KR102277068B1 - 급성 신장 이식 거부 반응 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 급성 신장이식 거부 반응을 현장에서 즉시 진단할 수 있는 분자 진단 기반의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트에 관한 것으로서, 신장 이식 거부반응을 나타내는 바이오마커인 IP-10에 의해 작동되는 토홀드 스위치를 포함하며, 상기 스위치의 작동에 의한 단백질 발현여부를 확인할 수 있는 급성 신장이식 거부반응 진단용 조성물 및 이를 이용한 급성 신장이식 거부반응 진단을 위한 정보 제공 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 급성 신장이식 거부 반응을 현장에서 즉시 진단할 수 있는 분자 진단 기반의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트에 관한 것이다.
신장 이식 환자의 경우, 급성 거부 반응의 초기 분석은 매우 중요한 사항이다. 이를 진단하기 위하여 종래에는 Needle biopsy와 같은 침습적인 방법을 이용하였으나, 이러한 방법은 수술의 여러 합병증을 유발하고, 여러 번 샘플을 채취하여야 하기 때문에, 이를 대신할 수 있는 비침습적 진단법에 대한 필요성이 대두되고 있다.
근래 주로 수행되고 있는 진단 방법으로서 PCR 방법은 신장 이식 환자에서 급성 거부 반응의 비 침습적 분석을 위한 유망한 방법으로 제안되고 있다. 그러나, PCR 기반 진단 방법의 정확성과 민감성에도 불구하고, 분석을 위해서는 전문적인 지식 및 기술을 필요로 하고, 진단을 내리는 데 오랜 시간이 걸린다는 단점이 있으므로, 현장에서 즉시 사용할 수 있는 진단방법으로는 적절하지 않다. 이러한 이유로, 신장 이식 환자에 있어, 급성 거부 반응을 조기 진단하기 위해 합리적인 가격으로 현장 진단이 가능한 진단 키트의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
이에 본 발명자들은, 급성 신장이식 거부 반응을 현장에서 즉시 진단할 수 있는 무세포 합성 방법 기반의 급성 신장이식 거부 반응 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트와, 이를 이용한 급성 신장이식 거부 반응 진단에 필요한 정보 제공 방법에 관한 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명의 목적은, 토홀드 도메인, 개시 코돈을 포함하는 줄기 도메인 및 리보솜 결합 부위를 포함하는 루프 도메인 및 리포터 단백질 코딩 도메인이 포함된 토홀드 스위치를 포함하는 신장이식 거부반응 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 환자로부터 분리된 시료를 상기 토홀드 스위치를 포함하는 조성물에 혼합 후 배양하여 리포터 단백질의 발현여부로부터 신장이식 거부 반응을 진단하는 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은, 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열 중 하나의 서열로 선택되는 IP-10 RNA 유래 서열을 포함하는 토홀드 도메인, 개시 코돈을 포함하는 줄기 도메인, 리보솜 결합 부위를 포함하는 루프 도메인 및 리포터 단백질 코딩 도메인이 포함된 토홀드 스위치를 포함하는 급성 신장이식 거부 반응 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 급성 신장 이식 거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법으로서, 환자로부터 분리된 시료를 채취하는 단계; 제1항의 조성물에 채취된 시료를 주입하여 배양하는 단계; 및 상기 배양 결과물로부터 리포터 단백질의 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는 분석 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 토홀드 스위치를 이용하여 환자의 시료 내에 존재하는 IP-10(Interferon Gamma-Induced Protein 10) 유전자의 존재 여부를 확인할 수 있는 조성물로서, 시료 내에 IP-10 유전자로부터 유래된 RNA 존재 시, 상기 스위치가 작동되도록 하는 원리를 이용한 것이다.
본 발명에서 사용된 토홀드 스위치(toehold switch)는 리보솜 결합 부위와 리보솜의 결합으로부터 출발 코돈을 격리시킴으로써 번역을 차단할 수 있는 헤어핀 구조를 포함하는 합성된 리보스위치이다. 토홀드 스위치는 트리거 RNA와 상보적인 토홀드 부위를 가지고 있어, 트리거 RNA가 토홀트 부위에 결합할 경우, 헤어핀에 의한 차단을 해제하고 번역이 진행되도록 한다(Pardee et al., 2016). 즉 본 발명의 일 실시예에서 제작된 본 발명의 토홀드 스위치는 IP-10 RNA과 상보적인 토홀드 도메인 영역을 포함하며, IP-10의 트리거 RNA가 상기 토홀드 영역에 결합할 경우, 헤어핀 구조에 의한 차단이 해제되면서 결합되어 있는 리포터 단백질(본 발명의 일 실시예에서 LacZ 유전자)이 발현되도록 설계되어 있다.
본원의 일 구현예에 따르면, 상기 토홀드 도메인 영역은 서열번호 1 내지 서열번호 5의 서열로부터 선택된 하나의 서열을 포함하며, 보다 바람직하게는 서열번호 1 또는 서열번호 3의 서열일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 확인한 바, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 토홀드 스위치의 경우, IP-10 트리거 RNA에 대한 검출 특이성이 가장 높은 것으로 나타났으나, 본 발명의 서열이 이에 제한되는 것은 아니다.
즉, 본 발명의 토홀드 스위치의 토홀드 도메인 영역에는 IP-10 RNA와 상보적인 서열을 포함하고 있으며, 본 발명의 진단 대상이 되는 신장 이식 환자로부터 분리된 시료에 IP-10 RNA가 포함되어 있을 경우, 상기 토홀드 도메인에 IP-10 RNA가 트리거 RNA로서 결합함으로 인하여 토홀드 스위치의 헤어핀 구조가 해제되고 결합된 리포터 단백질 유전자가 발현되도록 하는 것이다.
