JP2008001708A - 腫瘍内皮マーカー7α分子およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】新規のTEM7α核酸分子およびコードされるポリペプチド。
【選択図】なし
Description
本発明は、腫瘍内皮マーカー7α(TEM7α)ポリペプチドおよびこのポリペプチドをコードする核酸分子に関する。本発明はまた、TEM7αポリペプチドを産生するための、選択的結合因子、ベクター、宿主細胞、および方法に関する。本発明はさらに、TEM7αポリペプチドと関連する疾患、障害、状態の診断、処置、改善、および/または予防のための薬学的組成物および方法を提供する。
核酸分子の同定、クローニング、発現、および操作における技術進歩ならびにヒトゲノムの解読は、新規治療剤の発見を大きく加速した。現在、高速核酸配列決定技術は、前例のない速度で配列情報を作製し得、そしてコンピュータ分析と合わされて、重複配列を組み合わせて、ゲノムの一部および全体に集合すること、ならびにポリペプチドコード領域の同定を可能にする。既知アミノ酸配列のデータベース編集物に対する推定アミノ酸配列の比較は、以前に同定された配列および/または構造の目印に対する相同性の程度を決定することを可能にする。核酸分子のポリペプチドコード領域のクローニングおよび発現は、構造分析および機能分析のためのポリペプチド産物を提供する。核酸分子およびコードされるポリペプチドの操作は、治療剤としての使用に関して生成物に対して有利な特性を与え得る。
本発明は、新規のTEM7α核酸分子およびコードされるポリペプチドに関する。
(a)配列番号1または配列番号3のいずれかに示されるヌクレオチド配列;
(b)ATCC受託番号PTA−3199またはPTA−3200におけるDNAインサートのヌクレオチド配列;
(c)配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(d)(a)〜(c)のいずれかのヌクレオチド配列の相補体に、少なくとも中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプ
チドの活性を有する、ヌクレオチド配列;あるいは、
(e)(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列。
(a)配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドに少なくとも約70%同一であるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(b)配列番号1または配列番号3のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200におけるDNAインサートのヌクレオチド配列、または(a)のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列;
(c)少なくとも約25アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号1もしくは配列番号3のいずれかのヌクレオチド配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200におけるDNAインサートのヌクレオチド配列、または(a)もしくは(b)のヌクレオチド配列の領域であって、ここで、このポリペプチドフラグメントは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるコードポリペプチドの活性を有するか、または抗原性である、領域;
(d)少なくとも約16ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号1もしくは配列番号3のいずれかのヌクレオチド配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200におけるDNAインサートのヌクレオチド配列、または(a)〜(c)のヌクレオチド配列の領域;
(e)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(d)のいずれかの相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;あるいは
(f)(a)〜(e)のいずれかに対して相補的なヌクレオチド配列。
(a)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(b)少なくとも1つのアミノ酸挿入を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(c)少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(d)C末端短縮および/またはN末端短縮を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(e)アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端短縮、またはN末端短縮である1つの改変を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオ
チド配列;
(f)少なくとも約16ヌクレオチドのフラグメントを含む、(a)〜(e)のいずれかのヌクレオチド配列;
(g)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(f)のいずれかのヌクレオチド配列の相補体にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、ここで、このコードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;あるいは
(h)(a)〜(g)のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列。
(a)配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列;あるいは
(b)ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200におけるDNAインサートによりコードされるアミノ酸。
(a)配列番号2または配列番号4のいずれかのオルソログのアミノ酸配列;
(b)配列番号2または配列番号4のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約70%同一であるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチド活性を有する、アミノ酸配列;
(c)少なくとも約25アミノ酸残基を含む配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、ここで、このフラグメントは、配列番号2もしくは配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するか、または、抗原性である、フラグメント;あるいは
(d)配列番号2もしくは配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200におけるDNAインサートによりコードされるアミノ酸、または(a)もしくは(b)のアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列。
(a)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(b)少なくとも1つのアミノ酸挿入を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(c)少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(d)C末端短縮および/またはN末端短縮を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;ならびに
(e)アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端短縮、またはN末端短縮である少なくとも1つの改変を有する配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、ここで、このポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列。
