EP0914615A1 - Verfahren zum direkten diagnostischen nachweis von pathogenen, genetisch bedingten punktmutationen - Google Patents

Verfahren zum direkten diagnostischen nachweis von pathogenen, genetisch bedingten punktmutationen

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EP0914615A1
EP0914615A1 EP97929238A EP97929238A EP0914615A1 EP 0914615 A1 EP0914615 A1 EP 0914615A1 EP 97929238 A EP97929238 A EP 97929238A EP 97929238 A EP97929238 A EP 97929238A EP 0914615 A1 EP0914615 A1 EP 0914615A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
protein
analysis
examined
medical
pathogenic
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP97929238A
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English (en)
French (fr)
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Wolf-Georg Forssmann
Manfred Raida
Bernhard Brenner
Volker Nier
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Haemopep Pharma GmbH
Original Assignee
Haemopep Pharma GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Haemopep Pharma GmbH filed Critical Haemopep Pharma GmbH
Publication of EP0914615A1 publication Critical patent/EP0914615A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
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    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive

Definitions

  • the present invention relates to a method according to the preamble of claim 1.
  • Mutations at the gene level often result in the incorporation of amino acids, which are not intended per se, into proteins which are coded on the corresponding mutated gene segment. This can lead to pathological symptoms, see e.g. sickle cell anemia. Investigations of whether mutations that are responsible for pathological conditions are usually carried out at the DNA level. Such examinations are complex and their evaluation regularly takes a very long time.
  • One problem on which the invention is based is therefore to provide a method with which it is possible to determine the presence of mutations quickly and reliably.
  • the method according to the invention is used to detect mutations in organisms by comparing a mutation-caused deviation in the amino acid composition of a protein expressed in the region of the mutation as the protein to be investigated, in comparison with a corresponding protein which is of a wild type which has the mutation does not have, is expressed.
  • the method according to the invention is characterized in that
  • a sample is taken from the organism at a point at which the protein to be examined is expressed, can be detected and / or plays a physiological role,
  • the protein is either enriched or purified using protein analytical methods, followed by molecular weight determination, or
  • a molecular weight determination of the protein to be examined is carried out without pretreatment from the sample.
  • the invention advantageously relates to a rapid method for medical-diagnostic qualitative! and quantitative analysis at the protein level for the exchange of individual amino acids with pathogenic or non-pathogenic effects on the organism.
  • the medical-diagnostic analysis is preferably carried out by combining enzymatic or chemical cleavage of the isolated peptide, chromatographic separation of the fragments and analysis via mass spectrometry, both direct LC / MS and indirect MALDI-MS and analysis z. B. via capillary electrophoresis.
  • samples from an organism can be regarded as a basis for the method according to the invention.
  • locations at which the samples are taken those locations are selected at which the protein to be examined is expressed, is detectable or plays a physiological role, for example in muscle fiber bundles or tissue pieces from organs, especially hearts.
  • the samples are advantageously processed in such a way that the exchange of a single amino acid can be clearly identified by mass spectrometric, chromatographic and / or electrophoretic methods and the expression and incorporation ratio between wild form and mutant can be determined quantitatively. This means that direct protein analysis also makes it possible to diagnose the causes of a genetic disease at an early stage and to identify previously unknown mutations by comparing samples from healthy people with samples from sick people.
  • MALDI-MS laser-induced desorption and ionization flight time mass spectrometry
  • the method is distinguished from the previously used analyzes of the DNA coding for the proteins in that the detection of the mutation and the determination of the expression and incorporation ratio take place in a significantly shorter time. An analysis must be carried out within a week, in contrast to the usual analysis times for DNA analysis from several weeks to half a year. It is advantageous that a specific cleavage of the; Protein obtained from biopsy samples for diagnostic purposes with selective enzymes, endoproteinases or by chemical reagents, and the fragments obtained by this cleavage are separated by chromatographic methods and directly (LC / MS) or indirectly (MALDI-MS) on their molecular weights are characterized. The distribution of the separation and the molecular weight, determined by mass spectrometry, is clear evidence for each fragment of the protein.
  • the amino acid exchanges can be determined directly with the described method, without prior cleavage into fragments. Due to the accuracy of the measurement, it is possible to precisely determine deviations in the molecular weight of ⁇ 5 daltons and thus to detect wild forms in addition to mutants. The exact localization of the amino acid exchange can take place with the cleavage described above.
  • this method is also used in clinical diagnostic detection the cause of diseases and, by optimizing the separation and detection conditions, can also be adapted to systematically screen patient samples for specific, defined mutations.
  • the method described can also be largely automated using suitable devices.
