DE102006041644A1

DE102006041644A1 - Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid

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Publication number: DE102006041644A1
Application number: DE200610041644
Authority: DE
Inventors: Daniel Dr. Bächle; Thomas Dr. Flad; Alexander Cansier
Original assignee: PANATecs GmbH
Current assignee: PANATecs GmbH
Priority date: 2006-08-23
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2008-03-20
Anticipated expiration: 2026-08-24
Also published as: DE102006041644B4

Abstract

Es wird ein Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid vorgeschlagen, das die folgenden Schritte aufweist: Bereitstellen einer biologischen Probe, die zumindest ein Protein oder Peptid aufweist, Behandeln der Probe mit zumindest einer schnittstellenspezifischen Protease zur Erzeugung einer Mischung aus Fragmentpeptiden, Analyse der erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden zur Erzeugung eines Fragmentierungsmusters, Vergleich des erhaltenen Fragmentierungsmusters mit einem Referenzfragmentierungsmuster, das, ausgehend von dem Protein oder Peptid, ohne die Modifikation erhalten wurde, und Detektieren der Modifikationen anhand der Unterschiede zwischen dem Fragmentierungsmuster und dem Referenzfragmentierungsmuster.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid, sowie ein Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, die mit solchen Modifikationen in Zusammenhang stehen, ein Verfahren zur Dopingkontrolle, einen Kit, der zur Durchführung der Verfahren verwendet werden kann, sowie die Verwendung eines mit einer schnittstellenspezifischen Protease erhaltenen Fragmentierungsmusters eines Proteins oder Peptids und die Verwendung einer schnittstellenspezifischen Protease.
Proteine und Peptide sind natürliche Polymere, die aus Aminosäuren gebildet werden, die über Peptidbindungen verknüpft sind. Die Funktion oder Wirkung eines Proteins oder Peptids im Metabolismus eines Organismus wird dabei wesentlich von der Aminosäuresequenz, die auch als Primärstruktur bezeichnet wird, bestimmt. Ferner kann diese Primärstruktur z.B. durch eine Glykosylierung oder eine Phosphorylierung weiter chemisch bzw. biochemisch verändert werden, was zu einer Veränderung der Funktion oder Aktivität des Proteins oder Peptids führen kann.
In einem Protein oder Peptid können nun Modifikationen vorkommen, die dieses Protein oder Peptid von einem Referenzprotein oder -Peptid unterscheiden. Bei diesem Referenzprotein oder -Peptid kann es sich z.B. um den Wildtyp eines Proteins oder Peptids oder auch um ein gezielt hergestelltes Protein oder Peptid handeln. Solche Modifikationen können sowohl beispielsweise zur Erlangung einer besonderen Aktivität des Proteins oder Peptids gegenüber dem Referenzprotein oder -Peptid gewünscht als auch unerwünscht sein. Die unerwünschten Modifikationen können entweder selbst Auslöser für Störungen im Organismus, also Krankheiten, sein oder auch einen Anzeiger für Störungen in einem Organismus darstellen.
Ein Beispiel für eine gewünschte Modifikation in einem Protein oder Peptid ist das Insulin-Analog Lispro, in dem die Aminosäuren Lysin und Prolin an Position 25 und 28 der B-Kette gegenüber humanem Insulin vertauscht sind. Dies führt zu einem Insulin-Analog, das deutlich schneller aufgenommen wird.
Ein Beispiel für eine mit einem krankhaften Zustand eines Organismus assoziierte Modifikation ist die Deiminierung der proteinogenen Aminosäure Arginin zur unnatürlichen Aminosäure Citrullin, bei der die Ureidogruppe des Arginins durch eine Carbamoylgruppe ersetzt wird. Eine solche Deiminierung in Proteinen, die Arginin enthalten, ist häufig mit entzündlichen Krankheiten bzw. Autoimmunkrankheiten wie z.B. multipler Sklerose oder rheumatoider Arthritis assoziiert; vgl. Vossenaar et al. (2004), Arthritis Res. Ther. 6: R142.
Ferner ist es in den letzten Jahren insbesondere im Bereich des Hochleistungssports zu einer vermehrten Einnahme von leistungssteigernden Substanzen auf Basis von Proteinen oder Peptiden (Doping) gekommen. Solche Proteine oder Peptide unterscheiden sich ebenfalls häufig durch Modifikationen von den natürlich im Körper vorkommenden Proteinen oder Peptiden. Beispiele für solche Substanzen sind Erythropoetin, Insulin-Analoga, biotechnologisch hergestellte Wachstumshormone oder zur Aktivitätssteigerung veränderter Insulin-like growth factor (IGF). Zum Nachweis von Doping waren daher Analysemethoden nützlich, mit denen solche modifizierten Substanzen auch in geringen Mengen sicher nachgewiesen werden können.
Da die zuvor beschriebenen Modifikationen häufig nur zu relativ geringen strukturellen Veränderungen in einem Protein oder Peptid führen, werden die modifizierten Proteine selbst von spezifischen Antikörpern oft nicht von den nicht modifizierten Proteinen oder Peptiden unterschieden. Somit ist eine direkte Detektion einer Modifikation mit immunologischen Methoden häufig nicht zuverlässig möglich.
Auch die direkte Detektion von Modifikationen mit massenspektrometrischen Methoden ist oft schwierig, da die Modifikationen häufig zu keiner oder nur zu relativ geringen Masseunterschieden (eine einzige Deiminierung in einem Protein oder Peptid führt z.B. zu einem Massenunterschied von nur 1 Da) führen, so dass das Signal für ein modifiziertes Protein oder Peptid häufig von dem Signal des nicht modifizierten Proteins oder Peptids überdeckt wird. Modifikationen wie der Austausch der Positionen von Aminosäuren in einem Protein oder Peptid haben gar keinen Einfluss auf das Molekulargewicht des Proteins und sind somit mit massenspektrometrischen Verfahren überhaupt nicht direkt nachweisbar.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid bereitzustellen, mit dem Modifikationen einfach und zuverlässig auch bei einer relativ geringen Konzentration an modifiziertem Protein oder Peptid detektiert werden können.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Diagnose von Krankheiten bereitzustellen, die mit solchen Modifikationen in Zusammenhang stehen, mit denen Krankheiten in einem früheren Stadium diagnostiziert werden können, als dies mit derzeit bekannten Verfahren möglich ist, und mit denen der Krankheitsverlauf mit größerer Genauigkeit verfolgt werden kann.
Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis von Doping durch modifizierte Proteine oder Peptide bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die erste Aufgabe durch ein Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid gelöst, das die folgenden Schritte aufweist:

1. Bereitstellen einer biologischen Probe, die zumindest ein Protein oder Peptid aufweist,
2. Behandeln der Probe mit zumindest einer schnittstellenspezifischen Protease zur Erzeugung einer Mischung aus Fragmentpeptiden,
3. Analyse der in Schritt 2. erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden zur Erzeugung eines Fragmentierungsmusters,
4. Vergleich des in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmusters mit einem Referenzfragmentierungsmuster, das ausgehend von dem Protein oder Peptid ohne die Modifikation nach den Schritten 1. bis 3. erhalten wurde,
5. Detektieren der Modifikation anhand der Unterschiede zwischen dem in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmuster und dem Referenzfragmentierungsmuster.

Ferner wird die zweite Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, die mit Modifikationen von zumindest einem Protein oder Peptid im Zusammenhang stehen, mit den folgenden Schritten gelöst:

A. Bereitstellen einer biologischen Probe,
B. Unterziehen der Probe einem Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid,
C. optional ein ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt B., und
D. Bewertung des Krankheitszustands basierend auf der Art und dem Ausmaß der in Schritt B. detektierten Modifikationen,

Ferner wird die dritte Aufgabe durch ein Verfahren zum Nachweis von Doping mit zumindest einem modifizierten Protein oder Peptid mit den folgenden Schritten gelöst:

A. Bereitstellen einer biologischen Probe,
B. Unterziehen der Probe einem Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid,
C. optional ein ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt B., und
D. Nachweis von Doping mit zumindest einem modifizierten Protein oder Peptid basierend auf der Art und dem Ausmaß der in Schritt B. detektierten Modifikationen,

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung einen Kit zur Detektion von Modifikationen von Proteinen oder Peptiden, der Folgendes aufweist:

– zumindest eine schnittstellenspezifische Protease,
– zumindest ein Referenzfragmentierungsmuster für die Fragmentierung eines nicht modifizierten Proteins oder Peptids mit der zumindest einen schnittstellenspezifischen Protease des Kits, und
– eine Anleitung zum Durchführen der erfindungsgemäßen Verfahren.