ン;56位のグリシン;60位のグリシン;61位のトリプトファン;63位のアルギニン;66位のアルギニン;72位のグリシンもしくはアラニン;73位のヒスチジン;74位のバリン;75位のロイシン;76位のグルタミン酸;79位のリジン;82位のロイシン;96位のアラニン;97位のイソロイシン;100位のロイシン;107位のバリン;117位のバリン;120位のバリン;125位のグルタミン酸;130位のグルタミン酸;135位のバリンもしくはロイシン;140位のアルギニン;142位のヒスチジン;152位のセリン;175位のバリン;177位のイソロイシン;184位のフェニルアラニン;187位のアスパラギン酸;189位のイソロイシンもしくはロイシン;199位のバリン;224位のバリン;256位のバリン;265位のアラニン;272位のセリン;273位のグルタミン;278位のアラニン;286位のイソロイシン;287位のロイシン;293位のバリン;300位のセリン;302位のフェニルアラニン;307位のイソロイシン;314位のバリン;332位のグルタミン;341位のアスパラギン;342位のロイシン;365位のグルタミン酸;367位のロイシン;386位のグリシン;392位のセリン;395位のセリン;396位のアラニン;401位のセリン;402位のセリン;409位のセリン;414位のセリン;429位のロイシン;433位のアラニン;438位のロイシン;452位のバリン;454位のロイシン;461位のバリン;462位のロイシン;463位のアラニン;466位のロイシン;467位のイソロイシン;470位のイソロイシン;473位のアラニン;475位のイソロイシン;487位のロイシン;496位のヒスチジン;503位のヒスチジン;または524位のバリンである、少なくとも1つの保存的置換を有する配列番号4に示されるアミノ酸を含む単離されたポリペプチドであって、ここで、このポリペプチドが、配列番号4に示されるポリペプチドの活性を有する単離されたポリペプチドをさらに提供する。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する:
(項目1)
単離された核酸分子であって、以下:
(a)配列番号1または配列番号3のいずれかに示されるヌクレオチド配列;
(b)ATCC受託番号PTA−3199またはPTA−3200中のDNAインサートのヌクレオチド配列;
(c)配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;
(d)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(c)のいずれかのヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;あるいは
(e)(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
(項目2)
単離された核酸分子であって、以下:
(a)配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドと少なくとも約70%同一なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(b)配列番号1もしくは配列番号3のいずれかに示されるヌクレオチド配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200中のDNAインサートのヌクレオチド配列、または(a)のヌクレオチド配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体をコードするヌクレオチド配列;
(c)少なくとも約25アミノ酸残基のポリペプチドフラグメントをコードする、配列番号1もしくは配列番号3のいずれかのヌクレオチド配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200中のDNAインサートのヌクレオチド配列、または(a)もしくは(b)のヌクレオチド配列の領域であって、該ポリペプチドフラグメントは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるコードされるポリペプチドの活性を有するかまたは抗原性である、領域;
(d)少なくとも約16ヌクレオチドのフラグメントを含む、配列番号1もしくは配列番号3のいずれかのヌクレオチド配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200中のDNAインサートのヌクレオチド配列、または(a)〜(c)のヌクレオチド配列の領域;
(e)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(d)のいずれかのヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;あるいは
(f)(a)〜(e)のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
(項目3)
単離された核酸分子であって、以下:
(a)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(b)少なくとも1つのアミノ酸挿入を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(c)少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(d)C末端短縮および/またはN末端短縮を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(e)少なくとも1つの改変を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該改変は、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端短縮、またはN末端短縮であり、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;
(f)少なくとも約16ヌクレオチドのフラグメントを含む、(a)〜(e)のいずれかのヌクレオチド配列;
(g)少なくとも中程度にストリンジェントな条件下で、(a)〜(f)のいずれかのヌクレオチド配列の相補鎖にハイブリダイズするヌクレオチド配列であって、該コードされるポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ヌクレオチド配列;あるいは
(h)(a)〜(g)のいずれかのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列、
を含む、核酸分子。
(項目4)
項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
(項目5)
項目4に記載のベクターを含む、宿主細胞。
(項目6)
真核生物細胞である、項目5に記載の宿主細胞。
(項目7)
原核生物細胞である、項目5に記載の宿主細胞。
(項目8)
TEM7αポリペプチドを生成するプロセスであって、該ポリペプチドを発現するのに適切な条件下で、項目5に記載の宿主細胞を培養する工程、および必要に応じて、該培養物から該ポリペプチドを単離する工程、を包含する、方法。
(項目9)
項目8に記載のプロセスにより生成される、ポリペプチド。
(項目10)
前記核酸分子が、ネイティブTEM7αポリペプチドのプロモーターDNAではないプロモーターDNAを含み、該プロモーターDNAが、TEM7αポリペプチドをコードするDNAに作動可能に連結されている、項目8に記載のプロセス。
(項目11)
項目2に記載の単離された核酸分子であって、パーセント同一性が、GAP、BLASTN、FASTA、BLASTA、BLASTX、BestFit、またはSmith−Watermanアルゴリズムのコンピュータープログラムを用いて決定される、核酸分子。
(項目12)
化合物が、TEM7αポリペプチド活性またはTEM7αポリペプチド生成を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、該化合物に、項目5、6、または7のいずれかに記載の細胞を曝露する工程、および該細胞中のTEM7αポリペプチド活性またはTEM7αポリペプチド生成を測定する工程、を包含する、プロセス。
(項目13)
単離されたポリペプチドであって、以下:
(a)配列番号2もしくは配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列;または
(b)ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200中のDNAインサートによってコードされるアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
(項目14)
単離されたポリペプチドであって、以下:
(a)配列番号2または配列番号4のいずれかのオルソログのアミノ酸配列;
(b)配列番号2または配列番号4のいずれかのアミノ酸配列に少なくとも約70%同一のアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(c)配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列のフラグメントであって、該フラグメントは、少なくとも14アミノ酸残基を含み、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有するかまたは抗原性である、フラグメント;あるいは
