JP2003116580A - 新規蛋白質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 α−ＧａｌＮＡｃに対する特異的結合能及び
／又は血球凝集活性を有する新規な蛋白質、及び、該蛋
白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡの提供。 【解決手段】 イトマキヒトデの内部臓器の粗抽出液を
精製して得られる、α−ＧａｌＮＡｃに対する特異的結
合能及び／又は血球凝集活性を有する新規な蛋白質、該
蛋白質をコードする塩基配列を含むＤＮＡ、及びその利
用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、α−ＧａｌＮＡｃ
（α−Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉ
ｎｅ；α−Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン）に対す
る特異的結合能及び／又は血球凝集活性を有する新規な
蛋白質、及び、それをコードする塩基配列を含むＤＮＡ
に関する。また、該蛋白質及び該ＤＮＡの利用に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】レクチンは、各種糖鎖と結合することで
細胞凝集、分裂誘発、分化誘導、細胞障害等の機能を有
する物質の総称であり、一般に、免疫学的産物でなく、
かつ、糖鎖を特異的に認識する蛋白質と定義されてい
る。レクチンとしての活性を有する物質は、Ｈ．Ｓｔｉ
ｌｌｍａｒｋ（１８８８）がトウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ
ｃｏｍｍｕｎｉｓ）毒素の動物赤血球凝集作用を発見
したことを端緒として、種々の植物種子から同様の作用
を示すものとして発見された。以来、多数の植物由来レ
クチンが発見されているが、代表的なものとしてはイン
ゲンマメ（Ｐｈａｓｅｏｌｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）の
ｐｈｙｔｏｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）、ナ
タマメ（Ｃａｎａｖａｌｉａ ｅｎｓｉｆｏｒｍｉｓ）
のｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ Ａ（ＣｏｎＡ）、アメリ
カヤマゴボウ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ ａｍｅｒｉｃａ
ｎａ）のｐｏｋｅｗｅｅｄ ｍｉｔｏｇｅｎ（ＰＷ
Ｍ）、麦芽中の凝集素（ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ａｇｇ
ｌｕｔｉｎ）などがある。このうち、ＰＨＡとＣｏｎＡ
はＴ細胞の、ＰＷＭはＴ細胞とＢ細胞の分裂を誘発する
作用を有する。また、植物ばかりでなく、動物、特に節
足動物や軟体動物等の無脊椎動物の体液中にもレクチン
の定義に合う物質が発見され、動物レクチンと呼ばれて
いる。例えば、カブトガニ（Ｌｉｍｕｌｕｓ）、ウミザ
リガニ（Ｈｏｍａｒｕｓ）、イガイ（Ｍｙｔｉｌｕ
ｓ）、シャコガイ（Ｔｉｒａｎａ）、マイマイ（Ｈｅｌ
ｉｘ）などのレクチンは、哺乳類赤血球を凝集し、その
うちカブトガニとシャコガイのレクチンはヒトのリンパ
球に分裂を誘発する作用を有している。

【０００３】このように、レクチンの中には、免疫系に
おいて有用なリンパ球の分裂誘発等の作用を有するもの
もあり、また、特異的な糖鎖結合性を利用した細胞表面
糖鎖の探索や、複合糖質の特異的精製等にも用いられる
ようになってきた。しかし、免疫学的・細胞生物学的に
その重要性が認められつつあるものの、種々の動物にお
けるレクチンの存在や機能、その有用性等は、未だ十分
に解明されていない。

【０００４】Ｔｎ抗原は、糖鎖不全により生じる代表的
な糖鎖抗原である。主要な臓器の癌において高い頻度で
発現が確認されており、特に大腸癌では７０％以上に発
現されているとされ、その構造はＧａｌＮＡｃα１−Ｓ
ｅｒ／Ｔｈｒと考えられている。種々の腫瘍関連糖鎖抗
原の中でも、Ｔｎ抗原は、正常細胞においてはほとんど
発現が見られず、また存在していても表面化していない
ために免疫系に認識されないと考えられ、癌細胞におい
てのみ特異的に検出されることから、腫瘍マーカーとし
て有用性が高いとして注目されている。これらのことか
ら、Ｔｎ抗原に結合するレクチンとして知られるＨａｉ
ｒｙ ｖｅｔｃｈのＶｉｓｉａ ｖｉｌｌｏｓａ（Ｇｒ
ｕｂｈｏｆｆｅｒ，Ｌ． ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．ｊ．，１９５，６２３−６２６（１９８１））
や、Ｊａｐａｎｅｓｅ ｗｉｓｔｅｒｉａのＷＦＡ（Ｋ
ｕｒｏｋａｗａ，Ｔ．， ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．，２５１，５６８６−５６９３（１９７
６））等の解析が行われてきたが、特異性の解明や結合
能等が十分でなく、Ｔｎ抗原の検出方法は確立されてい
ない。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、α−Ｇａｌ
ＮＡｃに対する特異的結合能及び／又は血球を凝集させ
る活性（血球凝集活性）を有する新規な蛋白質、及び、
それをコードする塩基配列を含むＤＮＡを提供すること
を目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、イトマキ
ヒトデの内部臓器（生殖巣と幽門盲嚢を除く）から調製
した粗抽出液に含まれる血球凝集活性を有する蛋白質に
ついて解析を進めた結果、該蛋白質がα−ＧａｌＮＡｃ
に対してこれまでにない極めて高い特異的結合能を有す
ることを見出し、そのアミノ酸配列を明らかにした。ま
た、該蛋白質が大腸癌等の特異的抗原として知られるＴ
ｎ抗原に対して極めて高い親和性を持つことを見出し
た。本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたも
のである。

【０００７】すなわち、本発明によれば、（１）次の
（Ａ）又は（Ｂ）の性質を有する蛋白質、（Ａ）配列表
の配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有する。（Ｂ）
配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、
１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、α−Ｇａ
ｌＮＡｃに対する特異的結合能及び／又は血球凝集活性
を有する。（２）上記（１）に記載の蛋白質をコードす
る塩基配列を含むＤＮＡ、（３）ＤＮＡが、配列表の配
列番号：１に示す塩基配列を有するものである上記
（２）に記載のＤＮＡ、（４）上記（２）又は（３）に
記載のＤＮＡ、及びこれと連結するプロモーター配列を
含むことを特徴とする組換えＤＮＡ、（５）上記（４）
に記載の組換えＤＮＡを宿主に導入することにより取得
されるＤＮＡ導入体、（６）上記（５）に記載のＤＮＡ
導入体を培養して培養物中に蛋白質を生成せしめ、培養
物から上記（１）に記載の蛋白質を採取することを特徴
とする組換え蛋白質の製造法、（７）上記（４）に記載
の組換えＤＮＡを無細胞蛋白質合成系を用いて転写／翻
訳し、合成系中に蛋白質を生成せしめ、該合成系から上
記（１）に記載の蛋白質を採取することを特徴とする組
換え蛋白質の製造法、（８）上記（６）又は（７）に記
載の方法により製造された組換え蛋白質、（９）次の性
質を有する蛋白質、（ａ）α−ＧａｌＮＡｃに対する特
異的結合能を有する。（ｂ）還元状態では２０ｋＤａの
単量体、２量体及び３量体で存在し、非還元状態では３
０ｋＤａの単量体及び２量体で存在する。（ｃ）ｐＨ
５．５〜１０の範囲で血球凝集活性に大きな変化がな
い。（ｄ）血球凝集活性の発現には、金属塩の存在が必
要である。（ｅ）配列表の配列番号：４〜７の何れかに
記載のアミノ酸配列を有する。（１０）上記（１）、
（８）又は（９）に記載の蛋白質、又は該蛋白質の部分
ポリペプチドを抗原とする抗体、（１１）上記（１）、
（８）又は（９）に記載の蛋白質と、被検物質とを接触
させ、該蛋白質と被検物質との反応性を解析することを
特徴とする、末端にα−ＧａｌＮＡｃを有する糖鎖抗原
を表面に発現する癌細胞の検出方法、（１２）糖鎖抗原
がＴｎ抗原である上記（１１）に記載の方法、（１３）
上記（１）、（８）又は（９）に記載の蛋白質を含有し
てなる、上記（１１）又は（１２）に記載の検出方法を
行うための試薬、（１４）上記（２）又は（３）に記載
のＤＮＡを導入した非ヒト哺乳動物、又はその子孫、が
提供される。

【０００８】

【発明の実施の形態】以下、本発明を更に詳細に説明す
る。なお、本明細書において、蛋白質の分離・精製、Ｄ
ＮＡの単離・調製、ベクターの調製等の遺伝子操作等
は、特に明記しない限り、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ， Ａ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
（２００１））、新生化学実験講座（日本生化学会編；
東京化学同人）等の実験書に記載の方法又はそれに準じ
て行うことができる。

【０００９】１．本発明の蛋白質及びそれをコードする
塩基配列を含むＤＮＡの調製方法 本発明の蛋白質及び該蛋白質をコードする塩基配列を含
むＤＮＡは、例えば、以下のようにして調製することが
できる。具体的には、まず、（１）イトマキヒトデの内
部臓器（生殖巣と幽門盲嚢を除く）の摩砕懸濁液上清か
ら粗抽出液を調製し、（２）得られた粗抽出液から、活
性測定を行いながら本発明の蛋白質を分離・精製する。
次に、（３）得られた本発明の蛋白質を酵素により消化
して、各消化断片のアミノ酸配列を解析し、（４）この
アミノ酸配列を用いて蛋白質及びＤＮＡデータベースを
検索することにより、既知のアミノ酸配列又は塩基配列
との相同性を解析する。続いて、（５）イトマキヒトデ
の生殖巣からｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、精製したｍ
ＲＮＡからｃＤＮＡを調製して、上記アミノ酸配列を元
に設計されたプライマーを用いたＰＣＲを行い、得られ
たＤＮＡ断片の塩基配列を解析すればよい。また、
（６）得られたＤＮＡを適当なプロモーターと共にベク
ターに組み込んだ組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮ
Ａを適当な宿主に導入することによりＤＮＡ導入体を作
製することができる。さらに、該組換えＤＮＡ又はＤＮ
Ａ導入体を用いて、組換え蛋白質を製造することができ
る。以下、上記した各調製工程について更に詳細に説明
する。

【００１０】（１）粗抽出液の調製 本発明の蛋白質は、ヒトデ類等の生物から抽出・精製す
ることができる。用いる生物としては、α−ＧａｌＮＡ
ｃに対する特異的結合能及び／又は血球凝集活性を有す
る蛋白質が抽出できるものであればいかなるものでもよ
いが、ヒトデ類等の海洋生物が挙げられ、中でも特にイ
トマキヒトデが好ましく用いられる。具体的には、例え
ば、イトマキヒトデを用いて本発明の蛋白質を取得する
ためには、まず、イトマキヒトデの内部臓器（生殖巣と
幽門盲嚢を除く）をホモジナイズして摩砕懸濁液を調製
する。この懸濁液から適当な溶液で総蛋白質を抽出した
後、遠心を行って上清を得て、この上清を脱脂綿等を用
いてろ過したものを粗抽出液とし、次の精製工程に供す
ることができる。総蛋白質の抽出に用いる溶液は、蛋白
質の可溶化が安定的に行えるものであればいかなるもの
でもよく、例えば、ＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））に５
ｍＭ ＣａＣｌ₂を添加したもの等を用いることができ
るが、内部臓器を用いているためにプロテアーゼ活性が
高いことが考えられることから、ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、
ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ等のプロテアーゼ阻害剤を添加
することが好ましい。

【００１１】（２）本発明の蛋白質の分離・精製及び解
析 上記（１）において得られた粗抽出液から、通常用いら
れる公知の蛋白質の分離・精製方法、例えば、塩析法、
透析法、限外濾過法、逆相クロマトグラフィー、イオン
交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、電気泳動法等を組
み合わせて、本発明の蛋白質を分離・精製することがで
きる。本発明の蛋白質の分離・精製は、必要に応じてそ
の活性を測定したり、性質を解析しながら行うことが好
ましい。指標となる本発明の蛋白質の活性又は性質とし
ては、血球凝集活性、α−ＧａｌＮＡｃに対する特異的
結合能、分子量、ｐＨ依存性、金属塩の影響等が挙げら
れるが、中でも、血球凝集活性の測定、及び、α−Ｇａ
ｌＮＡｃに対する特異的結合能の解析を行うことが好ま
しい。血球凝集活性の測定、及び、α−ＧａｌＮＡｃに
対する特異的結合能の解析は、例えば、以下の（ａ）及
び（ｂ）に記載の方法等により行うことができる。

