KR20050105446A

KR20050105446A - 골형성 조성물

Info

Publication number: KR20050105446A
Application number: KR1020057014086A
Authority: KR
Inventors: 프란츠 베버
Original assignee: 더 유니버시티 오브 취리히
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2004-01-29
Publication date: 2005-11-04
Also published as: US20040152627A1; JP2006519782A; CN1761481A; WO2004067027A2; WO2004067027A9; EP1589989A2; AU2004208569B2; CA2513712A1; US7074412B2; BRPI0407178A; AU2004208569A1; CN100490893C; WO2004067027A3

Abstract

본 발명은 상승작용량의 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 상승작용량의 적어도 하나의 피롤리돈이 선택적으로 생분해성 중합체와 같은 약학적으로 허용가능한 담체에 포함된 약학적 조성물과 관련된다. 본 발명은 또한 상승작용량의 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 상승작용량의 적어도 하나의 피롤리돈을 선택적으로 생분해성 중합체와 같은 약학적으로 허용가능한 담체에 포함시켜 그러한 치료가 필요한 환자에게 동시에 투여함으로써 정형외과 및, 치주질환을 포함하는 치과 질환을 치료하는 방법과 관련된다.

Description

골형성 조성물{OSTEOGENIC COMPOSITION}

본 발명은 상승작용량(synergistic amount)의 적어도 하나의 골 형성 단백질(bone morphogenetic protein, BMP) 및 상승작용량의 적어도 하나의 피롤리돈(pyrrolidone)을, 선택적으로 생분해성 중합체와 같은 약학적으로 허용가능한 담체 중에 함유하는 약학적 조성물과 관련된다. 본 발명은 또한 선택적으로 허용가능한 담체 중에 상승작용량의 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 상승작용량의 약학적으로 적어도 하나의 피롤리돈을 포함시켜 이러한 치료가 필요한 환자에게 동시에 투여하는 정형외과 및, 치주 질환을 포함하는 치과 치료 방법과 관련된다.

과거에 골조직 유도 재생(guided bone regeneration, GBR)이 뼈의 치유를 촉진시키는 예측가능하고 효과적인 방법으로써 도입되었고, 특히, 치과 임플란트의 배치와 관련하여 골조직 유도 재생(GBR)은 임상적으로 문서기록에 의해 충분히 입증된 성공적인 치료방법이다[Dahlin, C., et al., Int J Periodontics Restorative Dent 11 (1991) 273-281; Hammerle, C. H. and Karring, T., Periodontol 2000 17 (1998) 151-175; Nyman, S. R. and Lang, N. P. Periodontol 2000 4 (1994) 109-118]. GBR에서, 막은 결합조직에 대한 장벽으로서 작용하고 한동안 뼈가 채워야 할 필요가 있는 개방공간으로써 유지된다.

이 뼈 채움 과정의 가속화는 만약 빈 공간이 다공성 물질로 채워진다면, 그것이 신생 골격에 대한 기초(scaffold)로서 작용한다는 골전도(osteoconduction)의 원칙에 의해 이뤄질 수 있다[Reddi, H., Cytokine & Growth Factor Reviews 8 (1997) 11-20]. 대안적으로 뼈의 치료는 골분화유도(osteoinduction)에 의해 가속화될 수 있는데, 그것은 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cells)를 조골세포(osteoblasts)로 분화시킬 수 있는 적당한 성장인자를 적용하는 것과 연관된다[Wozney, J. M. and Rosen, V., Clin Orthop Rel Res 346 (1998) 26-37].

골 분화유도에서 가장 유용한 성장인자는 골 형성 단백질(BMPs)인데, 그것은 분화 인자이며 뼈 형성을 유도하는 그것들의 능력에 기초하여 분리되었다 [Wozney, J. M., et al., Science 242 (1988) 1528-1534]. 그것들은 TGF-β-슈퍼패밀리(TGF-β-super-family)에 속하는 30개 이상의 구성원을 가지고 BMP 패밀리를 만든다. 이 BMP-패밀리는 BMP-2 및 BMP-4와 같은 BMP들, OP-1 또는 BMP-7, OP-2 또는 BMP-8, BMP-5, BMP-6 또는 Vgr-1와 같은 골형성 단백질(osteogenic proteins, OPs), CDMP-1 또는 BMP-14 또는 GDF-5와 같은 연골유래 형태형성 단백질(cartilage-derived morphogenetic proteins, CDMPs), GDF-1, GDF-3, GDF-8, GDF-9, GDF-11 또는 BMP-11, GDF-12 및 GDF-14와 같은 성장/분화 인자(growth/differentiation factors, GDFs), 및 BMP-3 또는 오스테오제닌(osteogenin), BMP-9 또는 GDF-2, 및 BMP10과 같은 다른 서브패밀리를 포함하는 서브패밀리들로 분류된다(Reddi et al.,1997, supra).

특히 동물 모델에서, BMP는 뼈 형성 및 치료의 강력한 유도자로 증명되었다. 그러나, 체액과의 접촉에 의한 BMP의 즉각적인 분해 및 BMP의 강력한 형태 형성 작용(morphogenetic action) 때문에, BMP의 비생리적으로(un-physiologically) 높은 용량이 골 분화유도 생물활성(osteoinductive bioactivity)을 위해 필요하다 [Weber, F. E., et al., Int J Oral Maxillofac Surg 31 (2002) 60-65; Rose, F. R. A. and Oreffo, R. O. C. Biochem Biophys Res Com 292 (2002) 1-7]. 국소적인 투여 경로가 사용되어야만 하고, 그것은 결정적인 담체 시스템의 선택에 영향을 미쳐서, 이용가능한 적당한 담체 시스템이 현재는 없다. BMP가 보통 유전자 재조합 기술(recombinant techniques)로 생산되고, 그래서 비싸고 오직 제한적인 양만이 이용가능하여, BMP는 알려진 효과에도 불구하고, 환자의 의료 처치에 영향이 없으며 현재는 임상적으로 적용되지 않는다.

생분해성(또한, 재흡수성(resorbable), 흡수성(absorbable), 및 침식성(erodible)이라고도 불리는) 중합체들이, 그것들의 순간적인 이물반응과 조직 재생능력 때문에, 현재 치료받는 환자에게 이식가능한 물질을 포함하는 조절 방출 시스템(controlled-release systems)에 대한 선택 물질이다(The Biomedical Engineering Handbook, Bronzino, J.D., Ed., CRC Press, Boca Raton, 2000, chapter 41, 41-1 내지 41-22 pages 참고). 가장 연구가 많이 된 생분해성 중합체는 폴리젖산(poly(lactic acid)s)(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드)-폴리(에틸렌글리콜) 공중합체(poly(lactide-co-glycolide)-poly(ethyleneglycol) copolymers, (PLG-PEG) copolymers), PLG-PGA 공중합체, 및 유사물을 포함한다. 그러나 합성 생분해성 중합체들은 단단하며, 예컨대 GBR, 특히 치과적 GBR에 적용하기 위해 필요한 유연성이 결여되어있다.

