WO2014098112A1 - ノダフジ由来改変レクチン - Google Patents

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WO2014098112A1
WO2014098112A1 PCT/JP2013/083854 JP2013083854W WO2014098112A1 WO 2014098112 A1 WO2014098112 A1 WO 2014098112A1 JP 2013083854 W JP2013083854 W JP 2013083854W WO 2014098112 A1 WO2014098112 A1 WO 2014098112A1
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WO
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amino acid
acid sequence
sugar chain
wfa
terminal
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PCT/JP2013/083854
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English (en)
French (fr)
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佐藤　隆
千葉　靖典
浩章 舘野
裕之 梶
後藤　雅式
成松　久
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独立行政法人産業技術総合研究所
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Publication date
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Priority to US15/706,144 priority patent/US10358466B2/en

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
    • G01N2333/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present invention has developed a method for producing genetic engineering of nodafuji lectin (Wisteriabunfloribunda aggulutinin, WFA).
  • the present invention also relates to a method for producing a novel modified lectin having a different sugar chain recognition activity by modifying some amino acids.
  • Stage Specific Embryonic Antigen 1 (SSEA1), a developmental differentiation marker, is an antibody against the sugar chain structure of Lewis X: Gal ⁇ 1,4GlcNAc (Fuc ⁇ 1,3)-and is used in clinical medicine as a colorectal cancer marker.
  • SSEA1 Stage Specific Embryonic Antigen 1
  • the CA19-9 epitope is a sugar chain antigen called sialyl Lewis A: SA ⁇ 2,3Gal ⁇ 1,3GlcNAc (Fuc ⁇ 1,4)-.
  • the sugar chain on the cell surface reflects the cell type and differentiation stage sensitively and is likely to be a very effective candidate for a biomarker.
  • a lectin that is a sugar chain-binding protein derived from a plant or a fungus has been used together with an anti-sugar chain antibody for a long time. Staining tissue sections with lectins can differentiate cells with different personalities or cells with different differentiation, but the lectin's sugar chain recognition specificity is not strict, so any sugar chain structure It is not possible to specify whether or not is changing.
  • WFA Wisteria floribunda agglutinin
  • GalNAc N-acetylgalactosamine residues.
  • the specificity is not clear. Nevertheless, the unique sugar chain recognition specificity of WFA is used as a marker in various biological fields. For example, in the cranial nerve field, WFA is known as a classic marker that stains the perineuronal network (PNN) (Non-Patent Document 1), and normal crypt epithelial cells are stained in the stomach (non-patent document 1). Patent Document 2).
  • Patent Document 1 It is also used in a differentiation method for distinguishing between prostate cancer and benign prostatic hyperplasia. Recently, the effectiveness as a biomarker used for diagnosis has been highlighted, and WFA-positive MUC1 has been reported to be a bile diagnostic marker for intrahepatic cholangiocarcinoma (Patent Document 2, Non-Patent Document) 3). Isolation of lectins from Nodafuji seeds has been reported by several groups in the 1970s (Table 1).
  • WFM Wisteria floribunda Mitogen
  • WFH Wisteria floribunda hemaggulutinin
  • the lectin purified by Kurokawa is a 68 KDa glycoprotein in which two 32 KDa subunits are SS-linked, and has hemagglutination activity inhibited by GalNAc (Non-patent Document 6).
  • Each of these two groups was purified by lectin using a classical biochemical separation method of proteins, whereas Poretz et al.'S group bound SS to 28 KDa monomers with hemagglutination activity due to their affinity for polyleucyl hog gastric mucin.
  • Homo dimer lectin Non-patent document 7
  • lectin having Mitogen activity 66 KDa dimer by 32 KDa monomer
  • the object of the present invention is to elucidate the details of the sugar chain recognition of lectin WFA derived from Nodafuji seed, which is of high biological importance, and to achieve its stable supply and uniformity among purified lots. Therefore, it is intended to provide a recombinant lectin by a genetic engineering technique, and further to provide a modified WFA in which the sugar chain to be recognized is changed by modifying the recombinant lectin. is there.
  • the inventors of the present invention succeeded in cloning a gene encoding Nodafuji lectin from cDNA derived from Nodafuji seed and expressing recombinant lectin in Escherichia coli.
  • rWFA sugar chain binding activity of recombinant WFA
  • nWFA natural dimer WFA
  • rWFA introduced with mutations in cysteine residues contributing to dimer formation specifically recognizes LDN (GalNAc ⁇ 1,4GlcNAc) sugar chains.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences shown in (1) or (2) below and having a Gal / GalNAc terminal sugar chain binding activity or a GalNAc terminal sugar chain binding activity; (1) The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added at positions other than position 272 in the amino acid sequence (provided that positions 273 or 274 Except when all amino acid sequences after the position are deleted), (2) An amino acid sequence in which any amino acid sequence from the N-terminal side to the 30th position of the amino acid sequence shown in (1) is deleted.
  • a nucleic acid encoding a polypeptide having a Gal / GalNAc-terminal sugar chain-binding activity comprising the base sequence encoding any one of the amino acid sequences shown in (1) or (2) above .
  • a base sequence that hybridizes with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or its complementary sequence under stringent conditions, and the position at position 272 on the amino acid sequence is a codon encoding Cys Sequence (except when all nucleotide sequences corresponding to the amino acid sequence after position 273 or position 274 are deleted) (2) In the base sequence shown in (1), the base sequence corresponding to any amino acid sequence from the N-terminal side to the 30th amino acid sequence is deleted.
  • a polypeptide comprising the amino acid sequence of any one of (1) to (6) below and specifically recognizing a GalNAc terminal sugar chain; (1) an amino acid sequence in which the amino acid at position 272 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid other than Cys; (2) In the amino acid sequence shown in (1), an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added at positions other than position 272, (3) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence from which any of the 13th to 15th amino acids from the C-terminal side has been deleted, (4) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in (3), (5) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid sequence that is Cys alkylated at position 272, or in that amino acid sequence, one or several amino acids are deleted or substituted at positions other than position 272; Inserted or added amino acid sequence, (6) An amino acid sequence obtained by
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences shown in the following (1) to (5) and particularly having an ability to recognize an LDN-specific sugar chain among GalNAc terminal sugar chains; (1) an amino acid sequence in which the amino acid at position 272 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid other than Cys; (2) In the amino acid sequence shown in (1), an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added at positions other than position 272, (3) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence from which any of the 13th to 15th amino acids from the C-terminal side has been deleted, (4) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in (3), (5) An amino acid sequence in which any one of the amino acid sequences from the N-terminal side to the 30th amino acid sequence is deleted from any one of the amino acid sequences shown in (1) to (4).
  • a nucleic acid encoding a polypeptide that specifically recognizes an LDN sugar chain comprising a base sequence encoding the amino acid sequence of any one of (1) to (5) according to [5].
  • a reagent for specifically detecting an LDN sugar chain comprising the polypeptide according to [5].
  • a polypeptide containing the amino acid sequence shown in (1) or (2) below, which forms a dimer and has Gal / GalNAc terminal sugar chain binding activity, is reduced, and then Cys in the amino acid sequence Wherein the sugar chain binding activity is changed to a GalNAc-terminal sugar chain-specific binding activity, characterized by comprising: (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added at positions other than position 272 in the amino acid sequence; (2) An amino acid sequence obtained by deleting any one of the amino acid sequences from the N-terminal side to the 30th amino acid sequence shown in (1).
  • the sugar chain binding activity is changed to an LDN sugar chain-specific binding activity, characterized by substitution or deletion of any amino acid from the 13th to the 15th amino acid from the C-terminal side of the amino acid sequence Method; (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added at positions other than position 272 in the amino acid sequence; (2) An amino acid sequence obtained by deleting any one of the amino acid sequences from the N-terminal side to the 30th amino acid sequence shown in (1).
  • the WFA monomer obtained by reduction of natural WFA provided by the present invention is a WFA lectin that specifically recognizes only GalNAc residues without recognizing Gal residues, and cysteine of the same recombinant WFA (rWFA).
  • the modified WFA monomer is a WFA lectin that specifically recognizes only the LDN (GalNAc ⁇ 1,4GlcNAc) sugar chain among the sugar chains having a terminal GalNAc residue.
  • the nucleotide sequence and deduced amino acid sequence N-terminal 30 amino acids of the nodafuji lectin (WFA) gene are expected to be signal sequences. It is expected that an N-linked sugar chain is added to the 146th asparagine (N). The C-terminal 13 amino acids may be cleaved.
  • Amino acid sequence alignment of legume lectins Recombinant WFA (rWFA) expression in E. coli (A) Construction of plasmid for expression of E. coli rWFA and C272A variants Replace N-terminal signal sequence with Hisx6 + FLAG sequence, downstream of pelB leader (secretory signal to periplasm) The gene was inserted into. It was introduced into E.
  • nWFA had a single band (lane 4) of about 60 KDa
  • rWFA had about half of the dimer and monomer (lane 5).
  • the mutant (C272A) showed a single band in the size of the monomer under both reducing and non-reducing conditions, and it was confirmed that no dimer was formed. This revealed that Cys at position 272 is essential for dimer formation.
  • nWFA is a glycoprotein containing a sugar chain that reacts with AAL.
  • Glycan array example Examples of sugar chains on Glycanlyarray Purified C272A modified rWFA (N-sugar chain) produced by transformed animal cells (A) Confirmation of monomer expression by SDS-PAGE (increase in molecular weight due to the effect of sugar chain) (B) Sugar chain by GP array Binding specificity analysis Purified C272A, N146Q modified rWFA (N-free sugar chain) produced by transformed animal cells and transformed yeast (A) Confirmation of monomer expression by SDS-PAGE (B) Glycan binding specificity by GP array analysis
  • Nodafuji seed-derived lectin and recombinant lectin cloned in the present invention In the present invention, we have succeeded in gene cloning of nodafuji seed-derived lectin, which has long been used as a tissue marker, and preparation of recombinant lectin.
  • the cloned gene encoded a new protein consisting of 286 amino acids ( Figure 1, SEQ ID NOs: 1 and 2), but matured except for the N-terminal signal sequence and the C-terminal processed region
  • the expected molecular weight of the type lectin region (aa31-273) was 26.6 KDa.
  • Non-patent Document 12 In view of the fact that other legume lectins such as peanut lectin (Peanut glutinin, PNA) have been reported to process the C-terminus (Non-patent Document 12), in natural WFA, the C-terminal 13 amino acids are processed. It is thought that there is. That is, the present invention provides a novel recombinant WFA (rWFA) that should be referred to as a “precursor WFA” before processing of the C-terminal amino acid in natural WFA. In the present invention, when referring to “rWFA”, compared to natural WFA, 13 amino acids are added to the C-terminal side, and the N-terminal 20 amino acids as the signal sequence are added or not added. WFA ".
  • the WFA lectin cloned this time is similar to the lectin previously reported by Kurokawa (Non-patent Document 6) and Cheung (Non-patent Document 7) in molecular weight and amino acid composition, but purified by Nodafuji reported by Toyoshima et al.
  • the molecular weight and amino acid composition do not completely match with lectin WFH (Non-patent Document 5). These differences may be due to differences in analytical methods, and it is possible that more lectins and mitogens are present in Nodafuji seeds.
  • rWFA expressed in E. coli is a natural WFA (nWFA), a precursor that has no sugar chain and at least 13 amino acids on the C-terminal side. However, it was revealed that it has the same sugar chain recognition activity as natural WFA. Natural WFA is expected to have one N-glycan, and the only N-glycan (N-type sugar chain) binding position is asparagine (N) at position 146 as seen from the amino acid sequence. However, since rWFA without a sugar chain had activity, this sugar chain is considered unnecessary for activity.
