JP2009507796A - デルタ様リガンド4のモジュレーターの利用及び同定方法 - Google Patents
デルタ様リガンド4のモジュレーターの利用及び同定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009507796A JP2009507796A JP2008529354A JP2008529354A JP2009507796A JP 2009507796 A JP2009507796 A JP 2009507796A JP 2008529354 A JP2008529354 A JP 2008529354A JP 2008529354 A JP2008529354 A JP 2008529354A JP 2009507796 A JP2009507796 A JP 2009507796A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dll4
- expression
- angiogenesis
- arterial
- therapeutic polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/06—Antipsoriatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5064—Endothelial cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Marine Sciences & Fisheries (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
Abstract
ある具体例において、本発明は、デルタ様リガンド4(Dll4)シグナリングのアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法及び利用する方法を提供する。
Description
血管形成(既存の脈管構造の内皮からの新しい血管の発生)は、固体腫瘍の宿主における成長、進行、及び転移において決定的に重要な過程である。生理的に正常な血管形成において、血管内皮の、周囲間質の成分とのオートクリン、パラクリン及びアンフィクリンの相互作用は、空間的時間的に厳密に調節されている。加えて、前血管形成サイトカイン及び血管形成サイトカイン並びに成長因子のレベル及び活性は、バランスが維持されている。対照的に、活性な腫瘍の成長に必要な病理的血管形成は、持続性であって、正常な血管形成システムの調節異常を示す。固体及び造血性腫瘍型は、特に、高レベルの異常な血管形成と関連している。一層最近、ある種の白血病は、血管形成に含まれるシグナリングによっても影響を受けるということが明らかとなった。
血管形成を阻止する薬剤は、癌治療において有用である。Avastin(商標)(ベバシツマブ)、血管内皮成長因子(VEGF)に結合するモノクローナル抗体は、様々な癌の治療において効果的であることが判明している。SDF/CXCR4シグナリング経路のアンタゴニストは、腫瘍の新血管新生を阻止して、マウスモデルにおける癌に対して効果的である(Guleng等、Cancer Res. 2005年7月1日; 65(13):5864-71)。イソクマリン−2−(8−ヒドロキシ−6−メトキシ−1−オキソ−1 H−2−ベンゾピラン−3−イル)プロピオン酸(NM−3)は、生体利用可能な経口の血管形成インヒビターとして、フェーズIの臨床評価を完了している。NM−3は、内皮細胞と腫瘍細胞を直接殺し、マウスにおける種々のヒト腫瘍異種移植片の治療において有効である(Agata等、Cancer Chemother Pharmacol. 2005年6月10日; [印刷に先行する電子ジャーナル])。
血管形成は、他の、非新生物疾患の特徴である。様々な眼病、特に、増殖性網膜症及び加齢関連黄斑変性、並びに炎症性疾患例えばリウマチ様関節炎及び乾癬は、患部組織の増大した新血管新生により特徴付けられる。抗血管形成性薬剤は、これらの疾患の治療に有効である。Macugen(商標)(VEGFに結合するアプタマー)は、新血管新生性(湿潤型)加齢関連黄斑変性の治療に有効であることが判明している。リウマチ様関節炎の治療におけるTNF−アルファアンタゴニストの成功は、部分的に、炎症の生じた関節組織に対する抗血管形成効果に帰せられるものである(Feldmann等、Annu Rev Immunol. 2001;19:163-96)。
動脈形成(血管形成とは関連するが異なる過程)は、既存の血管の内腔が増大して側枝を形成するときに起きる。心筋梗塞又は末梢(例えば、四肢、腎臓など)の虚血後に、小動脈は、冒された組織への主動脈の閉塞後の血流を維持するために一層重要な伝導性血管になる。従って、動脈形成を促進する薬剤は、心筋梗塞及び他の虚血性事象を治療するために利用することができ、部分的な動脈閉塞が検出され又は疑われる虚血性事象を防止するためにも利用することができる。
Notch経路(特に、Notch1及びNotch4)は、血管形成過程に関わっている。Notchシグナリングは、一般に、細胞の増殖、分化、特化及び生存という様々な過程の調節に関係している(Artavanis-Tsakonas等、1999)。脊椎動物におけるその複雑さは、各々異なる発現パターンを有する多数のNotchレセプターとリガンドの存在により説明される。哺乳動物では、4種類のNotchレセプター(notch1〜4)及び5種類のリガンド(jagged1、2及びDll1、3及び4)がある。マウスにおいて、Notchレセプター及びリガンドの突然変異は、3つの生殖細胞系列すべてに由来する血管系を含む様々な器官における異常へと導く(Iso等、2003)。このNotch経路は、局所的細胞相互作用を介して機能し、一つの細胞の表面に存在するリガンドの細胞外ドメインは、隣接細胞上のレセプターの細胞外ドメインと相互作用する。この相互作用は、2つのADAMプロテアーゼのNotchの細胞外ドメインに対する作用とその後のγ−セクレターゼの膜貫通ドメインに対する作用を可能にし(これは、細胞内ドメインを細胞膜から遊離させて核に向かうことを可能にする)、それは、CSLと共に機能して、エンハンサー・オブ・スプリット(enhancer-of-split)ファミリーの転写リプレッサーの発現を活性化する(Mumm及びKopan, 2000)。
動脈と静脈の何れに分化するかは、長い間、主に、血圧及び酸素濃度などの物理的因子によると考えられてきた。しかしながら、最近、循環の開始より十分前に動脈又は静脈内皮細胞で特異的に発現される幾つかの遺伝子の同定が、動脈と静脈の間の第一次分化事象において、内皮細胞の遺伝的決定について重要な役割を示すようである。これらの遺伝子の内には、静脈内皮細胞で特異的に発現されるeph−B4(Adams等、1999)及び、動脈内皮細胞で特異的に発現されるephrin−B2(Adams等、1999; Gale等、2001)、notch1(Krebs等、2000)、notch4(Uyttendaele等、1996)及びdll4(Shutter等、2000)がある(他の内で)。
ゼブラフィッシュNotch同族体の突然変異を用いた研究は、動脈と静脈の内皮の分化の調節におけるこの経路の重要性を示している(内皮の動脈特異的様式で最初に発現される遺伝子は、血管内皮成長因子及びソニックヘッジホッグの下流で、ephrin経路の上流にある(Lawson等、2002))。ゼブラフィッシュ及びマウスの両方において、Notch機能が、動脈内皮細胞の運命の確立に決定的に重要であるということの増大する証拠がある(Lawson等、2002; Fischer等、2004; Duarte等、2004)。
血管形成、動脈形成及び血管の同定のための薬剤及び治療剤を提供することは、本開示のゴールである。
発明の概要
ある面において、この開示は、Notchリガンドデルタ様4(Dll4)のアゴニスト及びアンタゴニストの利用及びそれらを同定する方法を提供する。驚くべきことには、ここに教示するように、Dll4のアゴニスト及びアンタゴニストの両者は、血管形成を生じているか又は他の状況にあって、血管形成を阻止し又は破壊することが望ましい腫瘍を治療するために利用することができる。その上、この開示は、動脈形成をD114アゴニストを投与することにより刺激する方法を提供する。動脈形成は、典型的には虚血組織における、側枝動脈の形成及び成長の過程である。それ故、Dll4アゴニストは、虚血事象例えば末梢虚血又は冠状動脈虚血を患い又はその危険にある患者を治療するために利用することができる。この開示は、更に、Dll4のアップレギュレーションが、内皮細胞に動脈の個性をもたせ、Dll4の阻止が内皮細胞に静脈の個性(identity)をもたせるという発見にも関係する。それ故、この開示は、適宜、Dll4のアゴニスト又はアンタゴニストを利用することにより、静脈又は動脈の個性を変える方法を提供する。更に、この開示は、関心ある薬剤がDll4シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを評価するために利用することのできるバイオマーカーを提供する。
ある面において、この開示は、Notchリガンドデルタ様4(Dll4)のアゴニスト及びアンタゴニストの利用及びそれらを同定する方法を提供する。驚くべきことには、ここに教示するように、Dll4のアゴニスト及びアンタゴニストの両者は、血管形成を生じているか又は他の状況にあって、血管形成を阻止し又は破壊することが望ましい腫瘍を治療するために利用することができる。その上、この開示は、動脈形成をD114アゴニストを投与することにより刺激する方法を提供する。動脈形成は、典型的には虚血組織における、側枝動脈の形成及び成長の過程である。それ故、Dll4アゴニストは、虚血事象例えば末梢虚血又は冠状動脈虚血を患い又はその危険にある患者を治療するために利用することができる。この開示は、更に、Dll4のアップレギュレーションが、内皮細胞に動脈の個性をもたせ、Dll4の阻止が内皮細胞に静脈の個性(identity)をもたせるという発見にも関係する。それ故、この開示は、適宜、Dll4のアゴニスト又はアンタゴニストを利用することにより、静脈又は動脈の個性を変える方法を提供する。更に、この開示は、関心ある薬剤がDll4シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを評価するために利用することのできるバイオマーカーを提供する。
この開示は、更に、Dll4の細胞外ドメインの一部を含むモノマー性ポリペプチドが低濃度で血管形成を促進し、一層高濃度ではVEGF媒介の血管系性を阻害することを示す。可溶性Dll4ポリペプチドは、動脈化又は動脈形成をすべての濃度で促進する。従って、モノマー性可溶性Dll4ポリペプチドの適当な投与量を選択することにより、血管形成に対する種々の効果を達成することができる。ある具体例において、可溶性Dll4ポリペプチドは、SEQ ID NO:1のDSLドメイン(アミノ酸173〜233)を含むが、膜貫通部分と細胞内部分(アミノ酸552〜685)を欠く。適宜、このDll4ポリペプチドは、アミノ酸SEQ ID NO:1のアミノ酸27〜528の領域に少なくとも200アミノ酸を含む。適宜、Dll4ポリペプチドは、SEQ ID NO:1のアミノ酸27〜486(好ましくは、アミノ酸27〜524)を含む。ある具体例において、この可溶性Dll4ポリペプチドは、Fcドメイン又はポリオキシアルキレン部分(例えば、PEG)などの、望ましい薬物動力学特性を付与する部分を含む。
ある具体例において、この開示は、動脈形成を刺激する方法を提供する。かかる方法は有効量のDll4シグナリングアゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含みうる。この患者は、虚血状況を有しうるか又はその危険にありうる。この患者は、例えば狭心症を含む冠動脈疾患を有するかもしれず又は心筋梗塞を有したかもしれない。この患者は、末梢動脈疾患例えば四肢、脳又は腎臓などの器官における虚血事象又は部分的閉塞を有しうる。この患者は、虚血事象の危険があると診断されうる。
ある具体例において、この開示は、血管における動脈の特徴をもつことを促進する方法を提供する。かかる方法は、有効量のDll4シグナリングアゴニストをそれを必要とする血管に生体外で又は患者に投与することを含みうる。血管は、静脈移植片例えば伏在静脈移植片であってよい。
ある具体例において、この開示は、血管形成を阻止する方法であって、有効量のDll4シグナリングアンタゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含む当該方法を提供する。この患者は、血管形成関連疾患を有していてよい。血管形成関連疾患の例には、血管形成依存性の癌、良性腫瘍、炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び乾癬、眼の血管形成性疾患、オスラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管新生、末梢血管拡張症、出血性関節、血管線維腫、創傷顆粒形成、創傷治癒、末梢血管拡張乾癬硬皮症、発熱性肉芽腫、皮膚潮紅、関節炎及び糖尿病性新血管新生が含まれる。方法は、更に、少なくとも一種の、血管形成を阻害する抗血管形成剤投与することを含むことができる。かかる追加の薬剤は、追加的又は相乗的仕方でDll4シグナリングアンタゴニスト共に用いることができる。
ある具体例において、この開示は、血管形成を破壊する方法を提供する。かかる方法は、有効量のDll4シグナリングアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含みうる。
ある具体例において、この開示は、腫瘍の脈管構造を破壊する方法を提供する。かかる方法は、有効量のDll4シグナリングアゴニストを、それを必要とする患者に投与することを含みうる。
ある具体例において、この開示は、試験薬剤のDll4シグナリングに対する効果を評価する方法を提供する。方法は、(a)内皮系統の細胞を該試験薬剤と接触させること;及び(b)動脈又は静脈の表現型と関連する表現型を検出することを含みうる。動脈表現型を取ることを促進する試験薬剤又は静脈表現型を取ることを阻止する薬剤は、Dll4シグナリングのアゴニストであり、動脈表現型を取ることを阻止し又は静脈表現型を取ることを促進する試験薬剤は、Dll4シグナリングのアンタゴニストである。
この開示は、Dll4シグナリグのアゴニストとアンタゴニストを識別するために利用することのできる特徴を提供する。一般に、Dll4シグナリングのアゴニストは、哺乳動物内皮細胞において、動脈表現型の発現を刺激して、静脈表現型の発現を阻止する。一般に、Dll4シグナリングのアンタゴニストは、哺乳動物内皮細胞において、動脈表現型の発現を阻止して、静脈表現型の発現を刺激する。動脈及び静脈の内皮細胞を識別する如何なる公知の特徴も、動脈及び静脈の表現型を評価する目的のために検出することができる。例えば、EphrinB2の発現及びコネクシン37の発現は、動脈表現型の指標として利用することができる。他の例として、EphB4の発現は、静脈表現型の指標として利用することができる。
図面の簡単な説明
図1は、ヒトのデルタ様リガンド4タンパク質のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1;GeneBank NP_061947)を示している。シグナル配列(アミノ酸1〜26)に下線を引いてある。膜貫通ドメイン(アミノ酸532〜552)を太字にしてある。成熟タンパク質の細胞外ドメインは、アミノ酸27〜531であるが、シグナルペプチドのプロセッシングにおける不明確さは、多少長さの異なるタンパク質を生じうる。細胞内ドメインは、アミノ酸532〜685である。
図2は、ヒトのデルタ様リガンド4タンパク質(SEQ ID NO:2;GenBank NM_019074)をコードする核酸配列(cDNA)を示している。コード配列は、核酸321〜2378である。
図3.pZ/EG−mDll4遺伝子導入ベクター及びCre活性の結果。
図4.(a)E8.0のZEG−mDll4胚のLacZ染色;(b)E8.5のdt胚におけるEGFP発現。(c)E9.0のdt胚における出血及び心膜浮腫。
図5.E9.0及びE9.5dt胚並びに対照用胚の全載PECAM1免疫染色。(a)E9.0の対照用胚、(b)肥厚した背側大動脈(左下の矢印)、分岐したACV(右下矢印)及び頭部領域における未熟脈管叢(上部矢印)を示すE9.0のdt胚 (c)E9.5の対照用胚、(d)肥厚した背側大動脈及びを示すがACV、頭部領域における未熟脈管叢及び肥厚した静脈洞及び心室のサインを殆ど示さないE9.5のdt胚。染色したE9.5の胚の半断面は、dt胚(f)の大動脈が静脈洞への接続の直後で萎縮していることを示した(下部矢印)が、対照用杯(e)では、胚全体で同じ口径を維持している。dt胚(h)の体節内血管(上部矢印)は、対照用胚(g)のものより僅かに広くて短いように見える。dt胚の背側領域(下部矢印)においては、血管形成を生じることができていない。(i)E9.5の対照用胚の卵黄嚢、(j)対照用胚における脈管構造の高度に組織化された構造と対照的な一次叢の改変(remodelling)の欠如を示すdt胚の卵黄嚢。
図6.低温切片化及び細血管造影法におけるPECAM1免疫染色。(a〜g) 静脈洞(下部矢印)への接続の直前での大動脈(右上矢印)とACV(左上矢印)の間の融合を示しているE9.5dt胚の一連の切片(前方−後方)。切片(a)では、ACVは、細い毛細血管の叢よりなり(左上矢印)、それらは、背大動脈との融合の直前で結合して、大きい内腔を有する単一の血管を形成する。切片(e)は、静脈洞の後方領域で、大動脈の萎縮を示している。(f、g)上述と同じ領域を描写しているE9.5の野生型胚の一連の切片。墨汁の注入を用いる細血管造影法は、胚の背大動脈とACVの間の機能的接続の存在を確認し、墨汁は、対照用胚(h)で認められる規則的な流れと対照的に、大動脈(左手矢印)から静脈洞(右手矢印)に直接流れている。
図7.dt胚における動脈マーカーの静脈での発現。E9.0dt胚に由来する低温切片の、ephrin−B2(a、b、c)及びコネキシン−37(d、e、f)特異的リボプローブを用いるイン・サイチューハイブリダイゼーション。変異型胚は、これらの動脈特異的マーカーの、背大動脈(AD)及び前心臓静脈(VCA)の両方で付随的発現を示している。対照用胚(c、f)では、予想されるように、この発現は、大動脈に限定されている。
図8.変異型胚の静脈内皮におけるNotchシグナリングのアップレギュレーション。E9.0のdt胚に由来する低温切片の、hey1(a、b、c)及びNotch1(d、e、f)特異的リボプローブを用いるイン・サイチューハイブリダイゼーション。両遺伝子は、前心臓静脈(VCA)において、アップレギュレートされるようである。対照用胚(c、f)では、予想されるように、この発現は、大動脈に限定されている。
図9.dt胚における静脈特異的マーカーのダウンレギュレーション。E9.0のdt胚に由来する低温切片のイン・サイチューハイブリダイゼーション及び免疫染色、(a)抗Eph−B4免疫染色、(c)eph−b4 mRNA、及びE9.0対照用胚、(b)抗−Eph−B4免疫染色、(d)eph−b4 mRNA。
図10は、ヒトのDll4のドメイン構造(上段)及び注釈を付けたヒトDll4のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)(下段)の図解を示している。シグナル配列及びDSLドメインには下線を引いて示してある。8つのEGF8ドメイン(EGF8)には影を付けてある。ΔXB(ΔEGF8)構築物は、19のエキストラアミノ酸(RSPSCIYRRSWRSRGAOIL)(SEQ ID NO:3)をC末端に、EGF8リピートのCAS残基の後に含む。P524−His構築物は、P524(膜貫通ドメインの前の4アミノ酸)で終端しており、C末端には6×Hisタグを有している。完全長の構築物は、Mycタグを有するか又はタグを有しない。
