JP2006340720A - 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用 - Google Patents

線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2006340720A
JP2006340720A JP2006196258A JP2006196258A JP2006340720A JP 2006340720 A JP2006340720 A JP 2006340720A JP 2006196258 A JP2006196258 A JP 2006196258A JP 2006196258 A JP2006196258 A JP 2006196258A JP 2006340720 A JP2006340720 A JP 2006340720A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
polypeptide
fgfr
seq
cells
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2006196258A
Other languages
English (en)
Inventor
Christiaan M Saris
エム． サリス クリスティアン
Sharon X Mu
エックス． ミュー シャロン
Min Xia
シャ ミン
Thomas Charles Boone
チャールズ ブーン トーマス
Todd Covey
コベイ トッド
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Amgen Inc
Original Assignee
Amgen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Amgen Inc filed Critical Amgen Inc
Publication of JP2006340720A publication Critical patent/JP2006340720A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/12—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis
    • A61P3/14—Drugs for disorders of the metabolism for electrolyte homeostasis for calcium homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Cardiology (AREA)

Abstract

【課題】診断的な利点または治療的な利点を有する、線維芽細胞増殖因子レセプター様、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定すること。
【解決手段】単離された核酸分子であって、以下：（ａ）特定の配列に示されるヌクレオチド配列；（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号中のＤＮＡインサートの、ヌクレオチド配列；（ｃ）特定の配列に示されるポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体に、中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチド配列；および（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【選択図】なし