(d)配列番号2もしくは配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列、ATCC受託番号PTA−3199もしくはPTA−3200中のDNAインサートのヌクレオチド配列、または(a)もしくは(b)のいずれかのアミノ酸配列の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体のアミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
(項目15)
単離されたポリペプチドであって、以下:
(a)少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(b)少なくとも1つのアミノ酸挿入を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(c)少なくとも1つのアミノ酸欠失を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;
(d)C末端短縮および/またはN末端短縮を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該ポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列;あるいは
(e)少なくとも1つの改変を有する、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列であって、該改変は、アミノ酸置換、アミノ酸挿入、アミノ酸欠失、C末端短縮、またはN末端短縮であり、該ポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、アミノ酸配列、
を含む、ポリペプチド。
(項目16)
項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸分子によりコードされる単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドの活性を有する、ポリペプチド。
(項目17)
項目14に記載の単離されたポリペプチドであって、パーセント同一性が、GAP、BLASTN、FASTA、BLASTA、BLASTX、BestFit、またはSmith−Watermanアルゴリズムのコンピュータプログラムを用いて決定される、ポリペプチド。
(項目18)
項目13、14、または15のいずれかに記載のポリペプチドに特異的に結合する、選択的結合因子またはそのフラグメント。
(項目19)
配列番号2もしくは配列番号4のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的に結合する、項目18に記載の選択的結合因子またはそのフラグメント。
(項目20)
抗体またはそのフラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目21)
ヒト化抗体である、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目22)
ヒト抗体またはそのフラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目23)
ポリクローナル抗体またはそのフラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。(項目24)
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。(項目25)
キメラ抗体またはそのフラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目26)
CDR移植抗体またはそのフラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目27)
抗イディオタイプ抗体またはそのフラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目28)
可変領域フラグメントである、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目29)
FabフラグメントまたはFab’フラグメントである、項目28に記載の選択的結合因子。
(項目30)
配列番号2または配列番号4のいずれかのアミノ酸配列を有するポリペプチドに対する特異性を有する少なくとも1つの相補性決定領域を含む、選択的結合因子またはそのフラグメント。
(項目31)
検出可能な標識に結合されている、項目18に記載の選択的結合因子。
(項目32)
TEM7αポリペプチドの生物学的活性と拮抗する、項目18に記載の選択的結合因子。(項目33)
医学的疾患、状態、または障害を処置、予防、または改善する方法であって、有効量の項目18に記載の選択的結合因子を患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目34)
前記医学的疾患、状態、または障害が、大理石骨病または骨粗鬆症である、項目33に記載の方法。
(項目35)
配列番号2または配列番号4のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドで動物を免疫することにより生成される、選択的結合因子。
(項目36)
項目1、2、または3のいずれかに記載のポリペプチドに結合し得る選択的結合因子を産生する、ハイブリドーマ。
(項目37)
項目18に記載の選択的結合因子またはフラグメントを用いて、TEM7αポリペプチドを検出またはその量を定量する方法。
(項目38)
生物学的サンプル中のGPCRポリペプチドを検出またはその量を定量するためのキットであって、項目18に記載の選択的結合因子を含む、キット。
(項目39)
項目13、14、または15のいずれかに記載のポリペプチド、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
(項目40)
前記薬学的に受容可能な処方剤が、キャリア、アジュバント、可溶化剤、安定化剤、または抗酸化剤である、項目39に記載の組成物。
(項目41)
項目13、14、または15のいずれかに記載のポリペプチドの誘導体を含む、ポリペプチド。
(項目42)
水溶性ポリマーで共有結合的に改変された、項目40に記載のポリペプチド。
(項目43)
前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、ポリ−(N−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオール、またはポリビニルアルコールである、項目42に記載のポリペプチド。
(項目44)
項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸分子、および薬学的に受容可能な処方剤を含む、組成物。
(項目45)
前記核酸分子がウイルスベクター中に含まれる、項目44に記載の組成物。
(項目46)
項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸分子を含む、ウイルスベクター。
(項目47)
異種アミノ酸配列に融合された、項目13、14、または15のいずれかに記載のポリペプチドを含む、融合ポリペプチド。
(項目48)
前記異種アミノ酸配列が、IgG定常領域またはそのフラグメントである、項目47に記載の融合ポリペプチド。
(項目49)
医学的疾患、状態、または障害を処置、予防、または改善する方法であって、有効量の項目13、14、もしくは15のいずれかに記載のポリペプチドまたは項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸によりコードされるポリペプチドを患者に投与する工程を包含する、方法。
(項目50)
前記医学的疾患、状態、または障害が、大理石骨病または骨粗鬆症である、項目49に記載の方法。
(項目51)
被験体における病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する方法であって、以下:
(a)サンプル中の、項目13、14、もしくは15のいずれかに記載のポリペプチドまたは項目1、2、もしくは3のいずれかに記載の核酸分子によりコードされるポリペプチドの存在または発現量を決定する工程;および
(b)該ポリペプチドの存在または発現量に基づき、病理学的状態または病理学的状態に対する感受性を診断する工程、
を包含する、方法。
(項目52)
デバイスであって、以下:
(a)移植に適した膜;および
(b)該膜内にカプセル化された細胞であって、項目13、14、もしくは15のいずれかに記載のタンパク質を分泌する、細胞、
を含み、該膜は、該タンパク質に対して透過性であり、そして該細胞に対して有害な物質に対して不透過性である、デバイス。
(項目53)
TEM7αポリペプチドに結合する化合物を同定する方法であって、以下:
(a)項目13、14、もしくは15のいずれかに記載のポリペプチドを化合物と接触させる工程;および
(b)該化合物に対するTEM7αポリペプチドの結合の程度を決定する工程、
を包含する、方法。
(項目54)
前記化合物に結合した場合に、前記ポリペプチドの活性を決定する工程をさらに包含する、項目53に記載の方法。
(項目55)
動物中のポリペプチドのレベルを調節する方法であって、項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸分子を該動物に登用する工程を包含する、方法。