図11は、ニッケルカラム精製(SDS−PAGE:CBB−G250染色)後の純粋なhDll4−P524−6×Hisタンパク質(ヒスチジンタグ付きhDll4−P524)を示している。
図12.hDll4は、ヒト動脈内皮細胞(HUAEC)における管形成を阻害する。VEGFを、20ng/mlで、陽性対照として用いた。低濃度のDll4(50ng/ml又は100ng/ml)は、管形成を促進したが、500ng/mlのDll4は、管形成を阻害した。
図13.hDll4は、ヒト動脈内皮細胞(HUAEC)における萌芽を阻害する。VEGFを、20ng/mlで、陽性対照として用いた。Dll4は、100ng/ml又は200ng/mlでは、萌芽を促進したが、500ng/mlでは、阻害した。
図14.hDll4は、ヒト動脈内皮細胞(HUAEC)におけるVEGF刺激された萌芽を阻害する。VEGFを、20ng/mlで用いた。100ng/mlのDll4は、殆ど効果を有しなかったが、200ng/mlのDll4は、VEGF刺激された萌芽を阻害した。
図1は、ヒトのデルタ様リガンド4タンパク質のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1;GeneBank NP_061947)を示している。シグナル配列(アミノ酸1〜26)に下線を引いてある。膜貫通ドメイン(アミノ酸532〜552)を太字にしてある。成熟タンパク質の細胞外ドメインは、アミノ酸27〜531であるが、シグナルペプチドのプロセッシングにおける不明確さは、多少長さの異なるタンパク質を生じうる。細胞内ドメインは、アミノ酸532〜685である。
図2は、ヒトのデルタ様リガンド4タンパク質(SEQ ID NO:2;GenBank NM_019074)をコードする核酸配列(cDNA)を示している。コード配列は、核酸321〜2378である。
図3.pZ/EG−mDll4遺伝子導入ベクター及びCre活性の結果。
図4.(a)E8.0のZEG−mDll4胚のLacZ染色;(b)E8.5のdt胚におけるEGFP発現。(c)E9.0のdt胚における出血及び心膜浮腫。
図5.E9.0及びE9.5dt胚並びに対照用胚の全載PECAM1免疫染色。(a)E9.0の対照用胚、(b)肥厚した背側大動脈(左下の矢印)、分岐したACV(右下矢印)及び頭部領域における未熟脈管叢(上部矢印)を示すE9.0のdt胚 (c)E9.5の対照用胚、(d)肥厚した背側大動脈及びを示すがACV、頭部領域における未熟脈管叢及び肥厚した静脈洞及び心室のサインを殆ど示さないE9.5のdt胚。染色したE9.5の胚の半断面は、dt胚(f)の大動脈が静脈洞への接続の直後で萎縮していることを示した(下部矢印)が、対照用杯(e)では、胚全体で同じ口径を維持している。dt胚(h)の体節内血管(上部矢印)は、対照用胚(g)のものより僅かに広くて短いように見える。dt胚の背側領域(下部矢印)においては、血管形成を生じることができていない。(i)E9.5の対照用胚の卵黄嚢、(j)対照用胚における脈管構造の高度に組織化された構造と対照的な一次叢の改変(remodelling)の欠如を示すdt胚の卵黄嚢。
図6.低温切片化及び細血管造影法におけるPECAM1免疫染色。(a〜g) 静脈洞(下部矢印)への接続の直前での大動脈(右上矢印)とACV(左上矢印)の間の融合を示しているE9.5dt胚の一連の切片(前方−後方)。切片(a)では、ACVは、細い毛細血管の叢よりなり(左上矢印)、それらは、背大動脈との融合の直前で結合して、大きい内腔を有する単一の血管を形成する。切片(e)は、静脈洞の後方領域で、大動脈の萎縮を示している。(f、g)上述と同じ領域を描写しているE9.5の野生型胚の一連の切片。墨汁の注入を用いる細血管造影法は、胚の背大動脈とACVの間の機能的接続の存在を確認し、墨汁は、対照用胚(h)で認められる規則的な流れと対照的に、大動脈(左手矢印)から静脈洞(右手矢印)に直接流れている。
図7.dt胚における動脈マーカーの静脈での発現。E9.0dt胚に由来する低温切片の、ephrin−B2(a、b、c)及びコネキシン−37(d、e、f)特異的リボプローブを用いるイン・サイチューハイブリダイゼーション。変異型胚は、これらの動脈特異的マーカーの、背大動脈(AD)及び前心臓静脈(VCA)の両方で付随的発現を示している。対照用胚(c、f)では、予想されるように、この発現は、大動脈に限定されている。
図8.変異型胚の静脈内皮におけるNotchシグナリングのアップレギュレーション。E9.0のdt胚に由来する低温切片の、hey1(a、b、c)及びNotch1(d、e、f)特異的リボプローブを用いるイン・サイチューハイブリダイゼーション。両遺伝子は、前心臓静脈(VCA)において、アップレギュレートされるようである。対照用胚(c、f)では、予想されるように、この発現は、大動脈に限定されている。
図9.dt胚における静脈特異的マーカーのダウンレギュレーション。E9.0のdt胚に由来する低温切片のイン・サイチューハイブリダイゼーション及び免疫染色、(a)抗Eph−B4免疫染色、(c)eph−b4 mRNA、及びE9.0対照用胚、(b)抗−Eph−B4免疫染色、(d)eph−b4 mRNA。
図10は、ヒトのDll4のドメイン構造(上段)及び注釈を付けたヒトDll4のアミノ酸配列(SEQ ID NO:1)(下段)の図解を示している。シグナル配列及びDSLドメインには下線を引いて示してある。8つのEGF8ドメイン(EGF8)には影を付けてある。ΔXB(ΔEGF8)構築物は、19のエキストラアミノ酸(RSPSCIYRRSWRSRGAOIL)(SEQ ID NO:3)をC末端に、EGF8リピートのCAS残基の後に含む。P524−His構築物は、P524(膜貫通ドメインの前の4アミノ酸)で終端しており、C末端には6×Hisタグを有している。完全長の構築物は、Mycタグを有するか又はタグを有しない。
図11は、ニッケルカラム精製(SDS−PAGE:CBB−G250染色)後の純粋なhDll4−P524−6×Hisタンパク質(ヒスチジンタグ付きhDll4−P524)を示している。
図12.hDll4は、ヒト動脈内皮細胞(HUAEC)における管形成を阻害する。VEGFを、20ng/mlで、陽性対照として用いた。低濃度のDll4(50ng/ml又は100ng/ml)は、管形成を促進したが、500ng/mlのDll4は、管形成を阻害した。
図13.hDll4は、ヒト動脈内皮細胞(HUAEC)における萌芽を阻害する。VEGFを、20ng/mlで、陽性対照として用いた。Dll4は、100ng/ml又は200ng/mlでは、萌芽を促進したが、500ng/mlでは、阻害した。
図14.hDll4は、ヒト動脈内皮細胞(HUAEC)におけるVEGF刺激された萌芽を阻害する。VEGFを、20ng/mlで用いた。100ng/mlのDll4は、殆ど効果を有しなかったが、200ng/mlのDll4は、VEGF刺激された萌芽を阻害した。
発明の詳細な説明
本発明は、部分的に、デルタ様リガンド4の機能が、イン・ビボでの血管形成に必須であり、更に、デルタ様リガンド4活性の増加が、動脈内皮細胞の増大した増殖及び内皮細胞による動脈個性の増大した採択と関連するという発見に基づいている。出願人は、血管形成における投薬量感受性欠如を示すマウスのDll4ノックアウト変異を生成した。その上、出願人は、Dll4過剰発現マウスモデルを生成して、Dll4の増大した発現が、ときに、動脈組織の肥厚を生じ、更には、静脈組織に動脈個性を採択させることを示した。これらの結果に基づいて、動脈及び静脈の系が生成される血管形成は、Dll4活性に高度に感受性であり、Dll4の阻害又は活性亢進によって混乱され(例えば、阻害され又は無秩序若しくは無効な仕方での血管形成を引き起こされ)うることが明らかである。それ故、驚くべきことに、Dll4のアゴニスト及びアンタゴニストの両者は、血管形成を伴う腫瘍を治療するために利用することができる。更に、この発明は、Dll4の過剰発現が、動脈の成長を刺激しえて、それ故、動脈形成を刺激するために利用することができるという発見に関係する。動脈形成は、典型的には虚血組織における、側枝動脈の形成及び成長の過程である。従って、Dll4アゴニストは、虚血事象例えば末梢若しくは冠動脈虚血を患い又はその危険にある患者を治療するために利用することができる。更に、この開示は、可溶性のモノマーDll4ポリペプチドが、血管形成を、低濃度又は高濃度で、それぞれ、阻止又は促進するように作用することができることを示している。
本発明は、部分的に、デルタ様リガンド4の機能が、イン・ビボでの血管形成に必須であり、更に、デルタ様リガンド4活性の増加が、動脈内皮細胞の増大した増殖及び内皮細胞による動脈個性の増大した採択と関連するという発見に基づいている。出願人は、血管形成における投薬量感受性欠如を示すマウスのDll4ノックアウト変異を生成した。その上、出願人は、Dll4過剰発現マウスモデルを生成して、Dll4の増大した発現が、ときに、動脈組織の肥厚を生じ、更には、静脈組織に動脈個性を採択させることを示した。これらの結果に基づいて、動脈及び静脈の系が生成される血管形成は、Dll4活性に高度に感受性であり、Dll4の阻害又は活性亢進によって混乱され(例えば、阻害され又は無秩序若しくは無効な仕方での血管形成を引き起こされ)うることが明らかである。それ故、驚くべきことに、Dll4のアゴニスト及びアンタゴニストの両者は、血管形成を伴う腫瘍を治療するために利用することができる。更に、この発明は、Dll4の過剰発現が、動脈の成長を刺激しえて、それ故、動脈形成を刺激するために利用することができるという発見に関係する。動脈形成は、典型的には虚血組織における、側枝動脈の形成及び成長の過程である。従って、Dll4アゴニストは、虚血事象例えば末梢若しくは冠動脈虚血を患い又はその危険にある患者を治療するために利用することができる。更に、この開示は、可溶性のモノマーDll4ポリペプチドが、血管形成を、低濃度又は高濃度で、それぞれ、阻止又は促進するように作用することができることを示している。
この発明は、更に、関心ある薬剤が、Dll4シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストであるかどうかを評価するために利用することのできるバイオマーカーに関係する。Dll4を含むデルタタンパク質に一般的に関係する科学文献は、特定の薬剤が、Dll4に媒介されるシグナリングを活性化又は阻害するかどうかに関して明らかにしていない。例えば、Dll4及びデルタの細胞外ドメイン(例えば、可溶性のモノマー型、欠失した細胞内ドメインを有する型、及び可溶性Fc融合物)は、様々なアッセイにて試験されてきており、観察された効果の何れかがアゴニスト若しくはアンタゴニスト活性によるものであるのかどうか、又は何らかの意味のある活性があるのかどうかは、不明のままである。更に、試薬は、Dll4シグナリングに、様々な経路で影響しうる。例えば、ある試薬は、Notch1及び/又はNotch4活性化に、又は逆行Dll4シグナリングの活性化(おそらく、Dll4細胞内ドメインにより媒介される)に影響しうる。ある試薬は、Notch1及びNotch4の両方に影響しうるプレセリンプロテアーゼ活性の活性にも影響しうる。本開示は、Dll4活性亢進が、内皮細胞の動脈表現型の採択を引き起こす(EphrinB2及びコネキシン37の発現により示される)が、機能のDll4欠如は、内皮細胞の静脈個性の採択を引き起こす(EphB4の発現により示される)ことを示す。この遺伝的に決定されたDll4活性のイン・ビボでの効果についての情報は、公知の薬剤及び新規に発見された薬剤の両者の、Dll4シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストしての同定を可能にする。
従って、ある面において、この開示は、癌並びに血管形成関連疾患及び望ましくない血管形成関連過程を治療するために利用することのできる多くのポリペプチド化合物(剤)を提供する。
Dll4は、Notchリガンドであって、シグナル配列、DSLドメイン、8つの上皮成長因子様反復、膜貫通ドメイン、及び細胞内領域を含み、これらのすべては、デルタタンパク質ファミリーのメンバーの特徴である。デルタ4mRNAの組織分布は、以前に、Notch4(Int−3)転写物について記載されたものと似ている。デルタ4の細胞外部分の可溶型は、ヒトの大動脈内皮細胞の見かけの増殖を阻害するが、ヒトの肺動脈内皮細胞の見かけの増殖は阻害しない。Yoneya等、Biochem. Vol.129, p.27-34 (2001)。
タンパク質のNotchファミリーのメンバーは、特徴的な多数の上皮成長因子(EGF)様反復並びに保存されたドメイン例えばRAM、アンキリン様反復及びPEST配列を含む膜貫通レセプターである。Notchタンパク質のリガンドは、キイロショウジョウバエのデルタ及びセレート、線虫のLAG−2及びAPX−1、並びに脊椎動物のデルタ及びセレート(又はジャッグド)を含む。これらのリガンドは又、膜貫通タンパク質でもあって、高度に保存されたDSL(デルタ−セレート−LAG−2)モチーフを、数の変化しうるEGF様反復の上流に含む。このDSLドメインは、Notchリガンドの特徴であり、タンパク質機能にとって重要であり;従って、LAG−2におけるDSLドメインの点突然変異は、活性の喪失を生じる。脊椎動物のデルタ及びジャッグド(セレート)タンパク質が類似の構造を示しても、タンパク質の各グループは又、幾つかの異なる特徴をも有する。それ故、脊椎動物のデルタタンパク質は8つのEGF様反復を含むが、ジャッグドタンパク質は、16のかかる反復を含む。更に、ジャッグドタンパク質では、これらのEGFドメインの後ろには、システインリッチなドメインが続いているが、デルタタンパク質ではそうでない。しかしながら、これらの構造的差異の重要性は、不明なままである。
Uyttendaele等(1996)は、マウスのNotch4遺伝子の完全なコード領域に相当するcDNAをクローン化した。イン・サイチューハイブリダイゼーションは、Notch4転写物が、主として、胚及び成体において内皮細胞に限られていることを示したが、これは、脊椎動物の内皮の発生におけるNotch4の役割を示唆している。
Li等(Genomics. 1998 Jul 1;51(1):45-58)は、ヒトのNOTCH4遺伝子が、30のエキソンを含み、約30kbに及ぶことを報告した。彼らは、6.7kbのNOTCH4(S)及び9.3kbのNOTCH4(L)mRNAイソ型に対応するcDNAを単離した。NOTCH4(S)によりコードされる予想されたタンパク質は、2,003アミノ酸長であり、特徴的なNotchモチーフ:1のシグナルペプチド、29の上皮成長因子(EGF)様反復、3のNotch/lin−12反復、1の膜貫通領域、6のcdc10(603151)/アンキリン反復、及びC末端のPEST保存領域を含んでいる。これらのマウス及びヒトのNOTCH4タンパク質の配列は、82%同一である。不完全にスプライシングを受けたNOTCH4(L)cDNAは、潜在的に、2つの異なるタンパク質をコードしている。第一のものは、7つのEGF反復よりなる。第二のものは、膜貫通ドメインと細胞内領域を含み、マウスのint3プロトオンコタンパク質と類似している。ノーザンブロット分析は、NOTCH4(S)が、主たる転写物であって、広範囲の組織で発現されていることを示した。
Krebs等(2000)は、遺伝子ターゲティングによってNotch4欠損マウスを生成した。この変異についてホモ接合である胚は正常に発生して、ホモ接合変異型の成体は、生存可能で繁殖可能であった。しかしながら、このNotch4変異は、関連するNotch1遺伝子のターゲティングによる変異と遺伝的相互作用を示した。Notch1変異体とNotch1/Notch4二重変異体胚の両方とも、血管形成の血管改変における重大な欠損を示した。Notchファミリーレセプターのリガンドをコードする遺伝子の発現パターンの分析は、Dll4遺伝子のみが、初期胚の脈管構造において、Notch1及びNotch4レセプターのリガンドをコードする遺伝子について予想されるものと一致するパターンで発現することを示した。それ故、血管の形態形成及び改変の調節において、Notchシグナリング経路について必須の役割があり、Notch4遺伝子は、胚発生において必須でないが、Notch4及びNotch1遺伝子は、マウスの胚発生において部分的に重複した役割を有していることを示している。
上記のように、この開示は、Dll4シグナリングのアゴニスト及びアンタゴニストを利用する方法及び同定する方法を提供する。候補のアゴニスト及びアンタゴニストは、一般に、例えば、Dll4、Notch1、Notch4及びプレゼニリンを含むDll4シグナリング経路に関係するタンパク質に結合する任意の抗体又は該タンパク質の可溶性部分である。候補のアゴニスト及びアンタゴニストは又、この経路のメンバーに結合し又は影響を及ぼす小型分子又は他の薬剤であってもよい。アンチセンス又はRNAi核酸は、Dll4、Notch1、Notch4若しくはプレゼニリン又はこのシグナリング経路の他のメンバーのアンタゴニストとして利用することができる。
薬剤の例は、下記を含む:
(a)Dll4に選択的に結合する抗体;
(b)Notch1に選択的に結合する抗体;
(c)Notch4に選択的に結合する抗体;
(d)Notch1及びNotch4に結合する抗体;
(e)Dll4のNotchレセプター結合性部分を含むポリペプチドモノマー;
(f)Dll4のNotchレセプター結合性部分を含む2以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー;
(g)Notch1又はNotch4のDll4結合性部分を含むポリペプチドモノマー;
(h)Notch1又はNotch4のDll4結合性部分を含む2以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー。
(a)Dll4に選択的に結合する抗体;
(b)Notch1に選択的に結合する抗体;
(c)Notch4に選択的に結合する抗体;
(d)Notch1及びNotch4に結合する抗体;
(e)Dll4のNotchレセプター結合性部分を含むポリペプチドモノマー;
(f)Dll4のNotchレセプター結合性部分を含む2以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー;
(g)Notch1又はNotch4のDll4結合性部分を含むポリペプチドモノマー;
(h)Notch1又はNotch4のDll4結合性部分を含む2以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー。
プレゼニリン活性又は他のメタロプロテイナーゼに干渉する薬剤(例えば、クズバニアン)は、Dll4シグナリングを変調することが予想される。これらの薬剤の各々は、上記のように、アゴニスト又はアンタゴニスト活性について評価することができる。
ある面において、この薬剤は、SEQ ID NO:1のアミノ酸27〜531に示したような、Dll4タンパク質の細胞外ドメインを含む可溶性ポリペプチドである。特定の具体例において、このDll4可溶性ポリペプチドは、Dll4タンパク質のDSLドメインを含む。
ここで用いる場合、主題の可溶性ポリペプチドは、Dll4可溶性ポリペプチドの断片、機能性変異体、及び改変型を含む。これらの主題の可溶性ポリペプチドの断片、機能性変異体、及び改変型は、Dll4のアゴニスト又はアンタゴニストとしての活性について、内皮細胞における動脈又は静脈表現型に対する効果を評価することにより試験することができる。
