EP1451590A2 - Peptide und verfahren zum nachweis von morbus alzheimer und zur unterscheidung von morbus alzheimer gegenüber anderen demenziellen erkrankungen - Google Patents

Peptide und verfahren zum nachweis von morbus alzheimer und zur unterscheidung von morbus alzheimer gegenüber anderen demenziellen erkrankungen

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Publication number
EP1451590A2
EP1451590A2 EP02798252A EP02798252A EP1451590A2 EP 1451590 A2 EP1451590 A2 EP 1451590A2 EP 02798252 A EP02798252 A EP 02798252A EP 02798252 A EP02798252 A EP 02798252A EP 1451590 A2 EP1451590 A2 EP 1451590A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptides
mac3
peptide
disease
alzheimer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02798252A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Norbert Lamping
Hans-Dieter Zucht
Hartmut Selle
Michael JÜRGENS
Gabriele Heine
Rüdiger HESS
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DIGILAB Inc
Original Assignee
Biovision AG
Biovision GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biovision AG, Biovision GmbH and Co KG filed Critical Biovision AG
Publication of EP1451590A2 publication Critical patent/EP1451590A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders
    • G01N2800/2821—Alzheimer

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of Alzheimer's disease, in particular a method which enables a distinction between Alzheimer's disease and other dementia diseases. For this purpose, the concentration of certain peptides in body fluids or other samples of the patient is determined.
  • the invention further relates to peptides, antibodies, nucleic acids etc. which have been found for determining the presence and / or the degree of the disease, and their uses for diagnosis and therapy.
  • dementia diseases are an increasing problem, as they appear with increasing age. Most dementia diseases are not curable and require long-term care of the sick.
  • Alzheimer's disease is the most common disease in the group of dementia diseases [1].
  • the diagnosis and therapy of Alzheimer's disease is therefore of particular importance.
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease that is characterized by the following symptoms: decrease in mental ability, short-term and long-term memory disorders, confusion and reduced self-preservation and self-care ability.
  • the deterioration in mental performance occurs in addition to the age-related deterioration in mental ability [1].
  • the diagnosis of Alzheimer's disease is difficult because, like other dementia diseases, it begins insidiously and is associated with slowly progressive destruction of nerve cells in the brain and the associated reduced mental performance.
  • Various other dementia diseases, such as vascular dementia have very similar symptoms, which makes it difficult to differentiate between Alzheimer's disease and other dementia diseases.
  • MMSE Score Minimum-Mental Status Examination
  • Alzheimer's disease cannot yet be distinguished with certainty from other dementia diseases [3].
  • the invention has for its object to avoid the disadvantages of Alzheimer's diagnosis in the prior art and to provide an early and reliable method for the detection and differentiation of Alzheimer's disease from other dementia diseases.
  • the peptides are fragments of the precursor molecule Complement C3, in particular a 17 amino acid long, defined peptide derived from Complement C3, which is referred to as C3f [4].
  • C3f a further C3f peptide, in which the C-terminal amino acid arginine has been split off (C3f-des-Arg), was detected in cerebrospinal fluid of cerebral Alzheimer's patients in concentrations which differ from the concentrations of the respective peptide in non- Alzheimer's dementia or healthy people deviates.
  • C3f occurs, but also the term C3F, whereby C3F is not identical to C3f. Rather, C3F stands for "C3-fast", a complement C3 polymorphism that causes the complete precursor molecule of this C3 variant to move faster in the electric field of gel electrophoresis.
  • MAC3 peptides The sequence of C3f is identical to the sequence for Seq. ID 1 from the sequence listing, as well as with the sequence of MAC3-1.
  • MAC3 peptides contain at least 8 and at most 17 amino acids, which are identical to the amino acids at the corresponding sequence positions in the sequence of C3f, according to Seq. ID 1, are.
  • MAC3 peptides can contain two point mutated, two deleted or two additional internally inserted amino acids, as well as N-terminal and / or C-terminal extensions according to Seq. Include ID 1.
  • C3f peptides and C3f peptide fragments are also referred to as MAC3 peptides, which are derived from naturally occurring complement C3 polymorphisms and from naturally occurring C3 mutants.
