지 않는 동통 ; 췌장염 ; 치주질환 ; 모공성홍색비강진(PRP : Pityriasis rubra pilaris) ; 박테리아성 및 비 - 박테리아성 전립선염을 포함하는 전립선염 및 관련 증상 ; 건선 및 관련 증상 ; 폐섬유증 ; 재관류 손상 ; 류마티스성관절염, 골관절염, 연소성관절염(연소성류마티스성관절염을 포함하나 이에 한정되지 않음), 혈청반응음성 다발성관절염, 강직성척추염, 라이터증후군 및 반응성관절염, 스틸병, 건선성관절염, 장병증성관절염(enteropathic arthritis), 다발성근염, 피부근염, 공피증, 전신성경화증, 맥관염(예를 들어, 가와사키병), 대뇌맥관염(cerebralvasculitis), 라임병, 포도상구균 - 유도("패혈성")관절염, 쇼그렌증후군, 류마티스열, 다연골염 및 류마티스성다발성근육통 및 거대세포 관절염을 포함하나 이에 한정되지 않는 류마티스성질환 ; 패혈쇽 ; 방사선 치료로 인한 부작용 ; 전신성홍반성루푸스(SLE : systemic lupus erythematous) ; 측두 하악골 관절질환(temporal mandibular joint disease) ; 갑상선염 ; 및 균주, 염좌, 연골 손상, 외상, 정형외과수술, 감염(예를 들어, HIV, 클로스트리듐 다이피셀 및 관련 종)또는 다른 질환 진행 등에 의한 조직 이식 및/또는 염증성 증상.
특정 실시형태에서, TNF 저해제는 TNF 생산의 하향조절 또는 저해, 유리 TNF 와의 결합, TNF 수용체에 대한 TNF 결합의 방해 및 TNF 수용체에 결합한 후 TNF 신호전달의 조절을 방해하는 작용 중 적어도 하나를 수행할 수 있다. "TNF 저해제"란 용어는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 제 Ⅰ 형 가용성 종양괴사인자 수용체(sTNF-RI ; p55 수용체라고도 명명함), 제 Ⅱ 형 가용성 종양괴사인자 수용체(p75 수용체라고도 명명됨) 및 Enbrel™, 에탄에르셉트를 포함하나 이에 한정되지 않는 가용화된 TNF 수용체 ; Remicade™, 인플릭시맵 및 D2E7(예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,090,382 호 및 제 6,258,562 호 참조)을 포함하나 이에 한정되지 않는 TNF 에 결합하는 항체 ; TNF 수용체에 결합하는 항체 ; sTNF-RI(예를 들어, 제 WO 98/24463 호 참조), 에탄에르셉트(Enbrel™), Avakine™ ; TNF-α 전환효소(TACE : TNF-α converting enzyme)의 저해제 ; 및 TNF 활성도에 영향을 끼치는 다른 분자.
전형적인 TNF-α 저해제는 다음과 같은 참고문헌에 기재되어 있다 : 유럽 특허 출원 제 EP 308 378 호 ; 제 EP 422 339 호 ; 제 EP 393 438 호 ; 제 EP 398 327 호 ; 제 EP 412 486 호 ; 제 EP 418 014 호 ; 제 EP 417 563 호 ; 제 EP 433 900 호 ; 제 EP 464 533 호 ; 제 EP 512 528 호 ; 제 EP 526 905 호 ; 제 EP 568 928 호 ; 제 EP 607 776 호[TNF-α 저해에 대한 레플루노마이드의 용도가 기재되어 있음] ; 제 EP 663 210 호 ; 제 EP 542 795 호 ; 제 EP 818 439 호 ; 제 EP 664 128 호 ; 제 EP 542 795 호 ; 제 EP 741 707 호 ; 제 EP 874 819 호 ; 제 EP 882 714 호 ; 제 EP 880 970 호 ; 제 EP 648 783 호 ; 제 EP 731 791 호 ; 제 EP 895 988 호 ; 제 EP 550 376 호 ; 제 EP 882 714 호 ; 제 EP 853 083 호 ; 제 EP 550 376 호 ; 제 EP 943 616 호 ; 제 EP 939 121 호 ; 제 EP 614 984 호 ; 제 EP 853 083 호 ; 미국 특허 번호 제 5,136,021 호 ; 제 5,929,117 호 ; 제 5,948,638 호 ; 제 5,807,862 호 ; 제 5,695,953 호 ; 제 5,834,435 호 ; 제 5,817,822 호 ; 제 5830742 호 ; 제 5,834,435 호 ; 제 5,851,556 호 ; 제 5,853,977 호 ; 제 5,359,037 호 ; 제 5,512,544 호 ; 제 5,695,953 호 ; 제 5,811,261 호 ; 제 5,633,145 호 ; 제 5,863,926 호 ; 제 5,866,616 호 ; 제 5,641,673 호 ; 제 5,869,677 호 ; 제 5,869,511 호 ; 제 5,872,146 호 ; 제 5,854,003 호 ; 제 5,856,161 호 ; 제 5,877,222 호 ; 제 5,877,200 호 ; 제 5,877,151 호 ; 제 5,886,010 호 ; 제 5,869,660 호 ; 제 5,859,207 호 ; 제 5,891,883 호 ; 제 5,877,180 호 ; 제 5,955,480 호 ; 제 5,955,476 호 ; 제 5,955,435 호 ; 제 5,994,351 호 ; 제 5,990,119 호 ; 제 5,952,320 호 ; 제 5,962,481 호 ; 국제 특허 출원 제 WO 90/13575 호, 제 WO 91/03553 호, 제 WO 92/01002 호, 제 WO 92/13095 호, 제 WO 92/16221 호, 제 WO 93/07863 호, 제 WO 93/21946 호, 제 WO 93/19777 호, 제 WO 95/34326 호, 제 WO 96/28546 호 , 제 WO 98/27298 호, 제 WO 98/30541 호, 제 WO 96/38150 호, 제 WO 96/38150 호, 제 WO 97/18207 호, 제 WO 97/15561 호, 제 WO 97/12902 호, 제 WO 96/25861 호, 제 WO 96/12735 호, 제 WO 96/11209, 제 WO 98/39326 호, 제 WO 98/39316 호, 제 WO 98/38859 호, 제 WO 98/39315 호, 제 WO 98/42659 호, 제 WO 98/39329 호, 제 WO 98/43959 호, 제 WO 98/45268 호, 제 WO 98/47863 호, 제 WO 96/33172 호, 제 WO 96/20926 호, 제 WO 97/37974 호, 제 WO 97/37973 호, 제 WO 97/47599 호, 제 WO 96/35711 호, 제 WO 98/51665 호, 제 WO 98/43946 호, 제 WO 95/04045 호, 제 WO 98/56377 호, 제 WO 97/12244 호, 제 WO 99/00364 호, 제 WO 99/00363 호, 제 WO 98/57936 호, 제 WO 99/01449 호, 제 WO 99/01139 호, 제 WO 98/56788 호, 제 WO 98/56756 호, 제 WO 98/53842 호, 제 WO 98/52948 호, 제 WO 98/52937 호, 제 WO 99/02510 호, 제 WO 97/43250 호, 제 WO 99/06410 호, 제 WO 99/06042 호, 제 WO 99/09022 호, 제 WO 99/08688 호, 제 WO 99/07679 호, 제 WO 99/09965 호, 제 WO 99/07704 호, 제 WO 99/06041 호, 제 WO 99/37818 호, 제 WO 99/37625 호, 제 WO 97/11668 호, 제 WO 99/50238 호, 제 WO 99/47672 호, 제 WO 99/48491 호, 일본 특허 출원 제 10147531 호, 제 10231285 호, 제 10259140 호 ; 및 제 10130149 호, 제 10316570 호, 제 11001481 호 및 제 127,800/1991 호 ; 독일 출원 번호 제 19731521 호 ; 및 영국 출원 번호 제 2 218 101 호, 제 2 326 881 호, 제 2 246 569 호. 상기에 기재한 모든 참고문헌을 모든 목적을 위해 본원에서 참고문헌으로 인용하였다.
제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호에는 총괄적으로 "sTNFRs" 로 명명되는, 제 Ⅰ 형 가용성 TNF 수용체(sTNFR-Ⅰ 또는 30 kDa TNF 저해제로 공지되어 있음) 및 제 Ⅱ 형 가용성 TNF 수용체(sTNFR-Ⅱ 또는 40 kDa TNF 저해제로 공지되어 있음)의 아미노산 및 핵산 서열이 기재되어 있다. 또한 제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호에는 단편, 기능적 유도체 및 변이체를 포함하나 이에 한정되지 않는 sTNFR-Ⅰ 및 sTNFR-Ⅱ 의 변형된 형태가 기재되어 있다. 또한, 제 EP 393 438 호 및 제 EP 422 339 호에는 저해제를 코드하는 유전자를 분리하는 방법, 유전자를 적절한 벡터내로 클로닝하는 방법, 특정한 세포 유형으로 유전자를 형질전환시키거나 트랜스펙션하는 방법 및 저해제를 생산하기 위해 유전자를 발현시키는 방법도 기재되어 있다.
sTNFR-Ⅰ 및 sTNFR-Ⅱ 는 신경 성장인자 수용체(NGF : nerve growth factor receptor), B 세포 항원 CD40, 4-1BB, 랫 T - 세포 항원 MRC OX40, 파스(fas)항원 및 CD27 과 CD30 항원을 포함하는 신경 성장인자/수용체의 TNF 수용체 상과의 요소이다[Smith 등의 (1990) Science, 248 : 1019-1023 참조]. 세포 표면 수용체 그룹의 보존된 특징은 시스테인이 풍부한 세포외 리간드 결합 도메인으로, 이는 잘 보존된 위치에 4-6 개의 시스테인 잔기를 포함하는 약 40 개의 아미노산을 갖는 반복되는 4 개의 모티프로 나누어질 수 있다[Smith 등의 (1990) 상기문헌 참조].
제 EP 393 438 호에는 전장의 재조합 40 kDa TNF 저해제 단백질의 절두된 형태인 40 kDa TNF 저해제 △51 및 40 kDa TNF 저해제 △53 이 기재되어 있다. △51 및 △53 은 각각 51 또는 53 개의 아미노산을 가지며, 성숙한 단백질의 카르복시 말단에서 삭제된 것이다.
공개된 PCT 출원 번호 제 WO 98/01555 호에는 네 번째 도메인(sTNFR-Ⅰ 의 아미노산 잔기 Thr127-Asn161 및 sTNFR-Ⅱ 의 아미노산 잔기 Pro141-Thr179) ; 세 번째 도메인 부분(sTNFR-Ⅰ 의 아미노산 잔기 Ans111-Cys126 및 sTNFR-Ⅱ 의 아미노산 잔기 Pro123-Lys140)을 포함하지 않으며 ; 선택적으로 첫 번째 도메인(sTNFR-Ⅰ 의 아미노산 잔기 Asp1-Cys19 및 sTNFR-Ⅱ 의 아미노산 잔기 Leu1-Cys32)을 포함하지 않는 sTNFR-Ⅰ 및 sTNFR-Ⅱ 의 절두된 형태가 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 절두된 sTNFRs 는 화학식 R1-[Cys19-Cys103]-R2 및 R4-[Cys32-Cys115]-R5 로 나타낸 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 각각 sTNFR-Ⅰ 및 sTNFR-Ⅱ 의 절두된 형태이다.
본원에 사용되는 "R1-[Cys19-Cys103]-R2"는 하나 또는 그 이상의 단백질을 나타내며, 이 식에서 [Cys19-Cys103] 은 sTNFR-Ⅰ 의 잔기 19 내지 103 이며, 이 서열은 제 WO 98/01555 호의 도 1 에 기재되어 있고 ; R1 은 Cys19 의 메티오닐화되거나 비메티오닐화된 아민기 또는 Cys18 내지 Asp1 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 아미노 - 말단 아미노산 잔기이며 ; R2 는 Cys103 의 카르복시기 또는 Phe104 내지 Leu110 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 카르복시 - 말단 아미노산 잔기이다.
본 발명의 전형적인 절두된 sTNFR-Ⅰ's 는 메티오닐화되거나 비메티오닐화된 sTNFR-Ⅰ2.6D/C105, sTNFR-Ⅰ2.6D/C106, sTNFR-Ⅰ2.6D/N105, sTNFR-Ⅰ2.3D/d8, sTNFR-Ⅰ2.3D/d18, sTNFR-Ⅰ2.3D/d15 및 이의 변이체와 유도체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정의 전형적인 절두된 sTNFR-Ⅰ's 는 예를 들어, 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 98/015555 호에 기재되어 있다.
본원에 사용하는 "R3-[Cys32-Cys115]-R4" 는 하나 또는 그 이상의 단백질을 나타내며, 이 식에서 [Cys32-Cys115]는 sTNFR-Ⅱ 의 잔기 Cys32 내지 Cys115 이고, 이 서열은 제 WO 98/01555 호의 도 8 에 기재되어 있으며 ; R3 는 Cys32 의 메티오닐화되거나 비메티오닐화된 아민기 또는 Cys31 내지 Leu1 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 아미노 - 말단 아미노산 잔기이고 ; R4 는 Cys115 의 카르복시기 또는 Ala116 내지 Arg122 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 카르복시 - 말단 아미노산 잔기이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 OPGL 에 결합하는 항체 및 적어도 하나의 세린 단백질분해효소 저해제를 함유하는 치료제 및 이러한 치료제를 사용하여 치료하는 방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 치료제는 OPGL 에 결합하는 항체와 세린 단백질분해효소 저해제 및 본원에 기재된 적어도 하나의 부가적인 분자를 함유한다.
