CN114107447A - Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠病毒的方法 - Google Patents

Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠病毒的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了由Nb.BsrDI(限制性内切酶)介导的多重交叉置换扩增(multiple cross displacement amplification)新型冠状病毒(SARS‑CoV‑2)目的基因结合荧光检测的方法，该方法针对SARS‑CoV‑2的ORF1ab和NP基因扩增并检测该核酸分子，所述方法将逆转录、核酸扩增及Nb.BsrDI介导的序列特异性检测整合到一个反应中，检测结果可以通过收集荧光信号实现，最低可检测到6.8个拷贝数的SARS‑CoV‑2核酸片段。本发明提供的方法具有灵敏高、特异性强特点，可作为临床和现场的检测工具。

Description

Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠 病毒的方法
技术领域
本发明公开了一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)的检测方法，属于微生 物检测技术领域。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是由SARA-COV-2引起的疾病， SARA-COV-2属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性， 与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)同源性达85％以上。SARA-COV-2 传播速度快较快(R0 3.28)，早期感染患者仍无症状或无特异性临床症状(如咳嗽、 发热、气短等)，难以确诊，暴露至少2天或2周后才出现明显症状。准确、 快速地识别通过近距离接触传播SARS-CoV-2的新冠患者(尤其是无症状感染 者)是控制SARS-CoV-2快速传播的主要挑战之一。
目前，通过检测SARS-CoV-2的核酸来诊断COVID-19是一种有效的方法。 用于SARS-CoV-2检测的方法主要包括全基因组测序、RT-PCR、等温扩增法、 基因编辑技术、胶体金免疫技术等。全基因组测序对SARS-CoV-2的检测具有 高通量和较好的准确性和精密度，但该方法耗时较长，操作复杂，不适合大规 模检测；RT-PCR对COVID-19感染的诊断具有较高的敏感性、特异性和准确 性，但假阴性检出率较高(仅能检测到约47-60％的阳性COVID-19病例)，检 测耗时约2小时；基因编辑技术具有较高的敏感性和特异性，但需要专用的试剂和专业人员；免疫胶体金技术和酶联免疫吸附技术缺乏特异性和敏感性；当 前主要的检测方法为RT-PCR法。
因此，迫切需要建立一种灵敏度高、特异性强、快速的检测方法。等温扩 增技术是一种操作简单、反应时间短、特异性高、灵敏度高的工具，有助于大 规模检测。本发明的目的是设计一种新型的诊断COVID-19技术，称为核酸内 切酶限制介导的实时逆转录多重交叉置换扩增(E-rRT-MCDA)。E-rRT-MCDA 方法将等温扩增、逆转录和核酸内切酶酶切与实时荧光分析相结合。
发明内容
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种限制性内切酶介导的多重交叉 置换扩增目的基因的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供置换引物F1和F2；交叉引物CP1和CP2；扩增引物C1和C2， 扩增引物D1和D2，扩增引物R1和R2，同时在所述扩增引物C1、D1或R1 的5’端链接如SEQ ID NO:21所示的序列，所述序列可以被限制性内切酶Nb. BsrDI酶所识别，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团；
(3)在步骤(2)所述引物存在及DNA聚合酶的作用下对步骤(1)获 得的基因组进行恒温扩增靶基因形成双链扩增产物，在本发明的一个具体实施 方案中，所述DNA聚合酶为Bst 2.0；
(4)使用Nb.BsrDI酶对步骤(3)获得的双链扩增产物进行剪切；
(5)检测步骤(4)获得的剪切产物的荧光信号。
在本发明的一个具体实施方案中，使用荧光定量PCR仪检测步骤(3)的 扩增产物的荧光信号，也可以使用实时浊度基因检测系统对对多重交叉置换扩 增之后产物进行扩增效果验证，阳性能产生浊度曲线，阴性无浊度曲线。
在一个优选的实施方案中，步骤(2)所述荧光基团为FAM，所述荧光淬 灭基团HBQ1，或者所述荧光基团为CY5，所述荧光淬灭基团HBQ2。在本发 明的具体实施中，上述标记均可以完成检测目的，在同时检测两种不同的目的 基因时，可以对不同的引物组合中的扩增产物标记不同的荧光基团。
在一个更为优选的实施方案中，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的置换引物ORF-F1和ORF-F2；序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的交叉引物ORF-CP1和ORF-CP2；序列分别如 SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF-C1和ORF-C2的扩增引物；序列 分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物ORF-D1和ORF-D2；序 列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的扩增引物ORF-R1和ORF-R2。 所述的引物组合是用于多重交叉置换扩增新型冠状病毒(SARS-CoV-2) ORF1ab(开放阅读框1a/b)设计的，其中，由于SARS-CoV-2的基因组为RNA， 步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA 的步骤。
