CN112198314A - 一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药生物技术领域，首先公开了一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的标志物，所述标志物为PSMC4抗原与ALDOC抗原的组合。本发明进一步公开了上述标志物的检测试剂在制备食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的产品中的应用，所述产品为试纸条或试剂盒。本发明首次将PSMC4抗原与ALDOC抗原的组合作为食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的标志物，该标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管癌的检出率，而且，对食管癌的检出率远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状食管癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率。

Description

一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查 的标志物及其应用

本申请是申请号为CN 202010422238.9，申请日为2020-05-19，名称为“一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条”的发明专利的分案申请。

技术领域

本发明属于医药生物技术领域，具体涉及一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条。

背景技术

食管癌(又称食管鳞癌)是世界上常见十大恶性肿瘤之一，我国是世界食管癌高发国家，组织类型主要为鳞状细胞癌。2018年出版的《中国肿瘤登记年报》最新数据显示，我国食管癌居恶性肿瘤发病第六位，死亡第四位，尤其是河南林县、河北磁县和山西长治地区，是食管癌高发区，与其它地区相比，食管癌发病率为500:1。对人民生活质量和家庭幸福构成了严重威胁。

食管癌起病隐匿，以进食哽咽为主诉就诊时，95％患者已处于晚期，中晚期患者术后5年总体生存率仅10％左右，如果在早期食管癌阶段即接受手术，5年生存率可达90％。因此，找到食管癌早期发现的关键技术，是减少食管癌发病率和死亡率的重要途径。现有研究表明，食管癌的病变进展历程为：正常食管粘膜→基底细胞增生→炎症→食管粘膜上皮不典型增生(包括轻度、中度和重度)→早期癌→晚期癌的过程。食管癌前病变是指食管上皮癌变极早期阶段的上皮异常增生，形态表现为基底细胞过度增生、轻、中和重度不典型增生及原位癌。王立东教授领衔的食管癌研究团队历经24年建立了5.4万例食管癌高发区无症状人群33年随访(1985-2018)研究队列和50万例食管癌患者临床诊疗、病理和45年随访(1973-2018)大数据库及生物样本库，随访过程中发现，食管癌前病变突出临床特点是其双向发展的不稳定性，即可向癌的方向持续发展(恶性进展)，也可以停留在某一阶段多年不变(稳定)，甚至可以退回到正常状态(逆转)。目前临床上无预测癌前病变恶性进展方向的诊断方法，仅依靠定期随访进行登记研究。综上，需要寻找一种准确、便捷和灵敏的方法对高发现场食管癌前病变人群进行癌变恶性进展风险预测和早期癌筛查，以指导临床尽早进行干预和治疗。将食管癌发病阻断在癌前病变阶段或者早期癌阶段，将大大降低死亡率。

量子点(Quantum dot,QD)又称半导体纳米晶，呈近似球形，直径在2-10nm范围内，具有明显的量子效应。量子点一般由II-VI族元素(如CdS、CdSe、CdTe、ZnSe、ZnS等)或III-V族元素(无镉量子点，如InP、InAs等)等半导体材料构成，也可由两种或两种以上的半导体材料构成核/壳结构(如常见的CdSe/ZnS核/壳结构量子点等)。量子点的物理、光学、电学特性远优于现有有机荧光染料，具有灵敏度高、稳定性好、保存期长等优势，是新一代荧光标记探针的最优选择。量子点作为标记探针尤其适用于高灵敏度、活体/在体长时间动态观察、多指标同时检测等应用领域。十几年来，量子点在生物标记领域涌现越来越多的研究成果和应用实例，但是在食管癌癌前病变恶性进展和食管癌早期筛查领域诊断试纸方面尚未见相关发明报道。

发明内容

针对现有技术中存在的问题和不足，本发明的目的旨在提供一种用于高发区食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的标志物，本发明的目的之二旨在提供一种上述标志物的应用，本发明的目的之三提供一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条。

为实现发明目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明首先提供了一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌筛查的标志物，所述生物标志物为PSMC4抗原、ALDOC抗原、TXLNA抗原中的任意一种或多种的组合。

本发明还提供了一种上述标志物的检测试剂在制备食管癌前病变恶性进展风险检测产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为与所述标志物特异性结合的抗体。

根据上述的应用，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫层析法或酶联免疫法检测样本中的所述标志物，确定样本中所述标志物的表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述产品为试纸条或试剂盒。