ある具体例において、主題の可溶性ポリペプチドの単離された断片を、Dll4をコードする核酸の対応する断片からの組換えにより生成したポリペプチドをスクリーニングすることによって得ることができる。加えて、断片は、当分野で公知の技術例えばメリフィールド固相f−Moc又はt−Boc化学を利用して化学的に合成することができる。これらの断片を、(組換え又は化学合成により)生成し、試験して、Dll4シグナリングを変調することのできるペプチド性断片を同定することができる。
ある具体例において、Dll4可溶性ポリペプチドの機能性変異体は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列の残基27〜531と少なくとも90%、95%、97%、99%又は100%同一のアミノ酸配列を含む。
ある具体例において、本発明は、機能的変異体を、主題の可溶性ポリペプチドの構造を治療若しくは予防効力又は安定性(例えば、エキス・ビボでの貯蔵寿命及びイン・ビボでのタンパク質分解への耐性)を増進させるなどの目的のために改変することによって作成することを企図する。改変された可溶性ポリペプチドを、例えば、アミノ酸の置換、欠失又は付加によって生成することができる。例えば、ロイシンのイソロイシン若しくはバリンでの、アスパラギン酸のグルタミン酸での、スレオニンのセリンでの孤立した置換、又はアミノ酸の構造的に関連したアミノ酸での類似した置換(例えば、保存的突然変異)は、その結果生成した分子の生物学的活性に大きな効果を有しないであろうと予想することは妥当なことである。保存的置換は、側鎖において関連するアミノ酸のファミリー内で起きるものである。
この発明は、更に、Dll4ポリペプチドのコンビナトリアル変異体並びに切り詰められた変異体のセットを生成する方法を企図し、これは、機能的変異体配列の同定に本質的に有用である。かかるコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする目的は、例えば、Dll4のアゴニスト又はアンタゴニストとして作用しうる可溶性ポリペプチド変異体を生成することであってよい。天然の可溶性ポリペプチドと比較して選択的効能を有するコンビナトリアル由来の変異体を生成することができる。かかる変異体タンパク質は、組換えDNA構築物から発現された場合、遺伝子治療プロトコールで利用することができる。同様に、突然変異誘発は、対応する野生型可溶性ポリペプチドと劇的に異なる細胞内半減期を有する変異体を生じうる。例えば、変化したタンパク質は、タンパク質分解又は関心あるタンパク質(例えば、可溶性ポリペプチド)の破壊若しくは不活性化を生じる他の細胞過程に対して一層安定にされうるし又は一層安定でなくされうる。かかる変異体及びそれらをコードする遺伝子を利用して、主題の可溶性ポリペプチドレベルを、それらの半減期を変調することにより変えることができる。短い半減期は、一層一過性の生物学的事象を生じうるし、誘導可能な発現系の部分の場合は、組換え可溶性ポリペプチドの細胞内レベルの一層厳密な制御を可能にしうる。上記のように、かかるタンパク質(及び特にそれらの組換え核酸構築物)は、遺伝子治療プロトコールで利用することができる。
潜在的同族体のライブラリーを、縮重オリゴヌクレオチド配列から生成することのできる多くの方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成を、自動化DNAシンセサイザーで行なうことができ、その合成遺伝子を、次いで、発現のために適当な遺伝子中に連結することができる。遺伝子の縮重セットの目的は、一の混合物中に、潜在的な可溶性ポリペプチド配列の所望のセットをコードするすべての配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は、当分野で周知である(例えば、Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura等(1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, AG Watron 編、Amsterdam: Elsevier p273-289; Itakura等(1984) Annu.Rev.Biochem.53:323; Itakura等 (1984) Science 198:1056; Ike等(1983) Nucleic Acid Res. 11:477を参照されたい)。かかる技術は、他のタンパク質の方向付けられた進化において採用されている(例えば、Scott等(1990) Science 249:386-390; Roberts等(1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin等(1990) Science 249: 404-406; Cwirla等(1990) PNAS USA 87:6378-6382;並びに米国特許第5,223,409号、5,198,346号、及び5,096,815号を参照されたい)。
或は、他の型の突然変異誘発を、コンビナトリアルライブラリーを生成するために利用することができる。例えば、可溶性ポリペプチド変異体(例えば、アンタゴニスト型)を生成して、ライブラリーから、例えばアラニンスキャニング突然変異誘発などを利用してスクリーニングすることにより(Ruf等(1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang等(1994) J.Biol.Chem. 269:3095-3099;Balint等(1993) Gene 137:109-118;Grodberg等(1993) Eur.J.Biochem. 218:597-601; Nagashima等(1993) J.Biol.Chem. 268:2888-2892);Lowman等(1991) Biochemistry 30:10832-10838;及び Cunningham等(1989) Science 244:1081-1085);リンカースキャニング突然変異誘発(Gustin等(1993) Virology 193:653-660;Brown等(1992) Mol.Cell Biol. 12:2644-2652;McKnight等(1982) Science 232:316)により;飽和突然変異誘発(Meyers等(1986) Science 232:613)により;PCR突然変異誘発(Leung等(1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19)により;又は化学的突然変異誘発などを含むランダム突然変異誘発(Miller等(1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 及び Greener等(1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)により単離することができる。リンカースキャニング突然変異誘発(特に、コンビナトリアルセッティングにおけるもの)は、切り詰められた(生物活性な)型の主題の可溶性ポリペプチドを同定するための魅力的な方法である。
当分野では、点突然変異及び切り詰めにより作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物のスクリーニングのための、そしてこの問題について、ある種の特性を有する遺伝子産物についてcDNAをスクリーニングするための広範な技術が知られている。かかる技術は、一般に、主題の可溶性ポリペプチドのコンビナトリアル突然変異誘発により生成した遺伝子ライブラリーの迅速スクリーニングに適合させることができる。最も広く利用されている大きい遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローン化すること、適当な細胞をトランスフォームしてベクターのライブラリーを生じること、及びコンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出が産物の検出された遺伝子をコードするベクターの比較的容易な単離を促進する条件下で発現させることを含む。下記の例証アッセイの各々は、コンビナトリアル突然変異誘発技術により造られた多数の縮重配列のスクリーニングに必要な高スループット分析に従順である。
ある具体例において、この発明の可溶性ポリペプチドは、更に、翻訳後修飾を含みうる。かかる修飾は、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化を含むが、これらに限られない。結果として、修飾された可溶性ポリペプチドは、非アミノ酸エレメント例えばポリエチレングリコール、脂質、多糖類又は単糖類、及びリン酸を含むことができる。かかる非アミノ酸エレメントの、可溶性ポリペプチドの機能性に対する効果は、Dll4に対するそのアゴニスト又はアンタゴニスト効果について試験することができる。
ある面において、主題の可溶性ポリペプチドの機能的変異体又は改変型は、可溶性ポリペプチドの少なくとも一部と少なくとも一つの融合ドメインとを有する融合タンパク質を包含する。かかる融合ドメインの周知の例には、ポリヒスチジン、Glu−Glu、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、チオレドキシン、プロテインA、プロテインG及び免疫グロブリン重鎖定常領域(Fc)、マルトース結合性タンパク質(MBP)が含まれる(これらは、融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィーによる単離に特に有用である)が、これらに限られない。アフィニティー精製の目的のためには、アフィニティークロマトグラフィー用の適当なマトリクス例えばグルタチオン結合樹脂、アミラーゼ結合樹脂、及びニッケル又はコバルト結合樹脂を利用する。当分野で周知の他の融合ドメインは、グリーン蛍光タンパク質(GFP)である。融合ドメインには又、通常短いペプチド配列である「エピトープタグ」も含まれ、これに対する特異的抗体を利用することができる。特異的モノクローナル抗体を容易に利用することのできる周知のエピトープタグには、FLAG、インフルエンザウイルスヘマグルチニン(HA)及びc−mycタグが含まれる。幾つかの場合には、これらの融合ドメインは、因子Xa又はトロンビンなどのプロテアーゼ開裂部位を有し、これは、適当なプロテアーゼが融合タンパク質を部分消化し、それにより、組換えタンパク質を遊離させることを可能にする。それらの遊離されたタンパク質を、次いで、その後のクロマトグラフィーによる分離によって融合ドメインから単離することができる。ある具体例において、本発明の可溶性ポリペプチドは、それらの可溶性ポリペプチドを安定化することのできる少なくとも一の改変を含む。例えば、かかる改変は、これらの可溶性ポリペプチドのイン・ビトロ半減期を増大させ、同ポリペプチドの循環半減期を増大させ又は同ポリペプチドのタンパク質分解による分解を低減させる。
ある具体例において、この発明の可溶性ポリペプチド(改変されたもの又はされてないもの)を当分野で公知の様々な技術により生成することができる。例えば、かかる可溶性ポリペプチドは、Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993)及びGrant G. A. (編)、Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992)に記載されたような標準的タンパク質化学の技術を利用して合成することができる。加えて、自動化ペプチドシンセサイザーが、市販されている(例えば、Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600)。或は、これらの可溶性ポリペプチド、それらの断片又は変異体を、当分野で周知の様々な発現系(下記参照)を利用して組換えにより生成することができる。
ある面において、この発明は、Dll4ポリペプチドをコードする単離された及び/又は組換えの核酸に関係する。主題の核酸は、一本鎖又は二本鎖のDNA又はRNA分子であってよい。これらの核酸は、治療剤として有用でありうる。例えば、これらの核酸は、細胞又は個人に治療剤として投与される組換え可溶性ポリペプチドの作成に有用である。或は、これらの核酸は、細胞又は個人に治療剤として(遺伝子治療などにおいて)直接投与することができる。
ある具体例において、この発明は、SEQ ID NO:2に描いたヌクレオチド配列の一領域と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%又は100%同一である単離された又は組換えの核酸配列を提供する。当業者は、主題の核酸に相補的な核酸配列及び主題の核酸の変異体も又、この発明の範囲内にあることを認めよう。更なる具体例において、この発明の核酸配列は、単離することができ、異質ヌクレオチド配列と組み換え及び/又は融合することができ、又はDNAライブラリー中にあってよい。
他の具体例において、この発明の核酸は又、高度にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:2に描いたヌクレオチド配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列、又はそれらの相補的配列を含む。上記のように、当業者は、DNAハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェントな条件は、変えることができるということを容易に理解できよう。当業者は、DNAハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェントな条件は、変化しうるということを容易に理解するであろう。例えば、ハイブリダイゼーションを、6.0×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)で、約45℃で行なって、その後、2.0×SSCにより50℃で洗うことができよう。例えば、洗浄工程での塩濃度は、約2.0×SSC(50℃)の低ストリンジェンシー〜約0.2×SSC(50℃)の高ストリンジェンシーから選択することができる。加えて、この洗浄工程での温度は、低ストリンジェンシー条件の室温(約22℃)から高ストリンジェンシー条件の約65℃まで増大させることができる。温度と塩の両方を変えることができ又は温度若しくは塩濃度を他を変えつつ一定に維持することができる。一具体例において、この発明は、6×SSC(室温)の低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズした後に2×SSC(室温)で洗浄した核酸を提供する。
主題の核酸と遺伝コードの縮重のために異なる単離された核酸も又、この発明の範囲内にある。例えば、幾つかのアミノ酸が、一のトリプレット以上によって指定される。同じアミノ酸を特定するコドン、即ちシノニム(例えば、CAU及びCACは、ヒスチジンのシノニムである)は、タンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない「サイレント」突然変異を生じうる。しかしながら、主題のタンパク質のアミノ酸配列の変化へと導くDNA配列の多型が哺乳動物細胞間には存在するということが予想される。当業者は、特定のタンパク質をコードする核酸の少なくとも一つのヌクレオチドにおけるこれらの変異(最大でヌクレオチドの3〜5%)が、自然の対立遺伝子変異のために、所定の種の個体間に存在しうるということを認めよう。任意の及びすべてのかかるヌクレオチド変異及びその結果生じるアミノ酸の多型は、この発明の範囲内にある。
ある具体例において、この発明の組換え核酸は、発現用構築物中の少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列に操作可能に結合することができる。調節用ヌクレオチド配列は、一般に、発現のために用いる宿主細胞に適している。多くの種類の適当な発現ベクター及び適当な調節配列は、様々な宿主細胞について当分野で公知である。典型的には、該少なくとも一つの調節用ヌクレオチド配列には、プロモーター配列、リーダー又はシグナル配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、並びにエンハンサー又はアクチベーター配列が含まれるが、これらに限られない。当分野で公知の構成的及び誘導性プロモーターは、この発明により企図される。これらのプロモーターは、天然のプロモーターであってよいし、又は一つより多くのプロモーターのエレメントを結合したハイブリッドプロモーターであってもよい。発現用構築物は、細胞中で、エピソーム例えばプラスミドとして存在してよいし、又は染色体内に挿入されていてもよい。好適具体例において、この発現ベクターは、トランスフォームされた宿主細胞の選択を可能にする選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、当分野で周知であり、用いる細胞によって変わる。
この発明のある面において、主題の核酸は、Dll4ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターにおいて与えられて、少なくとも一つの調節配列に操作可能に結合される。調節配列は、当分野で認められており、可溶性ポリペプチドの発現を指示するように選択される。従って、用語調節配列は、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御エレメントを包含する。典型的な調節配列は、Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。例えば、DNA配列を操作可能に結合した場合にその発現を制御する任意の様々な発現制御配列を、これらのベクターにおいて利用して、可溶性ポリペプチドをコードするDNA配列を発現させることができる。かかる有用な発現制御配列には、例えば、SV40の初期及び後期プロモーター、tetプロモーター、アデノウイルス若しくはサイトメガロウイルス最初期プロモーター、lacシステム、trpシステム、TAC若しくはTRCシステム、T7プロモーター(その発現は、T7RNAポリメラーゼにより指示される)、ラムダファージの主要オペレーター及びプロモーター、fdコートタンパク質の制御領域、3−ホスホグリセレートキナーゼ若しくは他の糖分解酵素のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター(例えば、Pho5)、酵母のα交配因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター及び 原核若しくは真核細胞又はそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することの知られた他の配列これらの様々な組合せが含まれる。発現ベクターのデザインは、かかるトランスフォームすべき宿主細胞の選択及び/又は発現を所望するタンパク質の種類などの因子に依存しうるということは理解されよう。その上、ベクターのコピー数、そのコピー数及びそのベクターによりコードされる任意の他のタンパク質(抗生物質マーカーなど)の発現を制御する能力も又、考慮すべきである。
この発明は又、少なくとも一種の主題の可溶性ポリペプチドのコード配列を含む組換え遺伝子でトランスフェクトされた宿主細胞にも関係する。この宿主細胞は、任意の原核細胞又は真核細胞であってよい。例えば、この発明の可溶性ポリペプチドは、細菌細胞(例えば、大腸菌)、昆虫細胞(例えば、バキュロウイルス発現系を利用)、酵母、又は哺乳動物細胞において発現させることができる。他の適当な宿主細胞は、当業者に公知である。
