EA008194B1

EA008194B1 - Способы обнаружения амниотической жидкости во влагалищном секрете и устройства для реализации указанных способов

Info

Publication number: EA008194B1
Application number: EA200500356A
Authority: EA
Inventors: Борис Фукс; Дмитрий Дмитриевич Петрунин; Евгений Ильич Зарайский; Марина Николаевна Болтовская; Светлана Владимировна Назимова; Нелли Андрониковна Старосветская; Александр Константинов; Маргарита Игоревна Маршицкая
Original assignee: Н-Диа, Инк.
Priority date: 2002-08-13
Filing date: 2003-08-12
Publication date: 2007-04-27
Also published as: US9494596B2; CN1697972A; US20130071865A1; US9568479B2; SI1535068T1; US20160327565A1; US20140011220A1; DK2204654T3; BRPI0313739B8; BRPI0313739B1; ES2401036T3; US7709272B2; AU2003259751A1; CN1697972B; EP1535068A4; US20120009609A1; JP4625696B2; EP2204654B1; EP1535068A2; ES2344693T3

Abstract

Данное изобретение относится к точному диагностическому способу обнаружения и устройству для выявления содержания малого количества амниотической жидкости во влагалище с помощью выявления антител к PAMG-1. Как показано на фиг. 1, устройство содержит прокладку 12 с зоной 10 меченого антитела М271, зону 14 анализа и зону 16 контроля.

Description

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке США № 60/403407, зарегистрированной 13 августа 2002 г., описание которой полностью входит в описание настоящей заявки по ссылке.

Данное изобретение относится к способу диагностики для точного обнаружения малых количеств амниотической жидкости во влагалище. В частности, изобретение относится к применению особым образом выбранных моноклональных антител, которые специфичным образом связывают плацентарный а₁-микроглобулин (РАМС-1). Более конкретно, настоящее изобретение относится к выбору пары антител против РАМС-1 (базовой пары), обеспечивающей чувствительность, достаточную для обнаружения минимальной фоновой концентрации РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин. Кроме того, настоящее изобретение относится к системе твердофазного иммунологического анализа, содержащей антитела против РАМС-1, в которой комбинацию двух или нескольких антител против РАМС-1иммобилизуют на твердотельной подложке устройства с целью точной настройки требуемого порогового уровня чувствительности.

Преждевременный разрыв плодной оболочки (амниотического мешка) происходит примерно у 10% беременных женщин, и при отсутствии незамедлительного лечения он вызывает примерно 10% всех перинатальных смертей. Термин РКОМ (ргета!иге гир!иге оГ !11е Ге!а1 тетЬгапез, преждевременный разрыв плодных оболочек) относится к спонтанному разрыву оболочек за 24 и более часов до начала своевременных или преждевременных родов. Термин РРКОМ (рге!егт ргета!иге гир!иге оГ тетЬгалек) относится к преждевременному раннему разрыву оболочек. Около 30-50% таких преждевременных разрывов происходят до 37 недели беременности. В этих случаях определенный диагноз разрыва является чрезвычайно важным, поскольку РКОМ связан с существенным повышением опасности внутриматочной инфекции и нарушения развития легочной системы плода. Внутриматочное проникновение таких инфекций примерно на 10% увеличивает как материнскую, так и перинатальную заболеваемость и смертность. Незамедлительный диагноз разрыва на 38-40 неделе беременности является критичным, поскольку в случае определения наличия РКОМ необходимо как можно скорее стимулировать роды. Диагностика разрыва также является важной до 37 недель беременности, поскольку она способствует предотвращению возникновения внутриамниотической инфекции и стимуляции развития легких плода.

Золотого стандарта для диагностики разрыва оболочки не существует. РКОМ имеет динамическую природу, поэтому интервал между разрывом оболочки и реализацией диагностической модальности, наличие интенсивной» потери амниотической жидкости, периодические просачивания, различия в возникновении РКОМ у различных групп пациенток и учет факторов, которые способны оказывать влияние на результаты анализов, являются параметрами, отсутствие учета которых ведет к неточному диагнозу. Эти неточности могут приводить к ошибкам интерпретации исследований, задачей которых является определение оптимальных средств для идентификации РКОМ.

Диагностика РКОМ традиционно основывается на жалобах пациенток о выделении жидкости из влагалища. Физический осмотр позволяет однозначно ставить диагноз, однако, бывают случаи, когда результаты осмотра являются внутренне противоречивыми или сомнительными. Такая ситуация требует проведения подтверждающих диагностических тестов (Ьоск^ооб С.1. е! а1., Ат. 1. ОЬз!е!. Супесок, 1994, ν. 171, Ыо 1, рр. 146-150). Некоторые методы, являющиеся, впрочем, недостаточно эффективными, используют в настоящее время для обнаружении амниотической жидкости во влагалище. К таким методам относится, в частности, папортниковый тест (М.Ь. Бпебтап апб Τ/Ψ. МсЕ1т, Э|адпо515 оГ Кир!игеб Бе!а1 МетЬгапез, Атепсап 1оита1 оГ ОЬз!е!г1с8 апб Супесо1о§у 1969, Уо1. 100, рр. 544-550). Данный метод основан на обнаружении присутствия амниотической жидкости путем наблюдения так называемой листовидной структуры, которая появляется при высыхании амниотической жидкости на предметном стекле. Однако этот метод является недостаточно точным, поскольку он основан на чрезвычайно изменчивых свойствах амниотической жидкости во влагалище. В 30% случаев он может давать ложные результаты.

Предлагалось также определять разрыв плодной оболочки с помощью нескольких красителей: нильский голубой, акридиновый оранжевый, бромтимоловый синий, нитразин и т.д. (М.Ь. Бпебтап апб Т.^. МсЕ1ш, см. выше). Этот подход является неудобным и обладает недостатками, связанными с изменчивостью химических свойств амниотической жидкости во влагалище и некоторых возможных примесей, содержащихся в ней. Так, например, влагалищная инфекция может оказывать влияние на результаты вышеуказанных анализов. Проведенное ранее исследование наиболее распространенных в настоящее время нитразинового и папортникового тестов показало, что эти тесты имеют высокую погрешность, которая прогрессивно возрастает, если с момента разрыва оболочки прошло более 1 ч, а через 24 ч результаты становятся совершенно неинтерпретируемыми. Исследование показало, что в случаях затяжного РКОМ эти тесты дают не лучшую диагностическую информацию, чем простое клиническое исследование (Согобезк1 1.С., Наппоуйх Ь., Вайап С.М., 1оита1 Реппа!. Меб, 1982, ν. 10, Ыо 6, рр. 286-292). Более поздние данные (Тгосо Б. е! а1., Мшегса Стесо1. 1998, ν. 50, Ыо 12, рр. 519-512) по этим тестам показывают нитразиновый тест - чувствительность 70%, специфичность 97%, точность 90%;

папортниковый тест - чувствительность 70%, точность 93%.

- 1 008194

Недавно было предложено определять разрыв плодных оболочек на основании иммунохимического анализа белков амниотической жидкости. Стыковочный (контактный) иммунохимический анализ использует следующие белки амниотической жидкости для определения разрыва оболочки: альфафетопротеин, пролактин, фибронектин и протеин 1, связывающий инсулиноподобный фактор роста, см. В.Ь. Кос1е1коп с1 а1., Кар1б Аккау - Рокк1Ь1е Αρρίίοαίίοη ίη 11с Б1адпок1к оГ РгетаГиге КирГиге оГ Ле МетЬгапек, ίη ОЬкГеГпск апб Супесо1о§у, 1983, ν. 62, рр. 414-418; Р.К. Кошскх еГ а1., Рго1асГт СопсепГгабоп ίη Уащпа1 Е1шб: а №\ν МеГйоб Гог Б1адпокшд КирГигеб МетЬгапек, Βτίίίκ! 1. ОЬкГеГг. Супесок, 1981, ν. 88, рр. 607-610; Р. Не11етапк еГ а1., РгеНттагу Кеки1Гк \νίΐ1ι ГНе Ике оГ Г1е КОМ С1еск 1ттипоаккау ίη Г1е Еаг1у БеГесйоп оГ КирГиге оГ Г1е АтпюОс МетЬгапек, Еиг. 1. ОЬкГеГ. Супесо1. Кергоб. Вю1., 1992, ν. 43(3), рр. 173-179; КиГапеп, Е.М. еГ а1., МеакигетепГ оГ 1пки1ш-11ке Сго\\111-Еас1ог Ьтбтд РгоГеш-1 ίη СегСса1/Уа§1па1 8есгеГюпк: Сотрапкоп νίίΗ Не КОМ С1еск МетЬгапе 1ттипоаккау ίη Не Б1адпок1к оГ КирГигеб Ее1а1 МетЬгапек, С1ш. СЫт. АсГа., 1993, ν. 214, рр. 73-81. КиГапеп Е.М. и др. позднее разработали хроматографический тест, используя хроматографическую мембрану в инверсной позиции (Р1-84863; патент США 5554504).

Способы, основанные на определении альфа-фетопротеина (АРР) и пролактина (РКЬ), являются ненадежными, поскольку отношение содержания АРР и РКЬ в крови/амниотической жидкости подвержено существенным колебаниям. АРР и РКЬ имеют высокую концентрацию в амниотической жидкости только во время второго трехмесячного периода беременности. К моменту родов отношение концентрации амниотического/сывороточного белка для обоих белков составляет всего лишь около 3-4.

Другой способ, основанный на определении фетального фибронектина в влагалищном секрете, также найден неудовлетворительным. Например, наличие фетального фибронектина может иметь место даже при отсутствии разрыва плодной оболочки (Р. Не11етапк еГ а1., Ргейттагу Кеки1Гк νίίΗ Г1е Ике оГ Не КОМ С1еск 1ттипоаккау ίη Не Еаг1у БеГесйоп оГ КирГиге оГ Г1е АттоОс МетЬгапек, Еиг. 1. ОЬкГеГ. Супесо1. Кергоб. Вю1., 1992, ν. 43(3), рр. 173-179; С. Ьоск^ооб еГ а1., РеГа1 Р1ЬгопесГт ίη Сегука1 апб Уащпа1 8есгейопк ак а РгебкГог оГ РгеГегт ЭеНуегу. №\ν Епд1апб 1оита1 оГ Мебкте, 1991, ν. 325, рр. 669-674), что приводит к ложноположительным результатам.

Все эти способы определения разрыва плодной оболочки, основанные на определении альфафетопротеина, пролактина и фибронектина, являются неточными из-за переменных факторов, регулирующих концентрацию этих белков в амниотической жидкости и относительную концентрацию этих белков в амниотической жидкости и в сыворотке крови.

Что касается усовершенствованного теста на 1СРВР-1 (протеин 1, связывающий инсулиноподобный фактор роста), то имеются противоречивые данные относительно его специфичности и точности. Экспресс-тест по индикаторной полосе (РКОМ тест, ОУ Меб1х Вюсйетюа, Финляндия, известный также под маркой Атш-сйеск, МА8Т Б1адпокйса, Германия) разработан для определения присутствия 1СРВР-1 во влагалищном секрете (КиГапеп ЕМ, Кагккашеп ТН, Еек1оу|г1а 1., ИоГ11а ГТ, Ншки1а МК, Нагбкашеп АЬ, ЕуаЫаОоп оГ а гар1б к1г1р ГекГ Гог тки1те-11ке дго\\111 ГасГог Ьтбтд ргоГеш-1 ίη Г1е б1адпок1к оГ гирГигеб ГеГа1 тетЬгапек, С1ш СЫт АсГа 1996 8ер 30; ν. 253 (1-2), рр. 91-101). Е. КиГапеп сообщил, что порог чувствительности в тесте был установлен таким образом, чтобы концентрации 1СРВР-1 ниже 400 нг/мл в цервикальном секрете (ниже 95-го процентиля содержания 1СРВР-1 в сыворотке беременных женщин) давали отрицательный результат. Однако в случаях кровотечения результат теста следует интерпретировать с осторожностью, поскольку кровь, полученная непосредственно из плацентарной площадки, может иметь более высокое содержание 1СРВР-1, чем кровь из цервикальных кровеносных сосудов.

Все пробы (п=55), взятые у пациенток с клинически подтвержденным РКОМ, показали положительный результат, а 71 из 75 проб, взятых у бессимптомных пациенток, были отрицательными согласно тесту. В данном наборе проб тест имел чувствительность 100% и специфичность 94,7%. Этот факт можно пояснить недостаточной чувствительностью (перекрестной реактивностью) моноклонального антитела, используемого на первом этапе тестирования.

У 181 пациентки с подозрением на РКОМ, не получившим однозначного подтверждения после первичного обследования, результаты теста были положительными в 64 случаях и отрицательными в 117 случаях. Пятьдесят из 64 пациенток (78,1%) с положительным результатом теста имели роды ранее 37 недель беременности, а 42 (65,6%) - в течение 2 недель после отбора пробы. Пять из 117 пациенток с отрицательным результатом теста перенесли избирательное кесарево сечение по причинам, не связанным с РКОМ. Из других 112 пациенток 102 (91,1%) родили в срок, 10 (8,9%) родили ранее 37 недель, а семь (6,3%) - в течение двух недель после отбора пробы (Е. КиГапеп еГ а1., 1996). К сожалению, данные, касающиеся чувствительности и специфичности теста на РКОМ у женщин с однозначным диагнозом РКОМ, отсутствуют.

В исследовании V. \Уо11тапп использовали тест АтЫ-сйеск для определения 1СРВР-1 в 150 пробах амниотической жидкости и 50 пробах влагалищного секрета, взятых у женщин с клинически неподтвержденным РКОМ. Тест имел чувствительность 97% и специфичность 100% (\Уо11тапп XV. еГ а1., Ζ. СеЬигкН. №опаГа1, 1995, ν. 199, рр. 243-244).

V. Кадок! оценил диагностическую точность теста АтЫ-сйеск в 75 пробах влагалищного секрета. Тест показал чувствительность 100% и специфичность 83%. Исследователи сообщают, что доля ложно- 2 008194 положительных результатов в сильной степени зависит от родовой активности. У женщин с маточными сокращениями (схватками) тест имел специфичность 59% (Вадокй V. е! а1., ОеЬийкй. и. Егаиепйеййк., 1996, νοί. 56, рр. 291-296).

В исследовании Е. Эаг| и 8. Ьугепах (Ле1а 0Ь§!е!. Оуиесо1. 8сапй., 1998, ν. 77, рр. 295-297) ΡΚΌΜтест имел чувствительность 95,7% и специфичность 93,1% у пациенток с клинически подтвержденным диагнозом (женщины с очевидным разрывом оболочек или женщины с неповрежденными оболочками). Однако у пациенток с подозрением на ΡΚΌΜ чувствительность и специфичность ΡΚΌΜ-теста составляли только 70,8 и 88,2% соответственно. Это расхождение можно объяснить тем, что пороговая чувствительность теста (400 нг/мл) делает невозможным определение низких концентраций амниотической жидкости во влагалищном секрете пациенток с сомнительным диагнозом (например, в случае небольшого разрыва).

Таким образом, значительный фоновый уровень содержания вагинального ЮЕВР-1 у женщин с неповрежденными оболочками и высокий пороговый уровень определения могут ухудшать чувствительность и специфичность способа и тем самым оказывать сильное влияние на точность теста для пациенток с сомнительным диагнозом. Примеси сыворотки крови и/или воспалительного экссудата также могут оказывать влияние на точность теста (см. выше данные Е. Эаг| и 8. Ьугеиак). Автор данного теста не исследовал этот его аспект.

С целью исключения некоторых из вышеуказанных недостатков использовали два моноклональных антитела для двух центров связывания инсулиноподобных факторов роста с целью обнаружения несвязанной фракции плацентарного щ-микроглобулина (патенты США 5968758; 5597700; 5891722; 5877029).

В этих патентах необоснованно допускается идентичность двух белков - несвязанных ΡΑΜΟ-1 и ЮЕВР-1. Фактически, такое допущение могло бы быть основано только на сравнении первичной структуры и генов этих белков.

В вышеуказанных патентах оказалось невозможным установить порог чувствительности такого теста, обеспечивающий максимально возможную степень точности (99% или более). Общей проблемой указанных тестов является фоновый уровень и непостоянство фоновой концентрации определяемого вещества. Так, например, фоновый уровень белка ΙΟΕΒΡ-1 во влагалищном секрете беременных женщин изменяется в широких пределах от 0,5 до 90 нг/мл (см. исследования К.и!аиеи). Вторым важным фактором является возможность присутствия примесей воспалительных экссудатов или сыворотки крови, содержащих определяемое вещество во влагалищном секрете. Это может приводить к получению ложноположительных результатов.

Белок ΡΑΜΟ-1 был впервые описан Д. Петруниным фейиши Э. е! а1., АкикйегаЩо ί Ошеко1од1а, 1977, №. 1, р. 64, на русском языке; см. также ΡΜΙΩ:65924 (ΡиЬΜеб-^ибеxеб £ог ΜΕΩΕΙΝΕ: 1ттииосйепнса1 ИеиЦЕсаДои о£ огдаи хресШс йитаи р1асеи!а1 а1рйа-д1оЬи1ш апб ίΐδ соисеи1га!юи ίη атшоОс Πιιίά. АкшФегЩ'о ί Ошеко1од1а, (^озсоЮ 1977 1аи, νο1. 1, р. 64)). Авторы получили антитела для очищенного и выделенного белка и с помощью иммунохимических методов определили содержание белка в амниотической жидкости (включая амниотическую жидкость, взятую из влагалища) на различных стадиях беременности. Определили также концентрацию белка в крови и различных органах плода и матери.

Указанная группа исследователей продолжала публиковать новые результаты изучения этого белка в последующие годы вплоть до 1990 г. (Ρе!^иη^и Э. е! а1., СотрагаЩе 8!ибу о£ Еоиг Ρ1асеиΐа1 Ρ^ο!е^и Эпг1ид Ое81айои, АкшйегаЩо ί Ошеко1од1а, 1988, №. 1, рр. 50-52; 2агащку, Е. е! а1., №рго§у Μеб. Кйетн, 1989, №. 5, рр. 131-132; Τа!а^^иον, Υ. е! а1., ИкрекЫ 8отг. Вю1одн аиб Μеб^с^ие, 1993 8ер; νο1. 116, №. 9, рр. 302-304 (все указанные работы опубликованы на русском языке с рефератами на английском языке). Д. Петрунин получил авторское свидетельство на способ выделения ΡΑΜΟ-1 (#8И-1614184 А1, приоритет 1988 г.).

