WO1998005970A1

WO1998005970A1 - Procedes d'analyse des reactions de rejet chroniques consecutives aux transplantations d'organes et de detection de composants urinaires

Info

Publication number: WO1998005970A1
Application number: PCT/JP1997/002627
Authority: WO
Inventors: Isamu Koyama; Tadaki Yasumura; Kyuichi Nemoto; Takako Mae; Kan Saiga; Hisako Takagi; Atsuko Isoda; Toshio Tanabe
Original assignee: Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 1998-02-12
Also published as: PL331480A1; CZ32299A3; AU726351B2; US6210912B1; EP0985932A1; CN1226967A; AU3635897A; CA2261739A1; BR9710776A; EP0985932A4; KR20000029575A

Description

明細書

臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法及び尿中の成分の測定方法

技術分野

本発明は、体外に取り出した体液を計測することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を検定するための検査方法に関し、詳細には、体液中の三酸化窒素 (N O 、マトリックスメタロブ口テア一ゼー 2 (以下「MM P— 2」という）又はその前駆体を検出することにより、臓器移植後の慢性期に出現する拒絶反応 (慢性拒絶反応）を検^するための検査方法、及び、尿中の MM P— 2 又はその前駆体の測定方法に f¾lする。背景技術

腎移植患者での慢性：絶）乂^の断においては、一般に腎生険が行われている。しかし、定期的な膂 1:.検は^ /ίに ^痛を与えると同時に腎機能低下をもたらす可能性がある。さらに、 ft' j'絶の進行は緩慢で、自覚症状に乏しく、苦痛を伴う腎生換は多くの患者に 11·: Aされる。

一方において、慢性 :絶 h t,により ¾機能が低下するため、慢性拒絶反応の進行の指標として腎機能検か uわれている。この検査においては、糸球体の異常を反映する「蛋白質透過 ' ;Λ進の指標」として、尿蛋白、尿中アルブミン、尿中トランスフェリンなどが、乂、「糸球体濾過値（ G F R ) 低下の指標」として、血中クレアチニン、血中 ^窒素（ B U N ) 、血中 5₂— ミクログロブリン、血中 α ,—ミクログロブリンなどが測定されている。しかし、慢性拒絶反応の進行によるこれらの検査値の変化は緩慢であり、検査値の異常が確認された時には慢性拒絶反応は末期症状を示している。今まで、尿や血液などの体液中の内因性物質の濃度を測定することによって、慢性拒絶反応の早期発見を可能とする様な検査方法は知られていない。現在、このように簡便な検査方法がないために、自覚症状に乏しい慢性拒絶反応を呈した患者は適切な処置を施されることなく末期症状となり、腎機能を喪失する場合が多く見られる。本発明は、臓器移植後の慢性拒絶反応の早期発見を可能とする簡便な検査方法を提供することを目的とする。発明の開示

N 0₃及び N0₂は N Oラジカルの生体内での最終代謝体である。 N Oラジカルは炎症、臓器傷害時に白血球やマクロファージ等から産生される。そのため、臨床的にも炎症、臓器傷害に起因する虚血性心疾患、ショック、移植後の急性拒絶反応、細菌感染時などに検出される。しかし、移植後の慢性拒絶反応においてはその報告がない。そこで、慢性的進行による拒絶反応に対して N 0₃の生体内での産生が見られるか否か、体液中の N 0₃が慢性拒絶反応の検査のマーカーになりうるか否かについて検討し、体液中の N 0 が慢性拒絶反応の検杏のマーカーとなり όることを見い出した。