  • the analysis duration for the described procedure is in the range of a few days, while the DNA analysis takes several weeks to months. At the same time, all proteins involved in a physiologically functional structure can be analyzed with it.
  • this method In contrast to the usual methods for the detection of point mutations by analysis of the genomic DNA or the cDNA, this method also allows the expression and the incorporation of the mutant into the physiologically functional structure, especially if due to the double set of chromosomes present in the cell nucleus, both forms of the protein in question are expressed and in the functional form it is not known in what ratio the two forms are present.
  • the invention further enables the identity of the wild type and the mutant to be proven by chemical sequence analysis or by amino acid analysis.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention consists in the cleavage of the protein to be examined with suitable enzymes or chemical reagents, the combination of chromatographic methods, in particular high-pressure liquid chromatography with capillary columns (MB-HPLC) and mass spectrometry.
  • the invention is explained in more detail using the example of the heavy chain of the ⁇ -isoform of myosin.
  • Point mutations in the heavy chain of the ß-isoform of myosin e.g. the Replacing the amino acid valine at position 606 with the amino acid methionine can lead to hypertrophic cardiomyopathy, a genetic thickening of certain heart walls, which can lead to sudden death.
  • the detection of the mutation is possible by combining an enzymatic cleavage with the LC / MS.
  • FIGS. 1 a and 1 b show the analysis of the peptide fragment: the human cardiac heavy chain of ⁇ -myosin ( ⁇ -MHC) with the aid of the coupling of high performance liquid chromatography (HPLC) with mass spectrometry (MS).
  • ⁇ -MHC human cardiac heavy chain of ⁇ -myosin
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • MS mass spectrometry
  • FIG. 1 a shows two marked areas in which, in addition to the original fragment, the wild-type fragment with a molecular weight of 1475.5, in addition to the fragment with the amino acid exchange and a in a person in whom the exchange had been proven at the gene level Molecular weight of 1507.5 could be demonstrated.
  • Figure 1b shows the analysis of a ⁇ -MHC sample of a person without a point mutation in the gene. Only the wild-type fragment can be detected here; in the area in which the mutated fragment eluted in FIG. 1 a, this peptide is completely absent. The mutated ⁇ -MHC can thus be detected in a person's muscle fibers.
  • the peptides detected in the fractions were confirmed in their sequence via the collision-induced fragmentation with the aid of the coupling of two mass spectrometers (CID-MS / MS).
  • the distances between the fragment ions denoted by b and y correspond highly specifically to the amino acids of the peptides.
  • the sequence of the peptide can be determined in whole or in part from these distances. Problems only arise with the amino acids Leu and Ile, which have no molecular weight differences and Lys and Gin, which differ by only 0.04 mass units. Since the enzymatic cleavage was carried out with an enzyme which cleaves specifically behind Lys, it can be assumed for the sequence determination that amino acids are a Lys at the end of the peptide.
  • the CID-MS / MS spectra are shown in FIGS. 3a and 3b.
  • the distance between b5 and b6 clearly shows the shift due to the amino acid exchange, while all other distances between the fragment ions remain unchanged.
  • the evaluation resulted in sequences DPLNETWGLYQK for the wild type and DPLNETVMGLYQK for the mutant.
  • Database comparisons showed no homology of the CID-MS / MS spectra to other proteins, except for very homologous ß-MHC of other species. The presence of the mutation in the muscle fibers could thus be clearly demonstrated at the molecular level.
  • the buffer used has a pH of 2.5 (100 mM phosphate buffer) in order to exclude electroendo-osmotic flows of the buffer itself and to charge all peptides positively.
  • the. Peptides of the identified fractions separated.
  • a commercially available peptide Iow-pH mobility marker from Applied Biosystems
  • the peptides themselves were identified in further separations by co-injection with the synthetic peptide of the same sequence.
  • the method according to the invention can generally be applied to all mutants of the ⁇ -MHC. So far, the Identification of several fragments which are potential carriers of mutations, these fragments are underlined in FIG. 5, the amino acids written under the continuous sequence are the exchanges known to date. Furthermore, the method according to the invention can be applied to all mutations with a pathogenic effect. This method can be used diagnostically for the early detection of the development of inheritable diseases. In addition to genetic analysis, direct analysis of the risk of a serious disease or of a course of the disease can be made for each patient by analyzing the functioning proteins from the organism become.
  • the basis of the selective cleavage is the isolation of the .beta.-MHC from muscle fibers of the soleus muscle, which are obtained in the context of biopsies, by dissolving in a buffer with a high salt concentration and precipitation of the .beta.-MHC by lowering the salt concentration.