【００１２】（ａ）血球凝集活性の測定 本発明の蛋白質を、５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＴＢＳ
（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ（ｐＨ７．５））に溶解して、同溶液で２倍ずつ
段階希釈した希釈系列を調製し、この希釈系列を用いて
血球凝集活性を測定する。例えば、各希釈液の３０μｌ
を、等容量の前記溶液で１０％に希釈した赤血球溶液と
混合して、３７℃で１時間インキュベートした後、凝集
を目視で観察する。赤血球凝集活性はタイター（ＡＵ）
で表現することができ、これは凝集が検出される最大希
釈の逆数として定義される。すなわち、上記蛋白質溶液
の原液を用いた場合に赤血球凝集が観察された場合、１
ＡＵと表現される。また、測定に用いる赤血球の動物種
や状態により凝集性が異なり、異なるタイターが得られ
ることがあるため、活性の比較を行う場合等には、測定
に用いる赤血球は同一のものを用いることが好ましい。
測定に用いる赤血球としては、細胞表面に本発明の蛋白
質と結合し得る糖鎖を発現しているものであればいかな
るものでもよいが、例えば、ヒツジ、モルモット、ウ
マ、イヌ等の赤血球が挙げられる。中でも、ヒツジ赤血
球を用いることが好ましい。活性の測定には、これらの
動物の血液を採取して適宜調製したものを用いてもよい
し、市販の赤血球溶液等を用いることもできる。

【００１３】（ｂ）α−ＧａｌＮＡｃに対する特異的結
合能の解析 （ｉ）種々の糖を用いた血球凝集阻害実験による解析 上記（ａ）に記載の血球凝集活性を測定する反応系に種
々の糖を添加して、どのような糖によって凝集が阻害さ
れるかを検出することにより、本発明の蛋白質の糖に対
する結合能を解析することができる。糖としては、単
糖、オリゴ糖、多糖、糖ペプチド、糖蛋白質、又は、糖
脂質等の中から、水性溶媒に溶解できるものを任意に選
択して用いることができる。

【００１４】血球凝集阻害実験の方法としては、例え
ば、まず、５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＴＢＳに適当な濃
度の本発明の蛋白質を溶解した溶液を調製する。本発明
の蛋白質の濃度は血球凝集が生じる濃度であればよく、
例えば、ヒツジ赤血球を用いる場合には１〜１０ＡＵ、
好ましくは４ＡＵ程度に調製して用いればよい。次に、
種々の糖をいくつかの濃度で添加して、５ｍＭ ＣａＣ
ｌ₂を含むＴＢＳに溶解した１０％ヒツジ赤血球溶液を
調製し、先に調製しておいた本発明の蛋白質溶液３０μ
ｌにそれぞれ等容量加える。ここで、本発明の蛋白質に
よる赤血球凝集が阻害された場合に、該蛋白質が添加し
た糖に対して結合能を有すると判定することができる。
また、赤血球凝集を阻害した糖の濃度から、該蛋白質の
該糖への結合の特異性の高さを検討することができる。

【００１５】用いる糖の具体例としては、構造既知のも
のであって、水性溶媒に溶解できるものであればいかな
るものでもよいが、例えば、Ｄ−ガラクトース、Ｄ−グ
ルコース、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｎ
−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガ
ラクトサミン、Ｄ−フコース、β−ラクトース、Ｄ−マ
ンノース等の単糖や、Ａ型、Ｂ型糖鎖等のオリゴ糖等が
挙げられる。糖ペプチドとしては、例えば、Ｔｎ抗原等
が挙げられ、糖蛋白質としては、フェツイン、アシアロ
フェツイン、ムチン、アシアロムチン等が挙げられる。
糖脂質としては、フォルスマン抗原、グロボシド、ガン
グリオシド等が挙げられる。ここで、糖蛋白質を用いる
場合には、本発明の蛋白質と結合し得る糖鎖が表面に露
出しておらず、反応性が低下することがあるので、その
ような場合には、あらかじめプロナーゼ消化等を行って
糖ペプチドとして調製し、これを用いることが好まし
い。

【００１６】（ii）ＥＬＩＳＡ法による解析 本発明の蛋白質がどのような糖に対して結合能を有して
いるかの解析や、活性の測定は、ＥＬＩＳＡ法を用いて
行うこともできる。用いる糖としては、マイクロタイタ
ープレート等に固定化できるものであればいかなるもの
でもよいが、例えば、上記（ｉ）と同様のものが挙げら
れる。ＥＬＩＳＡ法により本発明の蛋白質の解析及び活
性測定を行う方法としては、まず、種々の糖を緩衝液
（例えば、ＴＢＳ−０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０等）に溶
解して、各溶液をマイクロタイタープレートに入れ、４
℃で一夜インキュベートしてコートする。同じ緩衝液で
洗浄後、プレートを１％ＢＳＡを含む同じ緩衝液でブロ
ッキングし、あらかじめビオチンで標識した本発明の蛋
白質を加えて室温で２時間インキュベートしてから、同
じ緩衝液で洗浄する。ここで、本発明の蛋白質のビオチ
ン標識は、それ自体公知の通常用いられる方法により行
うことができ、例えば、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｏｓｕ（Ｄｏｊ
ｉｎｄｏ ｒｅａｇｅｎｔｓ社製）等の市販のキットを
用いることができる。次に、ストレプトアビジン−ホー
スラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（ＧＩ
ＢＣＯ−ＢＲＬ社製等）を加え、室温で１５分インキュ
ベートした後、ホースラディッシュペルオキシダーゼの
基質として２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチ
アゾリン−６−スルホン酸）を添加する。マイクロプレ
ートリーダーを用いて４１５ｎｍの波長で測定を行い、
酵素反応による発色を検出することにより、本発明の蛋
白質がどのような糖に対して結合能を有するかを解析す
ることができ、また、測定値から活性を知ることができ
る。

【００１７】（iii）ＴＬＣ−ｏｖｅｒｌａｙ ａｓｓ
ａｙによる解析 本発明の蛋白質がどのような糖に結合能を有するかの解
析は、ＴＬＣ−ｏｖｅｒｌａｙ ａｓｓａｙによっても
行うことができる。解析の方法としては、例えば、本発
明の蛋白質との結合性を解析したい目的の糖を公知の方
法に従ってＴＬＣ（薄相クロマトグラフィー）で展開し
た後、これに本発明の蛋白質をあらかじめビオチンで標
識したものを接触させて、アルカリフォスファターゼで
標識したストレプトアビジン（ストレプトアビジン−ア
ルカリフォスファターゼコンジュゲート）を作用させ、
発色法により検出及び定量を行うことができる。用いる
糖としては、ＴＬＣで展開可能なものであればいかなる
ものでもよいが、例えば、上記（ｉ）又は（ii）と同様
のものが挙げられる。中でも特に糖脂質については、水
性溶媒に溶解しにくい性質を有するものが多いことか
ら、ＴＬＣ−ｏｖｅｒｌａｙ ａｓｓａｙにより解析を
行うことが好ましい。

【００１８】上記（ａ）又は（ｂ）に例示したような方
法を用いることにより、本発明の蛋白質の活性を測定す
ることができ、また、どのような糖に対して結合能を有
するか、どの程度の特異性を有するかを解析することが
できる。またさらに、本発明の蛋白質の結合は糖のアノ
マー配位（α又はβ）を見分けることができるため、特
に結合性の高い糖の立体異性体がα−アノマー又はβ−
アノマーのどちらであるかについても解析することがで
きる。

【００１９】これらの測定又は解析によって、本発明の
蛋白質がＧａｌＮＡｃ（Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇａｌ
ａｃｔｏｓａｍｉｎｅ； Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクト
サミン）、中でも特にα−ＧａｌＮＡｃへの特異的結合
能が高いことを確認することができ、該蛋白質の分離・
精製にはＧａｌＮＡｃを結合させたセファロースＣＬ４
Ｂ等のアフィニティークロマトグラフィーを好ましく用
いることができる。さらに、アフィニティークロマトグ
ラフィーを行って得られた各画分について、血球凝集活
性の測定、又は、ＧａｌＮＡｃを有する糖を用いた活性
測定を行い、特に高い活性を有する画分を選択して次の
アミノ酸配列分析に供することができる。

【００２０】かくして得られる本発明の蛋白質は、上記
の解析方法もしくは後記実施例にて詳述するとおり、次
の諸性質を有するものである。 （I）α−ＧａｌＮＡｃに対する特異的結合能を有す
る。 （II）還元状態では２０ｋＤａの単量体、２量体及び３
量体で存在し、非還元状態では３０ｋＤａの単量体及び
２量体で存在する。 （III）既知のレクチンと比較して、１００倍以上の血
球凝集活性を有する。 （IV）ｐＨ５．５〜１０の範囲で血球凝集活性に大きな
変化がない。特に、ｐＨ７．５〜９の間では、ほぼ一定
である。 （V）血球凝集活性の発現には、金属塩の存在が必要で
ある。すなわち、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ又はＥ
ＧＴＡの存在下で血球凝集活性が失われ、金属塩、例え
ばＣａＣｌ₂の添加により、該活性が回復する。

【００２１】（３）本発明の蛋白質の部分アミノ酸配列
分析 次に、上記（２）において分離・精製・解析された本発
明の蛋白質の部分アミノ酸配列分析を行う。まず、例え
ば、細胞工学別冊８：新細胞工学実験プロトコール（監
修：豊島久眞男・山本 雅、秀潤社、ｐｐ．３０４−３
０９（１９９３））に示されるようなＩｎ Ｇｅｌ Ｄ
ｉｇｅｓｔｉｏｎ法等により、得られた蛋白質の酵素消
化を行う。消化に使われる蛋白質分解酵素としては、リ
ジルエンドプロテアーゼ、Ｖ８プロテアーゼ、エンドプ
ロテアーゼＡｓｐ−Ｎ、エンドプロテアーゼＡｒｇ−
Ｃ、トリプシン、キモトリプシン等があるが、これらの
なかで基質特異性、安定性、界面活性剤の存在下での活
性等の点から、リジルエンドペプチダーゼを用いるのが
好ましい。消化により得られたモノ又はポリペプチドの
分離法としては、例えば、逆相高速液体クロマトグラフ
ィー（逆相ＨＰＬＣ）、ゲルろ過クロマトグラフィー、
イオン交換クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラ
フィー、薄相クロマトグラフィー、濾紙電気泳動法、キ
ャピラリー電気泳動法等があるが、精度や再現性、回収
率等の点から、疎水性に基づいて分離を行うことができ
る逆相ＨＰＬＣを用いるのが好ましい。分離された各部
分ペプチドは、アミノ酸配列分析器を用いてそれぞれの
部分アミノ酸配列を分析し、その結果を市販の解析ソフ
トを用いて解析して配列を特定する。解析ソフトで解析
不可能であった部分については解析者の目視による解析
でまかなう。かくして得られる部分アミノ酸配列とし
て、配列表の配列番号：４〜７に記載の配列を挙げるこ
とができる。

【００２２】（４）蛋白質及びＤＮＡデータベースの検
索 上記（３）で得られた部分アミノ酸配列について、既知
のアミノ酸配列及びＤＮＡ配列のデータベース中に相同
性の高いものが存在するかどうか解析する。アミノ酸配
列のデータベースとしては、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（Ｅ
ｕｒｏｐｅａｎＢｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｅ）や、ＮＢＲＦ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉ
ｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔ
ｉｏｎ）等があるが、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴを用いるの
が好ましい。またＤＮＡ配列のデータベースについて
は、アミノ酸配列をコードするＤＮＡの相補鎖を含め両
鎖について３フレーム、計６フレームについて検索す
る。これに用いるＤＮＡデータベースとしてはＧｅｎＢ
ａｎｋ、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＤＤ
ＢＪ（ＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａ
ｎ）等が挙げられる。検索に用いるソフトとしては、Ｂ
ＬＡＳＴ（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａ
ｔｉｏｎ社製）、Ｇｅｎｅｔｙｘ（ソフトウェア開発株
式会社製）、ＥＵＧＥＮＥ、ＵＷＧＣＧ、Ｂｉｏｒｅｓ
ｅａｒｃｈ（富士通社製）等が用いられるが、検索精
度、検索速度からＢＬＡＳＴが好ましい。このような検
索の結果、上記（３）で得られた部分アミノ酸配列につ
いては、いずれのデータベースにも相同性の高い配列が
存在せず、本発明の蛋白質が新規な蛋白質であることを
確認することができた。

【００２３】（５）本発明の蛋白質のｃＤＮＡの単離及
びその塩基配列の決定 次に、本発明の蛋白質のｃＤＮＡを単離し、その塩基配
列を決定する。まず、上記（３）で得られた部分アミノ
酸配列からそれをコードする塩基配列を推定し、その塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして
ＤＮＡシンセサイザーにより合成する。得られたプライ
マーを用いて、イトマキヒトデ等の本発明の蛋白質を抽
出した生物のｃＤＮＡやｃＤＮＡライブラリー等を鋳型
にしたＰＣＲを行い、目的のＤＮＡ断片を増幅させるこ
とにより、本発明の蛋白質をコードするＤＮＡを取得す
ることができる。