また、 MM Ρ— 2は基底膜を構成するコラーゲンを分解する酵素で、組織の修復ゃ再生時に働く。また、癌においては、癌細胞の基底膜への浸潤時にコラーゲンを分解する酵素として働くと考えられている。本発明者らは鋭意検討した結果、 MM P— 2又はその前駆体は、健常人の尿などの体液や、慢性拒絶反応を起こしていない臂移植患者の尿などの体液には漏れ出さないか、漏れ出しても非常に微量しか漏れ出さないが、臓器移植後の慢性拒絶患者では、この尿等の体液中の M M P— 2又はその前駆体の量が著しく増大することを見い出した。本 ¾明は、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症に伴つて、血液や尿などの体液中に分泌される N 0₃や MMP— 2又はその前駆体等の内因性物質の濃度が著しく増大するという知見に基づいて、体液中のこれらの内因性物質を検定することによる臓器移植後の拒絶反応を検査する方法、それに使用する検査用キット及び尿中の MM P— 2又はその前駆体の測定方法を提供するものである。

即ち、本発明は、

( 1 ) 体外に取り出した体液を計測することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を早期に検定するための検査方法、

( 2 ) 体液中の N 0₃、 MM P— 2又はその前駆体を検出することを特徴とする臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法、 ( 3 ) 体液中の N 0₃を検出することを特徴とする丄記（ ² ) 記載の検査方法、

( 4 ) 体液中の MM P一 2又はその前駆体を検出することを特徴とする上記 ( 2 ) 記載の検査方法、

( 5 ) 体液がヒトの尿又は血液である上記（ 2 ) 、（ 3 ) 又は（ 4 ) 記載の検査方法、

( 6 ) 尿検体中の MMP— 2又はその前駆体を検出することを特徴とする上記 ( 2 ) 記載の検査方法、

( 7 ) 臓器移植が腎移植である上記（ 2 ) 、（ 3 ) 、（ 4 ) 、（ 5 ) 又は（ 6 記載の検査方法、

( 8 ) 尿検体中の MM P— 2前駆体濃度として 0. 1 から 1 0. O n g/m l の範囲の間に、腎移植慢性拒絶反応の有無を判定するためのカツトオフ値を設定する上記（ 6 ) 記載の検査方法、

( 9 ) カットオフ値を 0. 5から 5. O n g/m l の範囲の問に設定する上記 ( 8 ) 記載の検査方法、

( 1 0 ) 尿検体中の MMP— 2前駆体濃度およびクレアチニン濃度を測定し、クレアチニン濃度で補正することにより得られるインデックス力 s、 0. 1から 2

0. 0 g/g · クレアチニンの範囲の間に、腎移性拒絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定する上記（ 6 ) 記載の検査方法、

( 1 1 ) カットオフ値を 0. 5から 1 0. 0 g/ g ' クレアチニンの範囲の間に設定する上記 ( 1 0 ) 記載の検査方法、

( 1 2 ) 検出が免疫測定法による検出である上記 ( 2 ) 及び（ 4 ) 〜（ 1 1 ) のいずれかに記載の検査方法、

( 1 3 ) 免疫測定法が酵素免疫測定法である上記（ 1 2 ) 記載の検査方法、

( 1 4 ) 免疫測定法がサンドイッチ法である上記（ 1 2 ) 又は（ 1 3 ) 記載の検査方法、

( 1 5 ) 尿中の MMP— 2又はその前駆体を免疫測定法で測定する尿中 MMP 一 2又はその前駆体の測定方法、

( 1 6 ) 体外に取り出した体液を計測することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を早期に検査するためのキット、 ( 1 7 ) 体液中の三酸化窒素（N 0 、又は、マトリックスメタロブ口テア一ゼ（MMP) — 2若しくはその前駆体を検出することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を検査するためのキット、

( 1 8 ) 尿又は血液中の MMP— 2又はその前駆体を検出することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を検査するためのキット、

( 1 9 ) 検査が免疫測定法である上記（ 1 8 ) に記載のキット、

( 2 0 ) 体液を計測することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応を早期に診断する方法、

( 2 1 ) 体液中の三酸化窒素（N 0₃) 、又は、マトリックスメタロブ口テア一ゼ（MM P ) — 2若しくはその前駆体を検出することを特徴とする臓器移幢後の慢性拒絶反応の診断方法、