  • Non-patent Document 13 soybean agglutinin (SBA) belonging to the leguminous lectin family, it has been reported that addition of N-glycan does not contribute to activity or multimer formation (Non-patent Document 13), and the same tendency was confirmed in WFA .
  • nWFA forms a dimer with disulfide bonds
  • the determination of the amino acid sequence strongly suggested that the only cysteine at position 272 may contribute to the formation of disulfide bonds.
  • WFA was expressed in the periplasm of Escherichia coli, about half of rWFA purified from the medium could form a dimer, but C272A, a variant of cysteine to alanine, could not form a dimer. This possibility seems correct.
  • cysteine is present at a position close to WFA (FIG. 2), suggesting that this cysteine may contribute to dimer formation as well.
  • nWFA-RCA a monomer of nWFA, specifically recognized a GalNAc-terminal sugar chain, but did not recognize any other Gal-terminal sugar chain. It was reported by Kurokawa et al. That the binding activity to GalNAc did not change between the monomer and the dimer (Non-patent Document 6). However, in this result, not only GalNAc but also all sugar chains containing GalNAc at the terminal. In contrast, it was revealed that the recognition activity did not change. Cysteine residues are located almost at the C-terminus of mature WFA, so they are not expected to be involved in the formation of lectin sugar-binding pockets. Activity has occurred.
  • nWFA recognizes GalNAc and Gal in the same pocket, or whether a new sugar chain recognition site is generated because Gal is recognized by forming a dimer. If the structure is solved by analysis, the molecular mechanism of sugar chain bonding may be clarified. Moreover, rWFA C272A had surprisingly very limited sugar chain binding activity, that is, LDN-specific recognition ability. As shown in FIG. 3C, when rWFA was purified from the medium, approximately half formed a dimer via a cysteine residue, and showed Gal / GalNAc binding activity like nWFA. Modification of the cysteine residue of rWFA C272A does not affect the sugar chain binding pocket, but may affect the structure and stability other than the pocket by not forming a dimer in the protein synthesis process. There is also.
  • the novel recombinant WFA (rWFA) provided in the present invention comprises any one of the amino acid sequences shown in the following (1) or (2), and GalNAc together with the Gal terminal sugar chain. It can be expressed as a polypeptide having a binding activity to a terminal sugar chain (hereinafter referred to as Gal / GalNAc terminal sugar chain binding activity) or a GalNAc terminal sugar chain binding activity.
  • rWFA that formed a dimer has Gal / GalNAc-terminal sugar chain binding activity
  • monomeric rWFA has LDN-specific binding activity among GalNAc-terminal sugar chains.
  • the stringent condition means a stringent condition in which 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of identical sequences can hybridize in a general hybridization method.
  • a secretion signal is not particularly required. However, for purification of the expression product, it is easier and more efficient to secrete it into the medium and purify the medium. It is preferable to add a secretion signal.
  • a transformation host for producing the recombinant WFA of the present invention eukaryotic cells such as mammalian cells, insect cells, plant cells or yeasts can be used, but naturally occurring fucose-containing sugar chains Is not involved in the ability of WFA lectin to recognize sugar chains, and therefore prokaryotic hosts such as E. coli are preferred.
  • a normal purification method can be applied to the obtained recombinant WFA.
  • rWFA Recombinant WFA obtained in the present invention forms approximately the same amount of monomer together with a dimer similar to natural WFA.
  • the dimerized rWFA shows a wide range of sugar chain recognition ability almost equivalent to that of natural WFA, but rWFA in the monomer state is capable of recognizing LDN-specific sugar chains similar to the recombinant WFA variant described below.
  • Have The rWFA monomer can be separated from the dimer by a technique such as gel filtration.
  • Recombinant WFA variant having the ability to recognize LDN-specific sugar chains in the present invention (3-1) Recombinant WFA variant (C272rWFA) by introducing a mutation into rWFA at position 272 Cys
  • “LDN-specific sugar chain recognition ability” does not recognize a Gal-terminal sugar chain, and also recognizes only a GalNAc-terminal sugar chain having a GalNAc ⁇ 1,4GlcNAc sugar chain.
  • LDN sugar chain markers known to be expressed in normal gastric epithelial cells can be detected.
  • the recombinant WFA variant (C272 modified rWFA) by introducing a mutation into Cys at position 272 has Cys at position 272 substituted with another amino acid.
  • a dimer cannot be formed, and the result is a WFA lectin that has acquired LDN-specific sugar chain recognition ability, which can be expressed as follows.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences shown in (1) to (3) below and having LDN-specific sugar chain recognition ability; (1) an amino acid sequence in which the amino acid at position 272 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an amino acid other than Cys; (2) In the amino acid sequence shown in (1), an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added at positions other than position 272, (3) In the amino acid sequence shown in (1) or (2), any amino acid sequence from the N-terminal side to the 30th amino acid sequence is deleted.
  • the term “several” refers to 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5.
  • the amino acid at position 272 may be any amino acid other than Cys, but is preferably an amino acid having no reactive group such as Ala or Gly. Is preferred.
  • the recombinant WFA variant gene (C272rWFA gene) can be said to be a base sequence encoding the amino acid sequence shown in the above (1) to (3).
  • the base sequence is the following (4) to (4) It can also be expressed as any base sequence of (6).
  • the codon corresponding to the 272nd amino acid is a base sequence other than Cys
  • the codon corresponding to the 272nd amino acid is an amino acid other than Cys
  • (6) A base sequence in which the base sequence corresponding to any amino acid from the 5 ′ side to the N-terminal amino acid to the 30th amino acid in the base sequence shown in (4) or (5) is deleted.
  • the stringent condition means a stringent condition in which 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more of identical sequences can hybridize in a general hybridization method.
  • a recombinant WFA variant of C272, N146Q modified rWFA in which the asparagine at position 146 at the N-type sugar chain binding position is mutated to glutamine (N146Q) in the recombinant WFA variant (C272 modified rWFA) is also produced.
  • This variant is the same as the recombinant WFA variant (C272 modified rWFA) expressed in Escherichia coli as well as having no sugar chain even when using yeast or mammalian cells other than bacteria such as E. coli as the host. It was confirmed to have “LDN-specific sugar chain recognition ability”.
  • a recombinant WFA variant that forms a monomer exhibiting LDN sugar chain specificity similar to C272 rWFA if it is a recombinant WFA variant from which amino acids 13 to 15 from the C-terminal side have been deleted. It can be said.
  • such a C-terminal amino acid sequence-deleted recombinant WFA is sometimes referred to as a C-terminal deleted recombinant WFA variant or “rWFA delta”.
  • “RWFA delta” can be expressed as follows.
  • a polypeptide comprising any one of the amino acid sequences shown in (1) or (2) below and having LDN-specific sugar chain recognition ability; (1) In the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, an amino acid sequence from which any of the 13th to 15th amino acids from the C-terminal side has been deleted, (2) An amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, inserted or added in the amino acid sequence shown in (1).
  • the “rWFA delta” gene can be said to be a base sequence encoding the amino acid sequence shown in (1) or (2) above, but the base sequence is any of the following (3) to (6) It can also be expressed as a base sequence.
  • reduced WFA monomer dimeric recombinant WFA or natural WFA is simply treated by alkylating a post-reduction cysteine residue. Refers to the quantified WFA.
  • known methods can be applied sequentially or simultaneously.
  • a technique of reacting with an alkylating agent such as iodoacetamide after reduction using dithiothreitol (DTT) can be applied.
  • Any reduced WFA monomer loses the ability to recognize a sugar chain with respect to a Gal terminal sugar chain, and specifically recognizes only the GalNAc terminal sugar chain.
  • the method for producing a WFA monomer lectin that specifically recognizes the GalNAc terminal sugar chain of the present invention can be expressed as follows.
  • a dimer of a polypeptide having a Gal / GalNAc terminal sugar chain-binding activity that encodes the amino acid sequence shown in (1) or (2) below is incubated under reducing conditions, and at the same time, alkylation of a sulfur-containing functional group
  • Such a “WFA monomer lectin” that specifically recognizes a GalNAc terminal sugar chain is also provided for the first time in
  • LDN sugar chain marker detection method and kit therefor Various recombinant WFAs provided in the present invention are all useful as lectins for detection of Gal / GalNAc or GalNAc sugar chain markers, and are performed using conventional natural WFA. It can also be used for LDN sugar chain marker detection methods.
  • RWFA the precursor of natural WFA, retains the same sugar chain recognition ability as natural WFA, and can be mass-produced as a WFA gene expression product from transformed Escherichia coli, so the conventional Gal / GalNAc terminal sugar chain It can be used as an alternative to natural WFA for detection.
  • Monomeric rWFA obtained by separating the rWFA by gel filtration or the like specifically recognizes LDN sugar chains.
  • the WFA monomer lectin specifically recognizing the GalNAc terminal sugar chain of the present invention and also the C272 variant WFA capable of specifically recognizing only the LDN sugar chain among the GalNAc terminal sugar chains, Similar to the terminal monomer rWFA, higher specificity can be exhibited when used in the LDN sugar chain marker detection method for detecting a normal gastric mucosa site, which has been performed using conventional natural WFA. Specifically, it can be considered to be used as a probe for detecting endocrine tumors, small cell lung cancer, and the like, which are expected to express LDN sugar chains at high levels.
  • nWFA nodafuji lectin
  • Nodafuji lectin gene (1-1) Cloning of Nodafuji lectin gene (1-1) Preparation of cDNA library Nodafuji seed total RNA was extracted using the method of Naito et al. (Non-patent Document 9). About 150 mg of seeds are crushed in liquid nitrogen, and the seed crushed material is mixed with extraction buffer (1M Tris-HCl pH 9.0 / 1% SDS) and PCI (phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1)) And suspended until it became milky.
  • extraction buffer 1M Tris-HCl pH 9.0 / 1% SDS
  • PCI phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1)
  • the cDNA library used for gene cloning was prepared from Nodafuji seed mRNA prepared as described above using the Marathon R cRNA Amplification Kit (Clontech, Mountain View, CA, USA).
  • Adapter Primer-1 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Adapter Primer-2 5'-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • Rev-2 5'-ACTATAGACTGGTTCGCCGTCC-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • Rev-3 5'-GGGTGAGTTGTAAATGCCCTGA-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Example 2 Recombinant lectin (rWFA) transformation in Escherichia coli
  • rWFA Recombinant lectin
  • Transformation of E. coli with lectin gene In order to express the nodafuji lectin cloned in Example 1 in Escherichia coli, it is a lectin active region.
  • the expected amino acid residues 31-286 were incorporated by adding His Tag and FLAG Tag at the N-terminus downstream of the pelB leader of pET20b (Merck4 Biosciences, Darmstadt, Germany), a periplasmic expression vector.
  • WFA-HisFL-Fwd 5'-ccatggGACATCATCATCATCATCACCTCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGGCAAGCTTGCGGCCGCGAATTCAAAAGAAACAACTTCCTTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 9)
  • WFA-Rev-1 5′-ctcgagTTAGATGGAACCGCGCAGAA-3 ′ (SEQ ID NO: 10)
  • the prepared expression plasmid was E.
  • recombinant WFA was purified as a protein of approximately 31 KDa that was stained by CBB staining after development on SDS-PAGE under reducing conditions (FIG. 3C). , Lane 2).
  • Example 3 Verification of sequence identity between recombinant WFA (rWFA) and natural WFA (nWFA) (3-1) Amino acid analysis of natural WFA lectin (nWFA) Natural nodafuji lectin (purchased from Vector Lab) The amino acid analysis was performed using an amino acid sequencer Procise492HT (Applied Biosystems, CA) and a mass spectrometer LTQ Orbitrap Velos ETD (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Approximately 2 ⁇ g of lectin protein was treated in a sample buffer containing 2-mercaptoethanol at 100 ° C. for 5 minutes and developed by SDS-PAGE.