更为优选地，步骤(2)所述扩增引物ORF-D1被标记荧光基团FAM。
在另一个优选的实施方案中，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的置换引物N-F1和N-F2；序列分别如SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO:14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2；序列分别如SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO:16所示的N-C1和N-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的扩增引物N-D1和N-D2；序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物N-R1和N-R2。所述的引物组合是用于多重交叉置换扩增新型冠状病毒(SARS-CoV-2)NP(核蛋白)设计的，其中， 由于SARS-CoV-2的基因组为RNA，步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测 样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA的步骤。
在一个更为优选的实施方案中，步骤(2)所述扩增引物N-D1被标记荧 光基团CY5。
更为优选地，步骤(3)所述恒温扩增是在60-66℃的环境中进行的。
其次，本发明提供了一组用于多重交叉置换恒温扩增SARS-CoV-2的 ORF1ab基因的引物，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示的置换引物ORF-F1和ORF-F2；序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4 所示的交叉引物ORF-CP1和ORF-CP2；序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF-C1和ORF-C2的扩增引物；序列分别如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物ORF-D1和ORF-D2；序列分别如SEQ ID NO:9和 SEQ IDNO:10所示的扩增引物ORF-R1和ORF-R2。
在一个优选的实施方案中，，在扩增引物ORF-D1的5’端链接如SEQ ID NO:21所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团。
本发明还提供了另一组用于多重交叉置换恒温扩增SARS-CoV-2的NP基 因的引物，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示 的置换引物N-F1和N-F2；序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示 的交叉引物N-CP1和N-CP2；序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所 示的N-C1和N-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18 所示的扩增引物N-D1和N-D2；序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物N-R1和N-R2。
在一个优选的实施方案中，在扩增引物N-D1的5’端链接如SEQ ID NO:21 所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团。
最后，本发明提供了一种含有上述引物的基因检测试剂盒，，所述试剂盒 还包括链移位型聚合酶Bst 2.0、解链温度调节剂和限制性内切酶Nb.BsrDI。
本发明提供的限制性内切酶介导的多重置换交叉扩增检测的目的基因为 SARS-CoV2的ORF1ab序列和NP序列两个靶标，能在65分钟内完成检测(包 括标本处理10分钟，RNA提取15分钟，检测36分钟)。该方法具有优异的 检测灵敏度，其检测限为6.8个拷贝，而且也具有检测速度的优点，仅需36 分钟，即可获得扩增产物结果。
以病原体(冠状病毒HKU1、艾滋病毒HIV、甲型H9N2流感病毒、甲型 H7N9流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H1N1流 感病毒、乙肝病毒HBV、志贺氏菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌、炭疽杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、 流感嗜血杆菌、布鲁氏菌、奈瑟淋球菌)为模板评价SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA 技术的特异性。结果表明，SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA技术能准确的鉴别 SARS-CoV-2，说明SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA方法的特异性良好，也证明本 发明提供用于MCDA的引物序列具有优异的特异性和扩增效果。