本发明还提供了一种上述标志物的检测试剂在制备食管癌早期筛查产品中的应用。

根据上述的应用，优选地，所述检测试剂为与所述标志物特异性结合的抗体。

根据上述的应用，优选地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。

根据上述的应用，优选地，所述产品通过免疫层析法或酶联免疫法检测样本中的所述标志物，确定样本中所述标志物的表达水平。

根据上述的应用，优选地，所述产品为试纸条或试剂盒。

本发明还提供了一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条，所述试纸条包括结合垫和层析垫，所述结合垫上吸附有捕获抗体，所述捕获抗体为PSMC4单克隆抗体、ALDOC单克隆抗体和TXLNA单克隆抗体的混合物，PSMC4单克隆抗体、ALDOC单克隆抗体和TXLNA单克隆抗体上均带有可检测的标记物；所述层析垫上设有三条检测线和一条质控线，所述检测线上均包被有检测抗体，三条检测线包被的检测抗体分别为PSMC4多克隆抗体、ALDOC多克隆抗体和TXLNA多克隆抗体；所述质控线上包被有兔抗鼠IgG。

根据上述的试纸条，优选地，所述标记物为量子点。更加优选地，所述标记物为CdSe/ZnS量子点。最优选地，所述标记物为羧基水溶性CdSe/ZnS量子点。

根据上述的试纸条，优选地，所述试纸条还包括样品垫、吸样垫和底板，所述样品垫、结合垫、层析垫和吸样垫依次固定在底板上；其中，结合垫的一端压在样品垫的下方，结合垫的另一端压在层析垫的上方；层析垫的一端压在结合垫的下方，层析垫的另一端压在吸样垫的下方。

根据上述的试纸条，优选地，所述捕获抗体中PSMC4单克隆抗体、ALDOC单克隆抗体和TXLNA单克隆抗体的质量比为1:1:1。

根据上述的试纸条，优选的，所述层析垫上的三条检测线和一条质控线按照以下次序排列而成：从靠近吸样垫一端到靠近结合垫一端依次为包被有兔抗鼠IgG的质控线C、包被有TXLNA多克隆抗体的检测线T3、包被有ALDOC多克隆抗体的检测线T2、包被有PSMC4多克隆抗体的检测线T1。

根据上述的试纸条，优选地，层析垫上检测线T1、T2、T3以及质控线C之间的间隔均不小于5mm。

根据上述的试纸条，优选地，所述样品垫的材质为吸水性玻璃纤维，所述结合垫的材质为玻璃纤维膜，所述层析垫的材质为硝酸纤维膜；所述吸样垫的材质为吸水纸或吸水性玻璃纤维膜；所述底板为PVC底板、硬纸板或硬质纤维板。

优选地，本发明中所述样本为血清。

优选地，本发明中食管癌前病变为食管鳞状上皮的不典型增生，食管鳞状上皮的不典型增生根据程度不同，分为轻度不典型增生、中度不典型增生和重度不典型增生。

优选地，本发明中所述食管癌前病变恶性进展是指食管癌前病变人群5年后从食管癌前病变恶变进展为食管癌。

优选地，本发明用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条的应用范围为中国食管癌高发区人群。

本发明还提供了一种上述用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备结合垫：采用量子点分别标记PSMC4抗体、ALDOC抗体和TXLNA抗体，得到量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体，然后将量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体混合均匀后喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥，得到结合垫；

(2)制备层析垫：将PSMC4多克隆抗体、ALDOC的多克隆抗体、TXLNA多克隆抗体和兔抗鼠IgG分别包被在硝酸纤维膜上的检测线T1、T2、T3和质控线C上，包被完成后，将硝酸纤维膜放入封闭液中封闭，封闭后干燥，即得层析垫；

(3)试纸组装：将结合垫和层析垫固定在底板上，结合垫的一端与层析垫的一端连接，在结合垫的另一端放置样品垫，在层析垫的另一端放置吸样垫，干燥，即完成试纸组装，得到用于食管癌前病变进展风险检测的试纸条(如图1所示)。

根据上述的制备方法，优选地，步骤(1)的具体操作为：

(1a)量子点活化：采用N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)将量子点表面的羧基活化，得到活化量子点；接下来的反应中，在乙基-3-碳化二亚胺酸化物(EDC)的作用下，活化的量子点的羧基将会和捕获抗体表面的原始氨基形成酰胺键；

(1b)制备量子点标记的PSMC4单克隆抗体：将活化量子点放置至室温，向活化量子点中加入乙基-3-碳化二亚胺盐酸化物溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液、BSA溶液，摇匀后加入PSMC4单克隆抗体，摇匀后室温孵育30～45分钟，孵育过程中加入乙基-3-碳化二亚胺盐酸化物溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液；孵育后加入甲醇，混合后避光振荡；再加入β-巯基乙醇终止反应，终止反应后采用β－巯基乙醇进行透析；透析后离心去除上清，即得量子点标记PSMC4单克隆抗体；