В 1988-89 гг. было опубликовано несколько работ, описывающих частичную и полную последовательность сходных белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста (ΙΟΕΒΡ) и полученных из амниотической жидкости, плаценты и гепатомы женщин (Ве11 8. е! а1., 1988; БиОинаи Н. е! а1., 1989; 1и1кииеи е! а1., 1988; Бее, Υ. е! а1., 1988). Ген локализовали на участке 7р14-7р12 7-ой хромосомы человека. До 1991 г. исследователи использовали различные наименования для этого белка: «ι-ΡΕΟ, РР-12, ЮΕΒΡ, ΒΡ-25 и т.п.

В 1980-82 гг. Войи выделил белок из плаценты и назвал его РР-12. В своей работе он сравнил РР-12 с открытым ранее белком ΡΑΜΟ-1 и обсудил сходства и различия между ними.

Отличной от других исследований была работа авторов Ве11 е! а1. (1988 г.), которые обнаружили полиморфизм в Ν-концевом пептиде белка «ι-ΡΕΟ, а именно, в 11 и 12 позициях, и пришли к заключению о фактическом существовании не одного, а двух различных белков.

Позднее, 8. Ве11 снова сослался на свою работу, касающуюся двух различных белков σ.|-ΡΕΟ в амниотической жидкости. Эта работа признает решение Номенклатурного комитета от 1990 г. (Верой ои !йе №теис1а!иге о£ !йе ЮЕ Втбшд Ρ^ο!е^и8, 1оит. Сйи. Еибосг. Απ6 Μе!аЬο1. 1990, 70, #3, р. 817), который постановил, что белки ΑΕΒΡ, ΡΡ-12, «ι-ΡΕΟ, ОН-белок, связывающиеся белки 28, 26, 25, 1В-1 являются идентичными, и дал им всем общее наименование йЮΕΒΡ-1.

- 3 008194

Так называемый свободный РАМС-1 использовали для определения разрыва плодной оболочки. Однако, как указано выше, тест с высокой точностью (> 99%) не был разработан. Эта задача была решена позднее с помощью нашего нового способа и устройства, описанного в данной патентной заявке. Настоящее изобретение использует способ выбора пары моноклональных антител с целью обеспечения чувствительности, достаточной для определения очень низкой концентрации РАМС-1 во влагалищном секрете, а также использует выбор некоторых других анти-РАМС-1-антител, которые в сочетании с двумя вышеуказанными антителами позволяют точно установить предварительно заданный порог чувствительности для стрип-устройства. Это в свою очередь позволяет минимизировать частоту ложноположительных результатов теста.

Началом настоящего изобретения послужило новаторское исследование Д. Петрунина, который отделил и описал плацентарный альфа-микроглобулин и провел тщательное измерение его концентрации в амниотической жидкости, крови и некоторых тканях с помощью иммунохимических методов. Эта публикация является общественной собственностью, что следует принимать во внимание всем исследователям. Способ отделения РАМС-1 защищен официальным авторским свидетельством (#δϋ-1614184 А1, приоритет 1988 г.), которое являлось эквивалентом патента в бывшем СССР.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится к способу обнаружения малых количеств амниотической жидкости во влагалищном секрете в период беременности.

Настоящее изобретение относится также к способу определения содержания РАМС-1, превышающего минимальную фоновую концентрацию амниотического белка РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин и указывающего на присутствие амниотической жидкости.

В специфическом варианте реализации способа обнаружения белка РАМС-1 используют пару моноклональных антител, специально выбранных для определения минимальной фоновой концентрации белка РАМС-1 во влагалищном секрете. Эту пару антител используют в сочетании по меньшей мере с одним дополнительным моноклональным антителом против РАМС-1, чтобы точно устанавливать требуемую пороговую чувствительность теста.

Настоящее изобретение использует также сочетание антител, связывающих РАМС-1, в общем стрип-устройстве, чтобы обеспечить более точную установку порога чувствительности для способа обнаружения амниотического белка РАМС-1 во влагалищном секрете. Такой подход обеспечивает большую степень регулирования чувствительности и более широкий динамический диапазон, чем простое применение выбранной пары антител.

Наиболее подходящий порог чувствительности способа является близким к 5 нг/мл, поскольку верхний уровень РАМС-1 во влагалищном секрете, который может быть вызван воспалением, не превышает 3 нг/мл. С другой стороны, регулярный фоновый уровень РАМС-1 во влагалищном секрете здоровых беременных женщин составляет около 0,2 нг/мл. Существенный интервал между фоновым уровнем и пороговой концентрацией определяемого вещества минимизирует вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов. В одном из вариантов реализации первый этап распознавания амниотического РАМС-1 происходит в зоне прокладки стрип-устройства, куда помещают специально выбранное и меченое антитело. Второй этап реакции происходит в зоне анализа устройства в виде измерительного стержня, где иммобилизуют второе антитело из выбранной пары и предпочтительно по меньшей мере одно дополнительное антитело против РАМС-1.

В итоге, мы описываем способ и устройство для обнаружения малых концентраций амниотической жидкости во влагалище беременной женщины. Способ предпочтительно основан на выборе пары моноклональных антител антиплацентарного «ι-микроглобулина (РАМС-1). Первая задача выбора заключалась в том, чтобы обеспечить измерение минимальной фоновой концентрации РАМС-1 во влагалищном секрете. Имея эту информацию, можно использовать любой аналитический способ, способный определять содержание РАМС-1, превышающее пороговый уровень, чтобы детектировать амниотическую жидкость во влагалищном секрете. Пользуясь этой информацией, можно создать устройство, основанное на применении той же самой пары и дополнительных антител с целью снижения и точного установления пороговой чувствительности устройства и, соответственно, минимизации вероятности получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов.

Возможно применение различных комбинаций захватывающих (связывающих антиген) антител и их фрагментов или сочетаний других молекул, обладающих такими же свойствами, как указано в данном описании.

В одном из вариантов реализации способ согласно настоящему изобретению включает контактирование образца, содержащего белок РАМС-1, и моноклонального антитела, первого из выбранной пары, которое селективно связывает РАМС-1. Способ использует также антитело, которое образует комплекс антитело-РАМС-1, и включает стадию связывания комплекса антитело-РАМС-1 другим меченым моноклональным антителом из указанной пары. Кроме того, способ включает количественное измерение минимально низкой фоновой концентрации РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин, не имеющих разрыва плодных оболочек. Этот способ часто используют в категории тестов ЕЬИЗА (спхутс1шке6 1ттипо8ОтЬеп1 аккау - иммуносорбентный анализ с применением фиксированных ферментов).

- 4 008194

В другом варианте реализации настоящего изобретения в устройстве используют контакт образца, содержащего белок РАМС-1 и меченое моноклональное антитело, первое из выбранной пары, которое селективно связывает РАМС-1. Кроме того, используют антитело, которое образует комплекс антителоРАМС-1, создают растекание капли этого комплекса в радиальном направлении и выявляют комплекс антитело-РАМС-1 с помощью другого моноклонального антитела, распознающего РАМС-1, при этом порог чувствительности устройства устанавливают в диапазоне примерно 5-7 нг/мл с помощью дополнительных антител, что обеспечивает более высокую точность, чем использование только пары моноклональных антител, распознающих РАМС-1.

На прилагаемых чертежах представлены на фиг. 1 - схематический вид в продольном разрезе устройства согласно изобретению, которое можно использовать для обнаружения РАМС-1 с целью диагностики разрыва плодной оболочки;

на фиг. 2 - двумерное изображение устройства с фиг. 1.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение решает вышеуказанные задачи точного обнаружения присутствия амниотической жидкости во влагалищном секрете путем определения во влагалищном секрете очень низких концентраций плацентарного αι-микроглобулина. Достоинство данного подхода связано с низкой фоновой концентрацией РАМС-1 (около 0,2 нг/мл во влагалищном секрете беременных женщин). Важным фактором данного изобретения является выбор моноклонального антитела для обнаружения низкой концентрации белка, которое обеспечивает количественное определение этого параметра и, в свою очередь, позволяет применять любые аналитические методы для определения содержания РАМС-1. Во влагалищном секрете можно ожидать присутствия низкой концентрации РАМС-1, поскольку проницаемость капиллярной стенки для белков крови зависит от посттрансляционных модификаций белков и их взаимодействия с другими молекулами (Магшаго 1.А. е! а1.: О-д1усокбабоп бе1аук !Не с1еагапсе οί йишап 1СРЫпбшд рго1еш-6 Тгот !Не спси1а1юп; Еиг 1 Епбосппо1 2000, Мау; 142(5):512; 8сЬпееЬегдег Е.Е.: Рго!етк апб уекюи1аг !гапкрог! ш сарШагу епбо!11е1шт; Реб. Ргос 1983 Мау 15; 42(8):2419-24; М1кйа11 Κ.Ό. е! а1.: Уекю1е Тогтабоп апб ЩаТйсктд ш епбо1НеНа1 се11к апб геди1а1юп οί епбо!11ейа1 Ьатег Типсйоп; НМосНет Се11 Вю1 2002 РеЬ; 117(2):105-12; Эе1 УессЫо Р.1. е! а1.: Епбо!11ейа1 топо1ауег регшеаЬИНу !о тасгото1еси1ек; Реб. Ргос 1987 1ип; 46(8):2511-5; 8й1тдег-В1тЬо1т А. е! а1.: 8е1есбуИу оТ !Не епбо!11ейа1 топо1ауег: еТТес!к оп тсгеаке регтеаЬбйу; Мкгоуакс Век 1998 Ыоу; 36(3):216-27; СЫпеа Ν, Мбдгот ЕА пе\г Плпсбоп Тог !Не ЬН/СС гесер!ог: 1гапксу1ок1к оТ Ногтопе асгокк !Не епбо!ВеНа1 Ьатег ш !агде! огдапк; 8етш Вергобис! Меб 2001; 19(1):97-101). Среди молекул РАМС-1, которые подвергаются посттрансляционным модификациям или устанавливают нековалентную связь с другими молекулами, имеются такие, проникновение которых во влагалищный секрет является минимальным. Концентрация таких молекул во влагалищном секрете должна быть низкой, если отсутствует разрыв амниотического мешка. Гетерогенность молекул РАМС-1 также может быть результатом альтернативного сплайсинга. Ве11 е! а1. представили данные, касающиеся двух близких, но различных белков а_гРЕС в амниотической жидкости. αι-РЕС близок к РАМС-1. Низкое или высокое проникновение различных молекул в вагинальный секрет происходит вследствие селективной проницаемости капиллярных стенок и селективных секреторных процессов. Успешный иммунологический анализ требует обнаружения низкой фоновой концентрации молекул РАМС1 во влагалищном секрете.

Успешно выбрали пару моноклональных антител, пригодных для такого определения. Точные характеристики выявляемых молекул РАМС-1 оказались несущественными для целей настоящего изобретения за одним исключением: низкая концентрация этого белка во влагалищном секрете должна быть определена. Этот параметр является достаточным для установления порога чувствительности на низком уровне при поддержании значительного интервала между порогом чувствительности теста и фоновой концентрацией РАМС-1 во влагалищном секрете. Такой выбор оптимального порога чувствительности позволяет отфильтровывать потенциальные ложноотрицательные и ложноположительные результаты теста.

Моноклональные антитела (топос1опа1 апИЬоб1ек, МАЬ) по отношению к плацентарному а_гмикроглобулину исследовали на основании их реакции в системе МАЬ-РАМС-1-конъюгат другого МАЬ согласно настоящему изобретению (пример 4, табл. 6). Максимальный титр получили, используя пару М271-М52. Однако, используя пару МаЬ271-МАЬ52 и стандартную методику ЕЫ8А (епхуше-Нпкеб 1ттипокогЬеп! аккау - иммуносорбентный анализ с применением фиксированных ферментов), заявители не смогли обнаружить какую-либо концентрацию РАМС-1 во влагалищном секрете. Поэтому разработали специальную высокочувствительную методику ЕЫ8А для пары МАЬ271-МАЬ52 (пример 5, табл. 7) и использовали ее для измерения низких (в диапазоне пикограммов) концентраций РАМС-1 во влагалищных пробах (пример 6, табл. 8), а затем - в цервикальном и вагинальном секрете беременных женщин (пример 7, табл. 9). При анализе ЕЫ8А первый слой образовывался из высокоспецифичного МАЬ М271. Конъюгат пероксидазы хрена, содержащий МАЬ-М52, разбавили буфером, в котором отсутствовали ингибирующие агенты.

- 5 008194

Из примера 7, табл. 9 можно видеть, что концентрация РАМС-1 в цервикальном и вагинальном секрете беременных женщин, не имеющих осложнений беременности, составляла от 0,05 до 0,22 нг/мл. Из этих данных следует, что нормальная концентрация РАМС-1 (8 случаев) локализуется около некоторого постоянного уровня. Относительная стабильность содержания РАМС-1 как во влагалище, так и в шейке может служить показателем стабильности параметров метода и стандартизации способа отбора проб;

средний уровень нормальной концентрации РАМС-1 в цервикальном секрете составляет около 151 пг/мл, во влагалищном секрете - около 110 пг/мл;

в случае гестационной патологии, не связанной с нарушениями кровеносных сосудов (анемия, задержка развития плода), наблюдается уровень РАМС-1, также близкий к нормальному;

примесь крови сопровождается увеличением концентрации РАМС-1 в шейке, где наблюдался уровень 290 пг/мл в отличие от нормальной концентрации 151 пг/мл;

уровень РАМС-1 возрастает при наличии симптомов преждевременных родов и гистоза, что можно объяснить увеличением проницаемости плодных оболочек для белков;

при наличии подтекания амниотической жидкости уровень РАМС-1 резко возрастает (в 10-50 раз).

Как показано в приведенных ниже примерах, для дальнейшей разработки способа, устройства и аналитического набора выбрали пару моноклональных антител М271 и М52.

Таким образом, настоящее изобретение относится, в частности, к выбранной паре моноклональных антител, имеющих сродство к РАМС-1, биологическим составам, включающим антитела, имеющие сродство к РАМС-1, наборам для выявления РАМС-1 с помощью антител согласно настоящему изобретению и линиям клеток для получения антител согласно настоящему изобретению. Настоящее изобретение относится также к устройствам и способам определения содержания РАМС-1 и разрыва плодной оболочки на основании присутствия амниотической жидкости во влагалище, что показывает наличие РАМС-1 во влагалищном секрете.

В соответствии с приведенным далее более подробным описанием настоящее изобретение является, в частности, результатом исследования пары моноклональных антител, которые позволяют определять минимальную фоновую концентрацию РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин. Минимальная фоновая концентрация РАМС-1 во влагалищном секрете и его высокая концентрация в амниотической жидкости позволяют, во-первых, установить порог чувствительности устройства на низком уровне и тем самым выявлять очень малые количества амниотической жидкости во влагалищном секрете, и, во-вторых, позиционировать порог чувствительности устройства оптимальным образом, в частности, между типичным низким уровнем минимальной фоновой концентрации РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин, у которых отсутствует разрыв плодной оболочки, и высоким типичным уровнем РАМС-1 в амниотической жидкости. Дополнительные одно или несколько моноклональных антител против РАМС-1 позволяют более точно устанавливать порог чувствительности устройства на предварительно заданном уровне, например, для полуколичественного анализа. Кроме того, поскольку присутствие амниотической жидкости во влагалищном секрете является показателем разрыва плодной оболочки, определение обнаружение РАМС-1 во влагалищном секрете также можно использовать для определения разрыва плодной оболочки. Все это в сочетании позволяет минимизировать вероятность получения ложных результатов теста на определение РВОМ и РРВОМ.

Согласно настоящему изобретению антитела, специфичные для РАМС-1, можно использовать в составах материалов, наборах, устройствах и способах, применяемых для обнаружения РАМС-1, и, соответственно, определять разрыв плодной оболочки на основании присутствия РАМС-1 во влагалищном секрете.

Белок РАМС-1.

РАМС-1 представляет собой белок, присутствующий в сыворотке крови, амниотической жидкости и вагинальном секрете беременных женщин, а также в сыворотке крови всех людей. РАМС-1 присутствует в сыворотке крови небеременных (0-60 нг/мл) и беременных (5-120 нг/мл) женщин, при этом определяемая концентрация зависит от пары моноклональных антител, которые используют для его определения (пример 1, табл. 1, 2). Известно, что применение различных пар антител к одному и тому же белку может приводить к различным результатам измерения концентрации этого белка. Так, например, в аналогичном исследовании Οίαιηαηάί А. е! а1. (см. Οίαιηαηάί А. е! а1. 1ттииоа88ау о£ 1Нс 1п8и1т-Ь1ке Сго\\111 ЕасЮг-Вшбтд Рго1ет-3, 1оигпа1 о£ Сйшса1 Епбосгто1оду апб Ме1аЬо118т, 2000, 1ипе, Уо1. 85, Νο. 6, рр. 2327-2333) три варианта ЕБ18А показали три различных концентрации 1СЕВР-3, что П1атапб1 А. е! а1. объяснили способностью каждой пары антител выбирать специфическую посттрансляционную модификацию молекул белка. РАМС-1 имеет гораздо более высокую концентрацию в амниотической жидкости, чем в сыворотке (2000-75000 нг/мл).

РАМС-1 был выделен Д. Петруниным в 1977 г. из амниотической жидкости и вначале был определен как специфический альфа-1-глобулин плаценты (Ό. Ре!гпп1п. е! а1., 1ттипо1ощса1 ИепДЕсайоп о£ Огдап 8ресШс а1рйа-1 С1оЬи1т о£ Нитап Р1асеп!а апб Й8 Соп!еп! ίη !Не АтшоЕс Е1шб ίη Акизйегзко I Сшеко1од1уа, 1977, N 1, рр. 64-65, Мозсоте, и88В (см. пример 2).

- 6 008194

Аналогичный, но не идентичный белок, определенный как РР12 (плацентарный протеин 12), позднее выделили из плацентарной и плодной оболочек Бойл, е! а1. ('ТкоНегипд ипб Сйагак1епк1египд ешек №еиеп Р1асеп1акре/|Пксйеп Рго1ешк (РР12) ίη Агсй. Супесо1., 980, Уо1. 229, рр. 279-291). 8. Ве11, е! а1. сообщили о выделении эндометриального белка РЕС-1, отличного от РР12, в двух заместителях аминокислот (аминокислоты N 11, 12) в Ν-концевых пептидах 15 аминокислот (8. Ве11, е! а1., Атепсап 1ошпа1 о! Кергобисйуе 1ттипо1о§у, 1989, Уо1. 20, рр. 87-96).