본 발명의 상기 토홀드 스위치는 토홀드 도메인 영역 이외에 이에 연결된 줄기 도메인, 루프 도메인을 포함하고 있으며, 상기 줄기 도메인은 완전 또는 부분적 이중 가닥으로 구성되어 있으며, 개시 코돈을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에서 제작된 토홀드 스위치에 포함된 상기 줄기 도메인은 개시 코돈의 5’ 및 3’에 서열을 포함하고 있으며, 3‘ 서열은 종결 코돈을 포함하지 않는다. 또한 상기 루프 도메인은 리보솜 결합 부위(RBS)를 포함하고 있고, 약 12개의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 또한 상기 토홀드 스위치는 줄기 도메인과 리포터 단백질 코딩 도메인 사이에 연결된 링커를 포함하고 있으며, 이는 약 21개의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 발명의 토홀드 스위치에 결합된 리포터 단백질 유전자는 특별히 제한되는 것은 아니며, 공지된 리포터 단백질을 코딩하는 유전자를 제한없이 사용할 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, β-갈락토시다아제, 루시퍼라아제, β-락타마아제, 글리코시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), GFP(green fluorescent protein)를 코딩하는 유전자 중 하나를 선택하여 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 β-갈락토시다아제를 코딩하는 LacZ 유전자를 포함하도록 스위치를 설계하였다.
또한 상기 효소의 발현 여부를 확인하기 위하여, 본 발명의 조성물은 비색반응을 유발하는 발색 기질을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 리포터 단백질로서 β-갈락토시다아제가 발현되도록 스위치를 설계한 경우, 상기 효소와 결합하여 발색 반응을 나타내는 기질로서 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노사이드(chloro-phenol red-β-D-galactopyranoside(CPRG)), 오르토니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드( ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)) 중 선택되는 하나를 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노사이드를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 조성물은 무세포(cell-free) 합성 방법에 따라 단백질 합성을 개시할 수 있도록, 무세포 단백질 합성을 위한 성분을 추가로 포함할 수 있다. 여기에는 RNA 중합효소, 리보솜, tRNA, 아미노산, 에너지원 및 완충액을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에서는 상업적으로 구매한 In Vitro 단백질 합성 키트 (PURExpress, NEB, E6800S)를 사용하여, 단백질 합성을 시행하였다.
또한 본 발명은 상기 설명한 본 발명의 토홀드 스위치 등을 포함하는 급성 신장이식 거부반응 진단용 조성물을 키트로 제공하는 것을 포함한다. 상기 키트는 형태에 제한되지 않으며, 본 발명의 조성물이 적용된 칩, 시험지(paper), 스틱 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 급성 신장 이식 거부 반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법에 대한 것으로, 이는 환자로부터 분리된 시료를 채취하는 단계; 제1항의 조성물에 채취된 시료를 주입하여 배양하는 단계; 및 상기 배양 결과물로부터 리포터 단백질의 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는 분석 방법을 제공한다.
상기 분석 방법은 기존의 PCR 등의 방법을 이용한 분석 방법에 비하여 매우 빠른 결과를 도출하기 위하여, 무세포 단백질 합성 시스템을 기반으로 하는 것이 특징이다. 즉, 본 발명의 토홀드 스위치는 무세포 단백질 합성 시, 유전자의 발현을 조절하는 조절인자로서 작용하는 것이며, 상기 스위치의 작동은 환자로부터 분리된 시료에 포함되어 있는 IP-10 RNA가 트리거 RNA 로 작용하여 이의 존재에 의하여 조절된다.
즉, 본 발명의 조성물은 토홀드 스위치 이외에, 무세포 단백질 합성을 위한 RNA 중합효소, 리보솜, tRNA, 아미노산, 에너지원 및 완충액을 추가로 포함하며, 상기 조성물에 환자의 시료를 혼합한 후, 단백질의 합성 여부를 발색 기질을 통하여 확인하는 단계를 포함하는 급성 신장이식 거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 본 발명의 분석 방법에 사용된다.
환자로부터 분리된 시료는 혈액, 타액, 소변 등 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명에서는 진단의 효율성 및 편의성을 위하여 소변을 사용하였다. 즉, 본 발명의 일 실시예에서 상기 분석 방법은, 환자의 소변을 본원 발명의 조성물과 혼합하여 발색에 의한 단백질의 발현 여부를 확인하는 과정을 포함하는 과정을 포함한다. 즉, 환자의 소변에 급성 신장이식 거부반응을 나타내는 바이오마커인 IP-10 mRNA가 포함되어 있을 경우 상기 스위치의 상보적인 서열(토홀드 도메인 영역)에 결합함으로써, 스위치에 포함된 헤어핀이 해제되면서, 여기에 결합되어 있는 리포터 유전자(LacZ)의 발현으로 인한 β-갈락토시다아제가 발색 기질과 반응하여 나타내는 색상의 변화를 통하여 환자의 급성 신장이식 거부 반응을 조기에 진단할 수 있도록 정보를 제공한다.
상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 구현예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 기재된 추가적인 구현예 및 실시예가 존재할 수 있다.
본 발명의 급성 신장이식 거부 반응 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트와, 이를 이용한 급성 신장이식 거부 반응 진단에 필요한 정보 제공 방법은, 공지된 진단 방법에 비하여 매우 특이적이고 신속한 진단이 가능하며, 발색 반응을 통하여 현장에서 즉시 진단이 가능한 장점을 가진다.