내인성 단백질분해효소는 더이상 필요하지 않거나 유용하지 않은 침입(invading) 유기체, 항원 - 항체 복합체 및 특정 조직 단백질을 분해할 수 있다. 감염제는 유기체로 부가적인 단백질분해효소를 유도할 수 있다. 단백질분해효소 저해제는 내인성 및 침입 단백질분해효소 둘 다를 조절할 수 있다.
특정 실시형태에서, 자연발생적인 단백질분해효소 저해제는 내인성 단백질분해효소의 작용을 국소적으로 및 일시적으로 억제하여 조절할 수 있다. 특정 실시형태에서, 단백질분해효소 저해제는 감염제에 의해 체내로 유도되는 단백질분해효소를 저해할 수 있다. 특정 예에서, 특히 단백질분해 공격 및 감염되기 쉬운, 기도의 조직을 포함하나 이에 한정되지 않는 조직에는 단백질분해효소 저해제가 풍부하다.
단백질분해효소 저해제는 대략 10 % 의 인체 혈장단백질을 포함한다. 적어도 8 개의 저해제가 이러한 원에서 분리되었고 문헌에 특징화되어 있다. 이는 α2 - 마크로글로불린(α2M), α1 - 단백질분해효소 저해제(α1PI), α1 - 항키모트립신(α1Achy), α1 - 항콜라게나제(α1AC) 및 인터 - α - 트립신 저해제(I-α-I : inter-alpha-trypsin inhibitor)을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
특정 예에서, 단백질분해효소/단백질분해효소 저해제 균형이 깨지게 되면 기종, 관절염, 치근막염, 근위축증, 종양 침입 및 다양한 다른 병리학적 증상을 포함하나 이에 한정되지 않는 단백질분해효소 - 매개 조직파괴가 유도될 수 있다. 예를 들어, 패혈증 또는 급성 백혈병과 같은 심각한 병리학적 진행 상태에서, 유리된 단백질분해효소의 양은 분비세포에서 방출되는 효소에 의해 증가될 것이다.
또한 특정 예에서, 유기체의 감소된 조절 저해제 능력은 단백질분해효소/단백질분해효소 저해제 균형을 변화시킬 수 있다. 조절 저해제 능력의 감소로 인한 비제한적 예로는 α1 - 단백질분해효소 저해제 결핍이 있으며, 이는 폐기종의 발병과 관계가 있다.
특정 예에서, 만약 단백질분해효소를 조절하기 위한 대책을 수득할 수 없다면 이러한 비정상적인 증상이 존재하는 경우 유기체에 대한 치명적인 손상이 발생할 수 있다. 따라서, 단백질분해효소 저해제는 단백질분해효소를 조절하기 위해 유기체에 투여할 수 있다고 여겨져왔다.
백혈구 엘라스틴분해효소, 트립신, 카텝신 G 및 췌장 엘라스틴분해효소는 세린 단백질분해효소로 공지되어 있는 단백질분해효소류의 비제한적인 예이다.
특정 예에서, 백혈구 엘라스틴분해효소가 세포외로 분비되는 경우, 백혈구 엘라스틴분해효소는 결합조직 및 다른 중요 단백질을 분해한다. 정상적으로 작용하는 유기체가 특정량의 결합조직 및 다른 단백질을 분해하는 반면에, 과량의 백혈구 엘라스틴분해효소는 기종 및 류마티스성관절염을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 병리학적 상태와 관계가 있다. 특정 실시형태에서, 백혈구 엘라스틴분해효소가 표준보다 과량으로 존재할 경우 백혈구 엘라스틴분해효소의 효과를 방해하기 위해, 백혈구 엘라스틴분해효소에 특이적인 단백질분해효소 저해제가 고려되었다. 이러한 단백질분해효소 저해제는 정제된 형태 및 약학적으로 유용하도록 유효량으로 분리되거나 제조되는 경우에 유용할 것이다.
특정의 백혈구 엘라스틴분해효소 저해제는 예를 들어, Schiessler 등의 "Acid-Stable Inhibitors of Granulocyte Neutral Proteases in Human Mucous Secretions : Biochemistry and Possible Biological Function", Neutral Proteases of Human Polymorphoneuclear Leucocytes, Havemann 등의 urban 및 Schwarzenberg, Inc.(1978) 및 Travis 및 Salvesen, Ann. Rev. Biochem. 52 : 655-709(1983)에 기재되어 있다.
특정 예에서, 트립신은 췌장염을 포함하나 이에 한정되지 않는 다양한 급성 증상 중에 췌장 조직과 같은 특정의 연기관조직(soft organ tissue)을 분해하기 시작한다. 트립신 저해제는 정제된 형태 및 약학적으로 유용한 유효량으로 분리되거나 제조되는 경우에 유용할 것이다.
카텝신 G 는 백혈구 내에 존재하는 다른 단백질분해효소이다. 특정 실시형태에서, 카텝신 G 는 상보적 경로의 단백질을 포함하는 생체내 다양한 단백질을 분해할 수 있다. 췌장 엘라스틴분해효소는 췌장염에 작용할 수 있는 또다른 단백질분해효소이다. 따라서, 이러한 단백질분해효소에 대한 저해제는 또한 약학적으로 가치가 있다.
특정 실시형태에서, 세린 단백질분해효소의 상이한 저해제에 대한 기질 특이성 및 감수성은 오직 다수의 아미노산 잔기에서의 변화에 의해 야기될 수 있다고 여겨진다. 유추에 의하여, 상대적으로 다수의 아미노산이 변화된 세린 단백질분해효소 저해제류가 상이한 단백질분해효소를 저해할 것이라고 여기는 것이 가능해질 것이다. 특정 실시형태에서, 이러한 부류의 요소는 모든 세린 단백질분해효소를 저해한다.
전형적인 세린 단백질분해효소 저해제는 분비성 백혈구 단백질분해효소 저해제(SLPI : secretory leukocyte protease inhibitor) 및 이의 단편 및 유사체이다. 전형적인 세린 단백질분해효소 저해제는 항 - 루코프로테아제(ALP : anti-leukoprotease), 점액성 단백질분해효소 저해제(MPI : mucous protease inhibitor), 인체 정장 저해제 - I(HUSI-I : human seminal plasma inhibitor-I), 기관지 점액 저해제(BMI : bronchial mucus inhibitor) 및 경부 점액 저해제(CUSI : cervical mucus inhibitor)를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 세린 단백질분해효소 저해제는 또한 LPS 조절인자일 수 있다[예를 들어, Jin 등의 (1997) cell 88(3) : 417-26 참조]. 특정 실시형태에서, 이러한 분자는 바람직하게 연골에 특이적이므로 골손실을 야기시키는 증상에 사용하는데 매우 적합하다.
전형적인 세린 단백질분해효소 저해제는 예를 들어, 미국 특허 번호 제 4,760,130 호 ; 미국 특허 번호 제 5,900,400 호 ; 및 미국 특허 번호 제 5,633,227 호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해 본원에서 참고문헌으로 인용하였다. 상기 참고문헌에 기재되어 있는 분자 뿐만 아니라 이의 모든 변이체 또는 유사체는 총괄적으로 "세린 단백질분해효소 저해제" 라 명명한다.
IL-18 은 인터페론 - γ 를 유도한다고 발견되었으며 이미 인터페론 γ 유도 인자(IGIF : interferon gamma inducing factor)로 명명된 프로 - 면역성 시토킨이다. 특정 예로서, IL-1 은 IL-18 생산을 상향조절함이 알려져 있으며, IL-18 은 IL-16 및 MMP-1 을 포함하는 다량의 프로면역성 시토킨을 유도한다. 예를 들어, Dinarello 등의 (1998) J.Leukocyte Biol. 63 : 658-64 를 참조하라. 특정 예에서, 카스페이즈 Ⅰ(caspase Ⅰ)은 IL-18 생산에 중요하다. 또한, 실험은 TNF-α 가 IL-18 생산을 조절하고 TNF-α 및 IL-18 의 동시억제가 간 독성을 보호함을 제안한다. 예를 들어, Faggioni 등의 (2000) PNAS 97 : 2367-72 를 참조하라.
IL-18 은 IL-1 계의 수용체 시스템 회상(receptor system reminiscent)을 통해 생체외에서 작용한다. IL-18 은 보조 단백질(IL-18RAcP)과 상호작용하는 세포 표면 수용체(IL-18R)와 상호작용한다. IL - 18 - 매개 신호전달은 IL-18, IL-18R 및 IL-18RAcP 의 복합체를 형성한다. IL-18 에 대한 천연 저해제는 IL-18bp 이다. 특정 실시형태에서, IL-18bp 는 IL-18 분자에 결합하고 IL-18R 과의 상호작용을 방해함으로써 "데코이 수용체(decoy receptor)" 로서 작용한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 OPGL 에 결합하는 항체 및 적어도 하나의 IL-18 저해제를 함유하는 치료제 및 이러한 치료제를 이용한 치료방법에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 치료제는 OPGL 에 결합하는 항체와 IL-18 저해제 및 본원에 기재되어 있는 적어도 하나의 부가적인 분자를 함유한다. 특정 실시형태에 따라 치료될 수 있는 전형적인 증상은 염증, 자가면역질환, IL-1 매개 질환 및 TNF - 매개 질환을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에 따라 OPGL 에 결합하는 항체 및 적어도 하나의 IL-18 저해제로 치료할 수 있는 전형적인 증상은 류마티스성관절염을 포함하나 이에 한정되지 않는 관절염 ; 전신성홍반성루푸스(SLE) ; 이식편대숙주질환(GvHD : graft versus host disease) ; 간염 ; 패혈증 ; 및 이러한 질환과 동반되는 골과 연골의 손실을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
전형적인 IL-18 저해제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : IL-18 에 결합하는 항체 ; IL-18R 에 결합하는 항체 ; IL-18RAcP 에 결합하는 항체 ; IL-18bp ; IL-18R 단편(예를 들어, IL-18 수용체의 가용화된 세포외 도메인) ; IL-18 에 결합하고 IL-18R 과의 상호작용을 감소시키거나 방해하는 펩티드 ; IL-18R 에 결합하고 IL-18 또는 IL-18RAcP 와의 상호작용을 감소시키거나 방해하는 펩티드 ; IL-18RAcP 에 결합하고 IL-18R 과의 상효작용을 감소시키거나 방해하는 펩티드 ; 및 IL-18 생산 또는 IL-18, IL-18R 및 IL-18RAcP 와의 상호작용을 감소시키거나 방해하는 작은 분자.
특정의 IL-18 저해제는 다음의 문헌에 기재되어 있다 : 1994 년 7 월 14 일자로 공고된 미국 특허 번호 제 5,912,324 호 ; 1999 년 12 월 8 일자로 공개된 제 EP 0 962 531 호 ; 1994 년 11 월 15 일자로 공개된 제 EP 712 931 호 ; 1994 년 7 월 14 일자로 공고된 미국 특허 번호 제 5,914,253 호 ; 1997 년 7 월 10 일자로 공개된 제 WO 97/24441 호 ; 2000 년 5 월 9 일자로 공고된 미국 특허 번호 제 6,060,283 호 ; 1996 년 12 월 26 일자로 공개된 제 EP 850 952 호 ; 1998 년 9 월 16 일자로 공개된 제 EP 864 585 호 ; 1998 년 9 월 24 일자로 공개된 제 WO 98/41232 호 ; 2000 년 4 월 25 일자로 공고된 미국 특허 번호 제 6,054,487 호 ; 1997 년 8 월 14 일자로 공개된 제 WO 99/09063 호 ; 1997 년 11 월 3 일자로 공개된 제 WO 99/22760 호 ; 1998 년 1 월 23 일자로 공개된 제 WO 99/37772 호 ; 1998 년 3 월 20 일자로 공개된 제 WO 99/37773 호 ; 2000 년 1 월 26 일자로 공개된 제 EP 0 974 600 호 ; 2000 년 3 월 9 일자로 공개된 제 WO 00/12555 호 ; 1997 년 10 월 31 일자로 공개된 일본 특허 출원 제 JP 111,399/94 호 ; 1998 년 2 월 8 일자로 공개된 이스라엘 특허 출원 제 IL 121554 AO 호(상기 문헌은 모든 목적을 위해 본원에서 참고문헌으로 인용됨).