공개된 미국 특허출원 제20030104029호에서 출원인들은 그것들의 유연성은 알려진 가소제(plastiziser), N-메틸-2-피롤리돈(NMP)을, 중합체를 GBR에 쓸 수 있게 만드는 양으로 처치함으로써 생분해성 중합체의 단단함을 유연하게 하고, 유연성을 증가시킬 수 있다는 것을 개시하였다. 게다가, NMP 자체가 예상치 못한 골 형성 유도 효과를 가진다는 것을 발견했다.

약품의 담체로서 생분해성 중합체의 적용뿐만 아니라 BMP 이용에의 새로운 연구가 아직 필요하다.

도 1은 골조직 유도 재생 및 NMP에 의한 골 회복의 증진을 도시한다: 두개골(calvarial bone)의 6 mm(지름)의 결손부가 세 개의 다른 막(E1M-11, Osseoquest 및 E1M-11NMP)으로 처치되거나 또는 미처치로 남아있었다(대조군). 처치 4주 후에, 결손부의 골 재생을 측정하였다. 상부 패널(도 1A)은 면적의 퍼센티지를 보여주는데, 원래의 결손 구역과 관련하여 결손부에서의 골 재생이 일어났다. 각각의 수치는 8개의 독립적인 결손부에서의 결과를 나타낸다. P-수치가 주어졌다. 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome)에 의해 염색하여 결손부의 중간부분을 평가하였다. 하부 패널(도 1B)에는 대조군과 E1M-11NMP 처치한 결손부의 중간 단편의 한 예가 있다. 골드너-트리크롬 염색 후에 뼈는 암녹색 및 골적색(osteoid red)으로 보인다. 결손부의 정도가 표시되었다.

도 2는 체외실험에서의 전조골세포 주(preosteoblastic cell line, MC3T3-E1)의 성숙에 대한 NMP 유도 증가를 보여준다. 도 2A: 증가하는 양의 NMP로 처치한 MC3T3-E1 세포 및 6일 뒤에 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase) 활동도로써 측정한 성숙도. MC3T3-E1 세포의 성숙은 NMP를 0 내지 5 mM범위로 적용하였을 때 NMP의 양에 농도 의존적인 방식으로 증가한다. 도 2B: 알리자린-S-염색(Alizarin S-staining)으로 가시화한 6-웰 플레이트에 심겨진 MC3T3-E1 세포의 무기화(Mineralization). MC3T3-E1 세포는 5 mM 글리세롤 포스페이트 및 1㎍/ml의 rhBMP-2의 존재 하에 4주간 배양되었다. 윗줄에는 NMP가 첨가되지 않았고, 아랫줄에는 2.5 mM의 NMP가 실험 내내 존재했다. 윗줄과 비교했을 때 아랫줄의 붉게 염색된 부분의 증가는 무기화로써 측정한 성숙도가 2.5 mM NMP의 존재 하에 증가하였음을 보여준다.

도 3은 알칼라인 포스파타제(ALP) 활동도로 측정한 MC3T3-E1 세포의 성숙에 미치는 NMP와 rhBMP-2의 상승효과(synergistic effect)를 나타낸다. MC3T3-E1 세포는 2/ml 배지 내의 1㎍의 rhBMP 의 존재 또는 부재 하에 NMP로 처치되었다. 상승효과의 계산을 위해 단독 처치로 유도된 ALP활동도 및 NMP 단독 처치로 유도된 ALP활동도를 BMP 및 NMP가 모두 존재했을 때 구한 ALP 활동도에서 뺐다. SD는 그래프에 표시되어 있다.

도 4는 rhBMP-2 이합체를 가용화시키는 서로 다른 피롤리돈들의 능력과, 같은 물질들이 전조골세포주(MC3T3-E1)의 성숙에 미치는 영향의 상호관계를 나타낸다. 도 4A: rhBMP-2 이합체의 펠렛을 2시간 동안 증가하는 양의 서로 다른 피롤리돈들(NMP: 1-메틸-2-피롤리돈; NEP: 1-에틸-2-피롤리돈; PB: 2-피롤리돈; CP: 1-시클로헥실-2-피롤리돈)을 첨가한 인산염 완충 식염수에 녹였다. rhBMP-2를 가용화하는 피롤리돈의 농도 의존성이 도시되었다. 도 4B에서 NMP, NEP, PB, 및 CP의 MC3T3-E1 세포 성숙에 관한 영향이 보인다. 4가지 피롤리돈의 배지 내 농도는 5 mM였다.

본 발명의 목적은 이 필요를 충족하고 상기 언급된 단점과 불이익을 극복할 수 있는 새로운 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 이처럼, 치주병 분야를 포함하는 치과 분야 및 정형외과와 같은 다른 의료 분야의 환자 치료에 있어서 BMP의 골 형성 유도능을 이용하는 새로운 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 BMP, 특히 유전자 재조합으로 생산된 BMP의 투여용량을 줄일 수 있는 수단을 제공하여, 치주병 분야를 포함하는 치과 분야 및 정형외과와 같은 다른 의료 분야의 환자 치료에 있어서 BMP의 안전하고 비용효율적인 사용을 가능하게 하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 골조직 유도 재생술(GBR)을 이용하기 위한 새로운 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GBR에서 생분해성 막을 이용하기 위한 새로운 수단을 제공하여, 제2차의 외과적 단계를 피할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명의 목적은 BMP의 골 형태형성 특성과, NMP와 같은 피롤리돈의 골 형성 유도 특성을 상승작용 방식으로 함께 이용하는 약학적 조성물을 제공하는 것인데, 상기 조성물은 치과 임플란트의 융합(integration) 및 발치 이후의 치아 소켓의 충진을 포함하는 치아 및 치주 질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 또 다른 목적은 BMP의 골 형태형성 특성과 NMP와 같은 피롤리돈의 골 형성 유도 특성 및 생분해성 중합체를 상승작용 방식으로 함께 이용하는 약학적 조성물을 제공하는 것인데, 상기 조성물은 특히 골조직 유도 재생(GBR)을 통해 치과 임플란트의 융합(integration) 및 발치 이후의 치아 소켓의 충진을 포함하는 치아 및 치주 질환의 치료에 유용하다.

본 발명의 또 다른 목적은 골 형성의 유도가 필요한 환자의 치료 방법을 제공하는 것인데, 이 방법은 BMP의 골 형태형성 특성과 NMP와 같은 피롤리돈의 골 형성 유도 특성 및 선택적으로 생분해성 중합체를 상승작용 방식으로 함께 이용하며, 치과 임플란트의 융합(integration) 및 발치 이후의 치아 소켓의 충진을 포함하는 치아 및 치주 질환을 치료하고, 치조골 증대술(alveolar ridge augmentation), 동저 거양술(sinus floor elevation) 및, 외과적 뼈 수술 또는 사고로 인한 골절을 가진 환자의 회복 증진을 포함하는 불유합(non-unions)의 치유와 같은 골절 치유의 향상과 뼈의 생장이 필요한 정형외과 질병 및 부전증을 치료하기 위한 것이다.