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines mit einer schnittstellenspezifischen Protease erhaltenen Fragmentierungsmusters eines Proteins oder Peptids zur Detektion einer Modifikation des Proteins oder Peptids.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung einer schnittstellenspezifischen Protease zur Detektion einer Modifikation eines Proteins oder Peptids.

Die Erfinder haben überraschenderweise herausgefunden, dass gewisse Modifikationen von Proteinen und Peptiden zum Wegfallen, Auftreten oder zu einer Verschiebung von Schnittstellen für schnittstellenspezifische Proteasen führen können. Dies kann z.B. durch den Wegfall oder Austausch von Aminosäuren oder eine Änderung der Abfolge von Aminosäuren passieren. Ein weiterer Grund für das Auftreten und Wegfallen von Schnittstellen für schnittstellenspezifische Proteasen können posttranslationale bzw. chemisch eingeführte Modifikationen an den Seitenketten von Aminosäuren sein. Einige dieser Modifikationen und Proteasen, deren Schnittstellen durch die Modifikationen wegfallen, sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1

Modifikation [modifizierte Aminosäuren]	Betroffene schnittstellenspezifische Protease
Deiminierung [Arg] Chemische Modifikation der ε-Aminogruppe [Lys]	Trypsin bzw. Trypsin in Verbindung mit LysC
N-Glykosylierung [Asn]	Asparaginyl-Endopeptidase
Modifikation am N-Terminus (z.B. Acetylierung, Palmitoylierung, Formylierung)	Aminopeptidase
Modifikation am C-Terminus (z.B. Amidierung, ADP-Ribosylierung)	Carboxyopeptidase
γ-Carboxylierung [Glu]	Endoprotease GluC
Deamidierung [Asn]	Endoprotease AspN
Sulfatisierung [Tyr] Phosphorylierung [Tyr]	Cathepsin D