Для дальнейшей характеризации белков, выделенных из амниотической жидкости, провели ряд измерений с целью определения молекулярной массы РАМС-1. Для определения молекулярной массы РАМС-1 использовали метод иммуноблоттинга и получили результат, равный 32 кД (килодальтон, кД единица измерения атомной массы) (Во11оуккауа, М. Ν. е! а1., Н1к1осйет1са1 апб С11шсо-О1адпок11с 81ибу о! 1йе Р1асеп1а1 А1рйа-М1сгод1ойи11п [РАМС-1] Икшд Мопос1опа1 Ап11йоб1ек, ш Ви11е1т о! Е.хрептеп1а1 Вю1о§у апб Мебюше, 1991, №о. 10, рр. 397-400). Позднее заявители предположили, что РАМС-1 относится к семейству белков 1СРВР (см. патент США 5968758).

РАМС-1 может присутствовать в различных изоформах, т.е. может подвергаться различным посттрансляционным модификациям. Антитела могут иметь различную специфичность по отношению к разным изоформам, и этот факт может быть использован в качестве достоинства в анализах согласно настоящему изобретению.

Антитела для РАМС-1.

Первоначально использовали антитела, моноспецифические для РАМС-1 (см., например, Та1агшоу, Υ. е1 а1. ш икрекй| 8оуг. Вю1одп, 1990, Уо1. 109, рр. 369-373). Позднее получили антитела, способные распознавать только те молекулы РАМС-1, которые не содержали 1СР-1 и 1СР-2 (патент США 5891722).

Термин антитело, используемый в данном описании, относится к любому белку, который обладает сродством к связыванию, как указанно в настоящей заявке, независимо от способа получения этого белка. Так, например, белок может представлять собой моноклональное антитело, его фрагмент или любую молекулу, обладающую специфичностью к связыванию, как указано в данной заявке.

Согласно изобретению полипептид РАМС-1, выделенный из жидкостей организма, полученный в результате рекомбинации или химического синтеза, и его фрагменты, другие производные или аналоги, включая белки слияния, можно использовать в качестве иммуногена для получения антител, которые распознают полипептид РАМС-1. Такие антитела включают поликлональные, моноспецифические, моноклональные, химерные, одноцепочечные, фрагменты Рай и библиотеку экспрессии Рай, но не ограничиваются ими. Антитела против РАМС-1 согласно изобретению могут обладать перекрестной реактивностью, например, они могут распознавать РАМС-1 у различных биологических видов. Поликлональные антитела имеют более высокую вероятность перекрестной реактивности. В альтернативном варианте антитело согласно изобретению может быть специфичным к какой-либо одной форме РАМС-1. Предпочтительно такое антитело является специфичным по РАМС-1 человека.

Различные способы, известные специалистам, можно использовать для получения поликлональных антител для полипептида РАМС-1, а также их производных или аналогов. Для получения антитела можно произвести иммунизацию различных животных-хозяев путем инъекции полипептида РАМС-1 или его производного (например, фрагмента или белка слияния). Такими животными могут быть, в частности, но без ограничения, кролики, мыши, крысы, овцы, козы и т.п. В одном из вариантов реализации полипептид РАМС-1 или его фрагмент может быть конъюгирован с иммуногенетическим носителем, например, с альбумином бычьей сыворотки (йоуше кегит а1йитт, В8А) или с гемоцианином лимфы улитки (кеуйо1е йтре! йетосуашп, КЬН). Для повышения иммунологической реакции можно использовать различные адъюванты в зависимости от биологического вида хозяина, включая, в частности, но без ограничения адъювант Фрейнда (полный и неполный), минеральные гели, в частности, гидроксид алюминия, поверхностно-активные вещества, в частности, лизолецитин, плюрониловые многоатомные спирты, полианионы, пептиды, масляные эмульсии, гемоцианин лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные адъюванты человека, в частности, бациллы Кальметта-Герена (йасШе Са1тейе-Сиепп, ВСС) и Согупейас1егшт рагуцт.

Для получения моноклональных антител к полипептиду РАМС-1 или их фрагментов, аналогов или производных можно использовать любые способы, которые обеспечивают продуцирование молекул антител непрерывными клеточными линиями в культуре. Эти способы включают, в частности, но без ограничения, способ гибридомы, первоначально разработанный Кой1ег и М11к1еш (№а1иге 1975, 265:495-497), а также способ триомы, способ гибридомы В-клеток человека (Кохйог е! а1., 1ттипо1оду Тобау 1983, 4:72; Со1е е1 а1., Ргос. №11. Асаб. 8сг И8А 1983, 80:2026-2030) и способ гибридомы ЕВУ (Ерк1ет-Вагг У1гик, вирус Эпштейна-Барра) для получения моноклональных антител человека (Со1е е1 а1., ш Мопос1опа1 Ап11йоб1ек апб Сапсег 1йегару, А1ап К. Ыкк, 1пс., рр. 77-96, 1985). В другом варианте реализации изобретения моноклональные антитела можно получить у стерильных животных (1п1егпа1юпа1 РиЫюайоп №о. \νϋ 89/12690, опубликована 28 декабря 1989 г.). Согласно изобретению можно использовать способы, разработанные для получения химерных антител (Моткоп е1 а1., 1. Вас1епо1. 1984, 159:870; №еийегдег е1 а1., №а1иге 1984, 312:604-608; Такеба е1 а1., 1985, №а1иге 314:452-454) путем соединения генов молекулы антитела мыши, специфичного к полипептиду РАМС-1, вместе с генами молекулы антитела чело

- 7 008194 века с соответствующей биологической активностью; такие антитела включены в область распространения настоящего изобретения. Указанные человеческие или гуманизированные химерные антитела являются предпочтительными для применения в терапии заболеваний и нарушений организма человека (описанных ниже), поскольку сами человеческие или гуманизированные антитела с гораздо меньшей вероятностью, чем ксеногенные антитела, индуцируют иммунную реакцию, в частности, аллергическую реакцию.

Согласно изобретению способы, описанные для получения одноцепочечных антител (патенты США №№ 5476786 и 5132405, ΗοιΜοη; патент США 4946778), можно адаптировать для получения одноцепочечных антител, специфических для полипептида РАМС-1. Эти гены действительно могут быть доставлены для экспрессии ίη νίνο. Другой вариант реализации изобретения использует способы, описанные для построения библиотек экспрессии РаЬ (Нике е1 а1., 8с1Спсс 1989, 246:1275-1281), чтобы обеспечить быструю и простую идентификацию моноклональных фрагментов РаЬ с желательной специфичностью для полипептида РАМС-1, или его производных, или аналогов.

Фрагменты антитела, которые содержат идиотип молекулы антитела, можно получить известными способами. Так, например, указанные фрагменты включают, в частности, но без ограничения, фрагмент Р(аЬ)2, который можно получить путем расщепления пепсином молекулы антитела; фрагменты РаЬ, которые можно получить путем восстановления дисульфидных мостиков фрагмента Р(аЬ)2, и фрагменты РаЬ, которые можно получить путем обработки молекулы антитела папаином и восстанавливающим агентом.

При получении антител скрининг желаемого антитела можно выполнить способами, известными специалистам, например, с помощью радиоиммунологического анализа, ЕБ18А (иммуносорбентного анализа с применением фиксированных ферментов), послойного иммунологического анализа, иммунорадиометрического анализа, реакций преципитации с диффузией геля, иммунодиффузионного анализа, иммунологического анализа ίη κίΐιι (например, с помощью коллоидного золота, ферментов или радиоизотопных меток), вестерн-блоттинга, реакций преципитации, реакций агглютинации, (например, реакций агглютинации геля, реакций гемагглютинации), реакций связывания комплемента, иммунофлуоресцентных реакций, реакций протеина А, иммуноэлектрофорезных реакций и т.д. В одном из вариантов реализации связывание антитела определяют по выявлению метки первичного антитела. В другом варианте реализации первичное антитело выявляют путем связывания вторичного антитела или реагента с первичным антителом. В следующем варианте реализации метят вторичное антитело. Множество известных специалистам средств определения связывания в иммунологическом анализе включается в область распространения настоящего изобретения. Так, например, для выбора антител, которые распознают специфический эпитоп полипептида РАМС-1, можно проанализировать образующиеся гибридомы для продукта, связывающего фрагмент полипептида РАМС-1, содержащего указанный эпитоп. Для выбора антитела, специфического для полипептида РАМС-1 у конкретного вида животного, можно исходить из положительного связывания с полипептидом РАМС-1, экспрессированным или выделенным из клеток указанного вида животного.

Специфичные антитела согласно настоящему изобретению.

Линии клеток гибридомы согласно настоящему изобретению получают следующим способом. Вначале мышей, имеющих В-клетки селезенки и лимфатических узлов, подвергают иммунизации РАМС-1. Затем получают гибридомы для иммортализации В-клеток. В-клетки могут представлять собой В-клетки селезенки и/или лимфатических узлов. Эти гибридомы, вырабатывающие моноклональное антитело, которое обладает сродством к связыванию с РАМС-1, затем идентифицируют с помощью ЕЫ8А: первый слой - РАМС-1; второй слой - гибридомная надосадочная жидкость, и третий слой - конъюгат кроличьих антимышиных антител, меченых пероксидазой хрена. После этого указанные идентифицированные гибридомы культивируют в искусственных условиях или в асците и выделяют моноклональные антитела, которые они вырабатывают. В специфическом варианте реализации антитела получают из гибридом N52, N271 и N42, хранящихся в Российской национальной коллекции Банка производственных микроорганизмов с инвентарными номерами ВКПМ Н-92, ВКПМ Н-93 и ВКПМ Н-94 соответственно.

Составы согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к серии составов, которые содержат два или несколько антител согласно настоящему изобретению. В одном из вариантов реализации состав содержит пару антител и детектируемый (выявляемый) маркер, присоединенный к одному из антител указанной пары. При этом можно использовать множество детектируемых маркеров, включая, но без ограничения, окрашенные частицы, ферменты, флуоресцентные красители и радиоактивные изотопы. Одним из примеров детектируемого маркера являются окрашенные частицы золота, имеющие средний размер в пределах от 20 до 30 нм. Другим примером детектируемого маркера является перокисдаза хрена. Способы присоединения детектируемого маркера к антителу описаны, например, в Ме1йобк Ιη Εηζνιηοίοβν. 1981, νο1. 73, рр. 3-46, Наг^у, Е., апб Тале, Ό.; 'ΑηΛοάκδ а Ьа^гаЮгу МапиаГ', Οοίά 8ргшд ΗπιΓογ ^аЬο^аΐο^у, 1988, рр. 322, 323, 343; Р|егсе Ρπίπίοβ, рр. Т9-Т17 (1996). Пригодные ферменты включают, в частности, но без ограничения, щелочную фосфатазу и перокисдазу хрена. Другие маркеры или метки для применения согласно изобретению включают коллоидное золото, окрашенные латексные гранулы, магнитные гранулы,

- 8 008194 флуоресцентные метки (например, флуоресцеин изотиоцианат, МТС), фикоэритрин (РЕ), техасовый красный (ТВ), родамин, свободные или хелатные соли лантаноидов, в особенности Еи3+, некоторые флуорофоры, хемилюминисцентные молекулы, радиоизотопы (1251, 32Р, 358, хелатный Тс и т.д.) или метки для магнитно-резонансной визуализации. Другие маркеры включают гашение флуоресценции (с.|сиисЫид) и флуоресцентные трансфертные маркеры (Пиогексеисе ДаикГег), используемые, например, в гомогенных и твердофазных анализах. Кроме того, в соответствии с изобретением маркер может представлять собой эпитоп, «партнер» связывания, или обеспечивать взаимодействие с другой молекулой, в частности, с биотинстрептавидином, глутатионом-С8Т, гексагистидином никеля и т.п. Изобретение включает также применение вторичных антител, которые сами являются детектиуемыми метками и служат в качестве маркеров (например, в тех случаях, когда в паре анти-РМАС-1 антител используют антитела, содержащие части Ес от двух различных видов животных).

В другом варианте реализации настоящего изобретения состав может включать два или несколько моноклональных антител, локализованных в зоне анализа стрип-устройства согласно изобретению.

Аналитические наборы согласно настоящему изобретению.

Настоящее изобретение относится также к аналитическим наборам для обнаружения РАМС-1. В одном из вариантов реализации аналитический набор включает пару антител согласно изобретению, одно из которых является высокоспецифичным по отношению к РАМС-1. В одном варианте набора одно из двух антител содержит детектируемый маркер, присоединенный к антителу. В другом варианте набора одно из двух антител выбранной пары присоединяют к твердой подложке. В этом варианте мобилизуемое антитело из выбранной пары содержит детектируемый маркер. В следующем варианте реализации состав содержит три или более моноклональных антител, одно из которых является мобилизуемым и детектируемым. Такая комбинация позволяет регулировать порог чувствительности иммунохроматографического анализа.

В одном из вариантов реализации изобретения анти-РАМС-1 антитело с максимальным сродством к связыванию является мобилизуемым и помещается в зону прокладки устройства с целью обеспечения начального контакта с образцом. Другое антитело помещают в зону анализа устройства. В альтернативном исполнении другие моноклональные антитела с высоким сродством к связыванию РАМС-1, хотя и меньшим, чем максимальное сродство к связыванию, можно получить в приготовить различных комбинациях для иммобилизации в зоне анализа устройства, чтобы установить или настроить предварительно определенный порог чувствительности устройства согласно изобретению. Это можно выполнить с помощью стандартных экспериментов, как показано в примере 11. Различные сочетания антител обеспечивают различные уровни порогового обнаружения сигнала в устройстве согласно настоящему изобретению согласно имеющимся требованиям.

Способы и устройства для определения РАМС-1.

Настоящее изобретение устанавливает, что РАМС-1, в частности, РАМС-1, присутствующий в амниотической жидкости в гораздо большем количестве, чем в нормальной влагалищной жидкости, является полезным аналитом для определения разрыва плодной оболочки, который приводит к проникновению амниотической жидкости во влагалище. Иными словами, он позволяет диагностировать преждевременный разрыв оболочек, т.е. амниотического мешка. Изобретение устанавливает также пороговые значения для обнаружения РАМС-1 при нормальных условиях, различных симптомах вагинита и истинном разрыве оболочки. Идентифицировав аналит и относительные уровни содержания, указывающие на разрыв оболочки, специалист в данной области может успешно использовать любой известный аналитический способ для определения содержания белков, чтобы установить, имеет ли место преждевременный разрыв плодной оболочки у пациентки.

Иммунологический анализ, в частности иммунохроматографический анализ, является предпочтительным способом согласно изобретению. Методика иммунологического анализа подробно описана далее. Достоинствами этого анализа являются специфичность, точность, быстрота выполнения и экономичность.

Изобретение может использовать также другие способы обнаружения и количественного определения РАМС-1, хотя указанные способы могут потребовать применения дорогостоящего оборудования и ограничить параметры анализа имеющимися лабораторными настройками оборудования. Одним из таких способов является масс-спектрометрия, например, применение времяпролетной (ТОЕ) массспектрометрии (М8) с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы (МАЕИ1) с задержанной экстракцией и рефлектроном во времяпролетной камере. Анализ МАЬИ1 предпочтительно проводят на кремниевых матрицах. Примером матрицы для МАЕИ1 являются круглые гелевые прокладки размером 200 мкм, располагаемые на центрированных подложках из окисленного кремния размером 350 мкм. Гидрофобная (водоотталкивающая) поверхность между гелевыми прокладками обеспечивает получение более фокусированной матрицы/белковой точки для МАЬИ1, что повышает сигнал для количественного определения. Так, например, точки, образующиеся с помощью системы Раскатб Вюкшеисе, могут иметь диаметр менее 200 мкм. Система Р|ехо позволяет доставлять матрицу МАЬИ1 величиной около 300 пл (например, ИНВ, синапиновая кислота) в точную позицию местоположения агента, имеющего сродство к связыванию, и пептида, чтобы создать однородный пептидно-матричный кристалл. Десорб

- 9 008194 ция/ионизация (Кагаз е1 а1., Ιοη Ргосеззез, 1987, ν. 78, рр. 5-68 ог Ζβηοϋί е1 а1. Мазз 8рес1гот. Веу. 1998, ν. 17, рр. 337-366) из этого кристалла в МАЕЭ1-М8 (например, РегзерИуе Уоуадег) образует масс-спектр, в котором высота пептидного пика связана с количеством белка, содержащего указанный пептид.

Альтернативным способом применения настоящего изобретения является капиллярная электрофоретическая хроматография, которая позволяет количественно определять аналит, присутствующий в образце в малых концентрациях.

Кроме того, можно использовать количественные биохимические методы анализа, в частности, электрофорез на полиакриламидном геле, жидкостную хроматографию высокого разрешения и т.п., отдельно или в сочетании, чтобы выявить и количественно определить содержание РАМС-1 в образце.

Иммунологические методы и устройства обнаружения РАМС-1.

Различные средства обнаружения иммуноспецифического связывания антитела с антигеном, известные специалистам, могут быть использованы для обнаружения связывания согласно настоящему изобретению. Давно применяемый способ обнаружения взаимодействия между антигеном и антителом с помощью анализа комплекса заключается в осаждении на гелях. Другой способ определения связывания пары аналит-идентифицирующее антитело включает применение меченных радиоактивным йодом идентифицирующих антител или меченного радиоактивным йодом белка, реагирующего с 1дС, в частности, протеина А. Эти традиционные способы хорошо известны специалистам и описаны, в частности, в работе Ме1йобз ίη Епхуто1о§у. 1980, ν. 70, рр. 166-198. Выбрав антитело и условия получения положительного результата над пороговыми значениями для РВОМ, указанные в настоящем описании, можно использовать эти способы при реализации данного изобретения.