Description

本願は、２０００年３月２２日出願の米国仮特許出願第６０／１９１，３７９
号の継続であり、この仮出願の開示は、本明細書中で参考として明確に援用され
る。
（発明の分野）
本発明は、線維芽細胞増殖因子レセプター様（ＦＧＦＲ−Ｌ）ポリペプチドお
よびこのポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、ＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞およ
び方法に関する。本発明はさらに、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと関連する疾患、
障害、および状態の、診断、処置、改善、および／または予防のための薬学的組
成物および方法に関する。
（発明の背景）
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびに
ヒトゲノムの解読は、新規治療剤の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列
決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と
合わされて、ゲノムの一部および全体へと重複配列を集合すること、ならびにポ
リペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編
集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および／または
構造の目印に対して相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリ
ペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のた
めのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの
操作は、治療剤としての使用に関して生成物に対して有利な特性を与え得る。
過去１０年間にわたるゲノム研究における有意な技術進歩にも関わらず、ヒト
ゲノムに基づく新規治療剤の開発に関する可能性は、未だほとんど実現されてい
ない。潜在的に有利なポリペプチド治療剤をコードする多くの遺伝子またはこれ
らがコードするポリペプチド（これらは、治療分子に対して「標的」としてはた
らき得る）は、未だ同定されていない。 従って、診断的な利点または治療的な
利点を有する、新規ポリペプチドおよびこれらをコードする核酸分子を同定する
ことが、本発明の目的である。
本発明によって以下が提供される：
（項目１） 単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号１または配列番号４のいずれかに示される、ヌクレオチド配列
；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号＿中のＤＮＡインサートの、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５に示されるポリペプチドをコードする、ヌ
クレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体に、中程度にストリンジェントな条
件下または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチ
ド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目２） 単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドと少な
くとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって
、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいず
れかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１または配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列の
対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするか、ＡＴＣＣ受託番号＿
中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス
改変体をコードするか、または（ａ）の対立遺伝子改変体またはスプライス改変
体をコードする、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードす
る、配列番号１もしくは配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列の領域、ＡＴ
ＣＣ受託番号＿中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の領域、（ａ）または
（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、該ポリペプチドフラグメン
トは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるコードされたポリペプ
チドの活性を有するか、または抗原性である、領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１もし
くは配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列の領域、ＡＴＣＣ受託番号＿中の
ＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の領域、または（ａ）〜（ｃ）のいずれか
のヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条
件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチ
ド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目３） 単離された核酸分子であって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であっ
て、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のい
ずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、こ
こで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれか
に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、こ
こで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれか
に示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であっ
て、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のい
ずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末
端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２ま
たは配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列であって、ここで、該コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番
号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）
のいずれかのヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条
件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチ
ド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
（項目４） 項目１、項目２または項目３のいずれか１項に記載の
核酸分子を含む、ベクター。
（項目５） 項目４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
（項目６） 真核生物細胞である、項目５に記載の宿主細胞。
（項目７） 原核生物細胞である、項目５に記載の宿主細胞。
（項目８） ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生するためのプロセスであっ
て、該ポリペプチドを発現するために適切な条件下で項目５に記載の宿主細胞
を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する
工程を包含する、プロセス。
（項目９） 項目８に記載のプロセスによって産生される、ポリペプチ
ド。
（項目１０） 項目８に記載のプロセスであって、ここで、前記核酸分
子は、前記ＦＧＦＲ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結され
た、ネイティブなＦＧＦＲ−ＬポリペプチドについてのプロモーターＤＮＡ以外
のプロモーターＤＮＡを含む、プロセス。
（項目１１） 項目２に記載の単離された核酸分子であって、ここで、
前記同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴＡ、
ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリ
ズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定される、
単離された核酸分子。
（項目１２） 化合物がＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性またはＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求
項５、項目６、または項目７のいずれか１項に記載の細胞を該化合物に曝す
工程、および該細胞におけるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性またはＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチド産生を測定する工程を包含する、プロセス。
（項目１３） 単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示される、アミノ酸配列；お
よび
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号＿中のＤＮＡインサートによってコードされる、アミ
ノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１４） 単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）配列番号３または配列番号６に示されるアミノ酸配列であって、必要に
応じて、アミノ末端メチオニンをさらに含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号５のいずれかのオルソログについての、アミ
ノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約
７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列番号
２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ
酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２または配列番号５の
いずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、該フラグメ
ントは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性
を有するか、または抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列の対立
遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号＿中の
ＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体または
スプライス改変体のアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかの対立遺伝
子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１５） 単離されたポリペプチドであって、以下：
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは
、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有す
る、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列
番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ア
ミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは、配列
番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ア
ミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペプチドは
、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有す
る、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末
端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２ま
たは配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、該ポリペ
プチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活
性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
（項目１６） 項目１、項目２、または項目３のいずれか１項に記
載の核酸分子によってコードされる単離されたポリペプチドであって、ここで、
該ポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプ
チドの活性を有する、単離されたポリペプチド。
（項目１７） 項目１４に記載の単離されたポリペプチドであって、こ
こで、前記同一性パーセントは、ＧＡＰ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳ
ＴＡ、ＢＬＡＳＴＸ、ＢｅｓｔＦｉｔ、およびＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎア
ルゴリズムからなる群より選択されるコンピュータープログラムを用いて決定さ
れる、単離されたポリペプチド。
（項目１８） 項目１３、項目１４、または項目１５のいずれか１
項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグ
メント。
（項目１９） 配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ
酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する、項目
１８に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
（項目２０） 抗体またはそのフラグメントである、項目１８に記載の
選択的結合因子。
（項目２１） ヒト化抗体である、項目１８に記載の選択的結合因子。
（項目２２） ヒト抗体またはそのフラグメントである、項目１８に記
載の選択的結合因子。
（項目２３） ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
項１８に記載の選択的結合因子。
（項目２４） モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求
項１８に記載の選択的結合因子。
（項目２５） キメラ抗体またはそのフラグメントである、項目１８に
記載の選択的結合因子。
（項目２６） ＣＤＲ移植抗体またはそのフラグメントである、項目１
８に記載の選択的結合因子。
（項目２７） 抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、請
求項１８に記載の選択的結合因子。
（項目２８） 可変領域フラグメントである、項目１８に記載の選択的
結合因子。
（項目２９） 前記可変領域フラグメントが、Ｆａｂフラグメントまたは
Ｆａｂ’フラグメントである、項目２８に記載の選択的結合因子。
（項目３０） 配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を
有するポリペプチドに特異性を有する少なくとも１つの相補性決定領域を含む、
選択的結合因子またはそのフラグメント。
（項目３１） 検出可能標識に結合された、項目１８に記載の選択的結
合因子。
（項目３２） ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの生物学的活性と拮抗する、請
求項１８に記載の選択的結合因子。
（項目３３） ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド関連の疾患、状態、または障害
を、処置、予防、または改善するための組成物であって、有効量の項目１８に
記載の選択的結合因子を含む、組成物。
（項目３４） 配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を
含むポリペプチドで動物を免疫することによって産生される、選択的結合因子。
（項目３５） 項目１、項目２、または項目３のいずれか１項に記
載のポリペプチドに結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
（項目３６） 項目１８に記載の選択的結合因子またはフラグメントを
用いて、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの量を検出または定量する方法。
（項目３７） 項目１３、項目１４、または項目１５のいずれか１
項に記載のポリペプチドと、薬学的に受容可能な処方剤とを含む、組成物。
（項目３８） 前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバン
ト、溶解剤、安定剤、または抗酸化剤である、項目３７に記載の組成物。
（項目３９） 前記ポリペプチドが、配列番号３または配列番号６に示さ
れるアミノ酸配列を含む、項目３８に記載の組成物。
（項目４０） 項目１３、項目１４、または項目１５のいずれか１
項に記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
（項目４１） 水溶性ポリマーを用いて共有結合的に改変された、項目
４０に記載のポリペプチド。
（項目４２） 項目４１に記載のポリペプチドであって、ここで、前記
水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシポリエチレングリコ
ール、デキストラン、セルロース、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレ
ングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／
エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、およびポリビニ
ルアルコールからなる群より選択される、ポリペプチド。
（項目４３） 項目１、項目２または項目３のいずれか１項に記載
の核酸分子と、薬学的に受容可能な処方剤とを含む、組成物。
（項目４４） 前記核酸分子が、ウイルスベクター中に含まれる、項目
４３に記載の組成物。
（項目４５） 項目１、項目２または項目３のいずれか１項に記載
の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
（項目４６） 異種アミノ酸配列に融合された、項目１３、項目１４
、または項目１５のいずれか１項に記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプ
チド。
（項目４７） 前記異種アミノ酸配列が、ＩｇＧ定常ドメインまたはその
フラグメントである、項目４６に記載の融合ポリペプチド。
（項目４８） 医学的状態を、処置、予防、または改善するための組成物
であって、項目１３、項目１４、もしくは項目１５のいずれか１項に記載
のポリペプチド、または項目１、項目２、もしくは項目３のいずれか１項
に記載の核酸によってコードされるポリペプチドを含む、組成物。
（項目４９） 項目４８に記載の組生物であって、処置、予防または改
善される医学的状態が、造血性障害、骨粗鬆症、大理石骨病、骨形成不全症、パ
ジェット病、歯周疾患、高カルシウム血症、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、
癌、糖尿病、肥満、または悪液質である、組成物。
（項目５０） 被験体において病的状態または病的状態に対する感受性を
診断する方法であって、以下：
（ａ）サンプルにおいて、項目１３、項目１４、もしくは項目１５のい
ずれか１項に記載のポリペプチドの発現の存在または発現量、または項目１、
項目２、もしくは項目３のいずれか１項に記載の核酸分子によってコードさ
れるポリペプチドの発現の存在または発現量を、決定する工程；および
（ｂ）該ポリペプチドの発現の存在または発現量に基づいて、病的状態または
病的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
（項目５１） デバイスであって、以下：
（ａ）移植に適した膜；および
（ｂ）該膜内にカプセル化された細胞であって、該細胞は、項目１３、請求
項１４、もしくは項目１５のいずれか１項に記載のタンパク質を分泌する、細
胞；
を備え、
該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、かつ該細胞に有害な物質に対し
て不透過性である、デバイス。
（項目５２） ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに結合する化合物を同定する方
法であって、以下：
（ａ）項目１３、項目１４、もしくは項目１５のいずれか１項に記載の
ポリペプチドを、化合物と接触させる工程；および
（ｂ）該化合物への該ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの結合の程度を決定する工程
、
を包含する、方法。
（項目５３） 前記化合物に結合した場合の前記ポリペプチドの活性を決
定する工程をさらに包含する、項目５２に記載の方法。
（項目５４） 動物においてポリペプチドのレベルを調節するための組成
物であって、項目１、項目２、または項目３のいずれか１項に記載の核酸
分子を含む、組成物。
（項目５５） 項目１、項目２、または項目３のいずれか１項に記
載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
（項目５６） 化合物がＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性またはＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチド産生を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、請求
項５５に記載のトランスジェニック哺乳動物を該化合物に曝す工程、および該哺
乳動物におけるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性またはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
産生を測定する工程を包含する、プロセス。
（発明の要旨）
本発明は、新規ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子およびコードされるポリペプチドに関す
る。
本発明は、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、以下：
（ａ）配列番号１または配列番号４のいずれかに示される、ヌクレオチド配列
；
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号＿中のＤＮＡインサートの、ヌクレオチド配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列；
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかの相補体に、中程度にストリンジェントな条
件下または高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、ヌクレオチ
ド配列；および
（ｅ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明はまた、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドと少な
くとも約７０％同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって
、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のい
ずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号１または配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列の
対立遺伝子改変体またはスプライス改変体、ＡＴＣＣ受託番号＿中のＤＮＡイン
サートのヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体、または
（ａ）の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードする、ヌクレオチド
配列；
（ｃ）少なくとも約２５アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードす
る、配列番号１または配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列の領域、ＡＴＣ
Ｃ受託番号＿中のＤＮＡインサートのヌクレオチド配列の領域、（ａ）のヌクレ
オチド配列の領域または（ｂ）のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、上
記ポリペプチドフラグメントは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示さ
れるコードされたポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、ヌクレ
オチド配列の領域；
（ｄ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号１また
は配列番号４のいずれかのヌクレオチド配列の領域、ＡＴＣＣ受託番号＿中のＤ
ＮＡインサートのヌクレオチド配列の領域、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかの
ヌクレオチド配列の領域；
（ｅ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条
件下で、（ａ）〜（ｄ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチ
ド配列；ならびに
（ｆ）（ａ）〜（ｄ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択される、ヌクレオチド配列を含む。
本発明はさらに、単離された核酸分子を提供し、この核酸分子は、
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であっ
て、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５の
いずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、こ
こで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれ
かに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、こ
こで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれ
かに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であっ
て、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列番号５の
いずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末
端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２ま
たは配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列であって、ここで、上記コードされたポリペプチドは、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列；
（ｆ）少なくとも約１６ヌクレオチドのフラグメントを含む、（ａ）〜（ｅ）
のいずれかの、ヌクレオチド配列；
（ｇ）中程度にストリンジェントな条件下または高度にストリンジェントな条
件下で、（ａ）〜（ｆ）のいずれかの相補体にハイブリダイズする、ヌクレオチ
ド配列；ならびに
（ｈ）（ａ）〜（ｅ）のいずれかと相補的な、ヌクレオチド配列、
からなる群より選択されるヌクレオチド配列を含む。
本発明は、単離されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、
（ａ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示される、アミノ酸配列；お
よび
（ｂ）ＡＴＣＣ受託番号＿中のＤＮＡインサートによってコードされる、アミ
ノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明はまた、単離されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、
（ａ）配列番号３または配列番号６に示されるアミノ酸配列であって、必要に
応じてさらにアミノ末端メチオニンを含む、アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号２または配列番号５のいずれかのオルソログについての、アミ
ノ酸配列；
（ｃ）配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも約
７０％同一であるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配列番
号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミ
ノ酸配列；
（ｄ）少なくとも約２５アミノ酸残基を含む、配列番号２または配列番号５の
いずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、上記フラグ
メントは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活
性を有するか、または抗原性である、フラグメント；ならびに
（ｅ）配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列の対立
遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、ＡＴＣＣ受託番号＿中の
ＤＮＡインサートによってコードされるアミノ酸配列の対立遺伝子改変体または
スプライス改変体のアミノ酸配列、または（ａ）〜（ｃ）のいずれかの対立遺伝
子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
本発明はさらに、単離されたポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、
（ａ）少なくとも１つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチド
は、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有
する、アミノ酸配列；
（ｂ）少なくとも１つのアミノ酸挿入を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配
列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、
アミノ酸配列；
（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチドは、配
列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、
アミノ酸配列；
（ｄ）Ｃ末端短縮および／またはＮ末端短縮を有する、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリペプチド
は、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有
する、アミノ酸配列；ならびに
（ｅ）アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、Ｃ末端短縮、およびＮ末
端短縮からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、配列番号２ま
たは配列番号５のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、上記ポリ
ペプチドは、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドの
活性を有する、アミノ酸配列、
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
ＦＧＦＲ−Ｌアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドもまた、提供される。
本発明はまた、本明細書中に示されるような単離された核酸分子を含む発現ベ
クター、本明細書中に示されるような組換え核酸分子を含む組換え宿主細胞、お
よびＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生する方法を提供し、この方法は、この宿主
細胞を培養する工程、および必要に応じてそのように産生されたポリペプチドを
単離する工程を包含する。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子を含むトランスジェニック非
ヒト動物もまた、本発明に含まれる。ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子は、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドの発現およびＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの増加したレベル（これは、
増加した循環レベルを含み得る）を可能にする様式で、動物中に導入される。あ
るいは、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子は、内因性ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現を阻
害する（すなわち、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド遺伝子ノックアウトを保有するト
ランスジェニック動物を作製する）様式で動物に導入される。このトランスジェ
ニック非ヒト動物は、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくはげっ歯類（例
えば、ラットまたはマウス）である。
本発明のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの誘導体もまた、提供される。
本発明のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに特異的に結合し得る選択的結合因子（例
えば、抗体およびペプチド）が、さらに提供される。このような抗体およびペプ
チドは、アゴニストであってもアンタゴニストであってもよい。
本発明のヌクレオチド、ポリペプチド、もしくは選択的結合因子と、１つ以上
の薬学的に受容可能な処方剤とを含む、薬学的組成物もまた、本発明によって包
含される。この薬学的組成物は、治療有効量の本発明のヌクレオチドまたはポリ
ペプチドを提供するために使用される。本発明はまた、このポリペプチド、核酸
分子、および選択的結合因子を使用する方法に関する。
本発明のＦＧＦＲ−ＬポリペプチドおよびＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子は、疾患およ
び障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を処置、予防、改善、および／ま
たは検出するために使用され得る。
本発明はまた、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに結合する試験分子を同定するため
に、試験分子をアッセイする方法を提供する。この方法は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペ
プチドを試験分子と接触させて、このポリペプチドへのこの試験分子の結合の程
度を決定する工程を包含する。この方法はさらに、このような試験分子が、ＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストであるか否かを決定す
る工程を包含する。本発明はさらに、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現またはＦ
ＧＦＲ−Ｌポリペプチドの活性に対する分子の影響を試験する方法を提供する。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現を調整する方法およびＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドのレベルを調節する（すなわち、増加または減少させる）方法もまた、本発
明によって包含される。１つの方法は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする
核酸分子を動物に投与する工程を包含する。別の方法において、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドの発現を調整または調節するエレメントを含む核酸分子が、投与され
得る。これらの方法の例としては、本明細書中にさらに記載されるような、遺伝
子治療、細胞治療、およびアンチセンス治療が挙げられる。
このＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、そのリガンドを同定するために使用され得
る。種々の形態の「発現クローニング」が、レセプターについてのリガンドをク
ローニングするために使用されている（例えば、Ｄａｖｉｓら、１９９６、Ｃｅ
ｌｌ，８７：１１６１〜６９）。これらおよび他のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドリ
ガンドクローニング実験が、本明細書中により詳細に記載される。ＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドリガンドの単離により、このＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドシグナル伝
達経路の新規なアゴニストまたはアンタゴニストの同定または開発が可能である
。このようなアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドリガンド、抗ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドリガンド抗体およびその誘導体、低
分子、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられ、これらのうちのいず
れもが、１つ以上の疾患または障害（本明細書中に列挙されるものを含む）を潜
在的に処置するために使用され得る。
（発明の詳細な説明）
本明細書中で使用される節の表題は、組織的な目的のみのためであり、そして
記載される主題を限定するようには解釈されるべきではない。本願において引用
される全ての参考文献は、明確に本明細書中に参考として援用される。
（定義）
用語「ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子」または「ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子」また「ＦＧＦＲ
−Ｌポリヌクレオチド」とは、配列番号１または配列番号４のいずれかに示され
るヌクレオチド配列、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペ
プチドをコードするヌクレオチド配列、ＡＴＣＣ受託番号＿におけるＤＮＡイン
サートのヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むかま
たはこれらからなる、核酸分子をいう。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体」とは、生物または生物の
集団の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の、天然に存在する可能ないく
つかの代替形態のうちの１つをいう。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドスプライス改変体」とは、配列番号２または
配列番号５のいずれかに示されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドアミノ酸配列のＲＮ
Ａ転写物中のイントロン配列の選択的プロセシングによって生成される、核酸分
子（通常はＲＮＡ）をいう。
用語「単離された核酸分子」とは、（１）総核酸が供給源細胞から単離される
場合に、ともに天然で見出されるタンパク質、脂質、糖質、または他の物質のう
ち少なくとも約５０パーセントから分離された、本発明の核酸分子、（２）「単
離された核酸分子」が天然で連結しているポリヌクレオチドの全てまたは一部に
連結していない、本発明の核酸分子、（３）天然では連結しないポリヌクレオチ
ドに作動可能に連結されている、本発明の核酸分子、または（４）より大きなポ
リヌクレオチド配列の一部として天然には存在しない、本発明の核酸分子をいう
。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、いかなる他の夾雑核酸分子、ま
たは天然の環境において見出される他の夾雑物（これらは、ポリペプチド産生に
おける使用、または治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を
妨げる）も実質的には含まない。
用語「核酸配列」または「核酸分子」は、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列をいう
。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡの公知の塩基アナログのうちのいずれかから
形成される分子を含み、この塩基アナログは、例えば、以下であるがこれらに限
定されない：４−アセチルシトシン、８−ヒドロキシ−Ｎ６−メチルアデノシン
、アジリジニル−シトシン、プソイドイソシトシン、５−（カルボキシヒドロキ
シルメチル）ウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カル
ボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメ
チルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、Ｎ６−イソ−ペンテニルアデニン
、１−メチルアデニン、１−メチルプソイドウラシル、１−メチルグアニン、１
−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチ
ルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン
、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノ
−メチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン（ｂｅｔａ−Ｄ
−ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボニル−メチルウ
ラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニ
ン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸、オ
キシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２
−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオ
ウラシル、５−メチルウラシル、Ｎ−ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル
、ウラシル−５−オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉ
ｎｅ）、２−チオシトシン、および２，６−ジアミノプリン。
用語「ベクター」は、宿主細胞にコード情報を移すために使用される任意の分
子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）をいうために使用される。
用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換に適切であり、かつ挿入された
異種核酸配列の発現を、指向および／または制御する核酸配列を含む、ベクター
をいう。発現としては、転写、翻訳、およびＲＮＡスプライシング（イントロン
が存在する場合）のようなプロセスが挙げられるが、これらに限定されない。
用語「作動可能に連結された（されている）」は、隣接配列の配置方法をいう
ために本明細書中に使用される。ここで、このように記載される隣接配列は、そ
の通常の機能を実行するように構成されるかまたは集合される。従って、コード
配列に作動可能に連結された隣接配列は、そのコード配列の複製、転写および／
または翻訳をもたらすことができ得る。例えば、プロモーターがコード配列の転
写を指向し得る場合、このコード配列は、このプロモーターに作動可能に連結さ
れている。隣接配列は、それが正確に機能する限り、コード配列と連続している
必要はない。従って、例えば、翻訳されないが転写される介在配列が、プロモー
ター配列とこのコード配列との間に存在し得、そして、このプロモーター配列は
なお、このコード配列に「作動可能に連結されている」とみなされ得る。
用語「宿主細胞」は、核酸配列で形質転換されたかまたは形質転換され得、次
いで目的の選択された遺伝子を発現し得る、細胞をいうために用いられる。この
用語は、この選択された遺伝子が存在する限り、子孫が形態学または遺伝的構成
においてもとの親と同一であってもなくても、この親細胞の子孫を含む。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド」とは、配列番号２または配列番号５のいず
れかのアミノ酸配列を含むポリペプチドおよび関連ポリペプチドをいう。関連ポ
リペプチドとしては、以下が挙げられる：ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドフラグメン
ト、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体、
およびＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド誘導体であって、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるポリペプチドの少なくとも１つの活性を有するもの。ＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドは、本明細書中に定義されるように、成熟ポリペプチドで
あり得、そして調製方法によっては、アミノ末端メチオニン残基を有しても有さ
なくてもよい。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドフラグメント」とは、配列番号２または配列
番号５のいずれかに示されるポリペプチドのアミノ末端（リーダー配列を有する
かまたは有さない）の短縮および／またはカルボキシル末端の短縮を含むポリペ
プチドをいう。用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドフラグメント」とはまた、ＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド誘導体、またはＦ
ＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の
短縮物をいうか、あるいはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＦ
ＧＦＲ−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドの
アミノ末端および／またはカルボキシル末端の短縮物をいう。ＦＧＦＲ−Ｌポリ
ペプチドフラグメントは、選択的ＲＮＡスプライシングから生じ得るか、または
インビボプロテアーゼ活性から生じ得る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの膜結合形
態もまた、本発明によって意図される。好ましい実施形態において、短縮および
／または欠失は、約１０アミノ酸、または約２０アミノ酸、または約５０アミノ
酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または１００アミノ酸よ
り多いアミノ酸を含む。このように産生されたポリペプチドフラグメントは、約
２５個連続するアミノ酸、または約５０アミノ酸、または約７５アミノ酸、また
は約１００アミノ酸、または約１５０アミノ酸、または約２００アミノ酸、また
は２００アミノ酸より多いアミノ酸を含む。このようなＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドフラグメントは、必要に応じて、アミノ末端メチオニン残基を含み得る。この
ようなフラグメントは、例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに対する抗体を生成
するために用いられ得ることが理解される。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドオルソログ」とは、配列番号２または配列番
号５のいずれかに示されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドアミノ酸配列に対応する、
別の種由来のポリペプチドをいう。例えば、マウスおよびヒトのＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドは、互いにオルソログであるとみなされる。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体」とは、配列番号２または配列番号５
のいずれかに示されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドアミノ酸配列（リーダー配列を
有するか、または有さない）に比べて、１つ以上のアミノ酸配列の置換、欠失（
例えば、内部欠失および／もしくはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドフラグメント）、
ならびに／または付加（例えば、内部付加および／もしくはＦＧＦＲ−Ｌ融合ポ
リペプチド）を有するアミノ酸配列を含む、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをいう。
改変体は、天然に存在し得る（例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改
変体、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドオルソログ、およびＦＧＦＲ−Ｌスプライス改
変体）か、または人工的に構築され得る。このようなＦＧＦＲ−Ｌ−ポリペプチ
ド改変体は、配列番号１または配列番号４のいずれかに示されるＤＮＡ配列から
しかるべく変動するＤＮＡ配列を有する対応する核酸分子から調製され得る。好
ましい実施形態において、この改変体は、１〜３個、または１〜５個、または１
〜１０個、または１〜１５個、または１〜２０個、または１〜２５個、または１
〜５０個、または１〜７５個、または１〜１００個、または１００個よりも多い
アミノ酸の置換、挿入、付加および／もしくは欠失を有し、ここでその置換は、
保存的であっても、または非保存的であってもよいし、あるいはその組み合わせ
であってもよい。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド誘導体」とは、化学的に改変された、本明細
書中に定義されるような、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポ
リペプチド、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドフラグメント、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドオルソログ、またはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体をいう。用語「ＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチド誘導体」とはまた、化学的に改変された、本明細書中に定義さ
れるような、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド対立遺伝子改変体またはＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドスプライス改変体によってコードされるポリペプチドをいう。
用語「成熟ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド」とは、リーダー配列を欠くＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドをいう。成熟ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドはまた、アミノ末端（リ