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 적어도 하나의 염증용 치료제로 사용할 수 있다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 적어도 하나의 면역 장애용 치료제로 사용할 수 있다. 전형적인 염증 및 면역 장애용 치료제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 프레드니솔론을 포함하나 이에 한정되지 않는 부신피질호르몬 ; 제 1 형 사이클로옥시게나제(COX-1) 및 제 2 형 사이클로옥시게나제(COX-2) 저해제를 포함하나 이에 한정되지 않는 비스테로이달 항 - 염증성 약물(NSAIDs) ; 메토트랙사이트, 히드록시클로로퀸, 클로로퀸, 사이클로스포린, 금 화합물(예를 들어, 아우라노핀, 아우로피오말레이트 및 아우로티오글루코스) 및 레플루노마이드를 포함하나 이에 한정되지 않는 질환 변형 항류마티스성 약물(DMARDs : disease modifying antirheumatic drug) ; 롤리프램 및 펜톡시필린을 포함하나 이에 한정되지 않는 제 Ⅳ 형 포스포디에스터라제 저해제 ; 타크롤리무스(FK-506) ; 시로리무스(라파마이신) ; 마이코페놀산 ; 질루톤을 포함하나 이에 한정되지 않는 5 - 리폭시게나제 저해제 ; 인터루킨 - 6(IL-6)의 조절인자 ; 38 kDa 미오겐 - 활성 단백질 키나제(p38-MAPK)의 작은 분자 조절인자 ; 염증 경로와 관련된 세포내 분자의 작은 분자 조절인자(세포내 분자는 jnk, IKK, NF-kB, ZAP70 및 Ick 를 포함하나 이에 한정되지 않음). 특정의 전형적인 염증용 치료제는 캘리포니아 사우전드 오크스에 소재하는 암젠 인코포레이티드의 C.A. Dinarello 및 L.L. Moldawer Proinflammatory and Anti-Inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis : A Primer for Clnicians Third Edition (2001) 에 기재되어 있다. 특정의 전형적인 염증 및 자가면역질환용 치료제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 인터페론 - γ(IFN-γ) 조절인자 ; OX40/OX40L(OX40 의 가용성 형태 포함)의 조절인자 ; 4-1BB/4-1BB 리간드(4-1BB 의 가용성 형태 포함)의 조절인자 ; 및 수용체 리간드 쌍인 CD28/B7, CD40/CD40L, ICOS/B7RR1 및 AGP-3/TACI/BAFFR(TACI 및 BAFFR 수용체 둘 다에 결합하는 AGP-3)의 조절인자를 포함하나 이에 한정되지 않는 B 세포 - T 세포 공동경로의 조절인자. B 세포 - T 세포 공동경로의 조절인자는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : CD28, B7.1 및 B7.2(B7.1 또는 B7.2 의 가용성 형태 및 CTLA4 의 가용성 형태를 포함하며, 둘 다 분해를 감소시키거나 방해하고/하거나 반감기를 증가시키고 독성을 감소시키며 면역원성을 감소시키거나 또는 가용성을 증가시키거나 반감기를 순환시킴으로써 치료학적 단백질의 생물학적 활성도를 증가시킬 수 있는 이종 펩티드 또는 단백질에 융합될 수 있음) ; CD40 및 CD40L(이종 펩티드 또는 단백질에 융합될 수 있는 CD40 의 가용성 형태 포함)의 저해제 ; ICOS 및 B7RP1(이종 펩티드 또는 단백질에 융합될 수 있는 ICOS 의 가용성 형태 포함)의 저해제 및 AGP-3, TACI 및 BAFFR(TACI 및 BAFFR 의 가용성 형태 포함)의 저해제. ICOS, B7RP1 및 이의 저해제는 예를 들어, 제 WO 00/47740 호, 제 WO 01/85872 호, 제 WO 02/15273 호, 제 WO 98/39361 호 및 von Bulow 및 Bram (1997) Science 278 : 138-140 에 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 악성종양 또는 전이종양에 의해 야기되는 골용해성 침착에 의한 골손실을 포함하나 이에 한정되지 않는 골손실을 치료하는데 사용한다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 암 관련 골손실을 치료하는데 사용할 수 있다. 전형적인 암은 유방암, 전립선암, 갑상선암, 신장암, 폐암, 식도암, 직장암, 방광암, 자궁경부암, 난소암 및 간암 뿐만 아니라 위장관암을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 예를 들어, 호지킨병을 포함하는 다발성골수종 및 림프종을 포함하나 이에 한정되지 않는 특정 혈액악성종양과 관련된 골손실을 치료하는데 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 단독으로 투여한다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 적어도 하나의 다른 암 치료제를 포함하나 이에 한정되지 않는 적어도 하나의 다른 치료제와 함께 투여한다. 전형적인 암 치료제는 방사선요법 및 화학요법을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에서, 화학요법은 다음 중에서 선택한 하나 또는 그 이상의 것과 함께 치료하는 것을 포함한다 : 안트라사이클린, 탁솔, 타목시펜, 독소루비신, 5 - 플루오로우라실 및 본 분야에 공지되어 있는 다른 약물. 특정 실시형태에서, 암 치료제는 황체형성호르몬 - 방출호르몬(LHRH : Luteinizing hormome-releasing hormome) 길항물질이다. 특정 실시형태에서, LHRH 길항물질은 펩티드 길항물질이다.
특정 실시형태에서, LHRH 길항물질은 다음의 펩티드를 포함한다 : Ac-D-Nal-4-Cl-Phe-D-Pal-Ser-N-Me-Tyr-D-Asn-Leu-Lys(iPr)-Pro-D-Ala-NH2(SEQ ID NO : 20). 여기에서 Nal 은 3 - (2 - 나프틸)알라닐이고 ; 4-Cl-Phe 는 (4' - 클로로페닐)알라닐이며 ; Pal 은 3 - (3' - 피리딜)알라닐이고 ; Lys(iPr) 은 N - 엡실론 - 2 - 프로필 - 리시닐이다.
특정 실시형태에서, LHRH 길항물질은 LHRH 길항물질 데카펩티드이다. 특정의 전형적인 데카펩티드는 예를 들어, 모든 목적을 위해 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 번호 제 5,843,901 호에 기재되어 있다.
특정 실시형태에 따른 전형적인 치료학적 항체는 항체 라이브러리를 스크리닝하여 선택한 마우스 항체, 마우스 - 인체 키메라 항체, CDR - 이식 항체, 인체화된 항체와 완전 인체 항체 및 합성 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 전형적인 항체는 세포 표면 단백질 Her2, CDC20, CDC33, 뮤신 - 유사 당단백질 및 종양 세포 상에 존재하는 표피성장인자 수용체(EGFR : epidermal growth factor receptor)에 결합하고 선택적으로 이러한 단백질을 나타내는 종양 세포에 대한 세포증식억제 효과 및/또는 세포독성 효과를 유도하는 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 전형적인 항체는 유방암 및 다른 유형의 암을 치료하는데 사용할 수 있는 HERCEPTIN™(트라스투주맵 : trastuzumap) 및 RITUXAN™(리툭시맵), ZEVALIN™(아이브리투모맵 티욱세탄 : ibritumomab tiuxetan) 및 비 - 호지킨 림프종 및 다른 유형의 암을 치료하는데 사용할 수 있는 LYMPHOCIDE™(에프라투주맵 : epratuzumab)을 포함한다. 특정의 전형적인 항체는 또한 ERBITUX™(IMC-C225), BEXXAR™(요오드 - 31 토시투모맵) 및 캠파스(Campath)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 암 치료제는 TNF - 관련 폴리펩티드 TRAIL 을 포함하나 이에 한정되지 않는, 종양 세포 내에서 선택적으로 세포소멸을 유도하는 폴리펩티드이다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 암 치료제로 치료하기 전에, 동시에 및 직후에 적어도 한 번 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 전이로 인한 골손실의 현존하는 증상을 치료하기 위해 투여할 수 있다.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 다발성골수종과 관련된 골손실을 예방 및/또는 치료하는데 사용하거나/하고 상기 질환 그 자체를 예방 및/또는 치료하는데 사용할 수 있다. 다발성골수종은 심각한 이환율 및/또는 사망율을 야기시킬 수 있는 B 세포 유도 종양이다. 특정 예에서, 다발성골수종의 임상적 증상은 국소화된 영역에서 증가된 파골세포 활성에 기인한 병소 골손실이다. 골수종을 앓고 있는 다수의 환자들은 방사선 분석으로 알 수 있는 골병변을 수반하며 골격 동통도 앓고 있다. 특정 예에서, 골수종을 앓고 있는 환자는 자발적으로 또는 손상으로 인해 발생할 수 있는, 병리학적 골절이 발병되기 쉽다. 특정 예에서, 골수종을 앓고 있는 동안 발생하는 골격 병변은 특히 척추극에서 골침착 뿐만 아니라 기형 및 때때로 신경 압박도 일으킨다. 몇몇 환자에서는, 혈청 칼슘이 병리학적으로 증가되고(과잉칼슘혈증), 이는 질환을 치료하는 도중에 심각한 문제를 야기시킬 수 있다. 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체는 골흡수 및 칼슘의 방출을 감소시키거나 차단하기 위해 환자에게 투여할 수 있으며, 이는 골절 및 척추 기형의 위험을 감소시킬 수 있다.
특정 예에서, 골수세포는 골침착에는 직접적으로 관여하지 않지만 파골세포 분화 및 활성화를 야기하는 세포외 시그널 생산에는 관여한다. 특정 예에서, 파골세포는 특히 활성화된 경우에 시토킨 IL-6 를 고농도로 생산한다. IL-6 는 B - 세포 성장인자이며, 마우스 및 인체 생체내 골수세포 성장에 기여한다. 골수세포는 또한 직접적으로 또는 간접적으로 OPGL 을 생산하며, 이는 골수강 내의 골수세포 주위에 국소적 골용해를 야기시킬 수 있다. 특정 예에서, 골수세포에 인접해 있는 정상적인 파골세포는 차례로 IL-6 을 생산하며, 이는 종양 세포의 국소적 팽창을 일으킬 수 있다. 골수세포는 클론 성형(clonal fashion) 시팽창되고 부적절한 골흡수에 의한 골강(bone space)을 점유할 수 있다.
설치류에 OPG 를 투여할 경우에는 파골세포 집단이 신속하게 사멸됨이 관찰되었다[예를 들어, Lacey 등의 (2000) Am. J. Pathol. 157 : 435-448 참조]. 파골세포의 수가 감소하면 증가된 IL-6 생산의 효과를 방해하여 소주골(trabecular bone) 내 골수세포의 성장 및 생존에 영향을 끼칠 수 있다. 따라서 특정 실시형태에서, 골수종을 앓고 있는 환자에게 OPGL 에 결합하는 항체를 투여하게 되면 과잉골흡수를 차단할 뿐만 아니라 종양 자체의 팽창 및 생존에 영향을 끼치게 된다.
B - 세포는 OPGL, ODAR 에 결합하는 수용체를 발현한다. 골수세포도 ODAR 을 발현하며, 또한 OPGL 을 생산할 수 있다. 특정 예에서, 동일한 세포 집단에서의 OPGL 및 ODAR 의 발현은 골수세포의 생존에 영향을 끼치는 자가분비자극을 일으킬 수 있다. 따라서 특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체를 투여하여 종양 세포 생존을 감소시켜 골수종을 앓고 있는 환자에게서 보여지는 종양을 감소시키거나 제거할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 약학적으로 용인가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 아쥬반트와 함께 OPGL 에 결합하는 치료학적 유효량의 항체를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 약학적으로 용인가능한 희석제, 담체, 가용화제, 유화제, 방부제 및/또는 아쥬반트와 함께 OPGL 에 결합하는 치료학적 유효량의 항체 및 치료학적 유효량의 적어도 하나의 부가적인 치료제를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료제는 다음 중에서 선택한 것이다. : BMP-1 내지 BMP-12 로 지정된 골형성인자 ; 형질전환 성장인자 - β(TGF - β) 및 TGF - β과의 요소 ; IL-1ra 및 이의 유도체 및 kineret™, 아나킨라를 포함하나 이에 한정되지 않는 인터루킨 - 1(IL-1) 저해제 ; 가용성 TNF α 수용체, Enbrel™, 에탄에르셉트, 항 - TNFα 항체, Remicade™, 인플릭시맵 및 D2E7 항체를 포함하나 이에 한정되지 않는 TNFα 저해제 ; 부갑상선 호르몬 및 이의 유사체, 부갑상선 호르몬 관련 단백질 및 이의 유사체 ; E 일련의 프로스타글란딘 ; 비스포스네이트(예를 들어, 알렌드론에이트 및 그외의 것) ; 불화물 및 칼슘과 같은 골 - 증강 무기질 ; Celebrex™, 셀레콕시브 및 Vioxx™, 로페콕시브와 같은 COX-2 저해제를 포함하는 비 - 스테로이달 항 - 염증성 약물(NSAIDs) ; 메토트랙사이트 또는 레플루노마이드와 같은 면역억압약 ; 분비성 백혈구 단백질분해효소 저해제(SLPI)와 같은 세린 단백질분해효소 저해제 ; IL-6 저해제(예를 들어, IL-6 에 결합하는 항체), IL-8 저해제(예를 들어, IL-8 에 결합하는 항체) ; IL-18 저해제(예를 들어, IL-18 결합 단백질 또는 IL-18 항체) ; 인터루킨 - 1 전환효소(ICE) 조절인자 ; 섬유모세포 성장인자 FGF-1 내지 FGF-10 및 FGF 조절인자 ; PAF 길항물질 ; 케라티노사이트 성장인자(KGF), KGF - 관련 분자 또는 KGF 조절인자 ; 기질 금속단백질분해효소(MMP) 조절인자 ; 유도성 NOS 의 조절인자를 포함하는 산화질소 생성효소(NOS) 조절인자 ; 당질코르티코이드 수용체의 조절인자 ; 글루탐산염 수용체의 조절인자 ; 지질다당류(LPS) 수치의 조절인자 ; 및 노르아드레날린 및 조절인자와 이의 유사체.