Durch den Wegfall, die Verschiebung oder das Auftreten von Schnittstellen in einem modifizierten Protein oder Peptid kommt es gegenüber einem nicht modifizierten Protein oder Peptid zu einer Veränderung des durch die Behandlung mit der schnittstellenspezifischen Protease erzeugten Fragmentierungsmusters.
Genauer gesagt liegen im Falle einer solchen Modifikation für die schnittstellenspezifische Protease mehr, weniger, keine oder andere Schnittstellen vor, und somit kommt es zu einer veränderten Fragmentierung. Da die gebildeten Fragmente sich z.B. in ihrer Masse, jedoch auch in anderen Eigenschaften deutlich von den ursprünglichen Proteinen oder Peptiden unterscheiden, lassen sich die Unterschiede in den gebildeten Fragmenten und damit die Modifikationen deutlich einfacher und mit höherer Genauigkeit detektieren.
Gemäß der Erfindung erfolgt die Detektion der Modifikation also nicht mehr durch die direkte Detektion des modifizierten Proteins oder Peptids, sondern indirekt über die Fragmentierung dieses Proteins oder Peptids bei der Umsetzung mit einer schnittstellenspezifischen Protease. Durch die hohe Spezifität von schnittstellenspezifischen Proteasen können Veränderungen an diesen Schnittstellen mit einer hohen Zuverlässigkeit detektiert werden, was eine frühere und genauere Detektion von Modifikationen und damit auch eine Diagnose von Krankheiten, eine Qualitätskontrolle von Biopharmaka oder den Nachweis von Doping möglich macht.
Der Begriff "biologische Probe", wie er zuvor und hiernach verwendet wird, schließt jede Probe ein, in der Proteine oder Peptide erwartet werden. Beispielsweise kann diese Probe menschlichen, tierischen, pflanzlichen, mykotischen, bakteriellen oder viralen Ursprungs sein. Dies schließt aber auch Proben nicht-biologischen Ursprungs ein.
Der Begriff "Peptid", wie er zuvor und hiernach verwendet wird, beschreibt die Verkettung von zumindest zwei Aminosäuren durch eine Peptidbindung. Bei den Aminosäuren kann es sich sowohl um natürliche, proteinogene als auch um unnatürliche, nicht-proteinogene Aminosäuren und sowohl um L- als auch um D-Aminosäuren handeln. Diese Aminosäuren sowie die Peptide können sowohl synthetisch in vitro als auch in vivo hergestellt sein.
Der Begriff "Protein", wie er zuvor und hiernach verwendet wird, beschreibt die Verkettung von zumindest zwei Peptiden durch eine Peptidbindung. Die Proteine können sowohl synthetisch in vitro als auch in vivo hergestellt sein.
Der Begriff "Fragmentpeptid", wie er zuvor und hiernach verwendet wird, beschreibt ein Peptid, das durch Behandlung eines Proteins oder Peptids mit einer schnittstellenspezifischen Protease erhalten wurde. Hierbei sind auch Proteine und Peptide eingeschlossen, die aufgrund des Wegfalls aller Schnittstellen keine Veränderung erfahren haben.
Der Begriff "schnittstellenspezifische Protease" beschreibt eine Substanz, die ein Protein oder Peptid spezifisch und reproduzierbar an einer oder mehreren Stellen innerhalb der Aminosäure-Sequenz des Proteins oder Peptids spaltet. Eine solche Protease ist insbesondere, aber nicht ausschließlich, ein natürliches oder rekombinantes Enzym.
Der Begriff "schnittstellenspezifische Protease" schließt auch sequenzspezifisch spaltende Chemikalien nicht-biologischen oder nur teilweise biologischen Ursprungs ein. Beispiele für Spaltungen durch schnittstellenspezifische Chemikalien zur chemischen Fragmentierung von Peptiden und Proteinen schließen Folgendes ein, nämlich die Spaltung am Methionin mit Bromcyan, die Spaltung an Asparagin-Prolin-Bindungen durch saure Hydrolyse mit vorzugsweise 70 % (v/v) Essigsäure oder Trifluoressigsäure, die Spaltung an Tryptophan mit Iodosobenzoesäure, und die Spaltung von Asparagin-Glycin-Bindungen mit Hydroxylamin.
In einer Ausgestaltung der Erfindung ist die Modifikation eine Sequenzmodifikation.
Unter dem Begriff "Sequenzmodifikation", wie er hierin verwendet wird, wird jede Änderung der Aminosäuresequenz gegenüber dem Referenzprotein oder -Peptid oder verstanden. Diese Modifikationen können entweder bereits während der Protein- oder Peptidsynthese auftreten oder können durch nachträgliche chemische Modifikation einzelner Aminosäuren entstehen.
Beispiele für Sequenzmodifikationen, die während der Peptidsynthese auftreten, schließen sowohl Mutationen, die durch Veränderungen in der für das Protein oder Peptid kodierenden DNA oder Messenger-RNA erzeugt werden, oder die während oder nach der Translation entstehen, als auch Polymorphismen ein. Solche Modifikationen können unerwünscht bzw. zufällig aufgetreten sein, sie können aber auch gezielt erzeugt werden sein, bspw. während der Peptidsynthese durch Einführen eines geeigneten Expressionsvektors in einen Wirtsorganismus oder während der Peptid- oder Proteinsynthese mittels eines Peptidsynthesizers.
Ein Beispiel für eine nach der Peptidsynthese auftretende Sequenzmodifikation ist die Deiminierung des Arginins in einem Protein.
Solche Sequenzmodifikationen können gewünscht sein z.B. um schneller wirksame Insulin-Analoga zu produzieren oder unerwünscht, wobei sie selbst Auslöser oder ein Indikator für Krankheiten sein können.
Die Detektion von Sequenzmodifikationen ist daher vorteilhaft, da dadurch sowohl Krankheiten detektiert werden können als auch eine Qualitätskontrolle bei der Herstellung von Biopharmaka durchgeführt werden kann. Auf diese Weise kann ferner die Einnahme modifizierter leistungssteigernder Proteine oder Peptide nachgewiesen werden.
In einer Ausgestaltung der oben genannten Maßnahme sind die Sequenzmodifikationen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Additionen, Deletionen, Insertionen, Substitutionen und Positionsänderungen zumindest einer Aminosäure des Proteins oder Peptids und Kombinationen davon.
Ein Nachweis der oben genannten Modifikationen ist deshalb besonders vorteilhaft, da diese sehr häufig zum Entstehen, Wegfallen oder Verschieben von Schnittstellen führen.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die Modifikation eine Seitenkettenmodifikation.
Unter dem Begriff "Seitenkettenmodifikation", wie er hierin verwendet wird, versteht man jegliche Modifikation an den funktionellen Gruppen bzw. Seitenketten der Aminosäuren eines Proteins oder Peptids, die nicht zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz selbst führt. Diese Seitenkettenmodifikationen können entweder durch chemische Modifikation nach der Peptidsynthese eingeführt werden oder sie können z.B. durch Einsatz von bereits vorab modifizierten Aminosäuren während der Protein- oder Peptidsynthese eingeführt werden.
Solche Seitenkettenmodifikationen können z.B. durchgeführt werden, um ein Peptid zu markieren, damit es in komplexen biologischen Proben (Zelllysaten, Blutserum, Urin etc.) wiederzufinden ist. Eine solche Markierung erfolgt z.B. mit fluoreszierenden Verbindungen wie beispielsweise 5(6)-Carboxyfluorescein (Baechle D., Fischer R., Cansier A., Brock R., Kalbacher H., A post column alkalinization procedure enhances the sensitivity of fluorescence detection of fluorescein-labeled substances in RP-HPLC, Anal Biochem. 345(1): 161-3, 2005) oder mit Affinitätsmolekülen wie z.B. Biotin (Baechle D., Cansier A., Fischer R., Brandenburg J., Burster T., Driessen C., Kalbacher H., Biotinylated fluorescent peptide substrates for the sensitive and specific determination of cathepsin D activity, J. Pept. Sci. 11(3): 166-74, 2005).
Ferner können solche Seitenkettenmodifikationen auch zur Aktivitätssteigerung von Proteinen oder Peptiden eingesetzt werden. Beispielsweise wurde das Peptid ELAGIGILTV mit einem Puupehenone-Derivat gekoppelt und zeigte eine verbesserte Bindung an einen T-Zell-Rezeptor (Douat-Casassus C, Marchand-Geneste N, Diez E, Aznar C, Picard P, Geoffre S, Huet A, Bourguet-Kondracki ML, Gervois N, Jotereau F, Quideau S., Covalent modification of a melanoma-derived antigenic peptide with a natural quinone methide. Preliminary chemical, molecular modelling and immunological evaluation studies, Mol Biosyst. 2006 May;2(5):240-9)
In einer Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahme ist die Seitenkettenmodifikation ausgewählt aus Gruppe bestehend aus Deiminierungen, Deamidierungen, N-Glykosylierungen, Modifikationen am N-Terminus, Modifikationen am C-Terminus, γ-Carboxylierungen, Sulfatisierungen, Phosphorylierungen zumindest einer Aminosäure des Proteins oder Peptids und Kombinationen davon.
Diese Modifikationen führen alle zu Veränderungen in den Seitenketten der Aminosäure, die als Angriffspunkt der für schnittstellenspezifische Proteasen wirken. Somit lassen sich diese Modifikationen besonders gut mit dem vorliegenden Verfahren detektieren.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die Modifikation eine posttranslationale Modifikation.
Proteine werden im Cytoplasma biologischer Zellen anhand von RNA-Sequenzen sog. Messenger-RNA an den Ribosomen synthetisiert. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet. Nach dieser Translation können an den gebildeten Proteinen oder Peptiden weitere Modifikationen vorkommen, wobei diese Modifikationen sich aus physiologischen Vorgängen ergeben oder durch Einflüsse von außen entstehen können. Solche nach der Translation entstandenen Modifikationen werden als posttranslationale Modifikationen bezeichnet.
Solche posttranslationalen Modifikationen können sowohl beispielsweise zur Erlangung einer besonderen Aktivität des Proteins gewünscht als auch unerwünscht sein. Die unerwünschten translationalen Modifikationen können entweder selbst Auslöser für Störungen im Organismus, also Krankheiten, sein oder auch ein Anzeiger für Störungen im Organismus darstellen. Beispiele für posttranslational modifizierte Proteine, die in Zusammenhang mit Krankheiten gebracht werden, schließen posttranslational modifiziertes Filaggrin ein, das in Zusammenhang mit rheumatoider Arthritis (van Boekel et al. Arthritis Res. 2002; 4:87) und multipler Sklerose (Mastronardi et al. J. Neurosci. Res. 2005; 80: 301) steht.
Weitere Beispiele für posttranslationale Modifikationen, die mit Krankheiten in Verbindung stehen, schließen Folgendes ein, nämlich den Einfluss der Glykosilierung von Proteinen bei der Kontrolle epithelialer Strukturen (Allahverdian, S., Patchell, BJ, Dorscheid, DR, Carbohydrates and epithelial repair – more than just posttranslational modification, Curr. Drug Targets: 7(5): 597-606, 2006) oder die Erkennung von glykosilierten Proteinantigenen von Antigen-präsentierenden Zellen (Aarnoudse, CA, Garcia Vallejo, JJ, Saeland, E, van Koooyok, Y., Recognition of tumor glycans by antigen presenting cells, Curr. Opin. Immunol. 18(1): 1005-111, 2006); sowie den Einfluss der Phosphorylierung von p53 auf die Tumorentwicklung (Matsumoto, M., Furihata, M., Ohtsuki, Y., Posttranslational phosphorylation of mutant p53 Protein in tumor development, Med. Mol. Morphol. 39(2): 79-87, 2006).
Da posttranslationale Modifikationen bei krankhaften Zuständen schon sehr früh auftreten, würde der Nachweis einer posttranslationalen Modifikation eine frühe Diagnose möglich machen. Ferner sind solche posttranslationalen Modifikationen gute Marker, um den Verlauf von damit verbundenen Krankheiten und ggf. Therapieerfolge zu verfolgen.
Da posttranslationale Modifikationen häufig nur zu geringen strukturellen oder Masseänderungen führen, eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für den Nachweis von solchen posttranslationalen Modifikationen.
In einer Ausgestaltung der Erfindung erfolgt die Analyse der Mischung der Fragmentpeptide in Schritt 3. durch ein Verfahren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: massenspektrometrischen Verfahren, immunologischen Verfahren, elektrophoretischen Verfahren, chromatographischen Verfahren und Kombinationen davon.
Die oben genannten Verfahren bilden aufgrund ihrer Genauigkeit, Einfachheit oder Zuverlässigkeit in ihrer Durchführung besonders bevorzugte Methoden zur Analyse der Mischung der Fragmentpeptide.
In einer Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahme sind die massenspektrometrischen Verfahren ausgewählt aus ESI-MS und MALDI-MS.
ESI-MS (Electrospray Ionization Mass Spectrometry) und MALDI-MS (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry) sind Techniken, die sich besonders gut zur massenspektrometrischen Analyse von Proteinen eignen.
Bevorzugt kommen dabei sog. "time of flight" (TOF)-Messungen zur Bestimmung der Masse der zu untersuchenden Probe zum Einsatz. Hierbei wird die Masse anhand der Flugzeit eines Ions im Vakuum durch Vergleich mit bekannten Standards bestimmt.
Da in diesem Schritt nicht mehr die intakten Proteine oder Peptide, sondern die Fragmentierungsmuster und ggf. die An- oder Abwesenheit von Fragmentpeaks untersucht wird, ergeben sich die Probleme, die sich aus den geringen Massenunterschieden bei der Unterscheidung von nicht modifizierten und modifizierten Proteinen ergeben, hier nicht mehr.
Aufgrund des Ionisierungsverfahrens kommt es bei diesen Techniken im Allgemeinen bei der massenspektrometrischen Analyse von Proteinen nicht zu Fragmentierungen, die die Analyse verfälschen könnten.
Ferner haben diese Techniken den Vorteil, dass aus den Intensitäten der erhaltenen Peaks Rückschlüsse auf das Verhältnis der Fragmentpeptide und damit den Umfang der Modifikation gezogen werden können. Durch die Verwendung interner Standards kann sogar eine Absolutquantifizierung erfolgen.
Ferner können aus den erhaltenen Informationen über die Masse der Fragmentpeptide Rückschlüsse auf deren Sequenz und die Position der Modifikation gezogen werden.
In einer weiteren Ausgestaltung der oben genannten Maßnahme werden die immunologischen Verfahren unter Verwendung eines Protein- oder peptidspezifischen Antikörpers durchgeführt.
Eine hierbei bevorzugte Methodik ist die Verwendung von Antikörpern, die für das nicht fragmentierte Protein oder Peptid spezifisch sind, wobei das Vorliegen einer Modifikation z.B. durch eine fehlende Abnahme des Signals für ein nicht-fragmentiertes Protein oder Peptid nach Behandlung mit einer Protease detektiert wird.