附图说明
图1.E-rRT-MCDA操作流程及原理示意图；
图2.E-rRT-MCDA引物设计的位置和方向示意图；
图3.E-rRT-MCDA扩增检测结果图谱；
图4.E-rRT-MCDA检测ORF1ab基因最佳反应温度测试结果图谱；
图5.E-rRT-MCDA检测NP基因最佳反应温度测试结果图谱；
图6.E-rRT-MCDA检测ORF1ab基因的灵敏度测试结果图谱；
图7.E-rRT-MCDA检测NP基因的灵敏度测试结果图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成 任何限制。
本发明E-rRT-MCDA方法的具体操作流程如图1所示。所述操作包括样 品收集、模板准备、E-rRT-MCDA反应和结果检测4个部分。
1.E-rRT-MCDA扩增原理
MCDA的扩增原理见中国发明专利申请20151028765.X，本发明引用该专 利文献的说明书内容作为本发明说明书的组成部分。本发明选取SARS-CoV-2 的ORF1ab片段和NP基因两个靶标作为MCDA扩增的靶序列/目的基因，同 时评价单独扩增ORF1ab序列或NP基因以建立MCDA扩增检测新型冠状病 毒的方法。
(1)通过MCDA扩增构建可检测引物
ORF1ab和NP基因两个靶标的MCDA反应体系分别包括10条引物(如 表1所示)，识别靶序列的10个区域，分别为2条置换引物，即F1和F2，2 条交叉内引物，即CP1和CP2，6条扩增引物，即D1，D2，C1，C2，R1和 R2。为了构建可检测产物，在针对ORF1ab序列扩增引物ORF-D1的5’端标 记FAM并在该引物中连接BHQ1(记为ORF-D1*),在针对NP基因序列扩 增引物的N-D1的5’端标记CY5并在该引物中连接BHQ2(记为N-D1*)，原 理示意图见附图1。图1中，FAM代表6-羧基荧光素；CY5代表CY5荧光素； BHQ1/BHQ2代表荧光淬灭基团；AMV代表逆转录酶；Nb.BsrDI代表限制性 内切酶，识别位点为TGCAATG；Bst2.0代表链移位型聚合酶。
(2)结合说明书附图1简述E-rRT-MCDA检测原理如下：
在SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA检测体系中，在ORF1ab序列扩增引物 ORF-D1*的5’端链接Nb.BsrDI酶识别的短序列(TGCAATG)用FAM标记， 并在该引物中连接BHQ1荧光淬灭基团，在NP基因序列扩增引物的N-D1* 的5’端链接Nb.BsrDI酶识别的短序列(TGCAATG)用CY5标记，并在该引 物中连接BHQ2荧光淬灭基团。待测样品RNA在逆转录酶(AMV)的作用下， 将靶基因RNA序列逆转录为cDNA，在置换引物、交叉引物、扩增引物及DNA 聚合酶(Bst 2.0)、解链温度调节剂的作用下对cDNA模板靶基因进行恒温扩 增(工作温度为63—66℃)，扩增形成双链时，链接有短序列(TGCAATG) 的靶基因被Nb.BsrDI酶识别并剪切，荧光基团FAM/CY5和淬灭基团 BHQ1/BHQ2断裂分离，释放荧光信号，被荧光定量PCR仪检测。
表1.针对F1ab和N基因设计的引物序列及修饰
Figure BDA0003357246060000061
aORF1a/b：开放阅读框1a/b；NP：核蛋白基因。
bFAM：6-羧基荧光素；CY5：CY5荧光素；BHQ1：荧光淬灭基团1；BHQ2： 荧光淬灭基团2。
cmer：monomeric unit(单体单元)；nt：nucleitide(核苷酸)。
2.本发明中实施例所涉及的试剂和仪器：
本发明中实施例所涉及的试剂：逆转录酶(AMV)、限制性内切酶 (Nb.BsrDI)购置于北京擎科生物科技有限公司。恒温扩增试剂盒(Isothermal Amplification Kit)购于北京海泰正元生物科技有限公司(Beijing HaiTai-Zhenyuan Co.Ltd.,Beijing,China)。RNA提取试剂盒购于天隆生物科技 有限公司(中国，西安)。DNA提取试剂盒(QIAamp DNAminikits；Qiagen, Hilden,Germany)购于德国Qiagen公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
本发明实验中使用的主要仪器：全自动核酸提取仪(GeneRotex96)，中国 西安天隆；荧光定量PCR仪(7500FAST)，美国Bio-Rad产品；实时浊度基 因检测系统(LA-500)，荣研生物科技(中国)有限公司。
3.本发明中实施例所涉及的方法和菌毒株
基因组提取：含新型冠状病毒ORF1ab序列和NP基因序列的质粒DNA、 细菌的基因组DNA及其他病毒基因组核酸的提取采用Qiagen公司DNA提取 试剂盒提取，按照说明书进行操作。利用核酸定量仪测定基因组DNA的浓度 和纯度，质粒DNA用GE缓冲液5倍梯度连续稀释(1.1×105拷贝、2.1×104拷 贝、4.3×103拷贝、8.5×102拷贝、1.7×102拷贝、3.4×101拷贝、6.8拷贝、 1.4拷贝)。各种基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。新型冠状病毒病例标本核酸采用全自动核酸提取仪及配套的RNA提取试剂盒(西安天隆)提 取，按照说明书进行操作。