従って、本発明は、更に、主題の可溶性ポリペプチドを製造する方法に関係する。例えば、Dll4可溶性ポリペプチドをコードする発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を、Dll4可溶性ポリペプチドの発現を可能にして生じさせるのに適した条件下で培養することができる。このDll4可溶性ポリペプチドは、該可溶性ポリペプチドを含む細胞及び培地の混合物から分泌させて単離することができる。或は、これらの可溶性ポリペプチドは、細胞質に維持するか又は膜画分に維持することができ、そしてこれらの細胞を収穫し、溶解させて、該タンパク質を単離することができる。細胞培養物は、宿主細胞、培地及び他の副産物を含む。細胞培養に適した培地は、当分野で周知である。これらの可溶性ポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、又は両者から、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、限外濾過、電気泳動、及び免疫アフィニティー精製(可溶性ポリペプチドの特定のエピトープに特異的な抗体を利用)を含むタンパク質の精製のための当分野で公知の技術を利用して単離することができる。好適具体例において、この可溶性ポリペプチドは、その精製を容易にするドメインを含む融合タンパク質である。
この発明の組換え核酸は、クローン化遺伝子又はその一部分を、原核細胞、真核細胞(酵母、昆虫又は哺乳動物)又は両方における発現に適したベクター内に連結することにより生成することができる。組換え可溶性ポリペプチドの生成のための発現用ビヒクルは、プラスミド又は他のベクターを包含する。例えば、適当なベクターには、次の種類のプラスミドが含まれる:pBR322由来のプラスミド、pEMBL由来のプラスミド、pEX由来のプラスミド、pBTac由来のプラスミド及びpUC由来のプラスミド(大腸菌などの原核細胞における発現用)。
好適な哺乳動物用発現ベクターは、該ベクターの細菌における増殖を促進するための原核配列と、真核細胞で発現される一種以上の真核生物用転写ユニットの両方を含む。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2−dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko−neo、及びpHyg由来のベクターは、真核細胞のトランスフェクションに適した哺乳動物発現ベクターの例である。これらのベクターの幾つかは、原核及び真核細胞の両方で複製及び薬物耐性を促進するために、細菌プラスミド由来の配列例えばpBR322により改変される。或は、ウシパピローマウイルス(BPV−1)、又はエプスタイン−バールウイルス(pHEBo、pREP由来の及びp205)などのウイルスの誘導体を、タンパク質の真核細胞における一過性発現のために利用することができる。他のウイルス性発現系(レトロウイルスを含む)の例は、下記の遺伝子治療送達系の記載に見出すことができる。プラスミドの調製及び宿主生物体のトランスフォーメーションにおいて用いらるこれらの様々な方法は、当分野で周知である。原核細胞及び真核細胞の両方のための他の適当な発現系並びに一般的な組換え手順については、Molecular Cloning A Laboratory Manual, 第二版、Sambrook, Fritsch及びManiatis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、第16及び17章を参照されたい。幾つかの例においては、組換え体SLC5A8ポリペプチドを、バキュロウイルス発現系の利用によって発現することが望ましい。かかるバキュロウイルス発現系の例には、pVL由来のベクター(pVL1392、pVL1393及びpVL941など)、pAcUW由来のベクター(pAcUW1など)、及びpBlueBac由来のベクター(β−gal含有pBlueBacIII)が含まれる。
融合遺伝子を作成する技術は、周知である。本質的には、種々のポリペプチド配列をコードする様々なDNA断片を、慣用技術に従って結合することを行い、該技術では、鈍端又は付着末端を連結のために用い、制限酵素消化を適当な末端を与えるために用い、適宜粘着末端を埋め、望ましくない結合を回避するためにアルカリホスファターゼ処理を用い、そして酵素的連結を用いる。他の具体例においては、この融合遺伝子は、自動化DNAシンセサイザーを含む慣用の技術によって合成することができる。或は、遺伝子断片のPCR増幅を、2つの連続的遺伝子断片の間で相補的オーバーハングを生じさせる(これらは、次いで、アニールされてキメラの遺伝子配列を生成することができる)アンカープライマーを利用することにより行なうことができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel等編、John Wiley & Sons: 1992参照)。
ある面において、本発明は、Dll4シグナリングに対するアゴニスト又はアンタゴニスト効果を有する抗体を提供する。かかる抗体は、Dll4、Notch1又はNotch4などの抗原に結合することができる。好ましくは、この抗体は、かかる抗原の細胞外ドメインに結合する。抗体はポリクローナルであってもモノクローナルであってもよく;無傷であっても切り詰められていてもよく(例えば、F(ab')2、Fab、Fv);異種性、同系、完全にヒト型又はその改変型であってよい(例えば、ヒト化キメラ)ということは理解される。完全にヒトの抗体は、ヒトの免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物から選択することができ又は抗体断片を発現する組換えライブラリーから組み立てることができる。
Dll4、Notch1又はNotch4由来の免疫原を利用することにより、抗タンパク質/抗ペプチド抗血清又はモノクローナル抗体を、標準的プロトコールによって作成することができる(例えば、Antibodies: A Laboratory Manual Harlow及びLane編(Cold Spring Harbor Press: 1988)を参照されたい)。哺乳動物例えばマウス、ハムスター又はウサギを、免疫原形態のペプチド(例えば、ポリペプチド又は抗体応答を誘出することのできる抗原性断片、又は融合タンパク質)を用いて免疫化することができる。タンパク質又はペプチドに免疫原性を与える技術は、キャリアーへの結合体化又は他の当分野で周知の技術を含む。抗原の免疫原性部分を、アジュバントの存在下に投与することができる。免疫化の進行は、血漿又は血清中の抗体力価の検出によってモニターすることができる。標準的ELISA又は他のイムノアッセイを、免疫原を抗原として利用して抗体のレベルを評価することができる。
抗原性調製物を用いた動物の免疫化の後、抗血清を得ることができ、所望であれば、ポリクローナル抗体をその血清から単離することができる。モノクローナル抗体を生成するには、抗体産生細胞(リンパ球)を免疫化した動物から収穫して、標準的体細胞融合手順によって不滅化細胞例えばミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を生成することができる。かかる技術は、当分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ技術(Kohler及びMilstein, (1975) Nature, 256: 495-497によって最初に開発された)、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kozbar等 (1983) Immunology Today, 4: 72)、及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBVハイブリドーマ技術(Cole等 (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. p.77-96)を含む。ハイブリドーマ細胞を、Dll4、Notch1、Notch4又は他の標的ポリペプチドと特異的に反応する抗体の生成について、免疫化学的にスクリーニングして、モノクローナル抗体をかかるハイブリドーマ細胞を含む培養物から単離することができる。
用語抗体は、ここで用いる場合、やはり抗原と特異的に反応するその断片を含むことを意図している。抗体を、慣用技術を利用して断片化して、それらの断片を、全抗体について上記したのと同様にして、有用性についてスクリーニングすることができる。例えば、F(ab)2断片を、抗体をペプシンで処理することにより生成することができる。その生成したF(ab)2断片を処理して、ジスルフィド橋を還元してFab断片を生成することができる。本発明の抗体は、更に、二官能性の、一本鎖の、並びに抗体の少なくとも一つのCDR領域により与えられる抗原に対する親和性を有するキメラの及びヒト化した分子を含むことを意図している。一本鎖抗体の生成のための技術(米国特許第4,946,778号)は又、一本鎖抗体の生成にも適合させることができる。又、トランスジェニックマウス又は他の生物体(他の哺乳動物を含む)を利用して、ヒト化抗体を発現させることもできる。好適具体例において、これらの抗体は、それらに結合させた標識を更に含み、検出することができる(例えば、この標識は、放射性同位体、蛍光性化合物、酵素又は酵素補因子であってよい)。
ある好適具体例において、この発明の抗体は、モノクローナル抗体であり、ある具体例においては、この発明は、新規な抗体を生成する方法を利用可能にする。例えば、Dll4、Notch1又はNotch4に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、マウスにある量の、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な抗原ポリペプチドを含む免疫原性組成物を投与すること、そのマウスから抗体産生細胞(例えば、脾臓由来の細胞)を得ること及びそれらの抗体産生細胞をミエローマ細胞と融合させて抗体産生ハイブリドーマを得ること、そしてその抗体産生ハイブリドーマを試験して、該抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定することを含むことができる。一度得られれば、ハイブリドーマを、細胞培養にて増殖させることができ、適宜、ハイブリドーマ由来細胞が該モノクローナル抗体を生成する培養条件にて増殖させることができる。このモノクローナル抗体は、細胞培養物から精製することができる。
加えて、所望の抗体を同定するために抗体をスクリーニングするために用いられるこれらの技術は、得られる抗体の特性に影響を与えうる。例えば、ある治療目的に用いるための抗体は、好ましくは、特定の細胞型を標的とすることができる。従って、この型の抗体を得るためには、関心ある抗原を発現する細胞に結合する抗体についてスクリーニングするのが望ましいであろう(例えば、蛍光活性化セルソーティングにより)。同様に、もし抗体を、溶液中の抗原に結合させるために用いるのであれば、溶液結合を試験することが望ましいであろう。抗体:抗原相互作用を試験して、特に望ましい抗体を同定するために、様々な技術を利用することができる。かかる技術には、ELISA、表面プラズモン共鳴結合アッセイ(例えば、Biacore binding assay, Bia-core AB, スウェーデン国、Uppsala)、サンドイッチアッセイ(例えば、IGEN International, Inc., メリーランド、Gaithersburg のパラマグネチックビーズシステム)、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ及び免疫組織化学が含まれる。
ある面において、この開示は、Dll4転写物に生理的条件下でハイブリダイズして、細胞におけるDll4の発現を低減させる少なくとも一つの部分を含む単離された核酸化合物を提供する。かかる核酸は、ここに記載のように、Dll4アンタゴニストとして利用することができる。このDll4転写物は、任意のプレスプライシング転写物(即ち、イントロンを含む)、ポストスプライシング転写物、並びに任意のスプライシング変異体であってよい。ある具体例において、このDll4転写物は、SEQ ID NO:2に示したcDNA、特にそのコード部分に対応する配列を有する。ある面において、この開示は、Notch1又はNotch4転写物に生理的条件下でハイブリダイズして細胞におけるNotch1又はNotch4の発現を低減させる少なくとも一つの部分を含む単離された核酸化合物を提供する。これらは、Dll4アンタゴニストとしても利用することができる。このNotch1又はNotch4転写物は、任意のプレスプライシング転写物(即ち、イントロンを含む)、ポストスプライシング転写物、並びに任意のスプライシング変異体であってよい。
核酸化合物のカテゴリーの例には、核酸、RNAi構築物及び触媒性核酸構築物が含まれる。核酸化合物は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。二本鎖化合物は又、オーバーハングの領域又は非相補的領域を含むこともでき、該領域では、鎖の一方又は他方は、一本鎖である。一本鎖化合物は、自己相補的領域を含むことができ、これは、その化合物が、二重らせん構造によって、いわゆる「ヘアピン」又は「ステムループ」構造を形成することを意味する。核酸化合物は、Dll4、Notch1又はNotch4核酸配列の1000ヌクレオチド以下の、500ヌクレオチド以下の、250ヌクレオチド以下の、100ヌクレオチド以下の、50ヌクレオチド以下の配列よりなる領域に対して相補的なヌクレオチド配列を含むことができる。この相補的領域は、好ましくは、少なくとも8ヌクレオチドであり、適宜、少なくとも10又は少なくとも15ヌクレオチドである。相補的領域は、標的転写物のイントロン、コード配列又は非コード配列内(コード配列部分など)であってよい。一般に、核酸化合物は、約8〜500ヌクレオチド長又は塩基対長を有し、適宜、その長さは、約14〜50ヌクレオチドである。核酸は、DNA(特に、アンチセンス用)、RNA又はRNA:DNAハイブリッドであってよい。任意の一本鎖は、DNA及びRNAの混合物、並びに容易にDNA又はRNAとして分類できない改変型を含むことができる。同様に、二本鎖化合物は、DNA:DNA、DNA:RNA又はRNA:RNAであってよく、任意の一本鎖は、DNA及びRNAの混合物、並びに容易にDNA又はRNAとして分類できない改変型を含むこともできる。核酸化合物は、様々な改変の何れかを含むことができ、該改変には、主鎖に対するもの(ヌクレオチド間結合を含む、天然核酸の糖リン酸部分)又は塩基部分に対するもの(天然核酸のプリン又はピリミジン部分)が含まれる。アンチセンス核酸化合物は、好ましくは、約15〜30ヌクレオチド長を有し、しばしば、血清、細胞又は化合物が送達されそうな場所(例えば、経口送達される化合物の場合の胃、及び吸入される化合物の場合の肺)での安定性などの特性を改善するための一つ以上の改変を含む。RNAi構築物の場合には、標的転写物に相補的な鎖は、一般に、RNA又はその改変物である。他方の鎖は、RNA、DNA又は他の変形物であってよい。二本鎖又は一本鎖「ヘアピン」RNAi構築物の二本鎖部分は、好ましくは、18〜40ヌクレオチド長の、適宜、Dicer基質として働きさえすれば、約21〜23ヌクレオチド長の長さを有する。触媒性又は酵素的核酸は、リボザイム又はDNA酵素であってよく、改変型をも含むことができる。核酸化合物は、細胞と生理的条件下で且つナンセンス又はセンスコントロールが殆どないか効果がない濃度で接触させたときに、標的の発現を、約50%、75%、90%又はそれ以上阻止することができる。核酸化合物の効果を試験するの好適な濃度は、1、5及び10マイクロモルである。核酸化合物は又、細胞表現型(例えば、動脈又は静脈の個性)に対する効果について試験することもできる。
Dll4シグナリングのアゴニスト又はアンタゴニストとして作用する候補の薬剤についてのスクリーニングへの多くのアプローチがある。この開示は、Dll4シグナリングのアゴニスト及びアンタゴニストを識別するために利用することのできる特徴を提供する。一般に、Dll4シグナリングのアゴニストは、哺乳動物の内皮細胞において、動脈表現型の発現を刺激して、静脈表現型の発現を阻止する。一般に、Dll4シグナリングのアンタゴニストは、哺乳動物の内皮細胞において、動脈表現型の発現を阻止して、静脈表現型の発現を刺激する。動脈内皮細胞と静脈内皮細胞を識別する任意の公知の特徴を、動脈及び静脈表現型の評価の目的のために検出することができる。例えば、EphrinB2の発現及びコネキシン37の発現を、動脈表現型の指標として利用することができる。他の例としては、EphB4の発現は、静脈表現型の指標として利用することができる。
薬剤は又、Dll4、Notch1若しくはNotch4への結合活性について、又はNotch1(NICD)、Notch4若しくはDll4の活性な細胞内ドメインの生成を刺激し若しくは阻止する能力についてスクリーニングすることもできる。ヘアリー/エンハンサー・オブ・スプリット(HES)感受性プロモーターからの発現は又、Notchシグナリングが活性化されるかどうかの決定にも有用でありうる。NICDは、HES及びHES駆動されるプロモーターの発現を刺激する。
任意のスクリーニング系により同定された化合物を、次いで、動物で試験して、それらの血管形成、動脈形成、又は抗腫瘍活性に対するイン・ビボでの効果並びに動脈又は静脈の個性に対するイン・ビボでの効果を評価することができる。
化合物又は分子の高スループットスクリーニングを行なって、血管形成を阻止し又は腫瘍成長を阻止する薬剤又は薬物を同定することができる。試験薬剤は、合成により作成した、組換え技術により作成した又は天然起源から単離した任意の化学物質(成分、分子、化合物、薬物)であってよい。例えば、試験薬剤は、ペプチド、ポリペプチド、ペプトイド、糖、ホルモン、又は核酸分子であってよい。加えて、試験薬剤は、小型分子又はコンビナトリアル化学により作成されて例えばライブラリーに構成された一層大きい複雑さの分子であってよい。これらのライブラリーは、例えば、アルコール、アルキルハロゲン化物、アミン、アミド、エステル、アルデヒド、エーテル及び他のクラスの有機化合物を含むことができる。試験薬剤は又、天然物であっても、細胞(細菌、動物又は植物)の溶解物若しくは成長培地から人為的に処理した生成物又は細胞溶解物若しくは成長培地自体であってもよい。試験化合物の試験系への提示は、単離した形態であってもよいし又は化合物の混合物としてでもよい(特に、初期のスクリーニング段階において)。
例えば、Dll4(リガンド)のNotch1/Notch4(レセプター)への結合を特異的に阻止する(又はその逆の)化合物について、例えば、標識したリガンド−又はレセプター−Fc融合タンパク質の不滅化細胞への結合の阻止により、アッセイを行なってスクリーニングすることができる。
2つの細胞表面分子(例えば、Notch1及びDll4)の相互作用に干渉する物質を同定するためのアッセイの一具体例において、細胞表面分子の一つの型を発現する細胞の試料を、標識したリガンドと又は標識したリガンド及び試験化合物(又は試験化合物の群)と接触させる。これらの細胞に結合した標識したリガンドの量を測定する。試験化合物と接触させた試料中の一層少ない量の標識(標識は、例えば、放射性同位体、蛍光又は比色標識であってよい)は、試験化合物が、結合に干渉することの指標である。リガンドを発現する細胞を利用する相互アッセイを利用して、Ephレセプター又はその可溶性部分の結合に干渉する物質について試験することができる。