Ein solches Verfahren kann z.B. mittels der ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-Technik durchgeführt werden. Eine solche Technik hat den Vorteil, dass sie mit sehr geringem instrumentellen Aufwand durchgeführt werden kann.
In einer weiteren Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahme sind die elektrophoretischen Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1D- und 2D-Gelelektrophorese, wobei es sich vorzugsweise um eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) handelt.
Bei diesen Verfahren handelt es sich um seit langem etablierte zuverlässige Methoden zur Trennung von Proteingemischen. Nach einem Anfärben der Trenngele kann anhand des Bandenmusters die Anwesenheit oder das Fehlen von erwarteten Fragmentpeptiden einfach visuell überprüft werden. Ferner können hier Techniken wie z.B. eine isoelektrische Fokussierung verwendet werden, um ggf. das Auftrennvermögen zu verbessern. Die Intensität von Fragmentpeptidbanden oder Spots kann außerdem dazu verwendet werden, Rückschlüsse auf die Konzentration der modifizierten Proteine oder Peptide zu ziehen.
In einer weiteren Ausgestaltung der oben genannten Maßnahme sind die chromatographischen Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Größenausschlusschromatographie.
Bei diesen Techniken handelt es sich um zuverlässige gut etablierte Techniken zur Auftrennung von Mischungen aus Peptiden, so dass sich diese Techniken gut zur Analyse einer Mischung aus Fragmentpeptiden eignen.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die biologische Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Blut, Serum, Urin, Stuhl, Gewebe, Liquor, Lymphe und Synovialflüssigkeit.
Aufgrund des hohen Gehalts an Proteinen eignen sich diese biologischen Proben besonders gut zum Nachweis von Modifikationen eines Proteins oder Peptids.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die schnittstellenspezifische Protease in Schritt 2. ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Trypsin, Endoprotease LysC, Asparaginyl-Endopeptidase, Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Endoprotease GluC, Endoprotease AspN und Cathepsin D.
Bei diesen Proteasen handelt es sich um schnittstellenspezifische Proteasen mit einer hohen Spezifität, so dass diese sich besonders gut zur Detektion von Modifikationen an möglichen Schnittstellen für diese Proteasen eignen.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung folgt nach Schritt 1. ein weiterer Schritt 1.1 des Anreicherns des Proteins oder Peptids in der Probe und/oder nach Schritt 2. folgt ein weiterer Schritt 2.1 des Anreicherns der Fragmentpeptide in der Probe.
Durch das Anreichern der Proteine oder Peptide bzw. der Fragmentpeptide in der Probe kann das für das Fragmentpeptid erhaltene Signal verstärkt werden, was die Diagnose einfacher und sicherer macht. Dies erfolgt unabhängig davon, ob die noch zu fragmentierenden oder die bereits fragmentierten Proteine oder Peptide angereichert werden.
In einer Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahmen erfolgt der Schritt 1.1. und/oder der Schritt 2.2 durch ein Verfahren, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Zentrifugationsverfahren, Membranverfahren, immunologischen Verfahren, elektrophoretischen Verfahren, chromatographischen Verfahren und Kombinationen davon.
Die Anreicherung erfolgt hierbei durch ein Abtrennen der gewünschten Proteine oder Peptide von unerwünschten Substanzen wie bspw. Lösemitteln oder anderen Pepti den aufgrund von Unterschieden in deren Eigenschaften, wie bspw. Größe, Molekulargewicht, Ladung, Affinitäten oder Löslichkeit.
Bei diesen Verfahren handelt es sich um gut etablierte, sehr zuverlässige Verfahren, um gewünschte Proteine mit einer hohen Spezifität anzureichern. Somit eignen sich diese Verfahren besonders gut zur Anwendung in einem erfindungsgemäßen Verfahren.
In einer Ausgestaltung der zuvor genannten Maßnahme werden die immunologischen Verfahren unter Verwendung eines Protein- oder peptidspezifischen Antikörpers durchgeführt.
Ein immunologisches Verfahren unter Verwendung eines für das Zielprotein oder -peptid bzw. Fragmentpeptid spezifischen Antikörpers stellt aufgrund der hohen Spezifität eine besonders geeignete Methode zur Anreicherung eines gewünschten Proteins oder Peptids bzw. Fragmentpeptids dar.
In einer weiteren Ausgestaltung der oben genannten Maßnahme sind die elektrophoretischen Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 1D- und 2D-Gelelektrophorese und sind insbesondere eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese.
Mittels dieser Maßnahmen können Proteine auf einfache Weise getrennt und nach Anfärben über Referenzstandards anhand ihrer Masse einfach identifiziert werden. Die gewünschten Proteine können dann durch Ausschneiden des gewünschten Bandes und selektives Eluieren auf einfache Weise aus dem Elektrophoresegel gewonnen werden. Somit stellt diese Technik einen besonders einfachen, jedoch selektiven Weg zur Anreicherung der gewünschten Proteine oder Peptide bzw. Fragmentpeptide dar.
In einer weiteren Ausgestaltung der oben genannten Maßnahme sind die chromatographischen Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Affinitätschro matographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Größenausschlusschromatographie.
Bei solchen Verfahren handelt es sich um besonders schnell durchführbare Verfahren, die ggf. auch ohne größeren instrumentellen Aufwand bewerkstelligt werden können.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung liegt das Referenzfragmentierungsmuster in einer Form vor, die ausgewählt ist aus einer Gruppe bestehend aus: Druckerzeugnissen, elektronischen Dateien und Zugangsdaten zu Dateien im Internet.
Auf diese Weise können die Referenzfragmentierungsmuster leicht zugänglich bereitgestellt werden, ohne dass bei jedem Mal, bei dem das Verfahren gemäß der Erfindung durchgeführt wird, ein neues Referenzfragmentierungsmuster erzeugt werden muss.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung ist die diagnostizierte Krankheit eine entzündliche Krankheit und insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: Multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis.
Bei entzündlichen Krankheiten und insbesondere bei multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis treten posttranslationale Modifikationen bereits in Frühstadien der Krankheit auf. So ist ein Anzeichen für rheumatische Arthritis z.B. die Deiminierung von Filaggrin; vgl. von Boekel et al. (2002), Arthritis Res. 4, S. 87. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich somit, diese Krankheiten schon besonders früh zu erkennen, so dass diese möglichst früh und somit mit höchstmöglichem Erfolg behandelt werden können.
In einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung weist ein Kit gemäß der Erfindung ferner Anweisungen zur Korrelation eines mit der zumindest einen schnittstellenspe zifischen Protease erhaltenen Fragmentierungsmusters mit bekannten Krankheiten auf.
Durch diese Maßnahme wird ein Kit geschaffen, mit dem die Diagnose einer Krankheit, die mit Modifikationen von zumindest einem Protein oder Peptid in Zusammenhang steht, auf einfache Weise möglich ist.
In einem solchen Kit sind alle Chemikalien und Utensilien sowie eine genaue Arbeitsanweisung zusammengefasst, was Fehler bei der Durchführung des Verfahrens reduziert und die Durchführung des Verfahrens auch durch weniger geschultes Personal ermöglicht. Ein solcher Kit kann mit hoher Reproduzierbarkeit auch in der Routinediagnostik eingesetzt werden.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend zu nennenden Merkmale nicht nur in den angegebenen Kombinationen, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung anwendbar sind, ohne den Schutzbereich der Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung wird nun beispielhaft anhand der nachstehenden Beispiele in Zusammenhang mit den beiliegenden Figuren näher erläutert. Es zeigen:
1 eine stark schematische Darstellung eines erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens;
2 ein SDS-PAGE-Gel von Proben, die durch die Behandlung von Vimentin mit Peptidylarginin-Deiminase nach verschiedenen Reaktionszeiten erhalten wurden;
3a ein MALDI-MS-Spektrum von Vimentin nach einer Behandlung mit Trypsin;
3b ein MALDI-MS-Spektrum von citrulliniertem Vimentin nach einer Behandlung mit Trypsin;
4a ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGRATGA vor der Behandlung mit Trypsin;
4b ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGRATGA nach der Behandlung mit Trypsin;
5a ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGCitATGA vor der Behandlung mit Trypsin;
5b ein RP-HPLC-Chromatogramm des synthetischen Peptids EGTEGCitATGA nach der Behandlung mit Trypsin;
6 die Aminosäuresequenzen für humanes Insulin sowie 3 Insulin-Analoga, wobei die Veränderungen in der Aminosäuresequenz für die Insulin-Analoga fett dargestellt sind;
7a ein MALDI-MS-Spektrum von humanem Insulin nach einer Behandlung mit Trypsin;
7b ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Lispro nach einer Behandlung mit Trypsin;
7c ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Aspartat nach einer Behandlung mit Trypsin; und
7d ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Glulisin nach einer Behandlung von Trypsin;
8a ein MALDI-MS-Spektrum von humanem Insulin nach Behandlung mit Endoprotease GluC;
8b ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Aspart nach einer Behandlung mit Endoprotease GluC;
8c ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Glulisin nach einer Behandlung mit Endoprotease GluC;
9a ein MALDI-MS-Spektrum von humanem Insulin nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
9b ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Aspart nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
9c ein MALDI-MS-Spektrum von Insulin-Glulisin nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
10a eine Darstellung eines modifizierten Modellpeptids, wobei die Schnittstellen für Trypsin angedeutet sind;
10b ein MALDI-MS-Spektrum des Modellpeptids von 10a nach einer Behandlung mit Trypsin;
11a das MALDI-MS-Spektrum des Modellpeptids NLWNGIVPM nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN;
11b ein MALDI-MS-Spektrum des deamidierten Modellpeptids von 11a nach einer Behandlung mit Endoprotease AspN.
Beispiel 1: Prinzip des erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens
1 zeigt eine schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Detektionsverfahrens.
In Schritt A wird hierbei eine biologische Probe bereitgestellt, die z.B. in Form von Blut, Serum, Urin, Stuhl, Liquor, Lymphe oder Synovialflüssigkeit direkt aus einem Patienten gewonnen werden kann. Diese biologische Probe weist ein Gemisch aus verschiedenen Proteinen und Peptiden auf. In dieser Probe liegt ein Zielprotein vor, das z.B. einen Indikator für einen krankhaften Zustand bildet. In diesem Fall handelt es sich um das Protein Filaggrin, das einen Marker für rheumatoide Arthritis bildet. Es kann sich aber bspw. auch um ein zur Leistungssteigerung eingenommenes Biopharmakum handeln. Dieses Protein liegt sowohl in seinem nicht modifizierten, also gesunden Zustand wie auch in einem modifizierten Zustand in der Probe vor, der mit dem Vorliegen von rheumatoider Arthritis verbunden ist.
In einem Schritt B werden nun die gewünschten Zielproteine in der Probe angereichert. Dies erfolgt hier durch eine Affinitätsanreicherung. Hierbei wird die Probe mit einem oder mehreren Festkörpern, deren Oberflächen so modifiziert sind, dass sie eine Affinität gegenüber dem Zielprotein zeigen, in Kontakt gebracht, diese Festkörper werden abgetrennt und die Zielproteine von den Festkörpern eluiert. Hieraus ergibt sich eine Mischung aus dem nicht modifizierten und dem modifizierten Protein.
In Schritt C wird nun zu dieser Mischung aus dem nicht modifizierten sowie dem modifizierten Protein eine Protease zugegeben, die für eine Schnittstelle spezifisch ist, die durch die Modifikation, die detektiert werden soll, verändert wird. Im Falle der Detektion einer Deiminierung von Filiaggrin ist diese Protease Trypsin, die spezifisch an einem Arginin spaltet. Bei Vorliegen von rheumatoider Arthritis sind einige oder alle der Argininreste des Filiaggrins zu Citrullin deiminiert worden, so dass die ursprünglich vorhandenen Schnittstellen in dem modifizierten Protein nicht mehr vorliegen.
Das nicht modifizierte Zielprotein wird durch die Behandlung mit der Protease an der spezifischen Schnittstelle geschnitten, wodurch, wie hier dargestellt, zwei kleinere Fragmente gebildet wurden. Da in dem modifizierten Zielprotein keine Schnittstelle mehr vorliegt, kommt es auch zu keiner Spaltung, so dass hier noch das vollständige Protein vorliegt. Die Detektion dieser nun vorliegenden verschiedenen Proteine bzw. Peptide kann z.B. durch massenspektrometrische Techniken erreicht werden, da die beiden Fragmente des gesunden Zielproteins deutlich geringere Massen aufweisen als das noch intakte modifizierte Protein, wodurch diese Proteine massenspektrometrisch einfach zu unterscheiden sind.
Es ist auch möglich, diese Unterschiede immunologisch zu detektieren, wobei die in Schritt C erhaltene Mischung mit einem spezifischen Antikörper in Kontakt gebracht wird, der für das intakte Protein spezifisch ist. Liegt in der biologischen Probe ausschließlich nicht modifiziertes Zielprotein vor, wird dieses gespalten und es kommt zu keiner Bindung der Fragmente an den Antikörper, die dann durch dem Fachmann bekannte Methoden detektiert werden könnte. Liegt eine Modifikation zumindest zum Teil vor, kommt es zu einer Bindung des intakten modifizierten Proteins an den Antikörper, die wiederum durch dem Fachmann bekannte Techniken detektiert werden kann.
Das gleiche Verfahren kann auch angewendet werden, um z.B. Insulin-Analoga, die zur Leistungssteigerung im Sport eingesetzt werden, neben natürlich im Körper vorkommendem Insulin nachzuweisen.
Beispiel 2: Detektion einer Deiminierung in Vimentin
Dieses Beispiel zeigt anhand des Modelproteins Vimentin die Detektion einer posttranslationalen Modifikation eines Proteins in Form einer Deiminierung.
Das rekombinante humane Protein Vimentin (rhVim) wurde kommerziell erworben.