( 2 2 ) 体液が尿又は血液である上記 ( 2 1 ) に ^の診断方法、

に関する。図面の簡単な説明

図 1は臂移植患者の尿中 M M P _ 2前駆体濃度のヒストゲラムを示し、図 2は筲移植患者の尿中 MMP— 2前駆体濃度をクレアチニン ^度により補正した場合のヒストグラムを示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、臓器移植後の慢性拒絶反応により、体液中に特異的に分泌された内因性物質を測定することにより、臓器移植後の慢性拒絶反応を早期かつ簡便に測定することができる方法を提供するものである。本発明の体液（検体）としては、例えば尿や、血清、血漿等の血液等のヒト等の体液が挙げられる。尿検体としては、 MM P— 2又はその前駆体等の検出する物質が安定に保てるように採尿、または、採尿後保存されたものであれば何であってもよく、また、採尿の時期と方法も、 MMP— 2又はその前駆体等の臨床的意！?.を損なわない範囲であれば、特に制限されることはなく、通常の方法で採尿されたもの又は保存されたものは、いずれも使用できる。例えば、蓄尿時の安定性を保っために抗菌剤等を添加した容器で採尿することがあるが、添加した抗菌剤等が測定に干渉を及ぼさない限り、この様な検体も使用できる。また、臓器移植としては、腎移植、肝移植、心移植、膝移植等が挙げられ特に限定されないが、腎移植の場合が特に好ましい。

内因性物質としては、二 βδ化窒素（Ν 0₃) やマトリヅクスメタロブ口テアーゼ ( Μ Μ Ρ ) 一 2又はその前駆体などが挙げられる。

検体中の N O ₃量を測定（定量等）する方法は公知（例えば G r i e s s法）であり、本発明における N 0 の測定も公知の方法に従って行なうことができる。例えば、市販されている窒素、亜硝酸性窒素自動測定装置を使用し、高速液体クロマトグラフィー（ H P L C ) で定量することができる。又、 9 6穴等のマイクロブレー卜を用い、マクロブレートリ一ダ一等により測定することもでき、市販の N 0比色測キ ' ト、 N 0蛍光測定キ 'ソト等が使用できる。その他にも、 N 0₃を定量することかてきる装置であれば、いずれも使用することができる,

N 0₃は、健常人や慢性 ί! '：絶反を起こしていない臓器移植患者の血清等にも存在するが、慢性拒絶反^をこしている臓器移植患者の場合は、血清等に存在する Ν 0₃の量は有意に |·. W.する。従って、カットオフ値を適当な値に定めることにより、慢性拒絶反応を起こしているか否かを精度良く判定することが出来る。力ットオフ値は、使用する険体の種類や移植臓器の種類により異なり、それらの種類に応じて適宜決定されるか、 f 移植患考の血清を検体として用いる場合、 5 0 〜 1 2 0〃 M (該血清中の N 0 ,濃度）の範囲内でカットオフ値を定めるのが好ましい。

MMP— 2は、その前駆体であるプロ MMP— 2 ( p r o MMP - 2 ) として細胞外に放出され、細胞外で MM P— 2に変換される。本発明において、 MMP 一 2の前駆体とは、それが分解されることにより MM P— 2となりうるものを言い、具体的にはブ：： MM P— 2を意味する。このプロ MMP - 2は、 T I MP

V T 1 s s u e i n h i b i t o r o f m e t a l l o p r o t e i n a s e ) 一 2、 T I MP— 1等のインヒビターと複合体を形成していてもよく、本発明における前駆体には、複合体の形で存在するプロ MM P— 2 も含まれ、プロ MM P - 2の存在様式は特に限定されない。

