KR0172186B1 - 신규의 성장/분화인자를 암호화하는 dna 서열 - Google Patents

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Abstract

본원은 신규의 TGF-β족 단백질을 암호화하는 DNA 서열을 제공한다. TGF-β족은 성장 및/또는 분화인자로서 기능하며, 의료용으로 유용한 단백질로 구성된다. 본원은 또한 상기 DNA 서열의 분리, 암호화된 단백질의 발현, 상기 단백질의 생상 및 상기 단백질을 함유하는 제약조성물에 관한다.

Description

신규의 성장/분화인자를 암호화하는 DNA 서열
제1도는 관련 단백질과 함께 MP-52 및 MP-121의 아미노산 서열의 배열을 나타낸다. 1a는 최초의 7개의 보존 시스테인으로부터 출발한 BMP 단백질족의 일부 구성원과 함께 MP-52 의 배열을 나타내며; 1b는 인히빈 단백질 족의 일부구성원과 함께 MP-121의 배열을 나타낸다. *는 아미노산이 비교된 모든 단백질에 있어서 동일함을 의미한다; +는 아미노산이 MP-52(제1a도) 또는 MP-121(제1b도)와 비교하여 최소한 1개 단백질에서 동일함을 의미한다.
제2도는 본 발명에 사용된 올리고누클레오티드 프라이머의 누클레오티드 서열을 기지의 TGF-β 족 구성원의 서열의 배열과 함께 나타낸다. M은 A 또는 C; S는 C 또는 G; R은 A 또는 G; 그리고 K는 G 또는 T를 의미한다. 2a는 프라이머 OD의 서열을 도시하며; 2b는 프라이머 OID의 서열을 도시한다.
본 발명은 신규의 TGF-β - 형 단백질에 관한 것으로서 상응하는 유전자에 함유된 DNA 서열을 제공한다. 이러한 서열은 하기서열, 즉,
ATGAACTCCATGGACCCCGAGTCCACA 및
CTTCTCAAGGCCAACACAGCTGCAGGCACC 과 특히 SEQ ID No.1 및 2에 설명된 서열, 상기 서열의 대립형질 유도체 및 상기 서열에 대한 유전암호의 결과 축퇴된(degenarated) DNA 서열을 포함하는 누클레오티드 서열을 포함한다. 이들 서열은 또한 건축 조건(stringent condition)하에서 상술한 DNA 서열과 교잡하고 하기 아미노산 서열, 즉,
Mwt - Asn - Ser - Met - Asp - Pro - Glu - Ser - Thr 또는 Leu - Leu - Lys - Ala - Asn - Thr - Ala - Ala - Gly - Thr
을 함유한 DNA 서열을 포함한다.
비록 상기 대립형질, 축퇴성 및 교잡 서열은 약간의 결실 또는 치환과 같은 자연적으로 발생하는 돌연변이로 인해 구조적으로 차이가 있을 수 있지만, 본질적으로 동일한 유용한 특성이 있어서 기본적으로 동일한 의료 용도로 사용될 수 있다.
본 발명에 의하면 교잡이란 통상의 교잡 조건, 바람직하게는 62℃ 내지 66℃에서 염농도 6 × SSC 로 한 후 62℃ 내지 66℃에서 0.6 × SSC, 0.1 % SDC 로 1시간동안 세척하는 것을 의미한다. 교잡이란 용어는 바람직하기로는 긴축 교잡조건, 즉, 62℃ - 66℃에서 염농도 4 × SSC로 한 후 62℃ - 66℃에서 0.1 × SSC, 0.1 % SDS로 1시간 동안 세척하는 것을 의미한다.
암호화된 단백질의 주요 생물학적 활성은 유사분열 및 골-유도 능력을 포함하며, Roberts 등, PNAS 78 (1981), 5339-5343, Seyedin 등, PNAS 82 (1985), 2267-2271 또는 Spath 및 Redddi, PNAS 78 (1981), 7599-7603에 따른 시험법에 의해 확인할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예는 상술한 바와 같은 DNA 서열이며 척추동물, 바람직하게는 돼지, 소와 같은 포유류, 쥐 또는 생쥐와 같은 설치류, 특히 인간과 같은 영장류로부터 얻을 수 있다.