ーダー配列を有するか、または有さない）および／またはカルボキシル末端のタ
ンパク質分解性プロセシング、より大きい前駆体からのより小さいポリペプチド
の切断、Ｎ結合型グリコシル化および／またはＯ結合型グリコシル化などのよう
な、他の改変を含み得る。例示的な成熟ＣＨＬポリペプチドは、配列番号３また
は配列番号６のいずれかのアミノ酸配列によって示される。
用語「ＦＧＦＲ−Ｌ融合ポリペプチド」とは、本明細書中に定義されるような
、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチド、ＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドフラグメント、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドオルソログ、ＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチド改変体、またはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド誘導体の、アミノ末
端またはカルボキシル末端での１つ以上のアミノ酸（例えば、異種タンパク質ま
たは異種ペプチド）の融合体をいう。用語「ＦＧＦＲ−Ｌ融合ポリペプチド」と
はまた、本明細書中に定義されるような、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド対立遺伝子
改変体またはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドスプライス改変体によってコードされる
ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシル末端での、１つ以上のアミノ酸の
融合体をいう。
用語「生物学的に活性なＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド」とは、配列番号２または
配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドの少なくとも１つの活
性の特徴を有する、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをいう。さらに、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドは、免疫原として活性であり得る；すなわち、このＦＧＦＲ−Ｌポリ
ペプチドは、抗体が惹起され得る少なくとも１つのエピトープを含む。
用語「単離されたポリペプチド」とは、以下のような本発明のポリペプチドを
いう：（１）供給源細胞から単離された場合に、共に天然に見出されるポリヌク
レオチド、脂質、糖質、または他の材料の、少なくとも約５０％から分離された
ポリペプチド、（２）その「単離されたポリペプチド」が天然において結合され
ているポリペプチドの全体または一部分に（共有結合性の相互作用または非共有
結合性の相互作用によって）結合されていないポリペプチド、（３）天然におい
て結合されないポリペプチドに（共有結合性の相互作用または非共有結合性の相
互作用によって）作動可能に連結されているポリペプチド、あるいは（４）天然
に存在しないポリペプチド。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、その
治療用途、診断用途、予防用途または研究用途を妨害する、その天然の環境にお
いて見出されるいかなる他の夾雑ポリペプチドまたは他の夾雑物をも実質的に含
まない。
用語「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、当該分野で公知のように、２つ以上
のポリペプチド分子、または２つ以上の核酸分子の配列の間にある、これらの配
列を比較することによって決定される、関係をいう。当該分野では、「同一性」
はまた、核酸分子またはポリペプチドの配列関連性の程度（場合によっては、２
つ以上のヌクレオチド配列または２つ以上のアミノ酸配列のストリングの間の一
致により決定され得る）を意味する。「同一性」は、特定の算術モデルまたはコ
ンピュータープログラム（すなわち、アルゴリズム）によって位置付けられた、
ギャップアライメント（もし存在するならば）を有する２つ以上の配列のうちの
短い方の間の同一適合のパーセントを測定する。
用語「類似性（ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」は、関連する概念であるが、「同一
性」とは対照的に、「類似性」とは、同一適合および保存的置換適合の両方を含
む関連性の尺度をいう。２つのポリペプチド配列が、例えば、１０／２０の同一
のアミノ酸を有し、そして残りが全て非保存的置換であるならば、同一性パーセ
ントおよび類似性パーセントは、両方とも５０％である。同じ例で、保存的置換
が存在するさらに５つの位置が存在するならば、同一性パーセントは、５０％の
ままであるが、類似性パーセントは７５％（１５／２０）である。従って、保存
的置換が存在する場合、２つのポリペプチドの間の類似性パーセントは、これら
の２つのポリペプチドの間の同一性パーセントよりも高い。
用語「天然に存在する」または「ネイティブ」は、核酸分子、ポリペプチド、
宿主細胞などのような生物学的材料に関して使用される場合、天然に見出されか
つ人工的に操作されていない材料をいう。同様に、「天然に存在しない」または
「非ネイティブ」は、本明細書中において使用される場合、天然には見出されな
いか、または人工的に構造改変されたかもしくは合成された、材料をいう。
用語「有効量」および「治療的に有効な量」とは、各々、本明細書中に示され
るＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの１つ以上の生物学的活性の観察可能なレベルを支
持するために使用されるＦＧＦＲ−ＬポリペプチドまたはＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子
の量をいう。
本明細書中に使用される場合、用語「薬学的に受容可能なキャリア」または「
生理学的に受容可能なキャリア」とは、薬学的組成物としてのＦＧＦＲ−Ｌポリ
ペプチド、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子、またはＦＧＦＲ−Ｌ選択的結合因子の送達を
、達成するかまたは増強するのに適切な、１つ以上の処方材料をいう。
用語「抗原」とは、選択的結合因子（例えば、抗体）により結合され得る分子
または分子の一部であって、そしてさらに、その抗原のエピトープに結合し得る
抗体を産生するために動物において用いられ得る、分子または分子の一部をいう
。抗原は、１つ以上のエピトープを有し得る。
用語「選択的結合因子」とは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに対して特異性を有
する分子（単数または複数）をいう。本明細書中にて使用される場合、用語「特
異的」および「特異性」とは、ヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに結合するがヒト
非ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに結合しない、選択的結合因子の能力をいう。しか
し、その選択的結合因子が、配列番号２または配列番号５のいずれかに示される
ようなポリペプチドのオルソログ（すなわち、その種間のバージョン（例えば、
マウスＦＧＦＲ−ＬポリペプチドおよびラットＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド））も
また結合し得ることが、理解される。
用語「形質導入」は、１つの細菌から別のものへの（通常、ファージによる）
遺伝子の移入をいうために使用される。「形質導入」はまた、レトロウイルスに
よる真核生物細胞の配列の捕捉および移入をいう。
用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡまたは外因性ＤＮＡ
の取り込みをいうために使用される。そして、細胞は、その外因性ＤＮＡが細胞
膜の内側に導入されている場合、「トランスフェクト」されている。多数のトラ
ンスフェクション技術が、当該分野で周知であり、そして、本明細書中に開示さ
れる。例えば、Ｇｒａｈａｍら、１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６；
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ，１９８９）；Ｄａｖｉｓら、Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６）；お
よびＣｈｕら、１９８１，Ｇｅｎｅ １３：１９７を参照のこと。このような技
術は、１つ以上の外因性ＤＮＡ部分を適切な宿主細胞に導入するために使用され
得る。
用語「形質転換」は、本明細書中に使用される場合、細胞の遺伝特徴における
変化をいい、そして細胞は、新しいＤＮＡを含むように改変されている場合、形
質転換されている。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝的に改変さ
れた場合、形質転換されている。トランスフェクションおよび形質導入に続いて
、その形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体へ物理的に組み込むことによってその細
胞のＤＮＡと組み換わり得るか、複製されないエピソームエレメントとして一過
性に維持され得るか、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、そ
のＤＮＡが細胞の分裂と共に複製される場合、安定に形質転換されているとみな
される。
（核酸分子および／またはポリペプチドの関連性）
関連する核酸分子が、配列番号１または配列番号４のいずれかの核酸分子の対
立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含み、そして上記のヌクレオチド配列
のいずれかと相補的である配列を含むことが、理解される。関連する核酸分子は
また、配列番号２または配列番号５のいずれかのポリペプチドと比較して、１つ
以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加、および／または欠失を含むかまたはこ
れらから本質的になる、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。こ
のような関連するＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、例えば、１つ以上のＮ結合型グ
リコシル化部位もしくはＯ結合型グリコシル化部位の付加および／または欠失、
あるいは１つ以上のシステイン残基の付加および／または欠失を含み得る。
関連する核酸分子はまた、配列番号２または配列番号５のいずれかのＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドの、少なくとも約２５個連続したアミノ酸、または約５０アミ
ノ酸、または約７５アミノ酸、または約１００アミノ酸、または約１５０アミノ
酸、または約２００アミノ酸、または約２００個より多いアミノ酸残基のポリペ
プチドをコードする、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子のフラグメントを含む。
さらに、関連するＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子としてはまた、本明細書中に定義され
るような中程度にストリンジェントな条件または高度にストリンジェントな条件
下で、配列番号１または配列番号４のいずれかのＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子の完全な
相補配列とか、または配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるような
アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする分子の完全な相補配列とか、また
は本明細書中に定義されるような核酸フラグメントの完全な相補配列とか、また
は本明細書中に定義されるようなポリペプチドをコードする核酸フラグメントの
完全な相補配列、とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む分子が挙げられ
る。ハイブリダイゼーションプローブは、関連する配列に関して、ｃＤＮＡライ
ブラリー、ゲノムライブラリー、または合成ＤＮＡライブラリーをスクリーニン
グするために、本明細書中に提供されるＦＧＦＲ−Ｌ配列を用いて調製され得る
。既知の配列と有意な同一性を示すＦＧＦＲ−ＬポリペプチドのＤＮＡ配列およ
び／またはアミノ酸配列の領域は、本明細書中に記載されるような配列アライン
メントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域は、スクリー
ニングのためのプローブを設計するために使用され得る。
用語「高度にストリンジェントな条件」は、配列が高度に相補的であるＤＮＡ
鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そして有意にミスマッチしているＤＮ
Ａのハイブリダイゼーションを除外するように設計された、条件をいう。ハイブ
リダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホ
ルムアミドのような変性剤の濃度によって、決定される。ハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、６５〜６８℃
での、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウムで
あるか、または４２℃での、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ
クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミドである。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，
Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａ
ｌ ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照
のこと。
よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、
より高いホルムアミド、または他の変性剤）もまた、使用し得る−しかし、ハイ
ブリダイゼーションの速度は、影響される。他の薬剤が、非特異的なハイブリダ
イゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少
させる目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。
例は、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニル−ピロリドン、０．１
％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４
（ＳＤＳ））、フィコール、デンハルト溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ
（または別の非相補的ＤＮＡ）、および硫酸デキストランであるが、他の適切な
薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼ
ーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得
る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが
；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとん
どｐＨとは無関係である。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈ
ｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４
章（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さ、およ
び塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、これらの
変数を適応させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するの
を可能にするように、当業者によって調整され得る。完全に一致したＤＮＡ二重
鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る：
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ
）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼ
ーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃ
は、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不
完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致に対して約１
℃ずつ減少する。
用語「中程度にストリンジェントな条件」は、「高度にストリンジェントな条
件」下で生じ得るよりもより大きい程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が
、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は
、５０〜６５℃での、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン
酸ナトリウムであるか、または３７〜５０℃での、０．０１５Ｍ 塩化ナトリウ
ム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミドである。
例として、０．０１５Ｍ ナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジ
ェントな条件」は、約２１％の不一致を許容する。
「高度にストリンジェントな条件」と「中程度にストリンジェントな条件」と
の間に完全な区別は存在しないことが、当業者によって理解される。例えば、０
．０１５Ｍ ナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した
長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）で洗浄す
る場合、これは、約６％不一致を許容する。より遠く関連する配列を捕獲するた
めに、当業者は、単に温度を低下させ得るし、またはイオン強度を上昇させ得る
。
約２０ｎｔまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１Ｍ ＮａＣｌ＊に
おける融解温度の適切な概算値は、以下によって提供される：
Ｔｍ＝１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃＋１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃
＊６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍ
である。Ｓｕｇｇｓら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｕｓｉ
ｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３（ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）
１９８１）を参照のこと。
オリゴヌクレオチドに対して高いストリンジェンシーの洗浄条件は、通常、６
×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて、このオリゴヌクレオチドのＴｍの０〜５℃
下の温度である。
別の実施形態において、関連する核酸分子は、配列番号１または配列番号４の
いずれかに示されるようなヌクレオチド配列と少なくとも約７０パーセント同一
であるヌクレオチド配列を含むかもしくはこれからなるか、または配列番号２ま
たは配列番号５のいずれかに示されるポリペプチドと少なくとも約７０パーセン
ト同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかもしくはこれ
から本質的になる。好ましい実施形態において、このヌクレオチド配列は、配列
番号１または配列番号４のいずれかに示されるヌクレオチド配列と、約７５パー
セント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９０パー
セント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９８パー
セントまたは９９パーセント同一であるか、あるいは、このヌクレオチド配列は
、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチド配列と、約７
５パーセント、または約８０パーセント、または約８５パーセント、または約９
０パーセント、または約９５パーセント、９６パーセント、９７パーセント、９
８パーセントまたは９９パーセント同一であるポリペプチドをコードする。関連
する核酸分子は、配列番号２または配列番号５のいずれかに示されるポリペプチ
ドの少なくとも１つの活性を有するポリペプチドをコードする。
核酸配列における差異は、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸
配列に対するアミノ酸配列の保存的改変および／または非保存的改変を生じ得る
。
配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列に対する保存的改変（
およびコードヌクレオチドに対する対応する改変）は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドに類似した機能的特徴および化学的特徴を有するポリペプチドを生成する。対
照的に、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの機能的特徴および／または化学的特徴にお
ける実質的な改変は、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列に
おいて置換を選択することによって達成され得、これらの置換は、（ａ）置換領
域における分子骨格の構造（例えば、シートコンフォメーションまたはらせんコ
ンフォメーション）、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、あるい
は（ｃ）側鎖の大きさを、維持することに対するその影響において有意に異なる
。
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置におけるアミノ酸残基の極性ま
たは電荷にほとんど影響がないかまたは全く影響がないような、ネイティブなア
ミノ酸残基の非ネイティブな残基による置換を含み得る。さらに、ポリペプチド
中の任意のネイティブな残基はまた、「アラニンスキャニング変異誘発」に関し
て以前に記載されたように、アラニンで置換され得る。
保存的アミノ酸置換はまた、天然に存在しないアミノ酸残基を含み、これらの
残基は、生物系における合成によるよりむしろ化学的ペプチド合成によって代表
的に組み込まれる。これらは、ペプチド模倣物、およびアミノ酸部分の他の逆転
形態または反転形態を含む。
天然に存在する残基は、共通の側鎖の特性に基づいてクラスに分けられ得る：
１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
５）鎖の方向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
例えば、非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のク
ラス由来のメンバーへと交換することを含み得る。このような置換された残基は
、非ヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと相同性であるヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドの領域、またはこの分子の非相同性領域に、導入され得る。
このような変更を作製する場合、アミノ酸のハイドロパシー指標が、考慮され
得る。各アミノ酸は、その疎水性特徴および荷電特徴に基づいてハイドロパシー
指標が割り当てられている。これらのハイドロパシー指標は、イソロイシン（＋
４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋
２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラ
ニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（
−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（
−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン
（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジ
ン（−３．９）およびアルギニン（−４．５）である。
タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を付与することにおけるハイド
ロパシーアミノ酸指標の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（
Ｋｙｔｅら、１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−３１）。特定
のアミノ酸が類似のハイドロパシー指標またはハイドロパシースコアを有する他
のアミノ酸に代わって置換され得、そして依然として類似の生物学的活性を維持
し得ることが、公知である。ハイドロパシー指標に基づいて変化を起こす際に、
ハイドロパシー指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であ
るものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより特に好まし
い。
類似のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的になされ得る（特に、これに
よって作製された生物学的機能的に等価なタンパク質またはペプチドが、この場
合においてと同様に、免疫学的実施形態における使用に関して考慮される場合）
こともまた、当該分野において理解されている。その隣接するアミノ酸の親水性
によって支配される、タンパク質の最も大きな局所的平均親水性は、その免疫原
性および抗原性に、すなわち、そのタンパク質の生物学的特性に、相関する。
以下の親水性の値が、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニ
ン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グル
タミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；
グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン
（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイ
ン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−
１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニ
ン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。類似の親水性の値に基づ
いて変化を行う際に、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±
ｌ以内であるものが特に好ましく、そして±０．５以内であるものが、なおより
特に好ましい。一次アミノ酸配列から、エピトープを、親水性に基づいて同定も
し得る。これらの領域はまた、「エピトープコア領域」とも呼ばれる。
所望のアミノ酸置換（保存的であれ非保存的であれ）は、当業者によって、そ
のような置換が所望される時点で決定され得る。例えば、アミノ酸置換を使用し
て、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの重要な残基を同定し得るし、または本明細書中
に記載されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの親和性を増加もしくは減少させ得る。
例示的なアミノ酸置換は、表Ｉに記載される。
（表１）
（アミノ酸置換）
Figure 2006340720
当業者は、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のポリペプチドの適
切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。生物学的活性を破壊するこ
となく変化され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、活性のため
に重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまた
は他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合には
、当業者は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポ
リペプチドと比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保
存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに
対して保存されていない、ＦＧＦＲ−Ｌ分子の領域における変化が、ＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドの生物学的活性および／または構造に不利に影響を与える可能性
はさほどないことが、理解される。当業者はまた、比較的保存された領域におい
てさえ、活性を維持しながら、天然に存在する残基を化学的に類似するアミノ酸
に置換し得ることを知っている（保存的アミノ酸残基置換）。従って、生物学的
活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊するこ
となく、またはポリペプチド構造に不利に影響を与えることなく、保存的アミノ
酸置換に供され得る。
さらに、当業者は、活性または構造のために重要である、類似のポリペプチド
における残基を同定する、構造−機能研究を再調査し得る。このような比較を考
慮して、類似のポリペプチドにおける活性または構造のために重要なアミノ酸残
基に対応するＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドにおける、アミノ酸残基の重要性を予測
し得る。当業者は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのこのような予測された重要なア
ミノ酸残基に代わる化学的に類似するアミノ酸での置換を、選択し得る。
当業者はまた、類似のポリペプチドにおける三次元構造、およびその構造に関
連するアミノ酸配列を分析し得る。このような情報を考慮して、当業者は、ＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸残基のアライメントを、その三次元構造に関し
て予測し得る。当業者は、そのタンパク質の表面上に存在すると予測されるアミ
ノ酸残基に対する急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、この
ような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、
当業者は、単一のアミノ酸置換を各アミノ酸残基に含む、試験改変体を生成し得
る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニン
グされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使
用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変化が、破壊された活性、望
ましくなく減少した活性、または適切でない活性を生じたことを発見した場合に
は、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣
用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が、単独でかま
たは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、
容易に決定し得る。
多数の科学刊行物が、二次構造の推定に充てられてきた。Ｍｏｕｌｔ，１９９
６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７：４２２−２７；Ｃｈｏｕ
ら、１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３：２２２−４５；Ｃｈｏｕら、
１９７４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １１３：２１１−２２；Ｃｈｏｕら、１
９７８，Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．Ｒｅｌａｔ．Ａｒｅａｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
．４７：４５−４８；Ｃｈｏｕら、１９７８，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ
．４７：２５１−２７６；およびＣｈｏｕら、１９７９，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．
２６：３６７−８４を参照のこと。さらに、コンピュータープログラムが、二次
構造の予測を補助するために現在利用可能である。二次構造を推測する１つの方
法は、相同性モデリングに基づく。例えば、３０％よりも大きい配列同一性、ま
たは４０％よりも大きい配列類似性を有する、２つのポリペプチドまたはタンパ
ク質は、しばしば、類似した構造トポロジーを有する。タンパク質構造データベ
ース（ＰＤＢ）の近年の成長により、二次構造の推測可能性（ポリペプチド構造
またはタンパク質構造内の潜在的な折り畳みの数を含む）の促進がもたらされた
。Ｈｏｌｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１９９９、２７：２４４
−４７を参照のこと。所定のポリペプチドもしくはタンパク質において限定され
た数の折り畳みが存在すること、および一旦臨界数の構造が決定されると、構造
予測が劇的により正確になること、が示唆されている（Ｂｒｅｎｎｅｒら、１９
９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．７ ３６９−７６）。
二次構造を推定するさらなる方法は、「スレッディング（ｔｈｒｅａｄｉｎｇ
）」（Ｊｏｎｅｓ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．
７：３７７−８７；Ｓｉｐｐｌら、１９９６，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４：１５−
１９）、「プロフィール分析」（Ｂｏｗｉｅら、１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２
５３：１６４−７０；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９９０，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌ．１８３：１４６−５９；Ｇｒｉｂｓｋｏｖら、１９８７，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：４３５５−５８）、および「進
化学的連鎖」（Ｈｏｌｍら、前出、およびＢｒｅｎｎｅｒら、前出を参照のこと
）を包含する。
好ましいＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体としては、グリコシル化部位の数お
よび／または型が配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のアミノ酸配列
と比較して変化している、グリコシル化改変体が挙げられる。１つの実施形態に
おいて、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体は、配列番号２または配列番号５のい
ずれかに記載のアミノ酸配列より多いかまたはより少ない数のＮ結合グリコシル
化部位を含む。Ｎ結合グリコシル化部位は、配列Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓ
ｎ−Ｘ−Ｔｈｒによって特徴付けられ、ここで、Ｘと印されるアミノ酸残基は、
プロリン以外の任意のアミノ酸残基であり得る。この配列を作製するためのアミ
ノ酸残基の置換は、Ｎ結合型糖鎖の付加のための潜在的な新たな部位を提供する
。あるいは、この配列を排除する置換は、存在するＮ結合型糖鎖を除去する。１
つ以上のＮ結合グリコシル化部位（代表的には、天然に存在するグリコシル化部
位）が排除され、そして１つ以上の新たなＮ結合部位が作製される、Ｎ結合型糖
鎖の再配列もまた、提供される。さらなる好ましいＦＧＦＲ−Ｌ改変体としては
、１つ以上のシステイン残基が、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載
のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸（例えば、セリ
ン）で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に
活性な立体構造へとリフォールディングされなければならない場合に、有用であ
る。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン
残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシ
ステインから生じる相互作用を最小にする。
他の実施形態において、関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸挿入
を有する、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなり、そしてこのポリペプ
チドが配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有
するか、あるいはこの関連する核酸分子は、少なくとも１つのアミノ酸欠失を有
する、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなり、ここでこのポリペプチド
が配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のポリペプチドの活性を有する
。関連する核酸分子はまた、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたはこの配列からなり、こ
のポリペプチドがカルボキシル末端および／またはアミノ末端の短縮を有し、そ
してさらにこのポリペプチドが、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載
のポリペプチドの活性を有する。関連する核酸分子はまた、アミノ酸置換、アミ
ノ酸挿入、アミノ酸欠失、カルボキシル末端短縮、およびアミノ末端短縮からな
る群より選択される少なくとも１つの改変を含む、配列番号２または配列番号５
のいずれかに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むかまたは
この配列からなり、そしてポリペプチドが配列番号２または配列番号５のいずれ
かに記載のポリペプチドの活性を有する。
さらに、配列番号２または配列番号５のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペ
プチドあるいは他のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、同種ポリペプチドに融合され
てホモダイマーを形成し得るか、あるいは異種ポリペプチドに融合されてヘテロ
ダイマーを形成し得る。異種のペプチドおよびポリペプチドとしては、以下が挙
げられるが、それらに限定されない：ＦＧＦＲ−Ｌ融合ポリペプチドの検出およ
び／または単離を可能にするエピトープ；膜貫通レセプタータンパク質またはそ
の部分（例えば、細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）
；膜貫通レセプタータンパク質に結合する、リガンドまたはその部分；触媒的に
活性である、酵素またはその部分；オリゴマー化を促進するポリペプチドまたは
ペプチド（例えば、ロイシンジッパードメイン）；安定性を増加させるポリペプ
チドまたはペプチド（例えば、免疫グロブリン定常領域）；ならびに配列番号２
または配列番号５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドあるいは
他のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドとは異なる治療活性を有する、ポリペプチド。
融合は、配列番号２または配列番号５のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む
ポリペプチド、あるいは他のＩＬ１ｒａ−Ｒポリペプチドの、アミノ末端または
カルボキシル末端のいずれかにおいて、なされ得る。融合は、リンカーもアダプ
ター分子も用いずに直接であっても、リンカーもしくはアダプター分子を介して
であってもよい。リンカーまたはアダプター分子は、１つ以上のアミノ酸残基で
あり得、代表的に、約２０〜約５０アミノ酸残基であり得る。リンカーまたはア
ダプター分子はまた、融合した部分の分離を可能にするために、ＤＮＡ制限エン
ドヌクレアーゼまたはプロテアーゼについての切断部位を有して設計され得る。
一旦構築されると、融合ポリペプチドは、本明細書中に記載の方法に従って誘導
体化され得ることが、理解される。
本発明のさらなる実施形態において、配列番号２または配列番号５のいずれか
のアミノ酸配列を含むポリペプチド、あるいは他のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは
、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つ以上のドメインに融合される。抗体は、以下の２
つの機能的に独立した部分を含む；抗原を結合する「Ｆａｂ」として公知の可変
ドメイン、ならびに補体活性化および食作用細胞による攻撃のようなエフェクタ
ー機能に関与する、「Ｆｃ」として公知の定常ドメイン。Ｆｃは、長い血清半減
期を有し、一方でＦａｂは、短寿命である。Ｃａｐｏｎら、１９８９，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３３７：５２５−３１。治療タンパク質と一緒に構築される場合には、Ｆ
ｃドメインは、より長い半減期を提供し得るか、またはＦｃレセプター結合、プ
ロテインＡ結合、補体結合のような機能、および恐らく、胎盤移入のような機能
さえも、組み込み得る（同書）。表ＩＩは、当該分野において公知の特定のＦｃ
融合物の使用を要約する。
（表２）
（治療タンパク質とのＦｃ融合物）
Figure 2006340720
一例において、ヒトＩｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域が、
当業者に公知の方法を使用して、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ末端または
カルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。別の例において、ヒトＩ
ｇＧのヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドフラグメント（例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの推定細胞外部分）のアミ
ノ末端またはカルボキシル末端のいずれかにおいて、融合され得る。
得られるＦＧＦＲ−Ｌ融合ポリペプチドは、プロテインＡアフィニティーカラ
ムの使用によって、精製され得る。Ｆｃ領域に融合したペプチドおよびタンパク
質は、融合していない対応物より実質的に長いインビボでの半減期を示すことが
見出された。また、Ｆｃ領域への融合は、融合ポリペプチドの二量体化／多量体
化を可能にする。このＦｃ領域は、天然に存在するＦｃ領域であってもよいし、
または治療品質、循環時間、もしくは減少した凝集のような、特定の品質を改善
するよう変更されてもよい。
関連する核酸分子およびポリペプチドの同一性および類似性は、公知の方法に
よって容易に計算され得る。このような方法としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎ
ａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａ．Ｍ．Ｌｅｓｋ編、Ｏｘｆｏｒ
ｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ １９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎ
ｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｄ．
Ｗ．Ｓｍｉｔｈ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９３）；Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａ（Ｐａｒｔ １，
Ａ．Ｍ．ＧｒｉｆｆｉｎおよびＨ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ編、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒ
ｅｓｓ １９９４）；Ｇ．ｖｏｎ Ｈｅｉｎｌｅ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐ
ｒｅｓｓ １９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐｒｉｍｅｒ（
Ｍ．ＧｒｉｂｓｋｏｖおよびＪ．Ｄｅｖｅｒｅｕｘ編、Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ
Ｐｒｅｓｓ １９９１）；ならびにＣａｒｉｌｌｏら、１９８８，ＳＩＡＭ Ｊ
．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ．，４８：１０７３に記載されるものが挙げられる
が、これらに限定されない。
同一性および／または類似性を決定するための好ましい方法は、試験される配
列間での最大の適合を生じるように、設計される。同一性および類似性を決定す
るための方法は、公に利用可能なコンピュータプログラムにおいて記載されてい
る。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータ
プログラム方法としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅ
ｕｘら、１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅ
ｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、
およびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２
１５：４０３−１０）を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡ
ＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）および他の供給源（Ａｌ
ｔｓｃｈｕｌら、ＢＬＡＳＴ Ｍａｎｕａｌ（ＮＣＢ ＮＬＭ ＮＩＨ，Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ，ＭＤ）；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０、前出）から公に利用可能
である。周知のＳｍｉｔｈ Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムもまた、同一性を決
定するために使用され得る。
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアライメントスキームは、これ
ら２つの配列の短い領域のみの適合を生じ得、そしてこの小さな整列領域は、そ
の２つの全長配列間に有意な関連がない場合でさえも、非常に高い配列同一性を
有し得る。従って、好ましい実施形態において、選択されたアライメント方法（
ＧＡＰプログラム）は、本願ポリペプチドのうちの少なくとも５０個連続するア
ミノ酸にわたる整列を生じる。
例えば、コンピュータアルゴリズムＧＡＰ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔ
ｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、配列同一性の百分率が決定されるべき２つのポリ
ペプチドが、それらのそれぞれのアミノ酸の最適な適合（このアルゴリズムによ
って決定される「適合したスパン」）のために、整列される。ギャップオープニ
ングペナルティー（ｇａｐ ｏｐｅｎｉｎｇ ｐｅｎａｌｔｙ）（これは、平均
対角の３倍として計算される：「平均対角」とは、使用される比較行列（ｃｏｍ
ｐａｒｉｓｏｎ ｍａｔｒｉｘ）の対角の平均である；「対角」とは、特定の比
較行列によって各完全なアミノ酸適合に対して割り当てられたスコアまたは数で
ある）およびギャップエクステンションペナルティー（ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉ
ｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）（これは通常、キャップオープニングペナルティーの０
．１倍である）、ならびにＰＡＭ ２５０またはＢＬＯＳＵＭ ６２のような比
較行列が、このアルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列もま
た、このアルゴリズムによって使用される（Ｄａｙｈｏｆｆら、５ Ａｔｌａｓ
ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（補
遺３ １９７８）（ＰＡＭ２５０比較行列）；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、１９９２，
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：１０９１５−１９（Ｂ
ＬＯＳＵＭ ６２比較行列）を参照のこと）。
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられ
る：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３；
比較行列：ＢＬＯＳＵＭ ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆら、前出）；
ギャップペナルティー：１２
ギャップ長さペナルティー（Ｇａｐ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｅｎａｌｔｙ）：４
類似性の閾値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｏｆ Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）：０
このＧＡＰプログラムは、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメータ
は、ＧＡＰアルゴリズムを用いるポリペプチド比較（末端ギャップに対してはペ
ナルティーがないこととともに）のためのデフォルトパラメータである。
核酸分子配列比較のための好ましいパラメータとしては、以下が挙げられる：
アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，前出；
比較行列：適合＝＋１０，非適合＝０
ギャップペナルティー：５０
ギャップ長さペナルティー：３
このＧＡＰプログラムはまた、上記パラメータを用いて有用である。上記パラメ
ータは、核酸分子比較のためのデフォルトパラメータである。
Ｐｒｏｇｒａｍ Ｍａｎｕａｌ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅ
ｒｓｉｏｎ ９，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，１９９７に記載されるものを含む、他の
例示的なアルゴリズム、ギャップオープニングペナルティー、ギャップエクステ
ンションペナルティー、比較行列、および類似性の閾値が使用され得る。なされ
るべき特定の選択は、当業者に明らかであり、そしてなされるべき特定の比較（
例えば、ＤＮＡ対ＤＮＡ、タンパク質対タンパク質、タンパク質対ＤＮＡ）；な
らびにさらに、その比較が所定の配列対の間（この場合には、ＧＡＰまたはＢｅ
ｓｔＦｉｔが一般的に好ましい）であるか、１つの配列と大きな配列データベー
スとの間（この場合には、ＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴＡが好ましい）であるか
に、依存する。
（核酸分子）
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核
酸分子は、種々の様式（化学合成、ｃＤＮＡもしくはゲノムのライブラリーのス
クリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および／またはｃＤＮＡのＰ
ＣＲ増幅が挙げられるが、これらに限定されない）で容易に得られ得る。
本明細書中において使用される組換えＤＮＡ法は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒ
ｅｓｓ，１９８９）および／またはＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐ
ｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９
４）に記載されている方法である。本発明は、本明細書中に記載されているよう
な核酸分子、およびこのような分子を得るための方法を提供する。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子が１つの種から
同定された場合には、この遺伝子の全てまたは一部を、オルソログ（ｏｒｔｈｏ