놀랍게도 BMP와 피롤리돈만의 조합, 또는 NMP와 같은 피롤리돈으로 선택적으로 전처리되는 다른 생분해성 임플란트, 특히 막과 함께 조합하여 투여하는 것이 골 형성을 상승작용적인 방식으로, 종래 기술에서 보고된 BMP 또는 NMP 또는 NMP와 생분해성 중합체의 조합의 각각의 개별적인 골 형성 유도능에 기초해보았을 때 예측되지 않았던 정도까지 향상시킨다는 것이 발견되었다.

본 발명은 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 적어도 하나의 피롤리돈을, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 중에 함유하는 약학적 조성물과 관련되며, 여기서 상기 BMP 및 상기 피롤리돈은 골 형성에 상승적인 치료효과를 제공하는 양이 존재한다.

본 발명의 일 실시예에서 상기 피롤리돈은 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)이고 상기 BMP는 유전자 재조합 BMP이며, 여기서 NMP 및 상기 유전자 재조합 BMP는 골 형성에 상승적으로 치료효과를 제공하는 양이 존재한다.

본 발명의 다른 실시예에서 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 생분해성 중합체이다.

본 발명의 다른 실시예에서 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 생분해성 중합체이고, 그것은 피롤리돈으로 전처리 된 것이다.

본 발명의 일 실시예에서의 한 예는, 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP), 피롤리돈 및 생분해성 중합체를 포함하는 약학적 조성물이며, 여기서 상기 BMP, 상기 피롤리돈 및 상기 생분해성 중합체는 골 형성에 상승적으로 치료효과를 제공하는 양이 존재한다.

본 발명의 일 실시예의 다른 예는 적어도 하나의 재조합 골 형성 단백질(rBMP), 메틸-2-피롤리돈(NMP) 및 NMP로 전처리 된 생분해성 중합체를 포함하는 약학적 조성물인데, 여기서 상기 rBMP, 상기 NMP 및 상기 전처리된 생분해성 중합체는 골 형성에 상승적으로 치료효과를 제공하는 양이 존재한다.

본 발명은 또한 골 형성의 유도가 필요한 환자를 치료하는 방법과 관련되었는데, 이 방법은 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 적어도 하나의 피롤리돈을, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 내에 포함시켜, 동시에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 상기 BMP 및 상기 피롤리돈은 상기 환자에게 골 형성에 상승적인 치료효과를 제공하는 양이 존재한다.

본 발명은 어떻게 피롤리돈, 특히 NMP가 뼈의 재생을 높일 수 있는지의 기전을 밝히려는 출원인들의 더한 연구에 기초한다. GBR에 쓰기에는 너무 뻣뻣한 합성 생분해성 중합체, 즉 폴리락티드/폴리글리콜리드(polylactide/glycolide, PLGA)로 구성된 피롤리돈-처리 막은, 생체 내에서의 뼈의 재생에 있어서 미처치된 것 또는 섬유양 유연성 PLGA 막(texture like flexible PLGA-membranes)보다 좋은 결과를 보이며, 가소제, N-메틸-2-피롤리돈(NMP)으로 유연화시켰을 때, 토끼 생체실험 및 BMP-생산 세포주(BMP-producing cell line)에서의 체외실험에서 좋은 결과를 보이고, 비-BMP-생산 세포주에서의 체외실험에서는 그렇지 않다.

두개골 결손 모델이 동물 모델로서 선택되었는데, 왜냐하면 그것이 뼈의 치유에 역효과를 갖는 나쁜 혈액 공급과 뼈의 막(피질) 구조 때문에 골 재생에 관한 가장 선택적인 모델이기 때문이다. 결손부의 크기는 치명적인 결손부의 크기 이하였고, 치과분야에서 악골안면(maxillofacial) 수술 및 장애에서의 전형적인 골절제(osteotomy) 간격의 크기와 비슷하도록 선택되었다[Klinge, B., et al., J Oral Maxillofac Surg 50 (1992) 241-249]. 이 동물 모델에서, 두 가지의 시판중인 막 E1M-11 및 오세오퀘스트(Osseoquest) 및 NMP 처리된 E1M-11(E1M-11NMP)가 실험되었고 그들 모두는 뼈의 재생을 향상시키는 것으로 입증되었다(도 1).

그러나, NMP 처치된 막은 상당히 나은 결과를 보였고, 이것이 BMP-수용기를 통한 증가된 신호 전달(signal transduction)에 기인한다고 결론내렸다. 이 해석은 전조골세포주(MC3T3-E1)로부터의 체외 실험 데이터로부터 지지되는데, 여기서 낮은 NMP 용량을 적용시켰을 때 그것들의 성숙을 증가시켰다(도 2). 이 세포주는 BMP를 분비하고, 그것을 세포외 기질에 축적시키며, 스매드(Smads)를 통해 단독적으로 BMP 신호 전달에 작용하는 세포외 BMP의 작용을 통해 성숙시키는 것으로 알려져 있다[Suzawa, M., et al., Endocrin 140 (1999) 2125-2133]. 같은 신호 전달 경로가 또한 C3H10T1/2 세포에서도 존재하는데[Katagiri, T., et al., Biochem Biophys Res Com 172 (1990) 295-300], 하지만 NMP 적용에 대한 반응은 보이지 않았다. 따라서, NMP의 작용부위는 BMP수용기 수준 또는 그보다 하위가 아니라, NMP가 직접 세포외 BMP에 작용하는 것이다. 따라서, 체내실험에서 보이는 골 재생의 NMP-유도 향상과 체외실험에서 보이는 MC3T3-E1 세포의 가속화된 성숙은 양 시스템에 존재하는 자가 BMP들(autologous BMPs)의 생물활성도/생물학적이용도(bioactivity/bioavailability)가 NMP를 매개로 증가하는 것에 기인한다.

GBR에서, 합성 생분해성 중합체 막, 예컨대 NMP처리된 PLGA 막은, 뼈의 내부성장을 위해 생성된 개방공간으로부터 순수한 기계적인 분리자인 결합조직의 막의 기능으로부터 NMP에 대한 운반 수단까지 막의 기능을 확장한다. 이러한 조합을 통해 GBR은 직접 골분화유도와 연결되는데, 왜냐하면 체내에서의 자가 BMP 생물활성도/생물학적이용도가 상당히 증가하기 때문이다. 같은 동물 모델에서 필적할만한 골재생 규모를 얻기 위해서, 15㎍의 rhBMP-2가 필요한데(결과는 도시되지 않았음), 그것은 토끼 내에 존재하는 BMP의 총량과 같다(송아지에 존재하는 BMP 양을 기준으로 계산; Reddi et al., 1997, supra).

따라서 이 모델에서의 NMP의 사용은 또한 자가 치유 과정, 이 경우에는 자가 BMP를 통한 과정을 시행시키는 좋은 예이다.