특히 바람직한 본 발명의 구체예는 SEQ ID No.1 및 2에 도시된 MP-52 및 MP-121로 명명된 DNA 서열이다. MP-52의 상응 전사체는 배형성 조직으로부터 얻을 수 있고 BMP- 형 단백질의 성숙 부위와 상당한 아미노산 상동관계를 보이는 단백질의 암호를 지정한다.(제1a도 참조) BMP2(=BMP2A) 및 BMP4(=BMP2B) 의 단백질 서열은 Wozney 등, Science Vol 242, 1528-1534 (1988)에 기술되어 있으며, BMP5, BMP6, BMP7 각각의 서열은 Celeste 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol 87, 9843-9847 (1990) 에 기술되어 있다. 공지된 BMP - 서열에만 특이적인 전형적인 서열 상동관계는 MP-52의 프로펩티드 부분에서도 발견되었으나 MP-52 의 전구체 부분의 다른 부분은 BMP 전구체와 현저한 차이를 보여주었다. MP-121 의 mRNA는 간 조직에서 검출되었으며, 상응 아미노산 서열은 인히빈 단백질쇄의 아미노산 서열과 상동관계에 있다(제1b도 참조). TGF-β - 형 단백질을 암호화하는 cDNA 서열은 아직 간 조직으로부터 분리되지 않았는데, 이는 이 조직내에서 TGF-β 특이적 전사체가 적은 사실에 기인할 것이다. 그러나, 배형성 조직에서는 공지의 TGF-β - 형 단백질을 암호화하는 서열이 비교적 많이 발견될 수 있다. 최근 본 발명자들은 간에서도 TGF-β - 형 단백질의 집합물이 존재하는 사실을 발견하였다. 이 그룹의 공지 인자와 관련된 클론이 잘 알려지지 않아서 이들 조직 또는 다른 조직으로부터 신규의 TGF-β- 관련 서열을 확인하는데 제일 큰 장애가 된다. 본 발명에서는, 클로닝을 하기 방법으로 실시하였다. 일단 DNA 서열이 클로닝되면, TGF-β 형 단백질을 제조할 수 있는 숙주세포의 생산 및 상기 단백질의 생산은, 공지의 DNA 재조합기술을 사용하여 수행될 수 있는 바, 공지의 DNA 재조합 기술은 상기 단백질을 암호화하는 발현 플라스미드를 제조하는 단계, 상기 발현 플라스미드로 숙주세포를 형질전환시키는 단계, 적합한 배지에서 형질전환체를 배양하는 단계, 및 TGF-β- 형 활성을 지닌 생성물을 회수하는 단계를 포함한다.
따라서, 본 발명은 발현 조절서열에 임의적으로 결합되어 있는 상기의 DNA 서열을 포함하는 재조합 분자에 관한 것이기도 하다. 이러한 벡터는 안정적으로 또는 일시적으로 형질전환된 세포내에서 TGF-β- 형 단백질을 제조하는데 유용할 수 있다. 형질전환 및 후속 배양과정에 몇몇 동물, 식물, 균류 및 박테리아 시스템을 사용할 수 있다. 바람직하기로는, 본 발명에 사용될 수 있는 발현벡터는 숙주세포내의 복제에 필요한 서열을 함유하며 자발적 복제가 가능한 것이다. 또한 형질전환된 세포에 대해 쉽게 선택될 수 있는 선택성 표식 유전자를 함유한 벡터를 사용하는 것도 바람직하다. 필요한 조직은 당업자들에게 공지되어 있다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 발현 플라스미드에 의해 형질전환되었으며 TGF-β 족 단백질을 제조할 수 있는 숙주세포를 제공하는 것이다. 적합한 숙주세포의 예로는 대장균, 곤충 세포, 식물세포, 포유류 세포 및 이스트와 같은 다양한 진핵 및 원핵세포가 포함된다.
본 발명의 또다른 목적은 조직 유도성, 특히 골-유도성 및/또는 치료적 용도와 관련될 수 있는 유사분열능력과 같은 생물학적 특성을 지니며, 상기한 DNA서열에 의해 암호화된 TGF-β - 족 단백질을 제공하는 것이다. 상기 단백질의 상기 특성은 호모이합체 또는 헤테로이합체의 형성에 따라 변화할 수 있다. 이러한 구조체는 임상 용도로도 유용하다. TGF-β - 족 단백질 중 특히 바람직한 단백질 (MP-52) 의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3으로 나타내었다.
본 발명의 또다른 양상은 TGF-β 형 단백질의 제조방법을 제공한다. 이러한 방법은 본 발명의 DNA 서열로 형질전환된 숙주세포를 적당한 배지에서 배양시키는 단계 및 생성된 TGF-β - 형 단백질을 정제하는 단계를 포함한다. 따라서, 이 방법은 의료적 치료 또는 그 수행에 성장 인자를 필요로 하는 세포배양기법을 사용하는 용도에 유용한 바람직한 단백질을 충분한 양으로 생산하는 것을 가능케한다. 숙주세포는 바실루스(Bacillus) 또는 대장균(Escherichia coli) 과 같은 박테리아, 이스트와 같은 균, 담배, 감자 또는 아라비돕시스(Arabidopsis) 와 같은 식물, 포유류 특히 MO-, COS- 또는 CHO 세포계와 같은 척추동물 세포계로부터 얻을 수 있다.