(項目56)
項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸分子を含む、トランスジェニック非ヒト哺乳動物。
(項目57)
化合物が、TEM7αポリペプチド活性またはTEM7αポリペプチド生成を阻害するか否かを決定するためのプロセスであって、該化合物に、項目56に記載のトランスジェニック哺乳動物を曝露する工程、および該トランスジェニック哺乳動物中のTEM7αポリペプチド活性またはTEM7αポリペプチド生成を測定する工程、を包含する、方法。
(項目58)
固体支持体に結合された、項目1、2、または3のいずれかに記載の核酸分子。
(項目59)
項目1、2、または3のいずれかに記載の少なくとも1つの核酸分子を含む、核酸分子のアレイ。
(項目60)
少なくとも1つの保存的アミノ酸置換を有する、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドであって、該保存的アミノ酸置換は、10位のバリン;11位のロイシン;12位のバリンもしくはロイシン;13位のロイシン;14位のロイシン;16位のグリシン;17位のアラニン;19位のアルギニン;22位のセリン;28位のグリシン;50位のセリン;54位のアラニン;56位のグリシン;60位のグリシン;61位のトリプトファン;63位のアルギニン;66位のアルギニン;72位のグリシンもしくはアラニン;73位のヒスチジン;74位のバリン;75位のロイシン;76位のグルタミン酸;79位のリジン;82位のロイシン;96位のアラニン;97位のイソロイシン;100位のロイシン;107位のバリン;117位のバリン;120位のバリン;125位のグルタミン酸;130位のグルタミン酸;135位のバリンもしくはロイシン;140位のアルギニン;142位のヒスチジン;152位のセリン;175位のバリン;177位のイソロイシン;184位のフェニルアラニン;187位のアスパラギン酸;189位のイソロイシンもしくはロイシン;199位のバリン;224位のバリン;256位のバリン;265位のアラニン;272位のセリン;273位のグルタミン;278位のアラニン;286位のイソロイシン;287位のロイシン;293位のバリン;300位のセリン;302位のフェニルアラニン;307位のイソロイシン;314位のバリン;332位のグルタミン;341位のアスパラギン;342位のロイシン;365位のグルタミン酸;367位のロイシン;386位のグリシン;392位のセリン;395位のセリン;396位のアラニン;401位のセリン;402位のセリン;409位のセリン;414位のセリン;429位のロイシン;433位のアラニン;438位のロイシン;452位のバリン;454位のロイシン;461位のバリン;462位のロイシン;463位のアラニン;466位のロイシン;467位のイソロイシン;470位のイソロイシン;473位のアラニン;475位のイソロイシン;487位のロイシン;496位のヒスチジン;503位のヒスチジン;または524位のバリンであり、該ポリペプチドは、配列番号4に示されるポリペプチドの活性を有する、ポリペプチド。
(項目61)
配列番号15に示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
本明細書中で使用される項は、構成目的のためであり、そして、記載される構成要件を限定するように解釈されるべきでない。本願中に引用される全ての参考文献は、明確に、本明細書中に参考として援用される。
用語「TEM7α遺伝子」もしくは「TEM7α核酸分子」または「TEM7αポリヌクレオチド」とは、配列番号1または配列番号3のいずれかに示されるヌクレオチド配列
、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ATCC受託番号PTA−3199またはPTA−3200のDNAインサートのヌクレオチド配列、および本明細書中で定義される核酸分子を含むかまたはこれらからなる、核酸分子をいう。
合)のようなプロセスが挙げられるがこれらに限定されない。
いないポリペプチドに(共有結合的相互作用または非共有結合的相互作用によって)作動可能に連結している、本発明のポリペプチド、または(4)天然には存在しない本発明のポリペプチドをいう。好ましくは、この単離されたポリペプチドは、あらゆる他の混入ポリペプチドも、その治療的使用、診断的使用、予防的使用、または研究的使用を妨げるその天然の環境において見出される他の混入物も、実質的に含まない。
Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratories,1989);Davisら、Basic Methods in
Molecular Biology(Elsevier,1986);およびChuら、1981、Gene 13:197を参照のこと。このような技術を使用して、1つ以上の外因性DNA部分を適切な宿主細胞に導入し得る。
関連した核酸分子が、配列番号1、または配列番号3の核酸分子の対立遺伝子改変体またはスプライス改変体を含むこと、および上記のヌクレオチド配列のいずれかに相補的である配列を含むことが理解される。関連した核酸分子はまた、配列番号2または配列番号4のいずれかにおけるポリペプチドと比較して1以上のアミノ酸残基の置換、改変、付加および/または欠失を含むかまたは本質的にこれからなるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。このような関連したTEM7αポリペプチドは、例えば、1以上のN結合型および/もしくはO結合型グリコシル化部位の付加および/もしくは欠失、または1以上のシステイン残基の付加および/もしくは欠失を含み得る。
細書中に提供されるTEM7α配列を用いて調製され得る。TEM7αポリペプチドのDNA配列および/またはアミノ酸配列のうちの、既知配列に対して顕著な同一性を示す領域は、本明細書中に記載されるような配列アラインメントアルゴリズムを用いて容易に決定され、そしてこれらの領域を用いて、スクリーニングのためのプローブを設計し得る。
Tm(℃)=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)−600/N−0.72(%ホルムアミド)
ここで、Nは、形成される二重鎖の長さであり、[Na+]は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、%G+Cは、ハイブリッド中の(グアニン+シトシン)塩基の百分率である。不完全に一致したハイブリッドについては、融解温度は、不一致1%毎に約1℃下げられる。
015M塩化ナトリウム、0.0015Mクエン酸ナトリウムおよび20%ホルムアミドである。例として、0.015Mナトリウムイオン中で50℃の、「中程度にストリンジェントな」条件は、約21%の不一致を可能にする。
Tm=A−T塩基対あたり2℃ + G−C塩基対あたり4℃
*6×塩クエン酸ナトリウム(SSC)中のナトリウムイオン濃度は、1Mである。Suggsら,Developmental Biology Using Purified Genes、683(BrownおよびFox編、1981)を参照のこと。
1)疎水性:ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile;
2)中性親水性:Cys、Ser、Thr;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:Asn、Gln、His、Lys、Arg;
5)鎖の配向に影響を与える残基:Gly、Pro;および
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。
index)が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷特性に基づいて、ハイドロパシー指数を割り当てられている。ハイドロパシー指数は、以下である:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システイン/シスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);スレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リジン(−3.9);およびアルギニン(−4.5)。
当業者は、配列番号2または配列番号4のいずれかに示されるようなポリペプチドの適切な改変体を、周知の技術を使用して、決定し得る。活性を破壊することなく変更され得る分子の適切な領域を同定するために、当業者は、生物学的活性のために重要であるとは考えられない領域を標的化し得る。例えば、同じ種由来かまたは他の種由来の、類似の活性を有する類似のポリペプチドが既知である場合、当業者は、TEM7αポリペプチドのアミノ酸配列を、このような類似のポリペプチドに対して比較し得る。このような比較を用いて、類似のポリペプチド間で保存される分子の残基および部分を同定し得る。このような類似のポリペプチドに対して保存されていないTEM7αポリペプチドの領域における変化が、TEM7αポリペプチドの生物学的活性および/または構造にさほど不利に影響を与えない可能性があることが、理解される。当業者にはまた、比較的保存された領域においてさえ、天然に存在する残基を、活性を維持しながら化学的に類似のアミノ酸で置換し得ることが公知である(保存的アミノ酸残基置換)。従って、生物学的活性または構造のために重要であり得る領域でさえ、生物学的活性を破壊することもなく、ポリペプチド構造に悪影響を与えることもなく、保存的アミノ酸置換に供され得る。