  • the invention in a method for the detection of Alzheimer's disease by determining the concentration of at least one marker peptide in a biological sample of a patient, that at least one MAC3 peptide is used as the marker peptide, a concentration increase or concentration reduction specific for the respective marker peptide Marker peptide is detected in the sample and a change in the concentration of the marker peptide is evaluated in the aforementioned manner as a positive detection result for Alzheimer's disease.
  • MAC3 peptides that can be understood as fragments of the complement C3f sequence or the C3f peptide itself are referred to as MAC3 peptides. They include homologous peptides and peptide fragments derived from the complement C3f fragment. They include descendants of naturally occurring alleles of these peptides and homologous mutants, in particular point-mutated mutants with preferably no more than two amino acids which differ from complement C3.
  • Preferred markers according to the invention are specified in the sequence listing and are numbered from MAC3-1 to MAC3-16, corresponding to Seq. ID 1 to 16, where MAC3-1 of Seq. ID 1, MAC3-2 of Seq. ID 2, MAC3-3 of Seq. Correspond to ID 3, etc.
  • homologous sequences are spoken of in the present application, this refers to sequences which have at least 70 percent homology.
  • computer programs such as the GCG program package (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, USA), including GAP [5], BLASTP, BLASTN, FASTA [6] or the well-known Smith Waterman algorithm for determining homologies.
  • Preferred parameters for the amino acid sequence comparison include the algorithm by Needleman and Wunsch [7], the comparison matrix BLOSUM 62 [8], a gap value (gap penalty) of 12, a gap length value (gap length penalty) of 4 and a Homology threshold of 0.
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the above parameters are the error parameters (default parameters) for amino acid sequence comparisons, with gaps at the ends not reducing the homology value. In the case of very short sequences compared to the reference sequence, it may also be necessary to increase the expectation value to up to 100,000 (expectation value) and, if necessary, to reduce the word size to up to 2. Further exemplary algorithms, gap opening penalties, gap extension penalties, comparison matrices including those mentioned in the program manual, Wisconsin package, version 9, September 1997, can be used. The selection will depend on the comparison to be performed and also on whether the comparison is carried out between pairs of sequences, with GAP or the best fit being preferred, or between a sequence and an extensive sequence database, with FASTA or BLAST being preferred.
  • a match of, for example, 70% determined with the above-mentioned algorithm is referred to as 70% homology.
  • homologous sequences are understood in principle to be all sequences which have at least a 70 percent match, the match being calculated in accordance with the above description. This relates to both amino acid and nucleic acid sequences.
  • the marker peptides can be present in post-translational modifications and / or in enzymatically and / or chemically modified form, preferably as Peptide oxides, and can be detected in this form.
  • a chemically or post-translationally modified complement C3 peptide or MAC3 peptide can consist of both D- and L-amino acids, as well as combinations of D- and L-amino acids, and can occur naturally, recombinantly or enzymatically, or be chemically synthesized , These peptides can also contain unusual amino acids, ie amino acids that do not belong to the 20 standard amino acids. Numerous examples of unusual amino acids and post-translational modifications such as phosphorus and sulfate groups, glycosylation, amidation, deamidation, pyroglutamic acid etc. are described in the literature and in databases [9].
  • one or more amino acids or the entire peptide can be replaced by structures consisting of peptidomimetics.
  • peptidomimetics is used in the present application in the form of the broadest possible definition.
  • a peptidomimetic is a substance that contains non-peptide structural elements and is able to mimic or antagonize the biological action of the natural mother molecule. Numerous works are known in the prior art which deal in detail with possibilities of using peptidomimetics as a replacement for conventional peptide structures.
  • nucleic acids DNA, RNA and DNA-RNA hybrid molecules of both natural origin and also synthetically, enzymatically or recombinantly produced are regarded as nucleic acids. Also included are nucleic acids that contain modified nucleotides with changed in vivo stability, such as phosphorothioates. Such stabilized nucleic acids are already used when using ribozyme, antisense RNAi ("RNA-mediated interference") and triplex nucleic acid techniques.
  • the method according to the invention is a method in which specific biomarkers are detected, the concentration of which has been changed in the case of neurodegenerative diseases, in particular in Alzheimer's disease, and which also have the disease at a very early stage and an increased probability of Show disease risk early. This is important in order to provide a reliable clinical marker for the diagnosis of these diseases.