  • a band of approximately 28 KDa was recovered, and after reductive alkylation, digested with Trypsin and decomposed into peptide fragments. After concentration, LC / MS analysis was performed using LTQ Orbitrap Velos ETD, and the amino acid sequence of the constituent peptides was identified.
  • the lectin sequence (excluding the signal sequence portion) was matched (FIG. 8).
  • the 13 amino acids at the C-terminal of the WFA-ORF amino sequence determined in Example 1 are not included in the peptide obtained from the naturally-derived lectin, and may be processed during the maturation process of the protein. It was.
  • nWFA Natural WFA
  • AAL Aleuria Aurantia Lectin
  • Example 5 Production of mutant lectin C272A (5-1) Expression of mutant lectin C272A in E. coli
  • nWFA is a single 28 KDa in the non-reduced state and 60 KDa in the reduced state. NWFA is considered to form a dimer because it was a band.In rwFA, it was a single band of 31 KDa in the reduced state. Bands were detected in both molecular weights of the mer ( Figure 3C).
  • C272A in which the cysteine at position 272 in the rWFA amino acid sequence was substituted with alanine (C272A) was prepared in E. coli. Expressed. Mutant lectin C272A was prepared by PCR using the following C272A-Fwd and C272A-Rev primers.
  • C272A-Fwd 5'-AGCAGTGATGATGCCAACAACTTGCAT-3 '(SEQ ID NO: 11)
  • C272A-Rev 5'-ATGCAAGTTGTTGGCATCATCACTGCT-3 '(SEQ ID NO: 12)
  • FLAG-Tag WFA was prepared by inserting fragments amplified using the following N-FLAG and C-FLAG PCR primers into the EcoRI-XhoI site of pET20b, respectively.
  • N-FLAG WFA-FLAG-Fwd: 5'-gaattcAGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAAGAAACAACTTCCTTTGT-3 '(SEQ ID NO: 13)
  • WFA-Rev-2 5'-ggcctcgagTTAGTTGCAATCATCACTGCTAGGATCT-3 '(SEQ ID NO: 14)
  • C-FLAG WFA-Fwd-1: 5'-ggaattcaAAAGAAACAACTTCCTTTGT-3 '(SEQ ID NO: 15)
  • WFA-FLAG-Rev 5'-ctcgagTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTTGGCATCATCACTGCTAGGATCT-3 ' (SEQ ID NO: 16)
  • Example 6 Analysis of sugar chain-binding activity of recombinant lectin (rWFA) (6-1) Measurement of sugar chain-binding activity
  • the sugar chain-binding activity of recombinant lectin was analyzed using a complex carbohydrate microarray developed by AIST.
  • Non-Patent Document 10 Recombinant lectins were subjected to microarray by labeling lysine residues with Cy3 (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Cy3 signal was measured using Glycostation Reader 1200 (GP Bioscience, Yokohama, Japan).
  • nWFA-RCA lost or greatly reduced binding to Lac, Lec, LN, Asialo-FET, Asialo-AGP, Asialo-TF, Asialo-TG, Tn, Asialo-GP, BSM, and ⁇ Gal. , BGalNAc, di-GalNAc ⁇ , LDN, GA2, Forssman, Asialo-BSM, etc., binding to the sugar chain whose non-reducing end is GalNAc was hardly changed (FIG. 7B).
  • nWFA can bind more specifically to the GalNAc-terminal sugar chain in the monomer. That is, it was shown that natural WFA can bind to the Gal-terminal sugar chain in addition to the GalNAc-terminal sugar chain by dimerization.
  • Example 7 Production of C272A modified lectin in cultured human cells
  • human cultured cells HEK293T strain
  • a nucleic acid encoding WFA having the C272A mutation was introduced.
  • a gene encoding C272A modified rWFA was incorporated into a pFLAG-CMV3 expression vector (Sigma) and introduced into HEK293T cells.
  • purified lectin was detected as a single band around 35 KDa from the culture supernatant cultured for 48 hours in DMEM medium containing 10% bovine serum using an anti-FLAG antibody column (Sigma).
  • FIG. 12A Although an increase in molecular weight due to the sugar chain was observed (FIG. 12A). As a result of labeling with Cy3 and applying to a glycoprotein array, the same binding specificity (LDN and asialo-BSM) as the modified lectin prepared in E. coli was confirmed (FIG. 12B).
  • Example 8 Production of C272A, N146Q modified lectin in cultured human cells
  • 146th asparagine which is the only sugar chain binding site, was substituted with glutamine for C272A modified rWFA (N146Q)
  • C272A and N146Q modified rWFA were prepared.
  • the gene encoding the C272A, N146Q modified rWFA was incorporated into the pFLAG-CMV3 expression vector (Sigma) used in Example 7 and introduced into a human cultured cell (HEK293T strain).
  • the transformed cells were cultured in the same manner as in Example 7 to induce expression, and after collecting the culture supernatant, the same purification method was applied to obtain purified C272A, N146Q modified lectin.
  • the modified lectin purified from the culture supernatant could be detected as a single band of about 33 KDa (FIG. 13A left).
  • the same binding specificity (LDN and asialo-BSM) as the modified lectin prepared in E. coli was confirmed (upper part of FIG. 13B). Since the C272A modified rWFA expressed in Escherichia coli where glycosylation does not occur had LDN binding activity, it was well predicted that glycosylation would not affect the ability to recognize sugar chains, This result clarified that point.
  • Example 9 Production of C272A, N146Q modified lectin in yeast Yeast (methanol assimilating yeast Ogataea minuta TK10-1-2 strain) was subjected to the gene encoding C272A, N146Q modified rWFA described in Example 8. It was incorporated into a pOMEA1-10H3F expression vector having His and FLAG tags, and O. minutaTK10-1-2 strain was transformed. The transformed yeast was cultured in 200 ml of YPD medium (2% Peptone, 1% Yeast Extract, 2% glucose) at 30 ° C. for 2 days.
  • YPD medium 2% Peptone, 1% Yeast Extract, 2% glucose
  • BMMY medium 2% Peptone, 1% Yeast Extract, 1.34% Yeast Nitrogen Base w / o amino acids, 1% MeOH, 100 mM potassium phosphate buffer ( Endo-Om expression was induced by resuspending with pH 6.0)) and culturing at 30 ° C. for another 2 days. After recovering the culture supernatant, it was dialyzed against TBS buffer (1.24 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane, 6.27 g of tris (hydroxymethyl) aminomethane hydrochloride, 8.77 g / L of sodium chloride).
  • the crude lectin solution after dialysis was applied to a HisTrap HP column (GE Healthcare), washed with TBS buffer containing 50 mM imidazole, and then eluted with gradient TBS buffer containing 500 mM imidazole to elute the protein.
  • the fraction containing Endo-Om eluted from the column was subjected to ultrafiltration concentration with Amicon Ultra (10,000 MWCO, Millipore), and further replaced with TBS buffer to obtain purified C272A, N146Q modified lectin.
  • the modified lectin purified from the yeast culture supernatant could be detected as a single band around 34 Kda (FIG. 12A right).
  • the same binding specificity LDN and asialo-BSM
  • Sequence number 1 wisteria floribunda lectin
  • Sequence number 2 wisteria floribunda lectin
  • Sequence number 3 Fwd-1
  • Sequence number 4 Rev-1 Sequence number 5: Adapter Primer-1