이러한 결과들은, 임상 적용시에 필요한 외래 BMP의 양을 줄일 수 있을 것이라는 기대를 가지고 본 출원인들이 BMP에 부가한 NMP의 효과에 대한 연구를 더 하도록 고무시켰다.

그러나, 놀랍게도, 추가적인 연구에서, NMP와 같은 피롤리돈과 조합한 BMP의 투여가, 종래에 보고된 BMP나 NMP의 각각의 개별적인 골형성유도능에 기초하여 볼 때 예상할 수 없는 예상치 못한 수준으로, 상승작용적인 방식으로 뼈의 형성을 향상시킨다는 것을 발견하였다(도 3).

이것은 원하는 효과를 내기 위해서 필요한 물질이 소량이라는 점에서 장점을 가지는데, 그것은 특히 rBMP의 어려운 생산의 관점에서 큰 중요성을 가진다. 또한, 더 적은 양의 이물질이 쓰일 수 있을 때, 부작용의 위험이 상당히 줄어든다. 전체적으로, 본 발명은 처음으로 BMP, 특히 rBMP의 골분화유도능을 비용효율적으로 임상적인 이용을 할 수 있게 하였다.

본 발명의 목적을 위해서, BMP 또는 rBMP란 용어는 각각 천연 이합체 또는 유전자 재조합 제품으로서의 BMP 패밀리의 구성원들을 말한다. 따라서, 예를 들어 rBMP라는 용어는 BMP 서브 패밀리의 구성원들, 예컨대 BMP-2 및 BMP-4, OP 서브패밀리의 구성원들, 예컨대 OP-1 (또는 BMP-7), OP-2 (또는 BMP-8), BMP-5, BMP-6 (또는 Vgr-1), CDMP 서브패밀리의 구성원들, 예컨대 CDMP-1 (또는 BMP-14 또는 GDF-5), GDF 서브패밀리의 구성원들, 예컨대 GDF-1, GDF-3, GDF-8, GDF-9, GDF-11 (또는 BMP-11), GDF-12 및 GDF-14, 및 유전자 재조합 기술에 의해 생산된 다른 BMP 서브패밀리의 구성원들, 예컨대 BMP-3 (또는 오스테오제닌(osteogenin)), BMP-9 (또는 GDF-2), BMP-10, 및 BMP 15와 16을 망라한다. 본 발명의 약학적 조성물에 쓰일만한 바람직한 BMP와 rBMP의 예는 천연 및 재조합 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, 및 BMP-7을 포함하고, 이 BMP들은 현재 신생골의 형성과 결정적으로 연관되었다고 알려져 있다. 그러나, 본 발명의 범위는 골형성에의 역할이 명확하게 밝혀지지 않은 BMP를 함유하는 조성물도 역시 망라하는 것으로 의도된다.

본 발명에 쓰이는 천연 BMP는 예컨대 Johnson EE, et al. [Clin Orthop 250 (1990) 234-240]에 의해 기술된 것처럼 인간의 뼈로부터 또는 당업자에게 잘 알려진 방법으로 다른 포유동물의 뼈로부터 얻을 수 있다.

본 발명에 쓰이는 rBMP는 전통적인 방식으로 원핵 및 진핵 발현 시스템(prokaryotic and eukaryotic expression systems)을 이용하는 표준 유전자재조합 기술을 통해 마련될 수 있다. 이에 관하여, 예를 들어 Cerletti et al. (European Patent Application 0 433 225 A1) 및 Israel D.I. et al., Growth Factors 7 (1992) 139-150을 참고할 수 있다. 원핵 발현 시스템, 예컨대 대장균(Escherichia coli ) 균주나 다른 적당한 박테리아 균주를 사용한 생산물은 생산량의 면에서 이점이 있다. 원핵 발현 시스템은 특히 rBMP 단량체를 생산하기에 적합한데, 그것들은 그 후 예를 들어 Cerletti et al. (supra)에 의해 기술된 것과 같이 이합체화될 수 있다. 한편, 진핵 발현 시스템, 예컨대, 포유동물 또는 곤충의 세포, 특히 포유동물의 세포, 특히 무-단백질 배지를 사용하는 포유동물 세포는 제품 안전성의 관점에서 이점을 갖는다. 적당한 포유동물 세포의 예는, 중국 햄스터 난소세포(Chinese hamster ovarian (CHO) cells)를 포함한다. 포유동물 발현 시스템은 특히 rBMP를 생산하는데 적합하다. 그러나, 적당한 생산 시스템의 선택은 당해 기술분야의 통상의 기술에 속한다.

본 발명의 약학적 조성물에 쓰이는 피롤리돈(pyrrolidones)은 화학 분야에서 알려진 조직 손상 효과나 독성 효과없이 가소화성 또는 가용화성을 가지는 어떤 피롤리돈이라도 가능하다. 이러한 피롤리돈은 예를 들어, 1-메틸-2-피롤리돈(1-methyl-2-pyrrolidones, NMP), 1-에틸-2-피롤리돈(1-ethyl-2- pyrrolidones, NEP), 2-피롤리돈(2-pyrrolidones, PB), 및 1-시클로헥실-2-피롤리돈(1-cyclohexyl-2-pyrrolidones, CP)과 같은 알킬 또는 시클로 알킬 치환 피롤리돈을 포함하며, NMP 및 NEP가 바람직한 예이다. 추가로, 피롤리돈-기초 중합체인 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidones)과 같은 것도 역시 본 발명의 약학적 조성물에 쓰일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 함유할 수 있다. 상기 담체는 적당한 아무 액체, 고체 또는 반고체 담체일 수 있고, 용액 또는 현탁액을 형성하는 물, 식염수 및, 인산, 초산, 구연산, 타르타르산염 등과 같은 완충액과 천연 또는 합성 생분해성 중합체 또는 공중합체를 포함한다. 조성물의 피롤리돈 성분의 가용화 특성 덕분에, BMP성분의 용해도를 높이기 위한 추가적인 보조제(adjuvants)는 보통 필요하지 않다. 그러나, 액체 담체는 약학적 용액 또는 현탁액을 조제하기 위해 일반적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있는데, 예를 들어, 보조용매(co-solvents), 세제(detergents), 안정제(stabilizers), 항산화제(antioxidants), 점도개선제(viscosity improving agents), 보존제(preservatives) 및 기타의 것 등이다. 필요하다면, 막 여과와 같은 적당한 아무 살균방법을 이용하여 상기 조성물을 살균할 수 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시예에서 약학적으로 허용가능한 담체는 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리카프롤락톤(polycaprolactones), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트(polyhydroxybutyrates), 폴리히드록시발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(poly-orthocarbonates), 폴리알킬렌 옥살레이트(polyalkylene oxalates), 폴리알킬렌숙시네이트(polyalkylene succinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides)(셀룰로즈, 전분(starch), 덱스트란(dextran), 키틴(chitin), 키토산(chitosan)과 같은 것 등), 변성 단백질(modified proteins)(콜라겐, 카세인, 피브린 등과 같은 것) 및 그것들의 공중합체, 3원중합체(terpolymers) 또는 그것들의 화합물(combinations) 또는 혼합물(mixtures) 또는 중합체 혼합물(polymer blends)과 같은 합성 생분해성 중합체에 기초한 서방출시스템(slow release system)이다. 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드)(poly(L-lactide-co-glycolide)), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (poly(D,L-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드)(poly(L-lactide)), 폴리(D,L-락티드)(poly(D,L-lactide)), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide)), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리(L-락티드-코-카프롤락톤(poly(L-lactide-co-caprolactone)), 폴리(D,L-락티드-코-카프롤락톤(poly(D,L-lactide-co-caprolactone)), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonate), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(L-lactide-co-trimethylenecarbonate)), 폴리(D,L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(D,L-lactide-co-trimethylene-carbonate)), 폴리디옥사논(polydioxanone) 및 그것들의 공중합체, 3원중합체, 및 중합체 혼합물(polymer blends)이 특히 바람직한 중합체의 예이다. 가장 바람직하게는, 글리콜리드와 폴리락티드의 공중합체, 예를 들어 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (PLGA)가 담체로서 쓰인다.