본 발명은 또다른 양상은 대상 조직내의 적은 양의 mRNA 에 상응하는 DNA서열을 특히 고감도로 분리하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 방법은 4개의 다른 단계를 포함한다. 1단계로, mRNA를 분리한 다음 올리고누클레오티드 프라이머를 사용하여 증폭반응시킨다. 올리고누클레오티드 프라이머의 서열은 대상 유전자와 관련된 단백질의 아미노산 서열로부터 유도된 축퇴성 DNA 서열을 함유하고 있다. 이 단계는 이미 공지된 대상 유전자족을 증폭시킬 수 있으며, 따라서, 이들 바람직하지 못한 서열은 제거하여야 한다 이러한 목적은 기분석된 유전자족 구성원을 소화시키는 것으로 알려진 제한 핵산중간분해효소(restriction endonuclease)를 사용하여 달성할 수 있다. 증폭된 DNA 집단을 상기 제한 핵산중간분해효소로 처리한 후, 남아있는 바람직한 DNA 서열을 겔 전기영동에 의해 분리한 후 3단계에서 증폭반응으로 재증폭시킨다음, 4단계에서 이들의 서열 결정에 적합한 벡터내에서 클로닝시킨다. 감수성 및 효율을 증대하기 위해, 2단계 및 3단계를 반복수행하며, 본 발명의 한 실시예에서는 최소한 2회 수행한다.
바람직한 실시예에서, 상술한 분리 방법은 간 조직으로부터 DNA 서열을 분리하는데 사용된다. 상술한 방법의 특히 바람직한 실시예에서는 PCR 실험에 사용되는 첫 번째 프라이머가 mRNA polyA 꼬리와 상동인 반면, 두 번째 프라이머는 유전자-특이성 서열을 함유한다. 본 방법의 다양한 단계를 수행하는데 사용되는 기법(증폭반응 또는 시퀀싱기법과 같은)은 당업자에게 공지되어 있으며, 예를 들면 Sambrook 등, 1989, Molecular Coning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press에 기재되어 있다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명에 따른 TGF-β족 단백질을 치료학적으로 유용한 양으로 함유한 약제 조성물을 제공하는 것이다.
선택적으로, 이러한 조성물은 제약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 이런 약제 조성물을 단독 또는 적합한 담체와 함께, 그리고 가능하다면 기타 관련 단백질 또는 성장인자와 함께 상처회복 및 조직 복구뿐만 아니라 뼈, 연골 또는 치아 질환의 치료에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 약제 조성물은 이에 국한되는 것은 아니지만 MP-121 암호화된 단백질 및 임의적으로, EGF(표피성장인자) 또는 PDGF(혈소판으로부터 유도된 성장 인자)와 같은 기타 공지된 생물학적 활성물질과 함께 MP-52 암호화된 단백질을 포함할 수 있다. TGF-β - 형 단백질의 또다른 임상용도는 기관이식 거부반응을 막을 수 있는 면역반응 억제인자로도 사용하는 것이다. 본 발명 단백질을 포함하는 약제조성물은 예방적으로 사용되거나 또는 미용성형수술에서도 사용할 수 있다. 더욱이, 본 조성물의 용도는 인체에 국한되지 않고 동물 특히 가축에도 사용될 수 있다.
마지막으로, 본 발명의 또다른 목적은 본 발명 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 항체 조각을 제공하는 것이다. 이러한 특이적 항체를 얻는 방법은 공지되어 있다. 이러한 항체는 모노클론 항체인 것이 바람직하다. 이러한 항체 또는 항체 조각은 진단용으로 유용할 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 상세히 예시되어 있으나 이들이 본 발명을 국한시키는 것은 아니다.
본 발명은 TGF-β 족의 신규의 성장/분화인자를 암호화하는 DNA서열에 관한 것이다. 특히 본 발명은 TGF-β - 형 단백질을 암호화하는 신규의 DNA서열, 상기 DNA을 함유한 발현 플라스미드, 상기 발현 플라스미드에 의해 형질전환된 미생물, 그리고 상기 형질전환체를 배양하여 상기 단백질을 제조하는 것; 그리고 상기 단백질을 함유한 약제 조성물에 관한 것이다. BMP, TGF 및 인히빈(Inhibin)관련 단백질을 포함하는 성장인자의 TGF-β 족(Roberts and Sporn, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990), 419-472)은 특히 광범위한 의과적 치료용도와 관련되어 있다.