连续稀释的新型冠状病毒ORF1ab序列和NP基因序列的质粒DNA用于 MCDA扩增的最佳温度的探索及扩增体系的建立。以常见的病原体核酸为模 板评价SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA技术的特异性。菌毒株信息见表2。
表2.本发明中所使用病毒和菌毒株基因组
Figure BDA0003357246060000071
Figure BDA0003357246060000081
GZCDC：贵州省疾病预防控制中心
4.本发明实施例所涉及的引物设计
为了验证、评价E-rRT-MCDA技术及建立针对SARS-CoV-2的快速、特 异和敏感的E-rRT-MCDA检测体系。本发明针对SARS-CoV-2的特异基因设 计一套针对SARS-CoV-2的ORF1ab序列和NP基因序列的MCDA扩增引物， 旨在验证E-rRT-MCDA技术的可行性，敏感性，特异性及可靠性。引物设计 示意图见图2，其中ORF1ab序列的MCDA引物序列扩增SARS-CoV-2毒株 (GenBank MN908947)基因组ORF1ab序列的第13311至13598号碱基片段， NP基因的MCDA引物序列扩增SARS-CoV-2毒株(GenBank MN908947)N基 因序列的第28295至28547号碱基片段。
实施例1.E-rRT-MCDA扩增的可行性
标准的MCDA反应体系：2.2μL混合引物，包括置换引物F1和F2的浓 度为0.4μM，交叉引物CP1和CP2的浓度为2.4μM，扩增引物R1，R2，D1* 和D2的浓度为1.2μM，扩增引物C1和C2的浓度为0.4μM；6mM的MgSO4； 1.4mM的dNTP；12.5μL的聚合酶缓冲液；1μL AMV酶(10U)；1μL的链 置换Bst DNA聚合酶(10U)；1μL Nb.BsrDI酶(10U)；2μL的模板，补加 去离子水至25μl。整个反应恒温在65℃，36分钟。
MCDA扩增之后产物可以通过荧光定量PCR仪对其进行检测，阳性具有 扩增曲线，阴性无扩增曲线。针对SARS-CoV-2的ORF1ab基因设计的MCDA 引物标记荧光为FAM(如图3A1：①代表2.1×104拷贝，②代表4.3×103拷贝， NC代表阴性对照为H7N9核酸模板，DW代表空白对照为无菌水)。针对 SARS-CoV-2的NP基因设计的MCDA引物标记荧光为CY5(如图3B1：①代 表2.1×104拷贝，②代表4.3×103拷贝，NC代表阴性对照为H7N9核酸模板， DW代表空白对照为无菌水)。
另外，本发明还应用了实时浊度基因检测系统对MCDA扩增之后产物进 行扩增效果验证，阳性能产生浊度曲线，阴性无浊度曲线。针对SARS-CoV-2 的ORF1ab基因的MCDA扩增产物检测如图3A2：①代表2.1×104拷贝，② 代表4.3×103拷贝，NC代表阴性对照为H7N9核酸模板，DW代表空白对照 为无菌水。针对SARS-CoV-2的NP基因的MCDA扩增产物检测如图3B2： ①代表2.1×104拷贝，②代表4.3×103拷贝，NC代表阴性对照为H7N9核酸 模板，DW代表空白对照为无菌水。
实施例2.测定MCDA技术的最佳反应温度
在标准反应体系条件下，加入针对SARS-CoV-2病毒ORF1ab质粒和NP 质粒模板及所设计的对应的MCDA引物，其模板浓度为2.1×104拷贝。反应在 恒温条件下进行(63—66℃)，结果运用实时浊度基因检测系统进行检测，在 不同的温度下得到不同的动态曲线图，ORF1ab序列扩增(图4，A1为实时浊 度曲线，A2为浊度累积曲线)和NP基因序列扩增(图5，B1为实时浊度曲 线，B2为浊度累积曲线)。63—66℃被推荐作为MCDA引物的的最佳反应温度。本发明中的后续验证选择65℃作为恒温条件进行MCDA扩增。图4和5 标识表示针对ORF1ab和NP基因序列设计的检测SARS-CoV-2病毒的MCDA 引物温度动态曲线图。
实施例3.E-rRT-MCDA检测单一靶标的灵敏度
运用连续稀释好的提取自SARS-CoV-2病毒ORF1ab序列和NP基因质粒 的DNA进行标准的MCDA扩增反应后，运用荧光定量PCR仪检测显示：E-rRT-MCDA的检测范围为1.1×105～6.8拷贝(图6和图7：a代表1.1×105拷 贝、b代表2.1×104拷贝、c代表4.3×103拷贝、d代表8.5×102拷贝、e代表 1.7×102拷贝、f代表3.4×101拷贝、g代表6.8拷贝、h代表1.4拷贝)。当反 应体系中基因组模板量降低至6.8拷贝以下时，显示阴性结果。
实施例4.测定E-rRT-MCDA技术的特异性
以病原体(冠状病毒HKU1、艾滋病毒HIV、甲型H9N2流感病毒、甲型 H7N9流感病毒、甲型H5N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒、甲型H1N1流 感病毒、乙肝病毒HBV、志贺氏菌、沙门氏菌、结核分枝杆菌、炭疽杆菌、 肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、猪链球菌、 流感嗜血杆菌、布鲁氏菌、奈瑟淋球菌)为模板评价SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA 技术的特异性。结果表明，SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA技术能准确地鉴别 SARS-CoV-2，说明SARS-CoV-2-E-rRT-MCDA方法的特异性良好，也证明本 发明提供用于MCDA的引物序列具有优异的特异性和扩增效果。本发明用到 的病原体核酸模板见表2。
实施例5.E-rRT-MCDA技术的应用