(1c)按照上述步骤(1a)和(1b)的操作步骤，制备量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体，然后将量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体混合，得到捕获抗体；

(1d)将步骤(1c)制备的捕获抗体均匀喷涂在玻璃纤维素膜上，干燥，得到结合垫。

根据上述的制备方法，优选地，步骤(1)中所述量子点为CdSe/ZnS量子点。更加优选地，所述量子点为羧基水溶性CdSe/ZnS量子点。

根据上述的制备方法，优选地，步骤(1a)中所述活化量子点的浓度为1～10μM；步骤(1b)中所述PSMC4单克隆抗体的浓度为10～100μg/ml，所述活化量子点与PSMC4单克隆抗体的质量比为(1:2)～(1:10)，所述BSA溶液的浓度为20～200mg/mL。

根据上述的制备方法，优选地，步骤(1d)中，在喷涂前，采用包被缓冲液作溶剂，将捕获抗体溶解在包被缓冲液中。更加优选地，所述包被缓冲液为包含20～150mM NaCl、0.05％～3％PEG(w/v)、0.2％～1％海藻糖(w/v)、2～10mg/mL BSA(w/v)、0.05％NaN₃的10～100mM PBS缓冲液。

根据上述的制备方法，优选地，步骤(1d)中，在喷涂捕获抗体前，将玻璃纤维素膜放入预处理液中浸泡1～2h，然后于36～38℃烘干或真空冷冻干燥。更加优选地，所述预处理液为含0.02％～0.1％Tween-20(w/v)的0.01M PBS缓冲液(pH为7～7.3)；该预处理液对多种抗原和抗体都有良好的适应性。

根据上述的制备方法，优选地，步骤(2)的具体操作为：

(2a)采用包被缓冲液作为溶剂，将PSMC4多克隆抗体、ALDOC的多克隆抗体、TXLNA多克隆抗体和兔抗鼠IgG均配制成浓度为0.1～5mg/mL的溶液，得到PSMC4多克隆抗体溶液、ALDOC的多克隆抗体溶液、TXLNA多克隆抗体溶液和兔抗鼠IgG溶液；

(2b)按1～3μL/cm的用量将步骤(2a)制备的PSMC4多克隆抗体溶液、ALDOC的多克隆抗体溶液、TXLNA多克隆抗体溶液和兔抗鼠IgG溶液分别喷涂在硝酸纤维膜上的检测线T1、T2、T3和质控线C上，包被完成后，将硝酸纤维膜放入封闭液中封闭，封闭后干燥，即得层析垫。

根据上述的制备方法，优选地，步骤(2a)中，所述包被缓冲液为包含20～150mMNaCl、0.05％～3％PEG(w/v)、0.2％～1％海藻糖(w/v)、2～10mg/mL BSA(w/v)、0.05％NaN₃的10～100mM PBS缓冲液。

根据上述的方法，优选地，步骤(2b)中所述封闭液为1％-5％的牛血清白蛋白溶液。

根据上述的方法，优选地，步骤(1)、(2)和(3)中所述干燥的温度为37℃，干燥时间为3～5h。

根据上述的方法，优选地，步骤(3)中，在组装前，将样品垫放入预处理液中浸泡1～2h，然后于36～38℃烘干或真空冷冻干燥。更加优选地，所述预处理液为含0.02％～0.1％Tween-20(w/v)的0.01M PBS缓冲液(pH为7～7.3)。

本发明还提供了一种包含上述用于食管癌前病变恶性进展风险检测的试纸条的试剂盒。

根据上述的试剂盒，优选地，所述试剂盒还包含样本稀释液，所述样本稀释液为包含有0.45％～0.9％氯化钠(w/v)、0.02％～0.1％Tween-20(w/v)、20～200mg/mL牛血清白蛋白的PBS缓冲液。

本发明试纸条的使用方法为：将待测血清样本滴加在试纸条的样品垫上，5～15min后对试纸条层析垫进行鉴定。

本发明试纸条的结果判定方法为：

(1)定性结果判定：

将试纸条在紫外灯下观察，试纸条的层析垫上T1、T2、T3中任意1条检测线出现红色条带，质控线C上出现1条红色条带，判定检测结果为阳性；试纸条层析垫上的T1、T2、T3检测线均未出现红色条带，仅质控线C上出现一条红色条带，判定检测结果为阴性；试纸条层析垫质控线C上未出现红色条带，判断检测结果为无效，需要重新进行测试。