이들 인자는 상처회복 및 조직복구와 관련된 과정에 유용하다. 또한, TGF-β 족의 몇몇은 조직 유도, 특히 골-유도성이며 그 결과 연골 유도 및 뼈의 발육에 중대한 역할을 한다.
Wozney, Progress in Growth Factor Research 1 (1989), 267 - 280 및 Vale 등, Handbook of Experimental Pharmacology 95 (1990) 211 - 248 에는 BMP(골 형태형성 단백질)과 인히빈 그룹에 관련된 다양한 성장인자들이 기재되어 있다. 이들 그룹의 구성원은 상당한 구조적 유사성을 공유하고 있다. 단백질의 전구체는 아미노말단 시그널 서열, 프로펩티드 및 약 110개의 아미노산으로 된 카복시말단서열로 구성되어 있으며, 카복시말단 서열은 이후 전구체로부터 절단되어 성숙한 단백질이 된다. 더욱이, 이들 구성원들은 아미노산 서열의 상동관계에 의해 규정된다. 성숙한 단백질은 가장 보존적인 서열, 특히 족 구성원사이에 보존되어 있는 7개의 시스테인 잔기를 함유한다. TGF-β 형 단백질은 다관능기의 호르몬 활성 성장인자이다. 이들은 또한 세포의 화학주성 친화성, 세포분화촉진성 및 연골 및 골 유도능과 같은 조직유도능과 같은 관련 생물학적 활성을 공유한다. 미합중국 특허 제 5,013,649 호에는 BMP - 2 단백질(골 형태형성 단백질)로 명명된 골 - 유도단백질을 암호화하는 DNA 서열이 기재되어 있으며, 미합중국 특허출원 제 179101 호 및 제 179197 호에는 BMP 단백질 BMP - 1 및 BMP - 3 이 기재되어 있다. 더욱이 많은 세포 유형이 TGF-β형 단백질을 합성할 수 있고, 거의 모든 세포가 TGF-β 수용체를 지닌다.
이들 단백질은 그 구조에 있어서 차이가 있기 때문에 구체적인 생물학적 기능에 상당한 차이가 있다. 또한, 이들 단백질은 매우 다양한 조직 및 발생 단계에서 발견된다. 결과적으로, 이들은 구체적인 기능, 예를 들면 필요한 세포생리학적 환경, 수명, 표적, 필요한 보조인자, 및 분해에 대한 내성과 관련하여 차이점이 있을 수 있다. 따라서, 비록 조직 유도성, 특히 골 유도능을 나타내는 수많은 단백질이 기재되어 있지만, 생물체에서 이들의 본래의 역할, 보다 중요하게는 이들의 의료적 관련성은 보다 상세히 설명되어져야만 한다. 골 발생 또는 기타 조직의 분화/유도와 관련된 TGF-β 족의 아직 알려지지 않은 구성원이 존재할 것이 강력히 예상된다. 그러나, 이들 신규의 TGF-β- 형 단백질의 분리에 있어 중요한 문제점은 이들 단백질의 기능이 아직 식별력있는 생물 검정법을 설계할 수 있을 정도로 충분히 정확하게 아직 알려지지 않았다는 것이다. 반면, 이미 알려진 TGF-β 족 구성원에 대한 뉴클레오티드 서열의 상동관계는 예상율이 너무 낮아 전통적인 핵산 교잡법에 의한 스크리닝을 할 수 없다. 그럼에도 불구하고, 신규의 TGF-β - 형 단백질의 분리 및 동정은 모든 의료적 요구조건에 부합하는 유도 및 분화 단백질의 완전한 세트를 얻기 위하여 강력히 요청된다. 이들 인자는 뼈 및/또는 예를 들어 신장 및 간과 같은 기타 조직의 퇴행성 질환의 결함 복구 및 치료라는 유용한 의료적 용도로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명에 내재한 기술적 문제는 본질적으로 유사분열적 및/또는 분화-유도적, 즉 골 유도능을 지닌 TGF-β 단백질족의 신규 구성원을 암호화하는 DNA 서열을 제공하는 것이다.
상술한 기술적 문제에 대한 해답은 청구범위 제1항 내지 제17항에서 구체화된 실시예들을 제공함으로써 얻을 수 있다. 본 발명의 기타 특징 및 장점은 바람직한 구체예의 설명 및 도면으로부터 명백해질 것이다. 서열목록 및 도면을 간단히 설명하면 다음과 같다.
SEQ ID NO.1 은 MP-52의 뉴클레오티드 서열, 즉 성숙한 펩티드에 상응하는 배(胚) 유래 서열과 MP-52의 프로펩티드에 대한 대부분의 암호해독 서열을 나타낸다.
MP-52의 5' - 말단에서 프로펩티드 서열의 일부는 아직 확인되지 않았다.