Разработанные позднее способы определения аналита с помощью только одного антитела включают анализ конкурентного связывания. При этом на антитело, которое обычно иммобилизуют на твердой подложке, взаимодействует с образцом, в котором предполагается присутствие аналита, вместе с известным количеством меченого аналита. Два аналита, а именно, меченый аналит и аналит, присутствующий в образце, конкурируют за центр связывания антитела. Определение свободного меченого аналита или связанного меченого аналита позволяет установить содержание конкурирующего аналита в образце. Более подробное описание этого способа приведено в Вазю Ргтар1ез о! Апйдеп-АпйЬобу Веасйоп, ΕΙνίη А. ЬаЬа1, (Ме1йобз ίη Епгуто1оду, 70, 3-70, 1980). В этом примере меченый аналит может быть помечен радиоактивным изотопом или ферментной меткой.

Более современные методы иммунологического анализа используют способ двойного антитела для определения присутствия аналита. Эти способы также описаны в вышеуказанной работе Ме1йобз ίη Епхуто1оду. Согласно одному из вариантов реализации настоящего изобретения присутствие отдельных маркеров определяют с помощью пары антител, специфических для каждого определяемого маркера. Одно из антител указанной пары называют идентифицирующим антителом, а другое иммобилизованным антителом. Один из вариантов реализации настоящего изобретения использует послойный метод с двумя антителами для определения РАМС-1 в образце вагинальной жидкости. В этом методе аналит помещают между идентифицирующим антителом и иммобилизованным антителом, при этом иммобилизованное антитело необратимо иммобилизуют на твердой подложке. Идентифицирующее антитело содержит детектируемую метку, которая позволяет определять присутствие слоистой структуры антитело-аналит и тем самым - присутствие аналита.

Традиционно применяемые формы твердых подложек включают пластины, трубки или гранулы, все из которых хорошо известны специалистам в области радиоиммунологического анализа и ферментного иммунологического анализа. Позднее в качестве твердых подложек стали применять ряд пористых материалов, в частности нейлон, нитроцеллюлозу, ацетат целлюлозы, стекловолокно и другие пористые полимеры.

В одном специфическом варианте реализации устройство согласно изобретению содержит средство для проведения иммунохроматографического анализа (устройство для иммунохроматографического анализа). Такое устройство содержит твердофазное средство для пропускания жидкости. Термин твердофазное средство для пропускания жидкости, используемый в данном описании, относится к твердотельной подложке, через которую может мигрировать жидкость, например, за счет капиллярного механизма. Типичным продуктом такой природы является нитроцеллюлозная мембрана, которую можно получить способами, известными специалистам.

Многие средства и способы иммунохроматографического анализа известны специалистам и могут быть использованы при реализации настоящего изобретения. Средства для иммунографического анализа, использующие мембрану в качестве твердой подложки в устройстве в виде измерительного стержня, или в проточном устройстве, хорошо приспособлены для применения в клинической лаборатории и в альтернативных, т.е. в нелабораторных условиях эксплуатации. Устройство для иммунохроматографического анализа обычно представляет собой мембрану (целлюлозную или нецеллюлозную), установленную в пластмассовом держателе. Пластмассовый держатель фиксирует мембрану соответствующей конфигурации, чтобы обеспечить правильное функционирование всего устройства. Существует множество видоизменений базовой конструкции аналитических устройств. Так, например, Ьйтап е1 а1. (патенты США №№ 5156952 и 5030558) описывают способ анализа и устройство для определения присутствия мини

- 10 008194 мальных количеств аналита в образце. и11тап е! а1. (патенты США №№ 5137808 и 4857453) описывают устройство, содержащее аналитическую мембрану с замкнутой системой жидких реагентов, которая обеспечивает протекание образца. Иайотп е! а1. (патент США № 4981768) описывают устройство с каналами для подачи образца и дополнительной жидкости. СогЦ е! а1. (европейская патентная заявка № 89118378.2) СгеепсщМ е! а1. (патент США № 4806312) и Вегдег е! а1. (патент США № 5114673) также описывают аналитические устройства.

Устройство для иммунохроматографического анализа предпочтительно включает контрольное средство, указывающее на правильность проведения анализа. Контрольное средство может представлять собой специфичный связывающий реагент, который нанесен в точке, более удаленной от точки нанесения образца на твердотельную подложку, чем зона анализа, и который связывается с меченым реагентом в присутствии или при отсутствии аналита, указывая при этом, что мобилизуемый рецептор вместе с жидким образцом мигрировал на достаточное расстояние, чтобы дать значимый результат.

Метки, пригодные для применения в иммунохроматографическом анализе, включают ферменты, флуорофоры, хромофоры, радиоизотопы, красители, коллоидное золото, коллоидный уголь, латексные частицы и хемилюминисцентные агенты. При использовании контрольного маркера можно применять одни и те же или различные метки для рецептора и контрольного маркера.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения для проведения иммунологического анализа используют устройство проточного типа.

Уа1кЙ5 е! а1. (патент США № 4632901) описывают устройство, содержащее антитело, специфичное для антигенного аналита и связанное с пористой мембраной или фильтром, на которые наносят жидкий образец. При протекании жидкости через мембрану определяемый аналит связывается с антителом. Введение образца производят после введения меченого антитела. Визуальное определение меченого антитела указывает на присутствие в образце определяемого аналита.

Другой пример проточного устройства предложили Кготег е! а1. (ЕР-Р 0229359), которые описывают систему доставки реагента, содержащую матрицу, насыщенную реагентом или его компонентами, диспергированными в водорастворимом полимере, для регулирования скорости растворения реагента и его доставки в реакционную матрицу, расположенную под насыщенной матрицей.

В анализах миграционного типа твердотельную подложку, например, мембрану, пропитывают реагентами, необходимыми для проведения анализа. Создают тестовую зону выявления аналита, в которой связывается меченый аналит, и производят считывание результатов анализа. В частности, см. Тот е! а1. (патент США № 4366241) и 2ик (ЕР-А 0143574). Устройства для проведения миграционного анализа обычно содержат реагенты, присоединенные к окрашенным меткам, в частности к коллоидному золоту или углероду, что позволяет визуально получать результаты анализа без добавления дополнительных веществ. См., например, Ветп^еш (патент США № 4770853), Мау е! а1. (\УО 88/08534) и СЫид е! а1. (ЕРА 0299428). Все эти известные типы проточных устройств могут быть использованы согласно настоящему изобретению.

Одним из примеров меток, которые могут быть использованы в иммунохроматографических анализах согласно настоящему изобретению, являются прямые метки. Прямая метка определяется как компонент, который легко виден в естественном состоянии невооруженным глазом или с помощью оптического фильтра и/или применения стимуляции, например, ультрафиолетовым излучением, для создания флуоресценции. Примеры окрашенных меток, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, включают металлические зольные частицы, например зольные частицы золота, описанные, в частности, Ьеиуеттд (патент США № 4313734), зольные частицы красителей, описанные, в частности, СпЬпаи е! а1. (патент США № 4373932) и Мау е! а1. (\УО 88/08534), окрашенный латекс, описанный, в частности, Мау, см. выше, 8иубет (ЕР-А 0280559 и 0281327) или красители, инкапсулированные в липосомы, описанные СатрЬе11 е! а1. (патент США № 4703017). Другие прямые метки включают радионуклиды, флуоресцентные соединения или люминесцентные соединения. Кроме указанных прямых меток согласно настоящему изобретению могут быть использованы также косвенные метки, содержащие ферменты. Различные типы иммунологических анализов со связанными ферментами хорошо известны специалистам, например, щелочная фосфатаза и пероксидаза хрена, лизоцим, глюкоза-6фосфатдегидрогеназа, лактатдегидрогеназа, уреаза и другие соединения подробно рассмотрены Еуа Епдуа11 в работе Епхуше 1ттипоа88ау ЕЫ8А апб ЕМ1Т ш МеШобк т Епхуто1оду. 70,419-439,1980 и патенте США № 4857453.

В специфическом варианте реализации диагностическое устройство согласно настоящему изобретению содержит мембранный блок, в котором зона идентификации расположена вблизи точки введения образца, а зона захвата удалена вниз по течению потока от этой позиции. Зона идентификации содержит антитела (идентифицирующие антитела), которые реагируют с аналитами согласно настоящему изобретению, присутствующими в образце. Идентифицирующие антитела обратимо иммобилизованы на мембране и мигрируют с образцом в процессе применения. Предпочтительно, хотя и не обязательно, чтобы идентифицирующие антитела были мечеными, например, радионуклидами, ферментами, флуоресцентными соединениями, люминесцентным соединением или окрашенными метками, описанными, в частно

- 11 008194 сти, в прототипах и рассмотренными выше. Например, можно использовать реактивную метку, с которой антитело имеет золотистый цвет до захвата антигена и меняет его на фиолетовый цвет после захвата.

Зона захвата, которая, как указано выше, расположена ниже по течению потока от зоны идентификации, содержит захватывающие антитела, необратимо иммобилизованные на твердой подложке, при этом все антитела иммобилизованы в различных позициях зоны захвата. Антитела и необходимые реагенты иммобилизованы на твердой подложке известными стандартными способами, рассмотренными выше при описании устройств проточного типа для проведения иммунологического анализа. В общем случае антитела абсорбируются на твердотельных подложках в результате гидрофобного взаимодействия между неполярными белковыми субструктурами и неполярным материалом матрицы подложки.

Особым достоинством способов иммунохроматографического анализа согласно настоящему изобретению является возможность получения количественных результатов. Зона захвата может содержать, соответственно, смесь иммобилизованных антител, специфических для РАМО-1, при этом сигнал вырабатывается только в том случае, если содержание РАМО-1 в образце превышает желаемый порог обнаружения.

Кроме того, настоящее изобретение предполагает использование однородных способов иммунологического анализа. Один из примеров такого конкурентного однородного способа приведен в патенте США № 3817837, КиЬеп81ет и и11тап, где описан способ, в котором лиганд и ферментсвязанный лиганд конкурируют в занятии центров связывания антитела. Поскольку связывание антитела с ферментсвязанным лигандом изменяет активность фермента, концентрацию присутствующего лиганда можно определять, измеряя скорость, с которой смесь превращает субстрат в продукт. Таким образом, в однородном методе способность детекции метки существенно отличается в зависимости от связанного или несвязанного состояния метки. В связанном состоянии метка дает большую или меньшую интенсивность сигнала. Обычно связывание антитела с меченым лигандом вызывает уменьшение интенсивности сигнала, например, в том случае, если метка является ферментом. Типичные продукты данной категории включают линейку наборов ЕМ1Т для иммуноферментных анализов производства 8ууа Сотрапу и линейку ΤΌΧ для флуоресцентных поляризационных иммунологических анализов производства АЬЬо! Όίадпо811С8. Особенно однородный анализ можно провести при нанесении всех аналитов на гранулы. В этом случае при введении образца гранулы перемешивают, осаждают и анализируют.

Другие примеры устройств для биологической диагностики, которые можно использовать согласно настоящему изобретению, включают устройства, описанные О. Огеппег, Р.В. П1адпо8ЙС8 8у§1ет5, 1пс., в патентах США №№ 4906439 и 4918025. Устройство, описанное в патенте Огеппег '439, содержит диагностический тестовый элемент и блок ввода образца, включающий элемент подачи жидкости, который имеет слой со множеством канавок для подачи образца в тестовый элемент. Патент Огеппег '025 относится к устройству, содержащему средство для ввода образца, в частности, мембрану, рядом с которой расположен капилляр со связанным реактивом и резервуар для жидких отходов. Выделение связанного реагента из капилляра завершает реакцию после осаждения образца, а избыточная жидкость сохраняется в резервуаре для отходов, таким образом, устройство является автономным.

Измерение с применением мембраны является предпочтительным, однако, следует понимать, что другие способы и соответствующие сенсорные устройства могут быть также использованы аналогично описанным выше. В настоящее время существуют автоматические анализаторы, которые могут производить анализ нескольких образцов одновременно. Такие автоматические анализаторы включают приборы непрерывного действия/приборы с произвольной выборкой. Примеры указанных систем включают ОРИ8^ТМ производства РВ П1адпо811С 8у§1ет, 1пс. и 1МХ^ТМ Апа1ухег производства АЬЬой ЬаЬогаЮпех о£ Ыог!й СЫсадо, 111., 1988 г. В общем случае образец анализируемой жидкости вводят в приемную емкость, после чего все операции процесса, включая закапывание образца из пипетки в тестовый элемент, инкубацию и считывание полученного сигнала, выполняются автоматически. Системы автоматического анализа обычно включают ряд рабочих позиций, каждая из которых выполняет одну из операций процедуры анализа. Тестовый элемент может перемещаться с одной рабочей позиции на другую различными средствами, например, с помощью барабана или передвижного штатива, чтобы обеспечить последовательное выполнение операций анализа. Тестовые элементы могут включать также резервуары для хранения реагентов, смешивания жидкостей, разбавления образцов и т.п. Кроме того, тестовые элементы могут содержать отверстие для нанесения на пористое тело предварительно определенного количества жидкого образца и в случае необходимости - другого требуемого реагента. Тестовый элемент может также содержать окно для считывания сигнала, получаемого в результате аналитической операции и обычно представляющего собой флуоресцентное или калориметрическое изменение реагентов, присутствующих на пористом теле, например, с помощью спектроскопа или флуориметра, включенных в аналитическую систему. Приборы для автоматического анализа производства РВ П1адпо811С 8у§1ет, 1пс. описаны в патентах США №№ 5051237; 5141871 и 5147609.

Следующим классом систем для иммунохимического анализа, которые можно использовать для реализации настоящего изобретения, являются биосенсорные или иммуносенсорные оптические системы. В общем случае оптический биосенсор представляет собой устройство, которое использует оптические принципы для количественного анализа определяемого компонента с помощью преобразования его

- 12 008194 химической или биохимической концентрации или активности в электрические сигналы. Такие системы можно разделить на четыре основные категории: устройства, измеряющие отражение, устройства поверхностного плазменного резонанса, оптоволоконные устройства и устройства интегральной оптики. Устройства, измеряющие отражение, включают эллипсометрию, спектроскопию отражения с многократным интегрированием, флуоресцентные капилляродиффузионные системы. Оптоволоконные устройства включают флуоресценцию рассеянных полей, оптоволоконные капиллярные трубки и оптоволоконные флуоресцентные сенсоры. Устройства интегральной оптики включают флуоресценцию планарных рассеянных полей, иммуносенсоры с входным дифференцирующим устройством связи, интерферометр МахаЦендера, интерферометр Хартмана и дифференциальные интерферометрические сенсоры. Голографическое определение реакций связывания осуществляют по присутствию голографического изображения, которое формируется с предварительно заданной ориентацией, когда один реагент из связывающей пары связывается с иммобилизованным вторым реагентом этой пары (см. патент США № 5352582, выданный 4 октября 1994 г. Ыс1еп\та11ег е1 а1.). Общее описание примеров оптических иммуносенсоров приведено в обзорной статье О.А. КоЫпк (Абуаисек ίη Вюкепкотк), νοί. 1, рр. 229-256, 1991. Более подробное описание этих устройств можно найти, например, в патентах США №№ 4810658; 4978503 и 5186897; К.А. Вгабу е1 а1. (РЫ1. Тгапк. К. Зос. Ьапб. В 316, 143-160, 1987) и О.А. КоЫпкоп е1 а1. (ίη Зепкогк апб Ас1иа1отк, Е1ке\аег. 1992).

Способы и соответствующие аналитические наборы согласно настоящему изобретению можно использовать в различных оптических измерительных системах. В частности, в то время как аналитические наборы и материалы согласно настоящему изобретению можно применять в способе иммунологического анализа, такой способ можно реализовать в различных оптоэлектронных аналитических системах. При этом известно множество оптических иммуносенсорных систем, которые могут быть использованы для практической реализации настоящего изобретения. Так, например, устройства и способы, в частности, отражательные способы, поверхностный плазменный резонанс, оптоволоконные волноводные способы устройства интегральной оптики могут быть адоптированы и специально конфигурированы для определения и отображения результатов анализа биологических проб пациенток в соответствии со способом согласно настоящему изобретению. Особые способы отражения, в частности, измерение коэффициента отражения и эллипсометрия, а также специфическое применение оптических волокон, оптических волноводов, флуоресцентных капилляродиффузионных систем и интегральных оптических биосенсоров, представляют собой некоторые варианты способов и оборудования, которые также могут быть использованы. Общий обзор этих устройств можно найти в работе КоЫпкоп, О.А., Орйса1 1ттипокепкогк: Ап Оνе^ν^е^, А^апсек ш Вюкепкотк, νο1. 1, рр. 229-256 (1991).

Более конкретно, эллипсометрия основана на направлении луча поляризованного света вначале к базовой поверхности (стандарту), а затем - к поверхности образца с последующим сравнением природы и величины полученных отражений. В частности, связывание аналита с молекулами рецептора измеряется как изменение толщины поверхности относительно базовой поверхности.

В случае спектроскопии внутреннего отражения лиганд и его рецептор могут быть, например, ковалентно иммобилизованы на оптической поверхности планарного волновода из плавленого кварца, после чего луч света может быть внутренне отражен в волноводе и направлен в раствор, расположенный рядом с волноводом. При этом можно измерять разность хода преломленных лучей от стандарта и образца. В этом особом способе можно использовать флуоресцентную метку и произвести измерения флуоресценции, чтобы определить имеющуюся степень связывания.

В другом способе используют устройства, известные как флуоресцентные капилляродиффузионные системы. В этой системе две стеклянные пластины устанавливают на расстоянии, равном размеру капилляра. Рецепторные молекулы могут быть иммобилизованы на базовой пластине, которая служит также в качестве оптического волновода. Можно произвести конкурентный или послойный анализ, использующий мечение Е1Т8 (Пиотексеш 1ко1Ыосуапа1е, флуоресцинизотиоционат), а индуцированную флуоресценцию соединить в волноводе с сигналом от связанного источника, противоположным сигналу от несвязанных источников. Такой сигнал выделяется по его угловой расходимости после выхода из волновода. Разработаны также устройства поверхностного плазменного резонанса (ЗитГасе Р1актоп Кекопапсе, ЗРК), которые действуют, реагируя на связывание света, падающего на тонкую металлическую пленку, в поверхностных модах, связанных с коллективными электронными осцилляциями в металлической пленке. Условие резонанса зависит от оптических характеристик металлической пленки, ее толщины, коэффициентов преломления диэлектрика, расположенного по обеим сторонам пленки и угла падения света. Молекулы рецепторов связываются с верхней стороной металлической пленки, а свет направляют к нижней стороне пленки, в частности, через призматическую подложку. Определяемый аналит, связываясь с этими рецепторами, вызывает изменение локального коэффициента преломления и вследствие этого изменяет условия резонанса. Резонанс наблюдают, контролируя интенсивность отраженного света, поскольку угол падения светового луча на поверхность металлической пленки изменяется. Изменение величины угла, при котором возникает резонанс, непосредственно коррелирует с количеством связанного аналита.