そのタンパク質の表面に存在すると予測されるアミノ酸残基に急激な変化を起こさないように、選択し得る。なぜなら、このような残基は、他の分子との重要な相互作用に関与し得るからである。さらに、当業者は、単一のアミノ酸置換を所望のアミノ酸残基各々に含む、試験改変体を作製し得る。これらの改変体は、当業者に公知の活性アッセイを使用して、スクリーニングされ得る。このような改変体は、適切な改変体に関する情報を集めるために使用され得る。例えば、特定のアミノ酸残基に対する変更が、破壊された活性、望ましくない減少した活性、または適切でない活性を生じたことを発見した場合には、このような変化を有する改変体は、回避される。換言すれば、このような慣用的な実験から集めた情報に基づいて、当業者は、さらなる置換が単独でかまたは他の変異と組み合わせてかのいずれかで回避されるべきであるアミノ酸を、容易に決定し得る。
また、提供される。さらなる好ましいTEM7α改変体としては、1つ以上のシステイン残基が、配列番号2または配列番号4のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して欠失しているか、または別のアミノ酸(例えば、セリン)で置換されている、システイン改変体が挙げられる。システイン改変体は、TEM7αポリペプチドが、例えば不溶性の封入体の単離の後に、生物学的に活性な配置にリフォールディングされなければならない場合に、有用である。システイン改変体は、一般に、ネイティブタンパク質より少ないシステイン残基を有し、そして代表的には偶数のシステイン残基を有し、対合していないシステインから生じる相互作用を最小にする。
一つの例において、ヒトIgGヒンジ領域、CH2およびCH3領域の全てまたは一部は、当業者に公知の方法を使用してTEM7αポリペプチドのN末端またはC末端のいずれかに融合され得る。別の例において、ヒトIgGヒンジ領域、CH2領域およびCH3領域は、TEM7αポリペプチドフラグメント(例えば、TEM7αの推定細胞外部分)のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに融合され得る。
Manual(NCB/NLM/NIH Bethesda,MD);Altschulら,1990,上記)から公に入手可能である。周知のSmith Watermanアルゴリズムもまた同一性を決定するために使用され得る。
M250比較マトリクス);Henikoffら、1992、Proc.Natl.Acad.Sci USA、89:10915−19(BLOSUM62比較マトリクス))。
アルゴリズム:NeedlemaおよびWunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443−53;
比較マトリクス(Comparison matrix):BLOSUM 62(Henikoffら,上記)より;
ギャップペナルティー(Gap Penalty):12
ギャップレングスペナルティー(Gap Length Penalty):4
類似性の閾値:0。
GAPプログラムは、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメーターは、GAPアルゴリズムを使用するポリペプチド比較についてのデフォルトパラメーター(末端ギャップについてペナルティーなしで)である。
アルゴリズム:NeedlemanおよびWunsch,上記;
比較マトリクス:一致=+10、不一致=0
ギャップペナルティー:50
ギャップレングスペナルティー:3。
GAPプログラムはまた、上記パラメーターを用いて有用である。上記パラメーターは、核酸分子比較についてのデフォルトパラメーターである。
TEM7αポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子は、化学合成、cDNAライブラリースクリーニングもしくはゲノムライブラリースクリーニング、発現ライブラリースクリーニング、および/またはcDNAのPCR増幅が挙げられるがこれらに限定されない種々の方法で容易に取得され得る。
リペプチドを発現すると考えられている種々の組織供給源からcDNAライブラリーをスクリーニングし得る。さらに、配列番号1または配列番号3のいずれかに示される配列を有する核酸分子の一部または全てを使用して、ゲノムライブラリーをスクリーニングしてTEM7αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする遺伝子を同定および単離し得る。代表的には、中程度のストリンジェンシー条件または高ストリンジェンシー条件が、スクリーニングから得られる偽陽性の数を最小化するためのスクリーニングに使用される。
おける使用のために好ましいコドンを選択することによって)行われ得る。高度に発現される細菌性遺伝子のコドン嗜好(preference)のための「Eco_high.Cod」のようなコドン頻度表を組み込むコンピューターアルゴリズムが使用され得、そしてUniversity of Wisconsin Package Version 9.0(Genetics Computer Group,Madison,WI)によって提供される。他の有用なコドン頻度表としては、以下が挙げられる:「Celegans_high.cod」、「Cele_gans_low.cod」、「Drosophila_high.cod」、「Human_high.cod」、「Maize_high.cod」および「Yeast_high.cod」。
TEM7αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、標準的連結技術を使用して適切な発現ベクターに挿入される。ベクターは、代表的には、使用される特定の宿主細胞中で機能的であるように選択される(すなわち、ベクターは、宿主細胞機構に適合可能であり、その結果、遺伝子増幅および/または遺伝子発現が生じ得る)。TEM7αポリペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸分子は、原核生物宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞(バキュロウイルス系)および/または真核生物宿主細胞において増幅/発現され得る。宿主細胞の選択は、TEM7αポリペプチドが翻訳後修飾されるべきか否かに一部依存する(例えば、グリコシル化および/またはリン酸化)。そうならば、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞または哺乳動物宿主細胞が好ましい。発現ベクターの総説については、Meth.Enz.,vol.185(D.V.Goeddel編,Academic Press 1990)を参照のこと。
定のペプチダーゼを使用するような種々の手段によって、精製されたTEM7αポリペプチドから除去され得る。
ない原核生物宿主細胞のために、そのシグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、または熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列によって置換される。酵母分泌のために、そのネイティブなTEM7αポリペプチドシグナル配列は、酵母インベルターゼ、α因子、または酸ホスファターゼリーダーによって置換され得る。哺乳動物細胞発現において、このネイティブシグナル配列は十分であるが、他の哺乳動物シグナル配列が適切であり得る。
可能である場合、および使用のために選択された宿主細胞系と適合性である場合、異種プロモーターが好ましい。
;骨髄性細胞において活性な、β−グロビン遺伝子制御領域(Mogramら、1985,Nature 315:338−40;Kolliasら,1986,Cell 46:89−94);脳の稀突起神経膠細胞において活性な、ミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域(Readheadら、1987,Cell 48:703−12);骨格筋において活性な、ミオシン軽鎖−2遺伝子制御領域(Sani、1985,Nature
314:283−86);ならびに視床下部において活性な、性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域(Masonら、1986,Science 234:1372−1378)。
spp.などの種々の菌株がまた本方法において使用され得る。
0−17;Lucklow、1993、Curr.Opin.Biotechnol.4:564−72;およびLucklowら、1993、J.Virol.,67:4566−79に記載される。好ましい昆虫細胞は、Sf−9およびHi5(Invitrogen)である。
TEM7αポリペプチド発現ベクターを含む宿主細胞は、当業者に周知の標準的な培地を使用して培養され得る。この培地は、通常、細胞の増殖および生存に必要な全ての栄養分を含む。E.coli細胞を培養するために適切な培地としては、例えば、Luria