  • the present ⁇ -MHC can be washed with water to remove interfering soluble components.
  • the sample is passed through a 0.2 ⁇ m cellulose acetate filter at a maximum of 10,000 IQ -
  • peptides are eluted by a linear increase of 0.5% / min in the acetonitrile concentration in the buffer, starting from 10% acetonitrile in 0.06% TFA in water to 80% acetonitrile in 0.05% TFA in water.
  • the eluting peptides are passed through a fused silica capillary via a UV detector directly into the electrospray ionization device of the quadrupole mass spectrometer (SCIEX API III, Perkin-Elmer, Langen).
  • SCIEX API III electrospray ionization device of the quadrupole mass spectrometer
  • the m / z (mass to charge) values are determined every 4.2 seconds over a range from 400 to 2400 amu (atomic mass units).
  • the fragment of the wild type and the mutants can be detected from the recorded total ion chromatogram and the respective mass spectra by computer-aided evaluation.
  • Fig. 1 Upper area: total ion chromatogram of the separation of the fragments of the mutated ⁇ -MHC obtained by endoproteinase Lys-C.
  • Middle area detection of the non-mutated fragment in the hatched area (1) of the upper image.
  • the non-mutated fragment has a molecular weight of 1475.5. amu.
  • the ⁇ -MHC was cleaved by incubation with endoproteinase Lys-C and a subsequent separation using a reverse-phase C18 column under the conditions specified above.
  • an automatic fraction collector collects fractions every 2 minutes and 0.5 ⁇ l of each of these fractions with 1 ⁇ l of a suitable matrix substance, usually alpha-hydroxycinnamic acid or sinapic acid, dissolved in 60% acetonitrile and 0.2% TFA , mixed on a carrier for the MALDI-MS.
  • the molecular weights are then determined in a MALDI-MS (Vestec, Houston) using an external standard, i.e. two known synthetic peptides, for calibration of the measurement.
  • the mutated fragments can thus be clearly detected with the aid of MALDI-MS.
  • the fractions from example 2 were subjected to capillary electrophoresis (Beckmann P / ACE 2000, Beckman Kunststoff) using fused silica capillaries with an inner diameter of 75 ⁇ m in a buffer with 100 mM sodium phosphate, pH 8.0, at a Voltage from 15 to 17 kV separated.
  • the peptides are detected using a UV detector at 200 nm.

Abstract

Die Erfindung betrifft ein schnelles Verfahren zur medizinisch-diagnostischen qualitativen und quantitativen Analyse auf Proteinebene auf den Austausch einzelner Aminosäuren mit pathogenen oder nicht-pathogenen Auswirkungen auf den Organismus. Die medizinisch-diagnostische Analyse erfolgt durch die Kombination von enzymatischer oder chemischer Spaltung des isolierten Peptides, chromatographischer Auftrennung der Fragmente und Analyse über Massenspektrometrie, sowohl direkter LC/MS und indirekter MALDI-MS und Analyse über die Kapillarelektrophorese. Durch Vergleich zwischen Proteinproben von gesunden Menschen mit denen erkrankter Menschen können mit dem beschriebenen Verfahren neue, bisher nicht bekannte Mutationen ermittelt werden und die Expression und Inkorporation von Wildtyp zu Mutante quantifiziert werden.

Description

Verfahren zum direkten diagnostischen Nachweis von pathogenen. genetisch bedingten Punktmutationen
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Mutationen auf Genebene bewirken oft den Einbau an sich nicht vorgesehener Aminosäuren in Proteine, die auf dem ent¬ sprechenden mutierten Genabschnitt codiert sind. Dies kann zu pathologischen Erscheinungen führen, siehe z.B. die Sichelzellenanämie. Untersuchungen, ob Mutationen, die für pathologische Zustände verantwortlich sind, vorliegen werden üblicherweise auf DNA-Ebene durchgeführt. Solche Unter¬ suchungen sind aufwendig und deren Auswertung dauert regel¬ mäßig sehr lange.
Ein der Erfindung zugrundeliegendes Problem besteht mithin darin, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem es gelingt, das Vorliegen von Mutationen schnell und sicher festzu¬ stellen.