【００２４】具体的には、用いられるプライマーとして
は、例えば、上記（３）において解析された本発明の蛋
白質のアミノ酸配列（配列番号：４〜７）に基づいて設
計された、配列番号：８〜１０に記載のオリゴヌクレオ
チド等が挙げられる。プライマーとして用いる合成オリ
ゴヌクレオチドは、それ自体公知の通常用いられる方法
によって作製することができる。ｃＤＮＡとしては、イ
トマキヒトデの組織や細胞等からｔｏｔａｌ ＲＮＡを
抽出し、ｍＲＮＡを精製して、これを転写したｃＤＮＡ
を用いることができる。また、得られたｃＤＮＡを適当
なベクターにクローニングして作製したｃＤＮＡライブ
ラリーや、市販のｃＤＮＡライブラリーを用いることも
できる。

【００２５】このようにして得られるＤＮＡ断片は、こ
れを適当なベクターに挿入して組換えベクターを作製
し、このベクターについて適当なシークエンス用プライ
マーと、オートシークエンサー用ＰＣＲシークエンスキ
ット等を用いてシークエンスのためのＤＮＡ合成反応を
行い、これを適当なオートＤＮＡシークエンサー等を用
いて解析し、該組換えベクター中に挿入されたＤＮＡの
塩基配列を特定することができる。シークエンスキット
としては、例えば、Ｂｉｇｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏ
ｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｒｅａｄｙ
ＲｅａｃｔｉｏｎＫｉｔ（アプライドバイオシステムズ
社製）等が、シークエンサーとしては、例えば、ＤＮＡ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ：Ｍｏｄｅｌ ３７７Ａ（アプラ
イドバイオシステムズ社製）、ＡＬＦｒｅｄ ＤＮＡシ
ークエンサー（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ
Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等が挙げられる。

【００２６】次いで、得られた塩基配列が、オープンリ
ーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を含んでいること
を、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエア社製）等の市販の
塩基配列解析ソフト等を用いて解析する。塩基配列にＯ
ＲＦの全長が含まれていなかった場合は、既知の５’−
ＲＡＣＥ又は３’−ＲＡＣＥ法等を用いて上記ｃＤＮＡ
からＯＲＦの全長を含むＤＮＡを取得することができ
る。

【００２７】かくして得られる本発明のＤＮＡとして、
例えば、配列番号：１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ
が挙げられる。該ＤＮＡは、配列番号：１に記載の塩基
配列を有するものに制限されるものではなく、後述する
本発明の蛋白質のアミノ酸配列をコードする塩基配列を
含むものであれば、いかなる塩基配列であってもよい。
また、例えば、配列番号：１に記載の塩基配列におい
て、１若しくは数個の塩基の置換、欠失、挿入、付加、
又は逆位を含むものであっても、該ＤＮＡがα−Ｇａｌ
ＮＡｃに対する特異的結合能及び／又は血球凝集活性を
有する蛋白質をコードするものであれば、いずれのもの
でもよい。塩基配列の置換、欠失、挿入、付加、逆位等
を含むＤＮＡの調製は、それ自体既知の通常用いられる
方法、例えばサイトダイレクテドミュータジェネシスキ
ット（宝酒造製）や、クイックチェンジサイトダイレク
テドミュータジェネシスキット（STRATAGENE社製）等の
キットを用いて容易に行うことができる。

【００２８】配列表の配列番号：１に記載の塩基配列
は、本発明の蛋白質の未成熟型をコードするものであ
る。生体内において、一部の蛋白質は小胞体膜結合性の
リボソーム上で合成された後に脂質二重層を通過するた
めに、このときに必要なシグナルペプチドがＮ末端に存
在し、膜通過後にシグナルペプチダーゼにより切断され
て成熟型蛋白質となることが知られている。成熟型蛋白
質の解析は、上記（２）に記載の方法により精製された
本発明の蛋白質のＮ末端分析を行って、Ｎ末端アミノ酸
残基を同定することにより、配列番号：１に記載の塩基
配列中のＯＲＦ（塩基番号８５〜５９１）において、の
ちに切断されるシグナルペプチドをコードするシグナル
配列を区別し、本発明の蛋白質の成熟型をコードする配
列を決定することができる。蛋白質のＮ末端分析は、そ
れ自体公知の通常用いられる方法により行うことができ
るが、例えば、エドマン法、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミ
ノアゾベンゼン−４’−イソチオシアネート法（ＤＡＢ
ＩＴＣ法）、ダンシルアミノ−ＰＩＴＣ法等が挙げられ
る。中でもエドマン法を用いるのが好ましく、この方法
を自動化したアミノ酸配列分析装置等を用いて分析を行
うことができる。このような方法により解析された本発
明の蛋白質の成熟型は、配列番号：１に記載の塩基配列
中の塩基番号１３９〜５９１によりコードされているも
のであった。また、かくして得られる本発明の蛋白質の
成熟型のアミノ酸配列として、配列番号：３に記載の配
列が挙げられる。

【００２９】本発明の蛋白質は、配列番号：３に示すア
ミノ酸配列を含み、α−ＧａｌＮＡｃに対する特異的結
合能及び／又は血球凝集活性を有する蛋白質であれば、
いかなるものでもよい。また、例えば、配列番号：３に
記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ
酸の置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含むアミノ酸
配列からなるものであって、α−ＧａｌＮＡｃに対する
特異的結合能及び／又は血球凝集活性を有する蛋白質で
あれば、いずれのものでもよい。このような蛋白質とし
ては、天然に存在する本発明の蛋白質のアイソフォーム
をそれ自体公知の方法に従って取得したものでもよい
し、公知の方法を用いて任意に置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を生じさせたものでもよい。また、α−Ｇ
ａｌＮＡｃに対する特異的結合能及び／又は血球凝集活
性を有している限り、本発明の蛋白質は単量体でも多量
体を形成していてもよい。

【００３０】また、蛋白質は生体内に存在する蛋白質分
解酵素により切断（プロセッシング）されることがある
が、当然のことながら本発明の蛋白質においても、α−
ＧａｌＮＡｃに対する特異的結合能及び／又は血球凝集
活性を有するものであれば、切断されたアミノ酸配列の
部分断片であっても本発明の範囲に含まれる。さらに、
上記した蛋白質及びその部分断片をコードする塩基配列
を含むＤＮＡも、本発明に含まれる。

【００３１】（６）組換えＤＮＡ及びＤＮＡ導入体の作
製、それらを用いる蛋白質製造法、及び、該製造法によ
り製造される組換え蛋白質 本発明のＤＮＡを適当なプロモーター配列に連結させた
組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを適当な宿主に
導入することによりＤＮＡ導入体を作製することができ
る。また、該組換えＤＮＡ又はＤＮＡ導入体用いてを転
写及び翻訳させることにより、組換え蛋白質を製造する
ことができる。転写及び翻訳は、生細胞中又は無細胞蛋
白質合成系により行うことができる。具体的には、用い
られるＤＮＡとしては、例えば、配列表の配列番号：１
に記載の塩基配列で表されるＤＮＡ、該塩基配列中のＯ
ＲＦ部分のＤＮＡ（塩基番号８５〜５９１）、又は、該
塩基配列中の塩基番号１３９〜５９１で表される成熟型
蛋白質をコードするＤＮＡ等が挙げられる。転写及び翻
訳を生細胞中で行う場合には、本発明のＤＮＡを適当な
発現ベクター、若しくは適当なベクターに適当なプロモ
ーターとともに挿入して組換えＤＮＡを作製し、この組
換えＤＮＡを用いて適当な宿主微生物を形質転換した
り、適当な培養細胞に導入することによりＤＮＡ導入体
を作製する。これらのＤＮＡ導入体を適当な方法により
培養し、培養物中に蛋白質を生成させて、培養物から該
蛋白質を適当な精製方法を用いて精製することにより、
組換え蛋白質を取得することができる。

【００３２】（ａ）組換えＤＮＡの作製 組換えＤＮＡの作製に用いるベクターは、本発明のＤＮ
Ａが導入された適当な宿主微生物又は培養細胞において
発現されるものであれば特に制限はないが、通常それぞ
れの宿主微生物又は培養細胞に適したプロモーターが挿
入されている市販の蛋白質発現用ベクターを用いればよ
い。また、プラスミドベクター、ファージベクターとも
に用いることができる。具体的には、宿主微生物が大腸
菌の場合には、例えば、ｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社
製）、ｐＥＴ３、ｐＥＴ１１（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社
製）等が挙げられ、好ましくはｐＴＶ１１８Ｎが用いら
れる。また、ｐＧＥＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）等のＴａｇとして用い
得る蛋白質を付加するベクターを用いて発現を行えば、
Ｔａｇを利用して発現された蛋白質を簡便に分離・精製
することができる。その他に、酵母、昆虫細胞、動物細
胞等、それぞれに適したベクターを選択して用いること
ができる。これらのベクターへの本発明のＤＮＡの挿入
は、該ＤＮＡをベクター中のプロモーターの下流に該Ｄ
ＮＡがコードする蛋白質のアミノ酸配列がフレームシフ
トしないで翻訳されるように連結して行えばよい。本発
明のＤＮＡを発現させるためのプロモーターとしては、
宿主微生物又は培養細胞が保有するプロモーターを挙げ
ることができるが、これに限られるものではなく、具体
的には、例えば、宿主微生物が大腸菌の場合はＴ３、Ｔ
７、ｔａｃ、ｌａｃプロモーター等を用いることができ
る。

【００３３】（ｂ）ＤＮＡ導入体の作製 作製された本発明の組換えＤＮＡは、通常用いられる公
知の方法に従って任意の宿主微生物又は培養細胞等に導
入され、ＤＮＡ導入体を作製することができる。形質転
換を行う方法としては、宿主微生物が大腸菌の場合に
は、例えば、エレクトロポレーション法やヒートショッ
ク法等が挙げられる。

【００３４】更に、上記した発現ベクターを用いる方法
の他に、プロモーター配列を連結した本発明のＤＮＡ断
片を宿主微生物の染色体中に直接挿入する相同組換え技
術（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｓ
ｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５
７，２０３６（１９９３））、あるいはトランスポゾン
や挿入配列（Ａ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ ｅｔ ａｌ．，
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１１，７
３９（１９９４））を用いてＤＮＡ導入体を作製するこ
ともできる。

【００３５】ベクターを導入する宿主としては、本発明
のＤＮＡがコードする蛋白質が体内で生成されるもので
あれば特に制限されないが、例えば大腸菌、酵母、バキ
ュロウィルス（節足動物多角体ウィルス）−昆虫細胞、
動物培養細胞等が挙げられる。具体的には、大腸菌で
は、ＪＭ１０９（宝酒造社製）、ＢＬ２１、ＸＬ−１Ｂ
ｌｕｅ、ＸＬ−２Ｂｌｕｅ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社
製）等が挙げられ、中でも、ＪＭ１０９が好ましく用い
られる。

【００３６】（ｃ）組換えＤＮＡ又はＤＮＡ導入体を用
いた蛋白質の製造法 このようにして得られた本発明のＤＮＡ導入体は、それ
ぞれ適した培地により培養される。培地中にはＤＮＡ導
入体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物、ビタミ
ン、血清及び耐性スクリーニングに用いられる薬剤等が
含有される。具体的には、ＤＮＡ導入体の宿主が大腸菌
の場合には、例えばＬＢ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）等を用
いるのが好ましい。ＤＮＡ導入体の培養は通常温度２０
〜４５℃、ｐＨは５〜８の範囲で行われ、必要に応じて
通気や攪拌が行われる。これら以外の培地組成あるいは
培養条件下でも、本発明のＤＮＡ導入体が生育し、挿入
されたＤＮＡがコードする蛋白質が生成されるのであれ
ば、いかなるものでもよい。

【００３７】上記のようにＤＮＡ導入体を培養すること
により培養物中に蛋白質を生成させ、培養後にこれを集
め、適当な緩衝液中に懸濁し、超音波、リゾチーム及び
／又は凍結融解等の方法によって菌体あるいは細胞を破
壊したのち、遠心分離や濾過等の方法を用いて蛋白質粗
抽出液を取得するか、あるいはＤＮＡ導入体の培養上清
を得て、これらをさらに前記したような適当な精製方法
を組み合わせて精製することにより、本発明の組換え蛋
白質を取得することができる。

