JP5956580B2 - Trail/apo2lの円順列変異形を含む融合タンパク質、コーディング遺伝子およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
(1)TRAILの円順列変異形および前記変異形のN末端および/またはC末端に位置するオリゴペプチドを含む融合タンパク質であって、前記オリゴペプチドは3〜10個のヒスチジン残基からなる繰り返し配列を含み、前記TRAILの円順列変異形のN末端からC末端までの成分は、(a)TRAILのアミノ酸135〜281、(b)リンカー、および(c)TRAILのアミノ酸121〜135もしくはTRAILのアミノ酸114〜135もしくはTRAILのアミノ酸95〜135、もしくはTRAILのアミノ酸121〜135を含有するTRAILのアミノ酸95〜135の任意のフラグメントである、または
(2)(1)と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%アミノ酸配列同一性を有するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に規定した前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20%、例えば90〜110%、80〜120%、70〜130%、60〜140%、50〜150%、40〜160%、30〜170%、20〜180%、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する。同一性は、当該技術分野において周知の方法、例えばBLAST、デフォルトパラメータを用いて計算する。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215:403−410;Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389−402(1997)を参照されたい。一部の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形の(a)、(b)および/または(c)のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形内ならびに前記TRAILの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。
(1)TRAILの円順列変異形および前記変異形のN末端および/またはC末端に位置するオリゴペプチドを含む融合タンパク質であって、前記オリゴペプチドは3〜10個のヒスチジン残基からなる繰り返し配列を含み、前記TRAILの円順列変異形のN末端からC末端までの成分は、(a)TRAILのアミノ酸135〜281、(b)リンカー、および(c)TRAILのアミノ酸121〜135もしくはTRAILのアミノ酸114〜135もしくはTRAILのアミノ酸95〜135、もしくはTRAILのアミノ酸121〜135を含有するTRAILのアミノ酸95〜135の任意のフラグメントである、または
(2)(1)と少なくとも80%、好ましくは85%、90%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%アミノ酸配列同一性を有するTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質であって、前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質は、配列番号5に規定した前記TRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質の腫瘍阻害活性の少なくとも20%、例えば90〜110%、80〜120%、70〜130%、60〜140%、50〜150%、40〜160%、30〜170%、20〜180%、若しくはそれ以上である腫瘍阻害活性を有する。同一性は、当該技術分野において周知の方法、例えばBLAST、デフォルトパラメータを用いて計算する。例えば、Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990;215:403−410;Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997;25:3389−402(1997)を参照されたい。一部の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形のアミノ酸配列内にのみ存在する。また別の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形の(a)、(b)および/または(c)のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形以外のアミノ酸配列内にのみ存在する。一部の実施形態では、それらと(1)との差は、前記TRAILの円順列変異形内ならびに前記TRAILの該円順列変異形以外のアミノ酸配列内に存在する。