특정 실시형태에서, 용인가능한 제제 물질은 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 대해 비독성인 것이 바람직하다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 예를 들어, pH, 삼투몰농도, 점성, 정화도, 색, 등장성, 냄새, 무균상태, 안정성, 용해율 및 방출률, 흡착률 또는 투과율을 변형시키거나 유지하거나 또는 보존하기 위한 제제 물질을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적합한 제제 물질은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다 : 아미노산(예를 들어, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신) ; 항미생물제 ; 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 아황산나트륨 또는 황산수소나트륨) ; 완충용액(예를 들어, 붕산염, 중탄산염, 트리스 - HCl, 시트르산염, 인산염 또는 다른 유기산) ; 증강제(예를 들어, 만니톨 또는 글리신) ; 킬레이트제[에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA)] ; 착화제(예를 들어, 카페인, 폴리비닐피롤리돈, β- 사이크로덱스트린 또는 히드록시프로필 - β- 사이클로덱스트린) ; 충전제 ; 단당류 ; 이당류 ; 및 다른 당질(예를 들어, 글루코스, 만노스, 덱스트린) ; 단백질(예를 들어, 혈청 알부민, 겔라틴 또는 면역글로불린) ; 착색제, 향미료 또는 희석화제(diluting agent) ; 유화제 ; 친수성고분자(예를 들어, 폴리비닐피롤리돈) ; 저분자량 폴리펩티드 ; 염 - 형성 반대이온(예를 들어, 나트륨) ; 방부제(예를 들어, 염화벤잘코늄, 벤조산, 살리실산, 타이메로살, 펜에틸알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 또는 과산화수소) ; 용매(예를 들어, 글리세린, 프로필렌글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜) ; 당알콜(예를 들어, 만니톨 또는 소르비톨) ; 현탁화제 ; 계면활성제 또는 습윤제(예를 들어 플루로닉, PEG, 소르비탄에스테르, 폴리소르비탄 20, 폴리소르비탄 80 과 같은 폴리소르베이트, 트라이톤, 트로메타민, 레시틴, 콜레스테롤, 틸록사폴) ; 안정성 증강제(예를 들어, 수크로스 또는 소르비톨) ; 긴장도 증강제(알칼리 금속 할로겐화물, 바람직하게 나트륨 또는 염화칼륨, 만니톨 소르비톨) ; 수송 매개체 ; 희석제 ; 부형제 및/또는 약학적 아쥬반트. Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company(1990) 을 참조하라.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체 및/또는 치료학적 분자는 본 분야에 공지되어 있는 반감기 연장 매개체에 결합한다. 이러한 매개체는 Fc 도메인, 폴리에틸렌글리콜 및 덱스트란을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 매개체는 미국 출원 일련 번호 제 09/428,082 호 및 공개된 PCT 출원 번호 제 WO 99/25044 호에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 모든 목적을 위해 본원에서 참고문헌으로 인용한다.
특정 실시형태에서, 최적의 약학적 조성물은 예를 들어, 의도된 투여 경로, 수송 형태 및 요구되는 투여량에 따라 본 분야의 숙련자들에게 의해 투여될 것이다. 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기문헌을 참조하라. 특정 실시형태에서, 이러한 조성물은 본 발명의 항체에 관한 물리적 상태, 안정성, 생체내 방출률 및 생체외 청소율에 영향을 줄 수 있다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물 내의 제 1 매개체 또는 담체는 자연 상태에서 수성이거나 비수성일 수 있다. 특정 실시형태에서, 예를 들어, 적합한 매개체 또는 담체는 주사용 물, 생리식염수 또는 인공 뇌척수액일 수 있으며, 이는 비경구 투여용 조성물에서 다른 물질로 보충되는 것이 가능하다. 특정 실시형태에서, 중성의 완충식염수 또는 혈청 알부민과 혼합된 식염수도 또한 전형적인 매개체이다. 특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 약 pH 7.0-8.5 인 트리스 완충용액 또는 약 pH 4.0-5.5 인 아세트산 완충용액을 함유하며, 이는 또한 소르비톨 또는 적합한 이의 치환체를 포함할 수도 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, OPGL 에 결합하는 항체 함유 조성물은 바람직한 정도의 순도를 갖는 선택한 조성물과 임의의 제형화제(formulation agent)와 혼합하여(Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기문헌 참조), 동결건조된 케이크 또는 수용액 형태로 저장하기 위해 제조할 수 있다. 또한 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, OPGL 에 결합하는 항체 함유 조성물은 수크로스와 같은 적합한 부형제를 사용하여 동결건조된 상태로 제형화할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 수송용으로 선택할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물은 예를 들어, 경구적으로 소화관을 통해 흡입되거나 수송되도록 선택할 수 있다. 이러한 약학적으로 용인가능한 조성물 제제는 본 분야의 범주 내에 속한다.
특정 실시형태에서, 제제 성분은 투여하는 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 특정 실시형태에서, 완충용액은 생리 pH 또는 약간 낮은 pH, 전형적으로 약 5 내지 약 8 범위 내의 pH 로 조성물을 유지하는데 사용한다.
특정 실시형태에서, 비경구 투여가 고려되는 경우, 치료학적 조성물은 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, 약학적으로 용인가능한 매개체 내의 OPGL 에 결합하는 바람직한 항체를 함유하는 발열원이 유리된 비경구로 투여가능한 수용액 형태일 수 있다. 특정 실시형태에서, 비경구 주사용 매개체는 멸균증류수이며, 적어도 하나의 치료제가 존재하든 존재하지 않든, OPGL 에 결합하는 항체는 바람직하게 보존된 멸균 등장액으로 제형화된다. 특정 실시형태에서, 제제는 주사가능한 미소립자, 생 - 침식가능한(bio - erodible) 입자, 고분자 화합물[예를 들어, 폴리락트산(polylactic acid) 또는 폴리글리콜산], 비드 또는 리포솜과 같은 제제를 수반하는 바람직한 분자의 제형을 포함하며, 이는 축적주사(depot injection)를 통해 수송될 수 있는 조절 또는 서방성 산물을 제공할 수 있다. 특정 실시형태에서, 히알루론산이 사용될 수도 있으며, 이는 순환시 지속시간을 연장시키는 효과를 갖는다. 특정 실시형태에서, 이식가능한 약물 수송 장치는 바람직한 분자를 유도하는데 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 흡입용으로 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, OPGL 에 결합하는 항체는 흡입용 건조 분말로 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, OPGL 에 결합하는 항체 함유 흡입용 용액은 에어로졸 수송용 추진제와 함께 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 용액은 분무될 수 있다. 화학적으로 변형된 단백질의 폐 수송 방법이 기재되어 있는 PCT 출원 번호 제 PCT/US94/001875 호에는 또한 폐로 투여하는 방법이 기재되어 있다.
특정 실시형태에서, 제형은 경구 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, 이러한 방법으로 투여하는 OPGL 에 결합하는 항체는 정제 및 캡슐과 같은 고형의 약제학적 제형을 제조하는데 통상적으로 사용하는 담체가 존재하든 존재하지 않든 제형화할 수 있다. 특정 실시형태에서, 캡슐은 생체내이용효율이 최대화되고 전 - 전신성 분해가 최소화되는 경우에 위장관 부분에서 제형의 활성부분이 방출되도록 조작하였다. 특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 제제는 OPGL 에 결합하는 항체 및/또는 임의의 부가적인 치료제의 흡수를 촉진시키기 위해 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 희석제, 향미료, 저융점왁스, 식물성유, 윤활제, 현탁화제, 정제 붕해제 및 결합제도 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물은 적어도 하나의 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, 정제를 제조하는데 적합한 비 - 독성 부형제의 혼합물 내의 유효량의 OPGL 에 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 멸균수 또는 다른 적합한 매개체 내의 정제를 용해시킴으로써 용액을 단위 - 투여 형태로 제조할 수 있다. 특정 실시형태에서, 적합한 부형제는 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산염, 락토스 또는 인산석회와 같은 불활성 희석제 ; 녹말, 겔라틴 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 또는 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 활석과 같은 윤활제를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
적어도 하나의 부가적인 치료제가 존재하든 존재하지 않든, 부가적인 약학적 조성물이 서방성 또는 조절 수송 제형 내의 OPGL 에 결합하는 항체를 포함하는 제형을 포함함은 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다. 특정 실시형태에서, 리포솜 담체, 생 - 침식가능한 미소립자 또는 다공성 비드 및 축적주사와 같은 다양한 서방성 또는 조절 수송 수단으로 제형화하는 기술은 본 분야의 숙련자들에게 공지되어 있다. 예를 들어, 약학적 조성물의 수송을 위한 다공성 고분자 미세입자의 서방성에 대해 기재되어 있는 PCT 출원 번호 제 PCT/US93/00829 호를 참조하라. 특정 실시형태에서, 서방성 제제는 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐과 같이 형태화된 제품의 유형인 반투과성 고분자기질을 포함할 수 있다. 서방성 기질은 폴리에스테르, 히드로겔, 폴리락티드(제 US 3,773,919 호 및 제 EP 058,481 호 참조), L - 글루탐산 및 γ 에틸 - L - 글루타민의 공중합체[Sidman 등의 Biopolymers, 22 : 547-556(1983) 참조], 폴리(2 - 히드록시에틸 - 메타아크릴산염)[Langer 등의 J. Biomed. Mater, Res., 15 : 167-277(1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12 : 98-105(1982) 참조], 에틸렌 비닐 아세트산(Langer 등의 상기문헌 참조) 또는 폴리 - D(-) - 3 - 히드록시부틸산(제 EP 133,988 호 참조)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 서방성 조성물은 또한 리포솜을 포함할 수 있으며, 본 분야에 공지되어 있는 다양한 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들어, Eppstein 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 : 3688-3692(1985) ; 제 EP 036,676 호 ; 제 EP 088,046 호 및 제 EP 143,949 호를 참조하라.
일반적으로 생체내 투여하는데 사용하는 약학적 조성물은 멸균한다. 특정 실시형태에서, 이는 멸균 여과막에 의한 여과로 수행할 수 있다. 특정 실시형태에서, 조성물이 동결건조된 경우에는, 동결건조 및 재구성하기 전 또는 후에 이러한 방법을 이용하여 멸균할 수 있다. 특정 실시형태에서, 비경구 투여용 조성물은 동결건조된 형태 또는 용액으로 저장될 수 있다. 특정 실시형태에서, 일반적인 비경구 투여용 조성물은 예를 들어, 피하주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 정맥내용액 백(bag) 또는 유리병과 같은 멸균 점검구(access port)를 갖는 용기에 저장한다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물을 제형화하면, 용액, 현탁액, 겔, 에멀젼, 고체 또는 탈수 또는 동결건조된 분말 형태로 멸균된 유리병 내에 저장할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 제형을 사용에 대비한 형태 또는 투여 전에 재구성하는 형태(예를 들어, 동결건조)로 저장할 수 있다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 단일 - 투여량 투여 단위를 생산하기 위한 키트에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 키트는 건조 단백질을 갖는 첫 번째 용기 및 액상 제형을 갖는 두 번째 용기 둘 다를 포함한다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 단일 및 다중 챔버 형태의 예비 - 충진된 주사기[예를 들어, 액상 주사기 및 리오시링지(lyosyringe)]를 포함하는 키트를 포함한다.
특정 실시형태에서, 치료학적으로 사용되는 적어도 하나의 부가적인 치료제를 수반하거나 수반하지 않는 OPGL 에 결합하는 항체를 함유하는 약학적 조성물의 유효량은 예를 들어, 치료학적 환경 및 목적에 따라 결정된다. 본 분야의 숙련자는 부분적으로 수송되는 분자, 적어도 하나의 부가적인 치료제를 수반하거나 수반하지 않고 사용되는 OPGL 에 결합하는 항체의 적용, 투여 경로 및 환자의 크기(체중, 체표면적 또는 기관 크기) 및/또는 조건(나이 및 일반적인 건강 상태)에 따라 특정 실시형태에 따른 치료를 위한 적절한 투여량 수준을 결정함을 인식할 것이다. 특정 실시형태에서, 최적의 치료 효과를 얻기 위해 의사는 투여 경로를 변경하고 투여량을 조절할 수 있다. 특정 실시형태에서, 전형적인 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 0.1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 또는 그 이상의 범위를 가질 것이다. 특정 실시형태에서, 투여량은 0.1 ㎕/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ ; 또는 1 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ ; 또는 5 ㎍/㎏ 내지 약 100 ㎎/㎏ 의 범위일 것이다.
특정 실시형태에서, 투여 빈도는 OPGL 에 결합하는 항체의 약력학적 파라미터 및/또는 사용된 제형 내의 부가적인 치료제를 고려하여 결정되었다. 특정 실시형태에서, 의사들은 바람직한 효과를 이루는 투여량이 될 때까지 조성물을 투여할 것이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 단일 투여량 또는 일정 기간 동안의 둘 또는 그 이상의 투여량(바람직한 분자의 동일량을 함유할 수 있거나 함유할 수 없는 투여량) 또는 이식 장치나 카테터를 통한 연속 주입으로 투여될 것이다. 본 분야의 숙련자들에 의해 정기적으로 적절한 투여량으로 개선되었으며 그들에 의해 과제의 범위 내에서 정기적으로 수행되었다. 특정 실시형태에서, 적절한 투여량은 적절한 투여량 - 반응 데이타를 통해 확인할 수 있다.