Broth(LB)および/またはTerrific Broth(TB)が挙げられる。真核生物細胞を培養するために適切な培地としては、Roswell Park Memorial Institute培地1640(RPMI 1640)、Minimal Essential Medium(MEM)および/またはDulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)が挙げられ、これらの全ては、培養される特定の細胞株に必要な血清および/または増殖因子を補充され得る。昆虫培養物についての適切な培地は、必要に応じて、イーストレート(yeastolate)、ラクトアルブミン加水分解産物、および/またはウシ胎仔血清を補充したグレース培地である。
で、宿主細胞にこれらの遺伝子を導入することによって達成され、この細胞によって、確率論的遺伝子によってコードされた1以上のタンパク質が産生される。次いで、この宿主細胞はスクリーニングされて、所望の活性を有するペプチドまたはポリペプチドを産生するクローンが同定される。
本明細書中に記載される核酸分子およびポリペプチド分子が、組換え手段および他の手段によって産生され得ることは、当業者によって認識される。
用語「選択的結合因子」は、1以上のTEM7αポリペプチドに対して特異性を有する分子を言及する。適切な選択的結合因子としては、抗体およびその誘導体、ポリペプチド、ならびに低分子が挙げられるが、これらに限定されない。適切な選択的結合因子は、当該分野で公知の方法を使用して調製され得る。本発明の例示的なTEM7αポリペプチド選択的結合因子は、TEM7αポリペプチドの特定の部分を結合し得、これにより、このポリペプチドのTEM7αポリペプチドレセプターへの結合を阻害する。
グロブリン、またはダイズトリプシンインヒビターである。また、ミョウバンのような凝集剤は、免疫応答を増強させるために使用される。免疫化後、この動物は採血され、そして血清を、抗TEM7α抗体力価についてアッセイする。
変領域を含む)を有する抗体を産生する。PCT出願番号PCT/US96/05928およびPCT/US93/06926を参照のこと。さらなる方法は、米国特許第5,545,807号、PCT出願番号PCT/US91/245およびPCT/GB89/01207、ならびに欧州特許第546073B1号および同第546073A1号に記載される。ヒト抗体はまた、宿主細胞中の組換えDNAの発現または本明細書中に記載されるようなハイブリドーマ細胞中での発現によって産生され得る。
1の抗体によって代表的に結合され、その後、第2の抗体が、この分析物に結合され、このようにして不可溶性の3部の複合体を形成する。例えば、米国特許第4,376,110号を参照のこと。第2の抗体は、検出可能な部分でそれ自体標識され得るか(直接的なサンドイッチアッセイ)、または検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定され得る(間接的なサンドイッチアッセイ)。例えば、サンドイッチアセイの1つの型は、酵素結合イムノソルベント検定法(ELISA)(この場合、検出可能な部分は、酵素である)である。
DNAマイクロアレイ技術が、本発明に従って利用され得ることが理解される。DNAマイクロアレイは、固体支持体(例えば、ガラス)上に配置される核酸の、小型で高密度のアレイである。アレイ内の各セルまたはエレメントは、相補的な核酸配列(例えば、mRNA)とのハイブリダイゼーションのための標的として働く単一の核酸種の多数のコピーを含む。DNAマイクロアレイ技術を用いた発現プロファイリングにおいて、mRNAはまず、細胞または組織サンプルから抽出され、次いで、蛍光標識されたcDNAに酵素的に転換される。この物質は、このマイクロアレイにハイブリダイズされ、そして未結合のcDNAが洗浄によって除去される。次いで、このアレイ上に示された個々の遺伝子の発現は、各標的核酸分子に特異的に結合する標識されたcDNAの量を定量化することによって可視化される。このように、幾千もの遺伝子の発現が、生物学的材料の単一サンプルから、ハイスループットの並列様式で定量化され得る。
イスループットスクリーニングにおける選択的化合物の同定に役立つことによって向上する関連TEM7α低分子薬物発見。
TEM7αポリペプチドの化学的に改変された誘導体は、本明細書中に記載された開示を考慮して、当業者によって調製され得る。TEM7αポリペプチド誘導体は、このポリペプチドに天然に結合した分子の型または位置のいずれかにおいて異なる様式で改変される。誘導体は、1以上の天然に結合した化学的な基の欠失によって形成される分子を含み得る。配列番号2もしくは配列番号4または他のTEM7αポリペプチドのいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドは、1以上のポリマーの共有結合によって改変され得る。例えば、選択されたポリマーは、代表的に水溶性であり、その結果、それが結合するタンパク質は、水性環境(例えば、生理学的な環境)下で沈殿しない。ポリマーの混合物が、適切なポリマーの範囲内に含まれる。好ましくは、最終生成物の調製物の治療学的用途のために、このポリマーは、薬学的に受容可能である。
0154316および同第0401384;ならびに米国特許第4,179,337号。例えば、ペグ化は、本明細書において記載されるように、反応性ポリエチレングリコール分子(または、類似の反応性水溶性ポリマー)とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施され得る。アシル化反応について、選択されたポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。還元的アルキル化について、選択されたポリマーは、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。反応性アルデヒドは、例えば、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド(これは、水溶性である)であるか、またはモノC1−C10アルコキシもしくはそのアリールオキシ誘導体である(米国特許第5,252,714号を参照のこと)。
非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、または他のげっ歯類;ウサギ、ヤギ、ヒツジ、または他の家畜)は、本発明の範囲内にさらに含まれ、ここで、ネイティブTEM7αポリペプチドをコードする遺伝子は、破壊(すなわち、「ノックアウト」)されており、その結果、TEM7αポリペプチドの発現レベルは、有意に減少するかまたは完全に消失する。このような動物は、米国特許第5,557,032号に記載されるような技術および方法を用いて調製され得る。
病的状態に関連し得る。このような場合、遺伝子の発現を減少させる薬物候補の能力または病的状態を予防もしくは抑制する薬物候補の能力を試験し得る。他の例において、特定の代謝産物(例えば、ポリペプチドのフラグメント)の産生は、疾患または病的状態を生じ得るか、あるいは疾患または病的状態に関連し得る。このような場合、このような代謝産物の産生を減少させる薬物候補の能力または病的状態を予防するかもしくは抑制する薬物候補の能力を試験し得る。
いくつかの状況において、TEM7αポリペプチドの活性のモジュレーターである分子(すなわち、アゴニストまたはアンタゴニスト)を同定することが所望され得る。TEM7αポリペプチドを調節する天然の分子または合成分子は、1つ以上のスクリーニングアッセイ(例えば、本明細書において記載されるアッセイ)を用いて同定され得る。このような分子は、エキソビボ様式、または注射もしくは経口送達、移植装置などによるインビボ様式のいずれかによって投与され得る。
デキストランでコートされたセンサーチップ(これは、検出器中に位置する)への共有結合を含む。次いで、この試験化合物および他の相補的タンパク質が、同時にかまたは連続的にかのいずれかで、センサーチップを含むチャンバーに注入され得る。結合する相補的タンパク質の量は、センサーチップのデキストランコート側に物理的に会合する分子の質量の変化に基づいて評価され得、この分子の質量の変化は、検出器システムによって測定される。
tatタンパク質配列(HIV由来)は、細胞にタンパク質を内部移行するために使用され得る。例えば、Falwellら、1994、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、91:664−68を参照のこと。例えば、HIV tatタンパク質の11アミノ酸配列(Y−G−R−K−K−R−R−Q−R−R−R:配列番号7)(「タンパク質伝達ドメイン」、またはTAT PDTを呼ばれる)は、細胞の細胞膜および核膜
を横切る送達を媒介するとして記載されている。Schwarzeら、Science,285:1569−72(1999);およびNagaharaら、Nat.Med.4:1449−52(1998)を参照のこと。これらの手順において、静脈投与後に組織を貫くFITC−構築物(FITC標識化−G−G−G−G−Y−G−R−K−K−R−R−Q−R−R−R;配列番号8)が、調製され、そしてこのような構築物の細胞への結合は、蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)分析によって検出される。tat−β−gal融合タンパク質で処理された細胞は、β−gal活性を示す。注入に続いて、このような構築物の発現は、多くの組織(肝臓、腎臓、肺、心臓、および脳組織を含む)において検出され得る。これらの構築は、細胞への侵入のためにある程度のアンフォールディングを受け;細胞への侵入後にリフォールディングが必要とされ得ることが信じられている。