野生型ヒトTRAILコーディング遺伝子の構築
野生型ヒトTRAILのアミノ酸114〜281の配列を発現する遺伝子を含有するプラスミドを構築した。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてヒト脾臓cDNAライブラリー(Clontech社)ならびに、添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP1、P2を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
P2:ctta ggatcc ttagccaactaaaaaggccccgaaaaaac(配列番号18)
先行工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒトTRAIL遺伝子の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a−TRAIL 114−281と命名した。
組み換えヒト円順列変異TRAILを発現する遺伝子の構築
組み換えヒト円順列変異TRAIL(円順列変異TRAIL、CPTと称する)をコードする遺伝子を構築した。N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、(a)TRAILのアミノ酸135〜281、(b)リンカー、および(c)TRAILのアミノ酸122〜135である。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a−TRAIL 114−281ならびに、添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP3、P4を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
P4:agttatgtgagctgctacaccaccaccaccaccgccaactaaaaaggccccaaaaaaactg(配列番号20)
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第1工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP3、P5を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
第2工程のPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異TRAILの発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a−CPTと命名した。
様々な組み換えヒト円順列変異TRAILをコードする新規遺伝子の構築
1.組み換えヒト新規円順列変異TRAIL−1(新規円順列変異TRAIL−1、NCPT−1と称する)をコードする遺伝子の構築。
N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、(a)TRAILのアミノ酸135〜281、(b)リンカー、および(c)TRAILのアミノ酸121〜135である。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてヒト脾臓cDNAライブラリー(Clontech社)、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P7を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
P7:cgggatccgccaactaaaaaggccccaaaaaaactggcttc(BamHI制限部位)(配列番号23)
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a−TRAIL 135−281、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P8を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第2工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P9を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
第3工程のPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒトNCPT−1遺伝子の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a−NCPT−1と命名した。