  • Sequence number 6 Adapter Primer-2
  • Sequence number 7 Rev-2 Sequence number 8: Rev-3
  • Sequence number 9 WFA-HisFL-Fwd SEQ ID NO: 10: WFA-Rev-1 Sequence number 11: C272A-Fwd SEQ ID NO: 12: C272A-Rev Sequence number 13: WFA-FLAG-Fwd (N-FLAG)
  • Sequence number 14 WFA-Rev-2 (N-FLAG)
  • Sequence number 16 WFA-FLAG-Rev (C-FLAG)

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Abstract

【課題】　本発明は、生物学的に重要な糖鎖マーカーを認識するノダフジレクチン(WFA)の高品質かつ均一性の高い安定供給、及びその糖鎖認識活性を詳細に解明し、さらにその糖鎖認識活性の特異性を増大させることを目的とする。 【解決手段】　本発明は、ノダフジレクチン(WFA)をコードする遺伝子をクローニングし、形質転換細菌から、天然WFAと同様な糖鎖認識活性を有するリコンビナントWFAを生産する手法を開発した。　また、天然WFAを還元することで、末端GalNAc残基を特異的に認識する還元WFA単量体を製造し、リコンビナントWFAにシステイン変異を導入するか、又はC末端側アミノ酸欠失によって、末端GalNAc残基を有する糖鎖のうちでも、診断用マーカーとして重要なLDN (GalNAcβ1,4GlcNAc)糖鎖を認識するリコンビナント単量体WFAを製造した。

Description

ノダフジ由来改変レクチン
　本発明は、ノダフジレクチン(Wisteria floribunda aggulutinin，WFA)を、遺伝子工学的に生産する手法を開発した。また、一部のアミノ酸を改変することで、糖鎖認識活性の異なる新規な改変レクチンの作製法に関する。
　発生や分化の過程において、糖鎖構造は細胞の状態を反映して変化することが知られており、現在広く使われている分化マーカーやがんマーカーの多くは糖鎖を認識しているものが多い。たとえば、発生期の分化マーカーであるStage Specific Embryonic Antigen 1(SSEA1)はルイスX：Galβ1,4GlcNAc(Fucα1,3)-という糖鎖構造に対する抗体であるし、大腸がんマーカーとして臨床医療で用いられているCA19-9のエピトープはシアリルルイスA：SAα2,3Galβ1,3GlcNAc(Fucα1,4)-という糖鎖抗原である。このように細胞表面の糖鎖は、細胞の種類、分化段階を鋭敏に反映しており、バイオマーカーの非常に有効な候補となりやすい。
　疾患特異的な糖鎖変化を検出する方法として、抗糖鎖抗体とともに古くから使われてきたのが植物や真菌由来の糖鎖結合タンパク質であるレクチンである。レクチンを用いて、組織切片を染色すると、性格の異なった細胞あるいは分化の異なった細胞などを染め分けることが可能であるが、レクチンの糖鎖認識特異性は厳密ではないため、どんな糖鎖構造が変化しているかを特定することはできない。植物レクチンの１つであるノダフジレクチン(Wisteria floribunda agglutinin，WFA)はマメ科レクチンに属するレクチンで、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基を含む糖鎖を認識することが知られているが、詳細な特異性は明らかになっていない。それにも関わらず、WFAのユニークな糖鎖認識特異性は様々な生物学的分野でマーカーとして用いられている。例えば、脳神経分野においては、WFAはペリニューロナルネットワーク(PNN)を染色する古典的なマーカーとして知られているし(非特許文献１)、胃においては正常な腺窩上皮細胞を染色する(非特許文献２)。前立腺癌と前立腺肥大症とを鑑別するための鑑別法にも用いられている(特許文献１)。また、最近は診断に用いるバイオマーカーとしての有効性がクローズアップされており、WFA陽性のMUC1は肝内胆管がんの胆汁診断マーカーとなることが報告されている(特許文献２，非特許文献３)。
　ノダフジ種子からのレクチンの単離は1970年代に複数のグループから報告されている(表１)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　Toyoshimaらは分子量の異なる２種類の糖タンパク質レクチン(WFMとWFH)の単離と生化学的な解析を報告している。単量体の分子量がおよそ32KDaで、67KDaの2量体を形成するWisteria floribunda Mitogen(WFM)は赤血球凝集活性とphytogen活性を有する(非特許文献４)が、35KDa単量体の4量体である136KDaのWisteria floribunda hemaggulutinin(WFH)は、Mitogen活性は有さないが、WFMより強い赤血球凝集活性と白血球凝集活性を持っている(非特許文献５)。一方、Kurokawaが精製したレクチンは、２つの32KDaサブユニットがS-S結合した68KDaの糖タンパク質であり、GalNAcによって阻害される赤血球凝集活性を有する(非特許文献６)。これらの２つのグループはそれぞれタンパク質の古典的な生化学的分離手法によりレクチン精製したが、Poretzらのグループはpolyleucyl hog gastric mucinへのアフィニティにより、赤血球凝集活性を持つ28KDa単量体どうしのS-S結合によるホモ2量体レクチン(非特許文献７)とMitogen活性を持つレクチン(32KDaの単量体による66KDaの2量体)を単離している(非特許文献８)。これらのこれまでに報告されたノダフジ種子由来レクチンは、GalNAc認識などの性質は似ている部分があるが、アミノ酸組成、糖組成や分子量等に微妙な違いがあり、同一の分子か異なる分子かは判断が難しいのが現状である。
　WFAの生物学的重要性は近年増してきているが、WFAの糖鎖認識の詳細は未だ未解明なままであり、上記のニューロンと胃におけるWFAが認識する糖鎖構造が同じかどうかさえわかっていない。また、その生産についても、Vector Laboratory社やEY Laboratory社より試薬として販売されているWFAは天然のノダフジ種子から精製しており、安定的な供給や精製ロット間の均一性を管理するためには遺伝子工学的手法によるリコンビナントレクチン生産へのシフトが求められている。
国際公開ＷＯ２０１０／０９０２６４ 国際公開ＷＯ２０１０／１００８６２
Hartig，W.，Brauer，K.，and Bruckner，G. (1992) Neuroreport 3(10)，869-872 Ikehara，Y.，Sato，T.，Niwa，T.，Nakamura，S.，Gotoh，M.，Ikehara，S. K.，Kiyohara，K.，Aoki，C.，Iwai，T.，Nakanishi，H.，Hirabayashi，J.，Tatematsu，M.，and Narimatsu，H. (2006) Glycobiology 16(9)，777-785 Matsuda，A.，Kuno，A.，Kawamoto，T.，Matsuzaki，H.，Irimura，T.，Ikehara，Y.，Zen，Y.，Nakanuma，Y.，Yamamoto，M.，Ohkohchi，N.，Shoda，J.，Hirabayashi，J.，and Narimatsu，H. (2010) Hepatology 52(1)，174-182 Toyoshima，S.，Akiyama，Y.，Nakano，K.，Tonomura，A.，and Osawa，T. (1971) Biochemistry 10(24)，4457-4463 Toyoshima，S.，and Osawa，T. (1975) J Biol Chem 250(5)，1655-1660 Kurokawa，T.，Tsuda，M.，and Sugino，Y. (1976) J Biol Chem 251(18)，5686-5693 Cheung，G.，Haratz，A.，Katar，M.，Skrokov，R.，and Poretz，R. D. (1979) Biochemistry 18(9)，1646-1650 Kaladas，P. M.，and Poretz，R. D. (1979) Biochemistry 18(22)，4806-4812 Naito，S.，Hirai，M. Y.，Chino，M.，and Komeda，Y. (1994) Plant Physiol 104(2)，497-503 Tateno，H.，Mori，A.，Uchiyama，N.，Yabe，R.，Iwaki，J.，Shikanai，T.，Angata，T.，Narimatsu，H.，and Hirabayashi，J. (2008) Glycobiology 18(10)，789-798 Emanuelsson，O.，Brunak，S.，von Heijne，G.，and Nielsen，H. (2007) Nat Protoc 2(4)，953-971 Young，N. M.，Johnston，R. A.，and Watson，D. C. (1991) Eur J Biochem 196(3)，631-637 Adar，R.，Streicher，H.，Rozenblatt，S.，and Sharon，N. (1997) Eur J Biochem 249(3)，684-689
　本発明は、生物学的重要性が高いノダフジ種子由来レクチンWFAの糖鎖認識の詳細の解明と共に、その安定的な供給、精製ロット間の均一性を達成することを目的とする。そのために、遺伝子工学的手法によるリコンビナントレクチンを提供するものであり、さらに、当該リコンビナントレクチンを改変することにより、認識対象の糖鎖が変更されたＷＦＡ改変体を提供することを目的とするものである。
　本発明者らは、ノダフジレクチンをコードする遺伝子をノダフジ種子由来のcDNAよりクローニングし、大腸菌にてリコンビナントレクチンを発現させることに成功した。リコンビナントWFA(rWFA)の糖鎖結合活性を解析した結果、市販のものと同様のレクチン活性を有することが確認できた。また、2量体である天然型WFA(nWFA)を還元剤処理により単量体にすると、糖鎖認識特異性が変化し、GalNAc末端糖鎖を認識するレクチンになることを見出した。さらには、2量体形成に寄与するシステイン残基に変異を導入したrWFAはLDN(GalNAcβ1,4GlcNAc)糖鎖を特異的に認識することを見出した。
　以上の知見を得たことで、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の発明を含むものである。
〔１〕　下記(１)又は(２)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性又はGalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチド；
　（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列がすべて欠失している場合を除く)、
　（２）(１)に示されるアミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
〔２〕　前記〔１〕に記載の(１)又は(２)に示されたいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
〔３〕　下記(１)又は(２)に示されるいずれかの塩基配列を含み、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
　（１）配列番号１に記載の塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつアミノ酸配列上の272位の位置がCysをコードするコドンである塩基配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列に対応する塩基配列がすべて欠失している場合を除く)
　（２）(１)に示される塩基配列において、アミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
〔４〕　下記(１)～(６)のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGalNAc末端糖鎖を特異的に認識するポリペプチド；
　（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
　（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
　（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13～15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
　（４）(３)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
　（５）配列番号２に示されたアミノ酸配列の272位がアルキル化されたCysであるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
　（６）(１)～(５)に示されたいずれかのアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
〔５〕　下記(１)～(５)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGalNAc末端糖鎖のうちでも特にLDN特異的糖鎖認識能を有するポリペプチド；
　（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
　（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
　（３）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13～15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
　（４）(３)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
　（５）(１)～(４)に示されたいずれかのアミノ酸配列において、そのN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
〔６〕　前記〔５〕に記載の(１)～(５)のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、LDN糖鎖を特異的に認識するポリペプチドをコードする核酸。
〔７〕　下記(１)～(４)に示されるいずれかの塩基配列を含み、LDN糖鎖を特異的に認識するポリペプチドをコードする核酸；
　（１）配列番号１に記載の塩基配列において、272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
　（２）(１)に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