Способ, использующий оптоволоконные системы, включает флуоресценцию рассеянных полей. В этом способе конец оптического волокна освобождают от плакирующей оболочки, получая сенсорный

- 13 008194 элемент, который взаимодействует с окружающей средой в кратковременном режиме. Молекулы рецептора связываются с открытой поверхностью волокна, при этом можно провести прямой анализ, используя естественную флуоресценцию рецептора и конъюгатных белков. Для повышения чувствительности можно использовать конкурентный или послойный анализ с мечением Р1ТС. При проведении анализа световую волну пропускают по волокну, и часть кратковременно образующегося флуоресцентного излучения входит обратно в волокно и возвращается к чувствительному элементу.

Другой оптоволоконный способ использует капиллярную трубку оптического волокна, при этом оптическое волокно без плакирующей оболочки помещают в цилиндрическую заполняемую камеру, получая сенсорный элемент, который кратковременно взаимодействует с частью заполняемого объема, непосредственно окружающего волокно. Молекулы рецептора могут связываться с открытой поверхностью волокна, при этом можно произвести послойный анализ или анализ конкурентного вытеснения. Световая волна перемещается по волокну, и часть кратковременно индуцированного флуоресцентного излучения входит обратно в волокно и возвращается к чувствительному элементу. Сигнал от определяемого аналита выделяют из сигналов фоновых источников по его угловой расходимости после выхода из волокна. Другие оптоволоконные способы, в частности, оптоволоконная флуоресценция, могут быть адаптированы для реализации настоящего изобретения с помощью таких же принципов, как описаны выше.

Другие фотонные способы, в частности, интерферометрия, включают установку тонкопленочного волновода, содержащего, например, две дорожки, на первой из которых могут быть иммобилизованы молекулы рецептора, а вторая - экранирована для создания опорного канала. Лазерное излучение можно ввести, например, в волновод и разделить между двумя дорожками таким образом, чтобы по сдвигу фаз луча определять изменения коэффициента преломления и толщину защитного слоя, которые в свою очередь коррелируют с количеством связанного аналита. Видоизменение такого способа используют в интерферометре Хартмана, где имеется мультимодальный тонкопленочный планарный волновод с одной дорожкой. Молекулы рецептора могут быть иммобилизованы на этой дорожке, а лазерное излучение может быть введено в волновод таким образом, чтобы по указанной дорожке распространялись две моды. Оптические свойства мультимодальной геометрии таковы, что мода высшего порядка имеет большее поле рассеяния, обеспечивая сигнальный механизм, а мода низшего порядка практически не имеет поля рассеяния и создает опорный механизм. Связывание с определяемым аналитом вызывает относительные изменения коэффициента преломления и толщины защитного слоя на дорожке, которые определяются полем рассеяния моды высшего порядка и приводят к сдвигу фазы в этой моде. Поскольку мода низшего порядка или опорная мода не реагирует на такие изменения и в этой моде не происходит сдвига фазы, измерение разности хода сигнального и опорного лучей позволяет получить корреляцию для определения количества связанного аналита.

Приведенное выше описание, как общих условий, так и некоторых деталей, показывает возможность адаптации различных способов применения оптических сенсоров для практической реализации настоящего изобретения. Следует понимать, что вышеприведенное описание не является ни исчерпывающим, ни ограничительным, поскольку существует возможность применения множества современных способов, позволяющих успешно измерять разность связывания и, соответственно, определять присутствие и количество соответствующих маркеров или аналитов, представляющих интерес. Как подчеркивалось выше, независимо от применяемого способа реализация настоящего изобретения включает одновременное определение и измерение содержания по меньшей мере трех аналитов.

Иммунохроматографические способы обнаружения РАМО-1.

Ниже описаны способы обнаружения РАМО-1 согласно настоящему изобретению.

В одном из вариантов реализации способа РАМО-1 выявляют в образце посредством контакта образца, содержащего РАМО-1, с иммунологической аналитической системой согласно настоящему изобретению, чтобы получить комплекс антитело-РАМО-1. Затем производят выявление присутствия комплекса антитело-РАМО-1. В одном из вариантов реализации этого способа антитело содержит детектируемый маркер, при этом определяют содержание комплекса антитело-РАМО-1, содержащего детектируемый маркер.

В другом варианте реализации способа РАМО-1 выявляют в образце, контактирующем с антителом, которое имеет высокое сродство к связыванию с РАМО-1 (как М271, описанное ниже), получая при этом комплекс антитело М271-РАМО-1. Затем полученный комплекс вступает в контакт с иммобилизованным вторым антителом (например, типа М52). Второе антитело иммунологически отличается от первого антитела, и они не являются перекрестно реактивными, поэтому такие антитела могут одновременно связываться с молекулой РАМО-1. Иммобилизованное антитело связывается с комплексом (подвижное антитело)-РАМС-1, образуя комплекс иммобилизованное антитело-РАМО-1 антитело. РАМО-1 выявляют по присутствию этого гетеротримерного комплекса. Как указано выше, для начального распознавания РАМО-1 предпочтительно используют антитело с высокой специфичностью к РАМО-1.

В то время как вышеописанный способ включает применение одного антитела из выбранной пары, меченого детектируемым маркером, видоизмененный вариант этого способа включает контактирование образца с первым меченым антителом, а затем - контакт образца со вторым, иммобилизованным антителом. В этом варианте меченое антитело служит для связывания РАМО-1 в образце. В другом варианте

- 14 008194 реализации способ включает следующие операции: введение жидкого образца, содержащего РАМС-1, в зону пористого материала с мобилизуемым меченым антителом, при этом антитела и белки могут мигрировать сквозь указанный материал, а зона антител содержит мобилизуемое антитело, обладающее высокой специфичностью к РАМС-1, которая приводит к присоединению антитела к РАМС-1 и образованию комплекса антитело-РАМС-1; миграцию комплекса в зону анализа, содержащую второе антитело, иммобилизованное в ней, при этом указанное второе антитело обладает сродством к связыванию с РАМС-1, что приводит к связыванию второго антитела с меченым комплексом антитело-РАМС-1 и образованию иммобилизованного комплекса, и выявление иммобилизованного комплекса в зоне анализа.

Другой вариант реализации способа представляет собой стандартный послойный анализ, в котором немеченое антитело иммобилизуют на какой-либо поверхности. Добавление жидкого образца приводит к образованию иммобилизованного комплекса, состоящего из иммобилизованного антитела и РАМС-1. Добавление меченого антитела приводит к образованию иммобилизованного комплекса, состоящего из иммобилизованного антитела, РАМС-1 и меченого антитела, и с последующим выявлением этого комплекса.

Согласно вышеописанным способам антитела могут включать детектируемый маркер или метку, а операция выявления комплекса антитело-РАМС-1 или РАМС-1-антитело включает обнаружение детектируемого маркера или метки. Примеры детектируемых маркеров, которые могут быть использованы, включают окрашенные частицы, ферменты, красители и радиоактивные изотопы. В специфическом варианте реализации детектируемый маркер представляет собой окрашенные частицы золота, имеющие средний размер, например, около 20-30 нм. В другом варианте реализации детектируемый маркер представляет собой пероксидазу хрена.

Примеры устройств для обнаружения РАМС-1.

Существует множество устройств для обнаружения белка РАМС-1 в образце. Отдельный вариант реализации устройства согласно настоящему изобретению для обнаружения РАМС-1 показан на фиг. 12. Предпочтительно, чтобы устройства согласно настоящему изобретению могли выявлять наличие РАМС-1 в образце, если концентрация РАМС-1 составляет от 5 до 50 нг/мл. Предпочтительно также, чтобы указанные устройства имели порог чувствительности около 5-7 нг/мл. Чем шире интервал между фоновой концентрацией РАМС-1 и порогом чувствительности устройства, тем ниже вероятность получения ложноположительных результатов. В данном разделе рассматриваются различные возможные варианты реализации устройств согласно настоящему изобретению на примере устройства, показанного на фиг. 1, 2. Следует отметить, что это устройство может служить для простого обнаружения присутствия РАМС-1 в образце влагалищного секрета.

Термин примерно, используемый в данном описании, означает в пределах допустимой погрешности для конкретной величины, которая определяется специалистом в данной области и которая частично зависит от способа измерения или определения, т.е. от ограничений измерительной системы. Так, например, термин примерно может означать в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения согласно принятой практике в данной области. Альтернативно термин примерно может означать диапазон до 20%, предпочтительно до 10%, более предпочтительно до 5% и еще более предпочтительно до 1% данной величины. Альтернативно, в особенности для биологических систем или процессов, этот термин может означать в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах 5 крат и более предпочтительно в пределах 2 крат указанной величины. При описании в данной заявке и формуле изобретения конкретных величин термин примерно, если не указано иного, следует понимать как в пределах допустимой погрешности для соответствующей величины.

Описание устройства согласно настоящему изобретению

В качестве примера в настоящем описании использованы моноклональные антитела, рассмотренные ниже. Однако использование именно этих специфичных моноклональных антител не является обязательным. Как показано на фиг. 1 и 2, устройство имеет стрип-структуру, состоящую из нескольких взаимосвязанных элементов. Более конкретно, деталь 12 устройства содержит прокладку с зоной 10, в которой находятся антитела М271, меченые, например, окрашенными частицами 8Р (не показаны на чертежах). Прокладка 12 может быть выполнена из стекловолокнистой ткани или иного пористого материала, который не препятствует миграции различных веществ и субстанций образца. Окрашенные частицы могут представлять собой частицы золота, имеющие размер в пределах от 20 до 30 нм. Зона антител М271 содержит также мышиный иммуноглобулин 1дС, меченый таким же окрашенными частицами. Меченые антитела М271 и мышиный иммуноглобулин 1дС вводят в стрип-часть 10 прокладки 12 путем пропитывания прокладки 12 раствором меченых антител М271 и меченого мышиного иммуноглобулина 1дС. Раствор антител М271 и мышиного иммуноглобулина 1дС можно вводить в нитроцеллюлозную мембрану 22 с помощью чертежного пера или микрокапельницы. Нитроцеллюлозная мембрана 22, соединенная с одним концом прокладки 12 в продольном направлении, содержит зону 14 анализа и зону 16 контроля. Зона 14 анализа и зона 16 контроля расположены в поперечном направлении по всей ширине устройства. Зона 14 анализа представляет собой часть полосы нитроцеллюлозной мембраны 22. Зона 14 анализа содержит антитела М52, присоединенные к нитроцеллюлозной мембране 22. Зона 16 контроля содержит антитела против иммуноглобулинов мыши, присоединенные к нитроцеллюлозной мембране 22. Зона

- 15 008194 контроля 16 проходит по всей ширине полосы 22. Мембрану 24 из фильтровальной бумаги соединяют с концом нитроцеллюлозной мембраны 22, противоположным концу нитроцеллюлозной мембраны 22, который соединяется с прокладкой 12. Мембрану 24 из фильтровальной бумаги соединяют с концом нитроцеллюлозной полосы 22 в ее продольном направлении. Поверхность устройства покрывают специальными защитными пленками 28 и 30, например, тонкими клейкими лентами, специально предназначенными для стрип-устройств. Стрелками 18 на поверхности пленки 28 показан конец зоны нанесения образца прокладки 12. Прокладку 12, нитроцеллюлозную мембрану 22 и полосу 24 из фильтровальной бумаги присоединяют к клейкому жесткому пластмассовому основанию 26.

Обозначения на фиг. 1, 2.

- зона антител М271

12-прокладка

- зона анализа

- зона контроля

- стрелки

- нитроцеллюлозная мембрана

- мембрана из фильтровальной бумаги

- клейкое жесткое пластмассовое основание

- частично прозрачная защитная пленка со стрелками

- непрозрачная защитная пленка.

Предпочтительный вариант реализации устройства согласно настоящему изобретению

В варианте реализации, описанном в данном разделе, устройство содержит зону 10 прокладки с антителами М271, выполненной из пористой матрицы для нанесения образца, которая не препятствует миграции антител и белков. Зона 10 антител М271 содержит антитела М271, обладающие чрезвычайно специфическим сродством к связыванию с РАМС-1. Введение жидкого образца, содержащего РАМС-1, в зону антител М271 приводит к соединению антитела М271 с РАМС-1 и образованию комплекса антитело М271-РАМС-1. Устройство содержит также зону 14 анализа, которая соединяется посредством жидкой среды с зоной 10 антител М271 и выполнена из пористого материала, не препятствующего миграции антител и белков. Зона 14 анализа содержит антитело М52, иммобилизованное в этой зоне и также способное связываться с РАМС-1. Антитело М52 иммунологически отличается от антитела М271, поэтому антитела М271 и М52 могут одновременно связываться с РАМС-1. Введение жидкого образца в зону 10 антитела М271 приводит к миграции комплекса антитело М271-РАМС-1 в зону 14 анализа, где комплекс антитело М271-РАМС-1 связывается с антителом М52 и иммобилизуется в зоне анализа антителом М52. Устройство выявляет присутствие РАМС-1 в образце на основании присутствия антитела М52, иммобилизованного в зоне 14 анализа. В соответствии с этим вариантом реализации оба антитела представляют собой антитела согласно настоящему изобретению. Процедура выбора пары антител, описанная выше, может быть воспроизведена специалистом в данной области. В результате только РАМС-1 образует комплекс антитело М271-РАМС-1-антитело М52, который иммобилизуется в зоне 14 анализа. Таким образом, наличие антитела М52, иммобилизованного в зоне 14 анализа, является показателем присутствия РАМС-1 в образце.

В этом варианте реализации устройства антитело М271 присоединяется к детектируемому маркеру, который используют для определения присутствия РАМС-1, иммобилизованного в зоне 14 анализа. Примеры детектируемых маркеров, которые могут быть использованы, включают, в частности, но без ограничения, окрашенные частицы, ферменты, красители, флуоресцентные красители и радиоактивные изотопы. В одном варианте реализации детектируемый маркер представляет собой частицы золота, имеющие средний размер, примерно 20-30 нм. В другом варианте реализации антитело М271 представляет собой меченое антитело в сублимированном состоянии.

В варианте реализации, в котором антитело М271 метят детектируемым маркером в зоне прокладки, содержащей антитела М271, устройство включает также зону анализа, в которой находится антитело М52. Зона прокладки и зона анализа соединяются посредством жидкой среды.

В другом варианте реализации устройства, также соответствующего фиг. 1, 2, устройство имеет стрип-структуру с ближним и дальним концом. Зона 10 антител М271 стрип-структуры выполнена из материала, который не препятствует миграции антител и белков. Зона 10 антитела М271 стрипструктуры содержит антитело М271, обладающее чрезвычайно специфическим сродством к связыванию с РАМС-1. Введение жидкого образца, содержащего РАМС-1, в зону прокладки с антителами М271 приводит к соединению антитела М271 с РАМС-1 и образованию комплекса антитело М271-РАМС-1.

Стрип-структура содержит также зону 14 анализа, близко расположенную к зоне 10 антитела М271 и соединяющуюся посредством жидкой среды с зоной 10 антитела М271. Зона 14 анализа выполнена из материала, который не препятствует миграции антител и белков. Зона 14 анализа содержит антитело М52, иммобилизованное в этой зоне и имеющее сродство к связыванию с РАМС-1. Введение жидкого образца в зону 10 антитела М271 приводит к миграции комплекса антитело М271-РАМС-1 в зону 14 анализа, где комплекс антитело М271-РАМС-1 связывается с антителом М52 и иммобилизуется в зоне анализа антителом М52. Зона анализа содержит также антитело М42 и антитело М52, иммобилизованные

- 16 008194 в зоне 14 анализа. Комбинация немеченых антител М52 и М42 позволяет производить точную настройку порога чувствительности стрип-устройства согласно настоящему изобретению (пример 11). Устройство выявляет присутствие РАМС-1 в образце на основании иммобилизации комплекса меченое антитело М271-РАМС-1 в зоне 14 анализа.

Зона контроля. Устройство согласно изобретению включает одну стандартную зону 16 контроля (фиг. 1, 2). Эта зона контроля служит для подтверждения правильности функционирования устройства. При этом следует отметить, что в устройстве согласно настоящему изобретению можно использовать также любые альтернативные варианты реализации зоны контроля.

Устройство с одной зоной контроля включает зону 10 антитела М271, выполненную из материала, который не препятствует миграции антител и белков. Зона 10 антитела М271 содержит меченое антитело М271, которое не иммобилизовано в этой зоне и которое имеет высокую специфичность по отношению к РАМС-1. Введение жидкого образца, содержащего РАМС-1, в зону 10 прокладки с антителом ММ271 приводит к связыванию антитела М271 с РАМС-1 и к образованию комплекса антитело М271-РАМС-1. Устройство содержит также зону 14 анализа, которая связана жидкой средой с зоной 10 антитела М271 и выполнена из материала, не препятствующего миграции антител и белков. Зона 14 анализа содержит также антитело М52, иммобилизованное в этой зоне и имеющее сродство к связыванию с РАМС-1. Антитело М52 иммунологически отличается от антитела М271, поэтому антитела М271 и М52 могут одновременно связываться с РАМС-1. Введение жидкого образца в зону 10 антитела М271 приводит к миграции комплекса антитело М271-РАМС-1 в зону 14 анализа, где комплекс антитело М271-РАМС-1 связывается с антителом М52 и иммобилизуется в зоне 14 анализа антителом М52. Устройство выявляет присутствие РАМС-1 в образце на основании иммобилизации меченого антитела М271 в зоне 14 анализа. Если в образце присутствует низкая концентрация РАМС-1, по меньшей мере часть меченых антител М271 мигрирует из зоны 10 антител М271 через зону 14 анализа в зону 16 контроля. Антитела против иммуноглобулинов мыши иммобилизуются в зоне 16 контроля. Антитела против иммуноглобулинов связывают меченые антитела М272, которые окрашивают зону контроля. Если в образце присутствует высокая концентрация РАМС-1, то лишь небольшое количество антител М271 может приблизиться к зоне 16 контроля, при этом окрашивание зоны контроля может оказаться слишком слабым для распознавания невооруженным глазом человека. Чтобы предотвратить такую возможность, в зону 10 антитела М271 добавляют меченый мышиный иммуноглобулин 1дС. Этот иммуноглобулин не связывает РАМС-1 и свободно мигрирует сквозь зону 14 анализа, содержащую антитела М52, в зону 16 контроля, где он связывается антителами антимышиного антиглобулина и окрашивает зону 16 контроля. Зона контроля подтверждает правильность функционирования устройства независимо от концентрации РАМС-1 в образце.