본 발명에 쓰이는 약학적으로 허용가능한 담체의 다른 예는 콜라겐과 피브린과 같은 단백질, 인산 칼슘(calcium phosphates)(인산삼칼슘(tri-calciumphosphates), 수산화인회석(hydroxyapatite)), 골시멘트(bone cements), 생유리(bioglass), 산호광물(Algipore®), 진주층(nacre), 난각(egg shell), 소 유래(bovine-derived) 수산화인회석(Bio-Oss®), 및 모든 골전도성(다공성) 물질(osteoconductive (porous) materials)을 포함한다.

본 발명의 약학적 조성물은 BMP 성분(들)과 피롤리돈 성분(들)을 동시에 투여할 수 있는 아무 적당한 방법으로도 제형화될 수 있다. 일 실시예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 적당한 골형성유도량의 BMP 및 피롤리돈 성분(들) 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체를 혼합하여 조제될 수 있다.

대안적으로, 본 발명의 다른 실시예에서, 바람직하게는 막의 형태인 생분해성 중합체는 피롤리돈으로 전처리되어 쓰인다. 상기 처리는 성형된 중합체를 원하는 피롤리돈을 함유하는 용액에 중합체를 유연하게 만들기 위해 필요한 시간, 예컨대 15초 내지 3분간, 단순히 담그는 과정을 포함하거나 또는 중합체 내의 피롤리돈의 일정한 농도를 얻는 과정 및 그 다음 공기-건조의 과정을 포함한다. 그 다음 BMP는 담체 막의 헤파린화(heparinization) [Ruppert, R. et al. Eur J Biochem 237 (1996) 295-302]에 들어갈 수 있다. 상기 중합체는 임플란트를 삽입한 동안 충분히 길게 유연함을 유지해야 한다. 대안적으로, 성형된 중합체는 피롤리돈과 BMP의 혼합물로 유사하게 전처리될 수 있는데, 여기서 BMP는 간단한 흡수에 의해 중합체에 부착된다. 대안적으로, 상기 BMP는 개별적으로 하지만 동시에, 예컨대 피브린, 콜라겐, 폴리에틸렌글리콜, 생유리, 수산화인회석, 인산칼슘 및 상기 언급된 것들과 같은 유사한 담체 물질들과 같은 서로 다른 담체에서 적용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 본 발명의 약학적 조성물은 막들, 필름들, 판들, 메쉬판들(mesh plates), 스크류 탭들(screws tabs) 및 다른 형성체들을 포함하는 임플란트의 형태이다.

본 발명의 약학적 조성물은 골형성 유도량의 적어도 하나의 BMP 또는 rBMP 및 골형성 유도량의 적어도 하나의 피롤리돈을 함유한다. 이러한 양은, 예를 들어, 1회량 당 약 0.001 내지 약 4 mg의 BMP(들) 또는 rBMP(들) 및 약 0.005 내지 약 50 중량 퍼센트의 피롤리돈일 수 있다. 그러나, 상기 골형성 유도량은 서로 다른 적용분야에 따라, 특히 BMP의 경우에, 다를 수 있다. 이런 식으로, 더 작은 양이, 예컨대 치과분야에서 적합할 수 있고, 반면에, 다소 더 많은 양이, 예컨대 일측성(unilateral) 및 다발성(multilateral) 척추 융합(spinal fusions), 불융합의 치료, 골다공증(osteoporosis)의 치료 및 임플란트(고관절(hip))의 내부성장에서 원하는 효과를 얻기 위해서 필요할 수 있다.

본 발명의 조성물의 용량은 개별적인 환자 및 치료해야 할 질환에 따라 다르다. 본 발명의 조성물의 예시적인 1회 용량은 약 0.001 내지 약 4 mg의 범위 내에 있다. 그러나, 더 작은 용량이, 예를 들어 치과 환자의 치료에 적합할 수 있고, 반면에 다소 더 많은 용량이 다른 치료에 원하는 효과를 위해 필요할 수 있다.

본 발명의 치료방법은 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 골형성 유도량의 적어도 하나의 피롤리돈을 동시에 사용하는 것에 기초하고, 여기서 상승효과가 얻어진다. 본 발명의 방법에서, 골형성의 분화유도가 필요한 환자는 골형성 유도량의 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 골형성 유도량의 적어도 하나의 피롤리돈을, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 중에 포함하여 동시에 투여받으며, 여기서 상기 BMP(들) 및 상기 피롤리돈(들)은 골형성에 상승 치료 효과를 제공하는 양으로 투여된다. 본 발명의 방법의 목적을 위해서, "동시에 투여"라는 표현은 동시적인 및 순차적인 투여를 포함한다. 이렇게, 본 발명의 방법의 일 실시예에서, BMP성분(들) 및 피롤리돈 성분(들)은 본 발명의 약학적 조성물의 형태로 투여된다. 본 발명의 방법의 또 다른 실시예에서, BMP(들)은 NMP와 같은 피롤리돈으로 전처리된 약학적으로 허용가능한 담체를 치료 위치에 도입하고, 그 다음에 적당한 상승작용량의 BMP를 적용하여 순차적으로 투여될 수 있다.

본 방법에서 쓰이는 BMP 성분(들)과 피롤리돈 성분(들)의 양은 치료 상태에 따라 달라지며 치료 의사에 의해 결정될 것이다. 예시적인 용량은 상기에 주어졌다.

본 발명은 아래의 실시예를 통해 서술될 것인데, 그것은 오직 예시적인 목적으로 주어진다.

통계적인 분석을 위해, 독립 학생 T-테스트(unpaired Students T-test)를 시판중인 소프트웨어 패키지(SSPE, Chicago, II)를 가지고 수행하였다. 모든 수치는 "평균±평균의 표준오차"로 나타내었다.