　（３）配列番号１に記載の塩基配列において、3’末端側からC末端側13～15番目までのいずれかのアミノ酸に対応する塩基配列が欠失している塩基配列、
　（４）(１)～(３)に示されたいずれかの塩基配列において、5’側からN末端アミノ酸～30番目アミノ酸までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
〔８〕　前記〔２〕,〔３〕,〔６〕又は〔７〕に記載の核酸を含む発現ベクター。
〔９〕　前記〔２〕,〔３〕,〔６〕又は〔７〕に記載の核酸を用いて形質転換された、形質転換細胞。
〔１０〕　前記〔９〕に記載の形質転換細胞を培養して得られる培養物から採取することを特徴とする、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性、GalNAc末端糖鎖結合活性又はLDN糖鎖特異的結合活性を有するポリペプチドの製造方法。
〔１１〕　前記〔１〕又は〔４〕に記載のポリペプチドを含むことを特徴とするGal/GalNAc末端糖鎖，又はGalNAc末端糖鎖を特異的に検出するための試薬。
〔１２〕　前記〔５〕に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、LDN糖鎖を特異的に検出するための試薬。
〔１３〕　2量体を形成し、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有する下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを還元処理し、次いで前記アミノ酸配列中のCysをアルキル化することを特徴とする、前記糖鎖結合活性をGalNAc末端糖鎖特異的な結合活性に変更する方法；
　（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
　（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
〔１４〕　2量体を形成し、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有する下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの272位の位置のCysを他のアミノ酸に置換するか、又は前記アミノ酸配列のC末端側から13～15番目までのいずれかのアミノ酸を欠失させることを特徴とする、前記糖鎖結合活性をLDN糖鎖特異的な結合活性に変更する方法；
　（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
　（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
　本発明により、リコンビナントWFA(rWFA)が提供できたことで、天然WFAと同様の、末端GalNAc残基及びGal残基に対する糖鎖結合活性を有する、品質の安定したWFAレクチンを、形質転換細胞により大量生産可能になった。
　また、本発明により提供された天然WFAの還元によるWFA単量体は、Gal残基を認識せず、GalNAc残基のみを特異的に認識するWFAレクチンであり、同リコンビナントWFA(rWFA)のシステイン改変によるWFA単量体は、末端GalNAc残基を有する糖鎖のうちでも、LDN(GalNAcβ1,4GlcNAc)糖鎖のみを特異的に認識するWFAレクチンである。このように、本発明においては、極めて有用性の高い糖鎖認識性を改変したWFAレクチンを提供することができた。
ノダフジレクチン(WFA)遺伝子の塩基配列及び推定アミノ酸配列N末端30アミノ酸はシグナル配列であることが予想される。146番目のアスパラギン(N)にはN-結合型糖鎖が付加することが予想される。C末端13アミノ酸は切断される可能性が考えられる。 マメ科植物レクチンのアミノ酸配列アラインメント 大腸菌でのリコンビナントWFA(rWFA)の発現（Ａ）rWFA及びC272A改変体の大腸菌発現用プラスミドの構築 　N-末端のシグナル配列をHisx6 + FLAG配列に置き換え、pelB leader(ペリプラズムへの分泌シグナル)の下流に遺伝子を挿入した。大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPLに導入し、形質転換体を得た。（Ｂ）抗FLAG抗体によるリコンビナントタンパク質の発現の確認　その結果、リコンビナントタンパク質はペリプラズム画分以外に、培地にもリークして存在することがわかった。（Ｃ）抗FLAG抗体カラムを用いたリコンビナントタンパク質の培養上清からの精製　還元条件のSDS-PAGEでは、rWFAは31KDaに単一バンド(lane2)。市販のWFA(nWFA)は28KDaの単一バンドが観察された(lane1)。　非還元条件ではnWFAは約60KDaの単一のバンド(lane4)が、rWFAは2量体と単量体がおよそ半分ずつ存在することが確認された(lane5)。　一方、変異体(C272A)は還元、非還元条件ともに単量体の大きさに単一バンドが確認され、2量体を形成しないことが確認された。このことから、272位のCysが2量体の形成に必須であることが明らかとなった。 糖タンパク質アレイを用いた天然型WFAとリコンビナントWFAの糖鎖結合活性の比較（Ａ）糖タンパク質アレイ上のCy3ラベルnWFA及びrWFA（Ｂ）nWFA及びrWFAの糖鎖認識特異性の検証　その結果、nWFAとrWFAは非常に類似の糖鎖認識特異性を示した。両方ともに最も強いシグナルを示したのはAsialo-BSM(bovine submaxillary mucin)であり、GalNAc末端(A-di，βGalNAc，di-GalNAcβ，LDN，GA2，Tn，Forssman)の糖鎖と共に、Gal末端(asialo-AGPやasialo-TF)などにも結合性を示した。 C末端13アミノ酸を削除したリコンビナントWFAの発現（Ａ）C末端13アミノ酸を削除したリコンビナントWFA発現用プラスミドの構築　C末端13アミノ酸を削除したものと共に、N末端あるいはC末端にFLAG tagを付加したrWFA発現用プラスミドを構築した。（Ｂ）クマシーブリリアントブルー(CBB)染色によるタンパク質の検出結果　13アミノ酸を除いたものは2量体をほとんど形成できなかった。2量体はCBB染色では検出できなかった。 GPアレイによる糖鎖結合特異性解析GPアレイの結果、新たに大腸菌で作製した単量体rWFAはどれもLDN糖鎖を特異的に認識するレクチンであった。 単量体nWFAの糖鎖結合活性解析（Ａ）還元によるnWFA単量体の作製　2量体形成に寄与するS-S結合を還元し、アルキル化することにより単量体nWFAを作成した。非還元条件でのSDS-PAGEにより単量体であることを確認した。（Ｂ）糖鎖結合活性解析単量体化したnWFAはGalに対する特異性が消失し、GalNAc末端糖鎖を特異的に認識することが確認された。 天然WFAのアミノ酸解析 天然WFAとrWFAに対する各種レクチンによる染色　フコースを認識するAleuria Aurantia Lectin(AAL)レクチンを用いたレクチンブロットの結果、nWFAはAALに反応する糖鎖を含む糖タンパク質であることが確認できた。 Glycan arrayの例 Glycan array上の糖鎖の種類例 形質転換動物細胞により産生された精製C272A改変rWFA(含N-糖鎖)（Ａ）SDS-PAGEにより単量体発現の確認(糖鎖の影響により分子量の増加)（Ｂ）GPアレイによる糖鎖結合特異性解析 形質転換動物細胞及び形質転換酵母により産生された精製C272A、N146Q改変rWFA(不含N-糖鎖)（Ａ）SDS-PAGEにより単量体発現の確認（Ｂ）GPアレイによる糖鎖結合特異性解析
１．本発明のノダフジレクチン(WFA)及びそのリコンビナント改変体
１－１．本発明においてクローニングしたノダフジ種子由来レクチン及びリコンビナントレクチン
　本発明において、我々は古くから組織マーカーとして用いられてきたノダフジ種子由来レクチンの遺伝子クローニングとリコンビナントレクチンの作製に成功した。
　クローニングした遺伝子は286アミノ酸からなる新規タンパク質をコードしていた(図１，配列番号１，２)が、N-末端のシグナル配列やC-末端のプロセシングされる可能性がある領域を除いた成熟型レクチン領域(aa31-273)の予想分子量は26.6KDaであった。種子中では１本のN-glycanが付加されている可能性が考えられるため、その予想分子量およそ1.3KDaを加えると、27.9KDaとなり、市販のWFAレクチンの分子量とよく一致する。また、市販のWFAのLC/MS法によるショットガン・ペプチド配列分析の結果からも、今回クローニングしたレクチンはほぼ市販のWFAと同一であったが、天然物から精製した市販のWFAと比較してみると、C末端に13アミノ酸が付加されたポリペプチドであった。ピーナッツレクチン(Peanut Agglutinin，PNA)などの他のマメ科レクチンでもC末端がプロセスされる例が報告されていること(非特許文献１２)からみて、天然WFAでは、C末端13アミノ酸がプロセッシングされていると考えられる。
　すなわち、本発明においては、天然WFAにおけるC末端側アミノ酸のプロセッシング前の「前駆体WFA」ともいうべき新規なリコンビナントWFA(rWFA)を提供するものである。本発明において、「rWFA」というとき、天然WFAと比較して、C末端側に13アミノ酸が付加されており、さらにシグナル配列であるN末端20アミノ酸が付加された、もしくは付加されていない「リコンビナントWFA」を指す。
　今回クローニングしたWFAレクチンは、これまでにKurokawa(非特許文献６)やCheung(非特許文献７)らが報告したレクチンと分子量、アミノ酸組成ともに似ているが、Toyoshimaらにより精製が報告されたノダフジレクチンWFH(非特許文献５)とは分子量とアミノ酸組成が完全には一致しない。これらの違いは、分析法の違いによるものかも知れないし、ノダフジ種子にはさらに多くのレクチンやmitogenが存在している可能性も考えられる。
１－２．リコンビナントレクチン及びその改変体の2量体能
　今回、大腸菌で発現させたrWFAは天然型WFA(nWFA)とは、糖鎖を有さず、少なくともC末端側に13アミノ酸を有している前駆体であるが、天然WFAとは同じ糖鎖認識活性を持つことが明らかになった。天然型WFAは１本のN-glycanを持っていることが予想されており、アミノ酸配列からみて、唯一のN-glycan(N型糖鎖)結合位置は146位のアスパラギン(N)である。しかし、糖鎖を持たないrWFAが活性を有したことから、この糖鎖は活性には必要ないと考えられる。マメ科レクチンファミリーに属するSoybean agglutinin (SBA)において、N-glycanの付加が活性や多量体形成に寄与しないことが報告されており(非特許文献１３)、WFAにおいても同様の傾向が確認された。nWFAはジスルフィド結合で2量体を形成するが、今回アミノ酸配列を決定したことにより、272番目の唯一のシステインがジスルフィド結合の形成に寄与している可能性が強く考えられた。WFAを大腸菌のペリプラズムに発現させた場合、培地から精製したrWFAのおよそ半分は2量体を形成できたが、システインのアラニンへの改変体であるC272Aは2量体を形成できなかったことからこの可能性が正しいと思われる。タンパク質の成熟過程においてC末端の13アミノ酸がプロセシングされると仮定すると、成熟型nWFAタンパク質はほぼC末端で2量体を形成していることになる。我々はさらにC末端の13アミノ酸を予め除いたリコンビナントレクチンの発現も試みたが、それらの発現量は13アミノ酸を含むものと変わらなかったにも関わらず、ほとんど2量体を形成することはできなかった。これらのことから、WFAタンパク質の成熟過程においては2量体を形成した後にC末端のプロセシングが起こると考えられる。
　また、SBAやPNAなど同様にマメ科に属するレクチン配列中にはシステインを含んでいないにも関わらず、大腸菌で発現した際に非共有結合により多量体を形成できるが、WFAの場合にはシステインを含んでおり、ジスルフィド結合を形成できる点が上記レクチンと異なっている。Sophora Japonica agglutinin(SJA)の配列中にもWFAと近い位置にシステインが存在しており(図２)、このシステインが同様に2量体形成に寄与する可能性が示唆される。
１－３．WFAの単量体化及びリコンビナントレクチン改変体における糖鎖結合特異性
　今回、大腸菌でrWFAを発現・精製し、Glycan arrayを用いて糖鎖結合特異性を調べた結果、rWFAは天然のものと同様にGal/GalNAcに対する糖鎖結合特異性を示した。しかしながら、2量体の形成に寄与する272番目システイン残基の改変体であるC272Aや2量体であるnWFAを還元アルキル化して単量体にしたnWFA-RCAは、糖鎖結合特異性が変化したことから、天然由来WFAのGal/GalNAc認識にはシステインを介した2量体形成が重要であると思われる。一方、nWFAの単量体であるnWFA-RCAはGalNAc末端の糖鎖を特異的に認識し、それ以外のGal末端の糖鎖は認識しなかった。単量体と2量体ではGalNAcに対する結合活性が変わらないことはKurokawaらによって報告されていたが(非特許文献６)、今回の結果ではGalNAcのみならず、末端にGalNAcを含む糖鎖全般に対しても、認識活性が変わらないことが明らかとなった。システイン残基は成熟型WFAのほぼC末端に存在しているので、レクチンの糖鎖結合ポケットの形成に関係していないと予想されるが、2量体を形成することでGal末端糖鎖結合活性が生じたことになる。nWFAがGalNAcとGalを同じポケットで認識しているのか、2量体を形成することでGalを認識するため新たな糖鎖認識部位が生じているのかは解らないが、結晶化してＸ線構造解析により構造が解ければ、糖鎖結合の分子メカニズムが明らかになるかもしれない。
　また、rWFA C272Aは驚くべきことに非常に限定した糖鎖結合活性、つまりLDN特異的認識能を有していた。(図３Ｃ)に示すように、rWFAは培地から精製した場合は、およそ半分はシステイン残基を介して2量体を形成し、nWFAと同様にGal/GalNAc結合活性を示した。rWFA C272Aのシステイン残基の改変は糖鎖結合ポケットに影響するのではなく、タンパク質の合成過程において、2量体を形成しないことにより、ポケット以外の構造や安定性に影響を与えている可能性もある。
　今回、WFAレクチンをコードする遺伝子を単離し、アミノ酸配列を改変したリコンビナントWFAを遺伝子工学的に作製した結果、WFAの複数の糖鎖結合特異性がLDNに収束することを見出した。これはレクチンの欠点の１つである幅広い糖鎖認識特異性を遺伝子改変により解決できる可能性があることを示すものである。今後はこれらを鋳型に用いた進化工学的な手法を用いることで、認識特異性をも変えることができる可能性があり、今後、各種疾患の診断バイオマーカーや、組織、細胞のマーカーとして有用な改変レクチンの開発が期待できる。
２．本発明のWFA遺伝子及びその発現産物について
　本発明において提供された新規リコンビナントWFA(rWFA)は、下記(１)又は(２)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGal末端糖鎖と共にGalNAc末端糖鎖に対する結合活性(以下、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性という。)を有するか、又はGalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドとして表現できる。ここで、2量体を形成したrWFAは、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有し、単量体のrWFAはGalNAc末端糖鎖のうちでもLDN特異的な結合活性を有する。