Другим компонентом устройства согласно настоящему изобретению является пористый материал, который находится в плотном пористом соединении с материалом зоны анализа. Эта часть устройства работает как насос, который помогает перемещать жидкости, белки и антитела. Примеры детектируемых маркеров, которые могут быть использованы для мечения мышиных антител и иммуноглобулина 1дС, включают, в частности, но без ограничения, окрашенные частицы, ферменты, красители и радиоактивные изотопы. В одном из вариантов реализации детектируемый маркер представляет собой флуоресцентный краситель. В другом варианте реализации детектируемые маркеры являются окрашенными частицами. В одном из вариантов реализации антитело М271, которое является меченым антителом, и меченый мышиный иммуноглобулин 1дС находятся в сублимированном состоянии.

Материалы, используемые в различных зонах вышеописанного устройства, могут представлять собой любую комбинацию материалов, которые не препятствуют миграции антител и белков. Примеры пригодных материалов включают, в частности, но без ограничения, стекловолокно, пористую пластмассу, нитроцеллюлозу и фильтровальную бумагу.

Детали устройства можно располагать в любых функциональных комбинациях при условии, что в любом варианте реализации настоящего изобретения имеется выбранная пара антител, которая детектирует минимальную фоновую концентрацию РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин.

Устройство согласно настоящему изобретению может содержать защитную пленку, покрывающую по меньшей мере часть устройства. Она может быть прозрачной или непрозрачной и может иметь на поверхности необходимый товарный знак, информационные метки/символы или стрелки.

Определение разрывов плодной оболочки.

РАМС-1 содержится в амниотической жидкости с концентрацией, по меньшей мере примерно в 100 раз большей, чем в сыворотке крови беременных женщин, и по меньшей мере в 3000 раз большей, чем во влагалищном секрете беременных женщин при отсутствии разрыва плодной оболочки. Поэтому в случае растворения в образце вагинального секрета даже небольшого количества амниотической жидкости (примерно 1/100 капли на 1 мл вагинального секрета) в этом образце будет присутствовать достаточное содержание РАМС-1, указывающее на разрыв плодной оболочки. При этом несущественная примесь сыворотки крови в образце (10-15%) не оказывает влияния на результаты, получаемые с помощью устройств и способов согласно настоящему изобретению вследствие низкой концентрации РАМС-1 в сыворотке крови.

- 17 008194

Поскольку наличие амниотической жидкости во влагалищном секрете является показателем разрыва плодной оболочки, выявление РАМС-1 во влагалищном секрете также можно использовать для определения разрыва плодной оболочки.

Способ обнаружения РАМС-1 в амниотической жидкости согласно настоящему изобретению является чрезвычайно чувствительным. Так, например, можно обнаружить РАМС-1 в концентрации, равной 0,05 нг/мл (примеры 6, 7). Поскольку максимальная концентрация РАМС-1 в сыворотке составляет примерно 25 нг/мл по сравнению с минимальной концентрацией примерно 1680 нг/мл в амниотической жидкости и поскольку фоновая концентрация РАМС-1 во влагалищном секрете является очень низкой и составляет примерно 0,2 нг/мл, в способе согласно изобретению можно использовать более низкий пороговый уровень для РАМС-1, чтобы выявлять присутствие амниотической жидкости во влагалище. Использование более низкого порогового уровня согласно настоящему изобретению исключает большинство ложных результатов.

Устройства и способы согласно настоящему изобретению позволяют исключить появление ложных результатов за счет использования пары антител, которые являются высокочувствительными и специфичными для РАМС-1. Кроме того, порог чувствительности устройства согласно настоящему изобретению может быть точно установлен на предварительно определенном уровне, близком к 5-7 нг/мл.

В результате на устройства и способы согласно настоящему изобретению не влияет наличие вагинита и других переменных факторов, которые оказывают негативное воздействие на точность известных способов детекции разрывов плодной оболочки. Максимальная концентрация РАМС-1 в воспалительном экссудате составляет 3 нг/мл (примеры 8, табл. 10, 11). Такая же концентрация РАМС-1 может возникнуть, если примесь сыворотки крови во влагалищном секрете не превышает 10-15%. Кроме того, большая величина отношения концентрации сыворотки к концентрации амниотического РАМС-1 при применении устройств и способов согласно настоящему изобретению существенно уменьшает вероятность получения ложноположительных результатов вследствие присутствия сыворотки крови во влагалищном секрете даже при низком пороге детекции РАМС-1. Как указано далее, эти устройства и способы можно просто и быстро адаптировать для применения во внебольничных условиях. Так, например, способ согласно настоящему изобретению можно использовать с простым устройством, которое сможет эксплуатировать пациентка, не имеющая опыта или имеющая небольшой опыт работы с таким устройством. Для пользования устройством не требуется специального отсчета времени, разбавления или корректировки концентрации образца перед проведением измерения. Это обеспечивает высокую надежность устройства и способа и снижает зависимость от ошибки оператора. Способ можно также реализовать для простого обнаружения 'да/нет' присутствия РАМС-1 в образце и выявления присутствия амниотической жидкости во влагалище.

Настоящее изобретение обеспечивает способы и устройства для определения разрыва плодной оболочки на основании присутствия РАМС-1 во влагалищном секрете беременной женщины. Вследствие этого способ определения разрыва плодной оболочки согласно изобретению просто включает операцию выявления присутствия РАМС-1 во влагалищном секрете, при этом наличие РАМС-1 во влагалищном секрете указывает на появление разрыва плодной оболочки. Ключевым моментом настоящего изобретения является последовательный выбор пары антител, которые позволяют выявлять очень низкую фоновую концентрацию белка РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин. Во влагалищном секрете можно ожидать наличия низкой концентрации РАМС-1, поскольку проницаемость стенки капилляра для белков крови зависит от посттрансляционных модификаций белков и их взаимодействия с другими молекулами (Маттаго ТА.. е! а1., 0-β1νοοκνΗι(ίοη бе1аук (Не с1еагаг1се οΓ Нитаа ШС-ЬтбШд рго!ет-6 Гют (Не окЛюл, ίη Ени^еав .Шита οΓ Εηάο^ηοίο^, Мау 2000, νοί. 142(5), р. 512; ЗсНпссЬсгзсг Е. Е., Рго!етк авб уек!си1аг (ηι·^^! ίη сарШагу еηбο(Не1^ит. Реб. Ргас.. Мау 1983, νοί. 42(8), рр.2419-24; МткНа11 Β.Ό. е( а1., Уекю1е Γοπι-π-Πίοη авб (гаГПсктд ίη еηбο(Не1^а1 се11к аиб κ^^ίοη ег^НкШИ Ьатег Гцпсΐίοη, ЩбЮсЬет. Се11 Βίο1., РеЬ. 2002, νο1. 117(2), рр. 105-12; Эе1 УессНю Р.1. е! а1., Έ^οΐΜί^ ιηοηοΗ-ΠΌΓ регтеаЫШу !ο тас^οтο1еси1ек, ίη Реб. Ргос., Τιη 1987, νο1. 46(8), рр. 2511-2515; δίΓΗη^Γ-Βπώο™ А. е! а1., §е1ес(1У11у οΓ (Не еηбο(Не1^а1 тοпο1ауе^: еГГес!к οη тсгеаке регтеаЫШу. М^с^ονаки1а^ ЯекеагсН. Νον. 1998, νο1. 36(3), рр. 216-227; СНтеа Ν., Мбдгот Е.А., №\ν Гцпс!юп Γογ (Не ЬН/СС гесерЮг: ΐιοηδογίοδΐδ οΓ Ηοηηοικ асгакк (Не еаб^кЫ-б Ьатег ίη (агде( ογ^-πικ. ίη 8етт. Вергобис!. Меб., 2001, νο1. 19(1), рр. 97101). Часть молекул РАМС-1, подвергаемых посттрансляционным модификациям или устанавливающих нековалентную связь с другими молекулами, имеет минимальное проникновение в вагинальный секрет. Концентрация таких молекул во влагалищном секрете должна быть низкой. Низкая или высокая степень проникновения различных молекул связана с селективной проницаемостью капиллярных стенок и селективными секреторными процессами. Поскольку известно, что присутствие амниотической жидкости во влагалищном секрете беременных женщин является показателем разрыва плодной оболочки, выявление присутствия РАМС-1 во влагалищном секрете также можно использовать для определения наличия разрыва плодной оболочки. Примеры способов и устройств для обнаружения РАМС-1 во влагалищном секрете включают способы и устройства, более подробное описание которых приведено ниже. Способы, включающие операцию определения разрыва плодной оболочки на основании выявления РАМС-1 в образце вагинального секрета, также описаны далее более подробно.

- 18 008194

Как указано выше, способы и устройства для определения разрыва плодной оболочки являются высоко специфичными, чувствительными и точными. Чувствительность и точность обеспечиваются за счет широкого интервала между низкой фоновой концентрацией РАМО-1 во влагалищном секрете беременных женщин и гораздо более высоким, заранее установленным порогом чувствительности устройства согласно настоящему изобретению. Указанное пороговое значение в свою очередь является более низким, чем типичная концентрация РАМО-1 во влагалищном секрете во время разрыва плодной оболочки, который приводит к проникновению амниотической жидкости во влагалище. Точную настройку порогового значения обеспечивают с помощью по меньшей мере одного или нескольких антител против РАМО-1, вводимых в зону 14 анализа, чтобы с высокой точностью задать требуемый порог чувствительности устройства согласно настоящему изобретению (пример 9). Вследствие этого способы и устройства согласно настоящему изобретению помогают избежать получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов за счет применения пары высоко специфичных моноклональных антител М271 и М52 и по меньшей мере одного дополнительного антитела М42. В результате этого на точность указанных способов и устройств не оказывает отрицательного влияния присутствие вагинальных инфекций или других определенных переменных факторов, которые снижают точность известных способов определения разрыва плодной оболочки. Предпочтительные устройства и способы обнаружения РАМО-1 во влагалищном секрете беременных женщин согласно настоящему изобретению обеспечивают простоту, удобство и быстрое применение, что дает возможность использовать устройство согласно настоящему изобретению во внебольничных условиях. Так, например, указанные способы можно применять с простым устройством, которое сможет эксплуатировать пациент, не имеющий опыта или имеющий небольшой опыт работы с таким устройством. Для пользования устройством не требуется специального, отсчета времени, разбавления или корректировки концентрации образца перед проведением измерения. Это обеспечивает высокую надежность устройств и способов определения разрывов плодной оболочки согласно настоящему изобретению и уменьшает чувствительность к ошибкам оператора. Результаты клинических испытаний устройства согласно изобретению представлены в примере 10. Измерение концентрации РАМО-1 во влагалищном секрете при наличии вагинита представлено в примере 8. Из примера 8 можно видеть, что максимальная наблюдаемая концентрация РАМО-1 в воспалительном экссудате близка к 3 нг/мл.

Примеры

Приведенные ниже примеры более подробно описывают выделение РАМО-1 из амниотической жидкости, выбор пары анти-РАМО-1-антител, исследование специфичности таких антител и концентрации РАМО-1 в воспалительном экссудате при вагините. Эти примеры предназначены для иллюстрации определенных задач настоящего изобретения и не ограничивают области его распространения.

Пример 1. Концентрация РАМО-1 в крови и амниотической жидкости.

Концентрацию РАМО-1 измерили в сыворотке крови небеременных женщин, беременных женщин (37-40 недель беременности) и в амниотической жидкости (39-40 недель беременности) способом БОБА с применением пар моноклональных антител, полученных, как описано в примере 3.

Антитела М1, М271, М152 и М392 абсорбировали на полистироле в 0,05 М карбонатбикарбонатном буфере при рН 9,5 в течение 18 ч при 6°С (100 мкл раствора антитела в каждой лунке). Неспецифичную сорбцию к полистиролу удалили 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (ВБА) в фосфатном солевом буфере (РВБ) с рН 7,0, 200 мкл в каждой лунке, инкубировали в течение одного часа при 37°С.

В каждую лунку добавили 100 мкл антигена РАМО-1 с концентрацией 50, 25, 12, 6, 3, 1,5 и 0,7 нг/мл. Образцы сыворотки крови или амниотической жидкости разбавили в буфере 0,01% ВБА и 0,05% Τ\νίπ 20 в РВБ. Разбавленные образцы добавили в лунки и инкубировали в течение одного часа при 37°С. Вызвали реакцию с помощью раствора ортофенилендиамина в 0,05 М цитратфосфатном буфере (рН 4,7), инкубировали в течение 20 мин при 37°С. Определили оптическую плотность при длине волны 492 нм.

Определили концентрацию антител в первом слое и концентрацию конъюгата, получив в результате стандартную кривую оптической плотности для РАМО-1 с максимальным наклоном примерно 45° (увеличение на одну оптическую единицу соответствует увеличению концентрации РАМО-1 в образце на 1 нг/мл), с верхним пределом (для концентрации РАМО-1 50 нг/мл) в 1,5 оптических единицы и с точкой нулевой концентрации, не превышающей 0,1 оптических единицы. Образцы для исследования (сыворотки, амниотическую жидкость, вагинальный и цервикальный секреты) заморозили при -40°С. Каждый образец анализировали три раза. Сыворотку разбавили до 1/5 исходной концентрации. Образцы амниотической жидкости разбавили до 1/2000 исходной концентрации. Если оптическая плотность образца превышала 1,5 единицы, то такой образец дополнительно разбавляли и повторно анализировали.

Полученные данные обобщены ниже в табл. 1-3.

- 19 008194

Таблица 1

Концентрация РАМО-1 (нг/мл) в сыворотке крови небеременных женщин

№	ΜΙ -М91	М271-М52	М152-М91	М392-М371
1	20	0	15	12
2	20	0	15	13
3	60	5	50	46
4	50	7	48	50
5	40	4	30	34
6	64	15	50	56
7	20	7	15	14
8	48	8	35	30
9	15	0	10	14
10	40	5	20	35

Таблица 2

Концентрация РАМО-1 (нг/мл) в сыворотке крови беременных женщин (37-40 недель беременности)

№	ΜΙ -М91	М271-М52	М152-М91	М392-М371
1	90	8	70	50
2	100	15	90	75
3	105	16	95	75
4	120	22	100	94
5	100	12	98	90
6	98	14	95	80
7	104	20	90	80
8	98	25	75	60
9	64	5	55	40
10	70	10	60	40

Таблица 3

Концентрация РАМС-1 (нг/мл) в амниотической жидкости (39-40 недель беременности)

№	ΜΙ -М91	М271-М52	М152-М91	М392-М371
1	8000	1680	6400	5000
2	12000	8000	6000	5000
3	10000	6000	7000	6000
4	6000	2000	5000	4500
5	8000	12000	5800	5000
6	7000	20000	5000	5000
7	6000	2000	4000	3000
8	75000	8000	5000	4700
9	2000	3000	1440	1500
10	40000	13000	36000	25000

Пример 2. Выделение РАМО-1.

В 1980 г. Д. Петрунин предложил модифицированный способ выделения РАМО-1 (Петрунин Д.Д., Козляева Г.А., Татаринов Ю.С., Шевченко О.П. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, № 5, стр. 558, 1980 (на русском языке)). Схема операций выделения показана ниже в табл. 4.

-20008194

Таблица 4

Операции выделения РАМО-1

Операции выделения	Чистота, %	Выход, %
Амниотическая жидкость, 16-25 недель беременности	4	100
Осаждение 0,5% хлоридом лантана	25	90
Осаждение сульфатом аммония при насыщении 50%	35	70
Осаждение сульфатом лития при насыщении 60%	60	60
Отделение способом хроматографии с обращенной фазой	90	30

РАМО-1 выделили из амниотической жидкости при сроках беременности от 16 до 25 недель. Пробы жидкости получили у женщин, беременность которых была прервана по медицинским показаниям. К амниотической жидкости добавили 10% раствор хлорида лантана при объемном отношении 20:1 (таким образом, его конечная концентрация составила 0,5%) и инкубировали при 4°С в течение 18 ч. Образовался осадок, который отделили центрифугированием со скоростью 8000 об./мин в течение 30 мин. Осадок растворили в насыщенном растворе №₂НРО₄ и отделили нерастворимый осадок солей лантана, образовавшийся в процессе центрифугированием при 8000 об./мин в течение 30 мин. Полученный раствор фракционировали 50% насыщенным раствором с инкубацией при 4°С в течение 18 ч и растворили образовавшийся осадок в дистиллированной воде таким образом, чтобы в обоих случаях довести объем фракций растворенного осадка до начального объема амниотической жидкости. Затем осадили раствор 60%-ным насыщенным сульфатом лития и растворили осадок в небольшом количестве дистиллированной воды. После диализа адсорбировали примеси пирофосфатом кальция, добавив к раствору белка равный объем поглотителя влаги, перемешали и инкубировали в течение 10-15 мин, а затем отделили абсорбент с помощью центрифугирования.

Пример 3. Получение стабильных гибридных линий согласно настоящему изобретению.

Гибридомный эксперимент 1. Использовали лимфоциты из подколенных лимфатических узлов мышей ВАГВ/с (инбредных мышей экспериментальной линии Багга-Альбино). Мышей иммунизировали пятью инъекциями РАМО-1 в стопу. Каждая инъекция содержала 100 мкг РАМО-1 и полного адъюванта Фрейнда в отношении 1:1. После слияния клеток их посеяли в 1152 лунки. Протестировали 363 первичных гибридомы, 38 из них оказались РАМО-1-положительными. Затем проверили специфичность моноклональных антител путем исследования их перекрестного реактивного связывания белков - фертильного альфа-2-микроглобулина, хорионического гонадотропина человека, трофобластического бета-1гликопротеина, плацентарного лактогена человека, альфа-фетопротеина и сывороточного альбумина человека. Выбрали четырнадцать первичных гибридом, моноклональные антитела которых не обладали перекрестной реактивностью по отношению к другим белкам. Затем применили способ серийных разведений, чтобы дважды клонировать первичные РАМО-1-специфические гибридомы. И, наконец, выбрали пять клонов, которые, очевидно, были наиболее стабильными и продуктивными производителями моноклональных антител ΜΙ, М38, М42, М52 и М91.