本発明の特定の実施形態に従って、TEM7αポリペプチドに結合する特定の細胞型の供給源を決定し得ることは有用であり得る。例えば、適切な治療の選択における補助として疾患または病理学的状態の起源を決定することは、有用であり得る。特定の実施形態において、TEM7αポリペプチドをコードする核酸は、プローブとして使用されて、このようなプローブを用いて細胞の核酸をスクリーニングすることによって、本明細書中に記載される細胞を同定し得る。他の実施形態において、抗TEM7αポリペプチド抗体を使用して、細胞におけるTEM7αポリペプチドの存在について、従って、このような細胞が、本明細書中に記載される型の細胞であるかどうかを、試験し得る。
治療組成物は、本発明の範囲内である。このようなTEM7αポリペプチド薬学的組成物は、治療有効量のTEM7αポリペプチドまたはTEM7α核酸分子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物で、含み得る。薬学的組成物は、治療有効量の1以上のTEM7αポリペプチド選択的結合因子を、投与の様式と適合するように選択された薬学的にまたは生理学的に受容可能な処方薬剤との混合物で、含み得る。
または他の有機酸)、バルキング剤(例えば、マンニトールまたはグリシン)、キレート剤(例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA))、錯化剤(例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン)、フィラー(充填剤)、単糖類、二糖類、および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン)、タンパク質(例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン)、着色剤、香味剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン)、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン(例えば、ナトリウム)、保存剤(例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン(TEM7αorhexidine)、ソルビン酸、または過酸化水素)、溶媒(例えば、グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコール)、糖アルコール(例えば、マンニトールまたはソルビトール)、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤(例えば、プルオニック(pluronic);PEG;ソルビタンエステル;ポリソルベート(例えば、ポリソルベート20またはポリソルベート80);トリトン;トロメタミン;レシチン;コレステロールまたはチロキサポール(tyloxapal))、安定性増強剤(例えば、スクロースまたはソルビトール)、張度増強剤(例えば、ハロゲン化アルカリ金属(好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム)、またはマンニトール ソルビトール)、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および/または薬学的アジュバント)。Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,A.R.Gennaro編,Mack Publishing Company 1990)。
d.Mater.Res.15:167−277,(1981)およびLanger,Chem.Tech.12:98−105,(1982))、エチレンビニルアセテート(Langerら,前出)またはポリ−D(−)−3−ヒドロキシ酪酸(欧州特許第133988号)が挙げられ得る。持続性放出組成物はまた、リポソームを含み得、これは、当該分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得る。例えば、Eppsteinら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:3688−3692,(1985);欧州特許第036676号;同第088046号;同第143949号を参照のこと。
組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または移植デバイスによって投与され得る。
NA配列を結合することによって、目的の遺伝子の特定の領域に指向され得る。この標的化DNAは、ゲノムDNA領域に相補的である(相同である)ヌクレオチド配列である。ゲノムの特定の領域に相補的である標的化DNAの小片は、DNA複製プロセスの間に親鎖との接触下に置かれる。共有される相同領域を介して内因性DNAの他の小片とハイブリダイズし、そして従って、組み換わることは、細胞内に挿入されたDNAの一般的な特性である。この相補鎖が、変異配列もしくは異なる配列またはさらなるヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドに結合された場合、これもまた、新たに合成された鎖に組換えの結果として組み込まれる。プルーフリーディング機能の結果として、この新たなDNA配列が、テンプレートとして作用することが可能である。このように、この移入されたDNAは、ゲノム内に組み込まれる。
域のすぐ上流に位置する組換え部位に組み込ませる(BaubonisおよびSauer,Nucleic Acids Res.,21:2025−2029,1993;O’Gormanら,Science,251:1351−1355,1991)。転写を増大させることが公知の任意の隣接配列(例えば、エンハンサー/プロモーター、イントロン、翻訳エンハンサー)は、このプラスミド内に適切に配置された場合に、新たな転写単位または改変された転写単位を作製するような様式で組み込み、この細胞の内因性TEM7α遺伝子からの新規のTEM7αポリペプチド産生または増大したTEM7αポリペプチド産生を生じる。
さらなる配列は、岡崎フラグメントとして働き、そして新たに合成されたDNA娘鎖に組み込まれる。よって、本発明は、標的配列として使用され得る、TEM7αポリペプチドをコードするヌクレオチドを含む。
るDNA分子、形質転換された細胞を同定するための標識として有用なDNA分子、ネガティブ選択系、細胞特異的結合因子(例えば、細胞標的化のための)、細胞特異的内部移行因子、ベクターからの発現を増強する転写因子、ならびにベクター産生を可能にする因子を含み得る。
Inc.に対する米国特許第5,741,679号および同5,834,186号に記載される。
ポソームキャリアに関する)、同第5,593,875号(リン酸カルシウムトランスフェクションのための方法を記載する)、および同第4,945,050号(プロセス(ここで、生物学的に活性な粒子が、ある速度で細胞にて推進され、これによりこの粒子が細胞の表面を貫通しそして細胞の内部へ組み込まれる)を記載する)およびPCT公開番号WO96/40958(核リガンドに関する)。
TEM7αの核酸分子、ポリペプチド、ならびにそれらのアゴニストおよびアンタゴニストを使用して、多くの疾患、障害または状態(本明細書中に列挙されるものを含む)を処置、診断、改善または予防し得る。
これに限定されない)は、腎臓に関与する疾患の処置または診断に有用であり得る。このような疾患の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない:多発性嚢胞腎疾患、および急性腎不全。腎臓に関連する他の疾患は、本発明の範囲内に含まれる。
本発明の核酸分子(それ自体は生物学的に活性なポリペプチドをコードしない核酸分子を含む)を使用して、TEM7α遺伝子および関連遺伝子の染色体上の位置をマッピングし得る。マッピングは、PCR増幅およびインサイチュハイブリダイゼーションのような、当該分野において公知の技術によって行われ得る。
に、TEM7αポリペプチドに結合し得るか、またはTEM7αポリペプチドに特徴的な活性の少なくとも1つを増加する(TEM7αポリペプチドの薬物動態学を増加させることを含む)ようにポリペプチドに結合し得る。
一般に、Sambrookら(上述)に記載されるような材料および方法を使用して、マウスTEM7αポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングおよび分析した。
よび5’−G−C−C−A−G−T−A−C−T−G−G−T−G−C−T−G−C−T−C−3’(配列番号10))を使用するPCRによってマウス肺第1鎖cDNA(Clontech)より単離した。この増幅反応において生成したPCR産物を、pCRIIベクターにサブクローニングし、そして配列決定した。ヒトTEM7α遺伝子についてのコンセンサス配列を、少なくとも4つのクローンについて得られた配列より導き出した。