도 1은 본 발명의 실험예에서 일차적으로 선별한 5개의 토홀드 스위치를 스크리닝하는 과정 및 결과를 나타낸 것으로(1 (A), 2 (B), 32 (C), 33 (D) and 38 (E) 을 나타냄), (A) 내지 (E)는 각각의 토홀드 스위치의 시간에 따른 흡광도 변화 값을 측정한 것이다. (F)는 배수변화 값으로, 인큐베이션 후 45분 시점에서 5개의 토홀드 스위치의 LacZ(β-갈락토시다아제) 생산 속도를 계산한 것이다. Error bar는 세 번 반복하여 측정된 값의 SD 값이다. (G)는 5개 각각의 토홀드 스위치의 β-갈락토시다아제의 생산률을 CPRG 기질로부터 분리된 클로로페놀레드의 색상을 통해 확인한 결과이다. 상기 반응은 모두 1μM trigger RNA IP-10에 의해 유도되었으며, 37℃에서 105분간 인큐베이션 한 후 촬영되었다.
도 2는 토홀드 스위치의 특이성 분석 결과로서, (A)는 100 nM 트리거 RNA IP-10, CD3ε 및 18S 존재 시, 37 ℃에서 105분간 인큐베이션 한 후 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32)의 흡광도 값을 표시한 결과이다. Error bar는 세 번 반복하여 측정된 값의 SD 값이다. (B)는 chlorophenol red-β-D-galactopyranoside (CPRG, 황색) 기질에서 분해된 chlorophenol red (보라색)의 강도는 트리거 RNA IP-10, CD3ε 및 18S에 의해 유도되었을 때 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32)의 LacZ 생성 속도를 보여준다. 결과는 모두 37℃에서 105분간 인큐베이션 한 후 촬영되었다.
도 3은 토홀드 스위치의 민감도 분석 결과이다. (A)는 37 ℃에서 105 분간 인큐베이션 한 후, 1000nM 내지 1nM의 트리거 RNA IP-10 농도에서 토홀드 스위치 1의 흡광도 값을 측정한 것이다. Error bar는 세 번 반복하여 측정된 값의 SD 값이다. (B)는 토홀드 스위치 1로부터의 LacZ 생산 속도에 대한 트리거 RNA IP-10의 농도의 영향은 효소의 기질인 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노사이드 (CPRG, 황색)로부터 분해된 클로로페놀 레드(보라색)의 발색 반응을 통해 알 수 있다. 영상은 37 ℃에서 105 분 동안 배양 한 후 채취 하였다.
도 2는 토홀드 스위치의 특이성 분석 결과로서, (A)는 100 nM 트리거 RNA IP-10, CD3ε 및 18S 존재 시, 37 ℃에서 105분간 인큐베이션 한 후 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32)의 흡광도 값을 표시한 결과이다. Error bar는 세 번 반복하여 측정된 값의 SD 값이다. (B)는 chlorophenol red-β-D-galactopyranoside (CPRG, 황색) 기질에서 분해된 chlorophenol red (보라색)의 강도는 트리거 RNA IP-10, CD3ε 및 18S에 의해 유도되었을 때 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32)의 LacZ 생성 속도를 보여준다. 결과는 모두 37℃에서 105분간 인큐베이션 한 후 촬영되었다.
도 3은 토홀드 스위치의 민감도 분석 결과이다. (A)는 37 ℃에서 105 분간 인큐베이션 한 후, 1000nM 내지 1nM의 트리거 RNA IP-10 농도에서 토홀드 스위치 1의 흡광도 값을 측정한 것이다. Error bar는 세 번 반복하여 측정된 값의 SD 값이다. (B)는 토홀드 스위치 1로부터의 LacZ 생산 속도에 대한 트리거 RNA IP-10의 농도의 영향은 효소의 기질인 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노사이드 (CPRG, 황색)로부터 분해된 클로로페놀 레드(보라색)의 발색 반응을 통해 알 수 있다. 영상은 37 ℃에서 105 분 동안 배양 한 후 채취 하였다.
아래에서는 첨부한 도면을 참조하여 본원이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 실시예를 상세히 설명한다. 그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본원을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 "~(하는) 단계" 또는 "~의 단계"는 "~ 를 위한 단계"를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 "이들의 조합"의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
이하, 본원의 본원 발명의 신장 이식 거부반응 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트의 구현예 및 실시예와 도면을 참조하여 구체적으로 설명하도록 한다. 그러나, 본원이 이러한 구현예 및 실시예와 도면에 제한되는 것은 아니다.
<실험 방법>
1. In silico 토홀드 스위치(Toehold switch) 설계
장기 이식 환자의 소변으로부터 mRNA 서열을 기반으로 검출하기 위한 Toehold 스위치 센서는 Pardee et al. (Pardee et al., 2016)에 기재된 내용을 참고하였다. 간단히 말해서, 스위치의 토홀드 도메인 영역은 IP-10 mRNA(서열번호 6)의 연속 30-nt 영역에 결합하도록 설계되었으며, IP-10의 전체 mRNA로부터 1-nt씩 추가하는 방법으로 만들어졌다. 스위치의 다른 부분은 Pardee et al. (Pardee 외 2016)에 기재된 방법을 참고하였다. 이러한 방법에 따라 제작된 Toehold 스위치는 최적화된 영역(conserved squence region), 21-nt 링커 영역과 함께 상단 스템(12bp) 및 루프 영역 (12nt)이 포함되어 있다.
위와 같은 방법에 따라 IP-10 mRNA 주형으로부터 생성된 것으로 추정되는 토홀드 영역을 BLAST로 특이성에 대하여 스크리닝 하였다. 이어서, 프레임 내 정지 코돈을 피하기 위해 설계된 Toehold 스위치를 검사 하였다. NUPACK 분석 및 유틸리티 모듈에 의해 스위치의 트리거 RNA와의 상호 작용을 평가하기 위해 적합한 스위치를 설계하였다. (Zadeh 외. 2011). 트리거 RNA와 앙상블 결함이 적은 낮은 최소 자유 에너지 (MFE) 복합 구조를 갖는 토홀드 스위치를 실험을 위해 선택 하였다. 선택된 본 발명의 상기 토홀드 스위치는 서열번호 1 내지 서열 번호 5의 염기서열로 표시된다.