N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、(a)TRAILのアミノ酸135〜281、(b)リンカー、および(c)TRAILのアミノ酸95〜135である。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a−TRAIL 135−281、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P10を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第1工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P11を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第2工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P12を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第3工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P13を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
第4工程の結果として生じたPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異TRAIL(NCPT−2)の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a−NCPT−2と命名した。
N末端からC末端までの前記遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は、(a)TRAILのアミノ酸135〜281、(b)リンカー、および(c)TRAILのアミノ酸114〜135である
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとしてプラスミドpET42a−TRAIL 135−281、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P14を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
PCRは、PCR装置上で以下のパラメータにしたがって、テンプレートとして第1工程のPCR産物、ならびに添加したpfuDNAポリメラーゼ(Invitrogen社)を使用する下流および上流プライマーとしてのP6、P15を用いて実施した。1分間の94℃での変性、1分間の55℃でのアニーリングおよび1分間の68℃での伸長の30サイクル、ならびに10分間の68℃での伸長の最終サイクル。
第2工程のPCR産物を精製し、制限エンドヌクレアーゼのNdeIおよびBamHIを用いて消化し、T4リガーゼを用いて同一エンドヌクレアーゼを用いて消化したベクターpET42a内にライゲーションし、プレート上で培養して増殖させ、その後にプラスミド単離、消化試験および陽性クローンの予備スクリーニングを実施した。組み換えヒト円順列変異TRAIL(NCPT−3)の発現プラスミドはDNAシーケンシングによって確証し、構築したプラスミドをpET42a−NCPT−3と命名した。
NCPT−1、NCPT−2、およびNCPT−3の様々な変異体をコードする遺伝子の構築
1.NCPT−1.M1をコードする遺伝子の構築
Met−Gly−His−His−His−His−His−His遺伝子配列を、NCPT−1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet−Gly−His−His−His−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのN末端へ融合させた(MG+His6+NCPT−1)。
Met−Glyアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのN末端に融合させ、His−His−His−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのC末端に融合させた(MG+NCPT−1+His6)。
P18:catgccatgggcacattg tcttctccaa actc(配列番号34)
Met−Gly−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチド配列のN末端に融合させた(MG+His3+NCPT−1)。
His−His−His−His−His−His遺伝子配列を、NCPT−1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりHis−His−His−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのN末端へ融合させた(His6+NCPT−1)。
Met−Gly−His−His−His−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのN末端にGly−Ser−Gly−Gly−Glyのアミノ酸配列を備えるリンカーを使用して融合させた(MG+His6+NCPT−1_linker:GSGGG)。