【００３８】本発明の組換え蛋白質は、無細胞蛋白質合
成系を用いて発現させて製造することもできる。ここで
無細胞蛋白質合成系とは、ＤＮＡからｍＲＮＡへの転写
及びｍＲＮＡから蛋白質への翻訳に必要な全ての要素を
含む系であり、そこに鋳型となり得るＤＮＡを加えるこ
とによりそのＤＮＡがコードしている蛋白質が合成され
得るあらゆる系を意味する。具体例としては、真核細胞
及びバクテリア細胞又はそれらの一部からの抽出液に基
づいて調製された転写翻訳系が挙げられる。好ましい転
写翻訳系としては、例えば、ウサギ網状赤血球、小麦胚
芽、大腸菌からの抽出液（大腸菌Ｓ３０抽出液）に基づ
いて調製された転写翻訳系等が挙げられる。無細胞蛋白
質合成は、ＴＮＴ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ社
製）等の市販のキットを用いることもできる。転写及び
翻訳は、それぞれ順に行っても、同時に行ってもよく、
キットを用いる場合には各キットに示された方法に従っ
て行えばよい。

【００３９】このような無細胞蛋白質合成系を用いて組
換え蛋白質を発現させる場合に用いられる組換えＤＮＡ
は、鋳型となる本発明のＤＮＡが前記した適当なプロモ
ーターの下流に連結され、その制御下にありさえすれ
ば、いかなるものでもよい。また、本発明のＤＮＡが適
当な無細胞蛋白質合成系用のベクター等に組み込まれた
環状ＤＮＡでもよいし、直鎖ＤＮＡでもよい。本発明に
用いられる無細胞蛋白質合成系用のベクターとしては、
例えば前記したベクターから用いる無細胞蛋白質合成系
に適したものを選択すればよい。またプロモーターとし
ては、例えば前記したプロモーターから用いる無細胞蛋
白質合成系において用いられるＲＮＡ合成酵素が認識で
きるものを選択すればよい。具体的には、例えば、ＲＮ
ＡポリメラーゼＩを用いる場合には、Ｔ３、Ｔ７等が好
ましい。

【００４０】かくして、上記組換えＤＮＡ又はベクター
に含まれる鋳型ＤＮＡの転写及び翻訳を行って、合成系
中に蛋白質を生成させ、該合成系から適当な精製方法を
組み合わせて蛋白質を精製することにより、組換え蛋白
質を取得することができる。精製方法としては、前記し
たような通常生化学的に用いられる蛋白質の精製方法を
応用することができる。

【００４１】ここで、生細胞中又は無細胞蛋白質合成系
による組換え蛋白質の発現は、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法で分離を行い、得られたゲルをクマ
シーブリリアントブルー（ＣＢＢ）等で染色したり、又
は、後述する本発明の抗体により検出する等、一般的に
用いられる蛋白質の検出法を用いて確認することができ
る。

【００４２】（ｄ）組換え蛋白質 かくして得られる本発明の組換え蛋白質は、前記した本
発明のＤＮＡを発現させて得られるものであればいかな
るものでもよい。例えば、大腸菌を用いて本発明の組換
え蛋白質の発現を行った場合には、該蛋白質は単量体と
して得ることができる。このような蛋白質は、血球凝集
活性が無く、α−ＧａｌＮＡｃへの高い結合性を有して
いるため、細胞に存在する糖鎖の機能解析等にも好適に
用いることができる。さらに、公知の方法に従って該蛋
白質の多量体を形成させれば、高い血球凝集活性を有す
る蛋白質として調製することもできる。また、他の宿主
を用いて多量体を形成した組換え蛋白質を発現させ、こ
れを単量体として調製することもできる。

【００４３】また、一般的に、発現された蛋白質は生体
内に存在する蛋白質分解酵素により切断（プロセッシン
グ）が起こることが知られているが、当然のことながら
本発明の組換え蛋白質においても、α−ＧａｌＮＡｃに
対する特異的結合能及び／又は血球凝集活性を有するも
のであれば、切断されたアミノ酸配列の部分断片であっ
ても本発明の範囲に含まれる。

【００４４】さらに、得られる組換え蛋白質が遊離体の
場合には、公知の方法あるいはそれに準じる方法によっ
て塩に変換することができ、逆に塩の場合には、遊離体
又は他の塩に変換することができる。このような塩も本
発明の組換え蛋白質に含まれる。また、該蛋白質に、精
製前又は後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させることに
よって任意に修飾を加えたり、ポリペプチド鎖を部分的
に除去する等の操作を行って、修飾蛋白質とすることが
できる。これらの修飾蛋白質も、α−ＧａｌＮＡｃに対
する特異的結合能及び／又は血球凝集活性を有するもの
であれば本発明の範囲に含まれる。

【００４５】２．本発明の蛋白質又は該蛋白質の部分ポ
リペプチドを抗原とする抗体 本発明の抗体は、配列番号：２に記載のアミノ酸配列を
含む蛋白質又はその部分配列を有するペプチドを抗原と
して調製することができる。抗体の調製方法としては通
常用いられる公知の方法を用いることができ、抗原とし
て用いられる部分配列についても、公知の方法に従って
抗原性が高くエピトープ（抗原決定基）として適した配
列を選択して用いればよい。

【００４６】抗原として用いる蛋白質又はペプチドは、
イトマキヒトデ等の生物から抽出・精製したものでもよ
いし、上記組換え蛋白質を用いてもよく、公知の方法に
従って合成した合成ペプチドを用いることもできるが、
イトマキヒトデから抽出・精製した本発明の蛋白質を純
水に対して透析したものを用いるのが好ましい。蛋白質
又はペプチドは公知の方法に従って適当な溶液等に調製
して、哺乳動物、例えばウサギやマウス等に免疫を行え
ばよいが、安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるため
に、抗原ペプチドを適当なキャリア蛋白とのコンジュゲ
ートにして用いたり、抗原ペプチドの他にアジュバント
等を加えて免疫を行うのが好ましい。免疫後、適宜試験
的に採血を行ってウエスタンブロッティング等の方法で
抗体価の上昇を確認し、十分に抗体価の上昇した動物か
ら採血を行う。これに抗体の調製に用いられる適当な処
理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。具
体的には、例えば、公知の方法に従い血清から精製抗体
を取得することができる。また、該動物の脾臓細胞とミ
エローマ細胞とを用いて公知の方法に従って融合させ、
適宜ウエスタンブロッティング等の方法で抗体価を確認
して抗体産生能の高いハイブリドーマを選択し、これを
培養することにより、モノクローナル抗体を得ることも
できる。このようにして得られた本発明の抗体は、ウエ
スタンブロッティングや組織免疫染色等の他、後述する
癌細胞の検出にも用いることができる。

【００４７】３．末端にα−ＧａｌＮＡｃを有する糖鎖
抗原を表面に発現する癌細胞の検出方法 本発明の蛋白質はα−ＧａｌＮＡｃに対して特異的に結
合する性質を有するので、末端にα−ＧａｌＮＡｃを有
する糖鎖抗原を表面に発現する癌細胞の検出に有用であ
る。また、α−ＧａｌＮＡｃを利用して該癌細胞を検出
することにより、腫瘍の良性・悪性の判別、発癌状態や
進行状態、再発等の予後の管理等にも有用な情報を得る
ことができる。検出に用いる蛋白質としては、α−Ｇａ
ｌＮＡｃに対する特異的結合能を有しているものであれ
ばいかなるものでもよいが、イトマキヒトデ等の生物か
ら抽出・精製したものでもよいし、上記１．の（６）に
記載の組換え蛋白質を用いることもできる。また、α−
ＧａｌＮＡｃに対する特異的結合能を有してさえいれ
ば、それらの蛋白質の部分断片、修飾蛋白質等を用いる
こともできる。

【００４８】本発明の蛋白質を用いて検出される対象と
しては、該蛋白質が結合しうる糖鎖抗原をその表面に発
現している癌細胞で有ればいかなるものでも対象となり
うるが、本発明の蛋白質がα−ＧａｌＮＡｃに対する特
異的結合能を有していることから、末端にα−ＧａｌＮ
Ａｃを有する糖鎖抗原を発現している癌細胞を、より高
感度で検出することができる。このような抗原の具体例
としては、Ｔｎ抗原が挙げられる。Ｔｎ抗原は主要臓器
の癌のほとんどにおいて発現すると言われ、その起源が
上皮細胞であるものにより多く発現されると言われてい
るが、特に高発現するものとしては、例えば、大腸癌、
肺癌、膵臓癌、乳癌等が挙げられる。検出方法として
は、例えば、免疫組織染色やＥＬＩＳＡ法等の免疫学的
方法や、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法等の
分子生物学的方法等が挙げられる。試料（被検物質）と
しては、被験者から採取した組織、細胞や、それらの抽
出液、また、血液、リンパ液、尿、唾液等の体液、糞便
等を用いることができる。

【００４９】例えば、免疫組織染色により検出を行う場
合には、試料として被験者から検出を行う組織や細胞を
採取し、組織固定等の適切な前処理を行った後、これ
に、あらかじめ適当な標識化物質を結合させて標識化し
た本発明の蛋白質を接触させる。過剰の標識化蛋白質を
洗浄後、標識化物質を検出することによって、試料中の
糖鎖抗原に結合した本発明の蛋白質を検出及び定量する
ことができる。また、標識化していない本発明の蛋白質
を用いる場合には、上記した本発明の抗体を用いて、公
知の蛋白質検出方法により検出を行うことができる。

【００５０】４．癌細胞の検出試薬 本発明の試薬は、少なくとも本発明の蛋白質を含み、癌
細胞の検出を行えるものであれば、いかなる構成のもの
でもよい。該蛋白質としては、イトマキヒトデ等の生物
から抽出・精製したものでもよいし、上記１．の（６）
に記載の組換え蛋白質を用いてもよい。また、α−Ｇａ
ｌＮＡｃに対する特異的結合能を有してさえいれば、そ
れらの蛋白質の部分断片、修飾蛋白質等を用いることも
できる。

【００５１】試薬としての形態は、本発明の蛋白質の活
性を維持できる形態であれば特に制限はなく、溶液や懸
濁液等の液体でもよいし、固体であってもよい。また、
例えば、上記したような免疫組織染色を行うための試薬
の場合には、本発明の蛋白質は標識化物質を結合させて
標識化されたものであることが好ましい。このような試
薬を用いれば、本発明の癌細胞の検出方法を精度良く簡
便に行うことができる。

【００５２】５．本発明のＤＮＡが導入された非ヒト哺
乳動物 本発明のＤＮＡを含む導入ＤＮＡを構築し、ヒト以外の
哺乳動物の受精卵に導入して、これを雌個体の子宮に移
植して発生させることにより、本発明のＤＮＡが組み込
まれた非ヒト哺乳動物を作製することができる。より具
体的には、例えば、雌個体をホルモン投与により過剰排
卵させ、雄と交配し、交配後１日目の卵管から受精卵を
摘出して、構築された導入ＤＮＡをマイクロインジェク
ション等の方法により導入する。生存している受精卵
を、偽妊娠させた雌個体（仮親）の子宮に移植して出産
させ、新生児の細胞から抽出したＤＮＡのサザンブロッ
トを行うことにより、導入の成否を確認することができ
る。

【００５３】導入ＤＮＡは、少なくとも、本発明のＤＮ
Ａと任意の発現制御領域とを含んだものとして構築さ
れ、ヒト以外の哺乳動物の生殖細胞に導入されることに
より、これを発生させて作製したヒト以外の遺伝子改変
動物において本発明の蛋白質を発現するものであれば、
いかなるものでもよい。用いられるＤＮＡとしては、例
えば、配列表の配列番号：１に記載の塩基配列で表され
るＤＮＡ、該塩基配列中のＯＲＦ部分のＤＮＡ（塩基番
号８５〜５９１）、又は、該塩基配列中の塩基番号１３
９〜５９１で表される成熟型蛋白質をコードするＤＮＡ
等が挙げられる。これらのＤＮＡは、ｃＤＮＡでもよい
し、上記配列を含んでいるものであればゲノムＤＮＡ等
でもよい。任意の発現制御領域としては、転写調節領
域、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー領域等
を適宜選択して用いることができる。例えば、本発明の
蛋白質をある特定の組織や時期に発現させたい場合に
は、目的の組織や時期に発現されるようなプロモーター
やエンハンサーを選択すればよい。

【００５４】このようにして構築される導入ＤＮＡを、
ヒト以外の哺乳動物の生殖細胞に導入して遺伝子改変動
物細胞を作製し、これを発生させることによりヒト以外
の遺伝子改変動物を作製することができる。ヒト以外の
哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモッ
ト、ハムスター、ウサギ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ等が
挙げられる。この中でも、マウス、ラット等の齧歯類が
好ましく、マウスがより好ましい。