Erfindungsgemäß gelingt dies mit einem Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Erkennung von Mutationen in Organismen durch Vergleich von durch eine Mutation hervorgerufenen Abweichung in der Aminosäure- Zusammensetzung eines im Bereich der Mutation exprimierten Proteins als zu untersuchendem Protein, im Vergleich mit einem entsprechenden Protein, welches von einem Wildtyp, der die Mutation nicht aufweist, exprimiert wird. Das erfindungs¬ gemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß
dem Organismus an einer Stelle eine Probe entnommen wird, an der das zu untersuchende Protein exprimiert wird, nachweisbar ist und/oder eine physiologische Rolle spielt,
das Protein entweder mittels proteinanalytischer Methoden angereichert oder gereinigt wird, gefolgt von einer Molekulargewichtsbestimmung oder
eine Molekulargewichtsbestimmung des zu untersuchenden Proteins ohne eine Vorbehandlung aus der Probe erfolgt.
Die Erfindung betrifft vorteilhafterweise ein schnelles Verfahren zur medizinisch-diagnostischen qualitative:! und quantitativen Analyse auf Proteinebene auf den Austausch einzelner Aminosäuren mit pathogenen oder nicht-pathogenen Auswirkungen auf den Organismus. Die medizinxsch- diagnostische Analyse erfolgt vorzugsweise durch die Kom¬ bination von enzymatischer oder chemischer Spaltung des isolierten Peptides, chromatographischer Auftrennung der Fragmente und Analyse über Massenspektrometrie, sowohl direkter LC/MS und indirekter MALDI-MS und Analyse z. B. über die Kapillarelektrophorese. Durch Vergleich zwischen Protein¬ proben von gesunden Menschen mit denen erkrankter Menschen können mit dem beschriebenen Verfahren neue, bisher nicht bekannte Mutationen ermittelt werden und die Expression und Inkorporation von Wildtyp zu Mutante quantifiziert werden. Als eine Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens kann dabei die Gewinnung von Proben aus einem Organismus, ins¬ besondere durch Biopsie, angesehen werden. Als Stellen, an denen die Proben genommen werden werden solche Stellen ausgewählt, bei denen das zu untersuchende Protein exprimiert wird, nachweisbar ist oder eine physiologische Rolle spielt, z.B. bei Muskelfaserbündeln oder Gewebestücken aus Organen, besonders Herzen. Die Proben werden vorteilhafterweise so aufgearbeitet, daß durch massenspektrometrische, chromato¬ graphische und/oder elektrophoretische Methoden der Austausch einer einzelnen Aminosäure eindeutig nachgewiesen und das Expressions- und Inkorporationsverhältnis zwischen Wildform und Mutante quantitativ bestimmt werden kann. Somit wird es auch durch direkte Proteinanalyse möglich, Ursachen für eine genetisch bedingte Erkrankung in einem frühen Stadium zu diagnostizieren und durch vergleichende Analyse von Proben aus gesunden Menschen mit Proben aus erkrankten Menschen bisher unbekannte Mutationen zu identifizieren.
Durch den Einsatz der hochempfindlichen "Matrixunterstützten, laserinduzierten Desorptions- und Ionisations-Flugzeit Massenspektrometrie" (MALDI-MS) in Kombination mit der Flüssigchromatographie, insbesondere unter Verwendung von Säulen mit einem Innendurchmesser <. 1 mm (Mikrobore- und Kapillarsäulen) , kann der Nachweis auch mit geringsten Probenmengen geführt werden.
Das Verfahren zeichnet sich gegenüber den bisher angewandten Analysen der für die Proteine codierenden DNA dadurch aus, daß der Nachweis der Mutation und die Bestimmung des Expressions- und Inkorporationsverhältnisses in deutlich kürzerer Zeit erfolgt. Eine Analyse ist innerhalb von einer Woche durchzuführen, im Gegensatz zu den üblichen Analysen¬ zeiten bei der DNA Analyse von mehreren Wochen bis zu einem halben Jahr. Es ist vorteilhaft, daß eine spezifische Spaltung des; aus Biopsieproben gewonnen Proteins zu diagnostischen Zwecken mit selektiven Enzymen, Endoproteinasen, oder durch chemische Reagentien, erfolgt und die durch diese Spaltung erhalt.enen Fragmente durch chromatographische Methoden aufgetrennt und direkt (LC/MS) oder indirekt (MALDI-MS) auf ihre Molekular¬ gewichte hin charakterisiert werden. Die Verteilung ir. der Trennung und das Molekulargewicht, bestimmt durch die Massen- spektrometrie, ist ein eindeutiger Nachweis für jedes Frag¬ ment des Proteins.
Bei kleineren Proteinen, d.h. solchen mit einem Molekularge¬ wicht bis zu 100.000 Dalton, können mit dem beschriebenen Verfahren die Aminosäureaustausche direkt bestimmt werden, ohne vorherige Spaltung in Fragmente. Durch die Genauigkeit der Messung ist es möglich, Abweichungen im Molekulargewicht von < 5 Dalton genau zu bestimmen und damit Wildform neben Mutante nachzuweisen. Die genaue Lokalisierung des Amino¬ säureaustausches kann mit der oben beschriebenen Spaltung erfolgen.