Met−Gly−His−His−His−His−His−His−His−His−His遺伝子配列をNCPT−1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet−Gly−His−His−His−His−His−His−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのN末端へ融合させた(MG+His9+NCPT−1)。
Met−GlyおよびTRAILのアミノ酸129−134をNCPT−1ポリペプチドのN末端に融合させた(MG+129−134+NCPT−1)。
Met−Gly−Asn−Asn−Asn−Asn−Asn−Asn遺伝子配列を、NCPT−1をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet−Gly−Asn−Asn−Asn−Asn−Asn−Asnアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのN末端へ融合させた(MG+Asn6+NCPT−1)。
Met−Glyアミノ酸配列をNCPT−1ポリペプチドのN末端に融合させ、TRAILのアミノ酸136−141をNCPT−1ポリペプチドのC末端に融合させた(MG+NCPT−1+aa136−141)。
Met−Gly−His−His−His−His−His−His遺伝子配列を、NCPT−2をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet−Gly−His−His−His−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−2ポリペプチドのN末端へ融合させた(MG+His6+NCPT−2)。
Met−Gly−His−His−His−His−His−His遺伝子配列を、NCPT−3をコードする遺伝子の上流に融合させた、つまりMet−Gly−His−His−His−His−His−Hisアミノ酸配列をNCPT−3ポリペプチドのN末端へ融合させた(MG+His6+NCPT−3)。
TRAILの組み換えヒト円順列変異形およびその変異体の発現および精製
発現プラスミドを大腸菌の菌株BL21(DE3)内に形質転換させ、形質転換大腸菌を20μg/mLのカナマイシンを含有する10mLのLB液体培地中に植菌し、37℃で12時間にわたり振盪台上で培養した。次に10mLの培養を20μg/mLのカナマイシンを含有する1LのLB液体培地中に植菌して培養し、OD600値が0.6に達した時点に、タンパク質発現を誘導するために0.2mLの1MのIPTGを1Lの培養に加えた。3時間の誘導後、細胞を遠心により収集し、100mMのTris(pH7.9)、150mMのNaClを含有する100mLのバッファ中にペレットを懸濁させた。
肺癌細胞系へのNCPT−1、NCPT−2、およびNCPT−3の様々な変異体の死滅活性についてのアッセイ
NCI−H460細胞(ATCC)を対数増殖期までフラスコ内で培養し、0.25%トリプシン(Amresco社)を用いて消化し、遠心によって収集し(1,000rpm、5分間)、3%ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI1640培地(Invitrogen社)中に再懸濁させ、計数して1.5×105/mLの細胞懸濁液に調製し、96ウエル培養プレート(Nunc社)内に100μL/ウエルで添加し、37℃で5%のCO2インキュベータ内で一晩インキュベートした。試験対象のサンプルは、3%のFBSを含有する1640培地を用いて所定の濃度へ希釈し、さらに4倍希釈液(8倍希釈液)へ希釈した。培養プレート内の上清を廃棄し、試験対象のサンプルの連続希釈液をプレートに陰性コントロールおよび取り置いたブランクコントロールとともに100μL/ウエルで添加し、37℃の5%のCO2下で20〜24時間インキュベートした。顕微鏡下の検査の後、上清を廃棄し、各ウエルに50μLの0.05%クリスタルバイオレット溶液(50mgクリスタルバイオレットを20mLの無水エタノール中に溶解させ、容積が100mLとなるように水を加え、その後室温で貯蔵した)を加え、3〜5分間染色した。クリスタルバイオレットを流水で注意深く洗浄し、残留水を脱水(spin drying)によって除去し、脱染溶液(50mLの蒸留水、50mLの無水エタノール、および0.1mLの氷酢酸を完全に混合し、室温で貯蔵した)を100μL/ウエルで加え、次にOD570での示数をマイクロプレートリーダ(Bio−Rad 680)上で測定した(参照波長:630nm)。各サンプルの阻害濃度50(IC50)は、Sigmaplot 10.0ソフトウエアを使用する4−パラメータLogistic fittingによって計算した。CPTならびにNCPT−1、NCPT−2、およびNCPT−3の各変異体についてのIC50を計算し、各変異体の活性変化を各変異体のIC50対CPTのIC50の比率として表示した(表1)。結果は、様々な変異体の中で、NCPT−1.M1、NCPT−1.M2、NCPT−1.M3、NCPT−1.M4、NCPT−1.M5、NCPT−1.M6、NCPT−1.M7、NCPT−2.M11、およびNCPT−3.M12の活性がCPTの活性より有意に高く、NCPT−1.M8およびNCPT−1.M9の活性はCPTの活性に比較して有意に減少し、そしてNCPT−1.M10の活性はCPTの活性に比較してわずかに減少していることを示している。
