JP4923252B2 - 癌の判定方法および癌診断キット - Google Patents
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本願発明者らが、様々な上皮系腫瘍の患者についてNY−ESO−1に対する抗体産生能を調べたところ、膀胱癌で7%(9/124、非特許文献5参照)、前立腺癌で4.6%(10/218、非特許文献6参照)、乳癌で1.6%(1/62、非特許文献7参照)、食道癌で3.9%(2/51、非特許文献8参照)、肝臓癌で2.2%(2/92、非特許文献9参照)であり、何れ癌種もそれほど高くないという結果を報告している。
van der Bruggen P, Traversari C, Chomez P, Lurquin C, De Plaen E, van den Eynde B, Knuth A, Boon T.A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643-1647, 1991. Gure AO, Tureci O, Sahin U, Tsang S, Scanlan MJ, Jager E, Knuth A, Pfreundschuh M, Old LJ, Chen YT. SSX: a multigene family with several members transcribed in normal testis and human cancer. Int. J. Cancer 72: 965-971, 1997. Chen YT, Scanlan, MJ, Sahin U, Tureci O, Gure AO, Tsang S, Williamson B, Stockert E, Pfreundschuh M, Old LJ. A testicular antigen aberrantly expressed in human cancers detected by autologous antibody screening. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1914-1918, 1997. Jager E, Gnjatic S, Nagata Y, Stockert E, Jager D, Karbach J, Neumann A, Rieckenberg J, Chen YT, Ritter G, Hoffman E, Arand M, Old LJ, Knuth A. Induction of primary NY-ESO-1 immunity: CD8+ T lymphocyte and antibody responses in peptide-vaccinated patients with NY-ESO-1+ cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 12198-12203. Stockert E, Jager E, Chen YT, Scanlan MJ, Gout I, Karbach J, Arand M, Knuth A, Old LJ. A survey of the humoral immune response of cancer patients to a panel of human tumor antigens. J. Exp. Med. 187: 1349-1354, 1998. Kurashige T, Noguchi Y, Saika T, Ono T, Nagata Y, Jungbluth AA, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 expression and immunogenicity associated with transitional cell carcinoma: correlation with tumor grade. Cancer Res. 61: 4671-4674, 2001. Nakada T, Noguchi Y, Sato S, Ono T, Saika T, Kurashige T, Gnjatic S, Ritter G, Chen YT, Stockert E, Nasu Y, Tsushima T, Kumon H, Old LJ, Nakayama E. NY-ESO-1 mRNA expression and immunogenicity in advanced prostate cancer. Cancer Immunity 3: 10, 2003. Sugita Y, Wada S, Fujita S, Nakata T, Sato S, Noguchi Y, Jungbluth AA, Yamaguchi M, Chen YT, Stockert E, Gnjatic S, Williamson B, Scanlan MJ, Ono T, Sakita I, Yasui M, Miyoshi Y, Tamaki Y, Matsuura N, Noguchi S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in malignant and benign breast tumors.Cancer Res. 64: 2199-2204, 2004. Fujita S, Wada H, Jungbluth AA. Sato S, Nakata T, Noguchi Y, Doki Y, Yasui M, Sugita Y, Yasuda T, Yano M, Ono T, Chen YT, Higashiyama M, Gnjatic S, Old LJ, Nakayama E, Monden M. NY-ESO-1 expression and immunogenicity in esophageal cancer.Clin. Cancer Res. 10: 6551-6558, 2004. Nakamura, S, Nouso K, Noguchi Y, Higashi T, Ono T, Jungbluth AA, Chen YT, Old LJ, Nakayama E, Shiratori Y. Expression and immunogenicity of NY-ESO-1 in hepatocellular carcinoma. J. Gastroenterol. Hepatol. 21: 1281-1285, 2006.
本発明者らは、正常精巣由来のcDNAライブラリーと胃癌患者血清とを用いてSEREX法を実施し、陽性クローンの1つであるGKAP1がCT抗原であることを見出した。すなわち、胃癌患者の血清中に抗GKAP1抗体が存在することを見出した。さらに、GKAP1の発現解析を行い、GKAP1がヒト正常組織では精巣のみに強く発現していること、一方、癌組織および癌細胞株において発現が認められることを確認した。これらの知見に基づいて、癌マーカーとしてGKAP1を用いる本発明が完成した。
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号1に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドのレベルを測定するポリヌクレオチド測定工程、および上記ポリヌクレオチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。なお、ポリヌクレオチドにはDNAおよびRNAの両方が含まれる。
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号2に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドのレベルを測定するポリペプチド測定工程、および上記ポリペプチドのレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。