Dll4とNotch1/Notch4との間の相互作用に干渉する物質を同定するためのアッセイを、試験化合物と競合しない、固体支持体に結合された成分(例えば、細胞、融合タンパク質及び結合活性を有する部分を含む精製したタンパク質)を用いて行なうことができる。この固体支持体は、任意の適当な固相又はマトリクス例えばビーズ、プレートの壁又は他の適当な表面(例えば、ミクロ滴定プレートのウェル)、カラム細孔ガラス(CPG)又は溶液(ウェル中など)に沈めることのできるピンであってよい。細胞又は精製したタンパク質の固体支持体への結合は、直接でもよいし又は一つ以上のリンカー分子を介してでもよい。
一具体例において、単離した又は精製したタンパク質は、適当なアフィニティーマトリクス上に、標準的技術例えば化学的架橋又は単離し若しくは精製したタンパク質に対して高めた抗体によって固定化することができ、固体支持体に結合することができる。このマトリクスは、カラム又は他の適当な容器に詰めることができ、少なくとも一種の試験すべき化合物(例えば、混合物)と、その化合物の該タンパク質への結合に適した条件下で接触される。例えば、化合物を含む溶液を作成して該マトリクスを通して流すことができる。該マトリクスは、適当な洗浄緩衝液で洗って未結合の化合物及び非特異的に結合した化合物を除去することができる。結合したままの化合物を、適当な溶出用緩衝液によって遊離させることができる。例えば、溶出用緩衝液のイオン強度又はpHの変化は、化合物の遊離へと導くことができる。或は、この溶出用緩衝液は、化合物の結合を破壊するためにデザインされた遊離用成分(例えば、適宜、試験化合物の該タンパク質への結合を破壊し又は競合的に阻害することのできる一種以上のリガンド又はレセプター、又はその類似体)を含むことができる。
天然で見出されるタンパク質中に存在しない第二の部分に結合されたタンパク質の全部又は一部を含む融合タンパク質を、この方法の他の具体例で用いるために調製することができる。この目的のための適当な融合タンパク質には、第二の部分がアフィニティーリガンド(例えば、酵素、抗原、エピトープ)を含むものが含まれる。これらの融合タンパク質は、該タンパク質又はその一部分をアフィニティーリガンドをコードする適当な発現ベクターに挿入することによって生成することができる。この発現ベクターを、発現のための適当な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞を破壊して、融合タンパク質を含む細胞物質を適当なアフィニティーマトリクスに、融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分のアフィニティーマトリクスへの結合に十分な条件下で接触させることにより、該細胞物質を、アフィニティーマトリクスと結合させることができる。
この具体例の一面において、融合タンパク質を、適当なアフィニティーマトリクス上に、融合タンパク質のアフィニティーリガンド部分を該マトリクスに結合させるのに十分な条件下で固定化することができ、該融合タンパク質は、試験すべき一種以上の化合物(例えば、混合物)と、化合物の結合した融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合に適した条件下で接触される。次に、この結合した融合タンパク質を有するアフィニティーマトリクスを、適当な洗浄緩衝液で洗って未結合化合物及び非特異的に結合した化合物を、特異的に結合した化合物の結合を有意に破壊することなく除去することができる。結合したままの化合物を、融合タンパク質を結合して有するアフィニティーマトリクスを適当な溶出用緩衝液(化合物溶出用緩衝液)と接触させることにより遊離させることができる。この面において、化合物溶出用緩衝液を、融合タンパク質のアフィニティーマトリクスによる保持を可能にするが、試験する化合物の融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合に干渉するように配合することができる。例えば、溶出用緩衝液のイオン強度又はpHの変化は、化合物の遊離へと導くことができ、又はこの溶出用緩衝液は、化合物の融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合を破壊するようにデザインされた遊離用成分(例えば、化合物の融合タンパク質のレセプター又はリガンドタンパク質部分への結合を破壊することのできる一種以上のリガンド又はレセプター、又はその類似体)を含むことができる。固定化は、適宜、融合タンパク質を化合物と接触させる前に、接触と同時に、又は接触後に行なうことができる。試験する化合物、選択したアフィニティーマトリクス、及び溶出用緩衝液の処方などの因子によって、様々な方法の入れ替えが可能である。例えば、洗浄工程後に、化合物を結合して有する融合タンパク質を、アフィニティーマトリクスから適当な溶出用緩衝液(マトリクス溶出用緩衝液)を用いて溶出させることができる。融合タンパク質がトロンビン開裂部位などの開裂可能なリンカーを含む場合には、アフィニティーリガンドからの開裂は、化合物を結合して有する融合タンパク質の一部分を遊離させることができる。次いで、結合した化合物を、融合タンパク質又はその開裂生成物から、抽出などの適当な方法によって遊離させることができる。
ある具体例において、本発明は、血管形成を阻止する方法及び血管形成関連疾患を治療する方法を提供する。他の具体例において、本発明は、腫瘍の成長を阻止し又は低減させる方法及び癌を患っている個人を治療する方法を提供する。これらの方法は、その個人に治療上有効な量の上記の一種以上のDll4シグナリングのモジュレーターを投与することを含む。これらの方法は、特に、動物特にヒトの治療及び予防的処置を目的としている。
上記のように、血管形成関連疾患には、血管形成依存性の癌(例えば、固形腫瘍、血液担持される腫瘍例えば白血病)、及び腫瘍の転移;良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、及び発熱性肉芽腫;炎症性疾患例えば免疫又は非免疫性炎症;慢性関節リウマチ及び乾癬;眼の血管形成性疾患例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性、角膜移植片拒絶、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス;オスラー−ウェッバー症候群、角膜病、ルベオーシス、関節炎、糖尿病性新血管新生が含まれるが、これらに限られない。
特に、本発明の治療剤は、大腸癌、乳癌、中皮腫、前立腺癌、膀胱癌、頭頚部の扁平上皮細胞癌(HNSCC)、カポジ肉腫、及び白血病を含む(但し、これらに限られない)癌(腫瘍)を治療し又は予防するのに有用である。
かかる方法のある具体例において、一種以上の治療剤を、一緒に(同時に)又は異なる時点で(順次的に)投与することができる。加えて、治療剤は、癌治療のための又は血管形成阻止のための他の型の化合物と共に投与することができる。
ある具体例において、この発明の主題の方法は、単独で用いることができる。或は、主題の方法は、増殖性疾患(例えば、腫瘍)の治療又は予防に向けられる他の慣用の抗癌治療アプローチと組み合わせて用いることができる。例えば、かかる方法は、癌の予防、癌の外科手術後の再発及び転移の防止において、及び他の慣用の癌治療の補助剤として利用することができる。本発明は、慣用の癌治療(例えば、化学療法、光線療法、免疫療法、及び外科手術)の有効性を、主題のポリペプチド治療剤の利用によって増進させることを認識する。
慣用の化合物の広いアレイは、抗新生物活性を有することが示されている。これらの化合物は、化学療法における医薬として、固形癌を収縮させ、転移及び更なる成長を防止し、又は白血病若しくは骨髄の悪性腫瘍における悪性細胞の数を減らすために用いられてきた。化学療法は、様々な種類の悪性腫瘍の治療に有効であったが、多くの抗新生物化合物は、望ましくない副作用を誘発する。2種類以上の異なる治療剤を組み合わせた場合、それらの治療剤は、共同作用的に働いて各治療剤の投薬量を減らすことを可能にし、それにより、各化合物の一層高い投薬量により生じる有害な副作用を低減することが示されている。他の事例において、治療剤に不従順な悪性腫瘍は、2種類以上の異なる治療剤の組合せ両方には応答しうる。
本発明の治療剤を他の慣用の抗新生物剤と組み合わせて、同時に又は順次的に投与する場合、かかる治療剤は、該抗新生物剤の治療効果を増進させ又は細胞のかかる抗新生物剤への耐性を克服することが示される。これは、抗新生物剤の投薬量の減少を可能にし、それにより、望ましくない副作用を低減させ又は抵抗性細胞における抗新生物剤の効力を回復させることを可能にする。
組合せ抗腫瘍療法に利用することのできる医薬化合物には、単に説明のために、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、bcg、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンポテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタクセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコーチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトタン、マイトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレクスト、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが含まれる。
これらの化学療法用抗腫瘍性化合物は、それらの作用機構によって、例えば、次の群に分類されうる:代謝拮抗剤/抗癌剤、例えばピリミジン類似体(5−フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン)及びプリン類似体、葉酸アンタゴニスト及び関連インヒビター(メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び2−クロロデオキシアデノシン(クラドリビン));抗増殖剤/抗有糸分裂剤(天然物を含む)、例えばビンカアルカロイド(ビンブラスチン、ビンクリスチン及びビノレルビン)、微小管破壊剤例えばタキサン(パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポシロン及びナベルビン、エピジポドフィロトキシン(エトポシド、テニポシド)、DNA損傷剤(アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カムプトテシン、カーボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イホスファミド、メルファラン、メルクロレタミン、マイトマイシン、マイトキサントロン、ニトロソウレア、プリカマイシン、プロカルバジン、タキソール、タキソテレ、テニポシド、トリエチレンチオホスホルアミド及びエトポシド(VP16));抗生物質例えばダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、イダルビシン、アントラサイクリン、マイトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)及びマイトマイシン;酵素(L−アスパラギンを全身で代謝して、アスパラギンを合成する能力を有しない細胞を涸渇させるL−アスパラギナーゼ);抗血小板剤;抗増殖剤/抗有糸分裂アルキル化剤例えばナイトロジェンマスタード(メクロレタミン、シクロホスファミド及び類似体、メルファラン、クロラムブシル)、エチレンイミン及びメチルメラミン(ヘキサメチルメラミン及びチオテパ)、アルキルスルホネート−ブスルファン、ニトロソウレア(カルムスチン(BCNU)及び類似体、ストレプトゾシン)、トラゼン−ダカルバジニン(DTIC);抗増殖剤/抗有糸分裂代謝拮抗剤、例えば葉酸類似体(メトトレキセート);白金配位錯体(シスプラチン、カルボプラチン)、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、マイトタン、アミノグルテチミド;ホルモン、ホルモン類似体(エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド)及びアロマターゼインヒビター(レトロゾール、アナストロゾール);抗凝固剤(ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビンのインヒビター);フィブリン溶解剤(例えば、組織プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ)、アスピリン、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ;抗移動剤;抗分泌剤(ブレベルジン);免疫抑制剤(シクロスポリン、タクロリムス(FK−506)、シロリムス(ラパマイシン)、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル);抗血管形成性化合物(TNP−470、ゲニステイン)及び成長因子インヒビター(血管内皮成長因子(VEGF)インヒビター、繊維芽細胞成長因子(FGF)インヒビター);アンギオテンシンレセプターブロッカ;一酸化窒素ドナー;アンチセンスオリゴヌクレオチド;抗体(トラスツヅマブ);細胞周期インヒビター及び分化誘導剤(トレチノイン);mTORインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター(ドキソルビシン(アドリアマイシン)、アムサクリン、カムプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン及びマイトキサントロン、トポテカン、イリノテカン)、コルチコステロイド(コーチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコーチゾン、メチルペドニゾロン、プレドニゾン、及びプレニゾロン);成長因子シグナル変換キナーゼインヒビター;ミトコンドリア機能不全誘導剤及びカスパーゼアクチベーター;及びクロマチン破壊剤。
ある具体例において、組合せ抗血管形成療法に利用することのできる医薬化合物には:(1)「血管形成性分子」例えばbFGF(塩基性繊維芽細胞成長因子)の放出のインヒビター;(2)血管形成性分子の中和剤例えば抗βbFGF抗体;及び(3)内皮細胞の血管形成刺激に対する応答のインヒビター(コラゲナーゼインヒビター、基底膜ターンオーバーインヒビター、アンギオスタチックステロイド、真菌由来血管形成インヒビター、血小板因子4、トロンボスロンジン、関節炎用薬物例えばD−ペニシラミン及び金チオリンゴ酸、ビタミンD3類似体、アルファ−インターフェロンなどを含む)が含まれる。更なる提案される血管形成のインヒビターについては、Blood等、Bioch. Biophys. Acta., 1032:89-118 (1990), Moses等、Science, 248:1408-1410 (1990), Ingber等、Lab. Invest., 59:44-51 (1988), 及び米国特許第5,092,885号、5,112,946号、5,192,744号、5,202,352号、及び6573256号を参照されたい。加えて、血管形成を阻止するために利用することのできる広範な化合物例えば、VEGFに媒介される血管形成経路をブロックするペプチド又は薬剤、エンドスタチンタンパク質又は誘導体、アンギオスタチンのリジン結合性断片、メラミン又はメラミン促進性化合物、プラスミノーゲン断片(例えば、プラスミノーゲンのKringles1−3)、トロポインサブユニット、SaposinB由来のビトロネクチンαvβ3ペプチドのアンタゴニスト、抗生物質又は類似体(例えば、テトラサイクリン又はネオマイシン)、ジエノゲスト含有組成物、ペプチドに結合したMetAP−2阻害性コアを含む化合物、化合物EM−138、カルコン及びその類似体、及びナーラダーゼインヒビターがある。例えば、米国特許第6,395,718号、6,462,075号、6,465,431号、6,475,784号、6,482,802号、6,482,810号、6,500,431号、6,500,924号、6,518,298号、6,521,439号、6,525,019号、6,538,103号、6,544,758号、6,544,947号、6,548,477号、6,599,126号、及び6,569,845号を参照されたい。
組合せ療法の性質に依り、この発明の治療剤の投与を、他の治療を施与しながら及び/又は施与後に持続することができる。これらのポリペプチド治療剤の投与は、単一投与量で行なうこともできるし、多数回の投与で行なうこともできる。幾つかの事例では、これらの治療剤の投与は、慣用の治療の少なくとも数日前に開始するが、他の事例では、投与を、慣用の治療の施与の直前又は当該施与時に開始する。
ある具体例において、この開示は、動脈形成を刺激する方法を提供する。かかる方法は、有効量のDll4シグナリングアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含むことができる。その患者は、虚血状態を有し又はその危険にありうる。その患者は、例えばアンギナを含む冠動脈疾患を有し又は心筋梗塞を発生したことがありうる。その患者は、末梢動脈疾患例えば虚血事象又は四肢、脳又は腎臓などの臓器における部分的閉塞を有しうる。その患者は、虚血事象の危険にあると診断されうる。
ある具体例において、この開示は、血管において動脈の特徴を採択することを促進する方法を提供する。かかる方法は、有効量のDll4シグナリングのアゴニストを、血管にエキソ・ビボで又はそれを必要とする患者に投与することを含みうる。この血管は、冠動脈バイパス外科手術で利用されるような伏在静脈移植片などの静脈移植片であってよい。
ある具体例において、本発明の主題の治療剤は、製薬上許容しうるキャリアーと配合される。かかる治療剤は、単独で投与することができ又は医薬配合物(組成物)の一成分として投与することができる。これらの化合物は、投与のために、ヒト用又は獣医学用医薬において利用する慣用の方法で配合することができる。湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤(ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなど)並びに着色剤、剥離剤、被覆剤、甘味料、調味料及び香料、防腐剤及び抗酸化剤も又、これらの組成物中に存在してよい。
ある面において、この開示は、Dll4、Notch1、Notch4又はこの経路の他のメンバーを標的とする様々な核酸化合物の何れかを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、一般に、製薬上許容しうるキャリアーを含む。
非経口投与に適した医薬組成物は、一種以上のポリペプチド治療剤を、一種以上の製薬上許容しうる無菌の等張水溶液又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳濁液と、又は無菌の粉末(使用直前に無菌の注射溶液又は分散液に再構成することができるもの)と組み合わせて含むことができ、これらには、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、意図するレシピエントの血液と等張の配合物与える溶質又は懸濁化剤若しくは増粘剤が含まれうる。この発明の医薬組成物で用いることのできる適当な水性又は非水性のキャリアーの例には、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)及びこれらの適当な混合物、植物油例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル例えばオレイン酸エチルが含まれる。適当な流動性を、例えば、レシチンなどの被覆材の利用により、必要な粒度を維持することにより(分散液の場合)、及び界面活性剤の利用によって維持することができる。