데이터의 분석

결손부 가장자리를 국한시키기 위해서, 결손부의 중간으로부터의 수직 단편의 디지털 이미지를 mm 단위로 찍었고, 그것은 별도로 6mm였다. 두개골과 협력하여, 결손부 총 영역 주변의 뼈의 두께가 복원될 수 있었다. 아도브 포토샵(Adobe Photoshop) 5.0 프로그램을 사용하여 결손부의 총 화소 수를 측정할 수 있었다. 뼈로 채워져 있는 총 결손부의 일부가 역시 측정되고 뼈 영역의 화소 수로 표현되었다. 골 치유의 퍼센티지는 아래와 같이 계산되었다:

골 치유 [%]= 골 영역의 화소 수 X 100/결손부의 총 화소 수

세포 배양 기술 및 알칼라인 포스파타제 측정

MC3T3-E1 세포를 10% 우태혈청(Life Technologies, Inc.), 50 ㎍/ml의 겐타마이신(gentamycin) 및 50 ㎍/ml의 아스코르브산을 함유하는 알파-변성 미니멈 에센셜 배지(alpha-modified Minimum Essential Medium, Life Technologies, Inc., Grand Island, NY)에서 배양하였다. C3H10T1/2 세포는 50 ㎍/ml의 겐타마이신을 함유하는 Eagle 기본 배지에서 배양하였다. 양 세포주에서의 NMP의 작용을 확인하기 위해서, 6-웰 플레이트에 웰당 1x10⁵ 개의 세포를 심고, 그 다음 NMP를 첨가하였다. 배지 교환은 3일 후에 이루어졌으며 알칼라인 포스파타제(ALP)는 Lowry, O. et al. [J. Biol. Chem. 207 (1954) 19 - 37]에 따라 측정하였다: 유리 p-니트로페놀(p-nitrophenol)이 400 ㎕의 1 M NaOH을 첨가함으로써 p-니트로페닐레이트(p-nitrophenylate)로 변환되었고, 그것은 410 nm (epsilon=17500/molxcm)에서 측정하여 정량되었다. 알칼라인 포스파타제 활동도는 총 단백질로 표준화되었고, 분당 단백질 mg당 생성된 니트로페닐레이트로써 표현되었다.

5 mM의 글리세롤 포스페이트 및 1 ㎍/ml의 rhBMP-2가 추가된 같은 배지에서 배양한 MC3T3-E1 세포에서 무기화(mineralization)를 측정하였다. 알리자린 레드- S 염색(Alizarin red-S staining)을 Bodine, P. V. N., et al. [J Bone Mineral Res 11 (1996) 806-819]에 따라서 4주 후에 수행하였다.

실시예 1: NMP -처리된 PLGA 막의 뼈의 재생에 대한 영향

뼈의 재생을 평가하기 위해, 표준화된 결손부를 토끼의 두개골에 형성하였다. 뉴질랜드 흰 토끼(3.5-4.0 kg)를 지역 당국의 지침에 따라 처치하였다. 이 연구의 프로토콜은 취리히의 칸토날렘 버테리내람트(kantonalem Verterinaramt, Zurich)에게 승인받고 감독받았다. 진정(sedation) 후에, 4개의 6 mm 두개골 절개(craniotomy) 결손부를 치과용 핸드피스 중의 6 mm 관상톱(trephine)을 이용하여 만들었다. 결손부를 봉하기 위해서 경막쪽(dural side)으로부터 6.1 mm 지름의 막을 두개골을 통과하여 찔러넣었다. 이 막은 경막으로부터의 압력에 의해 고정되었다. 다른 10x10mm의 사각형의 막이 상기 결손부 위에 놓여졌다. 상단의 4개의 막들은 함께 봉합되었고, 전체 유닛이 외측에 남아있는 골막(periost)에 봉합되었다. 4주 후에 실험동물들을 희생시켜, 두개골을 절개하고, 방사선사진을 찍고, 메타크릴레이트에 포매시켜(embedding), Weber, F. E., et al. [Biochem. Biophys Res. Commun. 286 (2001) 554-558]에 기술된 것처럼 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색을 하였다.

PLGA로 구성된 3개의 다른 막들이 실험되었다: 오세오퀘스트(OsseoQuest, Gore-Tex® USA), E1M-11 (Inion OY, Finland), 및 NMP로 처리된 E1M-11 막 (E1M-11 NMP). NMP 처리는 상기 막을 30초간 NMP에 담그고 이후 15분간 공기로 건조시키는 것을 포함한다. 골분화유도 rhBMP-2가 Weber, F. E., et al., 2001, supra에 기술된 것과 같이 생산되었다.

토끼의 두개골에 형성된 표준화된 결손부위의 골재생 평가결과, 3개의 막 모두 미처치 대조군 결손부에 비해 상당히 증진된 뼈의 치유를 보였다(도 1). 결손부의 79.06 ±5.6%의 골 치유가 된, NMP 처치 E1M-11NMP 막이 가장 효과적이었다.

다른 두 막에 비해 상당히 증가된 뼈의 재생에 대한 원인은 E1M-11 막에 대한 NMP의 연화효과에 단독으로 기인한 것이 아닐 것인데, 왜냐하면 참고 막인 오세오퀘스트(Osseoquest)도 역시 그것의 섬유양 구조 덕분에 부드럽고 유연하기 때문이다. 따라서, 추가적인 실험을 두 개의 E1M-11 NMP 처치 결손부의 옆에 배치한 두 개의 비처치 대조군 결손부를 형성하여 수행하였다. 이 비처치된 결손부에 근접한 막들에 적용한 NMP의 존재 때문에, 그것은 위-대조군 결손부(pseudo-control defects)라 불렀다. 결과는 진정 대조군 결손부보다 위-대조군 결손부에서 상당히 나은 치유효과를 보였다(위-대조군 60.05±5.4%; 대조군 30.3±4.1% 치유; P<.038). 따라서 모든 생체실험 데이터는 NMP에 의한 골치유의 긍정적인 효과를 제시한다.

실시예 2: NMP -처리 PLGA 막 및 rhBMP -2를 함께 사용시의 골재생에 대한 상승효과

첫번째로, NMP의 골분화유도능을 증명하기 위해서 배아세포(embryonic), 쥐의 세포, 중간엽줄기세포(mesenchymal stem cell) 주 C3H10T1/2 및 전조골세포주 MC3T3-E1를 사용하여 상기 기술된 것과 같이 배양하였다. C3H10T1/2 c세포들은 연골, 뼈 또는 지방세포로 분화할 수 있고, 반면 MC3T3-E1는 자가 BMP를 생산하고 분비한다. 알칼라인 포스파타제 활동도가 조골세포 계통으로의 분화에 대한 표지로서 사용되었다.