用本发明试纸条对食管癌前病变患者的血清样品进行检测时，检测结果若为阳性，说明该癌前病变患者5年后进展为食管癌的风险较高，检测结果若为阴性，说明该癌前病变患者在本发明检测方法中5年后进展为食管癌的风险较低。

用本发明试纸条对食管癌高发区无症状高危人群的血清样品进行检测时，检测结果若为阳性，说明该无症状人可能患有早期食管癌，建议进一步进行内镜检查和粘膜病理活检。

(2)定量结果判定：

通过本发明的试纸条能够实现待测样本中PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白的定量检测。

待测样本中PSMC4蛋白的浓度判定：配置一系列浓度梯度的PSMC4蛋白标准液，如7.8125ng/L、15.625ng/L、31.25ng/L、62.5ng/L、125ng/L、250ng/L、500ng/L作为标准品溶液，分别取各浓度的标准品100μL样品加入到试纸样品垫上，5min后显色完成出现明显的T和C带，利用量子点荧光定量分析仪读取实验结果，分别将T/C的荧光强度及对应的PSMC4蛋白浓度来绘制标准曲线，得到荧光强度PSMC4蛋白浓度的标准曲线(如图2中A所示)，得到荧光强度与PSMC4蛋白浓度的计算公式；将试纸条检测线T1读取的荧光强度代入上述计算公式中，即可得到待测样本中PSMC4蛋白的浓度。

待测样本中ALDOC蛋白的浓度判定：按照上述同样的步骤绘制T/C的荧光强度-ALDOC蛋白浓度的标准曲线(如图2中B所示)，得到荧光强度与ALDOC蛋白浓度的计算公式；将试纸条检测线T2读取的荧光荧光强度代入上述计算公式中，即可得到待测样本中ALDOC蛋白的浓度。

待测样本中TXLNA蛋白的浓度判定：按照上述同样的步骤绘制T/C的荧光强度-TXLNA蛋白浓度的标准曲线(如图2中C所示)，得到荧光强度与TXLNA蛋白浓度的计算公式；将试纸条检测线T3读取的荧光荧光强度代入上述计算公式中，即可得到待测样本中TXLNA蛋白的浓度。

试纸条的灵敏度检测：

以零浓度标准品(即空白对照，不含蛋白)当作标本测量20次，计算其荧光值均值及标准差；以测定值的均值加上2倍的标准差所得的荧光值分别代入PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白的标准曲线方程，得到试纸条对PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白的最低检出浓度，其中，试纸条对PSMC4蛋白最低检出浓度为1ng/ml；对ALDOC蛋白的最低检出浓度为1ng/ml；对TXLNA蛋白的最低检出浓度为1ng/ml。由此说明，本发明试纸条的检测灵敏度高。

本发明用于食管癌前病变进展风险检测的试纸条的检测原理为：

将试纸条插入待测血清样品中，样品流向吸样垫的方向，当流到结合垫上时，结合垫上的量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体溶解，其中，量子点标记PSMC4单克隆抗体与血清样品中可能含有的PSMC4抗原(PSMC4蛋白)结合，形成量子点标记PSMC4单克隆抗体-PSMC4抗原复合物，量子点标记ALDOC单克隆抗体与血清样品中可能含有的ALDOC抗原(ALDOC蛋白)结合，形成量子点标记ALDOC单克隆抗体-ALDOC抗原复合物，量子点标记TXLNA单克隆抗体与血清样品中可能含有的TXLNA抗原(TXLNA蛋白)结合，形成量子点标记TXLNA单克隆抗体-TXLNA抗原复合物；由于毛细管效应，三种量子点标记的捕获抗体-抗原复合物TXLNA在层析垫上移动，当移动至检测线T1时，量子点标记的PSMC4单克隆抗体-抗原复合物与PSMC4多克隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检测线T1上；当移动至检测线T2时，量子点标记的ALDOC单克隆抗体-抗原复合物与ALDOC多克隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检测线T2上；当移动至检测线T3时，量子点标记的TXLNA单克隆抗体-抗原复合物与TXLNA多克隆抗体特异性结合，形成固化的免疫复合物，被截留在检测线T3上；游离的量子点标记捕获抗体由于毛细管效应继续向前泳动，与质控线C上包被的兔抗鼠IgG发生结合而被截留在质控线上；多余的未结合的物质在毛细作用下继续移动到吸样垫上。因此，通过检测线T1、T2、T3的显色情况或荧光强度，能够定性或定量判断待测样本中PSMC4、ALDOC和TXLNA肿瘤相关抗原。