특정 실시형태에서, 약학적 조성물의 투여 경로는 공지된 방법에 따른다 : 정맥내, 복강내, 대뇌내(실질내), 대뇌심실내, 근육내, 안내, 동맥내, 문맥내 또는 병소내 경로로 주사 ; 서방성 시스템 또는 이식 장치를 통해 주사. 특정 실시형태에서, 조성물은 환괴 주사 또는 연속적 주입 또는 이식 장치로 투여할 수 있다.
특정 실시형태에서, 조성물은 바람직한 분자가 흡수되거나 캡슐화된 막, 스펀지 또는 다른 적절한 물질을 이식함에 의해 국부적으로 투여할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이식 장치를 사용하기 위해 장치를 적절한 조직 또는 기관에 이식할 수 있으며 바람직한 분자의 수송은 분산, 지효성 환괴 또는 연속 투여를 통해 이루어질 것이다.
특정 실시형태에서, 적어도 하나의 부가적인 치료제를 함유하거나 함유하지 않으며 OPGL 에 결합하는 항체를 함유하는 약학적 조성물을 탈체(ex vivo) 방식으로 사용하는 것이 바람직할 것이다. 이러한 예로는, 환자로부터 떼어낸 세포, 조직 및/또는 기관을 적어도 하나의 부가적인 치료제를 함유하거나 함유하지 않으며 OPGL 에 결합하는 항체를 함유하는 약학적 조성물에 노출시킨 후 이 세포, 조직 및/또는 기관을 다시 환자에게 이식하였다.
특정 실시형태에서, OPGL 에 결합하는 항체 및/또는 어떤 부가적인 치료제를 본원에 기재한 방법을 사용하여 폴리펩티드를 발현하고 분비하도록 유전공학에 의해 생산된 특정 세포를 이식하여 수송할 수 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 세포는 동물 또는 인체 세포일 것이며 자원성, 이질성 또는 이종발생성일 것이다. 특정 실시형태에서, 세포는 불사화될 것이다. 특정 실시형태에서, 면역 반응이 일어날 가능성을 감소시키기 위해, 주변 조직의 침윤을 피하도록 세포를 캡슐화시켰다. 특정 실시형태에서, 캡슐화 물질은 전형적으로 단백질 산물은 방출시키지만 환자의 면역계 또는 주변 조직의 다른 장해 인자에 의한 세포 파괴는 예방하는 생체적합성의 반투과성 폴리머 엔클로저(enclosure) 또는 막이다.
실험을 실행하고 결과를 유도하는 것을 포함하는 다음 실시예는 예증적인 목적만을 위해 제공된 것이며 본 발명을 제한하려는 의도로 이해되서는 안된다.
αOPGL-1 중쇄 및 경쇄의 클로닝
전장의 인체 OPGL cDNA 를 발현하는 CHO 세포(ATCC 기탁번호 제 CRL 9096 호, 하기에 기재된 모든 CHO 세포의 입수처는 이와 동일함)를 인체 면역글로불린 유전자를 포함하는 형질전환 마우스를 면역시키는데 사용하였다. 면역시킨 마우스의 림프절을 마우스 골수종 세포에 융합시켜 하이브리도마를 생성하였다. 하이브리도마 세포주로부터의 상층액을 인체 OPGL 과 반응하는 항체에 대한 ELISA 검정으로 시험하였다. 항 - OPGL 을 발현하는 하이브리도마 세포주 AMG 6.5, AMG 6.4 및 AMG 6.1 이 OPGL 에 대해 높은 친화성을 갖는 항체를 발현함이 발견되었으며(각각 0.28 nM, 0.29 nM 및 0.23 nM 의 Kd's) AMG 6.5 는 클로닝에서 선택하였다. AMG 6.5 및 AMG 6.4 로부터의 중쇄 및 경쇄 cDNA 클론은 동일하며 AMG 6.4 는 αOPGL-1 중쇄 cDNA 를 클로닝하는데 사용하는 반면 AMG 6.5 는 αOPGL-1 경쇄 cDNA 를 클로닝하는데 사용한다.
α OPGL -1 경쇄의 클로닝
αOPGL-1 카파 경쇄 가변 영역을 AMG 6.5 총 RNA 로부터 제조한 제 1 가닥 cDNA 로부터 PCR 증폭 방법을 사용하여 수득하였다. 연장된 5' - 연결자[5' - GGCCGGATAGGCCTCACNNNNNNT - 3'(SEQ ID NO : 15)]를 갖는 무작위 프라이머 및 제 1 가닥 cDNA 합성 키트(cat. no. 18089 - 011)에 대해 Gibco SuperScript ⅡTM 예비증폭 시스템에 의해 제공되는 물질 및 방법을 사용하여 AMG 6.5 총 RNA 로부터 제 1 가닥 cDNA 를 제조하였다. 하기의 올리고누클레오티드를 PCR 에 사용하였다 :
Figure 112010006156193-pat00002
.
증폭된 DNA 를 pCRⅡ-TOPO(인비트로겐에서 입수) 내로 클로닝하였으며 결과적으로 생성된 플라스미드를 서열결정하였다. 카파 사슬 칸센서스 서열을 전장의 αOPGL-1 카파 사슬의 PCR 증폭을 위한 프라이머를 제조하는데 사용하였다. 5' αOPGL-1 카파 프라이머는 클로닝을 위한 XbaI 부위(TCTAGA)를 포함하며 초기 Met 코돈 앞에 "CCACC" 코작(Kozak) 서열을 포함한다. 3' αOPGL-1 카파 프라이머는 클로닝을 위해 종결 코돈 뒤에 SalI 부위(GTCGAC)를 포함한다.
Figure 112010006156193-pat00003
.
전장의 αOPGL-1 카파 사슬 cDNA 클론을 5' 및 3' αOPGL-1 카파 프라이머를 수반하는 PCR 증폭에 의해 상기 기재한 AMG 6.5 제 1 가닥 cDNA 를 사용하여 수득하였다. PCR 반응으로 αOPGL-1 카파 사슬의 235 개의 아미노산 잔기(20 개의 아미노산 카파 사슬 시그널 서열을 포함)를 코드하는 738 bp 단편이 생성되었다(도 4 참조, SEQ ID NO : 4). QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠 cat. no. 28104)를 사용하여 정제한 후, 이 단편을 카파 경쇄 발현 벡터를 구성하는데 사용하였다.
상기 생성된 738 bp 전장의 카파 단편을 XbaI 및 SalI 로 절단하고 프로메가 위저드 DNA 클린 - 업 시스템(프로메가 cat. no. A7100)을 사용하여 정제한 뒤 pDSRα19 내로 클로닝하여 플라스미드 αOPGL-1-카파/pDSRα19(도 5 참조)를 생성하였다. pDSRα19 는 이전에 기재된 것이다[어떤 목적을 위해 본원에 참고문헌으로 인용된 제 WO 90/14363 호를 참조하라(예를 들어, 도 12 참조)]. 간략하게, pDSRα19 를 만들기 위해, pDSRα2 를 다음과 같은 방법으로 변형시켰다 : FSH 폴리 A 는 약 1400 bp 만큼 짧아져 885 bp 가 되었으며 현재 NdeI 부위에서 끝난다 ; 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 프로모터는 현재 209 bp 를 포함하며 이는 5' 말단에서 약 1 kb 가 짧아진 것이다 ; DHFR 폴리 A 서열로부터 약 550 bp 의 BglⅡ 단편이 삭제되었다.
αOPGL-1 카파 경쇄 발현 클론을 AMG 6.5 하이브리도마에서 확인된 동일한 펩티드를 코드하는지를 확인하기 위해 서열결정하였다. 최종 발현 벡터인 αOPGL-1-카파-pDSRα19 는 5476 bp 이며 표 2 에 나타나는 7 개의 기능 영역을 포함한다.
Figure 112010006156193-pat00004
벡터의 환형 플라스미드 지도를 도 5 에 나타내었다.
α OPGL -1 중쇄의 클로닝
Clontech MarathonTM cDNA 증폭 키트(cat. no. K1802-1)로 제조한 AMG 6.4 하이브리도마 이중 - 가닥 cDNA 로부터 αOPGL-1 IgG2 중쇄를 클로닝하였다. AMG 6.4 중쇄 cDNA 의 증폭은 인체 배선 IgG2 중쇄 불변 영역 특이 프라이머(하기에 나타냄) 및 RACE 프라이머 및 MarathonTM cDNA 증폭 키트에 제공되는 다른 물질 및 방법으로 수행되는 cDNA 말단의 5′ 및 3′ 신속 증폭(RACE)에 의해 이루어졌다.
Figure 112010006156193-pat00005

600 bp 의 5′ RACE 산물 및 1200 bp 의 3′ RACE 산물을 pCR2.1(인비트로겐에서 입수) 내로 클로닝하고 서열결정하였다. 이 서열 정보를 전장의 서열의 클로닝을 위한 αOPGL-1 중쇄 특이 프라이머를 제조하는데 사용하였다. 중쇄 5′ 프라이머(5′ αOPGL-1 IgG2 프라이머)는 센스 가닥을 향하며 천연 개시 부위 앞에 HindⅢ 부위 및 칸센서스 코작 서열을 갖는다. 중쇄 3′ 프라이머(3′ αOPGL-1 IgG2 프라이머)는 안티센스 프라이머이며 중쇄 IgG2 서열의 마지막 아미노산 뒤에 SalI 부위 및 종결 코돈을 포함한다.
Figure 112010006156193-pat00006

상기 기재된 이중 가닥 DNA 를 5′- 및 3′- αOPGL-1 IgG2 프라이머를 수반하는 PCR 증폭에 의해 전장의 중쇄 cDNA 를 생성하는데 사용하였다. αOPGL-1 IgG2 중쇄 단백질의 467 개의 아미노산 잔기(19 개의 아미노산 IgG 시그널 서열을 포함, 도 2 참조, SEQ ID NO : 2)를 코드하는 1433 bp 단편을 PCR 로 생성하였다. QIAquick PCR 정제 키트(퀴아젠 cat. no. 28104)를 사용하여 정제한 후, 이 단편을 다음과 같이 중쇄 발현 벡터를 구성하는데 사용하였다.
상기에서 생성된 전장의 IgG2 중쇄 단편을 코드하는 DNA 를 HindⅢ 및 SalI 으로 절단하고 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아젠 cat. no. 28704)를 사용하여 정제한 후 이 단편을 pDSRα19 내로 클로닝하였다. 결과적으로 생성된 발현 플라스미드를 αOPGL-1-IgG2/pDSRα19 로 명명하였다(도 6 참조). XbaI 및 SalI 부위 사이의 αOPGL-1 카파 경쇄 cDNA 가 αOPGL-1 IgG2 중쇄 cDNA 로 치환된 것을 제외하고는 모든 벡터 성분은 상기 기재된 αOPGL-1-카파/pDSRα19 벡터와 동일하였다. αOPGL-1 IgG2 중쇄 발현 클론이 AMG 6.4 하이브리도마에서 확인된 동일한 폴리펩티드를 코드하는지를 확인하기 위해 서열결정하였다.
CHO 세포에서의 αOPGL-1 발현
디히드로폴레이트 환원효소 결핍(DHFR­) 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO AM-1/D, 미국 특허 번호 제 6,210,924 호) 내로 αOPGL-1- 카파/pDSRα19 및 αOPGL-1-IgG2/pDSRα19 플라스미드를 공동 - 트랜스펙션한 후 각 클론을 분리하고 시험하여 αOPGL-1 항체를 안정하게 발현시켰다.
트랜스펙션하기 전에(0일) CHO d- 배지[DMEM - 고 글루코스, 10 % 우태아혈청, 1 % 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 1X 피루브산나트륨, 1 % 비필수 아미노산(NEAA)](Gibco® 에서 입수) 및 1 % ht 보조물(Gibco® 에서 입수) 내의 1.5×106 AM-1/D 세포로 100 mm 조직 배양 접시를 평판하였다. 1 일에, 400 ㎕의 무혈청 RPMI 1640 배지(Gibco®에서 입수)를 12×75 mm 폴리프로필렌 튜브에 나누어 넣었다. 24 ㎕의 TransIT® - LT1 시약(미루스 코포레이션에서 입수)을 배지에 점적하여 첨가하였으며 이 혼합물을 10 분 동안 실온에서 항온하였다. 그런 다음 15 ㎍의 선형화된 플라스미드 DNA(7.5 ㎍ 의 αOPGL-1-카파/pDSRα19 및 7.5 ㎍ 의 αOPGL-1-IgG2/pDSRα19, Pvu1 로 절단됨) 모두를 혼합물에 점적하여 첨가하고 10 분 동안 실온에서 항온하였다.
세포에서 CHO d- 배지를 제거하고 100 ㎖ 둘베코 인산염완충식염수(Gibco®에서 입수)로 세척하였다. HT, L - glu, NEAA 및 피루브산나트륨(Gibco®에서 입수)을 보충한 6 ㎖의 무혈청 MEM 배지를 세포에 첨가하였다. DNA/LT1 복합체를 플레이트에 점적하여 첨가하고 셀에 DNA 가 고르게 공급되도록 앞뒤로 조심스럽게 흔들었다. 조직 배양 항온기에서 6 시간 동안 항온한 뒤, 배지를 신선한 CHO d- 배지로 교환하였다. 48 시간 후에 세포를 CHO 선별 배지[DMEM 고 글루코스, 10 % 투석시킨 우태아혈청(FBS), 1 % 페니실린/스트렙토마이신/글루타민, 1 % 비필수 아미노산 및 1X 피루브산나트륨](Gibco® 에서 입수)가 담긴 10 개의 100 mm 배양 접시에 나누어 담았다. 배지를 콜로니가 나타날 때까지 2 주마다 교환해 주었다.