Somit ist es möglich alle Proteine, die an einer physio¬ logisch funktioneilen Struktur, z.B. dem Muskel, beteiligt sind, auf pathogene und nichtpathogene genetisch bedingte Aminosäureaustausche hin zu charakterisieren.
Da durch die Sequenzierung des menschlichen Genoms bereits jetzt sehr viele Proteine in ihrer Aminosäuresequenz bekannt sind und in wenigen Jahren alle menschlichen Proteine auf¬ geklärt sein werden, kann mit Hilfe des hier beschriebenen Verfahrens durch die Auswahl der geeigneten Spaltung, die der Fachmann durch an sich bekannte Methoden erreichen kann, eine Analyse des Proteins in Bezug auf Mutationen durch¬ geführt werden.
Von großer Bedeutung kann es dabei sein, daß diese Methode auch in den klinisch-diagnostischen Einsatz bei der Erkennung der Ursache für Erkrankungen und, durch Optimierung der Trenn- und Nachweisbedingungen, auch zum systematischen Screenen von Patientenproben auf bestimmte, definierte Mutationen anpaßbar ist.
Die beschriebene Methode kann unter Verwendung von geeigneten Geräten auch weitgehend automatisiert werden. Die Analysen¬ dauer liegt bei dem beschrieben Vorgehen im Bereich von wenigen Tagen, während die DNA Analyse mehrere Wochen bis Monate benötigt. Gleichzeitig können alle an einer physio¬ logisch funktioneilen Struktur beteiligten Proteine damit analysiert werden.
Im Gegensatz zu den üblichen Verfahren des Nachweises von Punktmutationen durch Analyse der genomischen DNA oder der cDNA gestattet dieses Verfahren auch die Quantifizierung der Expression und die Inkorporation der Mutante in die physio¬ logisch funktionelle Struktur, besonders wenn bedingt durch den im Zellkern vorhandenen doppelten Chromosomensatz, beide Formen des betreffenden Proteins exprimiert werden und in der funktioneilen Form nicht bekannt ist, in welchem Ver¬ hältnis die beiden Formen vorliegen.
Die Erfindung ermöglicht weiterhin, daß die Identität des Wildtypes und der Mutante durch chemische Sequenzanalyse oder durch Aminosäurenanalyse belegbar wird.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Ver¬ fahrens besteht in der Spaltung des zu untersuchenden Proteins mit geeigneten Enzymen oder chemischen Reagenzien, die Kombination von chromatographischen Methoden, besonders der Hochdruck-Flüssigchromatographie mit Kapillarsäulen (MB- HPLC) und der Massenspektrometrie.
Die Erfindung wird am Beispiel der schweren Kette der ß-Isoform des Myosins näher erläutert. Punktmutationen in der schweren Kette der ß-Isoform des Myosins , z.B. der Austausch der Aminosäure Valin an Position 606 gegen die Aminosäure Methionin, kann zu der hypertrophen Kardio- myopathie führen, einer genetisch bedingten Verdi kung bestimmter Herzwände, die zu dem plötzlichen Tod führen kann. Erfindungsgemäß ist der Nachweis der Mutation durch die Kombination einer enzymatischen Spaltung mit der LC/MS möglich.
Fig. la und lb zeigen die Analyse der Peptidfragment«: der humanen kardialen schweren Kette des ß-Myosins (ß-MHC) mit Hilfe der Kopplung der High Performance Liquid Chromatography (HPLC) mit der Massenspektrometrie (MS) . In dem Beispiel wurde nach dem Vorhandensein der heterozygoten MutΞ.nten Val606Met, d. h. dem Austausch des Valins an Positio 606 der ß-MHC gesucht. Fig. la zeigt zwei markierte Bereiche, in denen bei einer Person, bei der der Austausch auf Genebene belegt worden war, neben dem ursprünglichen Fragment, dem Wildtyp-Fragment mit einem Molekulargewicht von 1475,5, daneben auch das Fragment mit dem Aminosäureaustausch und einem Molekulargewicht von 1507,5 nachgewiesen werden konnte. Im Vergleich dazu zeigt die Abbildung lb die Analyse einer ß-MHC-Probe einer Person ohne Punktmutation im Gen. Hier ist nur das Wildtyp-Fragment detektierbar, in dem Bereich, in dem in Abb. 1 a das mutierte Fragment eluierte, fehlt dieses Peptid vollständig. Damit wird die mutierte ß-MHC in Muskel¬ fasern einer Person nachweisbar.