ｌｏｇ）または同じ種由来の関連遺伝子を同定するためのプローブとして使用し
得る。このプローブまたはプライマーを使用して、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを
発現すると考えられる種々の組織供給源由来のｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングし得る。さらに、配列番号１または配列番号４のいずれかに記載されるよ
うな配列を有する核酸分子の部分または全てを使用して、ゲノムライブラリーを
スクリーニングし、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝
子を同定および単離し得る。代表的に、中程度または高度のストリンジェンシー
の条件が、スクリーニングのために使用されて、このスクリーニングから得られ
る偽陽性の数を最少にする。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子はまた、発現
されたタンパク質の特性に基づく陽性クローンの検出を使用する発現クローニン
グによって、同定され得る。代表的に、核酸ライブラリーは、抗体または他の結
合パートナー（例えば、レセプターまたはリガンド）を、宿主細胞表面において
発現および提示されたクローンタンパク質に結合させることによって、スクリー
ニングされる。抗体または結合パートナーは、所望のクローンを発現する細胞を
同定するために、検出可能な標識で改変される。
以下に記載される説明に従い実施される組換え発現技術に従って、これらのポ
リヌクレオチドを産生し得、そしてコードされたポリペプチドを発現させ得る。
例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸配列を適切
なベクターに挿入することによって、当業者は、多量の所望されるヌクレオチド
配列を容易に生成し得る。次いで、これらの配列を使用して、検出プローブまた
は増幅プライマーを生成し得る。あるいは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ
酸配列をコードするポリヌクレオチドを、発現ベクターに挿入し得る。発現ベク
ターを適切な宿主に導入することによって、コードされたＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドが、多量に生成され得る。
適切な核酸配列を得るための別の方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で
ある。この方法において、ｃＤＮＡは、酵素トランスクリプターゼを使用して、
ポリ（Ａ）＋ＲＮＡまたは全ＲＮＡから調製される。次いで、２つのプライマー
（代表的には、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ
の２つの別個の領域に対して相補的である）が、Ｔａｑポリメラーゼのようなポ
リメラーゼとともにこのｃＤＮＡに添加され、そしてこのポリメラーゼが、この
ｃＤＮＡにおけるこれら２つのプライマー間の領域を増幅する。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を調製する別
の手段は、Ｅｎｇｅｌｓら、１９８９，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．第２
８版：７１６−３４によって記載されるような、当業者に周知の方法を使用する
、化学合成である。これらの方法としては、とりわけ、核酸合成のためのホスホ
トリエステル、ホスホルアミダイト、およびＨ−ホスホネート方法が挙げられる
。このような化学合成のために好ましい方法は、標準的なホスホルアミダイト化
学を使用する、ポリマーにより支持される合成である。代表的に、ＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、数百ヌクレオチド長である
。約１００ヌクレオチドより長い核酸は、これらの方法を使用して、いくつかの
フラグメントとして合成され得る。次いで、これらのフラグメントが一緒に連結
されて、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の全長ヌクレオチド配列を形成し得る。通常、この
ポリペプチドのアミノ末端をコードするＤＮＡフラグメントは、ＡＴＧ（これは
、メチオニン残基をコードする）を有する。このメチオニンは、宿主細胞におい
て産生されるポリペプチドがその細胞から分泌されるよう設計されているか否か
に依存して、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの成熟形態で存在してもそうでなくても
よい。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
特定の実施形態において、核酸改変体は、所定の宿主細胞におけるＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドの最適な発現のために変更されたコドンを含む。特定のコドン変
更は、発現のために選択される宿主細胞およびＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに依存
する。このような「コドン最適化」は、種々の方法によって（例えば、所定の宿
主細胞において高度に発現される遺伝子において使用されるのに好ましいコドン
を選択することによって）実施され得る。高度に発現された細菌遺伝子のコドン
優先度（ｃｏｄｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）についての「Ｅｃｏ＿ｈｉｇｈ．
Ｃｏｄ」のようなコドン頻度表を組み込むコンピュータアルゴリズムが使用され
得、そしてＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ
Ｖｅｒｓｉｏｎ ９．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ
，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。他の有用なコドン頻度表として
は、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｃｅｌｅｇａｎｓ＿ｌｏｗ．
ｃｏｄ」、「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｈｕｍａｎ＿ｈｉ
ｇｈ．ｃｏｄ」、「Ｍａｉｚｅ＿ｈｉｇｈ．ｃｏｄ」、および「Ｙｅａｓｔ＿ｈ
ｉｇｈ．ｃｏｄ．」が挙げられる。
いくつかの場合において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体をコードする核酸
分子を調製することが所望され得る。改変体をコードする核酸分子は、プライマ
ーが所望の点変異を有する部位特異的変異誘発、ＰＣＲ増幅、または他の適切な
方法を使用して生成され得る（変異誘発技術の説明に関しては、Ｓａｍｂｒｏｏ
ｋら、前出、およびＡｕｓｕｂｅｌら、前出を参照のこと）。Ｅｎｇｅｌｓら、
前出によって記載される方法を使用する化学合成もまた、このような改変体を調
製するために使用され得る。当業者に公知の他の方法が、同様に使用され得る。
（ベクターおよび宿主細胞）
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子を、標準的な
連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入する。ベクターは、代表的に、使
用される特定の宿主細胞において機能的であるように選択される（すなわち、ベ
クターは、遺伝子の増幅および／または遺伝子の発現が生じ得るように、宿主細
胞機構と適合性である）。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
る核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫（バキュロウイルス系）
宿主細胞および／または真核生物宿主細胞において増幅／発現され得る。宿主細
胞の選択は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが翻訳後修飾（例えば、グリコシル化お
よび／またはホスホリル化）されるか否かに一部依存する。その場合、酵母宿主
細胞、昆虫宿主細胞、または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説
について、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，第１８５巻（Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌ編，Ａｃ
ａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １９９０）を参照のこと。
代表的に、任意の宿主細胞に使用される発現ベクターは、プラスミド維持のた
めの配列ならびに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配
列を含む。このような配列（集合的に、「隣接配列」という）は、特定の実施形
態において、代表的に、以下のヌクレオチド配列の１つ以上を含む：プロモータ
ー、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナーおよびアク
セプタースプライス部位を含む完全なイントロン配列、ポリペプチド分泌のため
のリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、
発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、
ならびに選択可能マーカーエレメント。これらの配列のそれぞれが、以下に議論
される。
必要に応じて、ベクターは、「タグ」コード配列（すなわち、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドコード配列の５’末端または３’末端に配置されるオリゴヌクレオチ
ド分子）を含み得；このオリゴヌクレオチド配列は、ポリＨｉｓ（例えば、ヘキ
サＨｉｓ）、または別の「タグ」（例えば、ＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素イン
フルエンザウイルス）またはｍｙｃ（これに対して、市販の抗体が存在する）を
コードする。このタグは、代表的には、ポリペプチドの発現の際にポリペプチド
に融合され、宿主細胞からの、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのアフィニティー精製
のための手段として役立ち得る。アフィニティー精製は、例えば、アフィニティ
ーマトリクスとして、タグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーに
よって達成され得る。必要に応じて、タグは、引き続いて、切断のために特定の
ペプチダーゼを使用するような、種々の手段によって、精製されたＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドから除去され得る。
隣接配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株由来）であ
り得るか、異種（すなわち、宿主細胞種または株以外の種由来）であり得るか、
ハイブリッド（すなわち、１つより多くの供給源由来の隣接配列の組み合わせ）
であり得るか、または合成であり得るか、あるいは隣接配列は、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチド発現を調節するために通常機能するネイティブな配列であり得る。こ
のように、隣接配列の供給源は、任意の原核生物または真核生物、任意の脊椎生
物または無脊椎生物、または任意の植物であり得るが但し、隣接配列は、この宿
主細胞の機構において機能的であり、そしてこの宿主細胞の機構によって活性化
され得る。
本発明のベクターに有用な隣接配列は、当該分野において周知である任意のい
くつかの方法によって得られ得る。代表的には、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の隣接配列
以外の、本発明で有用な隣接配列は、マッピングおよび／または制限エンドヌク
レアーゼ消化によって以前に同定されており、従って、適切な制限エンドヌクレ
アーゼを使用して、適切な組織供給源から単離され得る。いくつかの場合におい
て、隣接配列の全長ヌクレオチド配列は公知であり得る。ここで、隣接配列は、
核酸合成またはクローニングのために本明細書中で記載される方法を使用して合
成され得る。
隣接配列の全てまたは一部のみが公知である場合、これは、ＰＣＲを使用して
、および／または適切なオリゴヌクレオチドおよび／または同種もしくは別の種
由来の隣接配列フラグメントを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングする
ことによって得られ得る。隣接配列が公知ではない場合、隣接配列を含むＤＮＡ
のフラグメントは、例えば、コード配列または別の遺伝子さえも含み得る大きな
ＤＮＡ片から単離され得る。単離は、適切なＤＮＡフラグメントを生成するため
の制限エンドヌクレアーゼ消化、続くアガロースゲル精製を使用する単離、Ｑｉ
ａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ
）、または当業者に公知の他の方法によって達成され得る。この目的を達成する
ための適切な酵素の選択は、当業者に容易に明らかである。
複製起点は、代表的に、市販から購入された原核生物発現ベクターの一部であ
り、この起点は、宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。特定のコピー数
までのベクターの増幅は、いくつかの場合において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
の最適な発現のために重要であり得る。選択されたベクターが複製起点部位を含
まない場合、複製起点は、既知の配列に基づいて化学的に合成され得、そしてベ
クターに連結され得る。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａ
ｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）からの複製起点は、大部分のグ
ラム陰性細菌に適切であり、そして種々の起源（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ
、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはＨＰＶもしくはＢ
ＰＶのようなパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクロー
ニングのために有用である。一般的に、複製起点の成分は、哺乳動物発現ベクタ
ーには必要ない（例えば、ＳＶ４０起源は、それが初期プロモーターを含むとい
う理由のみによって、しばしば使用されている）。
転写終結配列は、代表的にポリペプチドコード領域の３’末端に配置され、
そして転写を終結させるのに役立つ。通常、原核生物細胞における転写終結配列
は、Ｇ−Ｃリッチフラグメントと、続くポリ−Ｔ配列である。この配列はライブ
ラリーから容易にクローン化されるか、またはベクターの一部としての市販から
の購入ですらあるが、これはまた、本明細書中に記載された核酸合成のための方
法を使用して容易に合成され得る。
選択マーカー遺伝子エレメントは、選択培養培地において増殖される宿主細胞
の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。代表的な選択マーカー遺伝
子は、（ａ）原核生物宿主細胞に対して、抗生物質または他の毒素（例えば、ア
ンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシン）に対する耐性を与えるか
；（ｂ）細胞の栄養要求性の欠損を補うか；あるいは、（ｃ）複合培地から入手
可能でない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択マ
ーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサ
イクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子もまた、原核生物宿主細胞
および真核生物宿主細胞における選択のために使用され得る。
他の選択遺伝子は、発現される遺伝子を増幅するために使用され得る。増幅は
、増殖に重要なタンパク質の産生のために大いに要求されている遺伝子が、組換
え細胞の継続世代の染色体内でタンデムに反復されているプロセスである。哺乳
動物細胞に対する適切な選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ
（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞の形質転換体
は、選択圧下に置かれ、ここで、形質転換体のみが固有に、ベクターに存在する
選択遺伝子によって生存するように適応される。選択圧を、培地中の選択因子の
濃度を連続的に変化させ、それによって選択遺伝子とＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
をコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く条件下で、形質転換された細胞を培養
することによって課される。結果として、増加した量のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドが、増幅されたＤＮＡから合成される。
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、そしてＳｈ
ｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列（原核性物）またはＫｏｚａｋ配列（真核生物）
によって特徴付けられる。このエレメントは、代表的に、発現されるＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドのプロモーターに対して３’側およびコード配列に対して５’側
に配置される。Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、可変であるが、代表的に
は、ポリプリン（すなわち、高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのＳｈｉ
ｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列は、同定されており、それぞれが、本明細書中に記
載の方法を使用して、容易に合成され得、原核生物ベクターにおいて使用され得
る。
リーダー配列、またはシグナル配列は、宿主細胞からＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドを指向させるために使用され得る。代表的には、シグナル配列をコードするヌ
クレオチド配列は、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子のコード領域に位置するか、または直
接ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドコード領域の５’側に位置する。多くのシグナル配
列が同定されており、選択された宿主細胞において機能的である任意のシグナル
配列が、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子と組み合わせて使用され得る。従って、シグナル
配列は、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子に対して同種（天然に存在する）または異種であ
り得る。さらに、シグナル配列は、本明細書中に記載される方法を使用して化学
的に合成され得る。大半の場合、シグナルペプチドの存在による宿主細胞からの
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの分泌は、分泌されたＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドから
のシグナルペプチドの除去を生じる。シグナル配列は、ベクターの成分であり得
るか、またはベクターに挿入されたＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子の一部であり得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドコード領域に結合されたネイティブなＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドシグナル配列をコードするヌクレオチド配列、または、ＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドコード領域に結合された異種シグナル配列をコードするヌクレオ
チド配列のいずれかの使用は本発明の範囲内である。選択された異種シグナル配
列は、宿主細胞によって認識され、プロセスされる（すなわち、シグナルペプチ
ダーゼによって切断される）ものであるべきである。ネイティブなＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドシグナル配列を認識せず、そしてプロセスもしない原核生物宿主細
胞について、シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナー
ゼ、または熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シ
グナル配列によって置換される。酵母分泌のために、ネイティブなＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファ
ターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、ネイティブ
なシグナル配列で十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
真核生物宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望されるような、いくつか
の場合において、グリコシル化または収量を改善するために種々のプレ配列（ｐ
ｒｅｓｅｑｕｅｎｃｅ）が操作され得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペ
プチダーゼ切断部位を変更し得るかまたはプロ配列（ｐｒｏ−ｓｅｑｕｅｎｃｅ
）を加え得、これはまた、グリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は、
１位に（成熟タンパク質の最初のアミノ酸と相対的に）、発現に付随する１つ以
上のさらなるアミノ酸を有し得、これは、完全には除去されない可能性がある。
例えば、最終のタンパク質産物は、アミノ末端に結合される、ペプチダーゼ切断
部位において見出される１つまたは２つのアミノ酸残基を有し得る。あるいは、
いくつかの酵素切断部位の使用は、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域
で切断する場合に所望のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのわずかに短縮された（ｔｒ
ｕｎｃａｔｅ）形態を生じ得る。
多くの場合において、核酸分子の転写は、ベクター内の１つ以上のイントロン
の存在によって増加する；これは、ポリペプチドが真核生物宿主細胞（特に、哺
乳動物宿主細胞）において産生される場合に特に当てはまる。使用されるイント
ロンは、特に使用される遺伝子が全長ゲノム配列またはそのフラグメントである
場合にＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子内に天然に存在するものであり得る。イントロンが遺
伝子内に天然に存在しない場合（大部分のｃＤＮＡについて）、イントロンは、
別の供給源から得られ得る。隣接配列およびＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子に対してイント
ロンの位置は、イントロンが有効に転写されなければならないので、一般的に重
要である。従って、ＦＧＦＲ−Ｌ ｃＤＮＡ分子が転写される場合、イントロン
の好ましい位置は、転写開始部位に対して３’側であり、かつポリ−Ａ転写終止
配列に対して５’側である。好ましくは、イントロンは、コード配列を妨害しな
いように、ｃＤＮＡの１つの側または他の側（すなわち、５’側または３’側）
に配置される。任意の供給源（ウイルス、原核生物および真核生物（植物または
動物）を含む）由来のイントロンを使用して本発明を実行し得るが、但し、この
イントロンは、挿入される宿主細胞に適合性である。合成イントロンもまたここ
に含まれる。必要に応じて、１つより多くのイントロンがベクター内で使用され
得る。
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは、代表的には、宿主生物
によって認識され、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする分子に作動可能に連
結されたプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構
造遺伝子（一般的に、約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンに対して上流（す
なわち、５’側）に配置される非転写配列である。プロモーターは、従来、２つ
のクラス（誘導プロモーターおよび構成プロモーター）のうちの１つにグループ
化されている。誘導プロモーターは、培養条件におけるいくらかの変化（例えば
、栄養素の存在または非存在、あるいは温度の変化）に応答して、それらの制御
下でＤＮＡからの転写の増加したレベルを開始する。他方、構成プロモーターは
、連続的な遺伝子産物の産生を開始する；すなわち、遺伝子発現に対してほとん
ど制御しないかまたは全く制御しない。多数のプロモーター（種々の潜在的な宿
主細胞によって認識される）が周知である。適切なプロモーターは、供給源のＤ
ＮＡからプロモーターを制限酵素消化によって取り出し、そして所望のプロモー
ター配列をベクターに挿入することによって、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコー
ドするＤＮＡに作動可能に連結される。ネイティブなＦＧＦＲ−Ｌプロモーター
配列は、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子の増幅および／または発現を指示するために使用
され得る。しかし、ネイティブなプロモーターと比較して多い転写および発現タ
ンパク質のより高い産生を可能とし、そして使用のために選択された宿主細胞系
と適合性である場合には異種プロモーターが好ましい。
原核生物宿主での使用に適切なプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよ
びラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ；トリプトファン（ｔｒ
ｐ）プロモーター系；およびハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモ
ーター）が挙げられる。他の公知の細菌プロモーターもまた適切である。これら
の配列は公開されており、これらの配列により、当業者は、任意の有用な制限部
位を供給するのに必要とされるリンカーまたはアダプターを使用して、所望のＤ
ＮＡ配列にそれらの配列を連結し得る。
酵母宿主での使用に適切なプロモーターはまた、当該分野において周知である
。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿
主細胞での使用に適切なプロモーターは周知であり、限定しないが、ポリオーマ
ウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ２）
、ウシパピローマウイルス、鳥類肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロ
ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましいシミアンウイルス４０（ＳＶ４
０）のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーターが挙げられる。他の適
切な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター（例えば、熱シ
ョックプロモーターおよびアクチンプロモーター）が挙げられる。
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子発現を制御する際に目的となり得るさらなるプロモーター
としては、限定しないが、以下が挙げられる：ＳＶ４０初期プロモータ領域（Ｂ
ｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０
４−１０）；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’側の長末端反復に
含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２ ：７
８７−９７）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら，１９
８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−
４５）；メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，
Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーターのような
原核生物発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７５：３７２７−３１）；また
はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：２１−２５）。組織特異性を示し、そして
トランスジェニック動物において利用されている、以下の動物転写制御領域もま
た関心が高い：膵臓腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓ
ｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９
８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏ
ｌ．５０：３９９−４０９（１９８６）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅ
ｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性なインシュ
リン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：１１
５−２２）；リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒ
ｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−５８；Ａｄａｍｅｓ
ら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，
１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１４３６−４４）；精巣細胞、
乳房細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞において活性なマウス哺乳動物腫瘍ウ
イルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−９５）；
肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，
Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−７６）；肝臓において活性なα
−フェトタンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．
Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，５：１６３９−４８；Ｈａｍｍｅｒら，１９８７，Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性なα１−抗トリプシン遺
伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．
１：１６１−７１）；骨髄性細胞において活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（
Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−４０；Ｋｏｌｌｉ
ａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳の稀突起神経膠細胞にお
いて活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１
９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−１２）；骨格筋において活性なミオシン軽鎖
−２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−８
６）；ならびに視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子制御
領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−７８）。
エンハンサー配列は、より高等な真核生物によって本発明のＦＧＦＲ−Ｌポリ
ペプチドをコードするＤＮＡの転写を増加するように、ベクターに挿入され得る
。エンハンサーは、転写を増加させるためにプロモーターに作用する、通常約１
０〜３００ｂｐの長さのＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは
、比較的方向および位置に非依存性である。これらは、転写ユニットに対して５
’側および３’側に見出された。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエン
ハンサー配列が公知である（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α
−フェトタンパク質およびインシュリン）。しかし、代表的には、ウイルス由来
のエンハンサーが、使用される。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス
初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイル
スエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメ
ントである。エンハンサーは、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子に対して５’位または３’
位でベクターにスプライシングされ得るが、代表的には、プロモーターから５’
側に配置される。
本発明の発現ベクターは、市販のベクターのような開始ベクターから構築され
得る。このようなベクターは、全ての所望な隣接配列を含んでも良いし、含まな
くても良い。本明細書中に記載される隣接配列の１つ以上が予めベクター内に存
在しない場合、これらは、個々に得られ得、ベクターに連結され得る。隣接配列
のそれぞれを得るために使用される方法は、当業者に周知である。
本発明を実行するために好ましいベクターは、細菌宿主細胞、昆虫宿主細胞、
および哺乳動物宿主細胞と適合性のベクターである。このようなベクターとして
は、特に、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３、およびｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇ
ｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、ｐＢＳＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ
Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、ｐＥＴ１５（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）
、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ
Ｊ）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、ｐ
ＥＴＬ（ＢｌｕｅＢａｃＩＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ
公開番号ＷＯ ９０／１４３６３）ならびにｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）が挙げられる。
さらなる適切なベクターとしては、限定しないが、コスミド、プラスミド、ま
たは改変ウイルスが挙げられるが、これらのベクター系は、選択された宿主細胞
と適合性でなければならないことが理解される。このようなベクターとしては、
限定しないが、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー
数ＣｏｌＥｌ−ベースのファージミド、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ ＣＡ）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクロー
ニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、ＴＯＰＯ
ＴＭ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ、ＰＣＲ２．１（登録商標）プ
ラスミド誘導体、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ならびに
バキュロウイルス発現系のような哺乳動物ベクター、酵母ベクターまたはウイル
スベクター（ｐＢａｃＰＡＫプラスミド誘導体、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、ＣＡ）が挙げられる。
ベクターが構築され、そしてＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子
がベクターの適切な部位に挿入された後に、完全なベクターが増幅および／また
はポリペプチド発現に適切な宿主細胞に挿入され得る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドについての発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェ
クション、感染、カルシウムＦＧＦＲ−Ｌｏｒｉｄｅ、エレクトロポレーション
、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン法、
または他の公知の技術のような方法を含む周知の方法によって達成され得る。選
択される方法は、使用される宿主細胞の種類にいくぶん関連する。これらの方法
および他の適切な方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、
上記に記載される。
宿主細胞は、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主
細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、または脊椎動物細胞）であり得る。宿主細
胞は、適切な条件下で培養される場合にＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを合成し、こ
れは、続いて、培養培地から（宿主細胞がそのポリペプチドを培地に分泌する場
合）収集され得るか、または直接そのポリペプチドを産生する宿主細胞から収集
される（そのポリペプチドが分泌されない場合）。適切な宿主細胞の選択は、所
望の発現レベル、活性に望ましいかまたは必要なポリペプチド修飾（例えば、グ
リコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子へと折り畳まれる容
易さなどの種々の因子に依存する。
多くの適切な宿主細胞が当該分野において公知であり、多くが、Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎ
ａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能である。例としては、限定しないが、チャイニー
ズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＨＯ ＤＨＦＲ（−）細胞（Ｕｒｌａｕｂ
ら，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：４
２１６−２０）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３または２９３Ｔ細胞、あるいは
３Ｔ３細胞のような哺乳動物細胞が挙げられる。適切な哺乳動物宿主細胞の選択
および形質転換、培養、増幅、スクリーニング、産物生成、および精製のための
方法が当該分野において公知である。他の適切な哺乳動物細胞株は、サルＣＯＳ
−１およびＣＯＳ−７細胞株、およびＣＶ−１細胞株である。さらなる例示的な
哺乳動物宿主細胞としては、霊長動物細胞株およびげっ歯類細胞株（形質転換細
胞株を含む）が挙げられる。正常な二倍体細胞、初代組織のインビトロ培養物か
ら誘導される細胞株、ならびに初代外植片もまた適切である。候補細胞は、選択
遺伝子を遺伝子型的に欠失し得るか、または優性に作用する選択遺伝子を含み得
る。他の適切な哺乳動物細胞株としては、限定しないが、マウス神経芽細胞腫Ｎ
２Ａ細胞、ＨｅＬａ、マウスＬ−９２９細胞、Ｓｗｉｓｓから誘導された３Ｔ３
株、Ｂａｌｂ−ｃまたはＮＩＨマウス、ＢＨＫまたはＨａｋハムスター細胞株が
挙げられる。これらの細胞株のそれぞれは、タンパク質発現に関する分野の当業
者にとって公知であり入手可能である。
同様に、本発明に適切な宿主細胞として有用なのは細菌細胞である。例えば、
Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、ＨＢ１０１、ＤＨ５α、ＤＨ１０、およびＭＣ１０６１
）の種々の菌株は、生物工学の分野において宿主細胞として周知である。Ｂ．ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、他のＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの種々の菌株もまた、本方
法において使用され得る。
当業者に公知の酵母細胞の多くの菌株はまた、本発明のポリペプチドの発現の
ための宿主細胞として利用可能である。好ましい酵母細胞としては、例えば、Ｓ
ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅおよびＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔ
ｏｒｉｓが挙げられる。
さらに、望ましい場合には、昆虫細胞系が、本発明の方法において利用され得
る。このような系は、例えば、Ｋｉｔｔｓら，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅｓ，１４：８１０−１７；Ｌｕｃｋｌｏｗ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ
．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４：５６４−７２；およびＬｕｃｋｌｏｗら，１９９
３，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：４５６６−７９に記載される。好ましい昆虫細胞
は、Ｓｆ−９およびＨｉ５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）である。
グリコシル化ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを発現するために、トランスジェニッ
ク動物がまた使用され得る。例えば、トランスジェニック乳汁産生動物（例えば
、雌ウシまたはヤギ）を使用し、本発明のグルコシル化ポリペプチドを動物の乳
汁中に得ることができる。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生するために、植物も
また使用し得るが、一般的に、植物において生じるグリコシル化は、哺乳動物細
胞において産生されるものとは異なり、ヒト治療の用途に適切ではないグリコシ
ル化産物を生じ得る。
（ポリペプチド産生）
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標
準的な培地を使用して培養され得る。この培地は通常、細胞の増殖および生存に
必要な全ての栄養素を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を培養するための適切な培地とし
ては、例えば、Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）および／またはＴｅｒｒｉｆｉ
ｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）が挙げられる。真核生物細胞を培養するための適切な培
地としては、Ｒｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ
ｅ ｍｅｄｉｕｍ １６４０（ＲＰＭＩ １６４０）、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓ
ｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）および／またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）が挙げられ、これら
の全ては、培養される特定の細胞株に必要とされるように血清および／または増
殖因子を補充され得る。昆虫培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イ
ーストレート（ｙｅａｔｏｌａｔｅ）、ラクトアルブミン加水分解産物、および
／または胎仔ウシ血清を補充したグレース培地である。
代表的に、トランスフェクトされた細胞または形質転換された細胞の選択的な
増殖に有用な抗生物質または他の化合物が、培地に補充物質として添加される。
使用される化合物は、宿主細胞が形質転換されるプラスミドに存在する選択マー
カーエレメントによって指示される。例えば、選択マーカーエレメントがカナマ
イシン耐性である場合、培養倍地に加えられる化合物は、カナマイシンである。
選択的増殖のための他の化合物としては、アンピシリン、テトラサイクリン、お
よびネオマイシンが挙げられる。
宿主細胞によって産生されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの量は、当該分野にお
いて公知の標準的な方法を使用して評価され得る。このような方法としては、限
定しないが、ウェスタンブロット分析、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動、非変性ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分離、免疫
沈降、および／またはＤＮＡ結合ゲルシフトアッセイのような活性アッセイが挙
げられる。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが宿主細胞から分泌されるように設計される場合、
ポリペプチドの大部分は、細胞培養培地中で見出され得る。しかし、ＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドが宿主細胞から分泌されない場合、細胞質および／または核（真
核宿主細胞について）に、あるいは、細胞質ゾル（グラム陰性細菌宿主細胞につ
いて）に存在する。
宿主細胞細胞質および／または核（真核生物宿主細胞について）に位置するか
または細胞質ゾル（細菌宿主細胞について）に位置するＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドについて、細胞内物質（グラム陰性細菌についての封入体を含む）は、当業者
に公知の任意の標準的な技術を使用して宿主細胞から抽出され得る。例えば、宿
主細胞は、フレンチプレス、ホモジネート化、および／または超音波処理、続く
遠心分離によって、ペリプラズム／細胞質の内容物を放出するように溶解され得
る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが細胞質ゾル内に封入体を形成した場合、この封入
体は、しばしば、細胞内膜および／または細胞外膜に結合され得、従って、主に
、遠心分離後のペレット材料において見出される。次いで、ペレット材料は、極
端なｐＨで、あるいはジチオトレイトールのような還元剤の存在下アルカリ性の
ｐＨで、またはトリスカルボキシエチルホスフィンの存在下酸性のｐＨで、界面
活性剤、グアニジン、グアニジン誘導体、尿素、または尿素誘導体のようなカオ
トロピック剤で処理されて、封入体を放出させ、分断させ、そして溶解させ得る
。次いで、溶解されたＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、ゲル電気泳動、免疫沈降な
どを使用して分析され得る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを単離することが望まし
い場合、単離は、本明細書中およびＭａｒｓｔｏｎら，１９９０，Ｍｅｔｈ．Ｅ
ｎｚ．，１８２：２６４−７５に記載される方法のような標準的な方法を使用し
て達成され得る。
いくつかの場合、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、単離の際に生物学的に活性で
なくても良い。ポリペプチドをその三次構造に「再折り畳み」または変換し、そ
してジスルフィド結合を生成するための種々の方法を使用して、生物学的活性を
回複し得る。このような方法は、溶解されたポリペプチドを、一定のｐＨ（通常
は、７より上）および特定の濃度のカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）の
存在に曝露する工程を包含する。カオトロピック剤の選択は、封入体溶解に使用
される選択肢に非常に類似するが、通常、カオトロピック剤は低い濃度で使用さ
れ、溶解に使用されるカオトロピック剤と必ずしも同一ではない。多くの場合、
再折り畳み／酸化溶液はまた、還元剤、または特定の比の還元剤およびその酸化
形態を含んで、特定の酸化還元電位を生成し、タンパク質のシステイン架橋の形
成を生じるジスルフィドシャフリングを可能にする。通常使用される酸化還元対
のいくつかとしては、システイン／シスタミン、グルタチオン（ＧＳＨ）／ジチ
オビスＧＳＨ、塩化銅ＦＧＦＲ−Ｌｏｒｉｄｅ、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）
／ジチアンＤＴＴ、および２−２−メルカプトエタノール（ｂＭＥ）／ジチオ−
ｂ（ＭＥ）が挙げられる。多くの場合において、共溶媒が、再折り畳みの効率を
増加するのに使用され得るかまたは必要とされ得、この目的のために使用される
より一般的な試薬としては、グリセロール、種々の分子量のポリエチレングリコ
ール、アルギニンなどが挙げられる。
封入体がＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現において有意な程度まで形成されな
い場合、ポリペプチドは、主に、細胞ホモジネートの遠心分離後の上清中に見出
される。ポリペプチドは、さらに、本明細書中に記載されるような方法を使用し
て上清から単離され得る。
溶液からのＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの精製は、種々の技術を使用して達成さ
れ得る。ポリペプチドが、ヘキサヒスチジン（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド／ヘキ
サＨｉｓ）のようなタグまたは他の小さなペプチド（例えば、ＦＬＡＧ（Ｅａｓ
ｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ Ｃｏ．，Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）またはｍｙｃ（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））をそのカルボキシル末端また
はアミノ末端のいずれかにおいて含むように合成された場合、カラムマトリクス
がタグに対して高い親和性を有するアフィニティーカラムに溶液を通すことによ
って一工程で精製され得る。
例えば、ポリヒスチジンは、ニッケルに対して大きな親和性および特異性を有
して結合する。従って、ニッケルのアフィニティーカラム（例えば、Ｑｉａｇｅ
ｎ（登録商標）ニッケルカラム）は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド／ポリＨｉｓの
精製のために使用され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉ
ｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ § １０．１１．８（Ａｕｓｕｂｅ
ｌら編，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ． ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ
ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９３）を参照のこと。
さらに、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを特異的に
認識し得、そして結合し得るモノクローナル抗体の使用によって精製され得る。
精製のための他の適切な手段はとしては、限定しないが、アフィニティークロ
マトグラフィー、免疫親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィ
ー、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｉｅｖｅ
ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、ＨＰＬＣ、電気泳動（ネイティブゲル電気
泳動を含む）、続くゲル溶出、および分取用等電点電気泳動（「Ｉｓｏｐｒｉｍ
ｅ」ｍａｃｈｉｎｅ／ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｈｏｅｆｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉ
ｃ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）が挙げられる。いくつかの場合におい