与现有技术相比，本发明取得的积极有益效果为：

(1)本发明首次将PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白这三种蛋白作为一个组合用于食管癌早期筛查检测，其检测灵敏度高达89.5％(即早期食管癌患者中应用这3个蛋白进行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为89.5％)，特异度达到了67.5％(即非食管癌患者中应用这3个蛋白进行诊断时确定为未患食管癌者的比率为67.5％)，因此，本发明的标志物具有较高的灵敏度和特异度，极大地提高了早期食管癌的检出率，而且，对食管癌的检出率远高于现有临床内镜筛查食管癌的检出率，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，有利于无症状食管癌高危人群早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为食管癌患者和家庭带来极大的福祉。

(2)本发明首次将PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白这三种蛋白作为一个组合用于食管癌前病变患者的病变恶性进展风险检测，通过对10000例内镜诊断为癌前病变患者的血清进行检测，评估出恶变高风险的人群，对恶变高风险人群进行5年跟踪随访、胃镜检查和组织病理活检，最终确定为食管鳞癌的比例为24.5％(953/3884)，具有较高的准确率，有利于食管癌的早期发现，实现早发现早治疗，将病变阻断在早期，大大提高食管癌检出率和延长患者寿命。

(3)本发明的该试纸条能够快速检测人血清/血浆中的PSMC4、ALDOC、TXLNA蛋白，实现了三种肿瘤标志物的联合检测，根据检测结果可以预测食管癌前病变患者5年后的病程恶化风险，操作简单，使用方便、快捷，检测时间短，数分钟即可获得结果，极大地提高了癌前病变风险的检测效率和诊断效率，适合在食管癌高发区高危人群的体检筛查诊断中使用。

(4)本发明采用量子点标记捕获抗体，量子点具有很强的荧光强度，量子点标记的灵敏度和特异性均优于其它有机荧光标记(如荧光素或荧光微球等)，检测灵敏度高，灵敏度可达到传统胶体金试纸条的数100～1000倍；而且，量子点的荧光寿命长，采用量子点标记捕获抗体，能够提高试纸条的长期存储稳定性。

附图说明

图1为本发明用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的试纸条的结构示意图。

图2为试纸条定量结果判定的标准曲线；其中A为荧光强度-PSMC4蛋白浓度的标准曲线，B为荧光强度-ALDOC蛋白浓度的标准曲线，C为荧光强度-TXLNA蛋白浓度的标准曲线。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。

食管癌的发生发展与多种基因的异常表达相关，其癌变的形成和发展和多种癌基因的激活和抑癌基因的失活或缺失密切相关。本研究团队前期利用全基因组关联分析、全基因组测序和全外显子测序等技术建立的基因组学数据库的基础上，筛选出一些了与食管癌相关的肿瘤标志物，并将筛选的食管癌标志物在食管癌高发区无症状人群进行长期验证，最终发现PSMC4基因、ALDOC基因和TXLNA基因与食管癌发生相关，并且与食管癌癌前病变恶性转归风险相关。即PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白表达阳性时，更易罹患食管癌；PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白表达阳性，则食管癌前病变患者5年后恶变进展风险可能性较大。因此，本发明采用筛选得到的三种蛋白(PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白)来制备试纸条，用来检测样本中PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白的表达水平，实现食管癌癌前病变恶性进展风险的检测和食管癌的早期筛查。

PSMC4(蛋白酶体26S亚单位)位于染色体19q13上，包含11个外显子。蛋白酶体26S是一个高度有序的多催化位点蛋白酶复合体，由2个复合体、一个20S核心和一个19S调节子组成。蛋白酶体26S在真核细胞中以高浓度分布，并以非溶酶体途径以ATP/泛素依赖的方式裂解多肽。研究发现，PSMC4蛋白在大肠癌、肝癌和神经退行性疾病中高表达，26S蛋白酶体在多数细胞胞质及胞核内表达,细胞内诸多起关键作用的蛋白均通过该途径降解,包括细胞周期调控、转录、凋亡调节以及趋化、血管形成和细胞粘附蛋白,蛋白酶体抑制剂通过下调细胞核内核因子(NF)-κB水平及上调p53、p27等，对于实体瘤和血液系统肿瘤具有明确抗癌作用。