検体中の MMP— 2又はその前駆体を検出（定量等）する方法は公知であり、本発明における MM P— 2又はその前駆体の検出（定置等）も公知の方法に従つて行なうことができる。例えば、 MM P— 2又はその前駆体に特異的な系で MM P— 2又はその前駆体を測定し、「蛋白質濃度」または「酵素活性値」等として MMP— 2又はその前駆体の港度等を求めることにより実施することがでる。 M M P— 2 又はその前駆体の澳度等を求める場合、 MM P— 2 又はその前駆体に特異的な方法であれば、どの様な方法を用いてもよく、特に限定されないが、簡便かつ高感度で、再現性のよい方法が好ましい。

より具体的に示すと、「蛋白質濃度」を求める方法としては、 MM P— 2又はその前駆体に特異性を有する抗体を用いて免疫学的に測定する方法がある。また、 Γ酵素活性値」を求める方法としては、 ΜΜ Ρ— 2 に特異性の高い基質を用いて、生化学的に測定する方法がある。

生化学的に酵素活性を測定する方法において、 MM Ρ— 2 に：！択性の高い基質としては検体中に存在する MM P— 2以外の酵素、例えば、セリンブ口テアーゼ、ぺブチダーゼ、エステラーゼなどの酵素類で加水分解され難く、 MM P— 2で容易に加水分解される基質、例えば、ゼラチン、コラーゲン、またはこれらの特徴的構造部分を有する合成基質が挙げられるが、好ましい基質としては、（ 7 —メトキシクマリン一 4一ィル）ァセチルー Lーブロリル一 L—口イシルーグリシル — L一口イシルー L一 C N - ( 2， 4一ジニト [' フエニル）一 L— 2， 3—ジァミノブ口ピオ二トリル〕一 L—ァラニル一 L—アルギニンアミド ( M C A ) 又は、 N—ァセチルー Lーブロリル一 L一口イシルーグリシルー L一口イシルー L一口イシルーグリシルェチルエステルなどが挙げられる。

MM P — 2の酵素活性を測定する方法としては、 MM P— 2 による基質の加水分解産物を直接測定してもよいが、該加水分解産物の何れかを高感度かつ特異的に検出できる系と組み合わせて、間接的に測定してもよい。

この方法による MM P — 2前駆体の検出（定量等）は、公知の方法（例えばトリブシン又は 4 ーァミノフエニル水銀齚酸（A P MA) による処理）により MM P— 2前駆体を分解して MM P— 2 を生成させ、生成した MM P— 2の酵素活性を測定することにより行うことが出来る。

免疫測定法としては公知のあらゆる方法が使用できる。固相を用いる一般的な免疫測定法としてはサンドイッチ測定法、競合法や抑制法（ b i n d i n g i n h i b i t i o n a s s a y) が使用できる。特殊な方法としては、酵素一基質の結合性を利用し、抗体の代わりに基質を固相に固定して用いる測定系や、標識抗体を使用せずに、固相化抗体への MMP— 2又はその前駆体の結合を表面ブラズモン（ S P R) で直接検出する方法などがある。具体的には特開昭 6 0— 2 1 8 7号公報、特公平 7 - 3 4 0 1 4号公報、特開平 6— 2 1 3 8 8 8号公報、特開平 7— 1 5 9 4 0 2号公報などに開示されている。また、ラテックスや血球を用いた凝集反応や比濁法、あるいはウェスタンプロット法での測定もあげられる。これらの方法はその測定原理において相違はある力⁵、いずれの方法でも測定できる。一般的には不溶性担体に固定した抗体と標識抗体によるサンドィツチ測定法が好適である。

免疫測定法に使用する抗体はポリクロナール抗体であってもモノクロ一ナル抗体であってもよい。抗体の由来する動物種も問わない。サンドイッチ測定法の様に 2種の抗体を使用する場合、固相化抗体と標識抗体によってサンドィツチ複合体が形成される組み合わせであれば、固相化抗体と標識抗体に同種の抗体を使用しても、異種の抗体の組み合わせであってもよい。抗体に標識する物質としては放射性物質、酵素、蛍光物質等やピオチンなどが使用できる。