て、２つ以上の精製技術を、増加した純度を達成するために組み合わせ得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドはまた、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら，１９６３，Ｊ．
Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｈｏｕｇｈｔｅｎら，１９８５，Ｐ
ｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：５１３２；ならびに、Ｓ
ｔｅｗａｒｔおよびＹｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓ
ｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．１９８４）に記載
されるような当該分野で公知の技術を使用する、化学合成法（例えば、固相ペプ
チド合成）によって調製され得る。このようなポリペプチドは、アミノ末端にメ
チオニンを有するかまたは有さずに合成され得る。化学的に合成されたＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドは、これらの参考文献に記載される方法を使用して酸化されて
、ジスルフィド結合を形成し得る。化学的に合成されたＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドは、組換え的に産生されるかまたは天然の供給源から精製された対応のＦＧＦ
Ｒ−Ｌポリペプチドに匹敵する生物学的活性を有すると期待され、従って、組換
えまたは天然のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと相互交換可能に使用され得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを得る別の手段は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが天
然に見出される供給源の組織および／または流体のような生物学的サンプルから
の精製による。このような精製は、本明細書中に記載されるようなタンパク質精
製のための方法を使用して行われ得る。精製の間、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの
存在が、例えば、組換え的に産生されたＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドまたはそのペ
プチドフラグメントに対して調製された抗体を使用してモニターされ得る。
核酸およびポリペプチドを産生するための多くのさらなる方法は、当該分野に
おいて公知であり、この方法は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに対して特異性を有
するポリペプチドを産生するために使用され得る。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓら，
１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２２
９７−３０３を参照のこと。これは、ｍＲＮＡとそのコードされるペプチドとの
間の融合タンパク質の産生を記載する。Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９９，Ｃｕｒｒ．
Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ． ３：２６８−７３もまた参照のこと。さらに
、米国特許第５，８２４，４６９号は、特定の生物学的機能を実行し得るオリゴ
ヌクレオチドを得るための方法を記載する。この手順は、異種プールのオリゴヌ
クレオチドを生成する工程を包含し、この異種プールのオリゴヌクレオチドはそ
れぞれが、５’ランダム化配列、中央部の予備選択配列、および３’ランダム化
配列を有する。得られる異種プールは、所望の生物学的活性を示さない細胞の集
団に導入される。次いで、細胞の亜集団を、予め決定された生物学的機能を示す
ものについてスクリーニングする。その亜集団から、所望の生物学的機能を実行
し得るオリゴヌクレオチドが単離される。
米国特許第５，７６３，１９２号；同第５，８１４，４７６号；同第５，７２
３，３２３号；および同第５，８１７，４８３号は、ペプチドまたはポリペプチ
ドを産生するためのプロセスを記載する。これは、確率論的な遺伝子またはその
フラグメントを産生し、次いで、その確率論的な遺伝子によってコードされた１
以上のタンパク質を産生する宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって
達成される。次いで、この宿主は、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプ
チドを産生する、これらのクローンを同定するためにスクリーニングされる。
ペプチドまたはポリペプチドの産生するための別の方法は、Ａｔｈｅｒｓｙｓ
，Ｉｎｃ．によって出願されたＰＣＴ／ＵＳ９８／２００９４（ＷＯ９９／１５
６５０に記載される。これは、「Ｒａｎｄｏｍ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」（
ＲＡＧＥ−ＧＤ）として知られており、このプロセスは、インサイチュ組換え方
法によって、内因性遺伝子の発現または遺伝子の過剰発現の活性化を含む。例え
ば、内因性遺伝子の発現は、非相同性組換えまたは異常な組換えによって、遺伝
子の発現を活性化し得る標的細胞中に、調節配列を組み込むことによって、活性
化または増加される。この標的ＤＮＡは、まず、照射に供せられ、そして遺伝子
プロモーターが挿入される。このプロモーターは、遺伝子の前方に最終的に配置
され、遺伝子の転写を開始する。これは、所望のペプチドまたはポリペプチドの
発現を引き起こす。
これらの方法はまた、包括的なＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現ライブラリーを
作製するために使用され得、これは、続いて、種々のアッセイ（例えば、生化学
的アッセイ、細胞アッセイおよび生物全体のアッセイ（例えば、植物、マウスな
ど））において、ハイスループット表現型スクリーニングのために使用され得る
ことが理解される。
（合成）
本明細書中に記載される核酸およびポリペプチド分子は、組換えおよび他の手
段によって産生され得ることが、当業者によって理解される。
（選択的結合因子）
用語「選択的結合因子」は、１以上のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに対して特異
性を有する分子をいう。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体
、ポリペプチド、ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切
な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の
例示的なＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド選択的結合因子は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドの特定の部分を結合し得、これにより、ポリペプチドのＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドレセプターへの結合を阻害する。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと結合する抗体および抗体フラグメントのような選
択的結合因子は、本発明の範囲内である。この抗体は、単一特異的なポリクロー
ナルを含むポリクローナル；モノクローナル（ＭＡｂ）；組換え；キメラ；ヒト
化（例えば、ＣＤＲ移植化）；ヒト；単鎖；および／または二特異的；ならびに
フラグメント；改変体；またはそれらの誘導体であり得る。抗体フラグメントと
しては、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのエピトープに結合する抗体の部分を含む。
このようなフラグメントの例としては、全長抗体の酵素的切断によって産生され
たＦａｂおよびＦ（ａｂ’）フラグメントが挙げられる。他の結合フラグメント
としては、組換えＤＮＡ技術（例えば、抗体可変領域をコードする核酸配列を含
む、組換えプラスミドの発現）によって産生されたフラグメントが挙げられる。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに指向されたポリクローナル抗体は、一般に、ＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドおよびアジュバンドの複数回の皮下注射または腹腔内注射
によって動物（例えば、ウサギまたはマウス）において産生される。ＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドをキャリアタンパク質に結合させることは有用であり得る。この
キャリアタンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン、血清、アルブミン
、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターのように、免疫
される種において免疫原性である。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応
答を増強させるために使用される。免疫後、この動物は採血され、そして血清を
、抗ＦＧＦＲ−Ｌ抗体力価についてアッセイする。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに指向されたモノクローナル抗体は、培養中の継代
細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の方法を使用して産生される。モノ
クローナル抗体を調製するために適切な方法の例として、Ｋｏｈｌｅｒら、１９
７５、Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−９７のハイブリドーマ法、およびヒトＢ
細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒ、１９８４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３
：３００１；Ｂｒｏｄｅｕｒら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ｓ ５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８７））が挙げ
られる。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと反応性のモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞株もまた、本発明によって提供される。
本発明のモノクローナル抗体は、治療剤として使用するために、改変され得る
。１つの実施形態は、「キメラ」抗体であり、この抗体において重鎖（Ｈ）およ
び／または軽鎖（Ｌ）の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラ
スもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相
同性であり、一方で、この鎖の残りの部分は、別の種に由来するか、または別の
抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応の配列と同一である
か、または相同性である。抗体のフラグメントが所望の生物学的活性を示す限り
、このような抗体のフラグメントも含まれる。米国特許第４，８１６，５６７号
；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８
１：６８５１−５５を参照のこと。
別の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、「ヒト化」抗体であ
る。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。米国特許第
５，５８５，０８９号および同第５，６９３，７６２号を参照のこと。一般に、
ヒト化した抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１以上のアミノ酸
残基有する。ヒト化は、例えば、当該分野（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕ
ｒｅ ３２１：５２２−２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ
３３２：３２３−２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２３９：１５３４−３６）で記載される方法を使用して、げっ歯類の相補性決定
領域（ＣＤＲ）の少なくとも一部をヒトの抗体の対応する領域に対して置換する
ことによって、実施され得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと結合するヒト抗体もまた、本発明によって包含さ
れる。内因性の免疫グロブリンの産物の非存在下で、ヒト抗体のレパートリーを
産生し得る、トランスジェニック動物（例えば、マウス）を使用して、このよう
な抗体は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗原（すなわち、少なくとも６個の連続す
るアミノ酸を有する）を用いて免疫することによって産生され、必要に応じて、
キャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，１９９３，Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．９０：２５５１−５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ
ら，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５５−５８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ
ら，１９９３，Ｙｅａｒ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ．７：３３を参照のこと。１つの
方法において、このようなトランスジェニック動物は、本明細書中の重鎖および
軽鎖免疫グロブリン鎖をコードする内因性遺伝子座を無能にし、そしてヒトの重
鎖および軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座をそのゲノムに挿入することによ
って産生される。次いで、部分的に改変された動物（この動物は、完全には補完
されていない改変を有する）は、所望の免疫系の改変の全てを有する動物を得る
ために交雑される。免疫原が投与される場合、これらのトランスジェニック動物
が、ヒト（例えば、マウスではない）アミノ酸配列（このアミノ酸配列は、これ
らの抗原に対して免疫特異性である可変領域を含む）を有する抗体を産生する。
ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８および同ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６
９２６を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号、ＰＣ
Ｔ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／２４５および同ＰＣＴ／ＧＢ８９／０１２０７、
ならびに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号および同第５４６０７３Ａ１号に記載さ
れる。ヒト抗体はまた、宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現または本明細書中に
記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
代替の実施形態において、ヒト抗体はまた、ファージディスプレイライブラリ
から産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．
２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５
８１）。これらのプロセスは、糸状バクテリオファージ表面上の抗体レパートリ
ーの提示を介した免疫選択、そして選択した抗原へのこれらの結合によるファー
ジの引き続く選択を模倣する。このような技術の１つは、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ
／ＵＳ９８／１７３６４に記載されており、これには、このようなアプローチを
使用する、ＭＰＬレセプターおよびｍｓｋレセプターに対して高い親和性の抗体
および機能的なアゴニスト抗体の単離が記載される。
キメラ抗体、ＣＤＲ移植抗体、およびヒト化抗体は、代表的には組換え方法に
よって産生される。抗体をコードする核酸は、宿主細胞中に導入され、そして本
明細書中に記載される材料および手順を使用して発現される。好ましい実施形態
において、この抗体は、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）中で産生され
る。モノクローナル（例えば、ヒト）抗体は、本明細書中に記載されるように、
宿主細胞中での組換えＤＮＡの発現またはハイブリドーマ細胞中での発現によっ
て産生され得る。
本発明の抗ＦＧＦＲ−Ｌ抗体は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの検出および定量
のための任意の公知のアッセイ方法（例えば、競合結合アッセイ、直接的および
間接的なサンドイッチアッセイ、および免疫沈降アッセイ）において使用され得
る（Ｓｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａ
ｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４７−１５８（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎ
ｃ．，１９８７））。これらの抗体は、使用されるアッセイ方法に適切な親和性
でＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと結合する。
診断的適用のために、特定の実施形態において、抗ＦＧＦＲ−Ｌ抗体は、検出
可能な部分で標識され得る。この検出可能な部分は、直接的または間接的のいず
れかで、検出可能なシグナルを産生し得る任意の部分であり得る。例えば、検出
可能な部分は、放射性同位体（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２５
Ｉ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、または６７Ｇａ）；蛍光化合物または化学発光化合
物（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、もしくはルシフ
ェリン）、または酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、もしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ）であり得る（Ｂａｙｅｒら，１９９
０，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．１８４：１３８−６３）。
競合結合アッセイは、標識した標準（例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド、ま
たはその免疫学的に反応性の部分）の能力に依存し、限定された量の抗ＦＧＦＲ
−Ｌ抗体との結合に関して、試験サンプル分析物（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド）
と競合する。試験サンプル中のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの量は、抗体と結合す
る標準の量と反比例する。結合する標準の量を決定するのを容易にするために、
これらの抗体は、代表的には競合前または競合後に不溶化され、その結果これら
の抗体と結合する標準および分析物は、結合しないままの標準および分析物から
都合よく分離され得る。
サンドイッチアッセイは、代表的には２つの抗体の使用に関し、各々の抗体は
、検出および／または定量されるべきタンパク質の異なる免疫原性部分またはエ
ピトープに結合し得る。サンドイッチアッセイにおいて、この試験サンプル分析
物は、代表的には固体支持体上に固定される第１抗体によって結合され、その後
、第２抗体が、この分析物に結合し、不溶性の３部分複合体を形成する。例えば
、米国特許第４，３７６，１１０号を参照のこと。第２抗体自体は、検出可能な
部分で標識され得るか（直接的なサンドイッチアッセイ）、または検出可能な部
分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る（間接的なサンド
イッチアッセイ）。例えば、サンドイッチアッセイの１つの型は、酵素結合イム
ノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）（この場合、検出可能な部分は、酵素であ
る）である。
抗ＦＧＦＲ−Ｌ抗体を含む、選択的結合因子はまた、インビボ画像化のために
有用である。検出可能な部分で標識した抗体は、動物に、好ましくは、血流に投
与され得、宿主中における標識した抗体の存在および位置がアッセイされる。こ
の抗体は、核磁気共鳴、放射線学、または当該分野で公知の他の検出手段のいず
れかによって、動物中で検出可能である任意の部分で標識され得る。
抗体を含む、本発明の選択的結合因子は、治療剤として使用され得る。これら
の治療剤は、一般に、アゴニストまたはアンタゴニストであり、これらはそれぞ
れ、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を、増強または
減少させる。１つの実施形態において、本発明のアンタゴニスト抗体は、ＦＧＦ
Ｒ−Ｌポリペプチドに特異的に結合し得、そしてインビボまたはインビトロでＦ
ＧＦＲ−Ｌポリペプチドの機能活性を阻害または排除し得る抗体またはその結合
フラグメントである。好ましい実施形態において、選択的結合因子（例えば、ア
ンタゴニスト抗体）は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの機能活性を、少なくとも約
５０％、および好ましくは、少なくとも約８０％阻害する。別の実施形態におい
て、選択的結合因子は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナー（リガンドま
たはレセプター）と相互作用し得、これにより、インビトロまたはインビボにお
いてＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性を阻害または排除する抗ＦＧＦＲ−Ｌポリペ
プチドであり得る。アゴニストおよびアンタゴニスト抗ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ド抗体を含む、選択的結合因子は、当該分野で周知であるスクリーニングアッセ
イによって同定される。
本発明はまた、ＦＧＦＲ−Ｌ選択的結合因子（例えば、抗体）および生物学的
サンプル中でＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドレベルを検出するために有用である他の
試薬を含むキットに関する。このような試薬として、検出可能な標識、ブロッキ
ング血清（ｂｌｏｃｋｉｎｇ ｓｅｒｕｍ）、ポジティブおよびネガティブコン
トロールサンプル、ならびに検出試薬が挙げられ得る。
（マイクロアレイ）
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、本発明に従って利用され得ることが、理解され
る。ＤＮＡマイクロアレイは、固体支持体（例えば、ガラス）上に配置された核
酸の小型高密度アレイである。このアレイ内の各細胞またはエレメントは、相補
的核酸配列（例えば、ｍＲＮＡ）とハイブリダイゼーションするための標識とし
て作用する、単一の核酸種の複数のコピーを含む。ＤＮＡマイクロアレイ技術を
使用する発現プロファイリングにおいて、ｍＲＮＡは、最初に細胞サンプルまた
は組織サンプルから抽出され、次いで、酵素的に蛍光標識されたｃＤＮＡへと変
換される。この材料は、マイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合の
ｃＤＮＡは、洗浄により除去される。次いで、このアレイ上に提示された個々の
遺伝子の発現は、各標識核酸分子に特異的に結合された標識ｃＤＮＡの量を定量
することによって視覚化される。この方法において、数千の遺伝子の発現が、生
物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットの並行様式で定量され得る。
このハイスループット発現プロファイリングは、本発明のＦＧＦＲ−Ｌ分子に
関連して広範な適用を有し、これには、以下が挙げられるが、これに限定されな
い：治療のための標的としてのＦＧＦＲ−Ｌ疾患関連遺伝子の同定および確認；
関連するＦＧＦＲ−Ｌ分子およびそのインヒビターの分子毒性；集団の層別化お
よび臨床試験のための代替マーカーの生成；およびハイスループットスクリーニ
ングにおいて、選択化合物の同定を補助することによって、関連するＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチド低分子薬物の発見を高めること。
（化学的誘導体）
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中に記載
された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ド誘導体は、このポリペプチドに天然に結合した分子の型または位置のいずれか
において異なる様式で改変される。誘導体は、１以上の天然に結合した化学的な
基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号２もしくは配列番号５ま
たは他のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチ
ドは、１以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択された
ポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、
水性環境（例えば、生理学的な環境）下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適
切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、目的産物の調製物の治療学的用
途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
このポリマーの各々は、任意の分子量を有し得、そして分枝または非分枝であ
り得る。このポリマーの各々は、代表的に、約２ｋＤａと約１００ｋＤａとの間
の平均分子量を有する（この用語「約（およそ）」は、水溶性ポリマーの調製の
際に、いくつかの分子が示された分子量より多く、いくつかは少ない分子量を有
することを示す）。各ポリマーの平均分子量は、好ましくは、約５ｋＤａと約５
０ｋＤａの間、より好ましくは、約１２ｋＤａと約４０ｋＤａとの間、そして最
も好ましくは、約２０ｋＤａと約３５Ｄａとの間である。
適切な水溶性ポリマーまたはその混合物としては、以下が挙げられるが、これ
らに限定されない：Ｎ−結合型またはＯ−結合型炭水化物、糖、ホスフェート、
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（これは、モノ−（Ｃ１−Ｃ１０）、アルコ
キシ−、またはアリールオキシ−ポリエチレングリコールを含むタンパク質を誘
導体化するために使用されたＰＥＧの形態を含む）、モノメトキシ−ポリエチレ
ングリコール、デキストラン（例えば、約６ｋＤの低分子量デキストラン）、セ
ルロース、または他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリド
ン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピ
レンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（
例えば、グリセロール）、およびポリビニルアルコール。共有結合したＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドマルチマーを調製するために使用され得る、二官能性架橋分子
もまた、本発明に包括される。
一般に、化学的誘導体化は、活性化したポリマー分子とタンパク質を反応させ
るために使用される任意の適切な条件下で、実施され得る。ポリペプチドの化学
的誘導体を調製するための方法は、一般的に以下の工程を包含する：（ａ）配列
番号２もしくは配列番号５または他のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのいずれかのア
ミノ酸配列を含むポリペプチドが、１以上のポリマー分子に結合する条件下で、
活性化したポリマー分子（例えば、ポリマー分子の反応性エステルまたはアルデ
ヒド誘導体）とポリペプチドを反応させる工程、ならびに（ｂ）反応生成物を得
る工程。最適の反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に基づいて決定
される。例えば、タンパク質に対するポリマー分子の比が大きくなるほど、結合
したポリマー分子の割合も大きくなる。１つの実施形態において、ＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチド誘導体は、アミノ末端の単一ポリマー分子部分を有し得る。例えば
、米国特許第５，２３４，７８４号を参照のこと。
ポリペプチドのペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、当該分野で公知の任意の
ペグ化反応を使用して特異的に実施され得る。このような反応は、例えば、以下
の参考文献に記載されている：Ｆｒａｎｃｉｓら，１９９２，Ｆｏｃｕｓ ｏｎ
Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３：４−１０；欧州特許第０１５４３１６号
および同第０４０１３８４号；ならびに米国特許第４，１７９，３３７号。例え
ば、ペグ化は、本明細書中に記載されるように、反応性ポリエチレングリコール
分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル
化反応を介して実施され得る。アシル化反応のために、選択されたポリマーは、
単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択
されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アル
デヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（これは、水
溶性である）か、またはモノＣ１−Ｃ１０アルコキシもしくはそのアリールオキ
シ誘導体である（米国特許第５，２５２，７１４号を参照のこと）。
別の実施形態において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、ビオチンに化学的に結
合され得る。次いで、ビオチン／ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド分子は、アビジンに
結合され得、４価のアビジン／ビオチン／ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド分子を生じ
る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドはまた、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはト
リニトロフェノール（ＴＮＰ）に共有結合され得、そして生じる結合体は、抗Ｄ
ＮＰまたは抗ＴＮＰ−ＩｇＭで沈殿され、１０価を有する１０量体の結合体を形
成する。
一般的に、本願発明のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド誘導体の投与によって、軽減
され得るかまたは調節され得る状態としては、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドについ
て本明細書中に記載される状態が挙げられる。しかし、本明細書中で開示される
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド誘導体は、さらなる活性、増強されたかまたは減少し
た生物学的活性あるいは他の特性（例えば、非誘導化分子と比較して増加または
減少した半減期）を有し得る。
（遺伝子操作した非ヒト動物）
さらに、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、また
は他の家畜のような非ヒト動物が本発明の範囲内に含まれ、ここで、ネイティブ
なＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子は破壊（すなわち「ノックアウ
ト」）され、その結果ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現レベルは、有意に減少す
るか、または完全に破壊される。このような動物は、米国特許第５，５５７，０
３２号に記載されるような技術および方法を使用して作製され得る。
本発明は、マウス、ラット、または他のげっ歯類；ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ま
たは他の家畜のような非ヒト動物をさらに含み、この動物のＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子
のネイティブな形態または異種ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子のいずれかが、この動物によ
って過剰発現され、これによって、「トランスジェニック」動物を作製する。こ
のようなトランスジェニック動物は、米国特許第５，４８９，７４３号およびＰ
ＣＴ公開番号ＷＯ９４／２８１２２号に記載されるような周知の方法を使用して
調製され得る。
本発明は、非ヒト動物をさらに含み、ここで、本発明の１以上のＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドのプロモーターは、（例えば、相同組換え方法を使用することによ
って）活性化されるか、または不活化されるかのいずれかであり、１以上のネイ
ティブなＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現のレベルを改変する。
これらの非ヒト動物は、薬物候補スクリーニングのために使用され得る。この
ようなスクリーニングにおいて、動物での薬物候補の影響が測定され得る。例え
ば、薬物候補は、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。特定の
実施形態において、産生されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの量は、動物を薬物候
補に曝露した後に測定され得る。さらに、特定の実施形態において、動物での薬
物候補の実際の影響を検出し得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現により、疾
患状態または病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連付けられ得る。こ
のような場合において、遺伝子の発現を減少させるための薬物候補の能力または
病理学的状態を予防または阻害するその能力を試験し得る。別の例において、ポ
リペプチドのフラグメントのような、特定の代謝産物の産生により、疾患状態ま
たは病理学的状態を生じ得るか、またはそれらに関連付けられ得る。このような
場合において、このような代謝産物の産生を減少させるための薬物候補の能力ま
たは病理学的状態を予防または阻害するその能力を試験し得る。
（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性の他の修飾因子についてのアッセイ）
いくつかの状況において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの活性の修飾因子である
分子（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）を同定することが所望され得
る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを調節する天然または合成分子は、本明細書中に
記載されるように、１以上のスクリーニングアッセイを使用して同定され得る。
このような分子は、エキソビボ様式またはインビボ様式のいずれかで、注射、ま
たは経口送達、移植デバイスなどによって投与され得る。
「試験分子」とは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの活性を調節する（すなわち、
増加または減少させる）能力について評価される分子を言う。最も一般的に、試
験分子は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと直接的に相互作用する。しかし、試験分
子はまた、例えば、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子発現に影響を与えることによってか、ま
たはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナー（例えば、レセプターまたはリガ
ンド）に結合することによって、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性を間接的に調節
し得るということもまた意図される。１つの実施形態において、試験分子は、少
なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは、約１０−８Ｍ、より好ましくは、約１０−
９Ｍ、そしてさらにより好ましくは約１０−１０Ｍの親和性定数（ａｆｆｉｎｉ
ｔｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ）でＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと結合する。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと相互作用する化合物を同定するための方法は、本
発明によって包含される。特定の実施形態において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
は、試験分子とＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドとの相互作用を可能とする条件下で、
試験分子と共にインキュベートされ、そして相互作用の程度が測定される。試験
分子は、実質的に精製された形態または粗製の混合物中でスクリーニングされ得
る。
特定の実施形態において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドアゴニストまたはアンタ
ゴニストは、タンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または低分子量の分子で
あり得、これは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと相互作用して、その活性を調節す
る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現を調節する分子は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドをコードする核酸と相補的である核酸分子、またはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドの発現を指示または制御する核酸配列に対して相補的である核酸分子、および
発現のアンチセンス制御因子として作用する核酸分子を含む。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと相互作用する場合として一旦、試験化合物が同定
されると、この分子は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性を増加または減少させる
その能力についてさらに評価され得る。試験分子とＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと
の相互作用の測定は、いくつかの形式で実施され得、これには、細胞ベースの結
合アッセイ、膜結合アッセイ、液相アッセイ、およびイムノアッセイが挙げられ
る。一般に、試験分子は、特定の期間、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと共にインキ
ュベートされ、そしてＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド活性が、生物学的活性を測定す
るために１以上のアッセイによって決定される。
試験分子とＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドとの相互作用はまた、イムノアッセイに
おいて、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用して直接的にアッセイ
され得る。あるいは、本明細書中に記載されるようなエピトープタグを含むＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドの改変形態は、溶液およびイムノアッセイ中で使用され得
る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが、結合パートナー（例えば、レセプターまたはリ
ガンド）との相互作用を介して、生物学的活性を示す場合において、種々のイン
ビトロアッセイが、対応する結合パートナー（例えば、選択的結合因子、レセプ
ター、またはリガンド）へのＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの結合を測定するために
使用され得る。これらのアッセイは、結合パートナーに対するＦＧＦＲ−Ｌポリ
ペプチドの結合の速度および／または程度を増加または減少させるその能力につ
いて、試験分子をスクリーニングするために使用され得る。１つのアッセイにお
いて、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、マイクロタイタープレートのウェル中で固
定される。次いで、放射標識したＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナー（例
えば、ヨウ素化したＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナー）および試験化合
物は、このウェルに、１つずつ（いずれかの順序で）または同時にのいずれかで
添加され得る。インキュベーション後に、このウェルを洗浄し、そしてシンチレ
ーション計数器を使用して、放射活性を計数し、結合パートナーがＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドに結合する程度を決定する。代表的に、分子は、一定の濃度範囲に
わたって試験され、そして試験アッセイの１以上のエレメントを欠く一連のコン
トロールウェルは、結果の評価の正確性のために使用され得る。この方法の代替
は、タンパク質の「位置」を逆にする工程（すなわち、マイクロタイタープレー
トウェルに対してＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーを固定し、試験分子
および放射標識したＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをインキュベートし、そしてＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチド結合の程度を決定する工程）を包含する。例えば、Ｃｕｒ
ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、
第１８章（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｉｎｃ．
ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ １９９５）を参照のこと。
放射性標識に対する代替として、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドまたはその結合パ
ートナーは、ビオチンと結合体化され得、そしてビオチン化されたタンパク質の
存在が、次いで、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）または
アルカリホスファターゼ（ＡＰ））（これらは、比色定量的に検出され得る）に
結合したストレプトアビジンを使用して検出され得るか、またはストレプトアビ
ジンの蛍光タグ化によって検出され得る。ＦＧＦＲ−ＬポリペプチドまたはＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナー（これらは、ビオチンに結合されている）
に対する抗体はまた、ＡＰまたはＨＲＰに連結した酵素連結ストレプトアビジン
との複合体のインキュベーション後に、検出の目的のために使用され得る。
ＦＧＦＲ−ＬポリペプチドまたはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーは
また、アガロースビーズ、アクリルビーズ、または他の型のこのような不活性な
固相基材への付着によって固定され得る。基材−タンパク質複合体は、相補性タ
ンパク質および試験化合物を含む溶液内に配置され得る。インキュベーション後
、これらのビーズは、遠心分離によって沈殿され得、そしてＦＧＦＲ−Ｌポリペ
プチドとその結合パートナーとの間の結合の量が、本明細書中に記載の方法を使
用して評価され得る。あるいは、基材−タンパク質複合体はカラム内に固定化さ
れ得、試験分子および相補性タンパク質はカラムを通過する。次いで、ＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドとその結合パートナーとの間の複合体の形成が、本明細書中に
記載の技術（例えば、放射性標識または抗体結合）のいずれかを使用して評価さ
れ得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合タンパク質とＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パ
ートナーとの間の複合体の形成を増加または減少させる試験分子を同定するため
に有用な別のインビトロアッセイは、表面プラズモン共鳴検出器システム（例え
ば、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗ
ａｙ，ＮＪ））である。ＢＩＡｃｏｒｅシステムは、製造業者によって特定され
るように利用される。このアッセイは、本質的に、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドま
たはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーのいずれかの、デキストランコー
ティングセンサーチップ（これは、検出器に存在する）への共有結合を含む。次
いで、この試験化合物および他の相補性タンパク質が、同時にかまたは連続的に
かのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相
補性タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコーティング側に物理的
に関連付けられる分子量の変化に基づいて評価され得、この分子量の変化は、検
出器システムによって測定される。
いくつかの場合において、２つ以上の試験化合物を一緒に、ＦＧＦＲ−Ｌポリ
ペプチドとＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形成を増
加または減少させるそれらの能力について評価することが所望され得る。これら
の場合において、本明細書中に記載のアッセイは、第一の試験化合物と同時にか
、またはそれに続いてのいずれかで、このようなさらなる試験化合物を添加する
ことによって容易に改変され得る。このアッセイにおける工程の残りは、本明細
書中に記載される。
インビトロアッセイ（例えば、本明細書中に記載されるもの）は、ＦＧＦＲ−
ＬポリペプチドとＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間の複合体の形
成に対する効果について、多数の化合物をスクリーニングするために、有利に使
用され得る。これらのアッセイは、ファージディスプレイ、合成ペプチド、およ
び化学合成ライブラリーにおいて生成された化合物をスクリーニングするために
、自動化され得る。
ＦＧＦＲ−ＬポリペプチドとＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーとの間
の複合体の形成を増加または減少される化合物はまた、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドまたはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーＦのいずれかを発現する細胞
および細胞株を使用して、細胞培養物においてスクリーニングされ得る。細胞お
よび細胞株は、任意の哺乳動物から得られ得るが、好ましくは、ヒト、または他
の霊長類、イヌまたはげっ歯類の供給源由来である。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
の、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーを発現する細胞表面への結合は、
試験分子の存在または非存在下で評価され、そして結合の程度が、例えば、ＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチド結合パートナーに対するビオチン化抗体を使用するフロー
サイトメトリーによって決定され得る。細胞培養アッセイは、本明細書中に記載
されるタンパク質結合アッセイにおいて、陽性であるとスコア付けされる化合物
をさらに評価するために有利に使用され得る。
細胞培養物はまた、薬物候補の影響をスクリーニングするために使用され得る
。例えば、薬物候補は、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の発現を減少または増加させ得る。
特定の実施形態において、生成されるＦＧＦＲ−ＬポリペプチドまたはＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドフラグメントの量は、細胞培養物の薬物候補への曝露の後に測
定され得る。特定の実施形態において、細胞培養物に対する薬物候補の実際の影
響が検出され得る。例えば、特定の遺伝子の過剰発現は、細胞培養物に対する特
定の影響を有し得る。このような場合に、遺伝子の発現を増加または減少させる
薬物候補の能力、または細胞培養物に対する特定の影響を予防または阻害するそ
の能力が試験され得る。他の例において、特定の代謝産物（例えば、ポリペプチ
ドのフラグメントなど）の生成が、疾患または病的状態を引き起こし得るか、ま
たはそれらと関連付けられ得る。このような場合、細胞培養物におけるこのよう
な代謝産物の生成を減少する薬物候補の能力が試験され得る。
（内部移行タンパク質）
ｔａｔタンパク質配列（ＨＩＶ由来）が、タンパク質を細胞内に内部移行させ
るために使用され得る。例えば、Ｆａｌｗｅｌｌら、１９９４、Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：６６４−６８を参照のこと。例え
ば、ＨＩＶ ｔａｔタンパク質の１１アミノ酸の配列（Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ
−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−Ｒ；配列番号９）（「タンパク質形質導入ドメイン」、また
はＴＡＴ ＰＤＴと称される）は、細胞の細胞質膜および核膜を横切る送達を媒
介するとして記載されている。Ｓｃｈｗａｒｚｅら，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２８５：１５６９−７２；およびＮａｇａｈａｒａら，１９９８，Ｎａｔ．Ｍ
ｅｄ．４：１４４９−５２を参照のこと。これらの手順において、ＦＩＴＣ構築
物（ＦＩＴＣ標識Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｒ−Ｋ−Ｋ−Ｒ−Ｒ−Ｑ−Ｒ−Ｒ−
Ｒ；配列番号１０）（これは、腹腔内投与後に組織に貫入する）が調製され、そ
してこのような構築物の細胞への結合が、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）分析に
よって検出される。ｔａｔ−β−ｇａｌ融合タンパク質で処理された細胞は、β
−ｇａｌ活性を示す。注入後、このような構築物の発現は多くの組織（肝臓、腎
臓、肺、心臓および脳組織を含む）において検出され得る。このような構築物は
、細胞に入るために幾分の変性を受け、そしてそれ自体、細胞内への進入後に、
再折り畳みを必要とし得ると考えられる。
従って、ｔａｔタンパク質配列は、所望のポリペプチドを細胞に内部移入させ
るために使用され得ることが理解される。例えば、ｔａｔタンパク質配列を使用
して、ＦＧＦＲ−Ｌアンタゴニスト（例えば、抗ＦＧＦＲ−Ｌ選択的結合因子、
低分子、可溶性レセプター、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ＦＧ
ＦＲ−Ｌ分子の活性を阻害するために、細胞内投与され得る。本明細書中で使用
される場合、用語「ＦＧＦＲ−Ｌ分子」は、本明細書中に記載されるような、Ｆ
ＧＦＲ−Ｌ核酸分子およびＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの両方をいう。所望される
場合には、ＦＧＦＲ−Ｌタンパク質自体もまた、これらの手順を使用して、細胞
に内部投与され得る。Ｓｔｒａｕｓ，１９９９，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：１４
６６−６７をまた参照のこと。
（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを使用する細胞供給源の同定）
本発明の特定の実施形態に従って、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと関連する特定
の細胞型の供給源を決定し得ることが有用であり得る。例えば、適切な治療を選
択する際の補助として疾患または病的状態の起源を決定することが有用であり得
る。特定の実施形態において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする核酸は、
プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリー
ニングすることによって、本明細書中に記載の細胞を同定し得る。他の実施形態
において、抗ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドの存在について試験し得、従って、このような細胞が本明細書
中に記載される型の細胞か否かを決定し得る。
（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド組成物および投与）
治療組成物は、本発明の範囲内にある。このようなＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
薬学的組成物は、治療有効量のＦＧＦＲ−ＬポリペプチドまたはＦＧＦＲ−Ｌ核
酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的または生理学的に受容
可能な処方剤との混合物中に含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の１以上の
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択
された薬学的または生理学的に受容可能な処方剤との混合物中に含み得る。
受容可能な処方材料は、好ましくは、使用される投薬量および濃度で、レシピ
エントに対して非毒性である。
薬学的組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄性、色、等張性
、におい、無菌性、安定性、解離もしくは放出の速度、吸着、または透過を改変
、維持または保存するための処方材料を含み得る。適切な処方材料としては、以
下が挙げられるが、これらに限定されない：アミノ酸（例えば、グリシン、グル
タミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジン）、抗菌剤、抗酸化剤（例え
ば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム（ｓｏｄｉ
ｕｍ ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｓｕｌｆｉｔｅ））、緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭
酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）、バル
ク剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピ
ロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデ
キストリン）、充填剤、単糖類、二糖類、および他の炭水化物（例えば、グルコ
ース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン
、ゼラチン、または免疫グロブリン）、着色剤、香料および希釈剤、乳化剤、親
水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形
成対イオン（例えば、ナトリウム）、保存剤（例えば、塩化ベンズアルコニウム
、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベ
ン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素）、
溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコ
ール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、
界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ＰＥＧ
；ソルビタンエステル；ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０またはポ
リソルベート８０）；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまた
はチロキサポール（ｔｙｌｏｘａｐａｌ））、安定性増強剤（例えば、スクロー
スまたはソルビトール）、張度増強剤（例えば、ハロゲン化アルカリ金属（好ま
しくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）、またはマンニトール、ソルビトー
ル）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または薬学的なアジュバント。Ｒ
ｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ 第
１８版，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍ
ｐａｎｙ １９９０を参照のこと。
最適な薬学的組成物は、当業者によって、例えば、意図される投与経路、送達
形式、および所望の投薬量に依存して決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出を参照のこと。
このような組成物は、ＦＧＦＲ−Ｌ分子の物理的な状態、安定性、インビボ放出
の速度およびインビボクリアランスの速度に影響し得る。
薬学的組成物における主要なビヒクルまたはキャリアは、本質的には、水性ま
たは非水性のいずれかであり得る。例えば、注入のための適切なビヒクルまたは
キャリアは、水、生理食塩水溶液または人工脳脊髄液であり得、これらは、非経
口投与のための組成物において一般的な、他の材料で補充され得る。中性の緩衝
化生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的
なビヒクルである。他の例示的な薬学的組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のＴｒ
ｉｓ緩衝液または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸塩緩衝液を含み、これはさらに、
ソルビトールまたは適切な代用物を含み得る。本発明の１つの実施形態において
、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組
成物を、任意の処方薬剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，前出）と混合することによって、凍結乾燥ケークまた
は水溶液の形態で、保存のために調製され得る。さらに、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チド産物は、スクロースのような適切な賦形剤を使用して凍結乾燥物として処方
され得る。
このＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの薬学的組成物は、非経口送達のために選択さ
れ得る。あるいは、これらの組成物は、吸入または消化管を介する送達（例えば
、経口的）のために選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製
は、当該分野の技術の範囲内にある。
処方成分は、投与の部位に受容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液は、生
理学的ｐＨまたはわずかにより低いｐＨ（典型的に、約５〜約８のｐＨ範囲内）
にこの組成物を維持するために使用される。
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬
学的に受容可能なビヒクル中に所望のＦＧＦＲ−Ｌ分子を含む、発熱物質を含ま
ない非経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。非経口注入のために特に適
切なビヒクルは、滅菌蒸留水であり、ここで、ＦＧＦＲ−Ｌ分子は、滅菌の等張
溶液として処方され、適切に保存される。なお別の調製物としては、所望の薬剤
と、その産物の制御された放出または持続された放出（徐放）を提供する、注射
可能なミクロスフェア、生分解性（ｂｉｏ−ｅｒｏｄｉｂｌｅ）粒子、ポリマー
化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム
のような因子との処方物が挙げられ得、これは、次いで、蓄積注射を介して送達
され得る。ヒアルロン酸もまた使用され得、そしてこれは、循環中の持続時間を
促進する効果を有し得る。所望の分子の導入のための他の適切な手段としては、
移植可能な薬物送達デバイスが挙げられる。
１つの実施形態において、薬学的組成物は、吸入のために処方され得る。例え
ば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、吸入のための乾燥粉末として処方され得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドまたは核酸分子の吸入溶液はまた、エアロゾル送達の
ための噴霧剤と共に処方され得る。なお別の実施形態において、溶液は、噴霧さ
れ得る。肺投与は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２００６９にさらに記載され、こ
れは、化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する。
特定の処方物が、経口投与され得ることもまた意図される。本発明の１つの実
施形態において、このよう様式で投与されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、固体
投薬形態（例えば、錠剤またはカプセル）の調合において慣用的に使用されるキ
ャリアを伴うかまたは伴わず処方され得る。例えば、カプセルは、バイオアベイ
ラビリティーが最大化されそして前全身性分解（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄ
ｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）が最小化される場合、胃腸管内にある時点でその処方物
の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる薬剤が、ＦＧＦＲ−Ｌポリ
ペプチドの吸収を容易にするために含まれ得る。希釈剤、香料、低融点ワックス
、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた使用され得る。
別の薬学的組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、有効
量のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを含み得る。錠剤を滅菌水または別の適切なビヒ
クルに溶解することによって、溶液が、単位用量形態で調製され得る。適切な賦
形剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：不活性な希釈剤（
例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウム、ラクトー
ス、あるいはリン酸カルシウム）；または結合剤（例えば、デンプン、ゼラチン
またはアカシア）；あるいは潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステ
アリン酸またはタルク）。
さらなるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの薬学的組成物は、当業者に明らかであり
、これらには、持続送達処方物または制御送達処方物中にＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドを含む処方物が挙げられる。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（
例えば、リポソームキャリア、生分解性微粒子あるいは多孔性ビーズ）の処方お
よび蓄積注射のための技術もまた、当業者に公知である。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ
９３／００８２９（これは、薬学的組成物の送達のための多孔性ポリマー性微粒
子の制御された放出を記載する）を参照のこと。
徐放性調製物のさらなる例としては、成形品の形態（例えば、フィルムまたは
マイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放性マトリ
クスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７
３，９１９号および欧州特許第０５８４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル
−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら，１９８３，Ｂｉｏｐｏｌ
ｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレ
ート）（Ｌａｎｇｅｒら，１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．
１５：１６７−２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１
２：９８−１０５）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら，前出）また
はポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３９８８号）が挙げら
れ得る。徐放性組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知の
いくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら
，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２：３６８８
−９２；および欧州特許第０３６６７６号、同第０８８０４６号、および同第１
４３９４９号を参照のこと。
インビボ投与のために使用されるＦＧＦＲ−Ｌの薬学的組成物は、代表的に、
滅菌されていなければならない。これは、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成さ
れ得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥お
よび再構成の前後のいずれかで実施され得る。非経口投与のための組成物は、凍
結乾燥された形態または溶液中で保存され得る。さらに、非経口組成物は、一般
に、滅菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能な
ストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアル）内に配置される。
一旦、薬学的組成物が処方されると、それは、滅菌バイアル中に、溶液、懸濁
液、ゲル、エマルジョン、固体としてか、あるいは乾燥粉末または凍結乾燥粉末
として保存され得る。このような処方物は、すぐに使用できる形態または投与の
前に再構成を必要とする形態（例えば、凍結乾燥形態）のいずれかで保存され得
る。
特定の実施形態において、本発明は、単回用量投与単位を生成するためのキッ
トに関する。このキットは、各々、乾燥タンパク質を有する第一の容器および水
性処方物を有する第二の容器の両方を備え得る。単一チャンバおよびマルチチャ
ンバの予め充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよび分散シリンジ（ｌ
ｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を備えるキットもまた、本発明の範囲内に含まれる。
治療的に使用されるＦＧＦＲ−Ｌの薬学的組成物の有効量は、例えば、治療の
内容および目的に依存する。従って、処置のための適切な投薬レベルが、送達さ
れる分子、ＦＧＦＲ−Ｌ分子が使用される指標、投与の経路、ならびに患者のサ
イズ（体重、体表面、または器官のサイズ）および状態（年齢および全身的な健
康状態）に部分的に依存して変化することが、当業者に理解される。従って、臨
床家は、最適な治療効果を得るために、投薬量を滴定（ｔｉｔｅｒ）し得、そし
て投与経路を改変し得る。代表的な投薬量は、上記の因子に依存して、約０．１
μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲にあり得る。他の実施形態において
、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ〜約
１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲にあり得る
。
投薬の頻度は、使用される処方物中でのＦＧＦＲ−Ｌ分子の薬物動態学的パラ
メーターに依存する。典型的に、臨床家は、所望の効果を達成する投薬量に達す
るまで組成物を投与する。従って、組成物は、単回用量として、長期にわたって
２回以上の用量（これは、同じ量の所望の分子を含んでも、含まなくてもよい）
として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する連続的な注入として、
投与され得る。適切な投薬量のさらなる改良は、当業者によって慣用的になされ
、そして当業者によって慣用的に実施される作業の範囲内にある。適切な投薬量
は、適切な用量−応答データの使用を介して確認され得る。
薬学的組成物の投与の経路は、公知の方法に従い、例えば、経口的にか；静脈
内、腹腔内、大脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内または
病巣内の経路による注入を介するか；徐放系によるか；または移植デバイスによ
る。所望される場合、これらの組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか
、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投
与され得る。
あるいは、またはさらに、組成物は、膜、スポンジ、または所望の分子が吸収
されるかまたはカプセル化される他の適切な材料の移植を介して局所的に投与さ
れ得る。移植デバイスが使用される場合、このデバイスは、任意の適切な組織ま
たは器官に移植され得、そして所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラスま
たは連続的な投与を介し得る。
いくつかの場合において、エキソビボ様式において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドの薬学的組成物を使用することが所望され得る。このような例において、患者
から取り出された細胞、組織または器官は、これらの細胞、組織、または器官が
その後患者に移植し戻された後に、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド薬学的組成物に曝
露される。
他の場合において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、本明細書中に記載されるよ
うな方法を使用して遺伝子操作されてＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを発現および分
泌する特定の細胞を移植することによって送達され得る。このような細胞は、動
物またはヒト細胞であり得、そして自己、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）、
または異種間（ｘｅｎｏｇｅｎｅｉｃ）であり得る。必要に応じて、細胞は、不
死化され得る。免疫学的応答の機会を減少するために、細胞は、周囲の組織の浸
潤を回避するようにカプセル化され得る。カプセル化材料は、典型的に、生体適
合性の半透性ポリマーの包囲物または膜であり、これらは、タンパク質産物の放
出を可能にするが、患者の免疫系によるかまたは周囲の組織からの他の有害な因
子による細胞の破壊を防止する。
本明細書中において議論されるように、単離された細胞集団（例えば、幹細胞
、リンパ球、赤血球、軟骨細胞、ニューロンなど）を１つ以上のＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドで処理することが、望ましくあり得る。これは、このポリペプチドが
、細胞膜に対して透過性の形態である場合には、単離された細胞をこのポリペプ
チドに直接曝露することによって達成され得る。
本発明のさらなる実施形態は、治療ポリペプチドのインビトロ産生と、遺伝子
治療または細胞治療による治療ポリペプチドの産生および送達との両方のための
、細胞および方法（例えば、相同組換えおよび／または他の組換え産生方法）に
関する。相同組換えおよび他の組換えの方法を使用して、通常は転写的にサイレ
ントなＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子（すなわち、過少発現される遺伝子）を含む細胞を改
変し得、これによって、治療有効量のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを発現する細胞
を産生し得る。
相同組換えは、転写的に活性な遺伝子における変異を誘導または矯正するよう
に遺伝子を標的化するために元々開発された技術である（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐｔ
ｉ，１９８９，Ｐｒｏｇ．ｉｎ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．＆ Ｍｏｌ．Ｂ
ｉｏｌ．３６：３０１，）。この基本的技術は、特定の変異を、哺乳動物ゲノム
の特定の領域へ導入するための方法として（Ｔｈｏｍａｓら、１９８６，Ｃｅｌ
ｌ，４４：４１９−４２８；ＴｈｏｍａｓおよびＣａｐｅｃｃｈｉ，１９８７，
Ｃｅｌｌ，５１：５０３−５１２；Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，１９８８，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５：８５８３−８５８７）、または欠損
遺伝子内の特定の変異を矯正するための方法として（Ｄｏｅｔｓｃｈｍａｎら，
Ｎａｔｕｒｅ，３３０：５７６−５７８，１９８７）開発された。例示的な相同
組換え技術は、米国特許第５，２７２，０７１号、欧州特許番号第９１３０５１
号、同第５０５５００号；ＰＣＴ／ＵＳ９０／０７６４２、ＰＣＴ公開第ＷＯ
９１／０９９５５に記載される。
相同組換えを介して、ゲノム中に挿入されるべきＤＮＡ配列は、標的化ＤＮＡ
にこのＤＮＡ配列を結合することによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向さ
れ得る。この標的化ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ領域に相補的である（相同である）
ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である標的化ＤＮＡの小
片は、ＤＮＡ複製プロセスの間に親鎖と接触下に置かれる。共有される相同領域
を介して内因性ＤＮＡの他の小片とハイブリダイズし、そして従って、組み換わ
ることは、細胞内に挿入されたＤＮＡの一般的な特性である。この相補鎖が、変
異または異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結
合された場合、これもまた、新たに合成された鎖に組換えの結果として組み込ま
れる。プルーフリーディング機能の結果として、この新たなＤＮＡ配列が、テン
プレートとして作用することが可能である。このように、この移入されたＤＮＡ
は、ゲノム内に組み込まれる。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと相互作用し得るかまたはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドの発現を制御し得るＤＮＡ領域（例えば、隣接配列）が、標的化ＤＮＡのこれ
らの小片に結合される。例えば、プロモーター／エンハンサーエレメント、サプ
レッサーまたは外因性転写調節エレメントが、所望のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
をコードするＤＮＡの転写に影響を与えるに十分に近位でかつ十分な方向で、そ
の意図される宿主細胞のゲノムに挿入される。制御エレメントは、宿主細胞ゲノ
ム中に存在するＤＮＡの一部を制御する。従って、所望のＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドの発現は、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子自体をコードするＤＮＡのトランスフェクシ
ョンによってではなく、むしろＤＮＡ調節セグメントと結合された標的化ＤＮＡ
（その目的の内因性遺伝子と相同な領域を含む）の使用によって達成され得、こ
の調節セグメントは、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の転写について認識可能なシグナルを
、その内因性遺伝子配列に提供する。
例示的な方法において、細胞内の所望の標的化された遺伝子（すなわち、所望
の内因性の細胞遺伝子）の発現は、少なくとも調節配列、エキソンおよびスプラ
イスドナー部位を含むＤＮＡの導入による、予め選択された部位でのその細胞ゲ
ノムへの相同組換えを介して変更される。これらの成分は、実際には、これらの
成分が、新たな転写単位の産生を生じる（ここで、そのＤＮＡ構築物中に存在す
る調節配列、エキソンおよびスプライスドナー部位が、内因性遺伝子に作動的に
連結される）様式で染色体（ゲノム）ＤＮＡ中に導入される。染色体ＤＮＡへの
これらの成分の導入の結果として、所望の内因性遺伝子の発現が変更される。
本明細書中に記載されるように、変更された遺伝子発現は、得られたときの細
胞において通常サイレントな（発現されない）遺伝子を活性化すること（または
発現されるのを引き起こすこと）、ならびに得られたときの細胞において生理学
的に重要なレベルで発現されない遺伝子の発現を増大させることを包含する。こ
の実施形態はさらに、得られたときの細胞において生じる調節または誘導のパタ
ーンとは異なるように調節または誘導のパターンを変更すること、ならびに得ら
れたときの細胞において発現される遺伝子の発現を減少させること（除去するこ
とを含む）を包含する。
相同組換えを用いて、細胞の内因性ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子からのＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチド産生を増大させ得るかまたは生じさせ得る１つの方法は、第１に、相
同組換えを用いて部位特異的組換え系（例えば、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ、ＦＬＰ／Ｆ
ＲＴ）（Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．
５：５２１−５２７；およびＳａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙ
ｍｏｌ．２２５：８９０−９００）由来の組換え配列を、細胞の内因性ゲノムＦ
ＧＦＲ−Ｌポリペプチドコード領域の上流に（すなわち、５’側に）配置するこ
とを含む。ゲノムＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に配置された
部位に相同な組換え部位を含むプラスミドは、この改変された細胞株に、適切な
リコンビナーゼ酵素と共に導入される。このリコンビナーゼ酵素は、このプラス
ミドを、プラスミドの組換え部位を介して、その細胞株におけるゲノムＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドコード領域のすぐ上流に位置する組換え部位に組み込ませる（
ＢａｕｂｏｎｉｓおよびＳａｕｅｒ，１９９３，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ
Ｒｅｓ．，２１：２０２５−２０２９；およびＯ’Ｇｏｒｍａｎら，１９９１，
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：１３５１−１３５５）。転写を増大させることが公知
の任意の隣接配列（例えば、エンハンサー／プロモーター、イントロン、翻訳エ
ンハンサー）は、このプラスミド内に適切に配置された場合に、新たな転写単位
または改変された転写単位を作製するような様式で組み込み、この細胞の内因性
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子からのデノボＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド産生または増大した
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド産生をもたらす。
部位特異的な組換え配列がその細胞の内因性ゲノムＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
コード領域のすぐ上流に配置された細胞株を使用するためのさらなる方法は、相
同組換えを使用して、第２の組換え部位を、この細胞株のゲノムの他の箇所に導
入することである。次いで、適切なリコンビナーゼ酵素が、この２つの組換え部
位の細胞株に導入されて、これが、組換え事象（欠失、反転または転移）を引き
起こす。この組換え事象は、新たな転写単位または改変された転写単位を作製し
、この転写単位が、この細胞の内因性ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子からのデノボＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチド産生または増加したＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド産生を生じる（
Ｓａｕｅｒ，１９９４，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５；５２
１−２７；およびＳａｕｅｒ，１９９３，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２
２５：８９０−９００）。
細胞の内因性ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子からのＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現を増
加させるかまたは引き起こすためのさらなるアプローチは、細胞の内因性ＦＧＦ
Ｒ−Ｌ遺伝子からのデノボＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド産生または増加したＦＧＦ
Ｒ−Ｌポリペプチド産生を生じる様式で、ある遺伝子（単数または複数）（例え
ば、転写因子）の発現を増加させるかもしくは引き起こすこと、および／または
ある遺伝子（単数または複数）（例えば、転写リプレッサー）の発現を減少させ
ることを包含する。この方法は、細胞の内因性ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子からのデノボ
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド産生または増加したＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド産生が
生じるように、天然には存在しないポリペプチド（例えば、転写因子ドメインに
融合した部位特異的ＤＮＡ結合ドメインを含むポリペプチド）をその細胞に導入
することを包含する。
本発明は、さらに、標的遺伝子の発現を変化させる方法において有用なＤＮＡ
構築物に関する。特定の実施形態において、例示的なＤＮＡ構築物は、以下を含
む：（ａ）１つ以上の標的化配列；（ｂ）調節配列；（ｃ）エキソン；および（
ｄ）不対（ｕｎｐａｉｒｅｄ）スプライスドナー部位。このＤＮＡ構築物におけ
る標的化配列は、細胞中の標的遺伝子へのエレメント（ａ）〜（ｄ）の取り込み
を、エレメント（ｂ）〜（ｄ）がその内因性標的遺伝子の配列に作動可能に連結
されるように、指向する。別の実施形態においては、ＤＮＡ構築物は、以下を含
む：（ａ）１つ以上の標的化配列、（ｂ）調節配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）ス
プライスドナー部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライスアクセプター
部位；ここで、この標的化配列は、エレメント（ａ）〜（ｆ）の取り込みを、（
ｂ）〜（ｆ）のエレメントが内因性遺伝子に作動可能に連結されるように、指向
する。この標的化配列は、相同組換えが生じる細胞染色体ＤＮＡにおける所定の
部位に相同である。この構築物において、エキソンは、一般に、調節配列の３’
側であり、そしてスプライスドナー部位は、エキソンの３’側である。
特定の遺伝子の配列（例えば、本明細書中に提示されるＦＧＦＲ−Ｌポリペプ
チドの核酸配列）が既知である場合には、この遺伝子の選択された領域に相補的
なＤＮＡ小片は、合成され得るか、またはさもなければ、例えば、その目的の領
域に結合する特異的な認識部位でのネイティブＤＮＡの適切な制限処理によって
、得られ得る。この小片は、細胞への導入時に標的化配列として作用し、そして
ゲノム内のその相同領域とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションが
ＤＮＡ複製の間に起こる場合、このＤＮＡ小片およびこのＤＮＡ小片に結合した
任意のさらなる配列は、岡崎フラグメントとして作用し、そして新たに合成され
たＤＮＡの娘鎖に組み込まれる。従って、本発明は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
をコードするヌクレオチドを包含し、このヌクレオチドは、標的化配列として使
用され得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド細胞治療（例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産
生する細胞の移植）もまた意図される。この実施形態は、生物学的に活性な形態
のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを合成および分泌し得る細胞を移植することを包含
する。このような可溶性ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド産生細胞は、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドの天然の産生者である細胞であり得るか、または所望のＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドをコードする遺伝子もしくはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの発現を増
強する遺伝子で形質転換することによってそのＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生
する能力が増強された、組換え細胞であり得る。このような改変は、その遺伝子
を送達するため、ならびにその発現および分泌を促進するために適したベクター
によって、達成され得る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを投与される患者において
、外来種のポリペプチドの投与によって生じ得るような潜在的な免疫学的反応を
最小化するためには、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生する天然の細胞が、ヒト
起源でありかつヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生することが、好ましい。同
様に、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生する組換え細胞が、ヒトＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドをコードする遺伝子を含む発現ベクターで形質転換されることが、好
ましい。
移植される細胞は、周囲の組織の浸潤を回避するために、カプセル化され得る
。ヒトまたは非ヒト動物の細胞は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの放出を可能にす
るが患者の免疫系によるかまたは周囲の組織からの他の有害な因子による細胞の
破壊を防止する、生体適合性の半透過性のポリマー包皮または膜内で、患者に移
植され得る。あるいは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを産生するようエキソビボで
形質転換された患者自身の細胞が、このようなカプセル化なしに、患者に直接移
植され得る。
生存細胞をカプセル化するための技術は、当該分野において公知であり、そし
てカプセル化された細胞の調製およびこれらの患者への移植は、慣例的に達成さ
れ得る。例えば、Ｂａｅｔｇｅら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１０５４５２およ
びＰＣＴ／ＵＳ９４／０９２９９）は、生物学的に活性な分子の効果的な送達の
ための、遺伝子操作された細胞を含む膜カプセルを記載する。これらのカプセル
は生体適合性であり、そして容易に回収可能である。これらのカプセルは、プロ
モーターに作動可能に連結された生物学的に活性な分子をコードするＤＮＡ配列
を含む組換えＤＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞をカプセル化し、これら
の細胞は、哺乳動物宿主への移植の際に、インビボでのダウンレギュレーション
に供されない。このデバイスは、生存細胞からレシピエント内の特異的な部位へ
の分子の送達を提供する。さらに、米国特許第４，８９２，５３８号、同第５，
０１１，４７２号、および同第５，１０６，６２７号を参照のこと。生存細胞を
カプセル化するための系は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／１０４２５（Ａｅｂｉ
ｓｃｈｅｒら）に記載されている。ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９１／１０４７０（Ａ
ｅｂｉｓｃｈｅｒら）；Ｗｉｎｎら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅｕｒｏｌ．，
１１３：３２２−３２９，Ａｅｂｉｓｃｈｅｒら、１９９１，Ｅｘｐｅｒ．Ｎｅ
ｕｒｏｌ．，１１１：２６９−２７５，；およびＴｒｅｓｃｏら、１９９２，Ａ
ＳＡＩＯ，３８：１７−２３もまた参照のこと。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのインビボおよびインビトロ遺伝子治療送達もまた
想定される。遺伝子治療技術の１つの例は、構成的プロモーターまたは誘導性プ
ロモーターに作動可能に連結され得るＦＧＦＲ−ＬポリペプチドをコードするＦ
ＧＦＲ−Ｌ遺伝子（ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または合成ＤＮＡのいず
れか）を使用して、「遺伝子治療ＤＮＡ構築物」を形成することである。このプ
ロモーターは、内因性ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子に対して同種であっても異種であって
もよいが、但し、この構築物が挿入される細胞または組織型において、このプロ
モーターは、活性である。遺伝子治療ＤＮＡ構築物の他の成分は、必要に応じて
、部位特異的組み込みのために設計されたＤＮＡ分子（例えば、相同組換えのた
めに有用な内因性配列）、組織特異的なプロモーター、エンハンサーまたはサイ
レンサー、親細胞より優れた選択的利点を提供し得るＤＮＡ分子、形質転換され
た細胞を同定するための標識として有用なＤＮＡ分子、ネガティブ選択系、細胞
特異的結合因子（例えば、細胞標的化のため）、細胞特異的インターナリゼーシ
ョン因子、ベクターによる発現を増強するための転写因子、およびベクターの産
生を可能にする因子を含み得る。
次いで、遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、ウイルスベクターまたは非ウイルスベク
ターを使用して、細胞に（エキソビボまたはインビボでのいずれかで）導入され
得る。遺伝子治療ＤＮＡ構築物を導入するための１つの手段は、本明細書中に記
載されるようなウイルスベクターによる手段である。特定のベクター（例えば、
レトロウイルスベクター）は、ＤＮＡ構築物を細胞の染色体ＤＮＡに送達し、そ
してこの遺伝子は、染色体ＤＮＡに組み込み得る。他のベクターは、エピソーム
として機能し、そして遺伝子治療ＤＮＡ構築物は、細胞質内に残る。
なお別の実施形態において、調節エレメントが、標的細胞におけるＦＧＦＲ−
Ｌ遺伝子の制御された発現のために含まれ得る。このようなエレメントは、適切
なエフェクターに対する応答の際に、オンにされる。この様式で、治療ポリペプ
チドは、所望のときに発現され得る。１つの従来の制御手段は、小分子結合ドメ
インおよび生物学的プロセスを開始し得るドメインを含むキメラタンパク質（例
えば、ＤＮＡ結合タンパク質または転写活性化タンパク質）を二量体化するため
に使用される、小分子二量体化剤またはラパログ（ｒａｐａｌｏｇ）の使用を包
含する（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９６／４１８６５、ＷＯ ９７／３１８９８、お
よびＷＯ ９７／３１８９９を参照のこと）。このタンパク質の二量体化を使用
して、導入遺伝子の転写を開始し得る。
代替の調節技術は、目的の遺伝子から発現されたタンパク質を、その細胞の内
側で凝集体またはクラスターとして貯蔵する方法を使用する。目的の遺伝子は、
融合タンパク質として発現され、この融合タンパク質は、条件的凝集ドメインを
含み、このドメインは、小胞体内での凝集したタンパク質の保持を生じる。貯蔵
されたタンパク質は、細胞内で安定でありそして不活性である。しかし、これら
のタンパク質は、条件的凝集ドメインを除去し、これによってこの凝集体または
クラスターを特異的に破壊する薬物（例えば、小分子リガンド）を投与すること
によって、放出され得、その結果、これらのタンパク質は、その細胞から分泌さ
れ得る。Ａｒｉｄｏｒら、２０００、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：８１６−８１７
およびＲｉｖｅｒａら、２０００，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，８２６−８３０を
参照のこと。
他の適切な制御手段または遺伝子スイッチとしては、本明細書中に記載される
系が挙げられるが、これらに限定されない。ミフェプリストン（ＲＵ４８６）が
、プロゲステロンアンタゴニストとして使用される。プロゲステロンアンタゴニ
ストに対する、改変されたプロゲステロンレセプターリガンド結合ドメインの結
合は、２つの転写因子の二量体の形成し、次いで、これらの転写因子が、核を通
ってＤＮＡに結合することによって、転写を活性化する。このリガンド結合ドメ
インは、そのレセプターがその天然のリガンドに結合する能力を排除するよう改
変される。改変されたステロイドホルモンレセプター系は、米国特許第５，３６
４，７９１号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９１１およびＷＯ９７／１
０３３７に、さらに記載されている。
なお別の制御系は、エクジソン（ショウジョウバエのステロイドホルモン）を
使用し、これは、エクジソンレセプター（細胞質レセプター）に結合し、そして
このレセプターを活性化する。次いで、このレセプターは、核に転移して、特定
のＤＮＡ応答エレメント（エクジソン応答性遺伝子由来のプロモーター）を結合
する。エクジソンレセプターは、転写を開始するための、トランス活性化ドメイ
ン、ＤＮＡ結合ドメインおよびリガンド結合ドメインを含む。エクジソン系は、
米国特許第５，５１４，５７８号ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／３８１１７
、ＷＯ９６／３７６０９、およびＷＯ９３／０３１６２にさらに記載されている
。
別の制御手段は、ポジティブなテトラサイクリン制御可能トランスアクチベー
ターを使用する。この系は、転写を活性化させるポリペプチドに連結された、変
異ｔｅｔリプレッサータンパク質ＤＮＡ結合ドメイン（逆テトラサイクリン調節
トランスアクチベータータンパク質（すなわち、これは、テトラサイクリンの存
在下で、ｔｅｔオペレーターに結合する）を生じる変異ｔｅｔ Ｒ−４アミノ酸
変化）を含む。このような系は、米国特許第５，４６４，７５８号、同第５，６
５０，２９８号、および同第５，６５４，１６８号に記載されている。
さらなる発現制御系および核酸構築物は、Ｉｎｎｏｖｉｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ Ｉｎｃ．に対する米国特許第５，７４１，６７９号および同第５，８
３４，１８６号に記載されている。
インビボ遺伝子治療は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子を、Ｆ
ＧＦＲ−Ｌ核酸分子の局所的注射を介してかまたは他の適切なウイルス送達ベク
ターもしくは非ウイルス送達ベクターによって、細胞に導入することにより達成
され得る（Ｈｅｆｔｉ，１９９４，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２５：１４１８
−１４３５，）。例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする核酸分子は、
標的化された細胞への送達のために、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに
含まれ得る（例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／３４６７０；
およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９５／０７１７８）。組換えＡＡＶゲノムは
、代表的に、機能的プロモーターおよびポリアデニル化配列に作動可能に連結さ
れたＦＧＦＲ−ＬポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に隣接する、ＡＡＶ逆方
向末端反復を含む。
代替の適切なウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウ
イルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、肝
炎ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、パポバウイルスベクター、ポッ
クスウイルスベクター、アルファウイルスベクター、コロナウイルスベクター、
ラブドウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、およびパピローマウイ
ルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，６７２，
３４４号は、組換え神経栄養性ＨＳＶ−１ベクターを含む、インビボウイルス媒
介遺伝子移入系を記載する。米国特許第５，３９９，３４６号は、治療タンパク
質をコードするＤＮＡセグメントを挿入するようインビトロで処理されたヒト細
胞の送達による、患者に治療タンパク質を提供するためのプロセスの例を、提供
する。遺伝子治療技術の実施のさらなる方法および材料は、米国特許第５，６３
１，２３６号（アデノウイルスベクターを含む）；米国特許第５，６７２，５１
０号（レトロウイルスベクターを含む）；および米国特許第５，６３５，３９９
号（サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む）に記載されている
。
非ウイルス送達方法としては、リポソーム媒介移入、裸のＤＮＡ送達（直接注
入）、レセプター媒介移入（リガンド−ＤＮＡ複合体）、エレクトロポレーショ
ン、リン酸カルシウム沈降、および微粒子ボンバードメント（例えば、遺伝子銃
）が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝子治療の材料および方法として
はまた、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー−プロモーター、部位特
異的組み込みのために設計されたＤＮＡ配列、親細胞より優れた選択的利点を提
供し得るＤＮＡ配列、形質転換された細胞を同定するための標識、ネガティブ選
択系および発現制御系（安全性の尺度）、細胞特異的結合因子（細胞標的化のた
め）、細胞特異的インターナリゼーション因子、およびベクターによる発現を増
強するための転写因子、ならびにベクター作製の方法が挙げられ得る。遺伝子治
療技術の実施のための、このようなさらなる方法および材料は、米国特許第４，
９７０，１５４号（エレクトロポレーション技術を含む）、米国特許第５，６７
９，５５９号（遺伝子送達のためのリポタンパク質含有系を記載する）、米国特
許第５，６７６，９５４号（リポソームキャリアを含む）、米国特許第５，５９
３，８７５号（リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する
）、米国特許第４，９４５，０５０号（生物学的に活性な粒子が、細胞において
、この粒子がこの細胞の表面を貫通しそしてこの細胞の内側に取り込まれる速度
で推進されるプロセス、を記載する）、およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／４０９
５８（核リガンドを含む）に記載されている。
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子治療または細胞治療が、同じまたは異なる細胞における１
つ以上のさらなるポリペプチドの送達をさらに含み得ることがまた意図される。
このような細胞は、患者に別々に導入され得るか、またはこれらの細胞は、単一
の移植可能なデバイス（例えば、上記のカプセル化膜）内に含まれ得るか、また
は細胞は、ウイルスベクターによって別々に改変され得る。
遺伝子治療を介して細胞における内因性ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現を増加
させるための手段は、１つ以上のエンハンサーエレメントをＦＧＦＲ−Ｌポリペ
プチドプロモーターに挿入することであり、ここで、このエンハンサーエレメン
トは、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の転写活性を増加させるよう作用し得る。使用される
エンハンサーエレメントは、遺伝子を活性化することが所望される組織に基づい
て選択される；この組織においてプロモーター活性化を与えることが公知である
エンハンサーエレメントが、選択される。例えば、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを
コードする遺伝子がＴ細胞において「オンにされる」場合には、ｌｃｋプロモー
ターエンハンサーエレメントが使用され得る。ここで、不可される転写エレメン
トの機能性部分は、標準的なクローニング技術を使用して、ＦＧＦＲ−Ｌポリペ
プチドプロモーターを含むＤＮＡのフラグメントに挿入され得る（そして必要に
応じて、ベクターおよび／または５’および／または３’隣接配列に挿入され得
る）。次いで、この構築物（「相同組換え構築物」として公知）が、エキソビボ
でかまたはインビボでのいずれかで、所望の細胞に導入され得る。
遺伝子治療はまた、内因性プロモーターのヌクレオチド配列を改変することに
よって、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現を減少させるために、使用され得る。こ
のような改変は、代表的に、相同組換え法を介して達成される。例えば、不活化
について選択されたＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子のプロモーターの全てまたは一部を含む
ＤＮＡ分子は、転写を調節するプロモーター片を除去および／または置換するよ
うに、操作され得る。例えば、プロモーターの転写アクチベーターのＴＡＴＡボ
ックスおよび／または結合部位が、標準的な分子生物学の技術を使用して、欠失
され得る；このような欠失は、プロモーター活性を阻害し得、これによって、対
応するＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の転写を抑制する。プロモーターにおけるＴＡＴＡボ
ックスまたは転写アクチベーター結合部位の欠失は、（調節されるＦＧＦＲ−Ｌ
遺伝子と同じ種かまたは関連する種由来の）ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドプロモー
ターの全てまたは関連する部分を含むＤＮＡ構築物を生成することによって達成
され得、ここで、１つ以上のＴＡＴＡボックスおよび／または転写アクチベータ
ー結合部位のヌクレオチドが、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失および／ま
たは挿入を介して変異される。その結果、ＴＡＴＡボックスおよび／またはアク
チベーター結合部位は、活性が減少されているか、または完全に不活性にされて
いる。この構築物はまた、代表的に、その改変されたプロモーターセグメントに
隣接するネイティブな（内因性の）５’および３’ＤＮＡ配列に対応する、少な
くとも約５００塩基のＤＮＡを含む。この構築物は、直接的にかまたは本明細書
中に記載されるようなウイルスベクターを介して、適切な細胞に（エキソビボで
かまたはインビボでかのいずれかで）導入され得る。代表的に、細胞のゲノムＤ
ＮＡへのこの構築物の組み込みは、相同組換えを介し、ここで、このプロモータ
ー構築物における５’および３’ＤＮＡ配列は、ハイブリダイゼーションを介す
るその内因性染色体ＤＮＡへの改変されたプロモーター領域の組み込みを補助す
るよう作用し得る。
（治療的使用）
ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびア
ンタゴニストは、本明細書中に引用される疾患、障害または状態を含む、多くの
疾患、障害または状態を処置、診断、改善または予防するために使用され得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドアゴニストおよびアンタゴニストとしては、ＦＧＦ
Ｒ−Ｌポリペプチド活性を調節し、そしてＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの成熟形態
の少なくとも１つの活性を増加または減少する、アゴニスト分子およびアンタゴ
ニスト分子が挙げられる。アゴニストまたはアンタゴニストは、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドと相互作用し、それによってそのＦＧＦＲ−Ｌの活性を調節する、補
因子（例えば、タンパク質、ペプチド、糖質、脂質または低分子量分子）であり
得る。潜在的なポリペプチドアゴニストまたはアンタゴニストとしては、ＦＧＦ
Ｒ−Ｌポリペプチドの可溶性形態または膜結合形態のいずれかと反応する抗体が
挙げられ、これらの形態は、ＦＧＦＲ−Ｌタンパク質の細胞外ドメインの全てま
たは一部を含む。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現を調節する分子としては、代表