2. 토홀드 스위치(Toehold switch) 구조
토홀드 스위치의 DNA주형은 마크로젠 (Macrogen)으로부터 구입한 것을 사용하였으며, 여기에 β-갈락토시다제 코딩 유전자 (LacZ) 및 벡터로 이를 연결하기 위해 2 개의 헤어핀 돌출부를 첨가하여 합성 하였다. 합성된 스위치는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 염기서열로 이루어져 있고, 각각의 5‘ 및 3’ 영역은 15-nt의 돌출부(overhang)를 포함하고 있으며 , 그 구조는 하기 표 1과 같다.
| Toehold switches | toehold domain (18nt) | Stem (12nt) | Conserved sequence region | Stem complimentary regions ( 12nt ) | Linker ( 21nt ) |
| 1 | AAGGCAGCAAATCAGAAT | GGCAGTTTGATT | GGACTTTAGAACAGAGGAGATAAAGATG | AATCAAACTGCC | AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG |
| 2 | GCAGCAAATCAGAATGGC | AGTTTGATTCAT | GGACTTTAGAACAGAGGAGATAAAGATG | ATGAATCAAACT | AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG |
| 32 | CATTGTAGCAATGATCTC | AACACGTGGACA | GGACTTTAGAACAGAGGAGATAAAGATG | TGTCCACGTGTT | AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG |
| 33 | TCATTGTAGCAATGATCT | CAACACGTGGAC | GGACTTTAGAACAGAGGAGATAAAGATG | GTCCACGTGTTG | AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG |
| 38 | TTCAGTAAATTCTTGATG | GCCTTCGATTCT | GGACTTTAGAACAGAGGAGATAAAGATG | AGAATCGAAGGC | AACCTGGCGGCAGCGCAAAAG |
구체적으로, DNA주형을 PCR로 증폭하고 겔 추출법으로 정제한 후, 각 스위치를 Gibson Assembly를 이용하여 β-갈락토시다제 코딩 유전자(LacZ)와 결찰 하였다. LacZ 코딩 유전자 서열은 21-nt 링커 서열의 오른쪽에 연결되었다. 생성물을 PCR로 증폭하여 총 30bp의 중첩 영역을 갖는 LacI를 구조적 발현 유전자로 포함하고 카나마이신 내성 유전자를 갖는 T7-발현 플라스미드(pET28)에 삽입 하였다. 플라스미드를 증폭하여 추가적으로 생산하기 위하여 상기 플라스미드를 DH5α 대장균주에 형질 전환시켰다.
전사를 최적화하기 위하여 IP-10, CD3ε 및 18s 트리거 RNA의 선형 DNA 템플릿을 PCR에서 각각의 프라이머로 생성하여(서열번호 15 내지 20) PCR 생성물의 5 '말단에 T7 프로모터 서열을 추가 하였다. Toehold 스위치의 선형 DNA 서열은 T7 프로모터 및 T7 터미네이터의 범용 쌍(서열번호 11 및 서열번호 12)을 사용하여 PCE에 의해 생성되었으며, 전사율을 증가시키기 위하여 상기 T7 프로모터의 오른쪽 끝 부분과 토홀드 스위치의 앞부분에 “GGG” 서열을 추가하였다.
Toehold 스위치의 RNA 형태는 T7 RNA-P 기반의 전사 키트 (MEGAscript ® 키트, 써모 피셔)를 사용하여 해당 DNA 템플릿에서 합성되었다. RNA는 MEGAclear™ 키트 (Thermo Fisher)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 정제하였다. NanoDrop 분광 광도계 (Thermo Fisher)를 사용하여 RNA의 농도를 확인하고 -20℃에서 보관하였다.
3. 무 세포(Cell-free) 반응 합성 및 배양
무세포 반응을 위해 In Vitro 단백질 합성 키트 (PURExpress, NEB, E6800S)를 사용하였다. A, B 솔루션 (Curr Protoc Mol Biol. 2014; 108: 16.31.1-16.31.22 (doi:10.1002/0471142727.mb1631s108), 솔루션 A : tRNA, 아미노산, rNTPs 포함. 솔루션 B : T7 RNA 합성효소, 번역 인자, 아미노아실 -tRNA 합성 효소, 에너지 재생 효소와 같은 리보솜과 단백질 구성 요소 포함)을 각각 제조업체의 매뉴얼에 따라 제조하였으며, RNA 억제제(20U/30μL reaction, NEB, Murine), 비색 반응을 위한 효소의 기질인 클로로 페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(CBRG, 0.6mg/L), 상기 실험예 1.에서 제작된 토홀드 스위치의 RNA(100 nM)및 IP-10의 트리거 RNA(1 μM)가 포함된다. 상기 조성을 37℃의 항온에서 인큐베이팅 하였으며, 무세포 합성 반응은 LacZ 의 발현을 통하여 생성되는 클로로 페놀 레드의 최대 흡광도인 570nm 파장에서 측정되었고, 흡광도가 최고점에 도달할 때까지 15~30분 마다 색상의 변화를 측정 하였다.
4. Toehold 스위치 스크리닝
Toehold 스위치의 스크리닝을 위하여 상대적인 반응 속도(reaction kinetics)를 평가하여 비교하였다. 분광 광도계(Thermo Fisher)를 이용하여 흡광도 570nm에서 측정한 반응의 흡광도 변화를 기반으로 15분, 30분 간격으로 무 세포 반응의 반응 속도 데이터를 만들었으며, 스크리닝을 위하여 스위치의 흡광도의 배수 변화를 측정하였다. 상기 결과로부터 상대적으로 높은 배수 변화를 가지며 짧은 인큐베이션 시간에서 최대 흡광도에 도달하는 스위치를 선택하였다.