NCPT−1.M1によるin vitroでの腫瘍細胞死滅における時間効果関係
NCPT−1.M1による肺癌細胞系死滅の時間効果関係。H460細胞(ATCC)を37℃で5%のCO2インキュベータ内の細胞培養フラスコ中に10%のFBSを含有するRPMI1640培地中で対数増殖期へ接着培養した。NCPT−1.M1を50ng/mLの最終濃度に加え、各々1時間、2時間、4時間および6時間培養し、その後に倒立位相差顕微鏡下で細胞の形態学的変化を観察した。ビヒクル(vehicle)コントロール群では、ビヒクル溶液の添加の6時間後に、細胞傷害の形態学的変化は認められなかった(図1A)。NCPT−1.M1添加の1時間後に、H460細胞の著明な形態学的変化は認められなかった(図1B)。NCPT−1.M1添加の2時間後、一部の細胞上では形態学的変化、細胞収縮、細胞膜小胞形成、屈折の減少が生じたが、剥離細胞はまだ希である(図1C)。NCPT−1.M1添加の4時間後、多数の細胞上で上記の形態学的変化が生じるが、剥離細胞は依然として希である(図1D)。NCPT−1.M1添加の6時間後、ほぼ全部の細胞が上記の形態学的変化を示し、フラスコ底部から剥離し、浮遊してペレットに凝集し、少数の正常細胞のみが散在した(図1F)。より高い倍率では、形態学的変化を備える細胞はアポトーシスに典型的な特徴、細胞質収縮、細胞収縮、膜小胞形成、複数のアポトーシス小体を結果として生じる、を示した(図1E)。結果は、NCPT−1.M1の1〜2時間にわたるH460細胞とのインキュベーションは、形態学的アポトーシスの外観を生じさせ、6時間にわたるインキュベーションは最大数の細胞のアポトーシスを生じさせることを示している。
多発性骨髄腫細胞系RPMI8226(ATCC)を死滅させることにおけるNCPT−1.M1の時間効果関係は、化学発光(ATPlite Luminescence Assay System、PerkinElmer社)法を使用して測定した。対数増殖期にある細胞を遠心によって収集し(1,000rpm、5分間)、3%のFBS−1640培地中に再懸濁させ、計数して2×105/mLの細胞懸濁液へ調整し、50μL/ウエルで96ウエル培養プレート内へ添加した。NCPT−1.M1サンプルは、3%のFBS−1640培地を用いて500ng/mL、63ng/mL、7.8ng/mLへ希釈し、上記NCPT−1.M1サンプルを50μL/ウエルで50μLの細胞を含有する培養ウエル内にNCPT−1.M1の最終濃度が250ng/mL、31.5ng/mL、3.9ng/mLとなるように加え、陰性コントロールウエルにはNCPT−1.M1を含まない同一容積の培地を加え、上記全部をさらに37℃の5%のCO2下で培養した。NCPT−1.M1を用いた処理の1、3、6、8、24、48時間後に、細胞溶解バッファを30μL/ウエルでプレート内に加え、3分間振盪した。細胞が完全に溶解された時点で、細胞溶解液を除去し、90μL/ウエルで化学発光プレート内に加えた。化学発光基質溶液をプレート内に30μL/ウエルで加え、3分間振盪し、その後、示数を測定した。細胞におけるNCPT−1.M1の阻害率は、NCPT−1.M1処理細胞およびコントロール細胞の発光強度に基づいて計算する。結果は、RPMI8226細胞と250ng/mL、31.5ng/mL、3.9ng/mLのNCPT−1.M1との1時間のインキュベーションでは、阻害作用は全く観察されない。3時間で、程度の異なる阻害が検出され、正の用量−作用関係にしたがう。6時間で、最大阻害に達し、8、24、48時間後の阻害強度と有意に相違しないことを示している(図2)。
NCPT−1.M1のin vitroでのアポトーシス誘導活性のアッセイ
本実施例ではNCPT−1.M1が様々なヒト腫瘍細胞系に及ぼすアポトーシス誘導活性を検出する。
RPMI8226細胞(ATCC)を対数増殖期になるまで細胞培養フラスコ内で培養し、遠心で収集し、1×106/ウエルで完全培地(10%FBS−RPMI1640)を用いて再懸濁させ、6ウエル細胞培養プレート(Costar社)内に加えた。NCPT−1.M1を完全培地で希釈し、200ng/mLの最終濃度に加え、37℃で5%のCO2インキュベータ内で3時間インキュベートした。細胞を収集し、スメアとして調製し、メタノールを用いて固定し、その後にメイ・グリュンバルト・ギムザ(May−Gruenwald−Giemsa:MGG、メイ・グリュンバルト染色:Beijing ZhongYeHengYuan Chemicals社から市販、ギムザ染色:Solarbio社から市販)染色を実施した。NCPT−1.M1と細胞との3時間のインキュベーション後に、アポトーシスの以下の明白な特徴:細胞質凝縮、細胞収縮、クロマチンの濃染、核の周辺でのクロマチン凝集、核凝縮、核崩壊、アポトーシス小体の形成が観察された(図3)。