도 2에 도시된 것과 같이, 낮은 용량의 NMP가 2.5-3.0배 정도까지 알칼라인 포스파타제의 활동도를 증가시켰고, MC3T3-E1에서 전조골세포의 조골세포로의 성숙을 가속화시켰다. 이 성숙의 가속화는 또한 장기간동안 계속되었는데, 왜냐하면 MC3T3-E1 세포의 NMP-처치는 알리자린 S-염색으로 측정한 바와 같이 성숙 조골세포가 수행하는 무기화를 증가시켰기 때문이다(도 2B). 한편, 5 mM의 NMP로 처리한 C3H10T1/2 세포들의 알칼라인 포스파타제 활동도는 증가되지 않았다(데이터는 도시되지 않음).이렇게 NMP 단독으로는 골분화유도가 되지 않는다.

세포주 간의 주 차이점은 MC3T3-E1세포에서만 생산되는 BMP의 존재 여부이기 때문에, 외래 BMP의 효과는 MC3T3-E1 세포를 사용한 동일한 실험 시스템에서 연구되었다. 구체적으로, 세포들은 첫날 4 ml의 배지에 심겨졌고, ALP측정은 여섯번째 날에 수행되었다. 첫번째 날에 BMP는 1 mM의 HCl 내에 2 mg/ml rhBMP-2가 들어있는 기본용액(stock solution)으로부터 1 ㎍/ml의 농도로 세포에 첨가되었다. NMP는 같은 시간에 희석되지 않은 용액으로써 0.1-20mM의 농도로 첨가되었다. 적용 후에, NMP 및 rhBMP를 전체 6-웰 플레이트를 부드럽게 흔들어주면서 혼합하였다. 다른 실험에서, 세포들은 NMP로만 처치되었다. 상승효과를 계산하기 위해서, rhBMP 단독 처치에 의해 유도된 ALP 활동도 및 NMP 단독 처치에 의해 유도된 ALP 활동도를 rhBMP 및 NMP가 모두 존재할 때 얻어진 ALP 활동도에서 뺐다. 결과는 도3에 도시되어 있다.

실시예 3: 서로 다른 피롤리돈들과 BMP-2의 상호작용

NMP는 여러가지 유기 및 무기 물질에 대한 좋은 용매로 알려져 있기 때문에, 관찰된 NMP 및 BMP의 상승효과가 rhBMP에 대한 NMP의 가용화 효과에 기인할 수 있는지에 대해 추측하고 분석하였다. 2 내지 20 마이크로그램의 rhBMP 단백질을 스피드-박(speed-vac)에서 동결건조하여 고형의 rhBMP 디스크를 형성하였다. 증가하는 양의 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP), 1-에틸-2-피롤리돈 (NEP), 2-피롤리돈 (PB), 및 1-시클로헥실-2-피롤리돈 (CP)을 함유하는 50 ㎕의 인산 완충 식염수를 첨가하고, 혼합하고 교반하면서 녹였다. 2 시간 후에 남아있는 디스크 내의 단백질을 침전시키고(22,000xg, 30 min) 상층액 20 ㎕의 단백질 함량을 슬롯-블롯법(slot-blot method, Weber, F. E., et al., 2002, supra)에 의해 측정하였다.

도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 실시예2에 기술된, NMP를 가지고 한 체외실험에서 쓰인 것과 같은 범위 농도의 피롤리돈이, 그렇지 않았다면 불용성인 rhBMP를 가용화하는데 충분했다. 도 4A에 도시된 결과에서 서로 다른 피롤리돈들이 rhBMP-2를 가용화 할 수 있는 능력에 대한 등급이 내림순서로 다음과 같다: 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP) > 1-에틸-2-피롤리돈 (NEP)> 2-피롤리돈 (PB) > 1-시클로헥실-2-피롤리돈 (CP).

동일한 피롤리돈들이 실시예 2에서 설명된 것과 같이 MC3T3-E1 세포에서 수행되었고, 알칼라인 포스파타제의 활동도의 증가는 같은 순위를 따랐다(도 4B). 따라서 피롤리돈들이 rhBMP를 가용화하는 능력은 피롤리돈들이 MC3T3-E1 세포의 성숙에 미치는 효과와 직접적인 연관이 있다.

순수한 NMP의 전조골세포주(MC3T3-E1)에 대한 효과가 연구되었다. 결과에서 낮은 용량의 NMP가, 아마도 그것의 골 형성 단백질(BMP)에 대한 결합 및 가용화 능력에 기인하여 자가 BMP의 생물활동도/이용도를 높이는 것에 의해 전조골세포의 조골세포로의 성숙을 가속화시킨다는 것을 볼 수 있었다. 따라서 NMP 또는 다른 피롤리돈이 자가 단백질의 생물활동도를 높이기 위해, 그리고 낮은 용해도의 재조합 단백질을 적용하기 위해 약품에 쓰일 수 있을 것이다. 더욱이 우리는 GBR 막의 기능을 조직의 기계적인 분리자로부터 생물활성물질의 운반장치로까지 확장시켰다.

<110> The University of Zurich <120> Osteogenic Composition <150> US <151> 2003-01-30 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcaagcca aacacaaaca gcggaaacgc cttaagtcca gctgtaagag acaccctttg 60 tacgtggact tcagtgacgt ggggtggaat gactggattg tggctccccc ggggtatcac 120 gccttttact gccacggaga atgccctttt cctctggctg atcatctgaa ctccactaat 180 catgccattg ttcagacgtt ggtcaactct gttaactcta agattcctaa ggcatgctgt 240 gtcccgacag aactcagtgc tatctcgatg ctgtaccttg acgagaatga aaaggttgta 300 ttaaagaact atcaggacat ggttgtggag ggttgtgggt gtcgctagta cagcaaaatt 360 aaatacataa atatatatat a 381