的に、発現のアンチセンス調節因子として作用し得る、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドをコードする核酸が挙げられる。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの細胞外ドメインは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ
）レセプターファミリーの遺伝子と配列同一性を共有することが見出され、ＦＧ
ＦＲ−Ｌ核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴ
ニスト（抗ＦＧＦＲ−Ｌ選択的結合因子が挙げられるが、これらに限定されない
）は、新規な増殖因子の同定において有用であり得る。
ＦＧＦＲ−ＬポリペプチドとＦＧＦレセプターファミリーとの間の配列同一性
はまた、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが、線維芽細胞、内皮細胞および上皮細胞に
おける有糸分裂誘発において役割を果たし得ることを示唆する。このような上皮
細胞としては、膵管細胞が挙げられ、これは、ＦＧＦに応答して分化し、インス
リン産生β島細胞を形成することが示されている。３〜４ｋｂ ＦＧＦＲ−Ｌ転
写物に加えて、膵臓はまた、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体をコードし得る、
６ｋｂの転写物を発現する。この潜在的なＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド改変体は、
ＦＧＦＲ−Ｌ転写物の活性とは異なる活性を有し得る。従って、ＦＧＦＲ−Ｌ核
酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、
組織修復、創傷治癒、脈管形成の調節、ならびに糖尿病の診断および処置に有用
であり得る。
いくつかの腫瘍細胞株において、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの細胞外ドメイン
は、培養培地中に流される。このことは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの細胞外ド
メインが、腫瘍細胞の増殖および／または分化において役割を果たし得ることを
示唆する。従って、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド、ならび
にそれらのアゴニストおよびアンタゴニストは、癌の診断および処置に有用であ
り得る。
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子は、造血幹細胞の維持を支持する、骨髄間質細胞株におい
て上方調節されることが見出された。従って、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子およびＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドは、幹細胞のエキソビボ拡大、遺伝子治療プロトコル、ま
たは造血障害の処置に有用であり得る。
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子はまた、破骨細胞発生（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅ
ｓｉｓ）の条件下で上方調節されることが見出された。従って、ＦＧＦＲ−Ｌ核
酸分子、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタ
ゴニストは、骨の障害（骨粗鬆症、大理石骨病、骨形成不全症、パジェット病、
歯周疾患および高カルシウム血症を含むが、これらの限定されない）の診断およ
び処置に有用であり得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現は、腎臓において検出された。従って、ＦＧＦ
Ｒ−Ｌ核酸分子、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよ
びアンタゴニストは、腎臓に関連する疾患の診断および／または処置に有用であ
り得る。このような疾患の例としては、急性糸球体腎炎および慢性糸球体腎炎が
挙げられるが、これらに限定されない。腎臓に関連する他の疾患は、本発明の範
囲内に包含される。
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子は、インサイチュハイブリダイゼーションによって決定さ
れた場合に、脂肪組織において最も豊富に発現される。この発現パターン実基づ
いて、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、脂肪生成または脂肪細胞機能（エネルギー
バランス制御およびリポリーシスを含むが、これらに限定されない）において役
割を果たし得る。従って、ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド、
ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストはまた、食事量の減少、体重
の増加の達成、または悪液質の処置に有用であり得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド機能のアゴニストまたはアンタゴニストは、処置さ
れる状態に適切であるように、１以上のサイトカイン、増殖因子、抗生物質、抗
炎症剤、および／または化学療法剤と組み合わせて（同時にまたは連続的に）使
用され得る。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの所望でないレベルによって生じるかまたは媒介さ
れる他の疾患は、本発明の範囲内に包含される。所望でないレベルには、ＦＧＦ
Ｒ−Ｌポリペプチドの過剰なレベルおよびＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの正常下の
レベルが含まれる。
（ＦＧＦＲ−Ｌ核酸およびＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの使用）
本発明の核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない
核酸分子を含む）を使用して、ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子および関連する遺伝子の染色
体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、当該分野で公知の技術（例えば
、ＰＣＲ増幅およびインサイチュハイブリダイゼーション）により行われ得る。
ＦＧＦＲ−Ｌ核酸分子（それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードし
ない核酸分子を含む）は、哺乳動物組織または体液サンプル中のＦＧＦＲ−Ｌ核
酸分子の存在について、定性的または定量的のいずれかで試験するための、診断
アッセイにおけるハイブリダイゼーションプローブとして有用であり得る。
他の方法はまた、１つ以上のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの活性を阻害すること
が所望される場合に使用され得る。このような阻害は、発現制御配列（三重らせ
ん形成）またはＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡに相補的でありかつ発現制御配列（三重
らせん形成）またはＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡにハイブリダイズする核酸分子によ
りもたらされ得る。例えば、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子（これらは、
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の少なくとも一部に相補的である配列を有する）が、細胞中
に導入され得る。アンチセンスプローブは、本明細書中に開示されるＦＧＦＲ−
Ｌ遺伝子の配列を使用して、利用可能な技術により設計され得る。代表的には、
このようなアンチセンス分子の各々は、選択された各ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の開始
部位（５’末端）に相補的である。このアンチセンス分子が、次いで、対応する
ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は、妨
げられるかまたは減少される。アンチセンスインヒビターは、細胞または生物に
おけるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの減少または非存在に関連する情報を提供する
。
あるいは、遺伝子治療を使用して、１つ以上のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのド
ミナントネガティブインヒビターを作製し得る。この状況において、各選択され
たＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡが調製さ
れ得、そして本明細書中に記載されるウイルスまたは非ウイルスの方法のいずれ
かを使用して患者の細胞中に導入され得る。このような変異体の各々は、代表的
に、その生物学的役割において内因性ポリペプチドと競合するように設計される
。
さらに、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、生物学的に活性であっても活性でなく
ても、免疫原として使用され得、すなわち、これらのポリペプチドは、それに対
して抗体が惹起され得る、少なくとも１つのエピトープを含有する。ＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドに結合する選択的結合因子（本明細書中に記載されるような）は
、インビボおよびインビトロでの診断目的のために使用され得、これらの目的と
しては、体液サンプルまたは細胞サンプル中のＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの存在
を検出するための標識された形態での使用を含むが、これに限定されない。これ
らの抗体もまた、本明細書中に列挙される疾患および障害を含む、多数の疾患お
よび障害を、予防、処置または診断するために使用され得る。これらの抗体は、
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を減少またはブロックす
るようにＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドに結合し得るか、またはポリペプチドに結合
してＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの少なくとも１つの活性特徴を増加し得る（ＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドの薬物動態を増加させることによるものを含む）。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドは、「発現クローニング」ストラテジーを使用して
、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドリガンドをクローニングするために使用され得る。
放射性標識（１２５ヨウ素）したＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドまたは「アフィニテ
ィ／活性−タグ化」ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド（例えば、Ｆｃ融合体またはアル
カリホスファターゼ融合体）を結合アッセイにおいて使用して、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチドリガンドを発現する細胞型、細胞株または組織を同定し得る。次いで
、このような細胞または組織から単離されたＲＮＡを、ｃＤＮＡに変換し、哺乳
動物発現ベクターにクローニングし、そして哺乳動物細胞（例えば、ＣＯＳまた
は２９３細胞）にトランスフェクトして発現ライブラリーを作製し得る。次いで
、放射性標識化またはタグ化ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドを、アフィニティ試薬と
して使用して、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドリガンドを発現する、このライブラリ
ー中の細胞のサブセットを同定および単離し得る。次いで、ＤＮＡを、これらの
細胞から単離しそして哺乳動物細胞にトランスフェクトして、二次発現ライブラ
リー（ここで、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドリガンドを発現する細胞の画分は、元
のライブラリーよりも何倍も高い）を作製し得る。この富化プロセスは、ＦＧＦ
Ｒ−Ｌポリペプチドリガンドを含む単一の組換えクローンが単離されるまで、繰
り返し反復され得る。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドリガンドの単離は、ＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドシグナル伝達経路の新規なアゴニストおよびアンタゴニストを同
定または開発するために有用である。このようなアゴニストおよびアンタゴニス
トとしては、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドリガンド、抗ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
リガンド抗体、低分子またはアンチセンスオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明のマウスおよびヒトＦＧＦＲ−Ｌ核酸はまた、対応する染色体ＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチド遺伝子を単離するための有用なツールである。例えば、ＦＧＦ
Ｒ−Ｌ配列を含むマウス染色体ＤＮＡは、ノックアウトマウスを構築するために
使用され得、それによって、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのインビボでの役割の試
験を可能にする。ヒトＦＧＦＲ−ＬゲノムＤＮＡは、遺伝性の組織編制疾患を同
定するために使用され得る。
ヒトＦＧＦＲ−ＬポリペプチドをコードするｃＤＮＡの寄託（登録番号＿を有
する）を、２０００年１月３１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕ
ｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅ
ｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１１０−２２０９に行った。
以下の実施例は、例示目的のみのために意図され、本発明の範囲をいずれにも
限定するとは解釈されるべきではない。
（実施例１：マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を使
用して、ラットＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングお
よび分析した。
マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする配列を、造血幹細胞支持性の２
つの骨髄間質細胞株（Ｆ４およびＦ１０）の混合物に由来するマウスｃＤＮＡラ
イブラリーから単離した。マウス骨髄間質細胞株Ｄ３、Ｆ４およびＦ１０を、Ｒ
．Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ博士（Ｅｒａｓｍｕｓ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｒｏｔ
ｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）から得て、そして１０％ ウ
シ胎仔血清、５％ ウマ血清、２ｍＭ グルタミン、０．１ｍＭ β−メルカプ
トエタノールおよび１μＭ ヒドロコルチゾン（コハク酸Ｎａ塩）を補充したＩ
ＭＤＭ中、３２℃かつ５％ ＣＯ２にて培養した。マウス骨髄間質ｃＤＮＡライ
ブラリーを、Ｔｒｉｚｏｌ法（ＬＴＩ）を使用してＦ４細胞およびＦ１０細胞か
らＲＮＡを単離することによって調製した。ポリ−Ａ ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴ
磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）を使用して精製し、そして等量のポリ−Ａ ＲＮＡ（
各１．５μｇのＦ４ ＲＮＡおよびＦ１０ ＲＮＡ）を混合した。オリゴ−ｄＴ
でプライムした全長ｃＤＮＡライブラリーを、ｔｈｅ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａ
ｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＬＴＩ）を使用して、このＦ４／Ｆ１
０ ＲＮＡ混合物から構築した。
マウス骨髄間質ｃＤＮＡライブラリー（６×１０６個の形質転換体を含む）を
プレートし、そして３．４×１０４個のコロニーを選択しそして並行して９６ウ
ェルプレートに移し、そしてフィルター上にスポットした。次いで、フィルター
を、骨髄間質Ｄ３細胞株から単離したポリ−Ａ ｍＲＮＡから生成した、３２Ｐ
−ｄＣＴＰ標識第１鎖ｃＤＮＡでプローブした。フィルター上にスポットした３
．４×１０４個のコロニーのうち、１１，２３２個は、Ｄ３プローブとハイブリ
ダイズしなかった。プラスミドを、これらのハイブリダイズしなかったコロニー
から単離し、そしてそれらのｃＤＮＡインサートの５’末端を配列決定した。
１個のクローン（ｓｍｓｆ２−０００１７−ｆ４）（これは、ＦＧＦレセプタ
ーファミリーの種々のメンバーとの相同性を示す）を、この配列分析において同
定した。全長クローン（ｓｍｓｆ２−０００１７−ｆ４−４１．６）を、５６個
のマウス骨髄間質ｃＤＮＡプール（各プールは、マウス骨髄間質ｃＤＮＡライブ
ラリー由来の１×１０４個のクローンを含む）のサザンブロットをスクリーニン
グすることによって得た。最も長いインサートを保持するプールを、引き続いて
プレートし、そして再度スクリーニングした。
マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの全長ｃＤＮＡの配列分析は、この遺伝子が
、Ｉ型膜貫通タンパク質をコードすることを示した（図１Ｂ、推定膜貫通ドメイ
ン：Ｌ−Ｐ−Ｗ−Ｐ−Ｖ−Ｖ−Ｉ−Ｇ−Ｉ−Ｐ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ｖ−Ｆ−Ｉ−Ｌ−
Ｇ−Ｔ−Ｖ−Ｌ−Ｌ−Ｗ−Ｌ−Ｃ；配列番号１２）。このマウスＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチド遺伝子は、５２９アミノ酸のタンパク質をコードする１５８７ｂｐの
オープンリーディングフレームを含み、そしてこのタンパク質は、そのアミノ末
端に潜在的なシグナルペプチドを保持する（図１Ａ，推定シグナルペプチド：Ｍ
−Ｔ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｌ−Ｇ−Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｓ−Ａ−Ｅ
−Ａ；配列番号１１）。図１Ａ〜１Ｃは、マウスＦＧＦＲ−Ｌ核酸配列のヌクレ
オチド配列およびマウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの推定アミノ酸配列を示す。
マウス細胞外ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定
した場合に、約５５ｋＤの見かけの分子量を有する。
このＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの細胞外ドメインは、ＦＧＦレセプターファミ
リーに最も密接に関連するが、このタンパク質の細胞質ドメインは、キナーゼド
メインも他の認識可能なドメインも含まない。図２Ａ〜２Ｂは、マウスＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドと、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと最も近い相同性を共有する公
知のタンパク質（イベリアトゲイモリ（Ｐｌｅｕｒｏｄｅｌｅｓ ｗａｌｔｌｉ
ｉ）ＦＧＦレセプター４）のアミノ酸配列アライメントを示す。ＢＬＡＳＴプロ
グラムを使用するコンピューター分析もまた、マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド
が、ヒト腎臓から単離された単一の４８６ｂｐヒトＥＳＴ（ＧｅｎＢａｎｋ登録
番号ＡＩ２４５７０１）に密接に関連することを示した。このＥＳＴの３７９ｂ
ｐのストレッチは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドとの８７％の同一性を示し、これ
は、ヒトオルソログの存在を示唆する。
（実施例２：ヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド遺伝子のクローニング）
一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（前出）に記載されるような材料および方法を使
用して、ヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよ
び分析した。
ヒト脾臓および混合組織ｃＤＮＡライブラリーを、以下のように調製した。製
造業者の推奨プロトコルに従って、総ＲＮＡを、Ｔｒｉｚｏｌ抽出手順（Ｇｉｂ
ｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用してヒト組織から抽出し、そ
してポリ−Ａ＋ＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ，Ｏｓｌｏ，Ｎｏｒ
ｗａｙ）を使用してこの総ＲＮＡから選択した。ランダムプライムしたｃＤＮＡ
またはオリゴ（ｄＴ）プライムしたｃＤＮＡを、ｔｈｅ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐ
ｔ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ａｎｄ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｒｏｃ
ｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を製造業者の推奨プロトコルに従って使用して、このポリ
−Ａ＋ＲＮＡから合成した。得られたｃＤＮＡを、適切な制限酵素で消化し、そ
してｐＳＰＯＲＴ１ベクターにクローニングした。連結産物を、当該分野で公知
の標準的な技術を使用してＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、そして形質転換体を、適
切な抗生物質を含む細菌培地プレート上で選択した。このｃＤＮＡライブラリー
は、これらの形質転換体の全てまたはサブセットからなった。
１×１０４個のコロニーのプールから単離したプラスミドＤＮＡを、以下のプ
ライマーを用いて行うＰＣＲ増幅においてテンプレートとして使用した：５’−
Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ−Ａ−
Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ｇ−３’（配列番号１３）および５’−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−
Ａ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−
Ｇ−Ｇ−３’（配列番号１４）。これらのＰＣＲプライマーは、実施例１に記載
のヒトＥＳＴ配列ＡＩ２４５７０１に基づいて設計した。いくつかのプールは、
２３４ｂｐのフラグメントを生じ、このフラグメントを、サブクローニングし、
そして図３Ａに示されるヒトＦＧＦＲ−Ｌ核酸配列の２０８位〜４４１位に対応
する核酸配列を有することを決定した。
次いで、上記の増幅反応においてこの２３４ｂｐのＰＣＲ産物を生じたプラス
ミドプールを、コロニーハイブリダイゼーション分析のためにプレートした。プ
レートしたコロニーを、上記で生成した２３４ｂｐのＰＣＲフラグメントをＲｅ
ｄｉｐｒｉｍｅ ＩＩランダムプライム標識キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で放射標識した後にプローブとして使用して、スクリー
ニングした。１３３３ｂｐのｃＤＮＡインサートは、図３Ａ〜３Ｃに示されるヒ
トＦＧＦＲ−Ｌ核酸配列の１１８位〜１４５０位に対応する配列を有すると決定
された。この１３３３ｂｐ配列とＡＩ２４５７０１の２３４ｂｐ配列のアセンブ
リは、図３Ａ〜３Ｃに示されるヒトＦＧＦＲ−Ｌ核酸配列を生じた。
Ｂａｋｅｒら（ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／６３０８８）は、ヒトＦＧＦＲ−Ｌ
ポリペプチドと配列同一性を共有するＰＲＯ９４３と称する、５０４アミノ酸の
ポリペプチド配列（配列番号１５）を教示する。ＲｕｂｅｎおよびＹｏｕｎｇ（
ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／２４７５６）は、ヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドと配
列同一性を共有する線維芽細胞増殖因子レセプター−５（ＦＧＦＲ５）と称する
、５０４アミノ酸のポリペプチド（配列番号１７）をコードする３１１２ｂｐの
核酸配列（配列番号１６）を教示する。最後に、ＷｉｅｄｅｍａｎｎおよびＴｒ
ｕｅｂ，２０００，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６９：２７５−７９は、ヒトＦＧＦＲ−
Ｌポリペプチドと配列同一性を共有する線維芽細胞増殖因子レセプター様タンパ
ク質１（ＦＧＦＲＬ１）と称する、５０４アミノ酸のポリペプチド（配列番号１
９）をコードする３０８０ｂｐの核酸配列（配列番号１８）を教示する。
（実施例３：ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡ発現）
ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を、ノーザンブロット分析によって試験した。
複数のマウスおよびヒト組織のノーザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、ヒト
ＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子の一部に対応する、３２Ｐ−ｄＣＴＰ標識した２３４ｂｐ
ＰＣＲフラグメント（実施例２を参照のこと）でプローブした。種々の細胞株か
ら単離したＲＮＡを含むさらなるブロットもまた、このプローブでスクリーニン
グした。
ノーザンブロットを、５×ＳＳＣ、３５％ 脱イオン化ホルムアミド、０．０
５％（ｗ／ｖ）ピロリン酸ナトリウム、２０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ ６
．８）、５ｍＭ ＥＤＴＡ、５×デンハルト溶液、０．２％ ＳＤＳおよび９４
μｇ／ｍｌ 変性サケ精子ＤＮＡ中、４２℃で２時間プレハイブリダイズし、つ
いで、約１ｎｇ／ｍＬの標識プローブを含む新しいプレハイブリダイゼーション
緩衝液中、４２℃で一晩ハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼーション後、フ
ィルターを、プレハイブリダイゼーション緩衝液中、室温で５分間１回、２×Ｓ
ＳＣおよび０．１％ ＳＤＳ中、室温で５分間１回、次いで２×ＳＳＣおよび０
．１％ ＳＤＳ中、４２℃で２０分間２回、洗浄した。次いで、このブロットを
オートラジオグラフィーに曝露した。
ノーザンブロットの分析（図５〜７）は、２．９ｋｂの分子量を有する単一の
転写物が、マウス肝臓、腎臓、Ｆ４およびＦ１０骨髄間質細胞、ＮＩＨ−３Ｔ３
細胞、ならびにＳＴ２骨髄間質細胞（ビタミンＤ３およびデキサメタゾンでの曝
露後の）において高度に発現されることを示した。これらの陽性サンプル中の単
一の転写物の検出は、これらの組織において、キナーゼドメインまたは他の認識
可能なドメインを含み得るより長い細胞質ドメインをコードする明らかなスプラ
イシング改変体が存在しないことを示唆する。この転写物の弱い発現は、マウス
心臓、脳、肺、骨格筋、精巣、Ｆ１０骨髄間質細胞、およびＳＴ２細胞（ビタミ
ンＤ３およびデキサメタゾンでの曝露前の）において検出された。
ノーザンブロット分析（図８〜１０）はまた、３．２ｋｂの分子量を有する転
写物がヒト組織間で高度に発現されること、および６．０ｋｂの分子量を有する
転写物がヒト膵臓で発現されることを示した。この６．０ｋｂの転写物の存在は
、機能的に異なるＦＧＦＲ−Ｌタンパク質改変体が存在し得ることを示唆する。
この３．２ｋｂ転写物の弱い発現は、肝臓、腎臓、心臓、骨格筋、脳、ならびに
細胞株ＨｅＬａ、Ｋ５６２、ＳＷ４８０、Ｍｏｌｔ４およびＲａｊｉにおいて見
られた。
ノーザンブロット分析（図１１）はまた、単一の転写物が、以下の細胞株にお
いて検出され得ることを示した：２６６−６（マウス腺房膵臓腫瘍）、ＡＲ４２
Ｊ（ラット膵臓腫瘍、外分泌）、ＣａＰａｎ Ｉ（ヒト膵臓腺癌）、ＨＩＧ−８
２（ウサギ滑膜細胞）、ＯＨＳ４（ヒト骨芽細胞）、ＳＷ１３５３（ヒト軟骨肉
腫、体液性）、ＳＷ８７２（ヒト脂肪肉腫）、Ｋ５６２（古い（すなわち、後期
継代）；慢性骨髄性白血病；後期継代）、Ｋ５６２（新しい（すなわち、初期継
代））、Ｊｕｒｋａｔ（ヒトＴ細胞株）、およびＦ４（マウス骨髄由来間質細胞
株）。ヒトおよびマウスＦＧＦＲ−Ｌ ｃＤＮＡ由来のプローブはまた、それぞ
れ、ヒトおよびマウス脂肪組織においてＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡを検出し得た（
図１２Ａ〜１２Ｂ）。
ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現をまた、ＲＮＡｓｅ保護アッセイにおいて試験
した（図１３）。シグナルは、試験したほとんどの組織において検出され、最も
高いシグナルは、褐色脂肪組織、白色脂肪組織および精巣において検出された。
ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を、標準的な技術を使用して、インサイチュハ
イブリダイゼーションによって局在化した。最も高いレベルのＦＧＦＲ−Ｌ ｍ
ＲＮＡは、白色脂肪組織および褐色脂肪組織の両方において見出され；ＦＧＦＲ
−Ｌ ｍＲＮＡ発現は、副腎および腎臓に隣接する腎周の脂肪貯留部（ｄｅｐｏ
ｔ）において検出された（図１４）。消化組織において、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮ
Ａに対応するシグナルは、小腸（十二指腸および回腸）において見出されたが、
大腸において見出されなかった（図１５）。詳細には、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡ
は、陰窩の基部（ほぼおそらく、パーネト細胞）で発現されることが見出された
。ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡ発現はまた、気管（シグナルは、気管の周囲の硝子軟
骨の環に隣接する軟骨膜細胞にわたって検出された）および子宮（強いシグナル
が、子宮管腔を裏打ちする上皮細胞にわたって検出された；図１６）において検
出された。線維軟骨（変形性関節症の関節において特徴的に存在する）は硝子軟
骨に類似するので、硝子軟骨において検出されたＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの高
い発現レベルは、変形性関節症の調節におけるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの潜在
的な臨床的有用性を示唆する。より低いレベルのＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡ発現も
また、膝関節の関節軟骨および脾臓（白脾髄（リンパ球；図１６）とは対照的に
、赤脾髄（造血性）にわたって）において検出された。より低いレベルの発現は
、卵巣、精巣および小腸において検出された。脂肪組織における高レベルのＦＧ
ＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡ発現は、いくつかの組織の脂肪組織による混入の結果として
のノーザンブロットデータの解釈における注意を正当化する。これは、ヒト膵臓
において観察された高レベルの発現について特に当てはまる可能性がある。
３つの骨髄間質細胞株（すなわち、Ｄ３、Ｆ４およびＦ１０）において検出さ
れたマウスＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現レベルは、これらの細胞株が造血幹細
胞を支持する能力と相関する。マウスＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡのもっと高い発現
は、最良の支持を提供する間質細胞株（Ｆ４およびＦ１０；図７）において検出
され、一方、はるかに低いレベルが、造血幹細胞を支持し得ない細胞株（Ｄ３）
において見出された。マウスＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡはまた、破骨細胞発生（ｏ
ｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）（このプロセスは、ｂＦＧＦによって阻
害されることが公知である（Ｊｉｍｉら、１９９６，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．１６８：３９５−４０２））の条件下で（すなわち、ビタミンＤ３および
デキサメタゾンに応答して；図１７）骨芽細胞ＳＴ２細胞において上方調節され
た。
さらに、発現分析は、マウスＦＧＦＲ−ＬポリペプチドのｍＲＮＡ発現のレベ
ルが、胎児発生の間に増加することを示し、最も低い発現が、分析した最も早い
時点（すなわち、７日目）で検出され、そして最も高い発現が、分析した最も遅
い時点（すなわち、１７日目）に検出された（図５）。
最後に、プロテオーム（ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ）分析は、マウスおよびヒトＦＧ
ＦＲ−Ｌポリペプチドの配列と同一の配列を有するペプチドが、Ｋ５６２細胞お
よびＳＶ４０で形質転換されたＡＧ２８０４細胞（ヒト線維芽細胞）から分泌さ
れることを示した。このアプローチにおいて、タンパク質混合物を、種々の細胞
株の任意の１つによって馴化した培養培地から単離し、そして質量分析に供して
個々のペプチド配列の存在を同定した。プロテオーム分析はまた、ヒトＦＧＦＲ
−Ｌポリペプチドにおける残基２３１（Ａｓｐ）および２９３（Ａｓｐ）でのＮ
結合型グリコシル化を示した。
（実施例４：抗ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗体の産生）
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗体を、マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの細胞外
ドメイン（ＥＣＤ）の一部に対応するポリペプチド（Ｄｅｓ７−ＦＧＦＲ−Ｌ／
ＥＣＤ；配列番号２０；ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの残基２８〜３６８を含む）
でウサギを免疫することによって得た。ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド−Ｆｃ融合体
構築物もまた、この細胞外ドメインの残基１〜３６６（配列番号２１および配列
番号２２）を使用して調製した。抗体を生成するための適切な手順を使用した（
例えば、ＨｕｄｓｏｎおよびＢａｙ、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ
ｙ（第２版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉ
ｏｎｓ）を参照のこと）。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗血清を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離したＥ．ｃｏｌ
ｉ由来Ｄｅｓ７−ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤおよびＣＨＯ由来ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤ
−Ｆｃタンパク質のウエスタンブロット分析において使用した。９５〜１００ｋ
Ｄおよび４０〜４５ｋＤの免疫反応性のバンドが、それぞれ、ＣＨＯ由来サンプ
ルおよびＥ．ｃｏｌｉ由来サンプルにおいて検出された（図１８）。６０〜７０
ｋＤの免疫反応性のバンドもまた、マウス脂肪組織（図１９）、２６６−６細胞
（マウス腺房膵臓腫瘍）、ＡＲ４２Ｊ（ラット膵臓外分泌腫瘍）、ＭＲＣ５細胞
（ヒト二倍体肺線維芽細胞）、ＯＨＳ４細胞（ヒト骨芽細胞）、ＳＷ１３５３細
胞（ヒト軟骨肉腫）、およびＫ５６２細胞（慢性骨髄性肉腫）において、細胞溶
解物ならびにこれらの組織および細胞株から収集した馴化培地の免疫沈降および
ウエスタンブロット後に検出された。１００〜１２０ｋＤのさらなるバンドが、
脂肪組織、ＯＨＳ４細胞およびＫ５６２細胞において検出された。この粗抗血清
をまた使用して、両方のタンパク質を免疫沈降し得た。ＦＡＣＳ分析においてこ
の粗抗血清を使用して、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド細胞表面染色は、（高いレベ
ルのＦＧＦＲ−Ｌ ＲＮＡを発現することが示された）Ｆ４骨髄間質細胞上に検
出されたが、（低いレベルのＦＧＦＲ−Ｌ ＲＮＡを発現することが示された；
図２０Ａ〜２０Ｂ）Ｄ３骨髄間質細胞上には検出されなかった。
（実施例５：ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのインビトロ特徴付け）
全長ＦＧＦＲ−ＬポリペプチドまたはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの細胞外ドメ
インをコードする構築物は、トランスフェクトされた細胞（例えば、ＣＨＯ、３
２９ ＨＥＫ、および間質細胞株）（トランスフェクトされていない細胞に対す
る安定したトランスフェクト体の数の低下および増殖速度の減少によって測定さ
れたように（図２１Ａ〜２１Ｄ））またはＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド点変異体を
コードする構築物でトランスフェクトした細胞によって、それほど寛容されない
ことがわかった。Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｄｅｓ７−ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤを骨髄間質
細胞培養物に添加した場合、ＦＧＦ媒介性であるが血清媒介性でない増殖が、阻
害された（図２２）。可溶性ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤが、ＦＧＦタンパク質によっ
て誘導される増殖を阻害するが、ＰＤＧＦまたは血清によって誘導された増殖に
対する阻害効果をそれほど有さないという観察は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドが
、ＦＧＦファミリーに対する相同性を有する天然のリガンドと、単独でかまたは
コレセプターと共に相互作用し得ることを示唆する。驚くことに、この効果は、
ＣＨＯ由来ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤ−Ｆｃ融合タンパク質を、Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｄ
ｅｓ７−ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤの代わりに使用した場合には、観察されなかった
（図２３）。同様の効果は、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＦＧＦ媒介増殖
およびＶＥＧＦ媒介増殖について得られた。ＣＨＯ由来ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチ
ドとＥ．ｃｏｌｉ由来ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドとの間の活性における差異は、
これらのＣ末端および／またはＮ末端におけるアミノ酸配列の差異に起因し得る
。
（実施例６：ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのインビボ特徴付け）
全長マウスＦＧＦＲ−Ｌおよびネオマイシン耐性遺伝子をコードする二シスト
ロン性メッセージ（またはネオマイシン耐性遺伝子単独）を保持するレトロウイ
ルスベクターで形質導入したマウス骨髄細胞を使用して、以前に記載されたよう
に（Ｙａｎら、１９９９、Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７：１４０９−１７）、
１０匹の致死的に照射したレシピエントに移植した。
これらのマウスのうちの５匹（評価のための無作為に選択した）において、４
ヶ月の期間にわたるＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの過剰発現が、総体重における１
５％の減少、血清コレステロールにおける１４％の減少、および血清トリグリセ
リドレベルにおける３５％の減少を生じた。しかし、３週間後、残りの５匹のマ
ウスを計量および採血し、そして同様の変化は観察されなかった。
ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドのインビトロ特徴付け（実施例５）は、このタンパ
ク質が、種々の細胞型によってそれほど寛容されず、その結果、ＦＧＦＲ−Ｌポ
リペプチド発現に対する選択が予測されないことを示した。上記のレトロウイル
ス構築物は、１つの二シストロン性メッセージにＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子およびネオ
マイシン耐性遺伝子の両方を保持するので、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現に対
する選択は、転写の下方調節または形質導入された細胞の除去のいずれかによる
、ｎｅｏ発現に対する対応する選択を同様に生じる。
その表現型を示す２匹のＦＧＦＲ−Ｌ／ｎｅｏ形質導入マウスおよび２匹のｎ
ｅｏ形質導入コントロールマウス由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＮ）ＲＮＡのノ
ーザンブロット分析は、コントロールマウスが、予測されたサイズのｎｅｏ転写
物の豊富な発現を示し、そしてＦＧＦＲ−Ｌ／ｎｅｏ形質導入マウスが、それを
示さないことを示した（図２４）。このことは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド発現
が、一過性の表現型の最終的な消失に対して活性に選択され、そしてその消失よ
りも優位にあることを示唆する。
本発明を、好ましい実施形態に関して記載したが、改変および変更が当業者に
想到されることが理解される。従って、添付の特許請求の範囲は、特許請求され
る本発明の範囲内にあるこのような全ての等価物を包含することが意図される。
図１Ａ〜１Ｃは、マウスＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、およびマウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定シグナルペプチド（下線部）および膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。 図１Ａ〜１Ｃは、マウスＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、およびマウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定シグナルペプチド（下線部）および膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。 図１Ａ〜１Ｃは、マウスＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号１）、およびマウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドの推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。推定シグナルペプチド（下線部）および膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。 図２Ａ〜２Ｃは、マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド（Ｓｍａｆ２−０００１７−ｆ４；配列番号２）とイベリアトゲイモリ（Ｉｂｅｒｉａｎ ｒｉｂｂｅｄ ｎｅｗｔ）（Ｐｌｅｕｒｏｄｅｌｅｓ ｗａｌｔｌｉｉ）線維芽細胞増殖因子レセプター４（ＰＩＲ：Ｂ４９１５１；配列番号７）とのアミノ酸配列アライメントを示す 図２Ａ〜２Ｃは、マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド（Ｓｍａｆ２−０００１７−ｆ４；配列番号２）とイベリアトゲイモリ（Ｉｂｅｒｉａｎ ｒｉｂｂｅｄ ｎｅｗｔ）（Ｐｌｅｕｒｏｄｅｌｅｓ ｗａｌｔｌｉｉ）線維芽細胞増殖因子レセプター４（ＰＩＲ：Ｂ４９１５１；配列番号７）とのアミノ酸配列アライメントを示す 図２Ａ〜２Ｃは、マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド（Ｓｍａｆ２−０００１７−ｆ４；配列番号２）とイベリアトゲイモリ（Ｉｂｅｒｉａｎ ｒｉｂｂｅｄ ｎｅｗｔ）（Ｐｌｅｕｒｏｄｅｌｅｓ ｗａｌｔｌｉｉ）線維芽細胞増殖因子レセプター４（ＰＩＲ：Ｂ４９１５１；配列番号７）とのアミノ酸配列アライメントを示す 図３Ａ〜３Ｂは、ヒトＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子のＮ末端部分をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号４）、およびヒトＦＧＦＲ−ＬポリペプチドのＮ末端部分の推定アミノ酸配列（配列番号５）を示す。推定シグナルペプチド（下線部）および膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。 図３Ａ〜３Ｂは、ヒトＦＧＦＲ−Ｌ遺伝子のＮ末端部分をコードするｃＤＮＡクローンのヌクレオチド配列（配列番号４）、およびヒトＦＧＦＲ−ＬポリペプチドのＮ末端部分の推定アミノ酸配列（配列番号５）を示す。推定シグナルペプチド（下線部）および膜貫通ドメイン（二重下線部）を示す。 図４は、マウスＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド（配列番号２）と、配列番号５の残基１〜４７２およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ２７７４３７の残基４７３〜５０４から構築した仮想ヒトＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド配列（配列番号８）とのアミノ酸配列アライメントを示す。推定シグナルペプチド（下線部）、膜貫通ドメイン（二重下線部）、およびＮ結合グリコシル化部位（太字）を示す。 図５は、７日目、１１日目、１５日目、および１７日目のマウス胚におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図６は、マウスの心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および精巣におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図７は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞ならびにＦ１０マウス骨髄由来間質細胞株、Ｆ４マウス骨髄由来間質細胞株、およびＤ３マウス骨髄由来間質細胞株におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図８は、ヒトの脳、心臓、骨格筋、結腸、胸腺、脾臓、腎臓、肝臓、小腸、胎盤、肺、および末梢血白血球におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図９は、前骨髄球白血病ＨＬ−６０細胞、ＨｅＬａ Ｓ３細胞、慢性骨髄性白血病Ｌ−５６２細胞、リンパ芽球性白血病ＭＯＬＴ−４細胞、バーキットリンパ腫Ｒａｊｉ細胞、結腸直腸腺癌ＳＷ４８０細胞、肺癌Ａ５４９細胞、および黒色腫Ｇ３６１細胞におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図１０は、ヒトの心臓、脳、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、および膵臓におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図１１は、２６６−６細胞、ＡＲ４２Ｊ細胞、ＣａＰａｎ Ｉ細胞、ＨＩＧ−８２細胞、ＯＨＳ４細胞、ＳＷ １３５３細胞、ＳＷ ８７２細胞、Ｋ５６２細胞（古い細胞、すなわち、継代後期細胞）、Ｋ５６２細胞（新しい細胞、すなわち、継代初期細胞）、Ｊｕｒｋａｔ細胞、およびＦ４細胞におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図１２Ａ〜１２Ｂは、ヒト脂肪組織（ヒトＦＧＦＲ−Ｌ由来プローブを使用する）およびマウス脂肪組織（マウスＦＧＦＲ−Ｌ由来プローブを使用する）におけるノーザンブロット分析により検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。 図１３は、ＲＮアーセプロテクションアッセイにおいて検出された、多数のマウス組織におけるＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。膵臓ＲＮＡサンプルにおいてサイクロフィリンバンドが存在しないことは、このサンプルが分解されたことを示唆する。 図１４は、正常成体マウスの腎周囲組織、白色脂肪組織、および褐色脂肪組織におけるインサイチュハイブリダイゼーションにより検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。（Ｈ＆Ｅ＝ヘマトキシリンおよびエオシン対比染色；ＩＳＨ＝インサイチュハイブリダイゼーション）。 図１５は、正常成体マウスの十二指腸、回腸、結腸および膵臓におけるインサイチュハイブリダイゼーションにより検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。（Ｈ＆Ｅ＝ヘマトキシリンおよびエオシン対比染色；ＩＳＨ＝インサイチュハイブリダイゼーション）。 図１６は、正常成体マウスの気管、膝関節の関節軟骨、脾臓、および子宮におけるインサイチュハイブリダイゼーションにより検出された、ＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの発現を示す。（Ｈ＆Ｅ＝ヘマトキシリンおよびエオシン対比染色；ＩＳＨ＝インサイチュハイブリダイゼーション）。 図１７は、破骨細胞生成条件下での骨芽細胞ＳＴ２細胞におけるＦＧＦＲ−Ｌ ｍＲＮＡの誘導（すなわち、ビタミンＤ３およびデキサメタゾンに対する５日間の曝露）を示す。 図１８は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗血清を使用する、Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｄｅｓ７−ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤタンパク質およびＣＨＯ由来ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＤＣ−Ｆｃタンパク質のウェスタンブロット分析の結果を示す。 図１９は、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗血清を使用する、マウスの眼（レーン１）および脂肪組織（レーン２）のウェスタンブロット分析の結果を示す。 図２０Ａ〜２０Ｂは、ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチド抗血清を使用する、Ｆ４骨髄間質細胞およびＤ３骨髄間質細胞のＦＡＣＳ分析の結果を示す。 図２１Ａは、ｒｈｕＰＤＧＦ（パネルＡ）に７２時間曝露した後の、Ｄ３骨髄間質細胞（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする構築物で形質導入されていないか、または形質導入されているかのいずれか）を使用する、増殖アッセイの結果を示す。 図２１Ｂは、ｒｈｕＦＧＦ−２（パネルＢ）に７２時間曝露した後の、Ｄ３骨髄間質細胞（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする構築物で形質導入されていないか、または形質導入されているかのいずれか）を使用する、増殖アッセイの結果を示す。 図２１Ｃは、ｒｈｕＦＧＦ−４（パネルＣ）に７２時間曝露した後の、Ｄ３骨髄間質細胞（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする構築物で形質導入されていないか、または形質導入されているかのいずれか）を使用する、増殖アッセイの結果を示す。 図２１Ｄは、ｒｈｕＦＧＦ−６（パネルＤ）に７２時間曝露した後の、Ｄ３骨髄間質細胞（ＦＧＦＲ−Ｌポリペプチドをコードする構築物で形質導入されていないか、または形質導入されているかのいずれか）を使用する、増殖アッセイの結果を示す。 図２２は、Ｅ．ｃｏｌｉ由来Ｄｅｓ７−ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤタンパク質および血清、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、またはＦＧＦ−６に曝露した後の、Ａ５−Ｆ骨髄間質細胞を使用する、増殖アッセイの結果を示す。 図２３は、ＣＨＯ由来ＦＧＦＲ−Ｌ／ＥＣＤ−Ｆｃタンパク質および血清、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ−４、またはＦＧＦ−６に曝露した後の、Ａ５−Ｆ骨髄間質細胞を使用する、増殖アッセイの結果を示す。 図２４は、２つのＦＧＦＲ−Ｌ／ｎｅｏ形質導入マウス由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＮ）ＲＮＡ（レーン１および２）、ならびに２つのｎｅｏ形質導入コントロールマウス由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＮ）ＲＮＡ（レーン３および４）のノーザンブロット分析により検出された、ネオマイシン耐性遺伝子の発現を示す。