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列がすべて欠失している場合を除く)、
（２）(１)に示されるアミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
　なお、数個とは、1～20個を指し、好ましくは1～10個、より好ましくは1～5個を意味する。
　したがって、rWFA遺伝子の塩基配列は、上記(１)又は(２)に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列であるといえるが、その塩基配列は、下記の(３)又は(４)で表現することもできる。
（３）配列番号１に記載の塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつアミノ酸配列上の272位の位置がCysをコードするコドンである塩基配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列に対応する塩基配列がすべて欠失している場合を除く)、
（４）(３)に示される塩基配列において、アミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
　なお、ストリンジェントな条件というとき、一般的なハイブリダイズ法において、85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性のある配列がハイブリダイズできる緊縮条件を意味する。
　本発明のWFA遺伝子を発現するための発現ベクターの構築に際して、特に分泌シグナルは不要であるが、発現産物の精製のためには、培地中に分泌させて、培地を精製する方が簡便かつ効率的であるため、分泌シグナルを付加することが好ましい。
　本発明のリコンビナントWFAを製造するための形質転換宿主としては、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞又は酵母など真核細胞を用いることもできるが、天然体が本来有しているフコース含有糖鎖は、WFAレクチンの糖鎖認識能には関与していないため、大腸菌などの原核細胞宿主が好ましい。
　得られたリコンビナントWFAに対しては、通常の精製方法が適用でき、例えば、通常のタグを用いた精製、又は糖鎖リガンドに対するアフィニティーカラムなどを用いて精製することができる。
　本発明で得られたリコンビナントWFA(rWFA)は、天然WFAと同様の2量体と共に単量体をほぼ同量形成する。2量体化したrWFAは、天然WFAとほぼ同等の広範な糖鎖認識能を示すが、単量体の状態のrWFAは、後述のリコンビナントWFA改変体と同様に、LDN特異的糖鎖認識能を有する。当該rWFA単量体は、ゲル濾過等の手法で2量体から分離することができる。
３．本発明におけるLDN特異的糖鎖認識能を有するリコンビナントWFA改変体
（３－１）rWFAの272位Cysへの変異導入によるリコンビナントWFA改変体(C272rWFA)
　本発明において、「LDN特異的糖鎖認識能」というとき、Gal末端糖鎖は認識せず、さらにGalNAc末端糖鎖のうちでも、GalNAcβ1,4GlcNAc糖鎖を有する場合のみを認識する糖鎖認識能を意味する。具体的には、正常の胃上皮細胞などに発現することが知られるLDN糖鎖マーカーが検出できる。
　本発明において、開発されたLDN特異性を有するリコンビナントWFA改変体のうち、272位Cysへの変異導入によるリコンビナントWFA改変体(C272改変ｒWFA)は、272位のCysが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を有することで、2量体を形成できず、その結果がLDN特異的糖鎖認識能を獲得したWFAレクチンであり、以下のように表現できる。
　下記(１)～(３)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつLDN特異的糖鎖認識能を有するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（３）(１)又は(２)に示されたアミノ酸配列において、そのN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
　なお、数個とは、1～20個を指し、好ましくは1～10個、より好ましくは1～5個を意味する。
　また、(１)のアミノ酸配列において、272位のアミノ酸としては、Cys以外のアミノ酸であればいずれのアミノ酸であっても良いが、Ala又はGlyなどの反応基を持たないアミノ酸が好ましく、特にAlaが好ましい。
　また、当該リコンビナントWFA改変体遺伝子(C272rWFA遺伝子)は、上記(１)～(３)に示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列であるといえるが、その塩基配列は、下記の(４)～(６)のいずれかの塩基配列として表現することもできる。
（４）配列番号１に記載の塩基配列において、272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（５）(４)に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
（６）(４)又は(５)に示された塩基配列において、5’側からN末端アミノ酸～30番目アミノ酸までのいずれかのアミノ酸に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
　なお、ストリンジェントな条件というとき、一般的なハイブリダイズ法において、85％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上の同一性のある配列がハイブリダイズできる緊縮条件を意味する。
　また、本発明では、リコンビナントWFA改変体(C272改変rWFA)において、さらにN型糖鎖結合位置の146位アスパラギンをグルタミンに変異（N146Q）させたC272，N146Q改変rWFAのリコンビナントWFA改変体も作製している。当該改変体は、宿主として大腸菌などの細菌以外の酵母、哺乳動物細胞を用いた場合でも糖鎖を持たないことと共に、大腸菌で発現されたリコンビナントWFA改変体(C272改変rWFA)の場合と同一の「LDN特異的糖鎖認識能」を有していることが確認された。
（３－２）C末端側欠失によるリコンビナントWFA改変体(rWFA delta)
　2量体リコンビナントWFAのC末側の部分アミノ酸配列を欠失させることによっても、C272の位置での2量体形成ができなくなり、単量体化できる。その単量体の糖鎖認識能はC272 rWFAと同様であって、LDN糖鎖特異性を示す。天然WFAは、リコンビナントWFAのC末側の13番目以降のアミノ酸配列(275～293位)を有していないにもかかわらず、272位のCysの位置でS-S結合による2量体を形成している。このことから、天然WFAではタンパク質が生合成され、2量体形成後に、275以下の13アミノ酸部分が切断されると推定できる。一方、予めC末端から13番目までのアミノ酸を欠失させたリコンビナントWFAの場合に、15番目の位置に相当する275 Cysでの2量体形成能を失って単量体化され、かつC272rWFAと同等のLDN糖鎖特異性を獲得することが確認されている(図３)。このことは、275位のCys及びその近傍のアミノ酸配列が除去されていれば、同様のLDN糖鎖特異性を有する単量体が形成できると考えられる。すなわち、C末端側から13～15番目までのアミノ酸を欠失させたリコンビナントWFA改変体であれば、C272 rWFAと同様のLDN糖鎖特異性を示す単量体を形成するリコンビナントWFA改変体であるといえる。
　本発明では、このようなC末側アミノ酸配列欠失リコンビナントWFAを、C末側欠失リコンビナントWFA改変体、又は「rWFA delta」と呼ぶこともある。
　「rWFA delta」は、以下のように表現できる。
　下記(１)又は(２)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつLDN特異的糖鎖認識能を有するポリペプチド；
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13～15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列。
　「rWFA delta」遺伝子は、上記(１)又は(２)に示されたアミノ酸配列をコードする塩基配列であるといえるが、その塩基配列は、下記の(３)～(６)のいずれかの塩基配列として表現することもできる。
（３）配列番号１に記載の塩基配列において3’末端側からC末端から13～15番目のいずれかのアミノ酸までに対応する塩基配列が欠失している塩基配列、
（４）(３)に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列。
（３－３）リコンビナントWFA改変体遺伝子の発現
　本発明のリコンビナントWFA改変体遺伝子(C272rWFA遺伝子又はrWFA delta遺伝子)を含むベクターを構築する際に、C272rWFA又はrWFA deltaを検出しやすくするために、上流側又は下流側にFLAGtagなどの検出用タグを結合してもよい。これらタグの結合によっても、そのLDN特異的糖鎖認識能は変わらない。
　本発明のリコンビナントWFA改変体(C272rWFA又はrWFA delta)発現のための、宿主及び発現ベクターはリコンビナントWFAと同様であり、その精製方法も同様である。
４．本発明における還元WFA単量体について
　本発明において「還元WFA単量体」というとき、2量体のリコンビナントWFA、又は天然WFAに対して、還元後システイン残基をアルキル化処理することで、単量体化されたWFAを指す。
　その際の還元方法、及びアルキル化方法は既知の手法を順次、もしくは同時に適用することが可能である。典型的には、ジチオスレイトール(DTT)を用いた還元処理後にヨードアセトアミドなどのアルキル化剤と反応させる手法が適用できる。
　いずれの還元WFA単量体も、Gal末端糖鎖に対する糖鎖認識能が失われ、GalNAc末端糖鎖のみを特異的に認識するようになる。
　すなわち、本発明のGalNAc末端糖鎖を特異的認識するWFA単量体レクチンの製造法は、以下のように表現できる。
　下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列をコードする、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドの2量体を、還元条件下でインキュベートし、同時に硫黄含有官能基のアルキル化処理を施すことを特徴とする、GalNAc末端糖鎖を特異的認識するWFA単量体レクチンの製造方法;
（１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
（２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
　このような、GalNAc末端糖鎖を特異的認識する「WFA単量体レクチン」も本発明ではじめて提供されたものである。
５．LDN糖鎖マーカーの検出法及びそのためのキット
　本発明において提供された各種リコンビナントWFAは、いずれもGal/GalNAc又はGalNAc糖鎖マーカー検出用レクチンとして有用であり、従来の天然WFAを用いて行われていたLDN糖鎖マーカー検出法にも用いることができる。
　天然WFAの前駆体WFAといえるrWFAは、天然WFAと同等の糖鎖認識能を保持しており、しかも形質転換大腸菌などからWFA遺伝子発現産物として大量生産できるため、従来のGal/GalNAc末端糖鎖検出のために、天然WFAの代替物として用いることができる。当該rWFAをゲル濾過などで分離して得られる単量体rWFAは、LDN糖鎖を特異的に認識する。
　また、本発明のGalNAc末端糖鎖を特異的認識するWFA単量体レクチン及び、さらにGalNAc末端糖鎖のうちでも特にLDN糖鎖のみを特異的に認識することができるC272改変体WFAは、C末側の単量体rWFAと同様、従来の天然WFAを用いて行われていた正常胃粘膜部位の検出のためのLDN糖鎖マーカー検出法に用いる場合に、より高い特異性が発揮できる。
　具体的には、LDN糖鎖の高発現が予想される、内分泌腫瘍や肺小細胞癌などを検出するためのプローブとして用いることが考えられる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明は特にこれら実施例に限定されるものではない。
　なお、本発明で使用されている技術的用語は、別途定義されていない限り、当業者により普通に理解されている意味を持つ。また、本発明で引用した先行文献又は特許出願明細書の記載内容は、本明細書の記載として組み入れるものとする。
（実施例で用いた試薬）
　精製ノダフジレクチン(nWFA)は、Vector Lab Inc.(Burlingame,CA,USA)より購入した。抗FLAG-tag M2-HRP conjugateは、Sigma-Aldrich社(St.Louis,MO,USA)より購入した。
（実施例１）ノダフジレクチン遺伝子のクローニング
（１－１）cDNAライブラリーの調製
　ノダフジ種子のtotal RNAは内藤らの方法を用いて抽出した(非特許文献９)。およそ150mgの種子を液体窒素中で破砕し、種子破砕物は抽出バッファー(1M Tris-HCl pH9.0 / 1％ SDS)とPCI(フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール(25:24:1))に混合し、乳液状になるまで懸濁した。遠心分離後の上清にPCIを加えた後、激しく撹拌し、遠心分離後の上清を回収し、上清に1/10容の3M Na-Acetateと３倍容のethanolを加え、-80℃で冷却し、核酸を沈殿させた。風乾後、H2Oに溶解し、4M LiClを加え氷上に一晩静置後、遠心分離しtotal RNAを沈殿物として回収した。Poly(A)RNAはNucleoTrapR mRNA(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG，Duren，Germany)を用いて調製し、cDNA合成に供した。遺伝子クローニングに用いたcDNAライブラリーは上記のように調製したノダフジ種子のmRNAからMarathonR cRNA Amplification Kit(Clontech社，Mountain View，CA，USA)を用いて作製した。
（１－２）遺伝子クローニング
　ノダフジレクチンをコードする遺伝子はノダフジ種子由来のcDNAからクローニングした。マメ科レクチンであるSoybean Agglutinin(SBA)のアミノ酸配列(Accession:P05046)をQueryとして用いてBlast検索を行い、Genbank DBより3種類のレクチン様タンパク質のアミノ酸配列を得た(Robinia pseudoacacia，Accession:BAA36414，Sophora japonica，Accession:AAB51441，Cladrastis kentukea，Accession:AAC49150)。それら3種類のレクチン様タンパク質の核酸配列(Robinia pseudoacacia，Accession:AB012633，Sophora japonica，Accession:U63011，Cladrastis kentukea，Accession:U21940)をアライメントし、最も保存されている領域に下記の２本のPCR用のプライマーを設計した。