アポトーシスのプロセス中、ゲノムDNAは、二本鎖の低分子量DNAフラグメントおよび切断端(ギャップ)を備える高分子量一本鎖DNAフラグメントに崩壊する可能性があり、これらDNA鎖のギャップは、酵素標識ヌクレオチド3’末端標識法を用いて同定することができる。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)の触媒作用の場合、FITC標識ヌクレオチドは、テンプレート非依存性様式でフリー3’末端ヌクレオチドに組み込むことができ、それにより標識されたDNA鎖のギャップが作成される(TUNEL法)。標識FITCは、ヒツジ由来Fabフラグメントに共役結合したホースラディッシュペルオキシダーゼ(POD)によって認識できる。DAB(3,3−ジアミノベンジジン)での顕色後、アポトーシス細胞であった褐色として染色された細胞を光学顕微鏡下で検査した。TUNELの技術は、アポトーシスを検出するための一般的方法である。NCI−H460細胞のNCPT−1.M1とのインキュベーション後のアポトーシスは、TUNEL技術を使用して検査した。対数増殖期にあるNCI−H460細胞(10%FBS−RPMI1640)は、NCPT−1.M1(15ng/mL)とともに4時間インキュベートし、次に全部の接着性および浮遊性細胞を収集し、PBSで2回洗浄し、PBSを用いて細胞懸濁液に調製し、スライドガラス上に塗布し、自然に風乾させ、室温で30分間かけて4%パラホルムアルデヒド中で固定した。その他の手順はTUNELアポトーシス検出キット(ZK−8005、Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology社)の取扱説明書にしたがって実施した。これらの結果は、NCPT−1.M1(15ng/mL)との4時間にわたるインキュベーション後に、多数のNCI−H460細胞はアポトーシスを経験し、核凝縮、多数の核フラグメントへのフラグメント化、様々なサイズの濃褐色顆粒を示すことを証明している(図4B)。陰性コントロール群ではアポトーシス細胞は全く見られない(図4A)。
対数増殖期にあるNCI−H460細胞をNCPT−1.M1(最終濃度、15mg/mL)とともに2時間、4時間、6時間にわたりインキュベートし、培地コントロール群にはNCPT−1.M1を加えなかった。全接着性および浮遊性細胞(およそ5×106)を収集し、DNAを抽出した(Wen Jinkun, Principles and experimental techniques of medical molecular biology, 236−237(1999))。DNAサンプルを除去し、6×ローディングバッファと混合し、1.8%アガロースゲル(臭化エチジウムの最終濃度、0.5μg/mL)電気泳動にかけた。ゲルを紫外線源下で観察して撮影し、DNAフラグメント化について分析した。H460細胞をNCPT−1.M1(15ng/mL)とともに2時間インキュベートすると、そのDNA電気泳動は、アポトーシスの主要な生化学的特徴である明瞭なラダーを示した[Cohen, Advances in Immunol., 50:55−85(1991)]。これとは反対に、培地コントロール群のDNA電気泳動では、高分子に対応するバンドはローディングウエルに極めて近く、DNAフラグメント化ラダーは存在しない。NCPT−1.M1とのインキュベーション時間を増加させると、DNAラダーは弱く曖昧になって判読できなくなるが(図5)、これはおそらくDNAがより小さなフラグメントに分解したためと考えられる。
H460細胞は、1.2ng/mLおよび10ng/mLのNCPT−1.Ml(培養法は上記と一緒である)とともに24時間インキュベートし、MTTアッセイによって測定した細胞生存率は各々60%および16%であった。30μmol/Lのカスパーゼ−8阻害剤であるzIETD−fmk(Santa Cruz社)を加え、1時間後に、1.2ng/mLもしくは10ng/mLのNCPT−1.M1を加えて24時間、同時インキュベートし、そうして、結果として細胞生存率は各々100%および90%であった。結果は、カスパーゼ−8阻害剤がH460細胞へのNCPT−1.M1のアポトーシス活性の誘導を遮断したことを示しており、カスパーゼ−8の活性化がH460細胞上のNCPT−1.M1によって誘導されたアポトーシスのシグナル伝達経路に関係していることを示唆している(図6)。
NCPT−1.M1のin vivoでのアポトーシス誘導活性のアッセイ