【００５５】かくして得られた本発明の非ヒト哺乳動物
は、個体を交配し、導入された本発明のＤＮＡが安定的
に保持されることを確認しながら通常の飼育環境で継代
飼育することによりその子孫を得ることもできるし、体
外受精を繰り返すことによりその子孫を得て、系統を維
持することもできる。本発明の非ヒト哺乳動物には、か
くして得られる本発明のＤＮＡを有するその子孫等も含
まれる。このようにして作製される本発明のＤＮＡが導
入された非ヒト哺乳動物は、本発明の蛋白質の生体内に
おける機能の解析や、該蛋白質が関与する疾患のモデル
動物として用いることができる。

【００５６】６．本発明の蛋白質及びそれをコードする
塩基配列を含むＤＮＡの他の利用 本発明の蛋白質は、それを基板上に固定化した蛋白チッ
プとして利用することができる。また、本発明の蛋白質
をコードする塩基配列及びその部分断片は、それらを基
板上に固定化したＤＮＡチップまたはＤＮＡアレイ（Ｄ
ＮＡマイクロアレイ及びＤＮＡマクロアレイ）として利
用することができる。これらの蛋白チップ、又はＤＮＡ
チップもしくはアレイには、本発明の蛋白質やＤＮＡ以
外に、他の蛋白質やＤＮＡが含まれていてもよい。ここ
で、蛋白質やＤＮＡを固定化する基板としては、ナイロ
ン膜、ポリプロピレン膜等の樹脂基板、ニトロセルロー
ス膜、ガラスプレート、シリコンプレート等が用いられ
るが、ハイブリダイゼーションの検出を非ＲＩ的に、例
えば、蛍光物質等を用いて行う場合には、蛍光物質を含
まないガラスプレート、シリコンプレート等が好適に用
いられる。基板への蛋白質やＤＮＡの固定化は、それ自
体公知の通常用いられる方法により容易に行うことがで
きる。これらの蛋白チップ、ＤＮＡチップあるいはＤＮ
Ａアレイも、本発明の範囲に含まれる。

【００５７】また、本発明の蛋白質及びＤＮＡの配列
は、配列情報としても用いることができる。すなわち、
得られたアミノ酸配列や塩基配列をコンピューターが利
用可能な所定の形式で適当な記録媒体に格納することに
より、アミノ酸配列や塩基配列のデータベースが構築で
きる。このデータベースには、他の種類の蛋白質やそれ
をコードする塩基配列が含まれていてもよい。また、本
発明においてデータベースとは、上記配列を適当な記録
媒体に書き込み、所定のプログラムに従って検索を行う
コンピューターシステムをも意味する。ここで適当な記
録媒体としては、例えば、フロッピー（登録商標）ディ
スク、ハードディスク、磁気テープ等の磁気媒体；ＣＤ
−ＲＯＭ、ＭＯ、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ等の光ディス
ク、半導体メモリ等を挙げることができる。

【００５８】上記した本発明の蛋白質やＤＮＡの配列情
報が含まれるデータベース、配列情報が格納された記録
媒体も、本発明の範囲に含まれる。

【００５９】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定され
るものではない。実施例１．イトマキヒトデの粗抽出液の調製 イトマキヒトデ（九州・北部海岸で採取）の内部臓器
（生殖巣と幽門盲嚢を除く）をホモジナイズして摩砕懸
濁液とし、５ｍＭ ＣａＣｌ₂と、各３０μｇ/ｍｌのｌ
ｅｕｐｅｐｔｉｎ及びｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａを加えた
ＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、０．１５Ｍ
ＮａＣｌ（ｐＨ７．５））溶液２Ｌで抽出した。この
抽出液を８，５００×ｇで３０分間遠心し、上清を脱脂
綿でろ過して、得られた濾液を粗抽出液として次の分離
・精製に用いた。

【００６０】実施例２．本発明の蛋白質の分離・精製 （１）アフィニティークロマトグラフィーによる精製 まず、分離・精製の前段階の検討として、上記実施例
１．で調製した粗抽出液の一部を用いて、単糖との結合
能について解析した。解析の方法は、後記実施例４．の
（２）において詳述する方法と同様にして行った。その
結果、ＧａｌＮＡｃに対する結合能が特異的に高いこと
が解ったので、分離・精製はＧａｌＮＡｃとの結合能を
利用したアフィニティークロマトグラフィーによって行
うこととした。

【００６１】まず、上記実施例１．で調製した粗抽出液
を、あらかじめ５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＴＢＳで平衡
化したＧａｌＮＡｃ−セファロースＣＬ４Ｂにかけ、ア
フィニティークロマトグラフィーを行った。同じ緩衝液
でカラムを洗浄した後、２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＴＢ
Ｓにより吸着した蛋白質を溶出させた。得られた各フラ
クションの赤血球凝集活性を測定したところ、蛋白質の
ピークと活性のピークが一致していることが確認され
た。赤血球凝集活性の測定は、実施例４．の（１）に後
述する方法と同様にして行った。また、ＧａｌＮＡｃ−
セファロースＣＬ４Ｂは、ｄｉｖｉｎｙｌ ｓｕｌｆｏ
ｎｅ及びセファロースＣＬ４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製）を用いて、Ｔ
ｅｉｃｈｂｅｒｇらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６３，１４０８６−１４０９２（１９８８））
に従って調製した。

【００６２】（２）ポリアクリルアミドゲル電気泳動に
よる精製度の確認、及び分子量の推定 上記（１）において精製された蛋白質を、ＳＤＳ−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；還元
状態）にかけ、ＣＢＢで検出して精製度を確認したとこ
ろ、１９ｋＤａ、４１ｋＤａ、６０ｋＤａの３本のバン
ドが得られた。一方、ネイティブ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動（Ｎａｔｉｖｅ−ＰＡＧＥ；非還元状態）
を行ってＣＢＢで検出した場合には、３１ｋＤａ、５７
ｋＤａの２本のバンドが得られた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及
びネイティブ−ＰＡＧＥは、それ自体公知の通常用いら
れる方法により行った。これらの結果から、還元状態で
は２０ｋＤａの単量体、２量体、３量体で存在してお
り、非還元状態では３０ｋＤａの単量体、２量体で存在
することが解った（図１）。また、これらの電気泳動に
おいて、他の非特異的なバンドはほとんど見られなかっ
たため、本発明の蛋白質がほぼ精製されたことが解っ
た。

【００６３】実施例３．本発明の抗体の調製 上記実施例２．において精製した本発明の蛋白質を用い
て、抗体の調製を行った。抗体の調製には、精製された
本発明の蛋白質を純水に対して透析したものを１ｍｇ用
いることとし、調製はアサヒテクノグラス社に外注し
た。

【００６４】実施例４．本発明の蛋白質の活性測定及び
諸性質の解析 （１）血液凝集活性の測定 上記実施例２．において精製された本発明の蛋白質を、
５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＴＢＳ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７．
５））に溶解して、同溶液で２倍ずつ段階希釈した希釈
系列を調製し、この希釈系列を用いて血球凝集活性を測
定した。各希釈液３０μｌを、等容量の同じ溶液で１０
％に希釈したヒツジ赤血球溶液（日本バイオテストラボ
ラトリーズ社製）と混合して、３７℃で１時間インキュ
ベートした後、凝集を目視で観察した。赤血球凝集活性
（タイター（ＡＵ））は、凝集が検出される最大希釈の
逆数として定義され、本発明の本発明の蛋白質のヒツジ
赤血球凝集活性は、１９７ＡＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
であった。

【００６５】（２）種々の糖による赤血球凝集阻害実験
１ 本発明の蛋白質の糖に対する特異性を解析するため、該
蛋白質の赤血球凝集作用に対する種々の糖の阻害効果を
調べた。まず、単糖に対する結合能の解析を行うことと
し、Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓｅ、Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｄ
−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｅ、Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍ
ｉｎｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇｌｕｃｏｓａｍｉｎ
ｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｄ−Ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎ
ｅ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｏ−
ｄｉｍｅｒ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇａｌａｃｔｏｓａｍ
ｉｎｏ−ｔｒｉｍｅｒ、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−ｇａｌａｃ
ｔｏｓａｍｉｎｏ−ｔｅｔｒａｍｅｒ、Ｍｅｔｈｙｌ−
２−ａｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−α−ｇａｌ
ａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｍｅｔｈｙｌ−２−ａ
ｃｅｔａｍｉｄｏ−２−ｄｅｏｘｙ−β−ｇａｌａｃｔ
ｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ、Ｄ−Ｆｕｃｏｓｅ、Ｌ−Ｆｕ
ｃｏｓｅ、Ｓｉａｌｉｃ ａｃｉｄ、β−Ｌａｃｔｏｓ
ｅ、Ｄ−Ｍａｎｎｏｓｅを用いて実験を行った。

【００６６】まず、上記（１）で活性測定を行った蛋白
質を、５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＴＢＳに４ＡＵになる
ように溶解して３０μｌずつ分注した。次に、５ｍＭ
ＣａＣｌ₂を含むＴＢＳに溶解した１０％ヒツジ赤血球
溶液中に上記の各糖がそれぞれ１００ｍＭから２倍ずつ
段階希釈されるように調製し、先に調製した蛋白質溶液
に各希釈液を等容量ずつ加えて、各糖が本発明の蛋白質
による血球凝集作用を阻害する濃度を調べた。得られた
結果を表１に示した。なお、表中、「＞１００」は、原
液（１００ｍＭ）でも阻害効果が見られなかったことを
意味する。

【００６７】

【表１】 実験の結果、本発明の蛋白質がＧａｌＮＡｃを有する糖
に対して特異的に結合することが確認された。

【００６８】（３）種々の糖による赤血球凝集阻害実験
２ 次に、糖蛋白質に対する結合能の解析をおこなった。解
析には、フェツイン、アシアロフェツイン、ムチン、ア
シアロムチン、Ｔｎ抗原を用いて、上記（２）と同様に
して実験を行った。

【００６９】５ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むＴＢＳに溶解し
た１０％ヒツジ赤血球溶液中に、各糖蛋白質が１０００
μｇ／ｍｌの濃度から２倍ずつ段階希釈されるようにし
て、各希釈液を調製した。その他の方法は、すべて上記
（１）と同様に行った。結果を表２に示した。なお、表
中、「＞１０００」は、原液（１０００μｇ／ｍｌ）で
も阻害効果が見られなかったことを意味する。

【００７０】

【表２】 実験の結果、本発明の蛋白質は、ＧａｌＮＡｃを末端に
有するムチン、アシアロムチン、Ｔｎ抗原への特異性が
非常に高いことが確認された。

【００７１】（４）ＥＬＩＳＡ法よる解析 ＥＬＩＳＡ法により、上記実施例２．において精製した
本発明の蛋白質の解析及び活性測定を行った。該蛋白質
との親和性を調べる糖としては、ＧａｌＮＡｃ、ガラク
トース、シアール酸、マンノース、Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−
Ｎ−Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＧｌｃＮＡｃ）、フコースを用い
た。

【００７２】まず、上記の各糖をそれぞれ緩衝液（ＴＢ
Ｓ−０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）に溶解して、各溶液を
マイクロタイタープレートに入れ、４℃で一夜インキュ
ベートしてコートした。同じ緩衝液で洗浄後、プレート
を１％ＢＳＡを含む同じ緩衝液でブロッキングし、ビオ
チンラベルした上記蛋白質を加えて室温で２時間インキ
ュベートしてから、同じ緩衝液で洗浄した。上記蛋白質
のビオチンラベルは、Ｂｉｏｔｉｎ−Ｏｓｕ（Ｄｏｊｉ
ｎｄｏ ｒｅａｇｅｎｔｓ社製）を用いて、キットの説
明書の記載に従って行った。

【００７３】次に、ストレプトアビジン−ホースラディ
ッシュペルオキシダーゼコンジュゲート（ＧＩＢＣＯ−
ＢＲＬ社製）を加え、室温で１５分インキュベートした
後、ホースラディッシュペルオキシダーゼの基質として
２，２’−アジノビス（３−エチルベンズチアゾリン−
６−スルホン酸）を添加し、マイクロプレートリーダー
５５０（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて４１５ｎｍの波長
で測定を行った。その結果、本発明の蛋白質は、Ｇａｌ
ＮＡｃに強く結合したことが検出されたのに対し、他の
糖には結合が見られず、ＧａｌＮＡｃに対する特異的結
合能が確認された。

【００７４】（５）ＴＬＣ−ｏｖｅｒｌａｙ ａｓｓａ
ｙによる解析 上記（２）〜（４）における解析の結果、いずれにおい
ても本発明の蛋白質がＧａｌＮＡｃに対して非常に高い
特異性を有することが確認されたので、ＴＬＣ−ｏｖｅ
ｒｌａｙ ａｓｓａｙを用いて、アノマー配位の特異性
について解析することとした。すなわち、本発明の蛋白
質が、α−ＧａｌＮＡｃ、又は、β−ＧａｌＮＡｃのど
ちらに特異性が高いかを解析した。