SEQ ID NO.2 는 현재까지 확인된 간-유래 서열 MP-121의 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
SEQ ID NO.3 은 SEQ ID NO.1로부터 추론된 MP-52의 아미노산 서열을 나타낸다.
MP-121의 분리
1.1 Chirgwin 등의 방법 [Biochemistry 18 (1979), 5294-5299]에 의해 인간 간조직 (40세 남성의 것)에서 전체 RNA를 분리하였다. 올리고 (dT) 크로마토그래피법에 의해 제조업자(Stratagene Poly (A) Quick columns)의 설명서에 따라서 전체 RNA에서 폴리 A+RNA를 분리하였다
1.2 역전사 반응을 위해, 간 조직에서 얻은 폴리A+RNA (1-25㎍)를 65℃에서 5분동안 가열한 후 얼음에서 급속냉각시켰다.
폴리(A+) ㎍당 27 U RNA 보호제(27 U RNA guard, pharmacia), 2.5 ㎍ 올리고 d (T)12-18(Pharmacia) 5×완충용액 (250 mM 트리스/HCl pH 8.5 : 50 mM MgCl2: 50 mM DTT : 5 mM 의 각각의 dNTP; 600 mM KCl) 및 20 단위의 조류 골수성백혈병 바이러스 역전사효소 (AMV, Boehringer Mannheim)를 함유하는 역전사 시약을 부가하였다. 반응 혼합물 (25 ㎕)을 42℃에서 2시간동안 인큐베이션시켰다. 간 cDNA 풀을 -20℃에 저장하였다.
1.3 증폭 반응 시발용의 디옥시누클레오타이드프라이머 OD와 OID (제2도)를 자동 DNA - 합성기 (Biosearch)를 이용하여 얻었다. 폴리아마이드겔을 이용하여 전기영동한 것을 변성하고 이소태코포레시스(isotachophoresis)에 의해 겔로부터 주요 밴드(main band)를 분리함으로써 정제를 행하였다. 올리고누클레오타이드는 공지의 몇몇 TGF-β족 구성원들의 핵산서열을 배열시킨 뒤 가장 보존 정도가 높은지역을 선택하는 방법으로 만들었다. 이 지역의 배열을 제2도에 나타내었다. 클로닝을 용이하게 할 목적으로 두 개의 올리고누클레오타이드 모두에 EcoR I 제한 부위를 함유시키고, OD에는 OD의 5'말단에 EcoR I 제한부위와 Nco I 제한부위를 함께 함유시켰다.
1.4 중합효소 사슬반응에서는 간에서 얻은 cDNA 풀이 50㎕의 반응혼합물내에서 주형으로서 사용되었다. 1×PCR-완충용액 [16.6mM(NH4)2SO4; 67mM 트리스/HCl pH 8.8 ; 2mM MgCl2; 6.7 μM EDTA ; 10mM β- 머캡토에탄올 ; 170 ㎍/㎖ BSA (Gibco)], 200μM 의 각 ddNTP(Pharmacia), 30 pmol의 각 올리고누클레오타이드(OD와 OID) 및 1.5 단위의 Taq 중합효소(AmpliTaq, Perkin Elmer Cetus)내에서 증폭시켰다.
PCR 반응에서 출발물질로서 30ng의 폴리 (A+)RNA에 대응하는 cDNA를 함유시켰다. 반응혼합물에 파라핀을 입힌 후 40 사이클 (사이클 1 : 80s 93℃/40s 52℃/40s 72℃ ; 사이클 2-9 : 60s 93℃/40s 52℃/40s 72℃; 사이클 10-29 : 60s 93℃/40s 52℃/60s 72℃ ; 사이클 30-31 : 60s 93℃/40s 52℃/90s 72℃ ; 사이클 40 : 60s 93℃/40s 52℃/420s 72℃)의 PCR을 행하였다. 여섯 개의 PCR - 반응혼합물 풀을 얻어서 동일 부피의 페놀, 페놀/클로로포름 (1:1 (v/v)) 및 클로로포름/이소아밀알콜 (24:1(v/v))로 차례로 추출한 뒤 에탄올 침전법으로 농축시켰다.
1.5 상기에서 얻은 PCR풀의 절반은 제한효소 Sph I (Pharmacia)와 AlwN I (Biolabs)로 소화시키고, 나머지 절반은 제한효소 Ava I (BRL), AlwN I (Biolabs) 및 Tfi I (Biolabs)가 사용된 일련의 반응으로 소화시켰다. 제한 핵산중간분해효소 소화는 8단위의 각 효소 및 제조업자가 권장하는 완충용액내에서 2-12시간 동안 100㎕로 37℃(Tfi I는 예외적으로 65℃)에서 행하였다.