Claims (1)

  1. 単離された核酸分子。
JP2006196258A 2000-03-22 2006-07-18 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用 Pending JP2006340720A (ja)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19137900P 2000-03-22 2000-03-22

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001569360A Division JP2003527858A (ja) 2000-03-22 2001-03-22 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009124657A Division JP2009278975A (ja) 2000-03-22 2009-05-22 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2006340720A true JP2006340720A (ja) 2006-12-21

Family

ID=22705247

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001569360A Withdrawn JP2003527858A (ja) 2000-03-22 2001-03-22 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用
JP2006196258A Pending JP2006340720A (ja) 2000-03-22 2006-07-18 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用
JP2009124657A Withdrawn JP2009278975A (ja) 2000-03-22 2009-05-22 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001569360A Withdrawn JP2003527858A (ja) 2000-03-22 2001-03-22 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2009124657A Withdrawn JP2009278975A (ja) 2000-03-22 2009-05-22 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用

Country Status (7)

Country Link
US (3) US7348162B2 (ja)
EP (1) EP1268793A2 (ja)
JP (3) JP2003527858A (ja)
AU (1) AU2001252940A1 (ja)
CA (1) CA2403572A1 (ja)
MX (1) MXPA02009224A (ja)
WO (1) WO2001070977A2 (ja)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030143676A1 (en) * 1999-03-25 2003-07-31 Genesis Research And Development Corporation Limited Fibroblast growth factor receptors and methods for their use
US7083791B2 (en) 1999-03-25 2006-08-01 Genesis Research & Development Corporation Limited Methods for enhancing immune responses by fibroblast growth factor receptor 5 polypeptides
US6797271B2 (en) 1999-03-25 2004-09-28 Genesis Research & Development Corporation Limited Methods for enhancing immune responses by fibroblast growth factor receptor 5 polypeptides
CA2427840A1 (en) * 2000-11-22 2002-07-18 Immunex Corporation Methods of using imxp-888 and imxp-888 antagonists
US20060115483A1 (en) * 2002-05-28 2006-06-01 Genesis Research And Development Corporation Limited Fibroblast growth factor receptors and methods for their use
US20050112642A1 (en) * 2002-05-28 2005-05-26 Genesis Research And Development Corporation Limited Fibroblast growth factor receptors and methods for their use
US20050009750A1 (en) * 2003-07-03 2005-01-13 Genesis Research And Development Corporation Limited Fibroblast growth factor receptors and methods for their use
US20070110752A1 (en) * 2002-05-28 2007-05-17 Genesis Research And Development Corporation Limited Fibroblast growth factor receptors and methods for their use
AU2003236557B2 (en) * 2002-06-27 2009-10-01 Verva Pharmaceuticals Pty Ltd Differentiation modulating agents and uses therefor
US20050282733A1 (en) * 2002-06-27 2005-12-22 Prins Johannes B Differentiation modulating agents and uses therefor
ES2582652T3 (es) 2006-02-10 2016-09-14 Genentech, Inc. Anticuerpos anti-FGF19 y métodos de uso de los mismos
US7842662B2 (en) 2006-11-10 2010-11-30 Cara Therapeutics, Inc. Synthetic peptide amide dimers
US8236766B2 (en) * 2006-11-10 2012-08-07 Cara Therapeutics, Inc. Uses of synthetic peptide amides
RU2500685C2 (ru) 2006-11-10 2013-12-10 Кара Терапеутикс, Инк Синтетические пептидные амиды
US8906859B2 (en) 2006-11-10 2014-12-09 Cera Therapeutics, Inc. Uses of kappa opioid synthetic peptide amides
US7713937B2 (en) * 2006-11-10 2010-05-11 Cara Therapeutics, Inc. Synthetic peptide amides and dimeric forms thereof
CA2701128A1 (en) 2007-10-01 2009-04-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 4 expression
US9173597B2 (en) 2008-09-19 2015-11-03 Bayer Healthcare Llc Analyte sensors, systems, testing apparatus and manufacturing methods
US20120189641A1 (en) 2009-02-25 2012-07-26 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy
WO2010099138A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
JP2012519282A (ja) 2009-02-27 2012-08-23 オーエスアイ・ファーマシューティカルズ，エルエルシー 間葉様腫瘍細胞またはその生成を阻害する薬剤を同定するための方法
US8642834B2 (en) 2009-02-27 2014-02-04 OSI Pharmaceuticals, LLC Methods for the identification of agents that inhibit mesenchymal-like tumor cells or their formation
CA2831867A1 (en) * 2011-03-31 2012-10-04 Kyoto University Therapeutic agent for cancer, and method for determining prognosis of cancer
EP2702173A1 (en) 2011-04-25 2014-03-05 OSI Pharmaceuticals, LLC Use of emt gene signatures in cancer drug discovery, diagnostics, and treatment
RS56090B1 (sr) * 2011-05-16 2017-10-31 Hoffmann La Roche Fgfr1 agonisti i načini primene
CN103597074A (zh) 2011-06-16 2014-02-19 Isis制药公司 成纤维细胞生长因子受体4表达的反义调节
WO2013152252A1 (en) 2012-04-06 2013-10-10 OSI Pharmaceuticals, LLC Combination anti-cancer therapy

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999063088A2 (en) * 1998-06-02 1999-12-09 Genentech, Inc. Membrane-bound proteins and nucleic acids encoding the same
US6930170B2 (en) * 1997-06-16 2005-08-16 Genentech, Inc. PRO1184 polypeptides
WO2000024756A1 (en) 1998-10-23 2000-05-04 Human Genome Sciences, Inc. Fibroblast growth factor receptor-5
US6242419B1 (en) 1999-03-25 2001-06-05 Genesis Research & Development Corporation Ltd. Compositions isolated from stromal cells and methods for their use
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JP2009278975A (ja) 2009-12-03
US20030087384A1 (en) 2003-05-08
WO2001070977A2 (en) 2001-09-27
JP2003527858A (ja) 2003-09-24
EP1268793A2 (en) 2003-01-02
US7348162B2 (en) 2008-03-25
AU2001252940A1 (en) 2001-10-03
US20080044859A1 (en) 2008-02-21
WO2001070977A3 (en) 2002-03-28
CA2403572A1 (en) 2001-09-27
US20020009776A1 (en) 2002-01-24
MXPA02009224A (es) 2003-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2006340720A (ja) 線維芽細胞増殖因子レセプター様分子およびその使用
JP2004502417A (ja) Ｂ７様分子およびその使用
JP2005508131A (ja) 線維芽細胞成長因子−２３分子およびその使用
AU2001241968A1 (en) Chordin-like-2 molecules and uses thereof
EP1266000A1 (en) Chordin-like-2 molecules and uses thereof
JP2005535297A (ja) Ｈｅｒ−２レセプターチロシンキナーゼ分子およびその使用
AU2002303091A1 (en) G-protein coupled receptor molecules and uses thereof
WO2002083736A2 (en) G-protein coupled receptor molecules and uses thereof
JP2009148256A (ja) 分泌型結腸上皮間質性−１ポリペプチド、これをコードする核酸、およびその使用
EP1585539A2 (en) Wnt-1 inhibitory factor-1 (wif-1) molecules and uses thereof
JP2008001708A (ja) 腫瘍内皮マーカー７α分子およびその使用
JP2006238894A (ja) 線維芽細胞成長因子−２３分子およびその使用
US20140273089A1 (en) Fibroblast Growth Factor Receptor-Like Molecules and Uses Thereof
JP2004514448A (ja) トランスフォーミング増殖因子β関連分子およびその使用
JP2004520083A (ja) Ａｔｐ結合カセットトランスポーター様分子およびそれらの使用
JP2007130023A (ja) Ｂ７様分子およびその使用
WO2001042465A2 (en) Chordin-like molecules and uses thereof
EP1947182A1 (en) Fibroblast growth factor-23 molecules and uses thereof
AU2005209710A1 (en) Fibroblast Growth Factor Receptor-Like Molecules and Uses Thereof
AU2004308908A1 (en) HEH4 molecules and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20080321

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20080421

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20080708

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20080711

A521 Written amendment

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20081020

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20081125

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20090205

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20090213

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20090714