【００７５】まず、種々の糖脂質を２．５ｎｍｏｌずつ
ＴＬＣプレート（ＰＥ ＳＩＬ Ｇ；Ｗｈａｔｍａｎ社
製）にスポットし、溶媒にクロロホルム／メタノール／
０．０２％ ＣａＣｌ₂（５：４：１（ｖ／ｖ））を用
いて展開した。展開後のプレートを３％スキムミルク−
ＴＢＳ溶液で、１時間、室温でブロッキングした後、上
記（４）と同様に調製したビオチン標識化蛋白質５μｇ
を含む０．０２％Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳに浸し、一時間、
室温で反応させた。０．０２％Ｔｗｅｅｎ−ＴＢＳで３
回洗浄した後、ストレプトアビジン標識アルカリフォス
ファターゼ（×１０００希釈；Ｓｉｇｍａ社製）を加え
て、さらに１時間、室温で反応させた。反応後、基質と
してＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ニトロブルーテトラゾリウムク
ロライド／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフ
ォスフェート）を加え、糖脂質に結合した本発明の蛋白
質を検出した。また、糖脂質がＴＬＣにおいて確実に展
開されていることを確認するために、公知の中性糖検出
法としてオルシノール−硫酸法を用いた検出を行った
（図２の（Ａ））。各レーンには、糖脂質として以下の
ものを展開し、本発明の蛋白質との結合を解析した（図
２の（Ｂ））。また、コントロールとして、レーン１に
ヒツジ赤血球膜の抽出液を展開した。

【００７６】レーン１：ヒツジ赤血球膜抽出液 レーン２：Ｇｂ５Ｃｅｒ（フォルスマン抗原；ＧａｌＮ
Ａｃα１，３ＧａｌＮＡｃβ１，３Ｇａｌα１，４Ｇａ
ｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ） レーン３：Ｇｂ４Ｃｅｒ（グロボシド；ＧａｌＮＡｃβ
１，３Ｇａｌα１，４Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’
Ｃｅｒ） レーン４：Ｇｂ３Ｃｅｒ（Ｇａｌα１，４Ｇａｌβ１，
４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ） レーン５：ＧＭ１ａ（Ｇａｌβ１，３ＧａｌＮＡｃβ
１，４［ＮｅｕＡｃα２，３］Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ
１，１’Ｃｅｒ） レーン６：ＧＭ２（ＧａｌＮＡｃβ１，４［ＮｅｕＡｃ
α２，３］Ｇａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ） レーン７：アシアロ−ＧＭ２（ＧａｌＮＡｃβ１，４Ｇ
ａｌβ１，４Ｇｌｃβ１，１’Ｃｅｒ）

【００７７】実験の結果、本発明の蛋白質はレーン２の
α−ＧａｌＮＡｃを末端に有するフォルスマン抗原に強
く結合し、β−ＧａｌＮＡｃやＧａｌを末端に有する糖
脂質には結合しないことが解り、α−ＧａｌＮＡｃに対
する特異性の高さが確認された。また、レーン１に展開
したヒツジ赤血球膜抽出液にも結合が見られたが、バン
ドの位置がレーン２のフォルスマン抗原のバンド位置と
一致し、ヒツジ赤血球膜表面にはフォルスマン抗原が存
在することが示唆された。

【００７８】（６）既知レクチンとの赤血球凝集活性の
比較 上記（２）〜（５）における解析の結果、本発明の蛋白
質がα−ＧａｌＮＡｃに対して非常に高い特異性を有す
ることが解ったので、Ｈａｉｒｙ ｖｅｔｃｈのＶｉｓ
ｉａ ｖｉｌｌｏｓａ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ社製；以
下、これを「ＶＶ」と称することがある）と、本発明の
蛋白質とを用いて、血球凝集活性の比較を行うこととし
た。ＶＶは、ＧａｌＮＡｃに特異的に結合することで知
られるレクチンである（Ｇｒｕｂｈｏｆｆｅｒ，Ｌ．
ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１９５，６２
３−６２６（１９８１））。血球凝集活性の測定は、上
記（１）に記載の方法と同様にして行った。その結果、
本発明の蛋白質のヒツジ赤血球を凝集させる活性が１９
７ＡＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎであったのに対し、ＶＶ
の赤血球凝集活性は１〜２ＡＵ／μｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
であり、本発明の蛋白質が既知のレクチンに比して１０
０倍以上の活性を有することが解った。

【００７９】（７）本発明の蛋白質のｐＨ依存性 本発明の蛋白質の赤血球凝集活性へのｐＨの影響を調べ
たところ、ｐＨ５．５〜１０の範囲では大きな変化がな
いことが解った。特にｐＨ７．５〜９．０ではほぼ一定
であった。

【００８０】（８）本発明の蛋白質への金属塩の影響 本発明の蛋白質の赤血球凝集活性への金属塩の影響を見
るため、緩衝液にＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ＋Ｃａ
Ｃｌ₂、ＥＧＴＡ＋ＣａＣｌ₂をそれぞれ添加した場合の
血球凝集の様子を観察した。まず、ＥＤＴＡ又はＥＧＴ
Ａをそれぞれ２．５ｍＭの濃度で添加して、本発明の蛋
白質と氷冷下で１時間反応させてから、５％ヒツジ赤血
球−ＴＢＳ溶液と混合し、上記（１）と同様に３７℃で
１時間インキュベートして血球凝集の様子を観察した。
ＣａＣｌ₂を加えるものについては、ＥＤＴＡ又はＥＧ
ＴＡと本発明の蛋白質とを反応させた後、５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ₂を含むＴＢＳに対して１６時間透析してから、ヒ
ツジ赤血球溶液と混合し、同様に血球凝集の様子を観察
した。その結果、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡの存在下では赤
血球凝集活性が失われるが、ＥＤＴＡ＋ＣａＣｌ₂、Ｅ
ＧＴＡ＋ＣａＣｌ₂の条件下では赤血球凝集活性が回復
することが解った。すなわち、金属塩のキレート剤であ
るＥＤＴＡ又はＥＧＴＡの存在下で失われる血球凝集活
性が、金属塩（ＣａＣｌ₂）の添加により回復すること
が解った。このことから、本発明の蛋白質の赤血球凝集
活性には金属塩の存在が必要であることが確認された。

【００８１】実施例５．アミノ酸配列分析 （１） 酵素消化 上記実施例２．の（２）において、本発明の蛋白質がほ
ぼ精製されたものであることが確認されたが、アミノ酸
配列分析を行うために、ごく微量の目的タンパク以外の
ものも完全に取り除くこととした。まず、ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥにかけ、ＣＢＢで検出して、目的蛋白質部分を切り
取った。切り取ったゲルをサンプリングチューブ（１．
５ｍｌ）に入れ、これに２５％イソプロパノール１．０
ｍｌを加え、室温で３０分間振とう攪拌した。上清を捨
て、さらに２５％イソプロパノール１．０ｍｌを加え、
室温で３０分間振とう攪拌した。上清を捨て、１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を０．５ｍ
ｌ加え、室温で１５分間振とう攪拌した。これをもう１
度繰り返し、上清を捨てた。これに、蛋白質消化酵素リ
ジルエンドプロテアーゼＡＰ−１（和光純薬社製）を
０．２μｇ加え、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液
（ｐＨ９．０）をゲルが浸る程度に加えた。マイクロ乳
棒を用いてゲルを摩砕した後、一晩３７℃で激しく振と
う攪拌した。

【００８２】（２） ペプチドの溶出 酵素消化した反応液を遠心（１６，０００ｒｐｍ、１０
分間）し、上清を集めた。これを上清１とした。沈殿に
１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ９．０）を
０．１ｍｌ加え、３７℃で２０分間振とう攪拌した後、
遠心（１６，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を集め
た。これを上清２とした。沈殿に、６０％アセトニトリ
ル−０．１％トリフルオロ酢酸を０．１ｍｌ加え、３７
℃で２０分間振とう攪拌した後、遠心（１６，０００ｒ
ｐｍ、１０分間）し、上清を集めた。これを上清３とし
た。さらに沈殿に６０％アセトニトリル−０．１％トリ
フルオロ酢酸−０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０を０．１ｍｌ
加えて、３７℃で２０分間振とう攪拌した後、遠心（１
６，０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を集め、これを
上清４とした。集めた上清１〜４を混合し、再度遠心
（１６，０００ｒｐｍ、１０分間）した後、真空遠心濃
縮器（ＶＥＣ−５０：イワキガラス社製）でアセトニト
リルを除去して約０．１ｍｌまで濃縮した。濃縮後、こ
れに０．１％トリフルオロ酢酸を加え、０．２ｍｌに調
製した。

【００８３】（３） 逆相ＨＰＬＣによる分離 ０．１％トリフルオロ酢酸／Ｈ₂Ｏ（ｖ／ｖ％）で平衡
化したＣ８ ＲＰ−３００カラム（パーキンエルマー社
製；内径１ｍｍ、長さ１００ｍｍ）に上記（２）で調製
した濃縮ペプチド溶液０．２ｍｌを全量供して、逆相Ｈ
ＰＬＣによる分離を行った。溶媒としては０．１％トリ
フルオロ酢酸を含むアセトニトリル／Ｈ ₂Ｏ溶液を用
い、０％から７０％へのアセトニトリルの濃度勾配によ
りペプチドの溶出を行った。流速は０．０５ｍｌ／ｍｉ
ｎ、カラム温度は３５℃で行った。波長２１５ｎｍの吸
光度を測定し、ピーク部分を分取して、得られた各画分
をアミノ酸配列分析の試料とした。

【００８４】（４） アミノ酸配列分析 上記（３）のＨＰＬＣによる分離によって得られた各画
分について、アミノ酸配列分析装置Ｐｒｏｃｉｓｅ ｃ
ＬＣ４９２（アプライドバイオシステムズ社）、及び、
分析用プログラム６１０Ａ（アプライドバイオシステム
ズ社）を用いて、アミノ酸配列分析を行った。その結
果、配列表の配列番号：４〜７に示す部分アミノ酸配列
が得られた。

【００８５】実施例６．データベース検索 上記実施例４．で得られた配列番号：４〜７に記載の部
分アミノ酸配列を、蛋白質データベース（ＳＷＩＳＳ−
ＰＲＯＴ）、ＤＮＡデータベース（ＧｅｎＢａｎｋ）に
対し、検索ソフト（ＢＬＡＳＴ）を用いて解析した結
果、いずれもデータベース中に登録されていないことが
解った。そこで、この部分アミノ酸配列を用いて、本発
明の蛋白質のｃＤＮＡを単離することとした。

【００８６】実施例７．本発明の蛋白質のｃＤＮＡの単
離及びその塩基配列の決定 ライブラリー（ベクターに組み込んだｃＤＮＡライブラ
リー）は作製せず、ＰＣＲによりｃＤＮＡを単離する方
法を用いることとした。まず、ＳｅｐａｓｏｌＲＮＡ
Ｉ（ナカライテスク社製）を用いて５００ｍｇのイトマ
キヒトデの生殖巣からｔｏｔａｌ ＲＮＡを得た。次
に、Ｆａｓｔ Ｔｒａｃｋ ２．０ ｋｉｔ（Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ社製）を用いてｔｏｔａｌ ＲＮＡからｍ
ＲＮＡを精製した。得られたｍＲＮＡのうち２．０μｇ
を鋳型として用い、ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ
ｓｃｒｉｐｔａｓｅ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ社製）とオリゴｄＴプライマーを用いてｆｉｒｓｔ
ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを作製した。これらのキットを
用いた作製は、すべてキットの説明書の記載に従った。

【００８７】次に、上記実施例４．で得られた配列番
号：４〜７に記載の部分アミノ酸配列を元に、センス、
アンチセンスのプライマーをデザインした。Ｎ末端ペプ
チド配列からセンスオリゴヌクレオチドプライマーＡｐ
／Ｃ７２９ＴＣ（配列番号：８）を合成した。内部配列
Ｃ７２７からアンチセンスプライマーＡｐ／Ｃ７２７ｉ
ｎ（配列番号：９）、Ａｐ／Ｃ７２７ｍｅｄ（配列番
号：１０）を合成した。Ｆｉｒｓｔ ｒｏｕｎｄ ＰＣ
Ｒは、Ａｐ／Ｃ７２９ＴＣとＡｐ／Ｃ７２７ｍｅｄをプ
ライマーとし、ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを
鋳型にして行った。キットにはＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓ
ｙｓｔｅｍｓ社製）、酵素にはＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏ
ｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ−Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を
用いて、キットの説明書の記載に従って行った。次に、
それぞれの増幅産物を鋳型にして、Ａｐ／Ｃ７２９ＴＣ
とＡｐ／Ｃ７２７ｉｎをプライマーに用いたｓｅｃｏｎ
ｄ ＰＣＲを行った。得られた増幅産物をｐＧＥＭ Ｔ
−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）に組
み込んで塩基配列を決定し、解析ソフト・ＤＮＡＳＩＳ
（日立ソフトウエア社製）を用いて解析したところ、こ
のＰＣＲ産物はオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）の全長を含んでいないことが解った。そこでさら
に、完全長のｃＤＮＡを得るために、ＳＭＡＲＴ ＲＡ
ＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ
（ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いて５’及び３’−ＲＡ
ＣＥ法を行った。