一実施形態において、本発明に係る癌診断方法は、被検体由来の試料を用いて癌を診断する方法であって、被検体由来の試料において、配列番号2に示されるアミノ酸配列またはその部分配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体のレベルを測定する抗体測定工程、および上記抗体のレベルを正常レベルと比較する比較工程を包含するものであればよい。
本発明に係るキットは、被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、配列番号1に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドを備えるものであればよい。配列番号1に示される塩基配列またはその部分配列を含むポリヌクレオチドとしては、例えば、GKAP1のmRNAを測定するために使用するプライマー、プローブを挙げることができる。本キットはGKAP1遺伝子の発現レベルの測定に好適に用いることができる。
SEREX法は、図1に概略を示したように、癌患者から摘出した癌組織から直接mRNAを抽出し作製したcDNA発現ライブラリーから、癌患者の血清を用いて癌抗原を検索する方法である。本実施例1では、胃癌の診断に有用な癌・精巣抗原を単離すべく、正常精巣由来のcDNAライブラリーと胃癌患者血清とを用いたSEREX法を実施した。
原発巣および肝転移巣共に縮小傾向を示した胃腺癌患者から血清を得た。なお、当該患者血清は、予め正常精巣から得たタンパク質画分と強く反応することを確認したものを選択した。血清はTBS(Tris-Buffered Saline)で10倍に希釈した後、E.coli Y1090/Y1089のアフィニティーカラム(BioDynamics Lab Inc., Tokyo)を用いて抗バクテリア抗体の吸収処理を行った。
正常精巣Total RNA(BD Biosciences Clontech, Palo Alto, CA, USA)よりQuick Prep Micro mRNA purification kit(Stratagene, La Jolla, CA, USA)を用いてmRNAを精製した。5μgのmRNAよりcDNAを合成し、γZAP Express vector(Stratagene)に組み換えてファージにパッケージングし、cDNA発現ライブラリーを作製した。
150mmプレートあたり約4,000個のファージを蒔き、6〜8時間培養した。IPTGで誘導した蛋白質を直径135mmニトロセルロースメンブラン(Schleicher & Schuell, Dassel, Germany)に転写した後、抗バクテリア抗体を吸収した胃癌患者血清(TBSで200倍に希釈)とさらに15時間反応させ、パーオキシデース標識抗ヒトIgG抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, Pa., USA)で検出した。この時、抗体産生細胞に由来するIgGクローンを除去するために、メンブランをあらかじめ二次抗体のみで処理した。陽性クローンを単離し、それぞれ直径82mmあるいは47mmのメンブランを用いて2次、3次スクリーニングを行い、単クローンとした。
陽性クローンをin vivoエキシジョンによりpBK−CMVプラスミドにした後、インサートcDNAの塩基配列を解析し(ABI PRISM R310 Genetic Analyzer; PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)、遺伝子データベース(http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)によるホモロジー検索を行った。
約20万クローンをスクリーニングした結果、表1に示した45個の陽性クローンを単離した。
(1)RT−PCRによる発現解析
GKAP1特異的プライマーとして、
G-SN(sense: 5’-CATTGTCAAACCCAGTACAG-3’、配列番号3)
G-ASN(antisense: 5’-CTTTCAGAACCACTTCCTGG-3’、配列番号4)
を使用した。プライマーはDNA合成機で合成した。
ヒト正常組織におけるGKAP1遺伝子の発現をノザンブロットにより解析した。精巣cDNAを上記GKAP1特異的プライマー(G-SNおよびG-ASN)を用いてPCR法により増幅した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離・精製した後、ランダムプライム標識法により32Pで標識し、これをGKAP1特異的プローブとして用いた。なお、当該GKAP1特異的プローブの塩基配列を配列番号5に示した。32P標識GKAP1特異的プローブを用いて65℃、17時間ハイブリダイズし(BD MTN Multiple Tissue Northern Blots; BD Biosciences Clontech)、バイオ・イメージアナライザBAS−2000II(Fuji Film)で解析した。
図2に、RT−PCRによるヒト正常組織のGKAP1遺伝子発現解析結果を示した。
図2に示したように、調べた16種類の正常組織のうち精巣にのみ発現がみられ、他の15種類の正常組織には発現がみられなかった。
Claims (10)
- 被検体由来の試料を用いた、被検体が癌を有しているか否かの判定方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号1または配列番号5に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドの転写産物の量を測定するポリヌクレオチド測定工程、
上記ポリヌクレオチドの転写産物の量を正常な転写産物の量と比較する比較工程、および
上記ポリヌクレオチドの転写産物の量が上記正常な転写産物の量の少なくとも2倍である場合に、被検体が癌を有していると判定する判定工程
を包含することを特徴とする判定方法。 - 被検体由来の試料を用いた、被検体が癌を有しているか否かの判定方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドの量を測定するポリペプチド測定工程、
上記ポリペプチドの量を正常なポリペプチドの量と比較する比較工程、および
上記ポリペプチドの量が上記正常なポリペプチドの量の少なくとも2倍である場合に、被検体が癌を有していると判定する判定工程
を包含することを特徴とする判定方法。 - 被検体由来の試料を用いた、被検体が癌を有しているか否かの判定方法であって、
被検体由来の試料において、配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体の力価を測定する抗体測定工程、
上記抗体の力価を正常な力価と比較する比較工程、および
上記抗体の力価が上記正常な力価の少なくとも2倍である場合に、被検体が癌を有していると判定する判定工程
を包含することを特徴とする判定方法。 - 上記癌が上皮系腫瘍または皮膚癌であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の判定方法。
- 上記癌が胃癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の判定方法。
- 被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号1または配列番号5に示される塩基配列を含むポリヌクレオチドを備えることを特徴とするキット。 - 被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドに特異的に結合する抗体を備えることを特徴とするキット。 - 被検体由来の試料を用いて癌を診断するためのキットであって、
配列番号2に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを備えることを特徴とするキット。 - 上記癌が上皮系腫瘍または皮膚癌であることを特徴とする請求項6〜8のいずれか1項に記載のキット。
- 上記癌が胃癌、乳癌、頭頸部癌、肺癌および悪性黒色腫から選択される少なくとも1種であることを特徴とする請求項6〜8のいずれか1項に記載のキット。
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