2.1 Deiminierung von Vimentin Ein Teil des rekombinanten humanen Vimentins wurde in vitro unterschiedlich lang bei 37°C mit dem Enzym Peptidylarginin-Deiminase (PAD) umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Schockfrieren bei –80°C beendet. Die erhaltenen Fraktionen wurden gelchromatographisch mittels SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) aufgetrennt. Das SDS-PAGE-Gel ist in 2 dargestellt. Eine Deiminierung von Proteinen führt zum Verlust einer positiven Ladung pro umgesetztes Arginin. Je mehr Arginine innerhalb eines Proteins in Citrullin umgesetzt wurden, desto geringer ist die Nettoladung des Proteins. Der mit zunehmendem Deiminierungsgrad steigende Ladungsverlust führt dazu, dass Banden von citrullinierten Proteinen im SDS-PAGE zu größeren Molekulargewichten hin verschoben sind. Nicht modifiziertes Vimentin (rhVim) wandert bei ~55 kDa, wohingegen citrulliniertes Vimentin (cit-rhVim) eine Bande bei ~59 kDa zeigt. Da es allerdings bei einem SDS-PAGE-Gel z.B. durch eine ungleiche Spannungsverteilung zu Verschiebungen kommen kann, eignet sich diese Technik nicht für eine zuverlässige direkte Detektion von Modifikationen von Proteinen oder Peptiden. Die einzelnen Banden wurden ausgeschnitten, zerkleinert, mit 30 μl Acetonitril versetzt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das Acetonitril wurde anschließend im Vakuum abgezogen. Die einzelnen Gel-Banden wurden zweimal mit jeweils 50 μl 30 % (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ gewaschen und dann wieder mit 30 μl Acetonitril versetzt, für 10 Minuten inku biert und im Vakuum getrocknet. Zur Reduktion der Proteine wurden die Banden mit 10 μl einer 10 mM Dithiothreitol-Lösung in 30 % (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ versetzt und bei 56 °C für 45 Minuten inkubiert. Die Proben wurden dann mit 30 μl Acetonitril für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend im Vakuum getrocknet. Für die Alkylierung der Proteine wurden jeweils 10 μl einer 40 mM Iodacetamid-Lösung in 30 % (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ zu den einzelnen Gel-Banden gegeben. Nach zwei weiteren Waschschritten mit 30 % (v/v) Acetonitril in 50 mM NH₄HCO₃ wurden die Gel-Banden mit 30 μl Acetonitril versetzt, für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und im Vakuum getrocknet.
2.2 Verdau des Vimentins und des citrullinierten Vimentins mit Trypsin Die Banden wurden mit 20 μl einer Trypsin-Lösung (12.5 μg/ml) versetzt und für 12 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Überstände wurden anschließend massenspektrometrisch vermessen.
2.3 Analyse des Fragmentierungsmusters aus dem Trypsin-Verdau von Vimentin und von citrulliniertem Vimentin mit MALDI-MS Proben der in 2.2 erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden von Vimentin bzw. citrulliniertem Vimentin wurden mit MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot (0.5 μl) der einzelnen Verdauansätze wurde auf einem Goldtarget mit 0.5 μl Dihydroxybenzoesäure-Matrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, REFLEX IV). Die Auswertung der MS-Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