　Fwd-1：5’-CTCTTGCTACTCAACAAGGTGAA-3’(配列番号３)
　Rev-1：5’-CAACTCTAACCCACTCCGGAAG-3’(配列番号４)
　ノダフジ種子由来cDNAを鋳型にKOD-plus-(TOYOBO，Osaka，Japan)でPCR反応(94℃，1分，(94℃，1分-60℃，30秒-68℃，1分を30サイクル)，68℃，1分)を行った結果、およそ650bpのDNA断片が増幅された。この断片をpCR-Blunt II-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)にサブクローニングし、3130xl Genetic Analyzer(Applied Biosystems，CA)で核酸配列を決定したところ、新規の核酸配列であった。
　この配列は部分配列であり、オープンリーディングフレームのN-末端および,C-末端を欠いていたためRACE(Rapid Amplification of cDNA End)法で全長配列決定を行った。3’-RACE法では、上記Fwd-1と下記のAdapter Primer-1(Clontech) プライマーを用いてPCR反応を行った(94℃ 1min，60℃ 30sec，68℃ 1min，35cycles)。
　Adapter Primer-1：5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(配列番号５)
　次いで、増幅した核酸を鋳型に、上記Fwd-2と下記のAdapter Primer-2(Clontech)のプライマーでNested PCRを行った。
　Adapter Primer-2：5’-ACTCACTATAGGGCTCGAGCGGC-3’(配列番号６)
　その結果得たおよそ700bpのDNA断片の配列決定した結果、終止コドンを含む遺伝子配列が得られた。
　さらに5’側の配列未知の部分に関しても、下記のRev-2及びRev-3を設計して、上記Adapter Primer-1及びAdapter Primer-2を用いた5’-Race法を行い、完全長配列を決定した。
　Rev-2：5’-ACTATAGACTGGTTCGCCGTCC-3’(配列番号７)
　Rev-3：5’-GGGTGAGTTGTAAATGCCCTGA-3’(配列番号８)
（１－３）レクチン遺伝子の配列解析
　ノダフジ種子よりクローニングした新規レクチン遺伝子は861bpのORFからなり、286アミノ酸からなるタンパク質をコードしていた(図１)。この新規アミノ酸配列は、マメ科レクチンに保存されたモチーフ配列を持ち、クエリーに用いたRobinia pseudoacaciaと62.8％、Cladrastis kentukeaと60.9％、Sophora japonicaと60.6％の相同性をそれぞれ有した。また、大豆レクチンSBA(Glycine max:P05046)と58.5％、ピーナッツ豆レクチンPNA(Arachis hypogaea:P02872)とも39.5％の相同性をそれぞれ有していた(図２)。配列中には１カ所のN-結合型糖鎖付加部位が存在し、C-末端近傍に１カ所のシステイン残基を認めた。決定した全長アミノ酸配列を用いて、シグナル配列予測プログラムSignalP4.0(デンマーク工科大学、http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/　非特許文献１１)を用いて解析したところ、N末端側の疎水性アミノ酸クラスターはシグナル配列であり、30番目のセリンと31番目のリジンの間で切断されることが予測された。
（実施例２）リコンビナントレクチン(rWFA)の形質転換大腸菌での発現
（２－１）レクチン遺伝子による大腸菌の形質転換
　実施例１でクローニングしたノダフジレクチンを大腸菌で発現させるために、レクチン活性領域であることが予想されるアミノ酸31-286残基を、ペリプラズム発現型のベクターであるpET20b(Merck4Biosciences，Darmstadt，Germany)のpelB leaderの下流にN末端にHis TagとFLAG Tagを付加して組み込んだ。
　また、WFAをコードするDNA断片を、下記WFA-HisFL-Fwd及びWFA-Revを用いて増幅し、pET20bのNcoI-XhoI部位に挿入した。
WFA-HisFL-Fwd：5’-ccatggGACATCATCATCATCATCACCTCGACTACAAGGACGACGATGACAAGGGCAAGCTTGCGGCCGCGAATTCAAAAGAAACAACTTCCTTTGTC-3’(配列番号９)
WFA-Rev-1：5’-ctcgagTTAGATGGAACCGCGCAGAA-3’(配列番号１０)
　作製した発現用プラスミドは大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL(Agilent
Technologies，CA)に形質転換され、形質転換体はマニュアルに従って最終濃度100mMのisopropyl β-D-thiogalactopyranoside(IPTG)の添加により発現誘導を行い、25℃で一晩震盪培養を行った。
（２－２）大腸菌でのrWFAの発現と精製
　ペリプラズム画分の抽出はpET System Manual 11thEdition(Merck4Biosciences)に従い行った。可溶性タンパク質の抽出はBugBuster(Merck4Biosciences)を用いて行った。発現誘導後、リコンビナントタンパク質は、ペリプラズム画分に発現が確認できた(図３Ａ，Ｂ)。さらに、可溶性画分にも存在し、培地中にも漏れ出してきていることが明らかとなった(図３Ｂ，lane 5，7)ので、取扱いが簡便な培地中よりFLAG Tagにてリコンビナントタンパク質を精製した。精製はDDDDK-tagged Protein PURIFICATION GEL(MBL，Nagoya，Japan)を用いて行い、リコンビナントタンパク質の溶出はDDDDK溶出ペプチドを用いた。最終的に、溶出タンパク質はAmicon Ultra 3K(Merck Millipore，MA)で濃縮した。
　FLAG tagに対するアフィニティによりリコンビナントレクチンの精製を行った結果、リコンビナントWFA(rWFA)は、還元条件のSDS-PAGEで展開後にCBB染色で１本に染色されるおよそ31KDaのタンパク質として精製できた(図３Ｃ，lane 2)。
（実施例３）リコンビナントWFA(rWFA)と天然WFA(nWFA)との配列上の同一性の検証
（３－１）天然由来WFAレクチン(nWFA)のアミノ酸解析
　天然由来ノダフジレクチン(Vector Labから購入)のアミノ酸解析をアミノ酸シークエンサーProcise492HT(Applied Biosystems，CA)及び質量分析装置LTQ Orbitrap Velos ETD(Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA)を用いて行った。およそ2μgのレクチンタンパク質を2-メルカプトエタノール入りのサンプルバッファー中で100℃、5分間処理し、SDS-PAGE展開した。およそ28KDaのバンドは回収され、還元アルキル化の後、Trypsin消化を行いpeptide断片に分解した。濃縮後LTQ Orbitrap Velos ETDを用いてLC/MS解析し、構成するペプチドのアミノ酸配列を同定した。
（３－２）rWFAとnWFAの配列比較の結果
　実施例１でのノダフジレクチン遺伝子のクローニングで決定されたORFの推定アミノ酸配列が、天然から精製された市販のWFAレクチンと同一かどうかを検証した。(３－１)においてアミノ酸シークエンサーにより、nWFA(Vector
Lab)のN-末端側の31番目のリジン以下の配列が同定された。また、このnWFAを(３－１)のように、トリプシンで消化し、LC/MS法により構成ペプチドのアミノ酸配列を決定した結果、市販レクチンから得られたトリプシン消化ペプチドの93％が新規に決定したレクチン配列(シグナル配列部分を除く)に合致した(図８)。
　また、実施例１で決定されたWFA-ORFアミノ配列のC末端の13アミノ酸は、天然由来レクチンから得られたペプチドには含まれておらず、タンパク質の成熟過程においてプロセシングされる可能性が考えられた。
（３－３）SDS-PAGEによる分子量及び2量体形成能の比較
　実施例２(２－２)で精製されたリコンビナントWFA(rWFA)は、還元条件のSDS-PAGEで、31KDaの単一バンドとして観察された(図３Ｃ，lane2)
　一方、市販の天然WFA(nWFA)はリコンビナントより小さいおよそ28KDaの単一バンドとして確認できた(図３Ｃ，lane1)。2-メルカプトエタノールを除いた非還元条件でSDS-PAGEした結果、nWFAはおよそ60KDaの単一のバンドとして検出され、S-S結合で2量体を形成していることが示唆された(図３Ｃ，lane4)。一方、rWFAは非還元条件では、2量体の分子量と単量体の分子量の両方にバンドが検出できた(図３Ｃ，lane5)。
（実施例４）天然由来WFAの還元によるnWFA単量体の作製
（４－１）天然由来WFAがフコースを含む糖鎖を有していることの確認
　天然型WFA(nWFA)はフコースを含む糖鎖を持つことが報告されていたので、フコースを認識するAleuria Aurantia Lectin(AAL)レクチンを用いてレクチンブロットを行った。その結果、nWFAはAALに反応する糖鎖を含む糖タンパク質であることが確認できた(図５)。
（４－２）nWFAの還元によるnWFA単量体の作製
　天然由来WFAの還元はジチオスレイトール(DTT)を用いて行った。1mg/mL(100mM Tris pH8.5)のnWFA 1mLに10μLの1M DTTを添加し、室温で4時間還元反応を行った。続いて、25μLの1Mヨードアセトアミドを加え、室温、暗所で30分間アルキル化反応を行った。これによりnWFAは還元され、2量体形成に寄与していたシステインはアルキル化され、S-カルボキシアミドメチルシステインとなり、nWFAは単量体となった。反応後の余分な試薬は限外ろ過(Amicon 3K，millipore)にて取り除いた。
（実施例５）変異体レクチンC272Aの作製
（５－１）変異体レクチンC272Aの大腸菌による発現
　実施例３(３－３)では、nWFAでは非還元状態では28KDaの、還元状態では60KDaの単一バンドであったことから、nWFAは2量体を形成していると考えられるが、rwFAでは、還元状態では31KDaの単一バンドであったが、非還元条件では、2量体の分子量と単量体の分子量の両方にバンドが検出された(図３Ｃ)。
　そこで、この2量体形成にシステイン残基が関与しているかどうかを検証するために、rWFAアミノ酸配列中で唯一の272位のシステインをアラニンに置換した変異体(C272A)を作製して大腸菌で発現させた。
　変異体レクチンC272Aは、下記C272A-Fwd及びC272A-Revのプライマーを用いてPCRで作製した。
C272A-Fwd：5’-AGCAGTGATGATGCCAACAACTTGCAT-3’(配列番号１１) 
C272A-Rev：5’-ATGCAAGTTGTTGGCATCATCACTGCT-3’(配列番号１２)
　FLAG-Tag WFAはそれぞれ以下のN-FLAG及びC-FLAG PCRプライマーを用いて増幅した断片をpET20bのEcoRI-XhoI部位に挿入して作製した。
N-FLAG：
WFA-FLAG-Fwd：
5’-gaattcAGACTACAAGGACGACGATGACAAGAAAGAAACAACTTCCTTTGT-3’(配列番号１３)
WFA-Rev-2：5’-ggcctcgagTTAGTTGCAATCATCACTGCTAGGATCT-3’(配列番号１４)，
C-FLAG：
WFA-Fwd-1：5’-ggaattcaAAAGAAACAACTTCCTTTGT-3’(配列番号１５) 
WFA-FLAG-Rev：
5’-ctcgagTTACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAGTCGTTGGCATCATCACTGCTAGGATCT-3’
(配列番号１６)
（５－２）SDS-PAGEによる2量体形成能の検討
　FLAG tagで精製したC272Aは還元条件、非還元条件ともにSDS-PAGEで単量体の大きさ28KDaにバンドが確認された(図３Ｃ，lane3 and 6)。システインの変異体が2量体を形成しなかったことから、システインを介したS-S結合が2量体の形成に必須であることが明らかとなった。
（実施例６）リコンビナントレクチン(rWFA)の糖鎖結合活性の解析
（６－１）糖鎖結合活性の測定
　リコンビナントレクチンの糖鎖結合活性は産総研が開発した複合糖質マイクロアレイを用いて解析した(非特許文献１０)。リコンビナントレクチンはリジン残基をCy3(GE Healthcare，Buckinghamshire，UK)でラベルし、マイクロアレイに供した。Cy3シグナルはGlycostation Reader 1200(GPバイオサイエンス、Yokohama，Japan)を用いて測定した。
（６－２）rWFAの糖鎖認識活性
　大腸菌で作製したrWFAが糖鎖認識活性を有するかどうかを、糖鎖・糖タンパク質アレイを用いて解析した。Cy3でラベルしたnWFAとrWFAは糖タンパク質アレイに供された。その結果、nWFAとrWFAは非常に類似した糖鎖認識特異性を示した(図４)。両方ともに最も強いシグナルを示したのはAsialo-BSM(bovine submaxillary mucin)であった。また、予想されていたようにGalNAc末端の糖鎖(A-di，βGalNAc，di-GalNAcβ，LDN，GA2，Tn，Forssman)にも結合性を示した。さらに、asialo-AGPやasialo-TF、asialo-TG，asialo-FETなどにも結合性を示した。これらの結果から、大腸菌で発現したrWFAは天然のものと同じ糖鎖認識活性を有することが明らかとなった。
（６－３）C末端13アミノ酸の欠失、及び272位のCys残基による糖鎖認識活性への影響
　続いて、C末端の13アミノ酸の影響を調べるため、13アミノ酸を除いたrWFAを作製し、糖鎖認識活性を調べた(図５)。13アミノ酸を除いてN末端にFLAG-tagを加えたもの(rWFA N-FLAG)、同じ設計でCys 272をAlaに改変したもの(C272A N-FLAG)、改変型でFLAG tagの位置をC末端に変更したもの(C272A C-FLAG)の3種類を大腸菌で発現させた(図５Ａ)。
　精製したリコンビナントレクチンをSDS-PAGEで展開した結果、C末端の13アミノ酸を欠失したrWFA N-FLAGはそのほとんどが2量体を形成することができずに、2ME-の非還元条件でも単量体の分子量に泳動された(図５Ｂ，lane6)。
　また、予想通り改変型のC272A N-FLAGは単量体であり、C末端にtagを移したC272A C-FLAGも単量体での発現が確認された(図５Ｂ，lane7 and 8)。