【００８８】まず、０．７５μｇのｍＲＮＡとＳｕｐｅ
ｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃ
ｒｉｐｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ
社製）を用い、ＳＭＡＲＴ ＩＩ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌ
ｅｏｔｉｄｅ及び５’−ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔ
ｈｅｓｉｓ ｐｒｉｍｅｒを用いて、キットの説明に従
って５’−ＲＡＣＥ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤ
ＮＡを作製した。得られた５’−ＲＡＣＥ ｆｉｒｓｔ
ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型に、Ａｄｖａｎｔａｇ
ｅ２ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）を用
いて、ｇｅｎｅｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ １
（Ｌ８５；配列番号：１１）とｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐ
ｒｉｍｅｒ ｍｉｘを用いたＰＣＲを行い、５’末端の
増幅ＤＮＡ断片を得た。

【００８９】次に、５’末端と同様に、３’−ＲＡＣＥ
ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓｐｒｉｍｅｒを用いて
３’−ＲＡＣＥ ｆｉｒｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ
を調製した。得られた３’−ＲＡＣＥ ｆｉｒｓｔ ｓ
ｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型に、ｇｅｎｅ ｓｐｅｃｉ
ｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ２（Ｕ１００；配列番号：１
２）とｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを用
いたＰＣＲを行って、３’末端の増幅ＤＮＡ断片を得
た。

【００９０】最後に、上記の５’及び３’−ＲＡＣＥ法
によって得られた５’末端及び３’末端の各増幅ＤＮＡ
断片をｐＧＥＭ−Ｔ−ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社製）に組み込んで塩基配列を決定し、これら
の配列と、すでに塩基配列を解析済みの前記ＰＣＲ産物
の塩基配列とをＤＮＡＳＩＳを用いてアライメントし、
全ＤＮＡ配列を決定した。その配列を、配列番号：１に
示した。また、その配列中のＯＲＦ部分のアミノ酸配列
を、配列番号：２に示した。

【００９１】次に、この塩基配列中のＯＲＦの中で、Ｎ
末端分析を行って得られた本発明の蛋白質のＮ末端配列
から、シグナルペプチド部分のアミノ酸配列を除いた成
熟型蛋白質のアミノ酸配列を決定し、その配列を配列番
号：３に示した。Ｎ末端分析は、アミノ酸配列分析装置
Ｐｒｏｃｉｓｅ ｃＬＣ４９２（アプライドバイオシス
テムズ社）を用いて、公知の方法に従って行った。

【００９２】実施例８．本発明の蛋白質のｃＤＮＡのア
イソフォーム 本発明の蛋白質のｃＤＮＡのアイソフォームを解析する
ために、ｃＤＮＡライブラリーを調製してスクリーニン
グを行う方法、及び、ＲＴ−ＰＣＲ法の２通りの解析を
行った。 （１）ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによる解
析 まず、ｃＤＮＡライブラリー及びプローブの調製を行っ
た。上記実施例７．で精製したｍＲＮＡ ５μｇから、
ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡ
ＧＥＮＥ社製）を用いて二本鎖ｃＤＮＡを合成し、Ｅｃ
ｏＲＩ ａｄａｐｔｏｒ及びＵｎｉ ＺＡＰ ＸＲ ｖ
ｅｃｔｏｒを用いてライゲーションした。次に、Ｇｉｇ
ａｐａｃｋ ＩＩＩ Ｇｏｌｄ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉ
ｔ（ＣＬＯＮＥＴＥＣＨ社製）を用いてインビトロパッ
ケイジングを行い、ライブラリーを作製した。二本鎖ｃ
ＤＮＡの合成及びライブラリーの作製は、すべてキット
の説明書の記載に従って行った。得られたライブラリー
は、一回増幅を行ってから次のスクリーニングに用いる
こととした。ＤＮＡプローブとしては、プライマーＡｐ
／Ｃ７２９ＴＣ（配列番号：８）及びＴ−１１（配列番
号：１３）を用いたＰＣＲを行い、得られた増幅産物を
ＤＩＧラベルしたものを用いた。ＤＮＡプローブの調製
は、ＰＣＲ ＤＩＧ Ｐｒｏｂｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）を用いて、キットの説明書
の記載に従って行った。

【００９３】形成された本発明の蛋白質のｃＤＮＡのプ
ラーク（３．７×１０⁵）を、メンブレンであるＢＩＯ
ＤＹＮＥ Ａ（Ｐａｌｌ社製）に写し取り、８０℃で３
０分間熱処理を行って固定した。このメンブレンを、５
×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝１５ｍＭクエン酸ナトリウム、
１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．０））、０．１％Ｓｏ
ｄｉｕｍ Ｎ−ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎａｔ
ｅ、０．０２％ ＳＤＳ、及び、１％ ＤＩＧ ｂｌｏ
ｃｋｉｎｇ ｒｅａｇｅｎｔを含む溶液中で２時間、６
５℃でプレハイブリダイゼーションを行った。これに、
ＤＩＧラベルされたＤＮＡプローブを６５℃で１６時間
作用させてハイブリダイゼーションを行った。

【００９４】０．１％ ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中
で、６５℃、３０分間洗浄した後、ＤＩＧ ＤＮＡ ｄ
ｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ社製）中のＮＢ
Ｔ／ＢＣＩＰ試薬を用いて発色による検出を行った。検
出方法は、キットの説明書の記載に従った。ここで陽性
を示したプラークをいくつか選択し、寒天培地をくりぬ
いて抽出して、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３（ＳＴＲ
ＡＴＡＧＥＮＥ社製）を用いてそれぞれプラスミド化し
た。得られたプラスミド中のＤＮＡの塩基配列は、前記
したような公知の塩基配列決定方法を用いて決定した。

【００９５】（２）ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた解析 次に、公知の方法に従って、ＲＴ−ＰＣＲ法を用いた解
析を行った。プライマーとしては、ＯＲＦの外側の配列
を用いて設計したＵ４２（配列番号：１４）及びＬ５９
３（配列番号：１５）を用いた。ＰＣＲは、各プライマ
ー０．５μＭ、ｍＲＮＡから合成したｃＤＮＡ（鋳型Ｄ
ＮＡ） ３ｎｇ、０．２ｍＭのｄＮＴＰｓ（各０．５μ
ＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰ）、
２ｍＭ ＭｇＣｌ２、及び、２．５ｍＵのＡｍｐｌｉＴ
ａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製）を含む混合液５０μｌを用いて行った。得られ
たＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル電気泳動を行って
ゲル中から抽出し、ＴＡクローニングによりｐＧＥＭ−
Ｔ−Ｅａｓｙ ｖｅｃｔｏｒに組み込んで、各クローン
の塩基配列を決定した。

【００９６】上記２通りの方法により解析を行い、得ら
れた各クローンの塩基配列について分類した結果、本発
明の蛋白質は、配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸
配列を有するｐｒｏｔｏｔｙｐｅに対して、配列番号：
３に記載のアミノ酸配列中のアミノ酸番号４９、６６、
１３５のアミノ酸について計４つのアイソフォームが存
在することが解った。プロトタイプ及び各アイソフォー
ムの配列と、それぞれのアイソフォームに分類されたク
ローンについて、表３に示した。

【００９７】

【表３】

【００９８】実施例９．組換えＤＮＡ、ＤＮＡ導入体、
及び、組換え蛋白質の調製 （１）組換えＤＮＡ及びＤＮＡ導入体の作製 上記実施例７．で配列を決定したＤＮＡを制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩ及びＮｃｏＩで処理し、アガロース電気泳動を行
ってゲルから切り出すことにより精製し、オープンリー
ディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を含むＤＮＡ断片
（配列番号：１の塩基番号８５〜６０９）を得た。得ら
れたＤＮＡ断片を、同じくＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで処
理したベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）に組み込
んだ後、精製してｐＴＡｐＬと命名した。このプラスミ
ドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転
換した。

【００９９】（２）組換え蛋白質の発現 ｐＴＡｐＬにより形質転換した大腸菌ＪＭ１０９を、１
００μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地中で、６０
０ｎｍの吸光度が０．５になるまで３７℃で培養した。
これに、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−ｇａｌａｃ
ｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を最終濃度０．
１ｍＭになるように加え、さらに１６時間、３７℃で培
養して発現誘導した。ここで、培養中、０、１５、３
０、４５、６０、１２０分において、それぞれ培養液の
一部を活性測定用のサンプルとして採取しておいた。ま
た、０、２、４、６、８、１６時間において、ウエスタ
ンブロット用のサンプルを採取しておいた。培養後、各
培養液から遠心によって細胞を集め、５ｍＭ ＣａＣｌ
₂を含むＴＢＳに懸濁し、超音波により破砕した。超音
波処理後、得られた溶液を遠心（２０，０００×ｇ、１
分）し、得られた上清（可溶性画分）を組換え蛋白質溶
液とした。また、何も組み込んでいないベクターｐＴＶ
１１８Ｎを用いて、同様の培養及び発現誘導を行い、１
２０分後に培養液の一部を採取して、上記と同様に蛋白
質溶液を調製し、活性測定用のネガティブ・コントロー
ルのサンプルとした。さらに、０、８、１６時間におい
ても同様に採取を行い、ウエスタンブロット用のネガテ
ィブ・コントロールのサンプルとした。

【０１００】（３）組換え蛋白質の活性測定 ＩＰＴＧ添加後の培養時間にともなって発現される組換
え蛋白質が、ＧａｌＮＡｃに結合する性質を有している
かどうかを確認するため、上記実施例３．の（４）と同
様に、アシアロムチンを用いてＥＬＩＳＡ法によって活
性測定を行った。上記（２）で調製した各組換え蛋白質
溶液をサンプルとし、対照としては、各溶液に２０ｍＭ
ＥＤＴＡを添加して血球凝集活性を失わせたものを用
いた。また、上記（２）でネガティブ・コントロール
（Ｍｏｃｋ）として調製したサンプルについても、同様
に測定を行った。マイクロタイタープレートのコーティ
ングには、１μｇ／１００μｌ（０．０２％ｔｗｅｅｎ
を含むＴＢＳ中に溶解）のアシアロムチン溶液を用い
た。測定の結果、得られた組換え蛋白質は、イトマキヒ
トデから精製された蛋白質と同様に、ＧａｌＮＡｃに対
して非常に高い結合性を有していることが確認できた
（図３）。

【０１０１】（４）組換え蛋白質のウエスタンブロット
による確認 上記実施例３．で調製した抗体を用いて、上記（２）で
調製した各組換え蛋白質溶液のウエスタンブロットによ
る検出を行った。ウエスタンブロットは、上記（２）で
調製した各組換え蛋白質溶液から５μｇ ｐｒｏｔｅｉ
ｎ相当量を分取してサンプルとして用い、公知の方法に
従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、泳動後のゲルをブ
ロッティング装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）によりニトロ
セルロースメンブレンに転写（１５Ｖ、１時間）した。
転写後のメンブレンを０．０２％ｔｗｅｅｎを含む１％
スキムミルク溶液でブロッキングし、上記実施例３．で
調製した本発明の抗体を反応させ、二次抗体として抗ラ
ビットＩｇＧ−ＨＲＰ（アマシャムファルマシア社
製）、検出試薬としてペルオキシダーゼ染色キット（ナ
カライテスク社製）を用いて、キットの説明書の記載に
従って蛋白質の検出を行った。ネガティブ・コントロー
ルのサンプルについても、同様に分取して用いた。

【０１０２】その結果、１９ｋＤａにバンドが検出さ
れ、本発明の抗体を用いて組換え蛋白質の検出を行うこ
とができることが確認された（図４）。また、ネガティ
ブ・コントロール（Ｍｏｃｋ）と比較して、本発明の組
換え蛋白質が発現誘導されていることが確認できた。

【０１０３】

【発明の効果】本発明の蛋白質は、ＧａｌＮＡｃ、中で
も特にα−ＧａｌＮＡｃに対して非常に高い特異性を有
しているため、Ｔｎ抗原等のα−ＧａｌＮＡｃを有する
糖鎖抗原を発現する癌細胞の検出等を特異的に行うこと
ができる。これまでに単離、同定された多くのレクチン
の中にも同様の性質を有するものが存在するが、本発明
の蛋白質はそれらに比して１００倍以上の活性を有して
おり、検出試薬等として好適である。