1.6 각 DNA 샘플을 4% 아가로즈겔(3% FMC Nusieve agarose, Biozym 및 1% agarose, BRL)과 트리스 붕산염 완충용액(89mM Trisbase, 89mM 붕산, 2mM EDTA, pH 8)을 사용한 전기영동법으로 분획시켰다. 에티디움브로마이드로 염색 후 분해되지 않은 증폭 생성물(약 200 bp ; 크기 표지(size marker)가 함께 이용됨)을 겔에서 절단해내어 페놀추출법으로 분리시켰다: 즉, 동일 부피의 페놀을 절단해낸 아가로즈에 부가하고, 작은 조각으로 만들고, 10분 동안 냉동시킨 후 와동 및 원심분리시켰다. 수상(水狀)을 수거하고, 중간상을 동일부피의 TE-완충용액으로 재추출하고 원심분리시킨 뒤 수상 모두를 함께 모았다. DNA를 페놀/클로로포름 추출법으로 2회, 클로로포름/이소아밀알콜 추출법으로 1회로 추가 정제하였다.
1.7 에탄올 침전후, 분리한 DNA 중 1/4 또는 1/5을 1차 증폭시 사용했던 바와 동일한 조건 [단, 사이클 횟수를 13회로 줄임 - 사이클 1 : 80s 93℃/40s 52℃/40s 72℃ ; 사이클 2-12 : 60s 93℃/40s 52℃/60s 72℃; 사이클 13 : 60s 93℃/40s 52℃/420s 72℃]하에 다시 증폭시켰다. 재증폭 생성물을 정제하여 상술한 바와 같은 효소로 제한시킨 뒤, 분해되지 않은 생성물을 상술한 바와 같은 방법으로 아가로즈 겔에서 분리해내었다. 재증폭과 제한 및 겔 분리를 차례로 다시 한 번 행하였다.
1.8 겔로부터의 마지막 분리 후, 증폭생성물을 EcoR I (Pharmacia) 4단위에 의해 제조업자가 권장하는 완충용액으로 37℃에서 2시간 증폭시켰다. 제한시킨 혼합물 1/4을 EcoR I에 의해 소화시킨 벡터 pBluescriptⅡ SK+ (Stratagene)에 결찰시켰다(ligated). 결찰 후, 각 효소 조합으로부터의 24개의 클론이 서열분석법에 의해 추가로 분석하였다.
AlwN I 과 Sph I로 제한시킨 샘플은 새로운 서열을 함유치아니하고 BMP6와 인히빈 βA서열만을 함유하였다. Ava I, AlwN I 및 Tfi I 로 제한시킨 샘플에서 MP-121로 명명된 19개의 동일한 새로운 서열을 얻었다. 단지 1개의 서열만이 나머지 서열과 달랐는데 그 차이는 2개의 누클레오타이드가 서로 다른 것뿐이었다. Sambrook 등의 방법[Molecular cloning : A Laboratory manual (1989)]으로 E. Coli HB101에서 결찰 반응과 형질전환 반응을 행하였다. 암피실린 내성여부를 조사하는 방법으로 형질전환체를 선별한 후, 표준 방법[Sambrook 등(1989)] 으로 플라스미드 DNA를 분리해내었다. 분석은 시퀀싱 키트 Seguenase Version 2.0 (미합중국 Biochemical Corporation)를 이용한 디데옥시리보누클레오타이드 사슬 말단 시퀀싱 법에 의해 두가닥 플라스미드를 시퀀싱하는 방법을 사용하였다.
클론은 Frohman이 상술한 방법 [Amplifications, published by Perkin - Elmer Corporation, issue 5 (1990), pp 11-15]을 사용하여 c-DNA의 3'말단에서 완결시켰다. MP-121의 첫 번째 조각 분리에 사용된 동일한 간 mRNA를 올리고 dT(16개의 잔기)가 어댑터 프라이머 (AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAAGC (T)16)에 연결되어 이루어진 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. 증폭은 어댑터 프라이머(AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)와 MP-121 서열의 내부프라이머(GGCTACGCCATGAACTTCTGCATA)를 사용하여 행하였다. 증폭된 생성물은 MP-121 서열의 내부 프라이머(ACATAGCAGGCATGCCTGGTATTG)와 상기 어댑터 프라이머를 사용하여 재증폭되었다. 재증폭생성물들을 제한된 벡터 pT7/T3 U19(Pharmacia)내에서 Sph I으로 제한시킨 뒤 클로닝한 후 시퀀싱키트Sequenase Version 2.0 (미합중국 Biochemical Corporation)으로 시퀀싱하였다. 클론의 서열을 공지의 MP-121 서열의 3' 말단에 오버랩시켜 확인하였다.