Гибридомный эксперимент 2. Использовали лимфоциты из селезенки 5 мышей. Мышей иммунизировали пятью внутрибрюшинными инъекциями РАМО-1 по 100 мкг. Каждая инъекция состояла из РАМО-1 и полного адъюванта Фрейнда в отношении 1:1. Использовали 1344 лунки и протестировали 562 гибридом. 45 из них оказалось РАМО-1-специфическими, а 19 не обладали перекрестной реактивностью по отношению к другим белкам, т.е. были специфичными к РАМО-1. Гибридомы, не обладающие перекрестной реактивностью, дважды клонировали и выбрали для дальнейшего применения 6 клонов, которые были наиболее стойкими и продуктивными производителями моноклональных антител М122, М152, М211, М271, М371 и М392.

Таким образом, получили 11 вариантов моноклональных антител для РАМО-1, из которых затем выбрали пару, способную выявлять минимальную фоновую концентрацию РАМО-1 во влагалищном секрете беременных женщин, как описано в примере 4.

Специфические клеточные линии согласно настоящему изобретению.

Антитела М271 и М52 получили с помощью гибридомных клеточных линий М271 и М52 соответственно. Клеточные линии, образующие моноклональные антитела и обозначенные в данном описании как М271 и М52, а также М42, вырабатывают моноклональные антитела, которые использовали для установки и настройки пороговой чувствительности устройства, как описано ниже.

В табл. 5 приведены результаты получения гибридом в двух опытах.

-21 008194

Таблица 5

	Всего	1 гибридома	2 гибридома
Лунки, всего	2496	1152	1344
Количество первичных гибридом	925	363	562
Количество гибридом, образующих РАМСг-1 положительные моноклональные антитела	83	38	45
Количество гибридом, образующих РАМО-1 специфические моноклональные антитела	33	14	19
Количество стойких гибридомных линий, образующих моноклональные тела, выбранные для дальнейших исследований	11	5	6

Пример 4. Выбор пары моноклональных антител, выявляющих минимальную концентрацию РАМО-1 во влагалищном секрете беременных женщин.

РАМО-1 с концентрацией 1 мкг/мл в 0,05М карбонатно-бикарбонатном буфере с рН 9,5 сорбировали на полистирольных планшетах путем выдержки в течение 18ч при 4°С. Антитела, указанные ниже в табл. 6, добавили в лунки с использованием серийных разведении, начиная с концентрации 3 мг/мл. Затем планшеты инкубировали в течение одного часа при 37°С. В лунки добавили конъюгат из кроличьих антимышиных-анти-ΙβΟ антител, меченых пероксидазой хрена. Инициировали реакцию раствором ортофенилендиамина в 0,05М цитратно-фосфатном буфере (рН 4,7) и инкубировали в течение 20 мин при 37°С. Определили титр моноклональных антител.

Таблица 6 Сродство к связыванию РАМО-1 при концентрации 1 мкг/мл моноклональными телами согласно настоящему изобретению

МАЬ	Титр при концентрации РАМО-1 1 мкг/мл
М1	1:900000
М42	1:1000000
М52	1:1000000
М91	1:1000000
М122	1:2000000
М152	1:1000000
М392	1:1000000
М371	1:400000
М271	1:3000000
М38	1:50000
М211	1:50000

Концентрации моноклональных антител, указанные в табл. 6, представляют собой минимальные концентрации, при которых антитела связывают РАМО-1, при условии, что концентрация РАМО-1 в растворе составляет 1 мкг/мл. Чем меньше концентрация, тем выше способность антитела выявлять минимальные концентрации РАМО-1. Моноклональные антитела М271 и М52 выбрали для того, чтобы обеспечить высокую чувствительность ЕЫ8А к РАМО-1.

При проведении ЕЫ8А моноклональное антитело М271 не проявляло перекрестной реактивности к следующим отдельным белкам амниотической жидкости: фертильному альфа-2-микроглобулину, хорионическому гонадотропину человека, трофобластическому бета-1-гликопротеину, плацентарному лактогену человека, альфа-фетопротеину и сывороточному альбумину человека.

-22008194

Кроме того, в опытах с колонками антитела М271 иммобилизовали на сефарозе и пропускали через колонку неразбавленную амниотическую жидкость. Элюат, полученный из колонки после электрофореза, показал полосу, соответствующую молекулярной массе РАМО-1 (28-30 кДа). Высокоспецифическое моноклональное антитело М271 поместили на прокладку бокового потока стрип-устройства согласно изобретению.

В противоположность антителу М271 антитело М52 при проведении Е1Л8А проявляло перекрестную реактивность по отношению к белку ЮРВР-3 (протеин 3, связывающий инсулиноподобный фактор роста), который имеет высокое содержание в сыворотке и амниотической жидкости. Концентрация негликозилированного ЮРВР-3, измеренная во влагалищном секрете, составляла примерно 600 нг/мл (пример 9). В экспериментах со стрип-устройством согласно настоящему изобретению такая концентрация ЮРВР-3 не препятствовала распознаванию РАМО-1, взятому с концентрацией 5 нг/мл.

Р1ример 5. Высокочувствительный анализ ΕΕΙ8Α для плацентарного оц-микроглобулина.

Обнаружение РАМО-1 во влагалищном секрете с помощью стандартного анлиза ΕΕΙ8Α и пары антител М271-М52 оказалась невозможным. Чтобы обеспечить его, чувствительность ΕΕΙ8Α повысили, уменьшив необходимую для выявления концентрации РАМО-1, до 0,05 нг/мл.

Получили слоистую систему иммунологического анализа с антителами М271-М52, которые проявляли чувствительность 50 пикограмм на миллилитр (0,05 нг/мл).

слой: моноклональные антитела М271, концентрация 6 мкг/мл, в карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 9,5.

слой: РАМО-1, концентрации 4300, 1600, 800, 300, 200, 100, 50 пг/мл, а также цервикальный и вагинальный секреты, разбавленные до 1/2 концентрации, на буфере с рН 7,0.

слой: конъюгат М52 на буфере при разбавлении 1/1000.

Повышение чувствительности получили, варьируя первым и третьим слоем. В отличие от высокочувствительной системы в регулярной системе с чувствительностью 1 нг/мл первый слой имел концентрацию М271 от 10 до 20 нг/мл, а разбавление конъюгата (М52, меченый пероксидазой хрена) составляло 1/40000.

Получили стандартную калибровочную кривую. Она представлена в табл. 7, где концентрация РАМО-1 указана в пикограммах на миллилитр (пг/мл), а оптическая плотность наблюдаемого окрашивания Е при длине волны 450 нм - в стандартных безразмерных единицах.

Таблица 7

Калибровочная кривая для высокочувствительного способа ΕΕΙ8Α

РАМО-1 пг/мл	3200	1600	800	400	200	100	50	0
Е 450 нм	2,000	1,725	1,432	1,130	0,851	0,600	0,304	0,051

Пример 6. РАМО-1 во влагалищном секрете беременных женщин.

Таблица 8

Концентрация РАМО-1 (нг/мл) во влагалищном секрете беременных женщин. Измерения произведены с помощью различных пар моноклональных антител к РАМО-1 (29-41 неделя беременности)

№	Недели беременности	М1-М91	М271 -М52	М152-М91	М392-М371
1	29	25	0,15	5	6
2	34	50	0,1	10	8
3	37-38	70	0,22	30	15

-23008194

4	37-38	60	0,06	25	10
5	33-34	30	0,05	13	5
6	29-30	45	0,05	13	5
7	33	50	0,16	14	10
8	30	60	0,09	15	12
9	39-40	84	0,21	28	18
10	35-36	90	0,13	30	19
11	38-39	90	0,13	30	20
12	38	65	0,15	25	15
13	31	95	0,35	45	30
14	39	44	0,05	10	5
15	29-30	80	0,2	28	12
16	40-41	58	0,078	24	10
17	37	90	0,15	40	30
18	29-30	70	0,4	15	12
19	29	65	0,64	15	12
20	30	80	0,1	22	20

После измерения минимальных концентраций все антитела пометили перкосидазой хрена. При проведении анализа ЕЫ8А немеченые антитела с концентрацией 10 мкг/мл ввели в лунки планшета. Затем в качестве второго слоя в планшет ввели РАМС-1 с концентрацией 50, 100, 200, 400, 800, 1600 и 3200 пг/мл. И, наконец, во все лунки планшета ввели конъюгат одного из остальных антител. Выбрали следующие антитела, работающие в парах (показаны как антитело-конъюгат): М1-М91; М271-М52; М152-М91; М392-М371.

Эти пары антител использовали для измерения концентрации РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин. Окончательно выбрали пару антител М271-М52, с которыми измеренная концентрация РАМС-1 во влагалищном секрете была минимальной. Концентрацию РАМС-1 для пары М271-М52 измерили с помощью высокочувствительного способа ЕЬ18А. Выбранную пару М271-М52 и несколько других пар использовали для измерения концентрации РАМС-1 в амниотической жидкости и в сыворотке крови небеременных и беременных женщин (пример 1, см. выше).

Пример 7. РАМС-1 во влагалищном и цервикальном секретах беременных женщин.

Таблица 9 Концентрация РАМС-1, пикограммы на миллилитр (пг/мл) в цервикальном и вагинальном секретах беременных женщин. Нормальная беременность в таблице означает отсутствие диагностированных отклонений от нормального протекания беременности.

Концентрацию измеряли способом высокочувствительного анализа ЕЬ18А с помощью пары антител М271-М52.

№	РАМО-1, пг/мл в цервикальном секрете	РАМО-1, пг/мл в вагинальном секрете	Недели беременности	Примечания
1	230	150	29	Нормальная беременность
2	220	100	34	Нормальная беременность
3	340	150	38	Эрозия, кровь в цервикальном секрете
4	110	220	37-38	Нормальная беременность
5	100	60	37-38	Нормальная беременность
6	350	78	40-41	Кровь в цервикальном секрете
7	60	400	29-30	Угроза выкидыша
8	50	50	33-34	Нормальная беременность
9	180	50	29-30	Нормальная беременность
10	470	150	37	Кровь в цервикальном секрете
11	600	640	29	Угроза выкидыша
12	150	160	33	Нормальная беременность
13	170	90	30	Нормальная беременность
14	122	210	39-40	Маловодие, гестоз

-24008194

15	300	50	39	Гестоз, вагинит
16	56	130	35-36	Нарушение ретроплацентарного кровоснабжения
17	120	130	38-39	Анемия
18	1000	5000	30-31	Подтекание амниотической жидкости
19	400	200	29-30	Угроза выкидыша
20	800	350	31	Гестоз

Пример 8. РАМС-1 во влагалищном секрете беременных женщин, страдающих вагинитом.

Таблица 10

Концентрация плацентарного альфа-1-микроглобулина во влагалищном секрете беременных женщин, страдающих вагинитом. Измерения производили с помощью невысокочувствительного ЕЫ8А

№ пациента	РАМО-1 (нг/мл)
	1,2
2	2,0
3	0
4	2,5
5	1,5
6	1,9
7	1,5
8	2,0
9	1,4
10	1,2
11	1,0
12	0
13	0
14	3,0
15	1,5

Таблица 11 Концентрация плацентарного альфа-1-микроглобулина во влагалищном секрете беременных женщин, страдающих вагинитом

№	Имя (инициалы фамилии, имени, второго имени)	Диагноз	Результат, полученный с помощью устройства согласно настоящему изобретению (- означает отрицательный)	ЕЫ8А нг/мл
1	С11., О. А,	40 недель беременности. Вагинит.		1,2
2	То., Е. Ν.	38 недель беременности. Плодная гипотрофия. Вагинит.		2,0
3	Νε.,Ν. Ν.	33 недели беременности. Пиелонефрит. Вагинит.		0
4	81., А. О.	38 недель беременности. Узкий таз. Вагинит.		2,5
5	8о., Т. Ν.	40 недель беременности. Вагинит.		1,5
6	сь„ о. с.	29-30 недель беременности. Опасность преждевременных родов. Вагинит.		1,9
7	Ку, V. V.	29 недель беременности. Признаки родов. Вагинит.		1,5
8	Ма, К. 8.	38 недель беременности. Цервикальная эрозия. Вагинит.		2,0
9	8ΐ, Ь. Е.	38-39 недель беременности. Узкий таз. Цервикальная эрозия. Вагинит.		1,4
10	Ьа., V. 8.	36-37 недель беременности. Опасность преждевременных родов. Вагинит.		1,2
11	8ί„ М. А.	39 недель беременности. Нефропатия. Анемия. Вагинит.		1,0
12	8к, 8. V.	37-38 недель беременности.	-	0

-25 008194

		Нефропатия. Вагинит.
13	АЬ., К. V.	36-37 недель беременности. Опасность преждевременных родов. Вагинит.		0
14	Си., Е. К.	36 недель беременности. Опасность преждевременных родов. Вагинит.		3,0
15	Ко., N. V.	35 недель беременности. Вагинит.		1,5
16	8. V.	32 недели беременности. Цервикальная эрозия. Вагинит.		0
17	Ζά., I. V.	35 недель беременности. Опасность преждевременных родов. Цервикальная эрозия. Вагинит.		1,0
18	Ко., Т. V.	24 недель беременности. Опасность преждевременных родов. Вагинит.		0
19	Ма., I. V.	36 недель беременности. Опасность преждевременных родов. Вагинит.		0
20	Ιο., I. V.	40 недель беременности. Цервикальная эрозия. Вагинит.		0
21	Ма., 8.	39 недель беременности.	-	0
22	Уе., Е. Ь.	38 недель беременности. Цервикальная эрозия. Вагинит.		0
23	81., I. Ν.	36 недель беременности. Нефропатия. Вагинит.	-	0
24	Ко., V. А.	39-40 недель беременности. Анемия. Вагинит.	-	0
25	Ри., Т. А.	38-39 недель беременности.	-	0
26	Ти., Υ. А.	21 неделя беременности. Подозрение на РКОМ.	-	0
27	Νο., 6. V.	22 недели беременности. Опасность прекращения.	-	0
28	Ма., Е. V.	31-32 недели беременности. Пиелонефрит. Вагинит.	-	0
29	8ΐ„ I. V.	36 недель беременности. Опасность прекращения.		0
30	Ка.,К.Р.	32 недели беременности. Нефропатия.	-	0

Пример 9. Модификации характеристик стрип-устройства.

В первом эксперименте приготовили растворы М52 МАЬ с концентрациями 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 и 1/32 мг/мл. Каждый раствор поместили в стрип-устройство. Смесь трех МАЬ (М52, М271, М42) также разбавили до концентраций 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16 и 1/32 от исходной концентрации и каждый разбавленный раствор ввели в отдельное стрип-устройство. Затем в каждое из 12 стрип-устройств добавили раствор, содержащий РАМС-1 с концентрацией 50 нг/мл. Раствор чистого антитела создал в зоне анализа окрашенную полосу, видимую при концентрации 1/8, а окрашенная полоса смеси МАЬ стала видимой при концентрации 1/2. Таким образом, смесь МАЬ препятствует присоединению молекул РАМС-1, регулируя тем самым видимость полосы.

Моноклональные антитела с концентрациями М52: 0,8 мг/мл и М42: 0,1 мг/мл поместили в зону анализа нескольких стрип-устройств. Затем в зону анализа каждого стрип-устройства согласно настоящему изобретению добавили РАМС-1 с широким диапазоном концентраций от 12800 до 7 нг/мл и с концентрацией 1 нг/мл. Индикаторную полосу можно было видеть невооруженным глазом в диапазоне концентраций РАМС-1 от 12800 до 7 нг/мл, при этом она была невидима при концентрации 1 нг/мл. В то же время, в случае применения раствора чистого М52 с такими же концентрациями индикаторную полосу можно было видеть во всем диапазоне концентраций РАМС-1, включая 1 нг/мл, хотя ее интенсивность при 1 нг/мл была низкой. Это существенно увеличивает вероятность получения ложноположительных результатов у пациенток с определенными медицинскими состояниями, в частности с воспалением.

1. Настройка чувствительности стрип-устройства согласно изобретению с помощью комбинации двух антител в зоне анализа.

В первом эксперименте в зону анализа вводили только антитела М52 (с концентрацией 0,4 мг/мл). Во втором эксперименте в зону анализа вводили антитела М52 (с концентрацией 0,4 мг/мл) и антитела М271 (с концентрацией 0,4 мг/мл). Антитела М271, конъюгированные с частицами золота, вводили в зону прокладки с концентрацией, выбранной таким образом, чтобы оптическая плотность была равна десяти при длине волны 510 нм. Этот конъюгат вводили в прокладку в растворе, содержащем 10% сахарозы и 2% казеина. РАМО-1 титровали до концентраций 20, 10, 5 и 1 нг/мл.

-26008194

В приведенных ниже таблицах представлены результаты измерения относительной оптической плотности, полученные сканером с помощью программы Зщта Зсап. Антитела М271 находятся на прокладке, а комбинация М271+М52 - в зоне анализа. Знак + указывает видимость индикаторной полосы (достаточно окрашена для наблюдения невооруженным глазом), а знак - невозможность наблюдения индикаторной полосы невооруженным глазом.

Концентрация РАМО-1, нг/мл	20	10	5	1
МАЬ М52	62	58	39	2
Видимость	+	+	+	-
МА6М52+М271	82	8	2	4
Видимость	+	-	-	-

Чувствительность анализа изменилась с 5 нг/мл в первом эксперименте до 20 нг/мл во втором эксперименте. Можно сделать вывод, что добавление МАЪ М271 в зону анализа приводит к подавлению чувствительности в четыре раза.

2. Настройка интенсивности индикаторной полосы в стрип-устройстве с помощью комбинации из двух антител.

В первом эксперименте в зону анализа вводили только антитела М52 (с концентрацией 0,8 мг/мл). Во втором эксперименте в зону анализа вводили антитела М52 (с концентрацией 0,8 мг/мл), антитела М271 (с концентрацией 0,7 мг/мл) и антитела М42 (с концентрацией 0,8 мг/мл). Смесь антител для ввода в зону анализа получили следующим образом: 14 мкл (микролитров) раствора антитела М52 с концентрацией 8,6 мг/мл смешали с 7 мкл раствора М42 с концентрацией 13,9 мг/мкл и с 3 мкл раствора М271 с концентрацией 10,9 мг/мл. Затем добавили буфер до суммарного объема 150 мкл и ввели раствор в стрип-устройство.