これらの組成物は又、補助剤例えば防腐剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤を含むこともできる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤例えばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などを含有させることにより確実にすることができる。等張剤例えば糖類、塩化ナトリウムなどをこれらの組成物中に含むことも又、望ましいであろう。加えて、この注射用医薬形態の延長された吸収を、吸収を遅延させる薬剤例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによりもたらすことができる。
注射可能なデポー剤を、一種以上のポリペプチド治療剤の、生物分解性ポリマー例えばポリラクチド−ポリグリコリド中の微小封入マトリクスを形成することにより作成することができる。薬物のポリマーに対する比及び用いた特定のポリマーの性質によって、薬物放出の速度を制御することができる。他の生物分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)及びポリ(アンヒドリド)が含まれる。注射可能なデポー剤配合物は又、薬物を、身体の組織と適合性のリポソーム又はミクロエマルジョン中に捕捉することによっても製造することができる。
主題のポリペプチド治療剤の配合物には、経口投与/鼻投与、局所投与、非経口投与、直腸投与及び/又は膣内投与に適したものが含まれる。これらの配合物は、便利に、投薬単位形態で提供することができ、製薬業分野で周知の任意の方法によって製造することができる。キャリアー物質と組み合わせて単一投薬形態を生成することのできる活性成分の量は、治療される宿主、特定の投与方法によって変化する。キャリアー物質と組み合わせて単一投薬形態を生成することのできる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる化合物の量である。
ある具体例において、これらの配合物又は組成物を製造する方法は、他の種類の抗腫瘍又は抗血管形成治療剤及びキャリアー及び、適宜、一種以上の補助成分を組み合わせることを含む。一般に、これらの配合物は、液体キャリアー若しくは微粉固体キャリアー又は両方を用いて製造することができ、その後、必要であれば、生成物に付形する。
経口投与のための配合物は、カプセル、カシェ剤、丸薬、錠剤、菓子錠剤(風味付きベース、通常、ショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムを使用)、粉末、顆粒の形態であってよく、又は溶液若しくは懸濁液(水性若しくは非水性液体中)、又は水中油若しくは油中水液体エマルジョン、又はエリキシル若しくはシロップ、又は芳香製剤(不活性ベース例えばゼラチン及びグリセリン、又はショ糖及びアラビアゴムを使用)、及び/又は口腔洗浄剤などであってよく、各々は、予め決めた量の主題の治療剤を活性成分として含んでいる。
経口投与のための固体投薬形態(カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など)において、本発明の一種以上のポリペプチド治療剤を、一種以上の製薬上許容しうるキャリアー例えばクエン酸ナトリウム又はリン酸二カルシウム、及び/又は次の何れかと混合することができる:(1)充填剤及び増量剤、例えば澱粉、ラクトース、ショ糖、グルコース、マンニトール、及び/又はケイ酸;(2)結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ショ糖、及び/又はアラビアゴム;(3)湿潤剤、例えばグリセロール;(4)崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、馬鈴薯澱粉又はタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のシリケート、及び炭酸ナトリウム;(5)溶液緩染剤、例えばパラフィン;(6)吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物;(7)湿潤剤、例えばセチルアルコール及びグリセロールモノステアレート;(8)吸収剤、例えばカオリン及びベントナイトクレイ;(9)潤滑剤、例えばタルク、カルシウムステアレート、マグネシウムステアレート、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物;及び(10)着色剤。カプセル、錠剤及び丸薬の場合には、これらの医薬組成物は、緩衝剤をも含むことができる。類似の種類の固体組成物は又、ラクトース又は乳糖並びに高分子量のポリエチレングリコールなどの賦形剤を利用して、ソフトフィルド及びハードフィルドゼラチンカプセルにおいて充填剤としても用いることができる。
経口投与のための液体投薬形態は、製薬上許容しうるエマルジョン、ミクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを含む。活性成分に加えて、これらの液体投薬形態は、当分野で一般に用いられる不活性希釈剤例えば水又は他の溶媒、可溶化剤及び乳化剤例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール、油類(特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、及び胡麻油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタンの脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物を含むことができる。不活性希釈剤の他にも、これらの経口組成物は、補助剤例えば湿潤剤、乳化剤及び懸濁化剤、甘味料、調味料、着色剤、香料、及び防腐剤をも含むことができる。
懸濁液は、活性化合物に加えて、懸濁化剤例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、及びソルビタンエステル、微晶質セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天及びトラガカントゴム、及びこれらの混合物を含むことができる。
この発明の治療剤は、皮膚又は頸部及び膣などの粘膜に局所投与することができる。これらの局所用配合物は、更に、一種以上の様々な、皮膚又は角質層透過増進剤として有効であることが知られた薬剤を含むことができる。これらの例は、2−ピロリドン、N−メチル−2−ピロリドン、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、プロピレングリコール、メチル又はイソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド、及びアゾンである。更なる薬剤を、更に含有させて、化粧用として許容しうる配合物を作成することができる。これらの例は、脂肪、ワックス、油、染料、芳香剤、防腐剤、安定剤、及び表面活性剤である。角質溶解剤例えば当分野で公知のものも含有させることができる。例は、サリチル酸及び硫黄である。
この局所投与又は経皮投与のための投薬形態には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチ、及び吸入が含まれる。主題のポリペプチド治療剤は、無菌条件下で、製薬上許容しうるキャリアー、及び任意の防腐剤、緩衝剤、又は噴射剤(必要とされうる)と混合することができる。これらの軟膏、ペースト、クリーム及びゲルは、主題のポリペプチド剤に加えて、賦形剤例えば動物性及び植物性の脂肪、油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカントゴム、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルク、及び酸化亜鉛、又はこれらの混合物を含むことができる。
粉末及びスプレーは、主題のポリペプチド治療剤に加えて、賦形剤例えばラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、及びポリアミド粉末、又はこれらの物質の混合物 を含むことができる。スプレーは、更に、通例の噴射剤例えばクロロフルオロ炭化水素及び揮発性不飽和炭化水素例えばブタン及びプロパンを含むことができる。
膣又は直腸投与のための配合物は、坐薬として調製することができ、それは、一種以上のこの発明の化合物を一種以上の適当な賦形剤又はキャリアー(例えば、ココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックス又はサリチル酸塩を含む)と混合することにより調製することができ、室温で固体であるが、体温では液体であり、それ故、直腸又は膣内腔で融解して活性化合物を放出する。
他の具体例において、この発明のポリペプチド治療剤は、真核生物のプロモーターから細胞内で発現させることができる。例えば、Dll4又はNotch1/Notch4の可溶性ポリペプチドを、適当なベクターから真核細胞内で発現させることができる。これらのベクターは、好ましくは、DNAプラスミド又はウイルス性ベクターである。ウイルス性ベクターは、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアルファウイルスに基づいて(但し、これらに限られない)構築することができる。好ましくは、これらのベクターは、安定に標的細胞に導入されて維持される。或は、一過性の発現を与えるウイルス性ベクターを利用することができる。かかるベクターは、必要なときに反復して投与することができる。主題のポリペプチド治療剤をコードするベクターの送達は、静脈若しくは筋肉内投与によるか、患者由来の外植された標的細胞へ投与した後その患者に再導入することによるか、又は所望の標的細胞への導入を可能にする他の手段によるなどして、全身的であってよい(総説としては、Couture等、1996, TIG., 12, 510を参照されたい)。
典型的具体例
この発明を今一般的に説明したので、それは、下記の実施例を参照することにより一層容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明を目的とするものであって、この発明を制限することを意図するものではない。
この発明を今一般的に説明したので、それは、下記の実施例を参照することにより一層容易に理解されるであろう。これらの実施例は、単に、本発明のある面及び具体例の説明を目的とするものであって、この発明を制限することを意図するものではない。
実施例1:動脈の発生におけるマウスのDll4の投薬量感受性要求
Duarte等(Genes Dev. 2004 Oct 15;18(20):2474-8)は、マウスDll4における機能喪失変異が脈管形成及び血管形成の欠損を引き起こすこと、及びこれらの欠損が投薬量依存性であることことを示し、Dll4+/-マウスは、ホモ接合のDll4-/-マウスよりも一層軽い表現型を示す。加えて、Dll4機能の喪失は、動脈血管の個性の喪失を引き起こす。これらの結果は、Notch経路では先例のないDll4シグナリングに対する感受性のレベルを示している。血管発生のDll4投薬量に対する感受性は、Dll4−Notch1/4シグナリング経路のアンタゴニストが、血管形成の阻止において高度に有効であろうことを示している。
Duarte等(Genes Dev. 2004 Oct 15;18(20):2474-8)は、マウスDll4における機能喪失変異が脈管形成及び血管形成の欠損を引き起こすこと、及びこれらの欠損が投薬量依存性であることことを示し、Dll4+/-マウスは、ホモ接合のDll4-/-マウスよりも一層軽い表現型を示す。加えて、Dll4機能の喪失は、動脈血管の個性の喪失を引き起こす。これらの結果は、Notch経路では先例のないDll4シグナリングに対する感受性のレベルを示している。血管発生のDll4投薬量に対する感受性は、Dll4−Notch1/4シグナリング経路のアンタゴニストが、血管形成の阻止において高度に有効であろうことを示している。
実施例2:mDLL4過剰発現は、発生中のマウス胚において、動脈肥厚及び静脈個性の喪失を引き起こす。
この研究において、出願人は、哺乳動物の血管の発生におけるmDll4の役割を、マウスの機能亢進変異体を生成して特性決定することによって更に研究することを企てた。mDll4の全身に広がった過剰発現を達成するために、条件付きトランスジェニックマウス系統、ZEG−mDll4を生成した。構成的cre系統、CAG−Creマウス(Sakai等、1997)との交雑に際して、これらのマウスは、ネイティブ型のmDll4を、ニワトリのベータアクチンプロモーター及びCMVエンハンサーの制御下で発現する。続くものは、認められた機能亢進表現型の記載である。
この研究において、出願人は、哺乳動物の血管の発生におけるmDll4の役割を、マウスの機能亢進変異体を生成して特性決定することによって更に研究することを企てた。mDll4の全身に広がった過剰発現を達成するために、条件付きトランスジェニックマウス系統、ZEG−mDll4を生成した。構成的cre系統、CAG−Creマウス(Sakai等、1997)との交雑に際して、これらのマウスは、ネイティブ型のmDll4を、ニワトリのベータアクチンプロモーター及びCMVエンハンサーの制御下で発現する。続くものは、認められた機能亢進表現型の記載である。
mDll4cDNAを、pCALL2−MigR(Lobe等、1999)中にクローン化して、pZ/EG−mDll4トランスジェネシスベクター(図7)を生成し、R1マウスの胚性幹(ES)細胞中にエレクトロポレーションした。これらのエレクトロポレーションを受けたES細胞から標準的方法(Nagy及びRossant, 2000)により得られたトランスジェニックマウス系統を、構成的cre系統、CAG−Creと交雑した。その結果生成した胚を、EGFP蛍光、第二レポーター(Cre組換えが起きた細胞中でDll4と同時発現される)につき分析した。EGFP発現は、二重トランスジェニック胚(dt)で強く且つ全身的であることが見出され(図8)、これは、正常なE8.5〜E9.5のメンデル比で起きた。これらの胚は、頭、心臓、鰓弓及び後背側領域での激しい出血、心膜浮腫及び不完全な転換をE9.0で示した(図8c)。E10.5の後、二重トランスジェニック胚は、回収されなかった。
二重トランスジェニック胚の全載の低温切片におけるPECAM1抗血清による免疫染色は、動静脈奇形を、特に背大動脈と前主動脈との融合(図10)をE8.5ほどの早期に示した。このステージでは、明白な程度の大動脈肥厚もあって、これは、E9.5まで漸進的に一層明白になったが、このことは、内皮細胞増殖の調節におけるNotch経路の役割を示唆している(図9)。この仮説と調和して、BrdU取込みの研究は、内皮細胞増殖の40%平均の増加を、二重トランスジェニック胚の前背大動脈で示した(示してない)。他方、前主動脈(ACV)は、それらが正しい血管形成の改変を受けなかったかのように、分岐して見え(図9)、又は、静脈洞に直接結合した領域を除いて殆ど存在しなかった(図10)。血管形成の改変は又、卵黄嚢及び心臓領域において生じることができておらず、一次毛細血管叢が、両方の場合において残っている(図9)。体節間血管は、正常より僅かに広がって短く、これは、おそらく、動脈と静脈の融合及び背側の最も末端での分岐の失敗の結果であろう(図9)。それらは又、ときに体節に侵入しているのが見られ、これは、それらの成長進路方向の破壊を示唆する(示してない)。E9.5では、dt胚の大動脈は、静脈洞領域に直接結合しているのが見られ(図10)、これは、心臓の末端における微小循環を造っている。おそらく、不十分な血流の結果として、この大動脈は、後方がひどく萎縮して静脈洞に結合している(図9及び10)。墨汁の注入を用いる細血管造影法による研究は、これらの変異体において、血液が、大動脈弓から大動脈へ流れ、その後、直接、静脈洞に流れ込み、殆どの血液は、後背大動脈に達しないことを示す(図10)。
動脈及び静脈特異的マーカー発現の特性表示は、胚のすべての血管が専ら動脈マーカーを提示するという著しい変異体表現型を示した。これらの二重トランスジェニック胚の静脈は、動脈特異的マーカー例えばephrin−B2、コネキシン37、hey1及びnotch1の異所的発現を示した(図11及び12)。他方、静脈マーカー(例えば、EphB4)の発現は、これらの変異体において検出できなかった(図13)。その上、通常、大動脈−性腺−中腎領域における主動脈に特異的である造血クラスターが、E9.0の変異体胚の静脈洞領域で検出され(示してない)、これは、静脈構造の機能的動脈化の証拠を与えるものである。
mDll4の過剰発現は、大動脈肥厚及び動静脈短絡、局所的血管形成阻止、静脈における内皮の動脈個性マーカーの異所的発現、及び内皮の静脈個性マーカーのダウンレギュレーションを引き起こす。
これらの結果は、内皮細胞の個性の確立におけるmDll4の役割を示しており、その血管芽細胞/内皮細胞の増殖及び血管形成の調節への関与を示唆している。
実施例3:ヒトのデルタ様リガンド(hdll4)は、内皮細胞の管形成及び内皮細胞の萌芽を調節する。
ヒトのdll4の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1のアミノ酸26〜524)を、Hisタグ又はFcタグと共に哺乳動物用発現ベクター中にクローン化して、分泌タンパク質として293細胞及びCHO−K細胞で発現させた。精製したdll4を、先ず、Notch1に結合することを示し、次いで、マトリゲル上で培養した場合の内皮細胞に対するイン・ビトロ活性について試験した。図10及び11を参照されたい。内皮細胞は、8〜24時間以内に組織化されて管様構造を形成し、該管形成は、成長因子涸渇条件において最少であった。20ng/mlでのVEGFの添加は、管形成を誘導する。成長因子欠乏条件で試験した場合、Dll4は、低投与量レベル(100及び200ng/ml)で管形成を誘導したが、一層高レベルの500ng/mlの投与量では、管形成を誘導することができなかった(図12)。しかしながら、Dll4は、VEGF含有培養物に加えた場合に、管形成を誘導しなかった。
ヒトのdll4の細胞外ドメイン(SEQ ID NO:1のアミノ酸26〜524)を、Hisタグ又はFcタグと共に哺乳動物用発現ベクター中にクローン化して、分泌タンパク質として293細胞及びCHO−K細胞で発現させた。精製したdll4を、先ず、Notch1に結合することを示し、次いで、マトリゲル上で培養した場合の内皮細胞に対するイン・ビトロ活性について試験した。図10及び11を参照されたい。内皮細胞は、8〜24時間以内に組織化されて管様構造を形成し、該管形成は、成長因子涸渇条件において最少であった。20ng/mlでのVEGFの添加は、管形成を誘導する。成長因子欠乏条件で試験した場合、Dll4は、低投与量レベル(100及び200ng/ml)で管形成を誘導したが、一層高レベルの500ng/mlの投与量では、管形成を誘導することができなかった(図12)。しかしながら、Dll4は、VEGF含有培養物に加えた場合に、管形成を誘導しなかった。
ヒトdll4は、内皮細胞スフェロイドを変化する投与量レベルのdll4で処理する萌芽アッセイにおいても試験した(図13及び14)。一層低レベルの投与量では萌芽が誘導されたが、一層高レベルの投与量では、萌芽を促進することができなかった(図13)。対照的に、VEGF処理された内皮細胞の萌芽は、一層低レベルのdll4によって最少の影響を受けたが、一層高レベルの投与量で顕著な減少を示した(図14)。