Balb/c nu無胸腺ヌードマウス(Beijing Huafukang Biotechnology社)にヒトMM RPMI8226腫瘍細胞を皮下接種した。腫瘍が700〜800mm3の容積に増殖した時点で、マウスをコントロール群(n=3)およびCPT処置群(n=3)に分け、連続3日間にわたり1日1回、15mg/kgの用量でコントロールもしくはNCPT−1.M1を腹腔内注射した。第4日に、腫瘍容積を測定し(上記と同一方法)、全動物を致死させ、腫瘍を切除して、10%ホルムアルデヒド溶液中で固定した。腫瘍組織は、様式化された方法にしたがってパラフィン中に包埋し、切片に切断してHE染色した。パラフィン包埋組織切片のアポトーシスアッセイは、TUNELアポトーシス検出キット(ZK−8005、Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology社)の取扱説明書にしたがって実施した。連続3日間にわたるNCPT−1.M1を用いた処理後に、平均腫瘍容積は投与前の798mm3から286mm3へ有意に減少した。HE染色は、凝縮および破砕した青−黒染色の核、ならびに淡赤色の細胞質を備える多数のアポトーシス細胞を示している(図7B)。これとは反対に、正常細胞の核は、淡青もしくは青色である(図7A)。TUNEL染色後、アポトーシス細胞の核は茶色に染色される(図7D)。結果は、NCPT−1.M1処理により迅速に多数のMM腫瘍細胞のアポトーシスが生じ得ることを示している。
NCPT−1.M1がヌードマウスにおける異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性
ヒト結腸癌異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性:
4〜5週齢のBalb/c nu雄マウス(Institute of Experimental Animals、Chinese Academy of Medical Sciences社)にCOLO205ヒト結腸癌組織片を皮下接種した。腫瘍が約120mm3の容積まで増殖した時点で、担癌マウスを4つの群(n=7/群)に分け、生理食塩液(陰性コントロール群)、NCPT−1.M1(5mg/kg)、NCPT−1.M1(15mg/kg)、およびwtTRAIL(15mg/kg)を各々1日1回、連続10日間にわたり腹腔内注射した。投薬停止後、マウスを実験終了前にさらに12日間観察した。実験中、腫瘍の長い径(a)および幅広の径(b)を2日毎にノギスを用いて測定し、腫瘍容積(TV)を以下の式にしたがって計算した。TV=1/2×a×b2。上記から、相対腫瘍容積(RTV)は下記の式にしたがって計算した。RTV=Vt/V0。式中、V0は、投与当日であるが投与前(つまりd0)に測定した腫瘍容積であり、Vtは、各時点で測定した腫瘍容積である。相対腫瘍増殖率T/C(%)は、評価指数として使用する。評価基準:T/C(%)>40%は作用なしを意味する。T/C(%)≦40%およびP<0.05の統計的有意性は、有効であることを意味する。
無胸腺ヌードマウス(Beijing Huafukang Biotechnology社)に5×106のRPMI8226腫瘍細胞/マウスを皮下接種した。腫瘍が500mm3の容積まで増殖した時点で、マウスを幾つかの群に分け、生理食塩液(陰性コントロール群)、NCPT−1.M1(15mg/kg)、およびwtTRAIL(15mg/kgまたは45mg/kg)を各々1日1回、連続8日間にわたり腹腔内注射した。腫瘍容積は、2日毎にノギスを用いて測定した。用量15mg/kgを用いたNCPT−1.M1群の腫瘍増殖率は45mg/kgを用いたwtTRAIL群の腫瘍増殖率に比較して有意に低く、これはNCPT−1.M1の主要素外活性がRPMI8226に野生型TRAILが及ぼす阻害活性より強力なことを示唆している(図8)。
化学療法薬と併用したNCPT−1.M1がヒト多発性骨髄腫細胞系に及ぼす阻害活性
本実施例では、化学療法薬メルファラン(GlaxoSmithKline社)と併用したNCPT−1.M1がヒト多発性骨髄腫細胞系RPMI8226、H929、U266B1(全てATCC由来)に及ぼす腫瘍死滅効果を化学発光(ATPlite Luminescence Assay System、PerkinElmer社)法を用いて測定したが、このときRPMI8226およびH929はどちらもNCPT−1.M1に対して感受性であり、U266B1はNCPT−1.M1に対して非感受性である。対数増殖期にある細胞を遠心によって収集し、10%ウシ胎児血清(FBS)を含有するRPMI1640培地を用いて2×105〜3×105/mLの密度で細胞懸濁液に調製し、1×104〜1.5×104/ウエルで96ウエル培養プレート(NUNC)内へ加えた。NCPT−1.M1およびメルファランは上記の培地を用いて2倍(または3倍もしくは4倍)連続希釈し、メルファラン(またはNCPT−1.M1)は所定の濃度のNCPT−1.M1溶液(もしくはメルファラン溶液)を用いて希釈し、上記の培養プレート内に添加し、37℃の5%のCO2インキュベータ内で反応を停止させる前に48時間インキュベートし、その後に化学発光を検出した。細胞生存率を実験ウエルおよびコントロールウエルの発光強度に基づいて計算し、併用治療の結果は、メジアン有効分析ソフトウエアCalcuSyn V2(BIOSOFT社)を使用して分析し、そしてCIは併用係数(Combination Index)を意味する。0.9〜1.1のCIは、2種の薬物の相加作用の指標である。CI<0.9は2種の薬物の相乗作用の指標であり、そしてCI>1.1は2種の薬物の拮抗作用の指標である。