本発明の慢性拒絶反応の検査方法では、 MMP— 2若しくはその前駆体の測定値（「蛋白質濃度」や「酵素活性値」等）自体又はその上昇の度合いを、直接、慢性拒絶の判定に用いてもよい力他のマーカ一との比を求めて相対化し、 MM P— 2若しくはその前駆体とのインデックスとして判定に用いてもよい。例えば、尿を検体とした場合、尿中のクレアチニン濃度で補正する方法（尿中の MMP— 2又はその前駆体の濃度を尿中のクレアチニン濃度で除する方法）等が挙げられる。本発明の検査方法を実施するにあたり、ほぼ正常な臓器機能を有する臓器移植患者の少なくとも 9 0 %以上が正常と判断される範囲にカツトオフ値を設定し検査するのが好ましい。また、臓器移植患者の N 0₃又は MM P— 2若しくはその前駆体を定期的に測定し、測定値あるいはインデックスの上昇の度合いから慢性拒絶反応の発症を判断することも可能である。

又、本発明は、換体中の MMP— 2若しくはその前駆体を定量せずに、以下の実施例に示したように、例えば、ゼラチン等の基質を含むポリアクリルアミドゲル中で電気泳動を行ないゼラチン等の基質の分解によるバンドが生じるか否かをみることによる方法等の方法によっても行うことができる。

以下、実施例によって、本発明を具体的に説明するが、本発明がこれらの実施例のみに限定されるものではない。

実施例 1

齊生検で慢性拒絶反応と診断された腎移植患者（A ) 、腎生検等で慢性拒絶反応を起こしていないと診断されたほぼ正常な腎機能（血^クレアチニン値； 1.2m g/dl以下）の腎移植患者（B ) 及び健常人（ C ) の血，,'ίを検体として、硝酸性 Ν、亜硝酸性 Ν自動測定装置（ T C I 一 Ν 0 X 1 0 0 0、 ' 京化成工^ (株））を用いて Ν 0₃量を測定した。その結果、表 1 に示した：こ n fr:絶反応と診断された膂移植患者の血清 N 0₃濃度は正常な腎機能を ¾ した f M.'i^f,fiの血清 N 0₃濃度、健常人の血清 N〇 ₃漉度より、有意に高値であった。 nil屮 N 0 が、慢性拒絶反応の有効なマ一カーとなっていることを示している。表 1. 腎移植患者及び健常人の血清 N 0₃濃度（ I ) 検体検体数（ n ψ均 ίι(!： *r . (範囲

Aの血清（慢性拒絶反応） 15 238.2± 133.3 ( 74.3 - 536.5 ) Bの血清（非慢性拒絶反応） 24 35.8± 21.6 ( 4.3- 83.7) Cの血清（健常人） 7 31.6土 15.0 (15.4- 59.6)

* pく 0.01 非慢性拒絶反応又は健常人との比較（T一検定）実施例 2 (ザィモグラム；生化学的な M M P— 2活性の検出）

尿検体に、等量の S % S D S、 4 0 %グリセロールをむ 0. 5 M トリス緩衝液（ρ Η 6 · 8 ) を加え、よく混合した。 l m g/m lゼラチンを含む 8 %ポリァクリルァミドゲルを作製後、上記混合物をポリアクリルァミドゲル中で電気泳勖する。泳動終了後、ゲルを 2 . 5 % トライトン X一 1 0 0 を含む 1 0 mM トリス緩衝液（ p H 8. 0 ) で、室温で 3 0分 2回振還しながら洗った。次いで、 0 , 5 mM塩化カルシウム、 1 0 〃 M塩化亜鉛を含む 5 O mM トリス緩衝液 ( p H 8 , 0 ) に交換し、 3 7 °Cで 1 6時間インキュベートした。ゲルを 1 %クマジーブル一 R— 2 5 0、 5 %酢酸、 1 0 %メタノールで 3 0分間染色後、 5 %酢酸、 1