実施例3の方法及び材料:
内皮細胞、平滑筋細胞、及び同時培養スフェロイドの生成
限定した細胞数の内皮細胞及び平滑筋細胞スフェロイドを生成した。簡単にいえば、SM又はHUVE細胞を、0.25%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含む対応する培養培地に懸濁させて、非粘着性丸底96ウェルプレートに播種した。これらの条件下で、すべての懸濁細胞は、限定した大きさ及び細胞数のウェル当たり単一のスフェロイドの形成に寄与する(標準的大きさ:2250細胞/スフェロイド;イン・ビトロ血管形成:750〜1000細胞/スフェロイド)。同時培養スフェロイドを生成するために、等量の懸濁させたSM及びHUVE細胞(標準的大きさ:1125SMC及び1125HUVEC/スフェロイド;イン・ビトロ血管形成:500SMC及び500HUVEC/スフェロイド)を混合して、上記のように非粘着性丸底96ウェルプレートに播種した。スフェロイドを、少なくとも24時間培養し、対応する実験に用いた。
内皮細胞、平滑筋細胞、及び同時培養スフェロイドの生成
限定した細胞数の内皮細胞及び平滑筋細胞スフェロイドを生成した。簡単にいえば、SM又はHUVE細胞を、0.25%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含む対応する培養培地に懸濁させて、非粘着性丸底96ウェルプレートに播種した。これらの条件下で、すべての懸濁細胞は、限定した大きさ及び細胞数のウェル当たり単一のスフェロイドの形成に寄与する(標準的大きさ:2250細胞/スフェロイド;イン・ビトロ血管形成:750〜1000細胞/スフェロイド)。同時培養スフェロイドを生成するために、等量の懸濁させたSM及びHUVE細胞(標準的大きさ:1125SMC及び1125HUVEC/スフェロイド;イン・ビトロ血管形成:500SMC及び500HUVEC/スフェロイド)を混合して、上記のように非粘着性丸底96ウェルプレートに播種した。スフェロイドを、少なくとも24時間培養し、対応する実験に用いた。
イン・ビトロ血管形成アッセイ
コラーゲンゲルにおけるイン・ビトロ血管形成を、前記のように、内皮細胞、平滑筋細胞、及び同時培養スフェロイドを利用して定量した。簡単にいえば、750〜1000細胞を含むスフェロイドを一晩生成し、その後、それらをコラーゲンゲル中に包埋した。コラーゲンストック溶液を、使用前に、8容のラットの尾の酸性コラーゲン抽出物(2mg/ml、4℃に平衡化)を、1容の10×EBSS(Gibco BRL, ドイツ国、Eggenstein);1容の0.1N NaOHと混合してpH7.4に調整することにより調製した。このストック溶液(0.5ml)を、0.5mlの室温の培地(コラーゲンゲルの重合前のスフェロイドの沈降を防ぐために0.5%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含むECGM基礎培地[PromoCell]に40%FCSを加えたもの)、50個のスフェロイド、及び対応する試験物質と混合した。このスフェロイド含有ゲルを迅速に予備加温した24ウェルプレートに移して、重合させ(1分間)、その後、0.1ml ECGM基礎培地を該ゲルの上にピペットで加えた。これらのゲルを、5%CO2中で、37℃、湿度100%でインキュベートした。24時間後に、イン・ビトロ血管形成を、各スフェロイドから伸出した萌芽の長さ(接眼グリッド(ocular grid)倍率100)を、実験群及び実験当たり少なくとも10個のスフェロイドを分析するデジタルイメージングソフトウェアDP−Soft(Olympus)を利用して測定することにより計数した。
コラーゲンゲルにおけるイン・ビトロ血管形成を、前記のように、内皮細胞、平滑筋細胞、及び同時培養スフェロイドを利用して定量した。簡単にいえば、750〜1000細胞を含むスフェロイドを一晩生成し、その後、それらをコラーゲンゲル中に包埋した。コラーゲンストック溶液を、使用前に、8容のラットの尾の酸性コラーゲン抽出物(2mg/ml、4℃に平衡化)を、1容の10×EBSS(Gibco BRL, ドイツ国、Eggenstein);1容の0.1N NaOHと混合してpH7.4に調整することにより調製した。このストック溶液(0.5ml)を、0.5mlの室温の培地(コラーゲンゲルの重合前のスフェロイドの沈降を防ぐために0.5%(w/v)カルボキシメチルセルロースを含むECGM基礎培地[PromoCell]に40%FCSを加えたもの)、50個のスフェロイド、及び対応する試験物質と混合した。このスフェロイド含有ゲルを迅速に予備加温した24ウェルプレートに移して、重合させ(1分間)、その後、0.1ml ECGM基礎培地を該ゲルの上にピペットで加えた。これらのゲルを、5%CO2中で、37℃、湿度100%でインキュベートした。24時間後に、イン・ビトロ血管形成を、各スフェロイドから伸出した萌芽の長さ(接眼グリッド(ocular grid)倍率100)を、実験群及び実験当たり少なくとも10個のスフェロイドを分析するデジタルイメージングソフトウェアDP−Soft(Olympus)を利用して測定することにより計数した。
蛍光細胞標識
SMC及びHUVECを、蛍光染料PKH26(赤色蛍光)及びPKH67(緑色蛍光)を製造業者の指示に従って利用して標識した。トリプシン処理後に、懸濁細胞を、HBSSで一回洗い、膜をPKH26又はPKH67で5分間標識して、対応する培養培地で3回洗った。細胞標識の品質を、蛍光顕微鏡観察を用いて検査した。
SMC及びHUVECを、蛍光染料PKH26(赤色蛍光)及びPKH67(緑色蛍光)を製造業者の指示に従って利用して標識した。トリプシン処理後に、懸濁細胞を、HBSSで一回洗い、膜をPKH26又はPKH67で5分間標識して、対応する培養培地で3回洗った。細胞標識の品質を、蛍光顕微鏡観察を用いて検査した。
超微細構造分析
スフェロイドを、Karnovsky固定液中で固定し、1.0%オスミウムテトロキシド中で後固定し、ある等級シリーズのエタノール中で脱水して、Epon中に包埋した。0.5μmの切片を切って、光学顕微鏡評価のためにアズレ11メチレンブルーで染色した。極薄切片(50〜80nm)を切り、銅製グリッド上に集めて、Zeiss EM10電子顕微鏡による観察のために酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で自動的に染色した。
スフェロイドを、Karnovsky固定液中で固定し、1.0%オスミウムテトロキシド中で後固定し、ある等級シリーズのエタノール中で脱水して、Epon中に包埋した。0.5μmの切片を切って、光学顕微鏡評価のためにアズレ11メチレンブルーで染色した。極薄切片(50〜80nm)を切り、銅製グリッド上に集めて、Zeiss EM10電子顕微鏡による観察のために酢酸ウラニル及びクエン酸鉛で自動的に染色した。
表面スフェロイド内皮細胞における内皮間接合点複合体の定量のために、2つの独立の調製物において、実験群当たり20の無作為に選んだスフェロイドのすべての接合点複合体を計数した。結果を、100個の表面単層内皮細胞当たりの、接合点複合体の数として表した(実験群当たり少なくとも200ECの分析)。
形態及び免疫組織化学的分析
スフェロイドを収穫して、3分間、200gで遠心分離した。培養した単層細胞をトリプシン処理により収穫して、遠心分離により集めた。スフェロイド及びペレット化した単層細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含むHBSS中で固定して、パラフィン包埋のために処理し;脱水(エタノール及びイソプロパノールの等級化シリーズ、各1時間)後、これらの試料を、先ず、パラフィンI(42℃で融解)に12時間、60℃で浸した。スフェロイド及び単層細胞を、再び、遠心分離により集めて、パラフィンII(56℃で融解)に12時間、70℃で浸した。その結果得られたパラフィンブロックを、最後に、室温まで冷却して、切片化のために整えた。組織化学的分析のために、パラフィン切片(4μm)を切り、脱パラフィンして、脱水した。次いで、切片を、3%H2O2とH2O中でインキュベートして内在性ペルオキシダーゼを阻害した。リン酸緩衝塩溶液中での洗浄後、これらの切片を、30分間、ブロッキング溶液(10%正常ヤギ血清)とインキュベートした後、対応する一次抗体と、加湿チャンバー内で4℃での一晩のインキュベーションを行なった。その後、それらを、二次抗体(ビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン又はビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体;Zymed, カリフォルニア、San Francisco)とインキュベートして、ストレプトアビジンペルオキシダーゼに曝露し、ジアミノベンジジン(基質)で顕色させて、ヘマトキシリンで弱く対比染色した。
スフェロイドを収穫して、3分間、200gで遠心分離した。培養した単層細胞をトリプシン処理により収穫して、遠心分離により集めた。スフェロイド及びペレット化した単層細胞を、4%パラホルムアルデヒドを含むHBSS中で固定して、パラフィン包埋のために処理し;脱水(エタノール及びイソプロパノールの等級化シリーズ、各1時間)後、これらの試料を、先ず、パラフィンI(42℃で融解)に12時間、60℃で浸した。スフェロイド及び単層細胞を、再び、遠心分離により集めて、パラフィンII(56℃で融解)に12時間、70℃で浸した。その結果得られたパラフィンブロックを、最後に、室温まで冷却して、切片化のために整えた。組織化学的分析のために、パラフィン切片(4μm)を切り、脱パラフィンして、脱水した。次いで、切片を、3%H2O2とH2O中でインキュベートして内在性ペルオキシダーゼを阻害した。リン酸緩衝塩溶液中での洗浄後、これらの切片を、30分間、ブロッキング溶液(10%正常ヤギ血清)とインキュベートした後、対応する一次抗体と、加湿チャンバー内で4℃での一晩のインキュベーションを行なった。その後、それらを、二次抗体(ビオチン化ヤギ抗ウサギ免疫グロブリン又はビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリン抗体;Zymed, カリフォルニア、San Francisco)とインキュベートして、ストレプトアビジンペルオキシダーゼに曝露し、ジアミノベンジジン(基質)で顕色させて、ヘマトキシリンで弱く対比染色した。
スフェロイドにおけるアポトーシス細胞の検出
アポトーシス細胞を、ヌクレオソーム断片化生成物(TUNEL)の組織化学的検出により可視化した(In Situ Cell Death Detection キットを製造業者の指示に従って適用)。簡単にいえば、パラフィン包埋スフェロイドの切片中のヌクレオソーム断片化生成物を、脱パラフィン及びプロテイナーゼK消化後に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いるフルオレセイン−dUTPによる3’標識によって検出した。標識を、蛍光顕微鏡により直接可視化し又はこれらの切片をペルオキシダーゼ標識した抗フルオレセイン抗体とインキュベートしてジアミノベンジジン(基質)により顕色させた後に間接的に可視化した。
アポトーシス細胞を、ヌクレオソーム断片化生成物(TUNEL)の組織化学的検出により可視化した(In Situ Cell Death Detection キットを製造業者の指示に従って適用)。簡単にいえば、パラフィン包埋スフェロイドの切片中のヌクレオソーム断片化生成物を、脱パラフィン及びプロテイナーゼK消化後に、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いるフルオレセイン−dUTPによる3’標識によって検出した。標識を、蛍光顕微鏡により直接可視化し又はこれらの切片をペルオキシダーゼ標識した抗フルオレセイン抗体とインキュベートしてジアミノベンジジン(基質)により顕色させた後に間接的に可視化した。
DNA断片化酵素結合イムノアッセイ(ELISA)
断片化DNAの定量を、ELISA(Cell Death Detection ELISA キット)により行なった。10個のスフェロイドの断片化DNAを、60分間、室温で、激しく攪拌しながら溶解させることにより抽出した。抽出物を、10分間、13,000gで遠心分離して、300μlの上清を、ペルオキシダーゼ標識した抗DNA抗体及びビオチン化抗ヒストン抗体と、製造業者の指示に従って、ストレプトアビジンコートしたミクロ滴定プレート中でインキュベートした。洗浄後、モノ及びオリゴヌクレオソームDNAの結合を、ペルオキシダーゼ基質ABTS(2,2’−アジノ−ジ[3−エチルベンズチアゾリン−スルホネート])により顕色させることにより可視化した。プレートを、自動化ミクロ滴定プレートリーダーを用いて405nmで分析した。
断片化DNAの定量を、ELISA(Cell Death Detection ELISA キット)により行なった。10個のスフェロイドの断片化DNAを、60分間、室温で、激しく攪拌しながら溶解させることにより抽出した。抽出物を、10分間、13,000gで遠心分離して、300μlの上清を、ペルオキシダーゼ標識した抗DNA抗体及びビオチン化抗ヒストン抗体と、製造業者の指示に従って、ストレプトアビジンコートしたミクロ滴定プレート中でインキュベートした。洗浄後、モノ及びオリゴヌクレオソームDNAの結合を、ペルオキシダーゼ基質ABTS(2,2’−アジノ−ジ[3−エチルベンズチアゾリン−スルホネート])により顕色させることにより可視化した。プレートを、自動化ミクロ滴定プレートリーダーを用いて405nmで分析した。
統計的分析
すべての結果を、平均値±SDとして表した。実験群間の差異を、片側スチューデントt検定により分析した。P値<0.05を統計的に有意とみなした。
すべての結果を、平均値±SDとして表した。実験群間の差異を、片側スチューデントt検定により分析した。P値<0.05を統計的に有意とみなした。
参考文献の援用
言及したすべての刊行物及び特許を、そっくりそのまま、本明細書中に、各々が個別に援用されることを示されたように、参考として援用する。
言及したすべての刊行物及び特許を、そっくりそのまま、本明細書中に、各々が個別に援用されることを示されたように、参考として援用する。
主題の発明の特定の具体例を論じてきたが、上記の明細書は、説明用であって制限するものではない。この明細書及び下記の請求の範囲を概観すれば、この発明の多くの変形物が、当業者には、明らかとなろう。この発明の全範囲は、同等物の全範囲を加えた請求の範囲及びかかる変形物を加えた明細書を参照することにより決定されるべきである。
Claims (38)
- 動脈形成を刺激する方法であって、Dll4の細胞外ドメインを含む有効量の治療用ポリペプチドをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
- 治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:1のDSLドメインを含む、請求項1に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:1のアミノ酸27〜524を含む、請求項1に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、望ましい薬物動力学的特性を与える部分に共有結合されたSEQ ID NO:1のアミノ酸27〜524よりなる、請求項1に記載の方法。
- 該部分が、Fcドメイン又はポリオキシアルキレン部分よりなる群から選択される、請求項4に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、モノマーポリペプチドである、請求項1に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、哺乳動物内皮細胞において、有効濃度で、動脈表現型の発現を刺激する、請求項1に記載の方法。
- 動脈表現型を、EphrinB2の発現及びコネキシン37の発現よりなる群から選択する、請求項2に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、哺乳動物内皮細胞において、有効濃度で、静脈表現型の発現を阻止する、請求項1に記載の方法。
- 静脈表現型が、EphB4の発現である、請求項9に記載の方法。
- 患者が、虚血性疾患を有する、請求項1に記載の方法。
- 患者が、冠動脈疾患を有する、請求項1に記載の方法。
- 患者が、末梢動脈疾患を有する、請求項1に記載の方法。
- 患者が、虚血事象の危険にあると診断される、請求項1に記載の方法。
- 血管において動脈の特性を採択することを促進する方法であって、有効量のDll4細胞外ドメインを含む治療用ポリペプチドをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
- 治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:1のDSLドメインを含む、請求項15に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:1のアミノ酸27〜524を含む、請求項15に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、望ましい薬物動力学的特性を与える部分に共有結合されたSEQ ID NO:1のアミノ酸27〜524よりなる、請求項15に記載の方法。
- 該部分を、Fcドメイン又はポリオキシアルキレン部分よりなる群から選択する、請求項18に記載の方法。
- 血管が、静脈移植片である、請求項15に記載の方法。
- 静脈移植片が、伏在静脈移植片である、請求項20に記載の方法。
- 血管形成を阻止する方法であって、有効量のDll4細胞外ドメインを含む治療用ポリペプチドをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
- 治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:1のDSLドメインを含む、請求項22に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、SEQ ID NO:1のアミノ酸27〜524を含む、請求項22に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、望ましい薬物動力学的特性を与える部分に共有結合されたSEQ ID NO:1のアミノ酸27〜524よりなる、請求項22に記載の方法。
- 該部分を、Fcドメイン又はポリオキシアルキレン部分よりなる群から選択する、請求項25に記載の方法。
- 治療用ポリペプチドが、哺乳動物内皮細胞において、有効濃度で、VEGFに刺激された血管形成を阻止する、請求項22に記載の方法。
- 患者が、血管形成関連疾患を有する、請求項22に記載の方法。
- 血管形成関連疾患を、癌、良性腫瘍、炎症性疾患、慢性関節リウマチ及び乾癬、眼の血管形成性疾患、オスラー−ウェーバー症候群、心筋血管形成、プラーク新血管新生、末梢血管拡張症、出血性関節、血管線維腫、創傷顆粒形成、創傷治癒、末梢血管拡張乾癬硬皮症、発熱性肉芽腫、冠動脈側枝、虚血性四肢における血管形成、ルベオーシス、関節炎、及び糖尿病性新血管新生よりなる群から選択する、請求項28に記載の方法。
- 該治療用ポリペプチドと共に、血管形成を阻止する少なくとも一種の更なる抗血管形成剤を追加的又は相乗的仕方で投与することを更に含む、請求項22に記載の方法。
- 試験薬剤のDll4シグナリングに対する効果を評価する方法であって、該方法は、下記:
(a)内皮系統の細胞を該試験薬剤と接触させること;及び
(b)動脈又は静脈の表現型と関連する表現型を検出すること