　精製したこれら３種類の単量体リコンビナントレクチンをCy3でラベル化し、糖鎖結合活性を糖鎖タンパク質アレイで検証した。その結果、３種類ともにnWFAで見られた糖鎖認識活性の多くが消失し、LDN(GalNAcβ1,4GlcNAc)とasialo-BSMへの結合活性のみが残存した。ここで、LDNの結合活性に比較するとasialo-BSMへの結合活性は無視できる程度であるため、当該結合活性は、「LDN特異的結合活性」と表現できる。さらに、C末端の13アミノ酸が付帯した改変型C272A WFA(図３Ｃ，lane3 and 6)も、同様のLDNとAsialo-BSMへの結合活性、すなわち「LDN特異的結合活性」を持っていた(data is not shown)。
（６－４）C末端13アミノ酸の存在による2量体形成能及び糖鎖結合特異性への影響
　プロセッシングされることが予想されるC末端13アミノ酸を削除し、N末端あるいはC末端にFLAG tagを付加したrWFAの発現を行った結果、13アミノ酸を除いたものは2量体をほとんど形成できなかった。2量体はCBB染色では検出できず、抗FLAG抗体のウエスタンブロットでかろうじて検出できた。C272Aは実施例５(図３)で確認した際と同様に2量体は形成できなかった。これらの精製したrWFAを用いて、糖鎖結合特異性を検討した(図６)。
（６－５）単量体リコンビナントがLDN及びasialo-BSMのみを認識する原因の解明
　LDNとasialo-BSMのみを認識したrWFAは単量体のレクチンだったため、nWFAとrWFAの糖鎖結合活性の違いが、単量体化によるものなのか、リコンビナント化によるものなのかを検証するために、実施例４で作製された還元後システイン残基がアルキル化されたnWFA単量体について、糖鎖認識活性を検討した(図７Ａ)。
　糖タンパク質アレイで解析した結果、還元したWFA(nWFA-RCA)はnWFAともrWFAとも異なる糖鎖認識を示した。nWFA-RCAはLac，Lec，LN，Asialo-FET，Asialo-AGP，Asialo-TF，Asialo-TG，Tn，Asialo-GP，BSM，αGalに対する結合は消失あるいは大きく減少したのに対し、A-di，bGalNAc，di-GalNAcβ，LDN，GA2，Forssman，Asialo-BSMなど非還元末端がGalNAcである糖鎖に対する結合はほとんど変化が見られなかった(図７Ｂ)。
　これらの結果からnWFAは単量体ではGalNAc末端の糖鎖に、より特異的に結合できることが示された。すなわち、天然のWFAでは、2量体化されたことで、GalNAc末端の糖鎖に加えて、Gal末端の糖鎖にも結合できるようになることが示された。
（実施例７）ヒト培養細胞でのC272A改変レクチンの作製
　大腸菌以外のホストでの改変レクチンの作製を検討するため、ヒト培養細胞(HEK293T株)に、実施例(５－１)に記載されたC272A変異を有するWFAをコードする核酸を導入した。具体的には、C272A改変rWFAをコードする遺伝子をpFLAG-CMV3発現ベクター(Sigma社)に組込み、HEK293T細胞に遺伝子導入した。
　遺伝子導入後、10%ウシ血清を含むDMEM培地で48時間培養した培養上清より、抗FLAG抗体カラム(Sigma社)を用いて精製した結果、改変レクチンは、およそ35KDa付近の単一バンドとして検出できたが、糖鎖による分子量の増加が観察された(図１２Ａ)。これをCy3で標識し、糖タンパク質アレイに供した結果、大腸菌で作製した改変レクチンと同様の結合特異性(LDNとasialo-BSM)が確認された(図１２Ｂ)。
（実施例８）ヒト培養細胞でのC272A，N146Q改変レクチンの作製
　この実施例では、C272A改変rWFAに対して、唯一の糖鎖結合部位である146番目のアスパラギンをグルタミンに置換し(N146Q)、真核細胞であっても糖鎖を付与できないC272A改変レクチンのC272A,N146Q改変rWFAをコードする遺伝子を作製した。
　当該C272A,N146Q改変rWFAをコードする遺伝子を、実施例７で用いたpFLAG-CMV3発現ベクター(Sigma社)に組込み、ヒト培養細胞(HEK293T株)に遺伝子導入した。
　上記形質転換細胞を実施例７と同様に培養し発現誘導を行い、培養上清を回収後、同様の精製方法を適用して、精製C272A,N146Q改変レクチンを得た。
　培養上清より精製した改変レクチンは、およそ33KDaの単一バンドとして検出できた(図１３Ａ左)。これをCy3で標識し、糖タンパク質アレイに供した結果、大腸菌で作製した改変レクチンと同様の結合特異性(LDNとasialo-BSM)が確認された(図１３Ｂ上)。
　糖鎖付加が起こらない大腸菌で発現させたC272A改変rWFAがLDN結合活性を有していたことから、糖鎖付加が糖鎖認識能には影響を与えないことは十分に予測されていたが、この結果によりその点が明確になった。
（実施例９）酵母でのC272A，N146Q改変レクチンの作製
酵母(メタノール資化性酵母Ogataea minuta TK10-1-2株)に、実施例８に記載されたC272A，N146Q改変rWFAをコードする遺伝子をHisおよびFLAGタグを有するpOMEA1-10H3F発現ベクターに組込み、O.minutaTK10-1-2株を形質転換した。
　上記形質転換酵母を200mlのYPD培地(2％Peptone、1％Yeast Extract、2％グルコース)にて、30℃で2日間培養を行った。遠心分離により培養上清を除いた後、菌体に200 mlのBMMY培地(2％Peptone、1％Yeast Extract、1.34％Yeast Nitrogen Base w/o amino acids、1％MeOH、100mMリン酸カリウムバッファー(pH6.0))を加えて再懸濁し、30℃でさらに2日間培養することでEndo-Omの発現誘導を行った。培養上清を回収後、TBSバッファー(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン1.24g、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン塩酸塩6.27g、塩化ナトリウム8.77g/L)にて透析を行なった。透析後の粗レクチン液をHisTrap HPカラム(GE Healthcare社)に供し、50mMのイミダゾールを含むTBSバッファーで洗浄した後、500mMイミダゾールを含むTBSバッファーでグラジエント溶出をすることによりタンパク質を溶出した。カラムから溶出されたEndo-Omを含む画分をAmicon Ultra(10,000 MWCO，Millipore社)で限外ろ過濃縮し、さらにTBSバッファーで置換し、精製C272A，N146Q改変レクチンとした。
　酵母培養上清より精製した改変レクチンは、およそ34Kda付近の単一バンドとして検出できた(図１２Ａ右)。それをCy3で標識し、糖タンパク質アレイに供した結果、大腸菌および培養細胞で作製した改変レクチンと同様の結合特異性(LDNとasialo-BSM)が確認された(図１２Ｂ下)。
［配列フリーテキスト］
配列番号１　：wisteria floribunda lectin(g)
配列番号２　：wisteria floribunda lectin(a)
配列番号３　：Fwd-1
配列番号４　：Rev-1
配列番号５　：Adapter Primer-1
配列番号６　：Adapter Primer-2
配列番号７　：Rev-2
配列番号８　：Rev-3
配列番号９　：WFA-HisFL-Fwd
配列番号１０：WFA-Rev-1
配列番号１１：C272A-Fwd
配列番号１２：C272A-Rev
配列番号１３：WFA-FLAG-Fwd(N-FLAG)
配列番号１４：WFA-Rev-2(N-FLAG)
配列番号１５：WFA-Fwd-1(C-FLAG)
配列番号１６：WFA-FLAG-Rev(C-FLAG)

Claims (14)

  1. 　下記(１)又は(２)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性又はGalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチド；
    （１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列がすべて欠失している場合を除く)、
    （２）(１)に示されるアミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
  2. 　請求項１に記載の(１)又は(２)に示されたいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
  3. 　下記(１)又は(２)に示されるいずれかの塩基配列を含み、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有するポリペプチドをコードする核酸；
    （１）配列番号１に記載の塩基配列、又はその相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつアミノ酸配列上の272位の位置がCysをコードするコドンである塩基配列(ただし、273位又は274位以降のアミノ酸配列に対応する塩基配列がすべて欠失している場合を除く)
    （２）(１)に示される塩基配列において、アミノ酸配列のN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
  4. 　下記(１)～(６)のいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGalNAc末端糖鎖を特異的に認識するポリペプチド；
    （１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
    （２）(１)に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
    （３）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13～15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
    （４）(３)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
    （５）配列番号２に示されたアミノ酸配列の272位がアルキル化されたCysであるアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
    （６）(１)～(５)に示されたいずれかのアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
  5. 　下記(１)～(５)に示されるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつGalNAc末端糖鎖のうちでも特にLDN特異的糖鎖認識能を有するポリペプチド；
    （１）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、272位のアミノ酸がCys以外のアミノ酸であるアミノ酸配列、
    （２）(１)に示されたアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
    （３）配列番号２に示されたアミノ酸配列において、そのC末端側から13～15番目のいずれかのアミノ酸までが欠失しているアミノ酸配列、
    （４）(３)に示されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
    （５）(１)～(４)に示されたいずれかのアミノ酸配列において、そのN末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失しているアミノ酸配列。
  6. 　請求項５に記載の(１)～(５)のいずれかのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む、LDN糖鎖を特異的に認識するポリペプチドをコードする核酸。
  7. 　下記(１)～(４)に示されるいずれかの塩基配列を含み、LDN糖鎖を特異的に認識するポリペプチドをコードする核酸；
    （１）配列番号１に記載の塩基配列において、272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
    （２）(１)に示された塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列であって、かつ272位アミノ酸に対応するコドンがCys以外のアミノ酸である塩基配列、
    （３）配列番号１に記載の塩基配列において、3’末端側からC末端側13～15番目までのいずれかのアミノ酸に対応する塩基配列が欠失している塩基配列、
    （４）(１)～(３)に示されたいずれかの塩基配列において、5’側からN末端アミノ酸～30番目アミノ酸までのいずれかのアミノ酸配列に対応する塩基配列が欠失している塩基配列。
  8. 　請求項２，３，６又は７に記載の核酸を含む発現ベクター。
  9. 　請求項２，３，６又は７に記載の核酸を用いて形質転換された、形質転換細胞。
  10. 　請求項９に記載の形質転換細胞を培養して得られる培養物から採取することを特徴とする、Gal/GalNAc末端糖鎖結合活性、GalNAc末端糖鎖結合活性又はLDN糖鎖特異的結合活性を有するポリペプチドの製造方法。
  11. 　請求項１又は４に記載のポリペプチドを含むことを特徴とするGal/GalNAc末端糖鎖，又はGalNAc末端糖鎖を特異的に検出するための試薬。
  12. 　請求項５に記載のポリペプチドを含むことを特徴とする、LDN糖鎖を特異的に検出するための試薬。
  13. 　2量体を形成し、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有する下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを還元処理し、次いで前記アミノ酸配列中のCysをアルキル化することを特徴とする、前記糖鎖結合活性をGalNAc末端糖鎖特異的な結合活性に変更する方法；
    （１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
    （２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
  14. 　2量体を形成し、かつGal/GalNAc末端糖鎖結合活性を有する下記(１)又は(２)に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの272位の位置のCysを他のアミノ酸に置換するか、又は前記アミノ酸配列のC末端側から13～15番目までのいずれかのアミノ酸を欠失させることを特徴とする、前記糖鎖結合活性をLDN糖鎖特異的な結合活性に変更する方法；
    （１）配列番号２に示されたアミノ酸配列、又はそのアミノ酸配列において、272位以外の位置で１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列、
    （２）(１)に示されたアミノ酸配列において、N末端側から30番目までのいずれかのアミノ酸配列が欠失したアミノ酸配列。
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