5. Toehold 스위치 특이성 및 민감도 분석
토홀드 스위치의 특이성과 민감도를 테스트하기 위해 무세포 반응을 상기 실험예 3.과 같이 설계하고 570nm 파장에서 105 분간 배양한 후, 이들 반응의 흡광도를 측정하였다.
토홀드 스위치의 특이성은 서로 다른 다른 소변 RNA, 즉 CD3ε, 18S인 비-동족성 트리거 RNA를 이용하여 평가하였다. 이들 소변 RNA는 서열번호 17 내지 20의 프라이머를 이용하여 RNA 합성 프로토콜에 따라 DNA 주형으로부터 합성되었으며, 토홀드 스위치의 특이성을 평가하기 위해 100nM의 농도로 무세포 반응에 첨가되었다. 토홀드 스위치의 특이성은 IP-10의 트리거 RNA와의 반응의 흡광도와 CD3ε및 18S 트리거 RNA 와의 반응의 흡광도를 비교하여 평가하였다.
선택된 토홀드 스위치의 민감도를 테스트하기 위해 0.1 nM 내지 1000nM 농도 범위의 IP-10 트리거 RNA를 사용하였다. 상기 반응의 흡광도를 토홀드 스위치만을 포함하는 비 특이적 반응의 흡광도와 비교하였다.
6. 배수변화 측정
배수 변화 값은 유도된 반응 중 LacZ의 생성 속도를 의미하는 색 변화 속도의 차이로 설명할 수 있다. 무세포 반응 및 비색계 기질인 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside)의 흡광도에 대한 영향을 제거하기 위하여, 토홀드 스위치와 트리거 RNA를 포함하지 않는 대조군이 사용되었다. 배수 변화값은 각 시점에서 반응의 흡광도를 토홀드 스위치를 포함하는 대조군 반응의 흡광도로 나누어 계산하였다 (Pardee et al., 2016). 측정 오류는 3회 반복 측정된 표준 편차를 통하여 계산하였다.
<실험 결과>
1. 소변으로부터 IP-10 mRNA 검출을 위한 토홀드 스위치 디자인
토홀드 스위치(toehold switch)는 리보솜 결합 부위와 리보솜의 결합으로부터 출발 코돈을 격리시킴으로써 번역을 차단할 수 있는 헤어핀 구조를 포함하는 합성된 리보스위치이다. 스위치는 또한 트리거 RNA와 상보적인 토홀드 부위를 가지고 있어, 트리거 RNA가 토홀트 부위에 결합할 경우, 헤어핀에 의한 차단을 해제하고 번역이 진행되도록 한다(Pardee et al., 2016). 이 연구에서 사용된 토홀드 스위치는 12-nt루프와 안정된 스템을 특징으로 가지도록 설계되었다. 이러한 특징들은 스위치로부터의 누설 신호를 줄임으로써 토홀드 스위치의 성능을 향상시키기 위해 사용되었다 (Ma et al., 2018; Pardee et al., 2016). 또한, 이 연구에서, LacZ 생산은 황색 기질인 CPRG를 보라색 클로로 페놀 레드로 전환시키는 능력에 의해 비색 산출물로 사용되었다.
소변 IP-10 RNA의 DNA 템플릿으로부터 총 100개 이상의 스위치가 생성되었다. 4개 이상의 동일한 뉴클레오타이드의 서열 패턴(예를 들어 AAAA, TTTT, CCCC, GGGG)을 포함하는 스위치를 제외하고, 86개의 토홀드 스위치를 선별하였다. 다른 사람의 서열과 상동성이 높은 토홀드 스위치 및 인-프레임 정지 코돈을 포함하는 경우를 제외하고, 22개의 토홀드 스위치를 선별하였다. 마지막으로 조립결함이 낮은 것과 복합 구조의 자유 에너지가 낮은 것을 선별하였으며, 최종적으로 5개의 스위치(1, 2, 32, 33 및 38)를 합성 및 시험을 위해 선택하였다.
2. In vitro에서 토홀드 스위치의 선별
토홀드 스위치와 LacZ 코딩 서열을 포함하는 벡터의 구조 및 확정된 서열에 따라, 5개의 토홀드 스위치를 제조하여 IP-10 RNA 의 검출 효능을 시험하였다. 도 1A 내지 1F는 상기 5 종류의 토홀드 스위치에 대한 검출 결과를 보여준다. 대부분의 토홀드 스위치의 시간에 대한 흡광도의 변화는 75분 배양 후, LacZ 생성 속도가 현저하게 증가하여 최고점에 도달했다는 것을 보여 주었다. 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32)는 생성 속도가 빠르기 때문에 15 분 간격으로 흡광도 값을 기록하였다(도 1A, B 및 C). 토홀드 스위치 1(도 1F)은, 배양 45분 이내에 최대 배수 변화가 76배에서 100 배 이상까지 달성되었다. 이 토홀드 스위치의 색상 변화는 육안으로 구별 할 수 있는 대조군 반응의 색소와 비교하여 상당히 뚜렷하게 관찰되었다(도 1G). 시험 된 5 개의 스위치 중 2 개의 스위치 (33 및 38)는 흡광도가 대응하는 대조군과 유사한 패턴으로 나타났으며(도 1D 및 1E), 이는 배양 시간 동안 흡광도가 변하지 않은 것으로 성능이 상대적으로 떨어짐을 확인할 수 있었다.