を含み、ここに、動脈表現型を採択することを促進する試験薬剤又は静脈表現型を採択することを阻止する薬剤は、Dll4シグナリングのアゴニストであり、動脈表現型を採択することを阻止し又は静脈表現型を採択することを促進する試験薬剤は、Dll4シグナリングのアンタゴニストである当該方法。 - 試験薬剤を、下記よりなる群から選択する、請求項27に記載の方法:
(a)Dll4に選択的に結合する抗体;
(b)Notch1に選択的に結合する抗体;
(c)Notch4に選択的に結合する抗体;
(d)Notch1及びNotch4に結合する抗体;
(e)Dll4のNotchレセプター結合性部分を含むポリペプチドモノマー;
(f)Dll4のNotchレセプター結合性部分を含む2以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー;
(g)Notch1又はNotch4のDll4結合性部分を含むポリペプチドモノマー;
(h)Notch1又はNotch4のDll4結合性部分を含む2以上のポリペプチドを含むポリペプチドマルチマー。 - 動脈表現型を、EphrinB2の発現及びコネキシン37の発現よりなる群から選択する、請求項27に記載の方法。
- 静脈表現型が、EphB4の発現である、請求項27に記載の方法。
- 血管形成を刺激する方法であって、有効量のDll4シグナリングのアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
- 血管において動脈の特性を採択することを促進する方法であって、有効量のDll4シグナリングのアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
- 血管形成を阻止する方法であって、有効量のDll4シグナリングのアンタゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
- 血管形成を破壊する方法であって、有効量のDll4シグナリングのアゴニストをそれを必要とする患者に投与することを含む当該方法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US71363705P | 2005-09-01 | 2005-09-01 | |
PCT/US2006/034391 WO2007028110A2 (en) | 2005-09-01 | 2006-09-01 | Methods for using and identifying modulators of delta-like 4 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009507796A true JP2009507796A (ja) | 2009-02-26 |
Family
ID=37809626
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008529354A Pending JP2009507796A (ja) | 2005-09-01 | 2006-09-01 | デルタ様リガンド4のモジュレーターの利用及び同定方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20070213266A1 (ja) |
EP (1) | EP1928486A2 (ja) |
JP (1) | JP2009507796A (ja) |
AU (1) | AU2006287228B2 (ja) |
CA (1) | CA2621226A1 (ja) |
WO (1) | WO2007028110A2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011507852A (ja) * | 2007-12-20 | 2011-03-10 | バスジーン セラピューティクス,インコーポレイテッド | デルタ様4のモジュレーターの利用及び同定方法 |
JP2021518345A (ja) * | 2018-03-15 | 2021-08-02 | ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | 喘息またはアレルギー性疾患を処置するための方法 |
Families Citing this family (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8048418B2 (en) | 2004-10-29 | 2011-11-01 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with combination of Dll4 antagonists and VEGF antagonists |
NZ568739A (en) | 2005-12-16 | 2010-09-30 | Regeneron Pharma | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with delta-like ligand 4 antagonists |
US9567396B2 (en) | 2006-03-07 | 2017-02-14 | Evonik Degussa Gmbh | Notch inhibition in the prevention of vein graft failure |
US8133857B2 (en) * | 2006-03-07 | 2012-03-13 | The Brigham and Women's FHospital, Inc. | NOTCH inhibition in the treatment of atherosclerosis |
EP2029159A2 (en) * | 2006-06-06 | 2009-03-04 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for modulating vascular development |
SG175615A1 (en) * | 2006-06-06 | 2011-11-28 | Genentech Inc | Anti-dll4 antibodies and methods using same |
SI2054082T1 (sl) * | 2006-08-07 | 2013-04-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Uporaba DII4 antagonistov pri ishemični poškodbi ali vaskularni insuficienci |
EP3357932A1 (en) | 2006-09-29 | 2018-08-08 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for diagnosing and treating cancer |
RU2448979C2 (ru) * | 2006-12-14 | 2012-04-27 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Антитела человека к дельта-подобному лиганду-4 человека |
GB0709333D0 (en) * | 2007-05-15 | 2007-06-20 | Smart Targeting Ltd | Binding protein |
EP2424567B1 (en) * | 2009-04-27 | 2018-11-21 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Method for making heteromultimeric molecules |
TWI513465B (zh) | 2009-06-25 | 2015-12-21 | Regeneron Pharma | 以dll4拮抗劑與化學治療劑治療癌症之方法 |
HUE029661T2 (en) | 2009-10-16 | 2017-03-28 | Oncomed Pharm Inc | A therapeutic combination and use of DLL4 antagonist antibodies and antihypertensive agents |
EP2493497A4 (en) | 2009-11-01 | 2013-07-24 | Brigham & Womens Hospital | INHIBITION OF NOTCH FOR THE TREATMENT AND PREVENTION OF OBESITY AND METABOLIC SYNDROME |
US20110165162A1 (en) * | 2009-12-01 | 2011-07-07 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods for Treating Cancers Comprising K-ras Mutations |
US8551479B2 (en) | 2010-09-10 | 2013-10-08 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating melanoma |
US9527925B2 (en) | 2011-04-01 | 2016-12-27 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Bispecific binding molecules binding to VEGF and ANG2 |
ES2707580T3 (es) | 2011-09-23 | 2019-04-04 | Oncomed Pharm Inc | Agentes de unión a VEGF/DLL4 y usos de los mismos |
WO2014071018A1 (en) | 2012-10-31 | 2014-05-08 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods and monitoring of treatment with a dll4 antagonist |
JP6827415B2 (ja) | 2014-10-31 | 2021-02-10 | メレオ バイオファーマ 5 インコーポレイテッド | 疾患の処置のための併用療法 |
EP3353204B1 (en) | 2015-09-23 | 2023-10-18 | Mereo BioPharma 5, Inc. | Bi-specific anti-vegf/dll4 antibody for use in treating platinum-resistant ovarian cancer |
WO2023063842A1 (ru) | 2021-10-12 | 2023-04-20 | Общество с ограниченной ответственностью "Пальмира Биофарма" | Нуклеотидная последовательность, кодирующая слитый белок |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4946778A (en) | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
ATE442373T1 (de) * | 1995-06-28 | 2009-09-15 | Imp Cancer Res Tech | Nukleotid- und proteinsequenzen von delta-genen von vertebraten und darauf basierende methoden |
US6121045A (en) * | 1997-04-04 | 2000-09-19 | Millennium Biotherapeutics, Inc. | Human Delta3 nucleic acid molecules |
EP1004669B1 (en) * | 1997-05-14 | 2007-04-18 | Asahi Kasei Kabushiki Kaisha | Novel differentiation inhibitor |
CA2367213A1 (en) * | 1999-03-18 | 2000-09-21 | Children's Medical Center Corporation | Novel antiangiogenic peptides |
US6689744B2 (en) * | 2000-09-22 | 2004-02-10 | Genentech, Inc. | Notch receptor agonists and uses |
-
2006
- 2006-09-01 US US11/514,773 patent/US20070213266A1/en not_active Abandoned
- 2006-09-01 JP JP2008529354A patent/JP2009507796A/ja active Pending
- 2006-09-01 WO PCT/US2006/034391 patent/WO2007028110A2/en active Application Filing
- 2006-09-01 EP EP06814124A patent/EP1928486A2/en not_active Withdrawn
- 2006-09-01 AU AU2006287228A patent/AU2006287228B2/en not_active Ceased
- 2006-09-01 CA CA002621226A patent/CA2621226A1/en not_active Abandoned
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2011507852A (ja) * | 2007-12-20 | 2011-03-10 | バスジーン セラピューティクス,インコーポレイテッド | デルタ様4のモジュレーターの利用及び同定方法 |
JP2021518345A (ja) * | 2018-03-15 | 2021-08-02 | ザ チルドレンズ メディカル センター コーポレーション | 喘息またはアレルギー性疾患を処置するための方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2621226A1 (en) | 2007-03-08 |
WO2007028110A3 (en) | 2007-07-26 |
EP1928486A2 (en) | 2008-06-11 |
WO2007028110A2 (en) | 2007-03-08 |
AU2006287228A1 (en) | 2007-03-08 |
AU2006287228B2 (en) | 2012-12-13 |
US20070213266A1 (en) | 2007-09-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2009507796A (ja) | デルタ様リガンド4のモジュレーターの利用及び同定方法 | |
US7906116B2 (en) | Methods for using and identifying modulators of Delta-like 4 | |
AU2007338734A1 (en) | Methods for using and identifying modulators of delta-like 4 | |
JP6243133B2 (ja) | 乳癌を治療または予防するためのアクチビンActRIIaアンタゴニストおよび使用 | |
KR101951410B1 (ko) | 항-전이성 요법에서 axl 신호전달의 저해 | |
JP2017222725A (ja) | アクチビン−ActRIIa拮抗薬およびFSH分泌を低減または阻害するための使用 | |
ES2532405T3 (es) | Proteínas de fusión basadas en Notch3 humanas como inhibidores señuelo de la señalización de Notch3 | |
JP2008514618A (ja) | 血管形成及び腫瘍増殖阻害用ポリペプチド化合物 | |
KR20010101194A (ko) | 결합 조직 성장인자 단편, 그의 제조 방법 및 그의 용도 | |
US6498144B1 (en) | Use of scatter factor to enhance angiogenesis | |
JP2003504315A (ja) | 血管新生標的免疫複合体 | |
JP2004154140A (ja) | 血管形成及び心血管新生の促進又は阻害 | |
Glienke et al. | CRIM1 is involved in endothelial cell capillary formation in vitro and is expressed in blood vessels in vivo | |
US20020045591A1 (en) | Methods and therapeutic compositions for treating cancer | |
US6635483B1 (en) | Compound and methods of inhibiting or stimulating presenilin 1 and related pharmaceuticals and diagnostic agents | |
US7538088B2 (en) | Method for inhibiting angiogenesis by administration of the extracellular domain of D1-1 polypeptide | |
JP5470261B2 (ja) | 大動脈瘤非ヒト動物モデルの作出方法 | |
AU2006331649B2 (en) | Isolated MCPIP and methods of use | |
JP2004506595A (ja) | 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害 | |
US7622443B2 (en) | Method for inhibiting pro-angiogenic activities of endothelial cells selectively at a site of neoangiogenesis in a mammal by administration of the extracellular domain of D1-1 polypeptides | |
JP2008525050A (ja) | ゼブラフィッシュのヘテロ三量体Gタンパク質γ2サブユニット(GNG2) | |
JP2009526861A (ja) | 血管新生標的としてのgpcr | |
US9670259B2 (en) | Method of inhibiting angiogenesis using inhibitors of G-protein-coupled receptor kinase interacting protein-1 (GIT1) | |
WO2012068477A1 (en) | Methods and compositions for inhibiting angiogenesis and tumor growth |