[실시예 2]
MP-52의 분리
또다른 cDNA 서열인 MP-52를 실시예 1의 방법에 따라서 사람의 배(胚) 조직 (8 - 9 주)으로부터 RNA를 사용하여 분리하였다. PCR 반응은 폴리(A+)RNA 20ng 에 상당하는 cDNA를 출발물질로서 함유하였다. 두 개의 효소 조합 모두를 2번씩 재증폭시켰다. 결찰후, 각 효소 조합에서 얻은 24개의 클론을 서열분석법으로 재차 분석하였다. AlwN I 과 Sph I 로 제한시킨 샘플에서 MP-52로 명명된 새로운 서열을 얻었다. 그 외의 클론은 BMP6 서열로 주로 이루어지고 한 개의 BMP 7 서열을 함유하였다. Ava I, AlwN I 및 Tfi I로 제한시킨 샘플은 새로운 서열은 함유치 아니하고, BMP 7 서열로 주로 구성되고 몇몇 인히빈 βA 서열을 함유하였다.
클론을 실시예1의 방법을 사용하여 3' 말단에서 완결시켰다. MP-52의 첫 번째 조각을 분리키위해 사용되었던 동일한 배 mRNA를 실시예 1에서와 같이 역전사시켰다. 증폭은 어댑터 프라이머(AGAATTCGCATGCCATGGTCGACG)와 MP-52서열의 내부 프라이머(CTTGAGTACGAGGCTTTCCACTG)를 사용하여 행하였다. 증폭생성물을 네스트된 어댑터 프라이머(ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG)와 MP-52서열의 네스트된 내부 프라이머(GGAGCCCACGAATCATGCAGTCA)를 사용하여 재증폭시켰다. 재증폭 생성물은 Nco I로 제한시킨 후, 제한된 벡터 (독특한 Nco I 제한 부위를 함유하는 변경된 멀티플 클로닝 부위를 지니는 pUC 19 (Pharmacia # 27 - 49 51 - 01))내에서 클론시켰고 이후 시퀀싱시켰다. 클론의 서열을 공지의 MP-52서열의 3' 말단에 오버랩시켜 클론을 확인하였다. 이들 클론 중의 일부는 SEQ ID NO : 1 의 서열 3' 말단에 존재하는 마지막 143 개의 염기쌍과 0.56 kb 의 3' 비번역지역(도면에 없는 서열)을 함유하였다. 이들 가운데 하나를 탐침으로 사용하여 Ausubel 등이 상술한 일반적인 방법 [Current protocols in Molecular Biology, published by Greene publishing Associates and Wiley - Interscience (1989)] 으로 인간 게놈 라이브라리(Stratagene # 946203)를 선별해내었다. 8×105λ 파지 가운데 한 개의 파지 (λ 2.7.4) (약 20 kb의 삽입물을 함유하는 것으로 밝혀진)을 분리하여 DSM (#7387) 에 기탁하였다. 이 클론은 상기한 증폭법으로 mRNA에서 분리한 서열외에도 5' 말단에 대한 추가적인 서열 정보를 함유하였다. 약 7.5 kb의 Hind Ⅲ 조각을 제한시킨 벡터(Bluescript SK, Stratagene # 212206)내에서 서브클론시켜 서열분석을 행하였다. 이 플라스미드 [SKL 52 (H3) MP12 라 명명됨]를 DSM (# 7353)에 기탁하였다. SEQ ID NO : 1 은 이 클론에서 얻은 서열정보를 보여준다. 누클레오타이드 NO. 1050번에서, 서열확인된 cDNA 와 각 게놈 서열은 1개의 염기쌍이 달랐다.(cDNA의 경우는 G였음에 반해 게놈 DNA는 A임). 게놈 서열이 정확하다고 판단되는 바, 이는 mRNA제조에 사용했던 배 조직에서 얻은 증폭된 게놈DNA를 시퀀싱하여 확인할 수 있었다. 게놈 DNA는 SEQ ID NO : 1의 염기상 332와 333 사이에 약 2kb의 인트론을 함유하였다. 인트론의 서열은 나타내지 않았다. 정확한 엑손/엑손연결 지역은 이지역을 포함하는 cDNA로부터 얻은 증폭 생성물을 시퀀싱하여 확인되었다. 당해 서열정보는 Frohman [Amplifications, published by Perkin - Elmer Corporation, issue 5 (1990), pp11-15]이 상술한 방법을 약간 변형시킨 방법의 도움을 받아 얻어졌다. MP-52의 3' 말단분리시 사용했던 것과 동일한 배 RNA를 5' 방향으로 배향된 MP-52 서열의 내부 프라이머(ACAGCAGGTGGGTGGTGTGGACT)를 사용하여 역전사시켰다.