Claims

약학적으로 허용가능한 담체 내에 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 적어도 하나의 피롤리돈을 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서 상기 BMP(들) 및 상기 피롤리돈(들)은 골형성에 상승적인 치료 효과를 제공하는 양이 존재하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피롤리돈은 알킬 또는 시클로알킬기로 선택적으로 치환된 피롤리돈 및 폴리피롤리돈으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 피롤리돈은 1-메틸-2-피롤리돈(1-methyl-2-pyrrolidones, NMP), 1-에틸-2-피롤리돈(1-ethyl-2-pyrrolidones, NEP), 2-피롤리돈(2-pyrrolidones, PB), 및 1-시클로헥실-2-피롤리돈(1-cyclohexyl-2-pyrrolidones, CP)으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 피롤리돈은 N-메틸-2-피롤리돈 (NMP)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 BMP는 유전자재조합 BMP (rBMP)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 유전자 재조합 BMP는 rBMP-2, rBMP-3, rBMP-4, rBMP-5, rBMP-6, rBMP-7, rBMP-8, rBMP-9, rBMP10, rBMP-11, rBMP-14, rBMP-15, rBMP-16, rGDF-1, rGDF-3, rGDF-8, rGDF-9, rGDF-12, rGDF-14 및 그것들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유전자 재조합 BMP는 rBMP-2, rBMP-4, rBMP-5, rBMP-6, 및 rBMP-7 그리고 그것들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제6항에 있어서, 상기 유전자 재조합 BMP는 rBMP-2 및 rBMP-4 그리고 그것들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 피롤리돈은 N-메틸-2-피롤리돈(NMP)이고, 상기 BMP는 rBMP-2 및 rBMP-4, 그리고 그것들의 혼합물로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 생분해성 중합체인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 생분해성 중합체는 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리락티드(polylactides), 폴리카프롤락톤(polycaprolactones), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonates), 폴리히드록시부티레이트(polyhydroxybutyrates), 폴리히드록시발레레이트(polyhydroxyvalerates), 폴리디옥사논(polydioxanones), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리카보네이트(polycarbonates), 폴리티로신카보네이트(polytyrosinecarbonates), 폴리오르토카보네이트(poly-orthocarbonates), 옥살산염 폴리알킬렌(polyalkylene oxalates), 숙신산염 폴리알킬렌(polyalkylene succinates), 폴리(말산)(poly(malic acid)), 폴리(무수말레산)(poly(maleic anhydride)), 폴리펩티드(polypeptides), 폴리뎁시펩티드(polydepsipeptides), 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol), 폴리에스테라미드(polyesteramides), 폴리아미드(polyamides), 폴리안히드라이드(polyanhydrides), 폴리우레탄(polyurethanes), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리시아노아크릴레이트(polycyanoacrylates), 폴리푸마레이트(polyfumarates), 폴리(아미노산)(poly(amino acids)), 변성 탄수화물(modified polysaccharides), 변성 단백질(modified proteins) 및 그것들의 공중합체, 3원중합체(terpolymers) 또는 그것들의 화합물(combinations) 또는 혼합물(mixtures) 또는 중합체 혼합물(polymer blends)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 생분해성 중합체는 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드)(poly(L-lactide-co-glycolide)), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (poly(D,L-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드)(poly(L-lactide)), 폴리(D,L-락티드)(poly(D,L-lactide)), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide)), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리(L-락티드-코-카프롤락톤(poly(L-lactide-co-caprolactone)), 폴리(D,L-락티드-코-카프롤락톤(poly(D,L-lactide-co-caprolactone)), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonate), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(L-lactide-co-trimethylenecarbonate)), 폴리(D,L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(D,L-lactide-co-trimethylene-carbonate)), 폴리디옥사논(polydioxanone) 및 그것들의 공중합체, 3원중합체, 및 중합체 혼합물(polymer blends)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제12항에 있어서, 상기 생분해성 중합체는 폴리-DL-락티드-코-글리콜리드(PLGA)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
생분해성 중합체 내에 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 적어도 하나의 피롤리돈을 포함하는 약학적 조성물로서, 여기서 상기 BMP(들), 상기 피롤리돈 및 상기 생분해성 중합체는 골형성에 상승적인 치료 효과를 제공하는 양이 존재하는 약학적 조성물.
제14항에 있어서, 상기 적어도 하나의 BMP는 유전자재조합 골 형성 단백질(rBMP)이고, 상기 피롤리돈은 NMP이며, 상기 생분해성 중합체는 폴리-DL-락티드-코-글리콜리드(PLGA)이고, 여기서 상기 재조합 BMP, 상기 NMP 및 상기 PLGA는 골형성에 상승적인 치료 효과를 제공하는 양이 존재하는 약학적 조성물.
골 형성의 유도가 필요한 환자를 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 골형성 유도량의 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 골형성 유도량의 적어도 하나의 피롤리돈이 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 내에 포함되어 상기 환자에게 동시에 투여되는 단계를 포함하며, 여기서 상기 BMP(들) 및 상기 피롤리돈(들)은 골형성에 상승적인 치료 효과를 제공하는 양이 투여되는 골 형성의 유도가 필요한 환자를 치료하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 적어도 하나의 피롤리돈은 약학적 조성물의 형태로 동시에 투여되며, 이것은 골형성 유도량의 적어도 하나의 골 형성 단백질(BMP) 및 골형성 유도량의 적어도 하나의 피롤리돈을, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 담체 내에 포함하고, 여기서 상기 BMP(들) 및 상기 피롤리돈(들)은 골형성에 상승적인 치료 효과를 제공하는 양이 존재하는 것을 특징으로 하는 골 형성의 유도가 필요한 환자를 치료하는 방법.
제17항에 있어서, 상기 피롤리돈은 알킬 또는 시클로알킬기로 선택적으로 치환된 피롤리돈 및 폴리피롤리돈으로부터 선택되고, 상기 BMP는 rBMP-2, rBMP-3, rBMP-4, rBMP-5, rBMP-6, rBMP-7, rBMP-8, rBMP-9, rBMP10, rBMP-11, rBMP-14, rBMP-15, rBMP-16, rGDF-1, rGDF-3, rGDF-8, rGDF-9, rGDF-12, rGDF-14 및 그것들의 혼합물로부터 선택되며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 생분해성 중합체인 것을 특징으로 하는 골 형성의 유도가 필요한 환자를 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 피롤리돈은 1-메틸-2-피롤리돈(1-methyl-2-pyrrolidones, NMP), 1-에틸-2-피롤리돈(1-ethyl-2- pyrrolidones, NEP), 2-피롤리돈(2-pyrrolidones, PB), 및 1-시클로헥실-2-피롤리돈(1-cyclohexyl-2-pyrrolidones, CP)으로부터 선택되고, 상기 BMP는 rBMP-2, rBMP-4, rBMP-5, rBMP-6, rBMP-7 및 그것들의 혼합물로부터 선택되며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 폴리글리콜리드(polyglycolide), 폴리(L-락티드-코-글리콜리드)(poly(L-lactide-co-glycolide)), 폴리(D,L-락티드-코-글리콜리드) (poly(D,L-lactide-co-glycolide)), 폴리(L-락티드)(poly(L-lactide)), 폴리(D,L-락티드)(poly(D,L-lactide)), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(poly(L-lactide-co-D,L-lactide)), 폴리카프롤락톤(polycaprolactone), 폴리(L-락티드-코-카프롤락톤(poly(L-lactide-co-caprolactone)), 폴리(D,L-락티드-코-카프롤락톤(poly(D,L-lactide-co-caprolactone)), 폴리트리메틸렌카보네이트(polytrimethylenecarbonate), 폴리(L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(L-lactide-co-trimethylenecarbonate)), 폴리(D,L-락티드-코-트리메틸렌카보네이트)(poly(D,L-lactide-co-trimethylene-carbonate)), 폴리디옥사논(polydioxanone) 및 그것들의 공중합체, 3원중합체, 및 중합체 혼합물(polymer blends)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 골 형성의 유도가 필요한 환자를 치료하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 피롤리돈은 1-메틸-2-피롤리돈 (NMP)이고, 상기 BMP는 rBMP-2 및 rBMP-4 및 그것들의 혼합물로부터 선택되며, 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 폴리-DL-락티드-코-글리콜리드 (PLGA)인 것을 특징으로 하는 골 형성의 유도가 필요한 환자를 치료하는 방법.