10 - 14 일 후에 1x 트립신 - EDTA(Gibco® 에서 입수)에 담갔던 5 mm 클로닝 디스크(Labcore® 에서 입수)를 사용하여 콜로니를 떼어내고 24 웰 조직 배양 플레이트에 CHO 선별 배지와 함께 배양하였다. 세포가 융합되었을 때, 무혈청 배지(FBS 를 뺀 CHO 선별 배지)를 첨가한 후 48 시간 후에 수집하였다. 이러한 조정 배지를 αOPGL-1 중쇄 및 염소 항 - 인체 카파 사슬 항체(일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 입수)를 검출하는 고추냉이 퍼옥시다제(HRP) - 접합 염소 항 - 인체 IgG Fc 항체(일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 입수)와 함께 웨스턴 블롯팅한 후 αOPGL-1 경쇄를 검출하는 HRP - 접합 토끼 항 - 염소 IgG(H+L) 항체(일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 입수)와 함께 웨스턴 블롯팅하여 항체 발현에 대해 분석하였다. 가장 많이 발현한 클론을 증가시키고 액체 질소에 저장하였다.
αOPGL-1 의 생산
세포주 125Q의 제조 및 창조
αOPGL-1 을 생산하는 CHO 세포를 무혈청 조건 하에서 96 웰 플레이트에 희석을 제한하면서 2 회 클로닝하였다. 다양한 현탁 용기에서 생산 및 성장 특징을 기초로 하여 클론을 선별하였다. 높은 수준의 αOPGL-1 을 생산하는 클론을 선별하기 위해 EIA 를 실행하였다. 그런 다음 3 L 아플리콘 생물반응기 뿐만 아니라 100 ㎖, 250 ㎖, 500 ㎖, 1 L 및 3 L 스피너 플라스크에 클론을 성장시켜서 배가 시간 및 밀도를 포함하는 성장 특성을 측정하였다. 고밀도의 배양에 이르도록 하는 빠른 배가 시간을 갖는 클론을 선별하였으며 이를 세포주 125Q 라고 명명하였다. 약 1×107 세포/mL 의 360 개의 앰플을 냉동시키기에 충분한 세포를 산출할 수 있을 만큼 클론이 증가되었을 때, 냉동 저장된 무혈청 배지[10 ㎖/L 의 비필수 아미노산 및 10 ㎖/L 의 L - 글루타민(깁코/LTI/인비트로겐에서 입수)이 보충된 90 % VM - 대두 회분 배지(자세한 내용은 표 3 을 참조하라) 및 10 % 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide, JT 베이커에서 입수)]에 세포를 재현탁시킨 후 냉동하였다. 앰플을 접근이 제한된 설비에 저장하고 액체 질소 보온용기 내의 액체 질소에 담궈놓았다.
소규모 회전장치 및 대규모의 생물반응기에서의 성장 및 생산에 기초하여, αOPGL-1 을 제조하기 위한 세포주로 세포주 125Q 를 선택하였다.
세포 배양
αOPGL 을 플라스미드 αOPGL-1-카파/pDSRα19 및 αOPGL-1-IgG2/pDSRα19 로부터 αOPGL-1 을 발현하는 CHO 세포의 클론 세포주인 세포주 125Q 에서 발현시켜 생산하였다. αOPGL-1 의 세포 배양 과정은 도 19 에 나타나 있다. 각 생산 단계에서, 세포주 125Q 유리병으로부터의 세포를 125 ㎖ 의 삼각 플라스크에 담긴 100 ㎖/L 의 비필수 아미노산 및 10 ㎖/L 의 L - 글루타민(깁코/LTI/인비트로겐에서 입수)(VM - 대두 Supp)이 보충된 50 mL 의 VM - 대두 회분 배지(조성은 표 3 을 참조하라)에 5 일 동안 100 rpm 으로 초기 배양하였다. 그런 다음 전체 배양물을 3×105 생세포/㎖(3E5 vc/㎖)까지 500 ㎖ 스피너 플라스크 내의 VM - 대두 Supp 에 접종하는데 사용하였으며 3 - 4 일 동안 70 rpm 으로 회전하면서 배양하였다. 그런 다음 500 ㎖ 스피너 플라스크로부터의 전체 배양물을 3E5 vc/㎖ 까지 3 L 스피너 플라스크 내의 VM - 대두 Supp 에 접종하였으며 3 - 4 일동안 70 rpm 으로 회전시키면서 배양하였다.
그런 다음 3 L 스피너 플라스크로부터의 배양물을 두 개의 3 L 스피너 플라스크 내의 페놀 레드가 없는 VM - 대두 Supp 에 3E5 vc/㎖ 으로 나누어 넣은 뒤 동일 조건 하에서 배양하였다. 그런 다음 이 스피너 플라스크 배양물을 페놀 레드가 없는 VM - 대두 Supp 이 담긴 추가적인 4 개의 스피너 플라스크에 3E5 vc/㎖ 로 접종하고 동일 조건 하에서 배양하였다. 4 개의 3 L 스피너 플라스크로부터의 4 L 의 배양물을 20 L 생물반응기 내의 페놀 레드가 없는 10 L 의 VM - 대두 Supp 에 접종하였으며 생물반응기를 7 - 10 일 동안 유가 배양 모드로 가동하였다. 유가 배양 모드에서, 농축된 배지 성분을 포함하는 영양분 먹이("먹이" 는 하기 표 3 에 나타난 바와 같음)를 세포 성장 및 배지 생존력을 유지하도록 첨가하였다.
그런 다음 20 L 생물반응기로부터의 전체 배양물을 150 L 생물반응기 내의 페놀 레드가 없는 70 L 의 VM - 대두 Supp 에 접종하고 생물반응기를 9 - 10 일 동안 유가 배양 모드로 작동시켰다. 최종적으로, 150 L 생물반응기로부터의 전체 배양물을 2000 L 생물반응기 내의 약 880 L 의 VM - 대두(보충물 또는 페놀 레드가 없음)에 접종하고 생물반응기를 유가 배양 모드로 작동시켰다. 유가 배양 모드 동안의 먹이 공급율은 배양물 내의 글루코스 수준이 각 생물반응기 내에서 0.6 g/L 로 유지되도록 결정된다. 세포 밀도 및 글루코스 농도를 매일 측정하였으며 먹이 공급율을 그에 따라 조절하였다.
αOPGL-1 이 세포에 의해 구조적으로 생산되고 세포 배양 배지로 분비되도록 약 2 주 동안 2000 L 생물반응기 내의 생산을 지속하였다.
생산 반응기에서 pH, 온도 및 용존 산소 수준을 조절하였다 : pH 는 7.0 이며 이산화탄소 가스 및 탄산나트륨을 첨가하여 조절하였다 ; 용존 산소는 120 mmHg 이며 공기, 질소 및 산소 가스 흐름에 의해 조절되었다. 세포는 생산 과정 동안 37 ℃ 로 유지되었다. 모든 가스는 0.22 ㎛ 또는 그 이하의 포어 크기를 갖는 막 필터를 통해 통과하였다.
생산의 마지막 단계에서, 세포 육즙을 디스크 스택 원심분리기(disk stack centrifuge)로 공급하였으며 배지 상층액을 세포로부터 분리해내었다. 센트레이트(centrate)를 쿠노 90SP 깊이 필터로 추가로 정화시킨 후 0.2 ㎛ 포시딘 필터(팔 컴파니에서 입수)로 정화시켰다. 그런 다음 정화된 조정 배지를 50kD NMWL 막(밀리포어 바이오맥스 50)을 사용하는 접선 유동(tangential flow) 한외여과(UF)로 농축시켰다. 조정 배지는 15 내지 30 배 농축되었다. 그런 다음 결과적으로 생성된 농축 조정 배지(CCM)를 정제하거나 나중에 정제할 수 있도록 냉동시켰다. 생산 과정은 도 19 에 나타내었다.
세포 배양 배지
전체 세포 배양 과정 동안 사용되는 세포 배양 배지는 둘베코 변형 이글 배지/햄 영양물 F12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's Nutrient F12 : DMEM/F12, 1 : 1)를 기초로 하며 보충 수준의 아미노산, 추가 영양물 및 염, 대두 가수분해물 및 재조합 인체 인슐린(Nucellin® Zn, 엘리 릴리에서 입수)을 함유한다. 성분은 표 3 및 표 4 에 명시되어 있다. 이 배지는 VM - 대두로 언급된다. 배지 용액은 사용 전에 0.2 ㎛ 포어 크기의 막 필터로 여과하였다.
Figure 112010006156193-pat00007
Figure 112010006156193-pat00008
정제 방법
CHO 세포에서 발현된 αOPGL-1 은 세포외 배지로 분비되었다. 순수한 물질을 생성하기 위해 일련의 단계를 거칠 것이다. 이러한 방법으로 소수성 전하 유도 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 낮은 pH 단계 및 바이러스 필터를 수반하는 소수성 상호작용 크로마토그래피를 사용하였다. 이러한 과정은 하기에 기재되었다.
A. 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC)
이 크로마토그래피 단계는 대부분의 숙주 세포 단백질 및 DNA 를 제거한다. 농축된 조정 배지(CCM)를 쿠노 30SP 필터로 여과한 후 쿠노 VR07 전하 셀룰로스 - 기저 필터로 여과하고 그런 다음 MEP HuperCel 수지 상에 로딩하였다. 로딩한 후 컬럼을 평형 완충용액(20 mM 트리스 pH 7.2)으로 세척하였다. 항체는 낮은 pH 의 완충용액(20 mM 아세트산나트륨, pH 5.0)을 사용하여 수지로부터 용출시켰다. 컬럼으로부터 용출되었으므로, 컬럼 용출액의 280 nm 에서의 흡광도를 기준으로 하여 수집하였다.
B. 바이러스 불활성화
MEP 풀을 pH 3.7 까지 적정하고 오염됐을 가능성이 있는 레트로바이러스를 불활성화시키기 위해 약 60 분 동안 유지시켰다. 유지 단계 후에, pH 를 약 6.0 으로 조절하였다.
C. 바이러스 여과
pH - 조절 풀을 밀리포어 비레솔브 NFR 필터 또는 등가물로 여과하였다. 오염됐을 가능성이 있는 바이러스는 50 nm 이상이므로 그대로 남아있는 반면 항체는 필터를 통과하였다.
D. 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)
항체를 SP 세파로스 HP(아메삼 파마시마에서 입수) 또는 등가물을 사용하는 양이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 양이온 교환 크로마토그래피 단계는 부가적인 CHO 세포 단백질, DNA, 저분자량의 단백질 및 αOPGL-1 의 집합 형태를 제거한다. 바이러스 여과 풀을 양이온 교환 수지 상에 로딩하였다. 로딩 후, 컬럼을 평형 완충용액(20 mM NaMES pH 6.2)으로 세척하였다. 그런 다음 증가하는 염(20 mM NaMES pH 6.2, 0 M NaCl 내지 20 mM NaMES pH 6.2, 0.3 M NaCl)의 직선 밀도구배를 이용하여 항체를 용출하였다. 컬럼으로부터 용출되었으므로 컬럼 용출물의 280 nm 에서의 흡광도를 기준으로 하여 산물을 수집하였다.
E. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)
항체를 페닐 토요펄 650S(Phenyl Toyopearl 650S, 토소 바이오세프에서 입수) 또는 등가물을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피 단계는 연마 단계로서 사용되며 CHO 세포 단백질, DNA, 저분자량의 단백질 및 αOPGL-1 의 집합 형태를 제거한다. 양이온 교환 풀을 컬럼 상에 로딩하기 전에 황산암모늄을 첨가하여 15 - 20 ℃ 에서 105 mS/㎝ 보다 큰 전도성을 갖도록 하였다. 로딩 후에, 컬럼을 평형 완충용액(1 M 인산칼륨 pH 8)으로 세척하였다. 그런 다음 감소하는 염 농도(1 M 인산칼륨, O mM 트리스 pH 8 내지 O mM 인산칼륨, 20 mM 트리스 pH 8)의 직선 밀도구배를 이용하여 항체를 용출하였다. 컬럼으로부터 용출되었으므로, 컬럼 용출물의 280 nm 에서의 흡광도를 기준으로 하여 산물을 수집하였다.
F. 농축 및 투석여과
HIC 컬럼 풀을 50 kD NMWL 막(밀리포어 바이오맥스 50)을 사용하는 접선 유동 한외여과에 의해 제형 완충용액내로 농축하고 투석여과하였다. 제형 완충용액은 10 mM 아세트산염, 5 % 소르비톨, pH 5.2 를 함유하며 αOPGL-1 은 30 mg/mL 이다.
최종 여과 및 저장
정제한 벌크를 0.22 ㎛ PVDF 필터(밀리포어)에 통과시키고 시료로 만든 후 안전한 냉동고에서 약 -30 ℃ 로 저장하였다.
αOPGL-1 의 결합 특이성
실시예 1 및 2 에 기술한 바와 같이 2 개의 발현 벡터가 트랜스펙션된 CHO 세포에서 생산된 항체는 다음 실시예 4, 5 및 6 에 사용할 수 있다.