为了评估E-rRT-MCDA在实际应用中的检测效果，应用采集自贵州省的 43份新冠肺炎病例标本核酸制备模板，采用SASR-CoV-2-E-rRT-MCDA对43 份核酸进行检测，同时与传统的荧光rRT-PCR方法进行比较。E-rRT-MCDA 方法从43标本核酸中检出38份阳性(ORF1ab基因38份，NP基因32份)， 传统的荧光rRT-PCR检出28份阳性(ORF1ab基因28份，NP基因25份)， 检测结果参见表3。E-rRT-MCDA方法检出阳性标本在覆盖传统的荧光 rRT-PCR检出阳性标本的基础上，检出阳性标本数最多，检测耗时最短(能在 65min内完成检测，包括标本处理10min，RNA提取15min，检测36min)。
表3.MCDA-LFB对新冠肺炎恢复期病人的标本检测结果
Figure BDA0003357246060000101
Figure BDA0003357246060000111
Figure BDA0003357246060000121
注：+标示阳性；—标示阴性
序列表
<110> 贵州省疾病预防控制中心
<120> Nb.BsrDI酶介导的多重交叉置换扩增结合荧光定量检测新冠病毒的方法
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 1
ccctgtgggt tttacactt 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 2
gaatttagca aaaccagcta ct 22
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 3
ggagttgatc acaactacag ccataaaaac acagtctgta ccgt 44
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 4
agtgcagccc gtcttacacc tgtagatgtc aaaagccctg 40
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 5
ggagttgatc acaactacag ccat 24
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 6
agtgcagccc gtcttacacc 20
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 7
tgcaatgcct ttccacatac cgcag 25
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 8
cactagtact gatgtcgta 19
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 9
actgaagcat gggttcg 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 10
cagctgatgc acaatcgtt 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 11
ccccgcatta cgtttggtg 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 12
agccaatttg gtcatctgga 20
<210> 13
<211> 40
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 13
cgttgttttg atcgcgcccc gaccctcaga ttcaactggc 40
<210> 14
<211> 41
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 14
accgctctca ctcaacatgg ctggtgttaa ttggaacgcc t 41
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 15
cgttgttttg atcgcgcccc 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 16
accgctctca ctcaacatgg c 21
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 17
tgcaatgtgc gttctccatt ctggttact 29
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 18
aaggaagacc ttaaattccc tcga 24
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 19
tgggtaaacc ttggggcc 18
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> SARS-CoV-2
<400> 20
ataatactgc gtcttggttc 20
<210> 21
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgcaatg 7

Claims (12)

1.一种限制性内切酶介导的多重交叉置换扩增目的基因的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)提取待检测样品的基因组；
(2)提供置换引物F1和F2；交叉引物CP1和CP2；扩增引物C1和C2，扩增引物D1和D2，扩增引物R1和R2，同时在所述扩增引物C1、D1或R1的5’端链接如SEQ ID NO:21所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团；