ALDOC位于染色体17q11.2，含有10个外显子，主要在人体的脑内、脂肪组织、心脏、肝脏中表达，食管中少量表达。该基因编码I类果糖-二磷酸醛缩酶，特异性表达在大脑的海马和浦肯野细胞中的一种糖酵解酶，可催化果糖-1,6-二磷酸和果糖1-磷酸可逆的羟醛裂解为磷酸二羟丙酮和甘油三磷酸甘油酯或甘油醛。ALDOC过度表达后，可激活Wnt信号通路，可能与癌症代谢相关。

TXLNA基因位于染色体1p 35.2位置上，含有11个外显子，编码的TXLNA蛋白分子量为61891Da，含有546个氨基酸。有研究报道，TXLNA在肝癌组织中表达上调，与肝癌细胞的增殖和低分化紧密联系。在肾癌组织中，TXLNA高表达对应更短的总生存时间和无病生存时间，且TXLNA高表达与肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移等关系密切。在结直肠癌中的研究显示，TXLNA表达与肿瘤细胞增殖活性显著相关，但是，在食管癌中，尚未见TXLNA基因相关报道。

下列实施例所述的实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规技术，或按照生产厂商所建议的条件；所用试剂、材料和仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：试剂条的制备

1、实验材料

PSMC4单克隆抗体(购自Santa Cruz Biotechnology公司，货号：sc-166003)、ALDOC单克隆抗体(购自Abcam公司，货号：ab87122)和TXLNA单克隆抗体(Santa CruzBiotechnology公司，货号：sc-80994)；PSMC4多克隆抗体(Leading Biology公司，货号APR07165G)、ALDOC的多克隆抗体(Leading Biology公司，货号APG01815G)、TXLNA多克隆抗体(LSBio公司，货号LS-C314712)和兔抗鼠IgG(Abcam公司，货号ab6728)。

PVC底板、硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、吸水纸等均为现有市售产品。

2、制备结合垫

(1)量子点活化：采用N-羟基硫代琥珀酰亚胺将CdSe/ZnS量子点表面的羧基活化，得到活化量子点，活化量子点的浓度为1～10μM。

(2)制备量子点标记的PSMC4抗体：将活化的量子点放置至室温，向活化的量子点中加入乙基-3-碳化二亚胺盐酸化物溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液、BSA溶液(浓度为20～200mg/mL)，摇匀后加入所述PSMC4单克隆抗体(浓度为10～100μg/ml)，活化量子点与PSMC4单克隆抗体的质量比为1：(2～10)，摇匀后进行孵育，孵育过程中加入乙基-3-碳化二亚胺盐酸化物溶液、N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液；孵育后再加入甲醇，混合后避光振荡；再加入β-巯基乙醇进行终止，终止反应后采用β-巯基乙醇进行透析；透析后离心去除上清，即得量子点标记的抗体。

(3)按照上述步骤(1)和(2)的操作步骤，制备量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体，然后将量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体混合，得到捕获抗体；

(4)将玻璃纤维膜放入预处理液中浸泡1～2h，然后于36～38℃烘干或真空冷冻干燥，将步骤(3)制备的捕获抗体采用包被缓冲液溶解后均匀喷涂在干燥的玻璃纤维膜上，干燥，得到结合垫。其中，包被缓冲液为包含20～150mM NaCl、0.05％～3％PEG(w/v)、0.2％～1％海藻糖(w/v)、2～10mg/mL BSA(w/v)、0.05％NaN₃的10～100mM PBS缓冲液；预处理液为含0.02％～0.1％Tween-20(w/v)的0.01M PBS缓冲液(pH为7～7.3)。

3、制备层析垫

(1)采用包被缓冲液作为溶剂，将PSMC4多克隆抗体、ALDOC的多克隆抗体、TXLNA多克隆抗体和兔抗鼠IgG均配制成浓度为0.1～5mg/mL的溶液，得到PSMC4多克隆抗体溶液、ALDOC的多克隆抗体溶液、TXLNA多克隆抗体溶液和兔抗鼠IgG溶液；其中，包被缓冲液为包含20～150mM NaCl、0.05％～3％PEG(w/v)、0.2％～1％海藻糖(w/v)、2～10mg/mL BSA(w/v)、0.05％NaN₃的10～100mM PBS缓冲液。

(2)选用硝酸纤维膜作为层析垫材料，在硝酸纤维膜上标记好三条检测线T1、T2、T3和一条质控线C的位置，彼此之间间隔6mm。用划膜仪在硝酸纤维膜上三条检测线T1、T2、T3和三条质控线C的位置上按0.1-0.5μL/mm用量进行划线，37℃干燥3～5h；然后将硝酸纤维膜浸入封闭液(1％-5％的牛血清白蛋白溶液)中封闭，封闭后干燥，即得层析垫。