인체 OPG 는 인체 뿐만 아니라 랫, 마우스 및 사이노몰구스 원숭이의 OPGL 에 결합하여 중화시킨다. αOPGL-1 은 인체 OPGL 에 높은 친화성으로 결합하지만 마우스 OPGL 에는 두드러지게 결합하지 않는다(표 5 참조).
Figure 112010006156193-pat00009
게다가, 인체 OPG가 OPGL 에 대한 DNA 및 아미노산 서열 상동성을 나타내는 TNF 과의 관련 요소인 종양 괴사 인자 - 관련 세포소멸 - 함유 리간드(TRAIL)(Truneh 등의 문헌, 2000)에 약하게 결합함이 보고되어 있다(Lacey 등의 문헌, 1998). 그러나, OPG 는 TNFα, TNFβ 또는 CD40 리간드와 같은 다른 TNF - 관련 단백질에는 탐지할 수 있을 만큼 결합하지 않는다.
αOPGL-1 은 EIA 플레이트 상에서 OPGL 에 특이적으로 결합한다(도 7 참조). 재조합 수용성 OPGL(2 ㎍/㎖)을 96 - 웰 EIA 플레이트 상에서 16 내지 24 시간 동안 실온에서 코팅하였다. PBS 에 용해된 1 % BSA 로 차단한 뒤, 1 % BSA/PBS 에 희석시킨 다양한 농도의 αOPGL(약 2 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖)을 웰에 첨가하고 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 항온하였다. 결합한 항체를 TMB - H202(테트라메틸벤지딘 및 과산화수소) 기질 칵테일을 사용하여 염소 항 - 인체 IgG(Fab') - HRP 와 함께 검출하였다. 흡광도는 450 nm 및 650 nm 에서 판독하였다.
αOPGL-1 은 트랜스펙션된 세포의 표면에 발현되는 OPGL 에 특이적으로 결합한다(도 8 참조). FACS 완충용액(PBS, 0.1 % BSA, 0.01 % 아지드화나트륨)에 희석시킨 αOPGL-1(100 ng/㎖)을 다양한 농도의 OPGL, TNFa, TNFb, TRAIL 또는 CD40 리간드(약 0.1 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖)와 예비항온한 후 세포 표면에 막결합 OPGL 을 안정하게 발현하는 CHO 세포인 약 200,000 개의 CHO REN 218 - 9 세포에 첨가하였다. 2 - 8 ℃ 에서 1 시간 후에, 결합하지 않은 항체를 원심분리 및 세척으로 제거하였다. 그런 다음 세포를 2 - 8 ℃ 에서 30 분 동안 FITC - 표지된 F(ab')2 염소 항 - 인체 IgG(Fcγ 단편 특이)와 함께 항온하였다. 원심분리 및 세척 후에, 세포 표면 형광을 유동 세포계수법으로 측정하였다. 도 8 은 CHO REN 218 - 9 세포에 대한 αOPGL-1 의 결합이 특이적이며 이는 수용성 OPGL 을 첨가함에 의해 경쟁적으로 감소하지만 TNFa, TNFb, TRAIL 또는 CD40 리간드의 첨가에 의해서는 감소하지 않음을 나타낸다.
경쟁 실험에서, EIA 플레이트 상의 OPGL 에 대한 αOPGL-1 의 결합은 외인성 OPGL 의 첨가로 인해 저해되지만(도 9 참조) TNFα, TNFβ, TRAIL 또는 CD40 리간드의 첨가에 의해서는 저해되지 않는다(도 10 참조). 이러한 과정은 일정한 농도의 αOPGL-1(100 ng/mL)을 OPGL - 코팅 플레이트에 첨가하기 전에 다양한 농도의 수용성 OPGL 또는 그외 리간드(각각 약 1 ng/㎖ 내지 1000 ng/㎖)와 예비항온하는 것을 제외하고는, EIA 플레이트 상의 OPGL 에 대한 αOPGL-1 의 결합에 있어서 상기와 실질적으로 동일한 방법으로 수행하였다.
αOPGL-1 중화 활성도
파골 세포 형성의 저해
RAW 264.7(버지니아 마나사스에 소재하는 ATCC 기탁번호 제 TIB - 71 호)은 아벨슨(Abelson) 마우스 백혈병 바이러스 - 유도 종양으로부터 유래한 마우스 대식 세포이다. RAW 264.7 세포는 OPGL 의 존재시 파골 세포 - 유사 세포로 분화될 것이다. OPGL 의 존재시 배양물에서 RAW 세포로부터의 파골 세포 생성에 대한 기초 검정은 어떤 목적을 위해 본원에 참고문헌으로 인용된 Simonet 등의(1997) Cell 89 p. 309 및 Lacey 등의 (1998) Cell 93 p.165 에 상세히 기재되어 있다.
RAW 세포는 리간드에 의해 자극되어 파골 - 유사 세포로 분화되며 이러한 분화를 파골 세포의 특성인 TRAP 활성에 의해 측정할 수 있다. 그러므로, 파골 세포 형성시 αOPGL-1 의 효과를 측정할 수 있다.
RAW 세포를 세포 배양 배지(DMEM, 10 % FBS, 0.292 ㎎/㎖ L - Glut, 100 유닛/㎖ 페니실린 G, 100 ㎍/㎖ 황산스트렙토마이신) 내의 일정량의 OPGL(40 ng/㎖) 및 다양한 양의 αOPGL-1(6.3 ng/㎖ 내지 200 ng/㎖)의 존재 하에 4 일 동안 항온하였다. 4 일 후반에, 세포를 투과성상승화(permeabilization) 및 산성화한 후 5 분 동안 파라 - 니트로페닐포스페이트로 처리하여 주석산 - 내성 산성 포스파타제(tartrate - resistant acid phosphatase : TRAP) 활성도에 대해 염색하였다. 간략하게, 세포로부터 배지를 떼어내고 100 ㎕ 의 시트르산 완충용액(410 ㎖ 의 0.1 M 시트르산, 590 ㎖ 의 0.1 M 시트르산염, 삼나트륨 염, 1 mL 의 트리톤 X -100)을 각 웰에 첨가한 후 플레이트를 실온에서 3 내지 5 분 동안 항온하였다. 그런 다음 100 ㎕ 의 PNPP 용액을 첨가하고[157.8 mg 의 산성 포스파타제 시약(시그마 104 - 100), 7.2 ㎖ 의 주석산염 용액(시그마 cat. no. 387 - 3) 및 22.8 ㎖ 의 시트르산 완충용액] 플레이트를 실온에서 3 내지 5 분 동안 항온하였다. 50 ㎕ 의 0.5 M NaOH 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다.
TRAP 는 파라 - 니트로페닐포스페이트를 파라 - 니트로페놀로 변화시킬 것이며 이 파라 - 니트로페놀은 405 nm 에서 최적 밀도 측정치로 정량될 수 있다. 그러므로 파골 세포 발생에 대한 대리 마커인 TRAP 활성은 405 nm 에서의 최적 밀도와 상호관계가 있다. 최적 밀도 대 αOPGL-1 농도의 플롯은 도 11 에 나타나 있으며 이러한 검정에서 αOPGL-1 이 파골 세포 형성을 저해함을 나타낸다.
OPGL 수용체에 결합하는 OPGL 의 저해
αOPGL 의 효능은 OPG 리간드가 그것의 동종 수용체인 파골 세포 분화 및 활성 수용체(ODAR, 또한 RANK 로 공지되어 있음)에 결합하는 것을 차단하는 능력으로 설명된다. 이러한 검정은 동질 시간 분해 형광 공명(HTRF)을 사용하여 유로퓸 - 접합 오스테오프로테게린 리간드(Eu - OPGL)에 αOPGL-1 이 결합하는 것을 검출하였다. αOPGL-1 이 ODAR 에 대한 Eu - OPGL 의 결합을 저해한다면, 형광 산출이 감소할 것이며 존재하는 αOPGL-1 의 양은 형광의 양과 반비례할 것이다.
337 nm 의 빛에서 여기되었을 때 620 nm 에서 빛을 방사하는 유로퓸으로 OPGL 을 표지하였다. ODAR 을 FLAG 및 Fc 에 융합시키고 이 Fc - ODAR - FLAG 융합 단백질을 620 nm 에서 빛에 의해 여기되었을 때 665 nm 의 빛을 방사하는 형광단인 알로피코시아닌(APC)에 결합한 항 - FLAG 항체로 표지하였다. 그러므로, Eu - 표지 OPG 리간드가 Fc - ODAR - FLAG/항 - FLAG - APC 복합체에 결합하게 되면, 3 차 복합체는 337 nm 에서 빛으로 여기되었을 때 665 nm 의 빛을 방사할 것이다.
0.05 ㎍/㎖ 의 Eu - OPGL 을 검정 완충용액(50 mM 트리스 pH 8, 100 mM NaCl, 0.05 % NaN3, 0.1 % BSA 및 0.05 % 트윈 20) 내의 다양한 농도의 αOPGL-1(0.1 내지 150 ng/㎖)과 실온에서 약 1 시간 동안 예비항온하였다(예비항온 혼합물). Fc - ODAR - FLAR(1 ㎍/㎖) 및 항 - FLAG - APC(2.5 ㎍/㎖)의 혼합물을 또한 검정 완충용액 내에서 제조한 후 실온에서 1 시간 동안 항온하였다(형광색소 혼합물). 그런 다음 동일한 부피의 예비항온 혼합물과 형광색소 혼합물을 혼합한 뒤 실온에서 3 시간 동안 항온하였다. 337 nm 의 여기 파장 및 665 nm 의 방사 파장을 이용하여 팩커드 디스커버리 HTRF 마이크로플레이트 분석기 상의 판독 플레이트로 형광을 측정하였다.
αOPGL-1 을 Eu - OPG 리간드와 예비항온한 후 Fc - ODAR - FLAG/항-FLAG - APC 와 혼합하였을 때, 665 nm 에서의 형광도는 도 12 에 나타난 바와 같이 투여량 - 의존 방식에서 감소하였으며 이는 αOPGL 162 가 ODAR 에 대한 OPGL 결합을 효과적으로 저해할 수 있음을 나타내는 것이다.
사이노몰구스 원숭이에서의 약력학
4.5 세 이하이며 2 내지 4 ㎏ 의 중량을 갖는 6 마리의 수컷 및 6 마리의 암컷 사이노몰구스 원숭이를 4 개 투여 그룹으로 나누었다. 그룹 1 은 3 마리의 수컷 및 3 마리의 암컷으로 구성하였다. 그룹 2, 3 및 4 는 각각 1 마리의 수컷 및 1 마리의 암컷으로 구성하였다. 그룹 2, 3 및 4 의 동물에게 각각 αOPGL-1 을 0.1, 1.0 또는 10.0 mg/kg 의 단일 IV 투여량으로 투여한 반면 그룹 1 의 동물에게는 1 mg/kg 의 αOPGL-1 을 단일 SC 투여량으로 투여하였다.
동물에게 트랜스펙션된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포로부터 발현된 αOPGL-1 을 투여하였다. αOPGL-1 수준의 검출, 항체 분석 및 골교체 마커 혈청 N - 텔로펩티드(혈청 N - Tx), 알칼리포스타파제(ALP) 및 혈청 칼슘(혈청 Ca)의 분석을 위해 혈청 시료를 수득하였다. N - 텔로펩티드(뇨 N - Tx) 및 크레아틴의 분석을 위해 뇨도 수집하였다.
Ⅳ 투여 후의 혈청 농도 - 시간 프로필을 트리 - 위상성 분포(tri - phasic distribution)로 특정하였다(도 13 참조). 초기에는, 급격한 분포상이 있었으며 그 후에 농도 - 의존성을 나타내는 상당히 완만한 플래토 상이 나타나 있다. 세 번째 관찰된 상은 급격한 소거 상있었다.
WinNonlin 프로페셔널(v1.5)을 사용하는 완전한 혈청 농도 - 시간 프로필의 비 - 구획 분석 및 시험 약품 투여 후 14 일까지의 데이타 및 SAAMⅡ(v1.1.2)를 사용한 10,000 ng/mL 보다 큰 혈청 농도의 지수 분석을 원숭이의 αOPGL-1 의 약력학을 연구하는데 사용하였다. 모든 Ⅳ 투여량으로부터의 분포의 초기 부피는 평균 28.9 ㎖/㎏ 으로 플라스마 부피와 유사하였다. 분포에서 정상 상태 부피(Vss)는 모든 Ⅳ 투여량에 걸쳐 평균 39 ㎖/㎏ 이었다. 지수 분석은 αOPGL-1 이 6.02 시간의 평균 분포 반감기(t½α)를 가지며 0.1 ㎎/㎏ 의 투여량에서 86.9 시간 내지 10.0 ㎎/㎏ 의 투여량에서 최대 444 시간으로 투여량에 따라 증가되는 반감기(t½β)를 갖는 연장된 두 번째 상을 가짐을 나타낸다. 최종 소거 반감기 (t½z) 는 모든 Ⅳ 투여 그룹에 걸쳐 비 - 구획적으로 평균 31 시간으로 평가되었다. 0.1 ㎎/㎏(0.401 ㎖/hr/㎏)의 투여량을 투여한 동물에서보다 3.3 배 낮은 평균 청소율(0.120 ㎖/hr/kg)을 갖는 10 ㎎/㎏ 의 Ⅳ 투여량을 투여한 동물에서의 αOPGL-1 의 청소율은 비 - 선형으로 나타날 것이다.