Um diesen Befund, der sich nur auf die beobachteten Mole- kulargewichtsverschiebung von +32 durch den Aminosäure- austausch Val gegen Met, begründet, wurden Fragmente einer enzymatischen Spaltung über HPLC getrennt und in den Fraktionen nach den Peptiden mit den Molekulargewichten 1475,5 und 1507,5 unter Einsatz der Massenspektromecrie gesucht.
Diese Peptide konnten in Fraktionen gefunden werden, die denen der oben gezeigten LC/MS-Analyse entsprechen. Die Pig. 2a und 2b zeigen die Massenspektren dieser Peptidfraktionen, neben den gesuchten Peptiden sind noch eine große Anzahl anderer Peptide der ß-MHC vorhanden.
Die in den Fraktionen nachgewiesenen Peptide wurden in ihrer Sequenz über die Kollision-induzierte Fragmentierung mit Hilfe der Kopplung zweier Massenspektrometer (CID-MS/MS) bestätigt. Die Abstände zwischen den mit b und y bezeichneten Fragmentionen entsprechen hochspezifisch den Aminosäuren der Peptide. Aus diesen Abständen kann die Sequenz des Peptides vollständig oder teilweise ermittelt werden. Probleme machen hierbei nur die Aminosäuren Leu und Ile, die keinerlei Molekulargewichtsunterschiede haben und.Lys und Gin, die sich nur um 0,04 Masseneinheiten unterschieden. Da die enzymatische Spaltung mit einem Enzym durchgeführt wurde, das spezifisch hinter Lys spaltet, kann für die Sequenzbe¬ stimmung davon ausgegangen werden, daß Aminosäuren am Ende des Peptides ein Lys sind.
Die CID-MS/MS-Spektren sind in Fig. 3a und 3b dargestellt. Der Abstand zwischen b5 und b6 zeigt die Verschiebung durch den Aminosäureaustausch deutlich, während alle anderen Abstände zwischen den Fragmentionen unverändert bleiben. Die Auswertung ergab als Sequenzen DPLNETWGLYQK für den Wildtyp und DPLNETVMGLYQK für die Mutante. Datenbankvergleiche ergaben keine Homologie der CID-MS/MS-Spektren zu anderen Proteinen, außer zu sehr homologen ß-MHC anderer -Species. Somit konnte das Vorhandensein der Mutation in den Muskel¬ fasern auf molekularer Ebene eindeutig belegt werden.
Die aufgeführten Techniken sind nicht dazu geeignet den Grad der Inkorporation von Wildtyp zu Mutante zu quantifizieren. Durch die unterschiedlichen Ionisationswahrscheinlichkeiten und durch die Störung durch andere Peptide, die in den Mischungen vorhanden sind, kann durch die Massenspektrometrie nicht auf die Peptidmenge geschlossen werden. Zur Quantifi¬ zierung empfiehlt sich ein weiteres Trennverfahrer., die Kapillarzonen- Elektrophorese, als quantitatives Nachweisver¬ fahren. Bei diesem Verfahren, das auf anderen spezifischen Parametern beruht als die HPLC, werden Peptide in pufferge¬ füllten unmodifizierten Glaskapillaren mit einem ID von 0,05 bis 0,075 mm und einer Länge von 50 cm in einem starken elektrischen Feld getrennt. Der verwendete Puffer hat einen pH-Wert von 2,5 (100 mM Phosphatpuffer), um elektroendo- osmotische Flüsse des Puffers selbst auszuschließen und um alle Peptide positiv zu laden. In diesem System wurden die. Peptide der identifizierten Fraktionen getrennt. Als interner Standard wurde ein käufliches Peptid (Iow-pH mobility marker von Applied Biosystems) in gleichen Mengen zugegeben, um zum einen die Peakflächen der zu vergleichenden Peptide unter¬ einander zu vergleichen und um Schwankungen in der Elutions- zeit bei den verschiedenen Läufen berücksichtigen zu körnen. Die gesuchten Peptide selbst wurden in weiteren Trennungen durch Koinjektion mit dem synthetischen Peptid gleicher Sequenz identifiziert. Über die Peakhöhe und auch über die Peakfläche wurde eine relative Inkorporation von 10 bis 15% % der Mutanten am gesamten ß^MHC berechnet. Dieses Experiment wurde mit 5 verschiedenen Präparationen, allerdings von einem Patienten durchgeführt. Die auf diese Weise gemessenen Werte für die Mutante ß-MHV Val606Met lagen immer zwischen 10 und 15%. Die Kapillarzonen-Elektrophoresen sind in Fig. 4a und 4b gezeigt, das markierte Peptid (*) ist der zugefügte interne Standard, das Peptide (1) ist das Fragment des Wildtyps der ß-MHC, das Peptid (2) das Fragment der Muta:ιten der ß-MHC.