В приведенной ниже таблице представлены значения относительной оптической плотности.

Концентрация РАМО-1, нг/мл	50	25	12	6	3	1,5
МАЬ М52	17	13	9	5	2	0
Видимость	+	+	+	+	-	-
МАЬ М271+М52+М42	25	18	13	3	0	0
	+	+	+	-	-	-

Наклон (градиент) кривой оптической плотности отличался в первом и втором эксперименте. При концентрации РАМО-1 12 нг/мл цветная линия на стрипе во втором эксперименте была ярче, чем в первом эксперименте. При концентрации РАМО-1 6 нг/мл цветная линия в стрипе была видна в первом эксперименте, но не видна во втором эксперименте.

В случае комбинации антител визуально наблюдали более яркие полосы. Таким образом, независимо от почти одинаковой чувствительности интенсивность окрашивания, наблюдаемая невооруженным глазом, различается.

3. Настройка чувствительности и наклона кривой интенсивности окрашивания устройства согласно настоящему изобретению с помощью комбинации из четырех антител.

В приведенной ниже таблице + указывает видимость индикаторной полосы, а - невозможность наблюдения индикаторной полосы невооруженным глазом.

Концентрация РАМО-1, нг/мл	0	1	2,5	5	10	25	50
МАЬ М52+М42+М172	-	-	-	-	+	+	+
МАЬ М271+ М52+М42+М122	-	-	-	+	+	+	+

Таким образом, комбинируя антитела, можно настраивать чувствительность анализа.

Пример 10: Результаты клинических испытаний.

Протокол исследования

Состояние пациенток оценивали по результатам клинического обследования и с помощью устройства согласно настоящему изобретению.

Критерии включения:

1) . Срок беременности 20-41 неделя.

2) . Пациентка сообщает о признаках или симптомах, предполагающих РКОМ или РРКОМ.

3) . Количественные анализы вагинального секрета отсутствовали до получения проб с целью выявления у пациентки РКОМ или РРКОМ.

-27008194

4). Пациентка согласна на проведение стерильного исследования с помощью зеркала с целью сбора стандарных клинических данных (депонирование, гидразин, феномен папортника) и стерильный смыв для анализа РАМО-1.

Критерии исключения:

1) . Активное вагинальное кровотечение, имеющее любой источник.

2) . Предлежание плаценты.

Статистический анализ 192 пациенток от 15.12.2000, проведенный в больницах 8Иагр Метопа1 Магу Впей Но§рйа1 £ог \¥отеп (Сан Диего) и 8иттй МесИса1 СеШег (Окленд).

У двух пациенток из 192 устройство согласно настоящему изобретению дало положительный результат, в то время как стандартное клиническое обследование не показало наличия РКОМ. Поэтому указанные два случая первоначально отнесли к ложноположительному результату устройства согласно настоящему изобретению (см. ниже Некорректированные данные). Однако у обеих пациенток в течение нескольких часов после обследования появились симптомы РКОМ. При втором клиническом обследовании диагноз РКОМ подтвердился, и оба результата, полученные с помощью устройства согласно настоящему изобретению, отнесли к истинно положительным (окончательные результаты испытаний представлены ниже в столбце Откорректированные).

Обобщенные данные Обобщенные данные (Не корректированные) ϋχ РКОМ (Корректированные) ϋχ РКОМ а= 84, Ь = 5, с = 2, ά = 101

Чувствительность = а/(а+с) = 84/(84+2) = 97,7% Специфичность = 4/(Ь+4) = 101/(5+101) = 95,3%

РРУ = а/(а+Ь) - 84/(84+5) = 94,4%

ΝΡν = 4/(4+с) = 101/(101+2) = 98,1% где а - число наблюдавшихся истинных положительных случаев;

Ь - число наблюдавшихся ложноотрицательных случаев;

с - число наблюдавшихся ложноположительных случаев;

ά - число наблюдавшихся истинных а = 88,Ь= 1,с = 0,а= 103

Чувствительность = 84/(84+0) = 100% Специфичность = 103/(1+103) = 99% РРУ = 88/(88+1) = 99%

ΝΡΥ= 103/(103+0) = 100% отрицательных случаев;

Чувствительность = а/(а+с);

Специфичность = (1/(Ь+<Л);

Положительная прогнозируемая величина:

РРУ = а/(а+Ь);

Отрицательная прогнозируемая величина:

ΝΡν=ά/(ά+ο);

Истинная положительная величина представляет собой количество положительных результатов, полученных с помощью устройства согласно настоящему изобретению, РКОМ подтвержден последующим клиническим обследованием, истинная отрицательная величина представляет собой количество отрицательных результатов, подтвержденных последующим клиническим обследованием, ложная положительная величина представляет собой количество положительных результатов, для которых РКОМ не подтвержден последующим клиническим обследованием, ложная отрицательная величина представляет собой количество отрицательных результатов, для которых РКОМ подтвержден последующим клиническим обследованием.

-28008194

Таблица 12

Результаты испытания устройства согласно настоящему изобретению (лот С 98-0007) в третьем родильном доме Москвы, Российская Федерация, отделение акушерства и гинекологии №2

№	Имя (инициалы фамилии, имении, отчества)	Диагноз	Результаты Атташе	Примечания
1	8ег., Ь. В.	17 недель беременности. Угроза выкидыша. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
2	Ста., Г. А.	17 недель беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование; отсутствие подтекания.
3	Κιιζ., М. В.	23 недели беременности. рН - отрицательное. Кровь.	Отрицательный	Отсутствие подтекания.
4	Ви1., Μ. V.	39 недель беременности. Подозрение на подтекание. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование: увеличенное вагинальное выделение. Дополнительное обследование: положительный результат теста подтвердился (увеличение выделения, начало родов).
5	Кга„ Е. И.	40 недель беременности. Гестоз. Амниотомия.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
6	Ме1„ N. V.	39 недель беременности. Гестоз. Мочекаменная болезнь.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
7	Вий., 8. Ν.	40 недель беременности. Повышенное	Отрицательный	Клиническое обследование:

-29008194

		артериальное давление.		отсутствие подтекания.
8	Νΐν., I. Ρ.	27-28 недель беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
9	А1к., А.	35 недель беременности. Угроза выкидыша. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
10	Уак., Г. А.	40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
11	ΚΪ8., О. V.	33 недели беременности. Угроза выкидыша. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
12	Коек., Ь. А.	34 недели беременности. Подозрение на подтекание.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
13	Вак, 8. А.	32 недели беременности. Угроза выкидыша. Гестоз.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
14	Мог., I. 8.	32 недели беременности. Угроза выкидыша. Вагинит	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
15	и_ёг.,Т. I.	33 недели беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
16	Рау., Ν. А.	22-23 недели беременности. Гестоз. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
17	Во§., Т. I.	29 недель беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
18	Уаг., Т. I.	32 недели беременности. Гестоз.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
19	Оа1„ О. V.	35 недель беременности. Гестоз. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие

-30008194

				подтекания.
20	Κοζ., О. А.	40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
21	8еп., 8, (3.	12-13 недель беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
22	Ро1„ Е. А.	21 неделя беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
23	Вег., Б. М.	24 недели беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
24	Αρά.,ν. М.	39 недель беременности. Острый гестоз. Плацентарная недостаточность.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
25	Ак1., А.	8 недель беременности. Гестоз. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.

Таблица 13

Результаты испытания устройства согласно настоящему изобретению (лот С 98-0007) в третьем родильном доме Москвы, Российская Федерация

№	Имя	Диагноз	Результаты Ашшзиге	Примечания
1	Гап., Е. А.	38 недель беременности. Отек.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
2	8еш., Ζ. О.	36 недель беременности. Гестоз.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
3	ТаЬ., N. V.	36-37 недель беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
4	гай., О. Р.	35 недель беременности. Отек. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
5	Оет., О. V.	38-39 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое

-31 008194

		Отек.		обследование подтвердило результаты теста.
6	Уи1., ϋ. V.	32 недели беременности. Угроза выкидыша. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
7	Κίο., V. V.	38-39 недель беременности. Отек. Пиелонефрит. Эрозия шейки матки.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
8	Вог., Ε. Α.	35-36 недель беременности. Нарушение плацентарной циркуляции.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
9	1ег„ Ε. Α.	40-41 неделя беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
10	У1к., Ν. Ρ.	41-42 недели беременности. Пиелонефрит. Отек. Вагинит.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
11	Тик, 0. 8.	35-36 недель беременности. Гестоз. Ожирение.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
12	Μεά., Τ. Ε.	38-39 недель беременности. Варикоз.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
13	Κιχζ., Τ. Α.	39-40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
14	КаЬ., Ε. Μ.	39-40 недель беременности. Отек. Полигидрамнион.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
15	СЬе., Ε. V.	39-40 недель беременности. Отек. Анемия.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
16	ΤΐΚ, Τ. Υ.	40 недель беременности. Предэклампсия.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
17	ВаЬ., N. I.	39-40 недель беременности. Прогноз родов. Подозрение	Отрицательный	Клиническое обследование
		на подтекание.		подтвердило результаты теста.
18	Сток N. V.	38-39 недель беременности. Гипоксия плода.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.
19	Οή., О. V.	25 недель беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование подтвердило результаты теста.

-32008194

Таблица 14

№	Диагноз	Результаты Атшзиге	Примечания
1	40 недель беременности. Гигантский плод. Подозрение на подтекание.	Положительный	Родовые схватки, роды проходили в течение 4 часов. Наблюдали очевидное подтекание.
2	34 недели беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование в течение 6 часов: отсутствие подтекания.
3	39 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
4	40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
5	39-40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
6	39-40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
7	39-40 недель беременности. Эрозия шейки матки.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
8	40 недель беременности. Симптомы родов. Подтекание амниотической жидкости.	Положительный	Клиническое обследование: подтекание амниотической жидкости.
9	40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
10	39-40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
И	39 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.

-33008194

Таблица 15 Результаты испытания устройства согласно настоящему изобретению (лот С 98-0007) в третьем родильном доме Москвы, Российская Федерация, отделение акушерства и гинекологии, кафедра Г осу дарственного Московского университета России

№	Диагноз	Результаты Атшзиге	Примечания
1	39 недель беременности. Нефропатия. Гидрамнион.	Отрицательный	Родовые схватки, родовая активность развивалась в течение 4 часов. Наблюдали очевидное подтекание.
2	41 неделя беременности. Отек.	Отрицательный	Клиническое обследование в течение 6 часов: отсутствие подтекания.
3	39-40 недель беременности. Гигантский плод. Родовые симптомы. Нефропатия.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
4	39-40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
5	37-38 недель беременности. Примесь крови. Повышенное кровяное давление.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
6	36 недель беременности. Нефропатия.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
7	40 недель беременности. Подозрение на подтекание.	Положительный	Клиническое обследование: подтекание. Роды проходили в течение 30 минут.
8	39-40 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания амниотической жидкости.
9	38-39 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
10	38 недель беременности.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
11	39 недель беременности. Несовершеннолетняя роженица.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
12	32 недели беременности. Гипотрофия плода.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
13	39-40 недель беременности. Гестоз.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
14	24 недели беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
15	34-35 недель	Отрицательный	Клиническое обследование:
	беременности. Гестоз.		отсутствие подтекания.
16	33 недели беременности. Отек.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
17	34-35 недель беременности. Гестоз.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
18	35-36 недель беременности. Г ипотрофия плода.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
19	32 недели беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
20	38-39 недель беременности. Подозрение на подтекание. Примесь крови во влагалищном выделении.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания. Воды отходили в течение 10 часов, начались роды.
21	40-41 неделя беременности. Симптомы родов.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
22	25 недель беременности. Угроза выкидыша.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.
23	28 недель беременности. Гестоз.	Отрицательный	Клиническое обследование: отсутствие подтекания.

Примечания: подтекание амниотической жидкости в табл. 13, 14, 15 при клиническом обследовании оценивали по количеству влагалищного выделения и с помощью ультразвукового анализа.

-34008194

Расширенное клиническое обследование в случае отрицательных результатов теста было возможным, поскольку пациенток госпитализировали для лечения сопутствующих заболеваний.

Специфические варианты реализации настоящего изобретения, приведенные в данном описании, не ограничивают области распространения изобретения. Различные модификации изобретения, кроме описанных здесь, являются очевидными для специалистов в данной области из приведенного выше описания и прилагаемых фигур. Такие модификации включаются в область распространения прилагаемой формулы изобретения.

Следует также понимать, что все приведенные числовые значения величин являются приблизительными и предназначены только описания.

Патенты, патентные заявки, публикации, описания продуктов и протоколы, цитируемые в настоящей заявке, полностью приведены здесь в качестве ссылки в любых целях.

Таблица 16 Микроорганизмы, хранящиеся в депозитарии Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) (Дорожный проезд, Москва 117545, Россия)

Наименование	Дата регистрации	Инвентарный номер
Гибрид омные клеточные линии № 52	22 мая 2003 г.	ВКПМ Н-92
Гибрид омные клеточные линии № 271	22 мая 2003 г.	ВКПМ Н-93
Г ибридомные клеточные линии № 42	22 мая 2003 г.	ВКПМ Н-94

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ минимизации вероятности получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов при обнаружении присутствия малых количеств амниотической жидкости во влагалищном секрете беременных женщин, при этом указанный способ включает:

(ΐ) выбор высокоспецифичной пары моноклональных антител для определения минимальной фоновой концентрации плацентарного альфа-1-микроглобулина (РАМС-1) во влагалищном секрете; и (й) выбор дополнительных моноклональных антител против РАМС-1 для использования в сочетании с указанной парой высокоспецифичных моноклональных антител в устройстве для проведения стрип-тестов с целью точной установки предварительно заданного порога чувствительности устройства для проведения стрип-тестов.
2. Способ по π. 1, отличающийся тем, что одна пара высокоспецифичных моноклональных антител (ΐ) локализована в зоне прокладки стрип-устройства.
3. Способ по π. 1, отличающийся тем, что одна пара высокоспецифичных моноклональных антител связана с маркером.
4. Способ по п.З, отличающийся тем, что маркер представляет собой окрашенную частицу.
5. Способ по π. 1, отличающийся тем, что одна пара высокоспецифичных моноклональных антител (ΐ) локализована в зоне анализа стрип-устройства.
6. Способ по π. 1, отличающийся тем, что одно или несколько дополнительных моноклональных антител против РАМС-1 (й) локализуют в зоне анализа указанного стрип-устройства в предварительно заданной пропорции по отношению к одному антителу (ΐ) из высокоспецифичной пары моноклональных антител, локализованных в указанной зоне анализа стрип-устройства.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что указанные дополнительные антитела (й) используют в сочетании с указанной парой высокоспецифичных моноклональных антител для установки предварительно заданного порога чувствительности указанного стрип-устройства.
8. Способ по пп.1, 6 и 7, отличающийся тем, что указанные моноклональные антитела против РАМС-1 (ΐ) и (й) используют в сочетании в заданной пропорции по отношению друг к другу для установки оптимального интервала между фоновым уровнем содержания указанного РАМС-1 во влагалищном секрете, составляющим около 0,05-0,2 нг/мл, и пороговой чувствительностью указанного стрипустройства, при этом указанное пороговое значение устанавливают в пределах от 5 до 10 нг/мл, чтобы минимизировать вероятность получения ложноотрицательных и ложноположительных результатов при определении малых концентраций амниотической жидкости во влагалищном секрете беременных женщин.
9. Способ определения попадания амниотической жидкости в вагинальный секрет, включающий обнаружение связывания пары антител, специфичных для РАМС-1 во влагалищном секрете.

-35008194
10. Способ по п.9, отличающийся тем, что пара антител является чувствительной к уровню РАМС1, превышающему фоновое значение.
11. Способ по п.9, отличающийся тем, что одно из пары антител иммобилизуют на твердотельной подложке.
12. Способ по п.11, отличающийся тем, что твердотельная подложка представляет собой мембрану, через которую жидкость может перемещаться под действием капиллярных сил.
13. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанные антитела являются моноклональными антителами.
14. Способ по п.11, отличающийся тем, что он дополнительно включает использование третьего антитела, специфичного для РАМС-1 и иммобилизованного на твердой подложке.
15. Способ по п.14, отличающийся тем, что содержание антител, иммобилизованных на твердотельной подложке, обеспечивает пороговый уровень обнаружения РАМС-1 примерно 5 нг/мл.
16. Способ по п.13, отличающийся тем, что моноклональное антитело выбирают из группы, включающей М271, образованное гибридомой N271, которая хранится в депозитарии Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) с инвентарным номером ВКПМ-93, М52, образованное гибридомой N52, которая хранится в ВКПМ с инвентарным номером ВКПМ-92, и М42, образованное гибридомой N42, которая хранится в ВКПМ с инвентарным номером ВКПМ-94.
17. Устройство, содержащее иммобилизованное антитело, специфичное для РАМС-1, и мобилизуемое антитело, специфичное для РАМС-1, при этом мобилизация мобилизуемого антитела жидким образцом обеспечивает связывание мобилизуемого антитела с каким-либо РАМС-1 в образце и связывание образующегося комплекса мобилизуемое антитело-РАМС-1 с иммобилизованным антителом, при этом мобилизуемое антитело содержит маркер.
18. Устройство по п.17, отличающееся тем, что указанные антитела являются моноклональными антителами.
19. Устройство по п.17, отличающееся тем, что иммобилизованное антитело иммобилизуют на мембранной подложке.
20. Устройство по п.17, отличающееся тем, что маркер представляет собой коллоидное золото.
21. Устройство по п.17, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит третье антитело, специфичное для РАМС-1 и иммобилизованное на твердой подложке.
22. Устройство по п.17, отличающееся тем, что отношение антител, иммобилизованных на твердотельной подложке, обеспечивает пороговый уровень обнаружения РАМС-1 примерно 5 нг/мл.
23. Устройство по п.17, отличающееся тем, что моноклональное антитело выбирают из группы, включающей М271, образованное гибридомой N271, которая хранится в депозитарии Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) с инвентарным номером ВКПМ-93, М52, образованное гибридомой N52, которая хранится в ВКПМ с инвентарным номером ВКПМ-92, и М42, образованное гибридомой N42, которая хранится в ВКПМ с инвентарным номером ВКПМ-94.