터미날 트란스퍼라제를 이용하여 첫 번째 가닥 cDNA의 5' 말단에 폴리 A 테일을 붙였다. 증폭은 2번 시켰는데, 첫 번째 증폭시에는 올리고 dT와 어댑터 프라이머[AGAATTCGCATGCCATGGTCGACGAA GC (T16)]로 구성된 프라이머를, 두번째 증폭시에는 어댑터 프라이머 (AGAATTDCGCATGCCATGGTCGACG)와 MP-52 서열의 내부프라이머(CCAGCAGCCCATCCTTCTCC)를 사용하였다. 증폭생성물을 상기와 같은 어댑터 프라이머와 MP-52 서열의 네스트된 내부 프라이머(TCCAGGGCACTAATGTCAAACACG)를 사용하여 재증폭 생성물을 다시 재차증폭시켰다. 최종적으로, 재증폭된 생성물을 네스트된 어댑터 프라이머(ATTCGCATGCCATGGTCGACGAAG)와 MP-52 서열의 네스트된 내부 프라이머(ACTAATGTCAAACACGTACCTCTG)를 사용하여 다시 재증폭시켰다. 최종 생성물을 EcoRV로 제한시킨 벡터(bluescript SK, stratagene # 212206)에 블런트 말단(blunt end)클로닝시켰다. 클론의 서열을 λ 2.7.4 의 DNA에 대해 오버랩시켜 확인하였다.
폴라스미드 SKL 52 (H3) MP 12를 Mascheroder Weg 1b, 3300 Braunschweig 소재 DSM (Deutsched Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에 12월 10일자로 기탁하고 기탁번호 7353을 교부받았다.
파지 λ 2.7.4를 DSM에 1993년 1월 13일자로 DSM에 기탁하고 기탁번호 7387을 교부받았다.
SEQ IN NO : 1
서열타입 : 누클레오타이드
서열길이 : 염기쌍 1207개
가닥 : 2가닥
형태 : 선상
분자타입 : DNA
오리지날 소스 : -
생물체 : 인간
간접실험소스 : 배 조직
특성 : 인간 TGF - β형 단백질에 대한 암호를 지정하는 서열 (MP - 52)
SEQ IN NO : 2
서열타입 : 누클레오타이드
서열길이 : 염기쌍 265개
가닥 : 1가닥
형태 : 선상
분자타입 : mRNA에 대한 cDNA
오리지날 소스 : -
생물체 : 인간
간접실험소스 : 간 조직
특성 : 인간 TGF - β형 단백질 (MP - 121)
SEQ IN NO : 3
서열타입 : 아미노산
서열길이 : 아미노산 401개
오리지날 소스 :
생물체 : 인간
간접실험소스 :
특성 : 인간 TGF - β형 단백질 (MP - 52)

Claims (6)

  1. TGF-β 족의 단백질을 암호화하는, 하기의 그룹에서 선택되는 DNA서열: (a) 누클레오타이드 ATG AAC TCC ATG GAC CCC GAG TCC ACA와 함께 그 첫 번째 누클레오타이드에서 시작되는 상기 단백질용 리딩 프레임을 포함하는 DNA서열 (b) 누클레오타이드 CTT CTC AAG GCC AAC ACA GCT GCA GGC ACC 와 함께 그 첫 번째 누클레오타이드에서 시작되는 단백질용 리딩프레임을 포함하는 DNA 서열 (c) DNA 서열(a) 및 (b)로부터의 유전코드의 결과로서 축퇴성인 DNA 서열, (d) DNA 서열 (a) 및 (b)의 대립유도체 (e) DNA 서열 (a), (b), (c)또는 (d)와 교잡화하고, 아미노산서열 Mwt - Asn - Ser - Met - Asp - Pro - Glu - Ser - Thr 또는 Leu - Leu - Lys - Ala - Asn - Thr - Ala - Ala - Gly - Thr을 함유하는 단백질을 암호화하는 DNA서열 (f) 긴축조건하에서 DNA 서열 (a), (b), (c) 및 (d)와 교잡화하는 DNA서열.
  2. 제1항에 있어서, 척추동물 DNA 서열, 포유류 DNA 서열, 바람직하기로, 영장류 DNA 서열, 돼지 DNA 서열, 소의 DNA 서열, 또는 바람직하기로 랫트와 마우스의 DNA 서열을 포함하는 설치류 DNA 서열인 DNA 서열.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO.1 의 누클레오타이드를 포함하는 DNA서열인 DNA 서열.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, SEQ ID NO.2 의 누클레오타이드를 포함하는 DNA 서열인 DNA서열.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 DNA 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자.
  6. 제5항에 있어서, DNA 서열이 발현-제어 서열에 기능적으로 연결되어 있는 재조합 DNA 분자.
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