Hierbei ist von Interesse, das die untersuchte Probe keine Symptome der familiären hypertrophen Kardiomyophathie zeigt. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß ein niedriger Inkorporationsgrad nicht zu äußerlich sichtbaren Ver¬ änderungen der Muskelfunktion führt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann generell auf alle Mutanten der ß-MHC angewandt werden. Bislang gelang die Identifikation von mehreren Fragmenten, die potentielle Träger von Mutationen sind, diese Fragmente sind in der Fig. 5 unterstrichen, die unter die durchgehende Sequenz ge¬ schriebenen Aminosäuren sind die bis jetzt bekannten Aus¬ tausche. Weiterhin kann das erfindungsgemäße Verfahren auf alle Mutationen mit pathogenem Effekt angewandt werden. Ein diagnostischer Einsatz dieses Verfahrens kann für die Früh¬ erkennung der Entwicklung von vererbbaren Erkrankungen erfolgen, neben der Genanalyse kann für jeden Patienten durch Analyse der funktionierenden Proteine aus dem Organismus eine direkte Vorhersage über ein Risiko einer schweren Erkrankung bzw. über einen Verlauf der Erkrankung gemacht werden.
Beispiel 1:
LC/MS Analyse der durch Endoproteinase Lys-C erhaltenen Fragmente der schweren Kette der ß-Isoform des Myosins (ß- MHC) .
Grundlage der selektiven Spaltung ist die Isolierung der ß- MHC aus Muskelfasern des Muskel soleus, die im Rahmen von Biopsien gewonnen werden, durch Lösen in einem Puffer mit hoher Salzkonzentration und Fällung der ß-MHC durch Er¬ niedrigung der Salzkonzentration. Die vorliegende ß-MHC kann zum Entfernen von störenden löslichen Bestandteilen mit Wasser gewaschen werden.
Zur Darstellung der zu analysierenden Fragmente wird die gefällte ß-MHC in 200 μl Puffer von 100 mM Ammonium- bicarbonat, pH 8.2, aufsuspendiert und über 24 Stunden bei 37 *C mit der Endoproteinase Lys-C (Boehringer Mannheim) inkubiert. Die Lösung wird anschließend einer Gefriertrock¬ nung unterzogen und in 100 μl 0.1 Trifluoressigsäure in Wasser gelöst.
Zum Entfernen von nicht gelösten Bestandteilen wird die Probe durch ein 0.2 μm Celluloseacetat Filter bei maximal 10.000 I Q -
x g filtriert und 20 bis 50 μl Ailiquots auf die MB-HPLC aufgetragen. Die Trennung erfolgt über eine reverse-phase C18 Säule mit einem Innendurchmesser von 1 mm und einer Länge von 100 mm bei einer Flußrate von 20 μl/min. Die Elutior der Peptide erfolgt durch einen linearen Anstieg von 0.5 %/min der Acetonitrilkonzentration im Puffer, ausgehend von 10 % Acetonitril in 0.06 % TFA in Wasser bis 80 % Acetonitril in 0.05 % TFA in Wasser. Die eluierenden Peptide werden durch eine fused-silica Kapillare über einen UV-Detektor direkt in die Elektrospray-Ionisationseinrichtung des Quadrupol- Massenspektrometers (SCIEX API III, Perkin-Elmer, Langen) geführt. Im Massenspektrometer erfolgt die Bestimmung der m/z (Masse zu Ladung) Werte über einen Bereich von 400 bis 2400 amu (atomic mass units) alle 4.2 Sekunden. Aus dem aufgezeichneten Totalionenchromatogramm und den jeweiligen Massenspektren kann durch computergestützte Auswertung das Fragment des Wildtypes und der Mutanten nachgewiesen werden.
Nach der beschriebenen Trennung wurde eine Probe der nicht- mutierten ß-MHC zusammen mit den synthetischen Peptiden mit den Sequenzen des nicht-mutierten und des mutierten Frag¬ mentes unter den gleichen Bedingungen analysiert. Die vorher gefundenen Moleküle liegen in den Bereichen, in denen die synthetischen Peptide eluieren.
Abb. 1: Oberer Bereich: Totalionenchromatogramm der Trenr.ung der durch Endoproteinase Lys-C erhaltenen Fragmente der mutierten ß-MHC.