。ヒトのTEM7α配列およびTEM7配列ならびにマウスのTEM7α配列およびTEM7配列(図4A〜4B)のClustal W整列は、ヒトTEM7αポリペプチドが多くの位置で非保存的アミノ酸置換を許容し、さらに保存的アミノ酸置換がヒトTEM7αアミノ酸配列中のいくつかの他の位置(例えば、位置50、72、82、175、386、396、402および470で)で起こり得ることを示唆する。Conserved
Domain Database(主にSmartデータベースおよびPfamデータベース由来の機能ドメインおよび構造ドメインの収集)に対するヒトおよびマウスのTEM7αオルソログのBLAST分析は、これらのタンパク質が少なくとも1つの保存されたタンパク質ドメイン(すなわち、Plexinリピートドメイン(いくつかの細胞外レセプター(Plexinレセプター、マホガニーレセプターおよびMetレセプターを含む)中に見出されるシステインリッチドメイン)(図5))をまた有することを示した。ここで、このシステイン残基は、ジスルフィド結合の形成に関与し得る。BLAST分析はまた、マウスTEM7αアミノ酸配列がまたNIDOドメイン(ニドゲン(nidogen)(エンタクチン(entactin))に見られる細胞外ドメイン)を有することを示した。
*推定のエキソン/イントロン連結を、Fichant,1992によって記載されるように同定した;コンセンサススプライシングドナー配列およびアクセプター配列中の不変
のヌクレオチドに下線を付した;エキソン配列を大文字で、そしてイントロン配列を小文字で示した。
ヒトTEM7αの発現を、実施例1に記載したような推定のエキソン配列由来のアンプリマー(5’−G−C−T−T−C−A−C−A−G−A−C−C−T−G−C−T−G−C−3’;配列番号11、および5’−A−A−T−G−T−G−A−A−G−C−T−T−C−C−C−A−G−G−3’;配列番号12)を使用するPCRによって分析した。予想したPCR産物(527bp)を、心臓、肺、腎臓、膵臓、胎盤、脳および骨格筋において検出した。予想したPCR産物を、肝臓には検出しなかった。肺および腎臓で検出した高発現のTEM7αは、TEM7の発現パターン(St.Croixら、2000、Science 289:1197−202)と類似する。TEM7もまた、結腸直腸腫瘍における血管の内皮コンパートメントで上昇したことを示した。TEM7(およびTEMファミリーの他のメンバー)の発現もまた、肺、胸部、脳および膵臓の肉腫および原発性腫瘍で示した。さらに、TEM発現を、転移性内皮組織で示した。
cassette)(Molecular Dynamics,Piscataway,NJ)中で一晩露光し、ホスホロ画像化リーダーで走査した。図7は、ノザンブロット分析によって検出した場合のTEM7α mRNAの発現を示す。
ける。正常な胎児および成体のマウス組織のパネルを、4%パラホルムアルデヒド中で固定し、パラフィン中で包埋し、そして5μmで切片化する。切片化した組織を、0.2M
HCl中で透過性にし、プロテイナーゼKで消化し、そしてトリエタノールアミンおよび無水酢酸でアセチル化する。切片を、ハイブリダイゼーション溶液(300mM NaCl、20mM Tris−HCl(pH8.0)、5mM EDTA、1×デンハルト溶液、0.2%SDS、10mM DTT、0.25mg/ml tRNA、25μg/mlポリA、25μg/mlポリCおよび50%ホルムアミド)中にて60℃で1時間プレハイブリダイズし、次いで、10%デキストランおよび2×104cpm/μlの33P−標識したアンチセンスリボプローブ(ヒトTEM7α遺伝子に相補的)を含む同一の溶液中にて60℃で一晩ハイブリダイズする。このリボプローブを、標準的技術を使用して、ヒトTEM7α cDNA配列を含むクローンのインビトロ転写によって得る。
(A.細菌でのTEM7αポリペプチド発現)
PCRを使用して、TEM7αポリペプチドをコードするテンプレートDNA配列の5’末端および3’末端に対応するプライマーを用いてこの配列を増幅する。この増幅したDNA産物を、発現ベクターへの挿入を可能にするための制限酵素部位を含むように改変し得る。PCR産物をゲル精製し、そして標準的組換えDNA方法論を使用して発現ベクターに挿入する。luxプロモーター、およびカナマイシン耐性をコードする遺伝子を含む例示的ベクター(例えば、pAMG21(ATCC番号98113))を、挿入したDNAの指向性クローニングのためにBamHIおよびNdeIで消化する。連結した混合物を、エレクトロポレーションによってE.coli宿主株に形質転換し、そして形質転換体を、カナマイシン耐性について選択する。選択したコロニーからプラスミドDNAを単離し、そして挿入物の存在を確認するためにDNA配列決定に供する。
を、5mLのPercoll溶液(75%液体Percollおよび0.15M NaCl)中で均一に懸濁するまでホモジナイズし、次いで、希釈し、21,600×gで30分間遠心分離する。封入体を含む勾配画分を回収し、そしてプールする。単離した封入体を、SDS−PAGEによって分析する。
PCRを使用して、TEM7αポリペプチドをコードするテンプレートDNA配列の5’末端および3’末端に対応するプライマーを用いてこの配列を増幅する。この増幅したDNA産物を、発現ベクターへの挿入を可能にするための制限酵素部位を含むように改変し得る。PCR産物をゲル精製し、そして標準的組換えDNA方法論を使用して発現ベクターに挿入する。エプスタインバーウイルス複製起点を含む例示的発現ベクター(pCEP4(Invitrogen,Carlsbad,CA)を、293−EBNA−1細胞でのTEM7αポリペプチドの発現のために使用し得る。増幅およびゲル精製したPCR産物を、pCEP4ベクターに連結し、そしてリポフェクションによって293−EBNA細胞に形質導入する。トランスフェクトした細胞を、100μg/mLハイグロマイシンにて選択し、そして生じた薬物耐性培養物を、コンフルエントまで増殖させる。次いで、この細胞を、無血清培地中で72時間培養する。馴化培地を回収し、そしてTEM7αポリペプチド発現をSDS−PAGEによって分析する。
TEM7αポリペプチド発現構築物を、リポフェクションプロトコルまたはリン酸カルシウムプロトコルのいずれかを使用して293EBNA細胞またはCHO細胞に導入する。
に透析し、そして−70℃で保存する。
TEM7αポリペプチドに対する抗体を、生物学的に生成した精製タンパク質または化学合成したTEM7αペプチドで免疫することによって取得し得る。抗体生成のための適切な手順としては、HudsonおよびBay,Practical Immunology(第2版、Blackwell Scientific Publications)に記載されるような手順が挙げられる。
TEM7αポリペプチドの生物学的活性を評価するために、肝臓特異的ApoEプロモーターの制御下でTEM7αポリペプチド/Fc融合タンパク質をコードする構築物を調製する。この構築物の送達によって、TEM7αポリペプチドの機能についての情報となる病理学的変化を引き起こされることを予想する。同様に、βアクチンプロモーターの制御下で全長TEM7αポリペプチドを含む構築物を調製する。この構築物の送達によって、遍在性発現を生じることを予想する。
を形質転換し、そして形質転換体を、薬物耐性について選択する。選択したコロニーからプラスミドDNAを単離し、そして適切な挿入物の存在および変異の非存在を確認するためにDNA配列決定に供する。TEM7αポリペプチド発現ベクターを、2度のCsCl密度勾配遠心分離によって精製し、適切な制限酵素で切断し、そしてTEM7αポリペプチド導入遺伝子を含む線状化フラグメントを、ゲル電気泳動によって精製する。この精製したフラグメントを、5mM Tris(pH7.4)および0.2mM EDTA中に2mg/mLの濃度で再懸濁する。
安楽死の前に、トランスジェニック動物を秤量し、イソフルオランによって麻酔し、そして心臓穿刺によって放血させる。このサンプルを、血液学および血清化学分析に供する。放血終了(terminal exsanguination)後に、ラジオグラフィーを行う。全体的な切開の際に、主要な内臓器官を秤量分析に供する。
イオン水で水和させる。この切片を、3%過酸化水素水でクエンチし、Protein Block(Lipshaw,Pittsburgh,PA)でブロックし、そしてラットモノクローナル抗マウスB220およびCD3(Harlan,Indianapol
is,IN)中でインキュベートする。抗体結合を、色素原としてDAB(BioTek,Santa Barbara,CA)を用いて、ビオチン化ウサギ抗ラット免疫グロブリンおよびペルオキシダーゼ複合体化ストレプトアビジン(BioGenex,San Ramon,CA)によって検出する。切片を、ヘマトキシリンで対比染色する。
に対するFITC複合体化モノクローナル抗体またはPE複合体化モノクローナル抗体(0.5μg)を用いて、2〜8℃で30分間染色する。抗体結合後、細胞を洗浄し、次いで、FACScan(Beckton Dickinson)でのフローサイトメトリーによって分析する。
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