【０１０４】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Mitsubishi Chemical Corporation <120> Novel Protein <130> J07596 <140> <141> <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.0

【０１０５】 <210> 1 <211> 1096 <212> DNA <213> Asterina pectinifera <220> <221> CDS <222> (85)..(591) <220> <221> mat#peptide <222> (139)..(588) <400> 1 tgccatctca tctgtaagct tcactctgca catgcatttt ggcttgtgac actcaacgga 60 gaaggaagac aacttgtaaa cagc atg gct ttc ttt cgg gcc ttg tgc ttc 111 Met Ala Phe Phe Arg Ala Leu Cys Phe -15 -10 gtc ctg ttg gtg ggt ttt gcc gcg gca tgt caa cca gac tgc tcg tgg 159 Val Leu Leu Val Gly Phe Ala Ala Ala Cys Gln Pro Asp Cys Ser Trp -5 -1 1 5 aag tgc cca cct aag tgt cca ccg atg tgg act ttc tac aat ggc aac 207 Lys Cys Pro Pro Lys Cys Pro Pro Met Trp Thr Phe Tyr Asn Gly Asn 10 15 20 tgc tac cgt tac ttc ggc act ggc aag acc tat gat gaa gct gag agc 255 Cys Tyr Arg Tyr Phe Gly Thr Gly Lys Thr Tyr Asp Glu Ala Glu Ser 25 30 35 cac tgc cag gag ttc act gaa gtc ggc ctg ggt cac ctt gcg tcc ata 303 His Cys Gln Glu Phe Thr Glu Val Gly Leu Gly His Leu Ala Ser Ile 40 45 50 55 gcc agc gcc gag gag aat aat ctg ctc ctg acg atg tgg aag tcg gtc 351 Ala Ser Ala Glu Glu Asn Asn Leu Leu Leu Thr Met Trp Lys Ser Val 60 65 70 cgt aca act aca aca ggc ggc ctg tgg atc ggc ttg aat gac cag gca 399 Arg Thr Thr Thr Thr Gly Gly Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp Gln Ala 75 80 85 gag gaa ggg aac ttc atc tgg aca gat gga tca gcg gtt acc ttc acc 447 Glu Glu Gly Asn Phe Ile Trp Thr Asp Gly Ser Ala Val Thr Phe Thr 90 95 100 gac tgg gct aca acc cag ccc gac aac tat caa aac gag gac tgt gct 495 Asp Trp Ala Thr Thr Gln Pro Asp Asn Tyr Gln Asn Glu Asp Cys Ala 105 110 115 cac atg cgg cat gag cta gat ggc gat gac aga tgg aat gac atc gca 543 His Met Arg His Glu Leu Asp Gly Asp Asp Arg Trp Asn Asp Ile Ala 120 125 130 135 tgc agc aga gcg ttc gcc tac gtg tgc aag atg tca act aca aat taa 591 Cys Ser Arg Ala Phe Ala Tyr Val Cys Lys Met Ser Thr Thr Asn 140 145 150 atcggctccg caatggacga ccacggatgc gtcagaacat atttgccaca tcaaacttga 651 agccctcaca atcgatggca tcggctatga tctcaccaaa ctgtctcacc aaactaacac 711 tcacaaacag aatcactgaa aggttgaatt tcgttgtaga gactgctctg ctgtcaggct 771 atacacggtg gaaaagaaat cattttaaga cgtaacccac tttgcatctt tgtggcttca 831 acgtttacag acctgcatgc tttcaagttt aacaagtagt atttagcctt tgctcgtttg 891 cccaggtgtc caggtttaat attgagaagt atggacaaag aacatacgta acggtgaact 951 aatcagctgt tgtactttaa aaaggcatgg taaatcaaat attcattttg tgcatttggt 1011 ttcgtttaaa gcaataaagg tgttgaaaat gttaagatgg agcttaacaa ctaaaaaaaa 1071 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1096

【０１０６】 <210> 2 <211> 168 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 2 Met Ala Phe Phe Arg Ala Leu Cys Phe Val Leu Leu Val Gly Phe Ala 1 5 10 15 Ala Ala Cys Gln Pro Asp Cys Ser Trp Lys Cys Pro Pro Lys Cys Pro 20 25 30 Pro Met Trp Thr Phe Tyr Asn Gly Asn Cys Tyr Arg Tyr Phe Gly Thr 35 40 45 Gly Lys Thr Tyr Asp Glu Ala Glu Ser His Cys Gln Glu Phe Thr Glu 50 55 60 Val Gly Leu Gly His Leu Ala Ser Ile Ala Ser Ala Glu Glu Asn Asn 65 70 75 80 Leu Leu Leu Thr Met Trp Lys Ser Val Arg Thr Thr Thr Thr Gly Gly 85 90 95 Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp Gln Ala Glu Glu Gly Asn Phe Ile Trp 100 105 110 Thr Asp Gly Ser Ala Val Thr Phe Thr Asp Trp Ala Thr Thr Gln Pro 115 120 125 Asp Asn Tyr Gln Asn Glu Asp Cys Ala His Met Arg His Glu Leu Asp 130 135 140 Gly Asp Asp Arg Trp Asn Asp Ile Ala Cys Ser Arg Ala Phe Ala Tyr 145 150 155 160 Val Cys Lys Met Ser Thr Thr Asn 165

【０１０７】 <210> 3 <211> 150 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 3 Cys Gln Pro Asp Cys Ser Trp Lys Cys Pro Pro Lys Cys Pro Pro Met 1 5 10 15 Trp Thr Phe Tyr Asn Gly Asn Cys Tyr Arg Tyr Phe Gly Thr Gly Lys 20 25 30 Thr Tyr Asp Glu Ala Glu Ser His Cys Gln Glu Phe Thr Glu Val Gly 35 40 45 Leu Gly His Leu Ala Ser Ile Ala Ser Ala Glu Glu Asn Asn Leu Leu 50 55 60 Leu Thr Met Trp Lys Ser Val Arg Thr Thr Thr Thr Gly Gly Leu Trp 65 70 75 80 Ile Gly Leu Asn Asp Gln Ala Glu Glu Gly Asn Phe Ile Trp Thr Asp 85 90 95 Gly Ser Ala Val Thr Phe Thr Asp Trp Ala Thr Thr Gln Pro Asp Asn 100 105 110 Tyr Gln Asn Glu Asp Cys Ala His Met Arg His Glu Leu Asp Gly Asp 115 120 125 Asp Arg Trp Asn Asp Ile Ala Cys Ser Arg Ala Phe Ala Tyr Val Cys 130 135 140 Lys Met Ser Thr Thr Asn 145 150

【０１０８】 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 4 Cys Gln Pro Asp Cys Ser Trp Lys 1 5

【０１０９】 <210> 5 <211> 24 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 5 Thr Tyr Asp Glu Ala Glu Ser His Cys Gln Glu Phe Thr Glu Val Gly 1 5 10 15 Leu Gly His Leu Ala Ser Ile Ala 20

【０１１０】 <210> 6 <211> 20 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 6 Ser Val Arg Thr Thr Thr Thr Gly Gly Leu Trp Ile Gly Leu Asn Asp 1 5 10 15 Gln Ala Glu Glu 20

【０１１１】 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Asterina pectinifera <400> 7 Ala Phe Ala Tyr Val Cys Lys 1 5

【０１１２】 <210> 8 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 8 tggcarccng aytgytc 17

【０１１３】 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 9 tcngcytcrt crtangt 17

【０１１４】 <210> 10 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 10 gtraaytcyt grcartg 17

【０１１５】 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 11 gccagtgccg aagtaacggt agca 24

【０１１６】 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 12 cggcactggc aagacctatg atgaa 25

【０１１７】 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 13 ttrcacatrt angcraangc 20

【０１１８】 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 14 ggcttgtgac actcaacgga 20

【０１１９】 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:synthetic <400> 15 tcgtccattg cggagccgat 20

【図面の簡単な説明】

【図１】 本発明の蛋白質をサンプルとしてポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を行い、クマシーブ
リリアントブルー（ＣＢＢ）で検出したゲルの写真であ
る。左はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）を行ったゲルの写真
であり、右はネイティブ−ＰＡＧＥ（非還元）を行った
ゲルの写真である。

【図２】 本発明の蛋白質と種々の糖脂質との結合能を
解析するために行った、ＴＬＣ−ｏｖｅｒｌａｙ ａｓ
ｓａｙのＴＬＣプレートの写真である。（Ａ）はオルシ
ノール−硫酸法で検出したものであり、（Ｂ）は本発明
の蛋白質との結合を発色反応により検出したものであ
る。

【図３】 ＩＰＴＧによって発現誘導された本発明の組
換え蛋白質の活性を、アシアロムチンとの結合を用いて
ＥＬＩＳＡ法により測定した結果を示すグラフである。
縦軸は４１５ｎｍの吸光度、横軸はＩＰＴＧによる誘導
時間である。グラフ中の丸は各誘導時間における大腸菌
の可溶性画分の活性、四角は前記各画分にＥＤＴＡを添
加して調製した対照の活性を示す。１２０分における白
丸は、ネガティブ・コントロール（Ｍｏｃｋ）の活性を
示す。

【図４】 ＩＰＴＧによって発現誘導された本発明の組
換え蛋白質を、本発明の抗体を用いてウエスタンブロッ
トにより検出した写真である。Ｍｏｃｋは、ネガティブ
・コントロールのサンプルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/574 5/00 Ａ Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA43 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA12 4B063 QA18 QA19 QQ02 QR48 QR54 QS24 QS28 QX01 4B064 AG28 CA02 CA19 CC24 DA14 4B065 AA26X AA90Y AB01 AC14 CA24 CA46 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 CA50 DA76 DA80 EA51 FA74 GA30

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の（Ａ）又は（Ｂ）の性質を有する蛋
   白質。 （Ａ）配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸配列を有
   する。 （Ｂ）配列表の配列番号：３に記載のアミノ酸配列にお
   いて、１若しくは数個のアミノ酸に置換、欠失、挿入、
   付加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、α
   −ＧａｌＮＡｃに対する特異的結合能及び／又は血球凝
   集活性を有する。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の蛋白質をコードする塩
   基配列を含むＤＮＡ。
3. 【請求項３】 ＤＮＡが、配列表の配列番号：１に示す
   塩基配列を有するものである請求項２に記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項２又は３に記載のＤＮＡ、及びこ
   れと連結するプロモーター配列を含むことを特徴とする
   組換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組換えＤＮＡを宿主に
   導入することにより取得されるＤＮＡ導入体。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のＤＮＡ導入体を培養し
   て培養物中に蛋白質を生成せしめ、培養物から請求項１
   に記載の蛋白質を採取することを特徴とする組換え蛋白
   質の製造法。
7. 【請求項７】 請求項４に記載の組換えＤＮＡを無細胞
   蛋白質合成系を用いて転写／翻訳し、合成系中に蛋白質
   を生成せしめ、該合成系から請求項１に記載の蛋白質を
   採取することを特徴とする組換え蛋白質の製造法。
8. 【請求項８】 請求項６又は７に記載の方法により製造
   された組換え蛋白質。
9. 【請求項９】 次の性質を有する蛋白質。 （ａ）α−ＧａｌＮＡｃに対する特異的結合能を有す
   る。 （ｂ）還元状態では２０ｋＤａの単量体、２量体及び３
   量体で存在し、非還元状態では３０ｋＤａの単量体及び
   ２量体で存在する。 （ｃ）ｐＨ５．５〜１０の範囲で血球凝集活性に大きな
   変化がない。 （ｄ）血球凝集活性の発現には、金属塩の存在が必要で
   ある。 （ｅ）配列表の配列番号：４〜７の何れかに記載のアミ
   ノ酸配列を有する。
10. 【請求項１０】 請求項１、８又は９に記載の蛋白質、
    又は該蛋白質の部分ポリペプチドを抗原とする抗体。
11. 【請求項１１】 請求項１、８又は９に記載の蛋白質
    と、被検物質とを接触させ、該蛋白質と被検物質との反
    応性を解析することを特徴とする、末端にα−ＧａｌＮ
    Ａｃを有する糖鎖抗原を表面に発現する癌細胞の検出方
    法。
12. 【請求項１２】 糖鎖抗原がＴｎ抗原である請求項１１
    に記載の方法。
13. 【請求項１３】 請求項１、８又は９に記載の蛋白質を
    含有してなる、請求項１１又は１２に記載の検出方法を
    行うための試薬。
14. 【請求項１４】 請求項２又は３に記載のＤＮＡを導入
    した非ヒト哺乳動物、又はその子孫。