In 3a ist ein MALDI-Spektrum von Vimentin nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt. In 3b ist ein MALDI-MS-Spektrum von citrulliniertem Vimentin nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt.

Aus diesen Spektren geht hervor, dass bei der Umsetzung von Vimentin acht Peptidfragmente gebildet werden, die bei der citrullinierten Form nicht entstehen. Diese acht Peptide werden nur während des Verdaus von Vimentin gebildet, da Trypsin Peptidbindungen C-Terminal nach Lysin und Arginin, jedoch nicht nach Citrullin spaltet. Diese acht Peptide sind nochmals in der nachstehenden Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2

	Position im Protein	theoretisch [M+H]⁺	detektiert [M+H]⁺
Arginin-spezifische Peptide
R.FLEQQNK	122-128	906.47	906.57
K.FADLSEAANR	294-303	1093.53	1093.69
R.FANYIDKVR	113-121	1125.61	1125.77
R.LGDLYEEEMR	145-154	1254.57	1254.73
R.SLYASSPGGVYATR	50-63	1428.71	1428.89
R.TYSLGSALRPSTSR	36-49	1495.75	1495.97
R.HLREYQDLLNVK	378-389	1527.83	1528.05
R.ISLPLPNFSSLNLR	410-423	1570.90	1571.15

Aus den beiden Spektren sind die Unterschiede in den Fragmentierungsmustern deutlich sichtbar.
Aus diesem Beispiel wird klar, dass durch den Verdau von Vimentin mit Trypsin und anschließender Analyse des Fragmentierungsmusters auf einfache Weise festgestellt werden kann, ob und in welchem Umfang Modifikationen in Vimentin vorliegen.
Beispiel 3: Nachweis einer Sequenzmodifikation in dem synthetischen Peptid EGTEGRATGA
Dieses Beispiel demonstriert die Detektion einer Sequenzmodifikation in einem Peptid in Form eines Aminosäureaustauschs (R → Cit) anhand eines Modelpeptids.

3.1 Herstellung der Peptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA Die Modellpeptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA wurden an der Festphase nach dem TBTU/HOBT-Kupplungsprotokoll (siehe: Baechle D, Flad T, Cansier A, Steffen H, Schittek B, Tolson J, Herrmann T, Dihazi H, Beck A, Mueller GA, Mueller M, Stevanovic S, Garbe C, Mueller CA, Kalbacher H, Cathepsin D is present in human eccrine sweat and involved in the postsecretory processing of the antimicrobial Peptide DCD-1L, J Biol Chem. 2006 Mar 3;281(9):5406-15. Der Inhalt dieses Dokuments ist durch Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung.) mit einem 7-fachen Überschuss an Fmoc-geschützten-Aminosäuren synthetisiert. Die temporäre Fmoc-Schutzgruppe wurde mit einer 40 %igen (v/v) Piperidin-Lösung in DMF entfernt. Die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen sowie der Peptide vom Harz erfolgte mit einer 95 %igen (v/v) TFA-Lösung mit 2.5 % (v/v) Wasser, 2.5 % (v/v) Ethandithiol und 5 % (w/v) Phenol für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Die Rohpeptide wurden in kaltem Diethylether ausgefällt, zentrifugiert und das Pellet in 25 % (v/v) tert.-Butanol in Wasser gelöst und lyophilisiert. Die Rohpeptide wurden mittels präparativer C18-RP-HPLC (RP-HPLC-Bedingungen: von 0 % System B (80 % (v/v) Acetonitril in Wasser mit 0,05 % Trifluoressigsäure) auf 100 % System B in System A (0,05 % (v/v) Trifluoressigsäure in Wasser) in 25 Minuten; Säule: C18, 2 cm, Porengröße 5 um) gereinigt (Reinheit > 95 %) und mittels Massenspektrometrie identifiziert.
3.2 Verdau der Peptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA mit Trypsin Jeweils 10 μl der Peptid-Lösungen (1 mM in Wasser) wurden mit 80 μl Trypsin-Lösung (3.125 μg/ml) in 50 mM NH₄HCO₃ versetzt und für vier Stunden bei 37 °C inkubiert.
3.3 Analyse des Fragmentierungsmusters Die mit Trypsin verdauten Modellpeptide EGTEGRATGA und EGTEGCitATGA wurden mittels RP-HPLC analysiert (RP-HPLC-Bedingungen: von 5 % System B (80 % (v/v) Acetonitril in Wasser mit 0,05 % Trifluoressigsäure) auf 80 % System B in System A (0,05 % (v/v) Trifluoressigsäure in Wasser) in 30 Minuten; Säule: C18, 2 mm, Porengröße 5 μm) und die einzelnen Fraktionen mittels MALDI-MS identifiziert. Dazu wurde jeweils ein Aliquot (0.5 μl) der einzelnen Fraktionen auf einem Goldtarget mit 0.5 μl Dihydroxybenzoesäure-Matrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, REFLEX IV). Die Auswertung der MS-Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis). Die ermittelten Massen sind den entsprechenden Peptidfragmenten zugeordnet.

In 4a ist ein RP-HPLC-Chromatogramm von EGTEGRATGA vor der Behandlung mit Trypsin dargestellt, während in 4b ein RP-HPLC-Chromatogramm nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt ist. Aus diesen Spektren wird klar ersichtlich, dass durch die Behandlung mit Trypsin das Peptid EGTEGRATGA vollständig in zwei Fragmentpeptide, nämlich ATGA und EGTEGR, aufgespalten wurde. Der Substanzpeak für das ursprüngliche Peptid ist in dem in 4b dargestellten Chromatogramm fast vollständig verschwunden. Das in 4b dargestellte Fragmentierungsmuster bildet hier das Referenzfragmentierungsmuster für das Peptid ohne die Modifikation.
In 5a ist ein RP-HPLC-Chromatogramm des citrullinierten Peptids EGTEGCitATGA vor der Behandlung mit Trypsin dargestellt. In 5b ist ein RP-HPLC- Chromatogramm des citrullinierten Peptids EGTEGCitATGA nach der Behandlung mit Trypsin dargestellt.
Hieraus wird ersichtlich, dass die Behandlung mit Trypsin überhaupt keine Auswirkungen auf das citrullinierte Peptid hat. Dies ist verständlich, da Trypsin lediglich Peptidbindungen C-Terminal nach Lysin und Arginin spaltet, jedoch nicht nach Citrullin. Durch das Fehlen eines Lysins oder eines Arginins in dem citrullinierten Peptid kommt es hier nicht zu einer Spaltung. Durch den Vergleich der Spektren von 4b und 5b ist sofort ersichtlich, dass in der Probe mit dem citrullinierten Peptid eine Modifikation stattgefunden haben muss.
Sollte in einer Probe nur ein Teil des Peptids in der citrullinierten Form vorliegen, ergäbe sich ein Chromatogramm, das sowohl die in 4b als auch die in 5b gezeigten Peaks enthält. Aufgrund der deutlichen Unterschiede in der Retentionszeit lassen sich die Peaks dennoch einfach unterscheiden und identifizieren.
Im Falle einer Mischung aus citrulliniertem und nicht-citrulliniertem Peptid kann ferner aus den Peaks das Verhältnis zwischen dem citrullinierten und nicht-citrullinierten Peptid bestimmt werden. Diese Information lässt dann Rückschlüsse auf das Ausmaß der Modifikationen und ggf. eines krankhaften Zustands zu.
Beispiel 4: Unterscheidung von verschiedenen Insulin-Analoga mittels verschiedener schnittstellenspezifischer Proteasen
Dieses Beispiel zeigt die Detektion von Sequenzmodifikationen anhand von 3 Insulin-Analoga im Vergleich mit humanem Insulin.