0 %メタノールで脱色した。

ゼラチン分解酵素（MM P— 2 ) の存在する場所に一致して、青いバックグラゥンドの中に透明なバンドが見えた。

実施例 3

腎生検及び血清クレアチニン倘（ 2. 0 m g / d 1以上）により慢性拒絶と診断された、 1 年以上 ί¼·に移を受けた患者、及び、血清クレアチニン値が 1 . 5 m g/ d l以下で、 i移 Wi後 1 年以内の、腎生検等により慢性拒絶を起こしていないと診断されたほほ ii: な^機能の患者（対照群）の尿を検体として、実施例 2の方法で MM P— 2 ;Vi性を検出した。その結果、慢性拒絶患者の尿検体で 1 0例中 8例で分子量 7 0 k Dの M M P — 2が検出されたのに対し、対照群の患者で検出されたのは 1 4例巾 1 例であった。

これは、 MM P— 2の S度の！：昇が、慢性拒絶の有効なマーカーとなっていることを示している。

実施例 4 (免疫測定;' による中の M M P _ 2前駆体濃度の測定）

MM P— 2前駆体分 - の異なる部位を認識する 2種のモノクローナル抗体を用いた、血清を対象とする ¾ 薬品工業社製の ΜΜ Ρ— 2測定キット（ p r o M M P— 2及びこれと T I M P— 2 との複合体を検出し、 MM P— 2は検出されない。）を用いた。しかし、血清中に比べて尿中の MM P— 2前駆体濃度が低いため、その操作条件を変更して測定した。すなわち試験管に尿あるいはキット添付の標準液を 1 5 0 1 とり 1 %牛血清アルブミンと 1 O mM E D T Aを含む 3 0 mMリン酸生理食塩水 p H 7 . 0 を加えてよく混合した後、抗体結合ビーズを入れて、室温で 2時間反応させた。反応液をァスビレーターで吸引除去し、キット添付の標識抗体液を 3 0 0 1加えて、室温で 1 時間反応した。再び反応液をァスビレーターで吸引除去し、ビーズを別の試験管に移し、キット添付の発色液を 3 0 0 1加えて室温で 3 0分間反応した。キット添付の停止液 1 5 0 0 1を加えて、反応を停止した。精製水を対照にして、反応液の波長 4 9 2 nm の吸光度を測定し、標準液から得られた吸光度をもとに作成した検量線より、尿検体中の MMP— 2前駆体 ¾度を求めた。また、同時に尿中のクレアチニン濃度を常法により測定し、クレアチニンで補正した尿中の MMP— 2前駆体濃度を算出した。

実施例 5

腎生検及び血清クレアチニン値により慢性拒絶と診断された、 1年以上前に臂移植を受けた患者 8例（発症群）、及び、血清クレアチニン値が 1. 5 m g/ d 1以下で、腎移植後 1年以内の、腎生検等により慢性拒絶を起こしていないと診断されたほぼ正常な腎機能の患者 3 6例（対照群）の尿を検体として、実施例 4 の方法で MM P— 2前駆体濾度を測定した。クレアチニン補正しない場合と、した場合のヒストグラムを図 1及び図 2に示す。クレアチニン補正をしない場合にカットオフ値を l n g/m l とすると対照群の 9 2 %は陰性に判定され、腎移植慢性拒絶と診断された患者は 1 0 0 %陽性と判定された。クレアチニン補正をした場合、カツトオフ値を 5 i g/ g · クレアチニンとすると対照群の 9 5 %は陰性になり、腎移植慢性拒絶と診断された患者は 1 0 0 %陽性と判定された。また. カヅトオフ値を l / g/ g · クレアチニンにしても対照群の 8 S %は陰性に判定された。

実施例 6

2例の腎移植患者について腎移植慢性拒絶の発症前及び発症後の尿を検体として、実施例 4の方法で MM P— 2前駆体濾度（クレアチニン補正値）を測定した, 結果を表 2に示す。 MM P— 2前駆体澳度は発症後大きく上昇しており、 MMP 一 2前駆体の瀵度の上昇が、腎移植慢性拒絶の発症を判定するのに役立つことを示している。表 2 発症前発症後