3. 토홀드 스위치의 특이성 및 민감도 분석
도 2는 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32번)의 특이도 분석 결과를 보여주는 결과이다. 이러한 무세포 반응의 흡광도는 이전 실험에서와 같이 흡광도가 최고점에 도달했을 때 105분 간 배양한 후 측정되었다. 세 개의 스위치 중에서 토홀드 스위치 2는 세 개의 서로 다른 트리거 RNA(IP-10, CD3ε, 18S RNA)를 포함하는 모든 반응에서 높은 흡광도를 나타내었다(도 2B). 특히 18S 트리거 RNA 의 경우, 흡광도는 트리거 IP-10 RNA의 흡광도와 유사했다. 상기 결과로부터 토홀드 스위치 2는 특이성이 낮으므로 IP-10의 검출에 사용할 수 없다는 결론을 내렸다. (도 2A).
남아 있는 2개의 스위치 중에서 토홀드 스위치 1의 트리거 IP-10의 경우 흡광도는 RNA의 CD3ε과 18S 흡광도 값보다 거의 8배 높은 20이상의 흡광도 값으로 가장 높은 특이성을 나타냈다 (도 2A 및 B). 토홀드 스위치 32도 다른 두 RNAs CD3ε과 18S에 비해 상대적으로 높은 특이성을 나타냈지만, 토홀드 스위치 1보다는 훨씬 낮았다. 따라서 토홀드 스위치 1은 트리거 RNA IP-10 검출 효율이 가장 좋았다.
토홀드 스위치 1의 검출 한계는 0.1 nM 내지 1000nM의 IP-10 농도 범위에서 시험하였다. 도 3은 상이한 농도에서 반응의 흡광도 값을 도시한 것이다. 도 3a에서 보듯이, 1000nM 및 100nM의 IP-10 농도에서 토홀드 스위치 1의 흡광도 값은 각각 41 배 및 42 배의 배율 변화로 가장 높게 나타났다. 농도가 100nM 내지 0.1nM 인 경우, 흡광도 값은 10 미만 이었지만 여전히 대조군 반응 값보다 높았다. 육안으로 볼 때, 1000 nM과 100 nM에서 반응의 비색 반응은 육안으로 식별 할 수 있는 맑은 자주색을 나타냈다. 농도가 10 내지 0.1 nM 인 경우, 색상은 적자색이었고, 1000 nM 및 100 nM에서 두 반응의 변화만큼 명확하지는 않았다. 그러나 이 결과는 대조군 반응의 색과 상당히 다른 것을 확인할 수 있었으며, 이는 육안으로도 충분히 인식할 수 있었다.(도 3B)
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
무세포 반응을 위해 In Vitro 단백질 합성 키트 (PURExpress, NEB, E6800S)를 사용하였다. A, B 솔루션 (Curr Protoc Mol Biol. 2014; 108: 16.31.1-16.31.22 (doi:10.1002/0471142727.mb1631s108), 솔루션 A : tRNA, 아미노산, rNTPs 포함. 솔루션 B : T7 RNA 합성효소, 번역 인자, 아미노아실 -tRNA 합성 효소, 에너지 재생 효소와 같은 리보솜과 단백질 구성 요소 포함)을 각각 제조업체의 매뉴얼에 따라 제조하였으며, RNA 억제제(20U/30μL reaction, NEB, Murine), 비색 반응을 위한 효소의 기질인 클로로 페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(CBRG, 0.6mg/L), 상기 실험예 1.에서 제작된 토홀드 스위치의 RNA(100 nM)및 IP-10의 트리거 RNA(1 μM)가 포함된다. 상기 조성을 37℃의 항온에서 인큐베이팅 하였으며, 무세포 합성 반응은 LacZ 의 발현을 통하여 생성되는 클로로 페놀 레드의 최대 흡광도인 570nm 파장에서 측정되었고, 흡광도가 최고점에 도달할 때까지 15~30분 마다 색상의 변화를 측정 하였다.
4. Toehold 스위치 스크리닝
Toehold 스위치의 스크리닝을 위하여 상대적인 반응 속도(reaction kinetics)를 평가하여 비교하였다. 분광 광도계(Thermo Fisher)를 이용하여 흡광도 570nm에서 측정한 반응의 흡광도 변화를 기반으로 15분, 30분 간격으로 무 세포 반응의 반응 속도 데이터를 만들었으며, 스크리닝을 위하여 스위치의 흡광도의 배수 변화를 측정하였다. 상기 결과로부터 상대적으로 높은 배수 변화를 가지며 짧은 인큐베이션 시간에서 최대 흡광도에 도달하는 스위치를 선택하였다.
5. Toehold 스위치 특이성 및 민감도 분석
토홀드 스위치의 특이성과 민감도를 테스트하기 위해 무세포 반응을 상기 실험예 3.과 같이 설계하고 570nm 파장에서 105 분간 배양한 후, 이들 반응의 흡광도를 측정하였다.
토홀드 스위치의 특이성은 서로 다른 다른 소변 RNA, 즉 CD3ε, 18S인 비-동족성 트리거 RNA를 이용하여 평가하였다. 이들 소변 RNA는 서열번호 17 내지 20의 프라이머를 이용하여 RNA 합성 프로토콜에 따라 DNA 주형으로부터 합성되었으며, 토홀드 스위치의 특이성을 평가하기 위해 100nM의 농도로 무세포 반응에 첨가되었다. 토홀드 스위치의 특이성은 IP-10의 트리거 RNA와의 반응의 흡광도와 CD3ε및 18S 트리거 RNA 와의 반응의 흡광도를 비교하여 평가하였다.
선택된 토홀드 스위치의 민감도를 테스트하기 위해 0.1 nM 내지 1000nM 농도 범위의 IP-10 트리거 RNA를 사용하였다. 상기 반응의 흡광도를 토홀드 스위치만을 포함하는 비 특이적 반응의 흡광도와 비교하였다.