(3)在步骤(2)所述引物存在及DNA聚合酶的作用下对步骤(1)获得的基因组进行恒温扩增靶基因形成双链扩增产物；
(4)使用Nb.BsrDI酶对步骤(3)获得的双链扩增产物进行剪切；
(5)检测步骤(4)获得的剪切产物的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述荧光基团为FAM，所述荧光淬灭基团HBQ1，或者所述荧光基团为CY5，所述荧光淬灭基团HBQ2。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示的置换引物ORF-F1和ORF-F2；序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的交叉引物ORF-CP1和ORF-CP2；序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF-C1和ORF-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的扩增引物ORF-D1和ORF-D2；序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的扩增引物ORF-R1和ORF-R2，其中，步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA的步骤。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增引物ORF-D1被标记荧光基团FAM，荧光淬灭基团HBQ1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述引物为：序列分别如SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:12所示的置换引物N-F1和N-F2；序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2；序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的N-C1和N-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的扩增引物N-D1和N-D2；序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物N-R1和N-R2，其中，步骤(1)还包括使用逆转录酶将待检测样品的基因组RNA序列逆转录为cDNA的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述扩增引物N-D1被标记荧光基团CY5，荧光淬灭基团HBQ2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述恒温扩增是在60-66℃的环境中进行的。
8.一组用于多重交叉置换恒温扩增SARS-CoV-2的ORF1ab基因的引物，其特征在于，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的置换引物ORF-F1和ORF-F2；序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的交叉引物ORF-CP1和ORF-CP2；序列分别如SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的ORF-C1和ORF-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示的扩增引物ORF-D1和ORF-D2；序列分别如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示的扩增引物ORF-R1和ORF-R2。
9.根据权利要求8所述的引物，其特征在于，在扩增引物ORF-D1的5’端链接如SEQ IDNO:21所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团。
10.一组用于多重交叉置换恒温扩增SARS-CoV-2的NP基因的引物，其特征在于，所述引物包括：序列分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示的置换引物N-F1和N-F2；序列分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的交叉引物N-CP1和N-CP2；序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的N-C1和N-C2的扩增引物；序列分别如SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18所示的扩增引物N-D1和N-D2；序列分别如SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示的扩增引物N-R1和N-R2。
11.根据权利要求10所述的引物，其特征在于，在扩增引物N-D1的5’端链接如SEQ IDNO:21所示的序列，并被荧光基团标记，并在该引物中间链接荧光淬灭基团。
12.一种含有权利要求8-11任一所述引物的基因检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括链移位型聚合酶、解链温度调节剂和限制性内切酶。
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