4.1 Verdau von Insulin und 3 Insulin-Analoga mit drei verschiedenen schnittstellenspezifischen Proteasen Humanes Insulin, Insulin-Lispro, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin (s. 6) wurden kommerziell erworben. 1 μl der jeweiligen Insulin-Stammlösung (10 mg/ml in 2% (v/v) Essigsäure) wurde mit je 1 μl Trypsin (0,5 mg/ml), bzw. 1 μl Endoprotease G1uC (0,5 mg/ml) bzw. 1 μl Endoprotease AspN (40 ng/ml) in 48 μl 50 mM NH₄HCO₃-Puffer bei 37° für 15 Stunden umgesetzt. Die Versuchsansätze wurden anschließend mittels MALDI-MS vermessen.
4.2 Analyse der Fragmentierungsmuster Proben der in 4.1 erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden wurden mittels MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot (0,5 μl der einzelnen Verdauansätze wurde auf einem Goldtarget mit 0,5 μl Dihydroxybenzoesäurematrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, Reflex IV). Die Auswertung der Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

In 7a–d sind jeweils die MALDI-MS-Spektren für den Verdau von humanem Insulin bzw. den verschiedenen Insulin-Analoga mit Trypsin dargestellt.
Wie aus 7a hervorgeht, entstehen bei der Umsetzung von humanem Insulin mit Trypsin drei Peptide, während für Insulin-Lispro und Insulin-Aspart nur zwei Fragmentpeptide gebildet werden (7b und 7c). Beim Verdau von Insulin-Glulisin mit Trypsin werden wiederum drei Fragmentpeptide (7d) gebildet.
Für Insulin-Lispro geht das unterschiedliche Fragmentierungsmuster darauf zurück, dass die Endoprotease Trypsin Peptide spezifisch C-terminal nach den Aminosäuren Arginin und Lysin spaltet, jedoch nicht, wenn diesen Aminosäuren die Aminosäure Prolin vorausgeht. Im humanem Insulin folgt die Aminosäure Prolin vom C-terminalen Ende der B-Kette aus gesehen auf die Aminosäure Lysin, so dass hier eine Schnittstelle für Trypsin vorliegt. In Insulin-Lispro sind die Positionen von Lysin und Prolin vertauscht, so dass in diesem Protein in der B-Kette vom C-terminalen Ende aus gesehen Prolin dem Lysin vorausgeht, wodurch hier keine Schnittstelle für Trypsin mehr vorliegt und daher im Fragmentierungsmuster nur noch zwei Peptidfragmente vorhanden sind.
Im Spektrum für Insulin-Glulisin, das in 7d dargestellt ist, erscheint ein zusätzlicher Peak, der dadurch verursacht wird, dass in diesem Protein an Position 3 der B-Kette ein Lysin vorliegt, was eine zusätzliche Schnittstelle für Trypsin generiert. Aufgrund der verschiedenen Fragmentierungsmuster lassen sich die Insulin-Analoga Insulin-Lispro und Insulin-Glulisin leicht von humanem Insulin unterscheiden.
Aus den in 8a–c dargestellten Spektren geht hervor, dass sich für den Verdau mit Endoprotease GluC keine Änderungen im Fragmentierungsmuster zwischen humanem Insulin und Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin ergeben. Die beobachteten Massenunterschiede gehen lediglich auf die Massenunterschiede der Ausgangspeptide zurück. Dies zeigt, dass die Auswahl der richtigen schnittstellenspezifischen Protease für das Verfahren essentiell ist.
In 9a–c sind die Fragmentmuster für Insulin, Insulin-Aspart und Insulin-Glulisin nach dem Verdau mit AspN dargestellt. Hierbei wird ein für Insulin-Aspartat deutlich anderes Fragmentmuster sichtbar, da lediglich dieses Protein Asparginsäure enthält, welche eine für Endoprotease AspN spezifische Schnittstelle erzeugt. Auf diese Weise ist Insulin-Aspart sehr einfach z.B. von humanem Insulin zu unterscheiden. Somit wäre z.B. nachzuweisen, ob ein Sportler unter Verwendung von Insulin-Aspart Insulin-Doping betrieben hat, auch wenn die Molekulargewichte der Proteine selbst sich mit 18 Dalton nur geringfügig voneinander unterscheiden.
Beispiel 5: Nachweis einer Seitenketten-Modifikation anhand eines Modellpeptids
Dieses Beispiel zeigt die Auswirkungen von Seitenketten-Modifikationen auf die Fragmentierung mit schnittstellenspezifischen Proteasen.

5.1 Herstellung des Modellpeptids Die Synthese des Modellpeptids AC-RRRRRRRRRK(Tamra)APISFFRLGK(Fluo)-CONH₂ (siehe 10a) erfolgte entsprechend Fischer R, Bachle D, Fotin-Mleczek M, Jung G, Kalbacher H, Brock R, A Targeted Protease Substrate for a Quantitative Determination of Protease Activities in the Endolysosomal Pathway, Chembiochem. 2006 Jul 26 (in press). Der Inhalt dieses Dokuments ist durch Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung. Tamra(5(6)-Carboxytetramethylrhodamin) und Fluo(5(6)-Carboxyfluorescein) sind Fluorophore und sind über eine Amidbindung an die ε-Aminogruppe von Lysin gekoppelt.
5.2 Verdau des Modellpeptids mit Trypsin Das in 5.1 erhaltene Peptid (1 μl einer 10 mM Lösung in Dimethylsulfoxid) wurde mit 1 μl Trypsin (0,5 mg/l) in 50 mM NH₄HCO₃ Puffer 15 Stunden bei 37°C umgesetzt. Der Reaktionsansatz wurde anschließend massenspektrometrisch vermessen. In diesem Fall wurde das Referenzfragmentierungsmuster nicht durch Fragmentierung eines Referenzpeptids, sondern anhand theoretischer Überlegungen erzeugt.
5.3 Analyse des Fragmentierungsmusters aus dem Trypsin-Verdau des Modellpeptids Eine Probe der in 5.2 erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden wurde mit MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot (0,5 μl) des Reaktionsansatzes wurde auf einem Goldtarget mit 0,5 μl Dihydroxybenzoesäurematrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, Reflex IV). Die Auswertung der MS-Daten erfolgte über gerätespezifische Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

Aus dem in 10b dargestellten Spektrum geht hervor, dass Trypsin den Nona-Arginin-N-Terminus abspaltet, jedoch das übrige Peptidfragment intakt lässt. In einem nicht modifizierten Peptid dieser Sequenz würde Trypsin dieses Peptid nach dem mittleren Lysin spalten und es wäre ein Spektrum zu erwarten, das zwei Peaks für kleinere Fragmente zeigt.
Aus diesem Experiment geht hervor, dass Trypsin nicht nach einem Lysin spaltet, das an seiner ε-Aminogruppe chemisch modifiziert wurde. Somit kann auf einfache Weise nachgewiesen werden, ob ein Protein gewünscht oder ungewünscht an einer ε-Aminogruppe des Lysins chemisch modifiziert wurde.
Beispiel 6: Nachweis einer chemischen Deamidierung von Asparagin in einem Modellpeptid

6.1 Herstellung des Modellpeptids Das Modellpeptid NLWNGIVPM wurde an der Festphase nach dem TBTU/HOBT-Kupplungsprotokoll (siehe: Baechle D, Flad T, Cansier A, Steffen H, Schittek B, Tolson J, Herrmann T, Dihazi H, Beck A, Mueller GA, Mueller M, Stevanovic S, Garbe C, Mueller CA, Kalbacher H, Cathepsin D is present in human eccrine sweat and involved in the postsecretory processing of the antimicrobial peptide DCD-1L, J Biol Chem. 2006 Mar 3;281(9):5406-15. Der Inhalt dieses Dokuments ist durch Bezugnahme Bestandteil dieser Anmeldung.) mit einem 7-fachen Überschuss an Fmoc-geschützten-Aminosäuren synthetisiert. Die temporare Fmoc-Schutzgruppe wurde mit einer 40 %igen (v/v) Pipe ridin-Lösung in DMF entfernt. Die Abspaltung der Seitenketten-Schutzgruppen sowie des Peptids vom Harz erfolgte mit einer 95 %igen (v/v) TFA-Lösung mit 2.5 % (v/v) Wasser, 2.5 % (v/v) Ethandithiol und 5 % (w/v) Phenol für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Das Rohpeptid wurden in kaltem Diethylether ausgefällt, zentrifugiert und das Pellet in 25 % (v/v) tert.-Butanol in Wasser gelöst und lyophilisiert. Das Rohpeptid wurden mittels präparativer C18-RP-HPLC (RP-HPLC-Bedingungen: von 0 % System B (80 % (v/v) Acetonitril in Wasser mit 0,05 % Trifluoressigsäure) auf 100 % System B in System A (0,05 % (v/v) Trifluoressigsäure in Wasser) in 25 Minuten; Säule: C18, 2 cm, Porengröße 5 μm) gereinigt (Reinheit > 95 %) und mittels Massenspektrometrie identifiziert.
6.2 Chemische Deamidierung des Modellpeptids Ein Teil des unter 6.1 erhaltenen Peptids wurde in einer Konzentration von 10 mg/ml in 50 mM NH₄HCO₃ 48 Stunden bei 37° inkubiert, wobei ein Teil des Peptids deamidiert wurde.
6.3 Verdau des nicht modifizierten Modellpeptids und des deamidierten Modellpeptids mit Endoprotease AspN Das nicht modifizierte Peptid sowie das in 6.2 erhaltene deamidierte Peptid wurden mit Endoprotease AspN (1 μl einer 40 ng/ml-Lösung) für 24 Stunden bei 37°C inkubiert und die Ansätze wurden massenspektrometrisch vermessen.
6.4 Analyse der Fragmentierungsmuster aus dem Endoprotease AspN Verdau des nicht modifizierten Modellpeptids und des deamidierten Modellpeptids Proben der in 6.3 erhaltenen Mischungen aus Fragmentpeptiden des nicht modifizierten Peptids sowie des deamidierten Peptids wurden mit MALDI-MS analysiert. Ein Aliquot der einzelnen Verdauungsansätze wurde auf einem Goldtarget mit 0,5 μl Dihydroxybenzoesäurematrix gemischt, kristallisiert und mittels MALDI-ReTOF vermessen (Bruker Daltonik, REFLEX IV). Die Auswertung der Daten erfolgte über die gerätespezifischen Programme (Bruker Data Analysis, Flex Analysis).