( J g/ g · クレアチニン） ( g / S · クレアチニン）患者 1 1. 3 1 4. 6

患者 2 0. 6 2 9. 4

産業上の利用可能性

本発明の検査方法を実施することにより、血清、尿等の体液（検体）中の N O MM P— 2 又はその前駆体の濃度の上昇等から、慢性拒絶反応の早期発見が可能となる。

Claims

請求の範囲

1 . 体外に取り出した体液を計測することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を早期に検定するための検査方法。

2. 体液中の三酸化窒素（N 0₃) 、又は、マトリックスメタロブ口テア一ゼ（M MP ) — 2若しくはその前駆体を検出することを特徴とする臓器移植後の慢性拒絶反応の検査方法。

3. 体液中の N 0₃を検出することを特徴とする請求の範囲第 2項記載の検査方法

4. 体液中の MM P— 2 又はその前駆体を検出することを特徴とする請求の範囲第 2項記載の検査方法。

5 . 体液がヒトの尿又は血液である請求の範囲第 2、 3、又は 4項に記載の検査方法。

6 . 尿検体中の MM P— 2 Xはその前駆体を検出することを特徴とする請求の範囲第 2項記載の検査方法。

7 . 臓器移植が腎移植である請求の範囲第 2〜 6 ®のいずれか 1 項に記載の検査方法。

8. 尿検体中の MM P— 2前駆体'濃度として 0. 1 から 1 0 . O n g/m lの範囲の間に、腎移植後の慢性拒絶反応の有無を判定するためのカツトオフ値を設定する請求の範囲第 6項に記載の検査方法。

9. カットオフ値を 0 . 5 から 5. O n g/m lの範 ISの問に設定する請求の範囲第 8項記載の検査方法。

1 0 · 尿検体中の MM P— 2前駆体濃度およびクレアチニン濃度を測定し、クレァチニン '濃度で補正することにより得られるインデックスが、 0. 1 から 2 0 . O g/ g · クレアチニンの範囲の間に、腎移植後の慢性拒絶反応の有無を判定するためのカットオフ値を設定する請求の範囲第 6項記載の検査方法。

1 1. カットオフ値を 0 . 5から 1 0. 0 u g/ g ' クレアチニンの範囲の間に設定する請求の範囲第 1 0項己載の検査方法。

1 2. 検出が免疫測定法による検出である請求の範囲第 2項及び 4項〜 1 1項のいずれかに記載の検査方法。

1 3. 免疫測定法が酵素免疫測定法である請求の範囲第 1 2項記載の検査方法。

1 4. 免疫測定法がサンドイッチ法である請求の範囲第 1 2項又は 1 3項記載の検査方法。

1 5. 尿中の MM P— 2 又はその前駆体を免疫測定法で測定する尿中 MMP— 2 又はその前駆体の測定方法。

1 6. 体外に取り出した体液を計測することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を早期に検査するためのキット。

1 7 . 体液中の三酸化窒素（ N 0₃) 、又は、マトリックスメタロブ Dテアーゼ (MM P ) 一 2若しくはその前駆体を検出することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の発症を検査するためのキット。

1 8. 尿又は血液中の M M P— 2 又はその前駆体を検出することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応の ¾ を検査するためのキット。

1 9. 検査が免疫測定法である^求の範囲 1 8項に記載のキット。

2 0. 体液を計測することによる、臓器移植後の慢性拒絶反応を早期に診断する方法。

2 1 . 体液中の三酸化^ （ N 0 ₃) 、又は、マトリックスメタロブ口テアーゼ (MM P ) 一 2若しくはその前駆体を検出することを特徴とする臓器移植後の慢性拒絶反応の診断方法。

2 2. 体液が尿又は血液である請求の範囲 2 1項に記載の診断方法。