4、制备样品垫

样品垫的材质为玻璃纤维膜，将玻璃纤维膜放入预处理液中浸泡1～2h，然后于36～38℃烘干或真空冷冻干燥，即得样品垫；其中，预处理液为含0.02％～0.1％Tween-20(w/v)的0.01M PBS缓冲液(pH为7～7.3)。

5、试纸条组装

试纸条由样品垫、结合垫、层析垫、吸样垫和底板组成，吸样垫的材料为吸水滤纸。

将样品垫、结合垫、层析垫、吸样垫依次裁剪成合适的尺寸，宽度为1cm，长度为8cm。将层析垫贴合在底板的中间，为检测区和质控区，即在层析垫上设置用以判读结果的检测线T1、T2和T3以及质控线C；层析垫右端(上段)为手持部位，固定有吸样垫(吸水滤纸)，吸收检测样品中多余液体；层析垫左端固定结合垫，吸附有量子点标记PSMC4单克隆抗体、量子点标记ALDOC单克隆抗体和量子点标记TXLNA单克隆抗体；结合垫和吸样垫分别与层析垫的两端重叠；结合垫远离层析垫的一端(下段)固定有样品垫，用于接触待检测样品，组装完成后干燥，即得试纸条。

6、试纸条的使用方法

将待测样品滴加在试纸条的样品垫上，5～15min后对试纸条层析垫进行鉴定。

7、试纸条的检测结果判定

定性结果判定：将试纸条在紫外灯下观察，试纸条的层析垫上T1、T2、T3中任意1条检测线出现红色条带，质控线C上出现1条红色条带，判定检测结果为阳性；试纸条层析垫上的T1、T2、T3检测线均未出现红色条带，仅质控线C上出现一条红色条带，判定检测结果为阴性；试纸条层析垫质控线C上未出现红色条带，判断检测结果为无效。

用本发明试纸条对食管癌癌前病变患者的血清样品进行检测时，检测结果若为阳性，说明该癌前病变患者5年后进展为食管癌的风险较高，检测结果若为阴性，说明该癌前病变患者在本发明检测方法中5年后进展为食管癌的风险较低。

用本发明试纸条对食管癌无症状高危人群的血清样品进行检测时，检测结果若为阳性，说明该无症状人可能患有早期食管癌，建议进一步完善内镜和粘膜病理活检；检测结果若为阴性，说明患食管癌风险较低。

实施例2：试纸条用于食管癌早期筛查的价值分析

以本发明实施例1制备的试纸条对食管癌患者和癌前病变患者的血清进行检测，验证PSMC4基因、ALDOC基因和TXLNA基因在食管癌患者和癌前病变患者血清中的表达水平。

1、样本来源

收集来自郑州大学第一附属医院河南省食管鳞癌重点开放实验室的400例血清样本。400例血清样本中包含200例早期食管癌患者血清(食管癌组)和200例食管癌前病变患者血清(癌前病变组)。200例食管癌患者血清(食管癌组)均来自内镜和组织病理检测确诊且未接受任何放化疗的初诊病人，男性100例，女性100例，平均年龄59.1±6.8岁，年龄范围40～80岁。200例食管癌癌前病变患者血清(癌前病变组)均来自内镜和组织病理检测确诊的初诊病人，无任何肿瘤相关证据，其中男性100例，女性100例，平均年龄58.8±6.5岁，年龄范围42～81岁。

2、实验方法

采用本发明实施例1制备的试纸条分别对食管癌组、癌前病变组的血清样本进行检测，具体检测的方法为：取上述待检样品50μL待测血清样本，将待测血清样本与50μL的样品稀释液混合均匀后滴加在试纸条的样品垫上，将试纸条平放静置5～15min，然后在紫外灯下观察检测线和质控线颜色变化，判断检测结果。

同时为了与本发明实施例1制备的试纸条检测性能进行对比，本发明制备了6种对比试纸条，6种对比试纸条的检测指标分别为PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白、PSMC4蛋白+ALDOC蛋白、ALDOC蛋白+TXLNA蛋白、PSMC4蛋白+TXLNA蛋白，采用6种对比试纸条分别对食管癌组、癌前病变组的血清样本进行检测。