Das deamidierte Peptid enthält im Vergleich zum nicht modifizierten Peptid eine Asparaginsäure und somit eine Schnittstelle für die Endoprotease AspN. Der Massenunterschied zwischen den beiden Peptiden per se beträgt lediglich ein einziges Dalton. Aus den Spektren gehen jedoch für das deamidierte Peptid neue Massenpeaks insbesondere bei 432,244 und 631,312 hervor. Diese Peaks repräsentieren jeweils Fragmentpeptide, die durch die Spaltung des deamidierten Peptids durch Endoprotease AspN erzeugt wurden. Dadurch lässt sich einfach das Vorliegen von deamidiertem Peptid nachweisen.

Claims

Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid, das die folgenden Schritte aufweist: 1. Bereitstellen einer biologischen Probe, die zumindest ein Protein oder Peptid aufweist, 2. Behandeln der Probe mit zumindest einer schnittstellenspezifischen Protease zur Erzeugung einer Mischung aus Fragmentpeptiden, 3. Analyse der in Schritt 2. erhaltenen Mischung aus Fragmentpeptiden zur Erzeugung eines Fragmentierungsmusters, 4. Vergleich des in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmusters mit einem Referenzfragmentierungsmuster, das ausgehend von dem Protein oder Peptid ohne die Modifikationen nach den Schritten 1. bis 3. erhalten wurde, und 5. Detektieren der Modifikationen an Hand der Unterschiede zwischen dem in Schritt 3. erhaltenen Fragmentierungsmuster und dem Referenzfragmentierungsmuster.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation eine Sequenzmodifikation ist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Sequenzmodifikation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Additionen, Deletionen, Insertionen, Substitutionen und Positionsänderungen zumindest einer Aminosäure des Proteins oder Peptids und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation eine Seitenkettenmodifikation ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Seitenkettenmodifikation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Deiminierungen, Deamidierungen, N-Glycosylierungen, Modifikationen am N-Terminus, Modifikationen am C-Terminus, γ-Carboxylierungen, Sulfatisierungen, Phosphorylierungen zumindest einer Aminosäure des Proteins oder Peptids und Kombinationen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation eine posttranslationale Modifikation ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Analyse der Mischung der Fragmentpeptide in Schritt 3. durch ein Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: massenspektrometrischen Verfahren, immunologischen Verfahren, elektrophoretischen Verfahren, chromatographischen Verfahren und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die massenspektrometrischen Verfahren ausgewählt sind aus ESI-MS und MALDI-MS.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die immunologischen Verfahren unter Verwendung eines Protein- oder peptidspezifischen Antikörpers durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrophoretischen Verfahren ausgewählt sind aus 1D- und 2D-Gelelektrophorese.
Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die 1D- und 2D-Gelelektrophorese eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese ist.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die chromatographischen Verfahren ausgewählt sind aus Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Größenausschlusschromatographie.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Blut, Serum, Urin, Stuhl, Gewebe, Liquor, Lymphe und Synovialflüssigkeit.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die schnittstellenspezifische Protease in Schritt 2. ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Trypsin, Endoprotease LysC, Asparaginyl-Endopeptidase, Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Endoprotease GluC, Endoprotease AspN und Cathepsin D.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt 1. ein weiterer Schritt 1.1. des Anreichern des Proteins oder Peptids in der Probe folgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt 2. ein weiterer Schritt 2.1. des Anreicherns der Fragmentpeptide in der Probe folgt.
Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt 1.1. und/oder der Schritt 2.1. durch ein Verfahren erfolgt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Zentrifugationsverfahren, Membranverfahren, immunologischen Verfahren, elektrophoretischen Verfahren, chromatographischen Verfahren und Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die immunologischen Verfahren unter Verwendung eines Protein- oder peptidspezifischen Antikörpers durchgeführt werden.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die elektrophoretischen Verfahren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: 1D- und 2D-Gelelektrophorese.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die 1D- und 2D-Gelelektrophorese eine SDS-PAGE-Gelelektrophorese ist.
Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die chromatographischen Verfahren ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasenchromatographie und Größenausschlusschromatographie.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzfragmentierungsmuster in einer Form vorliegt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Druckerzeugnissen, elektronischen Dateien und Zugangsdaten zu Dateien im Internet.
Verfahren zur Diagnose von Krankheiten, die mit Modifikationen von zumindest einem Protein oder Peptid im Zusammenhang stehen mit den folgenden Schritten: A. Bereitstellen einer biologischen Probe, B. Unterziehen der Probe einem Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid, C. Optional ein ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt B., und D. Bewertung des Krankheitszustands basierend auf der Art und dem Ausmaß der in Schritt B. detektierten Modifikationen, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt B. ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 eingesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheit eine entzündliche Krankheit ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass die entzündliche Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Multipler Sklerose und rheumatoider Arthritis.
Verfahren zum Nachweis von Doping mit zumindest einem modifizierten Protein oder Peptid mit den folgenden Schritten: A. Bereitstellen einer biologischen Probe, B. Unterziehen der biologischen Probe einem Verfahren zur Detektion von Modifikationen in einem Protein oder Peptid, C. Optional ein ein- oder mehrmaliges Wiederholen von Schritt B., und D. Nachweis des Dopings mit zumindest einem modifizierten Protein oder Peptid basierend auf der Art und dem Ausmaß der in Schritt B. detektierten Modifikationen, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt B. ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22 eingesetzt wird.
Kit zur Detektion von Modifikationen in Proteinen oder Peptiden, der Folgendes aufweist: – zumindest eine schnittstellenspezifische Protease, – zumindest ein Referenzfragmentierungsmuster für die Fragmentierung eines nichtmodifizierten Proteins oder Peptids mit der zumindest einen schnittstellenspezifischen Protease des Kits, und – eine Anleitung zum Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 22, und/oder 23 bis 25 und/oder 26.
Kit nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die schnittstellenspezifische Protease ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Trypsin, Endoprotease LysC, Asparaginyl-Endopeptidase, Aminopeptidase, Carboxypeptidase, Endoprotease GluC, Endoprotease AspN und Cathepsin D.
Kit nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass das Referenzfragmentierungsmuster in einer Form vorliegt, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Druckerzeugnissen, elektronischen Dateien und Zugangsdaten zu Dateien im Internet.
Kit nach einem der Ansprüche 27 bis 29, dadurch gekennzeichnet, das er ferner Anweisungen zur Korrelation eines mit der zumindest einen schnittstellenspezifischen Protease erhaltenen Fragmentierungsmusters mit bekannten Krankheiten aufweist.
Verwendung eines mit einer schnittstellenspezifischen Protease erhaltenen Fragmentierungsmusters eines Proteins oder Peptids zur Detektion einer Modifikation des Proteins oder Peptids.
Verwendung einer schnittstellenspezifischen Protease zur Detektion einer Modifikation eines Proteins oder Peptids.