6. 배수변화 측정
배수 변화 값은 유도된 반응 중 LacZ의 생성 속도를 의미하는 색 변화 속도의 차이로 설명할 수 있다. 무세포 반응 및 비색계 기질인 클로로페놀 레드-β-D-갈락토피라노사이드(chlorophenol red-β-D-galactopyranoside)의 흡광도에 대한 영향을 제거하기 위하여, 토홀드 스위치와 트리거 RNA를 포함하지 않는 대조군이 사용되었다. 배수 변화값은 각 시점에서 반응의 흡광도를 토홀드 스위치를 포함하는 대조군 반응의 흡광도로 나누어 계산하였다 (Pardee et al., 2016). 측정 오류는 3회 반복 측정된 표준 편차를 통하여 계산하였다.
<실험 결과>
1. 소변으로부터 IP-10 mRNA 검출을 위한 토홀드 스위치 디자인
토홀드 스위치(toehold switch)는 리보솜 결합 부위와 리보솜의 결합으로부터 출발 코돈을 격리시킴으로써 번역을 차단할 수 있는 헤어핀 구조를 포함하는 합성된 리보스위치이다. 스위치는 또한 트리거 RNA와 상보적인 토홀드 부위를 가지고 있어, 트리거 RNA가 토홀트 부위에 결합할 경우, 헤어핀에 의한 차단을 해제하고 번역이 진행되도록 한다(Pardee et al., 2016). 이 연구에서 사용된 토홀드 스위치는 12-nt루프와 안정된 스템을 특징으로 가지도록 설계되었다. 이러한 특징들은 스위치로부터의 누설 신호를 줄임으로써 토홀드 스위치의 성능을 향상시키기 위해 사용되었다 (Ma et al., 2018; Pardee et al., 2016). 또한, 이 연구에서, LacZ 생산은 황색 기질인 CPRG를 보라색 클로로 페놀 레드로 전환시키는 능력에 의해 비색 산출물로 사용되었다.
소변 IP-10 RNA의 DNA 템플릿으로부터 총 100개 이상의 스위치가 생성되었다. 4개 이상의 동일한 뉴클레오타이드의 서열 패턴(예를 들어 AAAA, TTTT, CCCC, GGGG)을 포함하는 스위치를 제외하고, 86개의 토홀드 스위치를 선별하였다. 다른 사람의 서열과 상동성이 높은 토홀드 스위치 및 인-프레임 정지 코돈을 포함하는 경우를 제외하고, 22개의 토홀드 스위치를 선별하였다. 마지막으로 조립결함이 낮은 것과 복합 구조의 자유 에너지가 낮은 것을 선별하였으며, 최종적으로 5개의 스위치(1, 2, 32, 33 및 38)를 합성 및 시험을 위해 선택하였다.
2. In vitro에서 토홀드 스위치의 선별
토홀드 스위치와 LacZ 코딩 서열을 포함하는 벡터의 구조 및 확정된 서열에 따라, 5개의 토홀드 스위치를 제조하여 IP-10 RNA 의 검출 효능을 시험하였다. 도 1A 내지 1F는 상기 5 종류의 토홀드 스위치에 대한 검출 결과를 보여준다. 대부분의 토홀드 스위치의 시간에 대한 흡광도의 변화는 75분 배양 후, LacZ 생성 속도가 현저하게 증가하여 최고점에 도달했다는 것을 보여 주었다. 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32)는 생성 속도가 빠르기 때문에 15 분 간격으로 흡광도 값을 기록하였다(도 1A, B 및 C). 토홀드 스위치 1(도 1F)은, 배양 45분 이내에 최대 배수 변화가 76배에서 100 배 이상까지 달성되었다. 이 토홀드 스위치의 색상 변화는 육안으로 구별 할 수 있는 대조군 반응의 색소와 비교하여 상당히 뚜렷하게 관찰되었다(도 1G). 시험 된 5 개의 스위치 중 2 개의 스위치 (33 및 38)는 흡광도가 대응하는 대조군과 유사한 패턴으로 나타났으며(도 1D 및 1E), 이는 배양 시간 동안 흡광도가 변하지 않은 것으로 성능이 상대적으로 떨어짐을 확인할 수 있었다.
3. 토홀드 스위치의 특이성 및 민감도 분석
도 2는 3개의 토홀드 스위치(1, 2 및 32번)의 특이도 분석 결과를 보여주는 결과이다. 이러한 무세포 반응의 흡광도는 이전 실험에서와 같이 흡광도가 최고점에 도달했을 때 105분 간 배양한 후 측정되었다. 세 개의 스위치 중에서 토홀드 스위치 2는 세 개의 서로 다른 트리거 RNA(IP-10, CD3ε, 18S RNA)를 포함하는 모든 반응에서 높은 흡광도를 나타내었다(도 2B). 특히 18S 트리거 RNA 의 경우, 흡광도는 트리거 IP-10 RNA의 흡광도와 유사했다. 상기 결과로부터 토홀드 스위치 2는 특이성이 낮으므로 IP-10의 검출에 사용할 수 없다는 결론을 내렸다. (도 2A).
남아 있는 2개의 스위치 중에서 토홀드 스위치 1의 트리거 IP-10의 경우 흡광도는 RNA의 CD3ε과 18S 흡광도 값보다 거의 8배 높은 20이상의 흡광도 값으로 가장 높은 특이성을 나타냈다 (도 2A 및 B). 토홀드 스위치 32도 다른 두 RNAs CD3ε과 18S에 비해 상대적으로 높은 특이성을 나타냈지만, 토홀드 스위치 1보다는 훨씬 낮았다. 따라서 토홀드 스위치 1은 트리거 RNA IP-10 검출 효율이 가장 좋았다.