3、结果分析

根据试纸条的检测结果评价其对食管癌的筛查诊断价值，结果如表1所示。

表1不同抗原组合对食管癌诊断价值的真实性评价

由表1可知，随着试纸条检测指标(肿瘤相关抗原)的增加，试纸条对食管癌前病变和食管鳞癌的区分准确度逐渐提高，当试纸条联合检测PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白三种肿瘤相关抗原时，对早期食管癌的检测灵敏度达到了89.5％，即食管癌患者中应用该检测方法进行检测正确判断为食管癌的比例为89.5％。随着试纸条检测指标的增加，检测的特异度有所降低，但是联合检测PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白三种肿瘤相关抗原时，检测特异度仍能达到67.5％，也就是说非食管癌患者采用该检测方法进行检测能够正确诊断为非食管癌的比例为67.5％。而且，与单独检测一种肿瘤相关抗原的试纸条相比，联合检测PSMC4、ALDOC和TXLNA三种肿瘤相关抗原的试纸条对食管癌诊断的灵敏度分别为单一指标PSMC4、ALDOC、TXLNA的2.42倍、2.67倍和3.65倍。

因此，通过联合检测血清样本中的PSMC4、ALDOC和TXLNA三种肿瘤相关抗原对早期食管癌筛查诊断，可以保证诊断特异度的前提下，大幅提高诊断的灵敏度；对待检测对象食管癌风险评估具有较好的诊断和应用价值。

从以上研究结果也可以看出，食管癌患者外周血中PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白的表达水平明显高于癌前病变患者，而且，在部分食管癌癌前病变患者血清中也检测到了PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白，说明PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白可能在食管癌癌变过程中高表达，可能用于食管癌癌前病变转归风险预测。

实施例3：试纸条用于食管癌前病变恶变进展风险检测的价值分析

为了进一步研究该试纸条在食管癌癌前病变恶变进展风险检测中的价值，在食管癌高发区(河南省林州市、安阳市、辉县市和山西省长治市)选取内镜下诊断为食管癌前病变患者10000例，年龄为40-70岁，10000例癌前病变患者的采集外周血，离心取血清，然后采用本发明实施例1制备的试纸条对10000例癌前病变患者的血清进行检测，从中筛选出癌变高风险人群(试纸条检测结果为阳性，即判断为癌变高风险人群)和癌变非高风险人群(试纸条检测结果为阴性)。并对两组人群进行5年跟踪随访，记录其内镜检测、病理活检结果。统计5年后两组人群中食管癌患病人数，并进行统计学分析，从而判断PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白联合检测与癌前病变恶性转归风险的关系。

同时为了与本发明实施例1制备的试纸条检测性能进行对比，本发明制备了6种对比试纸条，6种对比试纸条的检测指标分别为PSMC4蛋白、ALDOC蛋白、TXLNA蛋白、PSMC4蛋白+ALDOC蛋白、ALDOC蛋白+TXLNA蛋白、PSMC4蛋白+TXLNA蛋白，采用6种对比试纸条分别对食管癌组、癌前病变组的血清样本进行检测。

本发明实施例1制备的试纸条和6种对比试纸条对10000例食管癌前病变患者的检测结果如表2所示。

表2不同抗原组合检测对食管癌癌前病变进展风险预测价值对比

由表2可知，试纸条联合检测PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白三种肿瘤相关抗原时，筛选出的癌变高风险人群例数最多，癌变高风险人群中5年后发展成食管癌的比例为24.5％(953/3884)，远高于现有内镜在高发区人群中筛查时对食管癌的检出率(2％-3％)；而且，筛选出的癌变非高风险人群中5年后发展成食管癌的比例仅有2.2％(139/6116)。由此说明，三种抗原联合检测时对食管癌前病变恶性进展风险预测价值最大。

采用卡方检验进一步对三种抗原联合检测时筛选出的癌变高风险人群(3884例)和癌变非高风险人群(6116例)进行分析，对比组间差异，分析结果见表3。

表3基于食管癌癌前病变进展风险评估结果

由表3可知，联合检测PSMC4蛋白、ALDOC蛋白和TXLNA蛋白三种肿瘤相关抗原时，筛选出的癌变高风险人群中5年后发展为食管鳞癌的人数是癌变非高风险人群的14倍，95％置信区间在11.6～16.8之间。

综上所述，本发明制备的试纸条能够用于食管癌前病变恶性进展风险检测，也可用于食管癌早期辅助筛查，具有较高的诊断价值。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (5)

1.一种用于食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的标志物，其特征在于，所述生物标志物为PSMC4抗原与ALDOC抗原的组合。

2.权利要求1所述标志物的检测试剂在制备食管癌前病变恶性进展风险检测或食管癌早期筛查的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为与所述标志物特异性结合的抗体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品通过免疫层析法或酶联免疫法检测样本中的所述标志物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为试纸条或试剂盒。

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