化学療法薬と併用したNCPT−1.M1がヌードマウスにおける異種移植片腫瘍に及ぼす阻害活性
雄性Balb/c nu無胸腺ヌードマウス(Beijing Huafukang Biotechnology社)に5×106個のRPMI8226腫瘍細胞/マウスを皮下接種した。腫瘍が約500mm3〜600mm3に増殖した時点で、マウスを生理食塩液コントロール群(ip)、NCPT−1.M1群(15mg/kg、ip、連続10日間にわたり1日1回)、プレドニゾン(10mg/kg、PO、連続10日間にわたり1日1回)と併用したメルファラン群(0.75mg/kg、PO、連続5日間にわたり1日1回)、メルファランおよびプレドニゾンと併用したNCPT−1.M1群に分けた(各薬物の用量、投与方法および投与頻度は上記と同一であった)。腫瘍容積は、2日毎にノギスを用いて測定した。実験終了時に、メルファランおよびプレドニゾンと併用したNCPT−1.M1群の腫瘍容積は、NCPT−1.M1単剤療法群およびプレドニゾンと併用したメルファラン群の腫瘍容積より有意に少なかった(P<0.05)。これら3種の薬物を併用した場合、腫瘍は57%のマウスにおいて完全に消失し、NCPT−1.M1単剤療法群では、腫瘍は16%のマウスにおいてのみ完全に消失したが、プレドニゾンと併用したメルファラン群では腫瘍は完全には消失しなかった。結果は、NCPT−1.M1、メルファランおよびプレドニゾンの3剤併用がRPMI8226腫瘍に及ぼす腫瘍阻害作用が有意に増強されることを示唆している(図12)。
5〜6週齢のBalb/c nu無胸腺雄マウス(Institute of Experimental Animals、Chinese Academy of Medical Sciences社)にNCI−H460ヒト肺癌を皮下接種した。腫瘍が約150mm3のサイズに増殖したら、マウスを以下に示す、生理食塩液コントロール群(ip)、NCPT−1.M1単剤療法群(15mg/kg、ip、連続9日間にわたり1日1回)、化学療法群(PCレジメン:パクリタキセル30mg/kg(ip)およびカルボプラチン60mg/kg(ip)、第1日に1回投与)、NCPT−1.M1併用化学療法群(各薬物の投与様式および用量は上記と同一である)に分けて投与した。実験中、腫瘍の長径(a)および幅広の径(b)を2日毎にノギスを用いて測定し、腫瘍容積(TV)を以下の式にしたがって計算した。TV=1/2×a×b2。上記から、相対腫瘍容積(RTV)を下記の式にしたがって計算した。RTV=Vt/V0。式中、V0は、投与当日だが投与前(つまりd0)に測定した腫瘍容積であり、Vtは、各時点に測定した腫瘍容積である。相対腫瘍増殖率T/C(%)は、評価指数として使用する。
Claims (12)
- 配列番号5〜11、及び15〜16からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるTRAILの円順列変異形を含む融合タンパク質。
- 請求項1に記載の融合タンパク質をコードする単離核酸。
- 請求項2に記載の単離核酸を含むベクター。
- 請求項3に記載のベクターを含む宿主細胞。
- 腫瘍を治療するための医薬組成物であって、請求項1に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
- 前記腫瘍は、多発性骨髄腫、リンパ腫、脾腫、黒色腫、神経膠腫、縦隔腫瘍、尿管腫瘍、婦人科腫瘍、内分泌系腫瘍、中枢神経系腫瘍、肺癌、結腸癌、胃癌、食道癌、腸癌、肝臓癌、膵臓癌、直腸癌、腎腺癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、精巣癌、卵巣癌、乳癌、及び白血病からなる群から選択される請求項5に記載の医薬組成物。
- 腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む請求項5又は6に記載の医薬組成物。
- 腫瘍を治療するための前記追加の薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、VP16、5−FUからなる群から選択される請求項7に記載の医薬組成物。
- 腫瘍を治療するためのキットであって、請求項1に記載の融合タンパク質を含むキット。
- 腫瘍を治療するための1つ以上の追加の薬物をさらに含む請求項9に記載のキット。
- 腫瘍を治療するための前記融合タンパク質および前記追加の薬物は、一緒に混合される、または別個に配置される請求項10に記載のキット。
- 腫瘍を治療するための前記追加の薬物は、メルファラン、デキサメタゾン、サリドマイド、レナリドミド、ベルケード、ビンクリスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、リポソームドキソルビシン、シクロホスファミド、イリノテカン、プレドニゾン、パクリタキセル、カルボプラチン、シスプラチン、VP16、および5−FUからなる群から選択される、請求項10又は11に記載のキット。
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