토홀드 스위치 1의 검출 한계는 0.1 nM 내지 1000nM의 IP-10 농도 범위에서 시험하였다. 도 3은 상이한 농도에서 반응의 흡광도 값을 도시한 것이다. 도 3a에서 보듯이, 1000nM 및 100nM의 IP-10 농도에서 토홀드 스위치 1의 흡광도 값은 각각 41 배 및 42 배의 배율 변화로 가장 높게 나타났다. 농도가 100nM 내지 0.1nM 인 경우, 흡광도 값은 10 미만 이었지만 여전히 대조군 반응 값보다 높았다. 육안으로 볼 때, 1000 nM과 100 nM에서 반응의 비색 반응은 육안으로 식별 할 수 있는 맑은 자주색을 나타냈다. 농도가 10 내지 0.1 nM 인 경우, 색상은 적자색이었고, 1000 nM 및 100 nM에서 두 반응의 변화만큼 명확하지는 않았다. 그러나 이 결과는 대조군 반응의 색과 상당히 다른 것을 확인할 수 있었으며, 이는 육안으로도 충분히 인식할 수 있었다.(도 3B)
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Toehold switches no.1
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taatacgact cactataggg aaggcagcaa atcagaatgg cagtttgatt ggactttaga 60
acagaggaga taaagatgaa tcaaactgcc aacctggcgg cagcgcaaaa gatgaccatg 120
attacg 126
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Toehold switches no.2
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<212> RNA
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Toehold switches no.38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> DNA sequence of IP-10 mRNA
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<211> 330
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> DNA sequence of CD3e mRNA
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<212> DNA
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<223> REV_primer_pET28_vector
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<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REV_primer_LacZ_BL21
<400> 14
ttcgggcttt gttagcagtt atttttgaca ccagacca 38
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FWD_IP-10 (T7 promoter included)
<400> 15
taatacgact cactataggg atgaatcaaa ctgccattct ga 42
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REV_IP-10
<400> 16
ttttgctccc ctctggtttt aa 22
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FWD_CD3E (T7 promoter included)
<400> 17
taatacgact cactataggg atcagttggc gtttgggg 38
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REV_CD3E
<400> 18
atctccatgc agttctcaca c 21
<210> 19
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FWD_18S (T7 promoter included)
<400> 19
taatacgact cactataggg acccggggag gtagtgacga a 41
<210> 20
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> REV_18S
<400> 20
gcccgctccc aagatccaac ta 22
Claims (9)
- 트리거 RNA와 결합하는 토홀드 도메인, 개시 코돈을 포함하는 줄기 도메인, 리보솜 결합 부위를 포함하는 루프 도메인 및 리포터 단백질 코딩 도메인이 포함된 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 토홀드 스위치 및 발색 기질을 포함하고,
상기 트리거 RNA는 IP-10(Interferon Gamma-Induced Protein 10) RNA인 것을 특징으로 하며,
상기 리포터 단백질 코딩 도메인은 β-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하고,
상기 발색 기질은 클로로페놀레드-β-D-갈락토피라노사이드(chloro-phenol red-β-D-galactopyranoside(CPRG)) 및 오르토니트로페닐-β-D-갈락토피라노사이드( ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside(ONPG)) 중 선택되는 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는, 급성 신장이식 거부 반응 진단용 조성물. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 조성물은 무세포 단백질 합성을 위한 RNA 중합효소, 리보솜, 아미노산, 에너지원 및 완충액을 추가로 포함하는 급성 신장이식 거부 반응 진단용 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 급성 신장 이식 거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
환자로부터 분리된 시료를 채취하는 단계;
제1항의 조성물에 채취된 시료를 주입하여 배양하는 단계; 및
상기 배양 결과물로부터 리포터 단백질의 발현 여부를 확인하는 단계를 포함하는 분석 방법. - 제 7항에 있어서,
상기 환자로부터 분리된 시료는 소변인 것을 특징으로 하는 분석 방법. - 제7항에 있어서,
상기 리포터 단백질의 발현 여부는 효소-기질 발색 반응에 의하여 확인하는 것을 특징으로 하는 분석 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190064226A KR102277068B1 (ko) | 2019-05-31 | 2019-05-31 | 급성 신장 이식 거부 반응 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020190064226A KR102277068B1 (ko) | 2019-05-31 | 2019-05-31 | 급성 신장 이식 거부 반응 진단용 조성물 및 이를 포함하는 진단 키트 |
Publications (2)
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|---|---|
| KR20200137596A KR20200137596A (ko) | 2020-12-09 |
| KR102277068B1 true KR102277068B1 (ko) | 2021-07-14 |
Family
ID=73787387
Family Applications (1)
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102277068B1 (ko) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102570655B1 (ko) * | 2020-08-31 | 2023-08-23 | 경희대학교 산학협력단 | 토홀드 스위치 시스템을 이용한 생물학적 지표 검출용 키트 및 검출방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20160312312A1 (en) * | 2013-12-06 | 2016-10-27 | President And Fellows Of Harvard College | Paper-based synthetic gene networks |
| WO2016177791A1 (en) * | 2015-05-05 | 2016-11-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Cxcl10 as predictive biomarker of renal transplant acute rejection and diagnostic biomarker of antibody-mediated rejection (abmr) |
-
2019
- 2019-05-31 KR KR1020190064226A patent/KR102277068B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2016177791A1 (en) * | 2015-05-05 | 2016-11-10 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Cxcl10 as predictive biomarker of renal transplant acute rejection and diagnostic biomarker of antibody-mediated rejection (abmr) |
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| Publication number | Publication date |
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| KR20200137596A (ko) | 2020-12-09 |
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