Mittlerer Bereich: Nachweis des nicht mutierten Fragmentes in dem schraffierten Bereich (1) des oberen Bildes. Das nicht-mutierte Fragment hat ein Molekulargewicht von 1475.5. amu.
Unterer Bereich: Nachweis des mutierten Fragmentes in dem schraffierten Bereich (2) des oberen Bildes. Das mutierte Fragment hat ein Molekulargewicht von 1507.5 amu. Beispie l 2 :
Nachweis der Fragmente des Wildtypes und der Mutante der ß- MHC mit Hilfe der MALDI-MS Technik
Wie in Beispiel 1 beschrieben erfolgte die Spaltung der ß-MHC durch Inkubation mit Endoproteinase Lys-C und eine an¬ schließende Trennung über eine reverse-phase C18 Säule mit den oben angegebenen Bedingungen. In diesem Beispiel werden statt einer direkten Kopplung mit dem Massenspektrometer durch einen automatischen Fraktionssammler alle 2 Minuten Fraktionen gesammelt und von diesen Fraktionen jeweils 0.5 μl mit 1 μl einer geeigneten Matrixsubstanz, üblicherweise alpha-Hydroxyzimtsäure oder Sinapinsäure, gelöst in 60 % Acetonitril und 0.2 % TFA, auf einem Träger für die MALDI-MS vermischt. Die Bestimmung der Molekulargewichte erfolgt anschließend in einem MALDI-MS (Vestec, Houston) unter Verwendung eines externen Standards, d.h. zweier bekannter synthetischer Peptide, zur Kalibrierung der Messung.
Diese Messungen ergaben in den korrespondierenden Fraktionen aus Beispiel 1 die erwarteten Massen von 1477.5 und 1507.5 amu.
Somit können auch unter Zuhilfenahme der MALDI-MS die mutierten Fragmente eindeutig nachgewiesen werden.
Beispiel 3 :
Analyse der Fraktionen aus Beispiel 2 mit Hilfe der Kapillar¬ elektrophorese
Die Fraktionen aus beispiel 2 wurden mit Hilfe der Kapillar¬ elektrophorese (Beckmann P/ACE 2000, Beckman München) unter Verwendung von fused-silica Kapillaren mit einem Innendurch¬ messer von 75 μm in einem Puffer mit 100 mM Natriumphosphat, pH 8.0, bei einer Spannung von 15 bis 17 kV getrennt. Die Detektion der Peptide erfolgt mit Hilfe eines UV Detektors bei 200 nm.
Durch Koinjektion der synthetischen Peptide in einem zweiten Trenngang konnte die Identität der natürlichen nicht- mutierten und mutierten Fragmente gezeigt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erkennung von Mutationen in Organismen durch Vergleich von durch eine Mutation hervorgerufenen Abweichung in der Aminosäurezusammensetzung eines im Bereich der Mutation exprimierten Proteins als zu untersuchendem Protein, im Vergleich mit einem ent¬ sprechenden Protein, welches von einem Wildtyp, der die Mutation nicht aufweist, exprimiert wird,
dadurch gekennzeichnet, daß
dem Organismus an einer Stelle eine Probe entnommen wird, an der das zu untersuchende Protein exprimiert wird, nachweisbar ist und/oder eine physiologische Rolle spielt,
das Protein entweder mittels proteinanalytischer Methoden angereichert oder gereinigt wird, gefolgt von einer Molekulargewichtsbestimmung oder
eine Molekulargewichtsbestimmung des zu untersuchenden Proteins ohne eine Vorbehandlung aus der Probe erfolgt
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu untersuchende Protein in Proteinfragmente zer¬ legt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß das zu untersuchende Protein die schwere Kette der ß-Isoform des Myosins oder ein durch Endo- protease Lys-C erhältliches Fragment davon ist.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Erfassung des Mole¬ kulargewichts mittels LC/MS-Kopplung oder MALDI-MS erfolgt .
5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 zum direkten medizinisch-diagnostischen Nachweis der Expression und der Inkorporation von Wildtyp neben Mutante auf Proteinebene in Präparationen die aus Biopsien aus humanem oder tierischem Gewebe gewonnen wurden.
6. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 für die medizinisch-diagnostische Quantifizierung der Expression und der Inkorporation in physiologisch funktionelle Strukturen von Wildtyp und Mutante auf Proteinebene.
7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 zur medizinisch-diagnostischen Analyse der Expression und Inkorporation und des Verhältnisses von Wildtyp zu Mutante in verschiedenen Gewebe- und Organbereichen.
8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4 für den medizinisch-diagnostische Nachweis von bisher unbekannten pathogenen und nicht-pathogenen Mutationen direkt auf Proteinebene.
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