피하내 투여 후에, 천천히 흡수되며 132 시간에 11,600 ng/㎖ 의 평균 피크 농도(Cmax)를 갖는다. SC 투여 후의 노출의 범위는 상당한 변화를 나타내며 0.387±0.281 ㎖/hr/㎏ 의 평균 청소율 및 202±80.1 시간의 평균 잔류 시간을 야기한다. 평균 생체내이용효율은 89 % 이다.
상기의 데이타를 표 6 에 나타내었다.
Figure 112010006156193-pat00010
αOPGL-1 은 투여 후 24 시간 내에 혈청 N - Tx 수준의 급격한 감소를 일으켰다(도 14 참조). 최대 효과의 평균 시간은 Ⅳ 투여량이 0.1 로부터 10 ㎎/㎏ 으로 증가함에 따라 투여 후 12 시간 및 7 일 사이이며 1.0 ㎎/㎏ 의 SC 투여량을 투여한 동물에서는 12 시간 및 11 일 사이이다. 최대 효과는 0.1 내지 1 ㎎/㎏ 의 투여량 범위에 걸쳐 시작일로부터 약 80 내지 91 % 증가하였다. 그러나, 높은 투여량에서는 91 % 의 최대 저해를 나타내는 추가적인 억제는 발견되지 않았다. 혈청 N - Tx 의 평균 수준은 0.1 ㎎/㎏ 을 Ⅳ 투여한지 28 일 후에 및 1 ㎎/㎏ 을 SC 투여한지 70 일 후에 기준선으로 돌아왔다. 뇨 N - Tx 는 모든 그룹이 105 일째에 기준선 수치로 돌아간 것을 제외하고는 혈청 N - Tx 와 유사한 경향을 나타내었다(도 15 참조).
10.0 ㎎/㎏ 을 Ⅳ 투여한 지 7 일 후에 혈청 Ca 가 기준선 평균 이하로 31.6 % 의 평균 최저점까지 억제되었다. 그외의 모든 투여 그룹은 그들의 기준선 평균으로부터 26.4 % 보다 적게 혈청 Ca 가 감소하였다. 17 일에 시험 동물의 모든 혈청 Ca 수준이 그들의 기준선 평균의 10 % 내로 돌아왔다(도 20 참조).
골흡수 및 골형성은 직접적으로 관련되어 있으므로, 골형성 마커(ALP)에서의 변화는 또한 ALP 수준의 상당히 완만한 감퇴 및 형성 마커인 N - Tx 보다 좀 더 연장된 억제로 관찰되었다(도 21 참조). αOPGL-1 의 투여 후 골형성 마커보다 앞서 관찰되는 골흡수 마커 감소는 αOPGL-1 이 골 항 - 흡수제임을 확인해주는 것이다.
대부분의 동물(12 마리 중 9 마리)에서 αOPGL-1 에 대한 항체가 증가하였다. αOPGL-1 에 대한 항체의 발생은 투여량 또는 경로 의존적이지 않는다. 투여 그룹이 항체 음성 및 양성 동물이 아닐 때 0.1 ㎎/㎏ 보다 많은 αOPGL-1 약력학의 αOPGL-1 에 대한 항체의 효과를 평가하는 것은 불가능하다. 0.1 ㎎/㎏ 의 Ⅳ 투여에서, 대부분의 αOPGL-1 은 항체가 발생하기 전에 제거되므로 αOPGL-1 성질의 효과가 관찰되지 않았다(도 16 참조).
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  42. 다음의 a) 중쇄 및 b) 경쇄를 포함하는, 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)와 상호작용하는 항체
    a) 다음을 포함하는 중쇄
    1) SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열 ; 또는
    2) SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열 ;
    b) 다음을 포함하는 경쇄
    1) SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열 ; 또는
    2) SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열.
  43. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  44. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함함을 특징을 하는 항체.
  45. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 을 포함하는 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  46. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 로 이루어진 중쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  47. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  48. 제 44 항에 있어서, SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  49. 제 45 항에 있어서, SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  50. 제 46 항에 있어서, SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  51. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  52. 제 43 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  53. 제 44 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  54. 제 45 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  55. 제 46 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  56. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  57. 제 43 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  58. 제 44 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  59. 제 46 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  60. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  61. 제 43 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  62. 제 44 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  63. 제 45 항에 있어서, SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  64. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  65. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  66. 제 42 항에 있어서, SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 포함함을 특징으로 하는 항체.
  67. 제 42 항, 제 43 항, 제 47 항, 제 48 항, 제 49 항, 제 50 항 및 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 중쇄 및 경쇄는 단쇄 항체를 형성함을 특징으로 하는 항체.
  68. 제 67 항에 있어서, 단쇄 Fv 항체임을 특징으로 하는 항체.
  69. 제 42 항, 제 43 항, 제 47 항, 제 48 항, 제 49 항, 제 50 항 및 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 Fab 항체, Fab' 항체 또는 (Fab')2 항체임을 특징으로 하는 항체.
  70. 제 42 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 완전 인체 항체임을 특징으로 하는 항체.
  71. 제 42 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 파골세포 분화 및 활성화 수용체(ODAR)에 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)가 결합하는 것을 저해함을 특징으로 하는 항체.
  72. 제 42 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는, 골손실을 치료하기 위한 약학적 조성물.
  73. 제 42 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항의 항체와 생물학적 시료를 접촉시킴을 포함하는, 상기 생물학적 시료 내의 오스테오프로테게린 리간드(OPGL) 수치를 검출하는 방법.
  74. 제 72 항에 있어서, 골손실은 골다공증, 파제트질환, 골수염, 칼슘과잉혈증, 골감소증, 골괴사, 염증성 증상, 자가면역 증상, 류마티스성관절염 및 암 중에서 선택한 적어도 하나의 증상과 관련된 것임을 특징으로 하는 조성물.
  75. 제 72 항에 있어서, 골손실 치료는 골형성인자, 형질전환 성장인자-β(TGF-β), 부갑상선 호르몬, 부갑상선 호르몬의 유사체, 부갑상선 호르몬 관련 단백질, 부갑상선 호르몬 관련 단백질의 유사체, 프로스타글란딘, 비스포스포네이트, 알렌드론에이트(alendronate), 불화물(fluoride), 칼슘, 섬유모세포 성장인자(FGF) 및 FGF 조절인자 중에서 선택한 적어도 하나의 부가적인 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  76. 제 74 항에 있어서, 골손실은 염증성 증상과 관련된 것이며, 상기 골손실 치료는 인터루킨-1(IL-1) 저해제, IL-1ra, Kineret™, 아나킨라, TNFα 저해제, 가용성 TNFα 수용체, Enbrel™, 에탄에르셉트, 항-TNFα 항체, Remicade™, 인플릭시맵, D2E7 항체, 비-스테로이달 항-염증성 약물(NSAID), COX-2 저해제, Celebrex™, 셀레콕시브, Vioxx™, 로페콕시브 및 레플루노마이드(leflunomide) 중에서 선택한 적어도 하나의 부가적인 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  77. 제 74 항에 있어서, 골손실은 자가면역 증상과 관련된 것이며, 상기 골손실 치료는 인터루킨-1(IL-1) 저해제, IL-1ra, Kineret™, 아나킨라, TNFα 저해제, 가용성 TNFα 수용체, Enbrel™, 에탄에르셉트, 항-TNFα 항체, Remicade™, 인플릭시맵, D2E7 항체, 메토트랙사이트, CTLA4 의 가용성 형태 및 당질코르티코이드 수용체의 조절인자 중에서 선택한 적어도 하나의 부가적인 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  78. 제 74 항에 있어서, 골손실은 류마티스성관절염과 관련된 것이며, 상기 골손실 치료는 인터루킨-1(IL-1) 저해제, IL-1ra, Kineret™, 아나킨라, TNFα 저해제, 가용성 TNFα 수용체, Enbrel™, 에탄에르셉트, 항-TNFα 항체, Remicade™, 인플릭시맵, D2E7 항체, 비-스테로이달 항-염증성 약물(NSAID), COX-2 저해제, Celebrex™, 셀레콕시브, Vioxx™, 로페콕시브, 레플루노마이드, 메토트랙사이트, CTLA4 의 가용성 형태 및 당질코르티코이드 수용체의 조절인자 중에서 선택한 적어도 하나의 부가적인 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  79. 제 74 항에 있어서, 골손실은 암과 관련된 것이며, 상기 골손실 치료는 케라티노사이트 성장인자(KGF), KGF-관련 분자, KGF 조절인자, 항-Her2 항체, 항-CDC20 항체, 및 항-EGFR 항체, 및 PAF 길항물질 중에서 선택한 적어도 하나의 부가적인 치료제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  80. 제 72 항에 있어서, 골손실은 암과 관련된 것이며, 상기 골손실 치료는 적어도 하나의 방사선요법 및 화학요법을 추가로 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  81. 제 72 항에 있어서, 조성물은 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  82. 제 72 항에 있어서, 조성물은 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  83. 제 72 항에 있어서, 조성물은 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체를 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  84. 중쇄를 코드하는 제 1 폴리누클레오티드 및 경쇄를 코드하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함하는 분리된 조성물이되, 상기 제 1 폴리누클레오티드 및 상기 제 2 폴리누클레오티드는 함께 제 42 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항의 항체를 코드하는 분리된 조성물.
  85. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 코드하고, 제 2 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코드함을 특징으로 하는 조성물.
  86. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 코드하고, 제 2 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코드함을 특징으로 하는 조성물.
  87. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코드하고, 제 2 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코드함을 특징으로 하는 조성물.
  88. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 을 포함하는 중쇄를 코드하고, 제 2 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 코드함을 특징으로 하는 조성물.
  89. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 로 이루어진 중쇄를 코드하고, 제 2 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 코드함을 특징으로 하는 조성물.
  90. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 1 에 기재되어 있는 누클레오티드 서열을 포함하고, 제 2 폴리누클레오티드는 SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있는 누클레오티드 서열을 포함함을 특징으로 하는 조성물.
  91. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  92. 제 85 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  93. 제 86 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  94. 제 87 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  95. 제 88 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  96. 제 89 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  97. 제 90 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 동일한 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  98. 제 84 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 서로 다른 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  99. 제 85 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 서로 다른 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  100. 제 86 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 서로 다른 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  101. 제 87 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 서로 다른 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  102. 제 88 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 서로 다른 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  103. 제 89 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 서로 다른 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  104. 제 90 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드 및 제 2 폴리누클레오티드는 서로 다른 핵산 분자의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  105. 제 91 항에 있어서, 핵산 분자는 벡터임을 특징으로 하는 조성물.
  106. 제 98 항에 있어서, 제 1 폴리누클레오티드는 제 1 벡터의 부분이고 제 2 폴리누클레오티드는 제 2 벡터의 부분임을 특징으로 하는 조성물.
  107. 제 105 항에 있어서, 벡터는 바이러스성 벡터임을 특징으로 하는 조성물.
  108. 제 106 항에 있어서, 제 1 벡터 및 제 2 벡터 중 적어도 하나는 바이러스성 벡터임을 특징으로 하는 조성물.
  109. 제 84 항의 조성물을 포함하는 분리된 숙주세포.
  110. 제 109 항에 있어서, 숙주세포는 SEQ ID NO : 13 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 코드하는 제 1 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO : 14 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코드하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 숙주세포.
  111. 제 109 항에 있어서, 숙주세포는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 코드하는 제 1 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 코드하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 숙주세포.
  112. 제 109 항에 있어서, 숙주세포는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 중쇄를 코드하는 제 1 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 코드하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 숙주세포.
  113. 제 109 항에 있어서, 숙주세포는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 을 포함하는 중쇄를 코드하는 제 1 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 를 포함하는 경쇄를 코드하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 숙주세포.
  114. 제 109 항에 있어서, 숙주세포는 SEQ ID NO : 2 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 20 내지 잔기 467 로 이루어진 중쇄를 코드하는 제 1 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO : 4 에 기재되어 있는 아미노산 서열의 잔기 21 내지 잔기 235 로 이루어진 경쇄를 코드하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 숙주세포.
  115. 제 109 항에 있어서, 숙주세포는 SEQ ID NO : 1 에 기재되어 있는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 1 폴리누클레오티드, 및 SEQ ID NO : 3 에 기재되어 있는 누클레오티드 서열을 포함하는 제 2 폴리누클레오티드를 포함함을 특징으로 하는 숙주세포.
  116. 제 109 항에 있어서, 원핵 숙주세포 또는 진핵 숙주세포임을 특징으로 하는 숙주세포.
  117. 제 116 항에 있어서, 숙주세포는 인체 간세포 종양 세포임을 특징으로 하는 숙주세포.
  118. 제 116 항에 있어서, 비인체 포유동물 숙주세포임을 특징으로 하는 숙주세포.
  119. 제 118 항에 있어서, 숙주세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장 세포 및 원숭이 신장 세포 중에서 선택한 것임을 특징으로 하는 숙주세포.
  120. 제 116 항의 숙주세포를 배양함을 포함하는, 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)과 상호작용하는 항체를 제조하는 방법.
  121. 제 118 항의 숙주세포를 배양함을 포함하는, 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)과 상호작용하는 항체를 제조하는 방법.
  122. 제 119 항의 숙주세포를 배양함을 포함하는, 오스테오프로테게린 리간드(OPGL)과 상호작용하는 항체를 제조하는 방법.
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