  • the concentration of the MAC3 peptides in the sample but also the characteristic pattern of the occurrence of several specific MAC3-
  • Alzheimer's disease underlines Alzheimer's disease, since reliable detection of the disease is a prerequisite for the development of a therapy.
  • MAC3 peptides also makes it possible, in the context of clinical studies to develop new therapies for the treatment of Alzheimer's disease with high specificity, to select only those patients who are suffering from Alzheimer's disease and not from other similar diseases. This is important in order to obtain meaningful study results, since patients misdiagnosed as Alzheimer's disease patients negatively affect the quality of the results of an Alzheimer's therapy study. Complement C3 biology
  • the complement system plays a central role in the specific and non-specific immune defense and consists of more than 30 proteins, some of which are proteases and some of which are substrates of these proteases.
  • the functioning of the complement system is based on a kind of chain reaction, at the beginning of which a substance, e.g. a bacterial cell membrane, a component of the complement system activates, this complement factor in turn activates the next complement factor, etc.
  • the complement activation can also lead to the lysis of healthy, host-own cells which happen to be in the vicinity of the complement activation site. This process is also called the "bystander" effect, and it can result in extensive tissue destruction.
  • the anaphylatoxin C3a has, for example, cytotoxic, blood vessel-expanding and cell-stimulatory properties
  • a number of other complement C3 cleavage products such as C3b, C3c, C3d, C3g, C3e and C3f, are known (Fig. 1) Of these C3 peptides, some, but not all, are known to have biological functions.
  • C3d peptide is the C3 peptide in which the thiolester group is present in the intact C3 molecule and which therefore occurs covalently linked to complement-activating substances.
  • Scientific studies show that C3f sometimes mediates biological effects similar to C3a. C3f and C3a lead to contraction smooth muscles and increase vascular permeability [1 1].
  • C3a and C3f the C-terminal amino acid is an arginine, and the cleavage of this amino acid alters the biological activity of both C3a and C3f.
  • the resulting products are called C3a-des-Arg and C3f-des-Arg.
  • C3f and C3a presumably use, at least in part, the same receptors, which could explain their similar biological effects [1 1].
  • C3 is mainly synthesized by the liver, but also locally by monocytic cells and macrophages.
  • C3-concentrations in the cerebrospinal fluid are about 20 times higher.
  • the C3 concentration in the cerebrospinal fluid also increases, but only by a factor of two, while in other inflammatory reactions in the brain, e.g. in aseptic meningitis the C3 concentration in the cerebrospinal fluid remains unchanged [12].
  • Complement proteins and their receptors are also synthesized by microglia, astrocytes and neurons, among others.
  • the amount of mRNA and protein of the complement proteins C1 to C9 is increased in the brain of Alzheimer's disease patients relative to the brain of healthy people.
  • the concentration of C3 and C4 is the least changed with a 2-fold increase in the brain and unchanged concentrations in the liver, relative to healthy people.
  • Various other complement proteins are, compared to healthy individuals, significantly higher in the brain of Alzheimer's disease patients: C1 q mRNA is increased 23-fold, C1 r 5-fold, C7 6-fold and C9 is 22-fold increased [12 ]. It is therefore surprising and unexpected that fragments of the complement C3 protein and not fragments of other complement proteins are suitable as markers for Alzheimer's disease.
  • Deposits in the form of "plaques” and “tangles” in the brain of Alzheimer's disease patients consist primarily of beta-amyloid and tau protein.
  • these proteins include 1-anti-chymotrypsin, synaptophysin, cystatin C, heme oxigenase, various apolipoproteins such as Apo E4, Apo J and Apo A1, IL-6, the AMY antigen, prion protein, beta spectrin, alpha-2 macroglobulin, lactoferrin and various
  • Complement proteins such as C1 q, C3 and C4d.
  • these deposits also contain sugar structures, e.g. Heparan sulfate. These deposits thus represent complex structures made of proteins and other substances.
  • Eikelenboom et al. discovered that deposits in the brain of Alzheimer's disease patients contain, among other things, complement C3 and that beta-amyloid presumably activates the complement cascade, which was shown experimentally in subsequent work [13].
  • MAC3-3 to MAC3-16 represent C3f peptide fragments that have never been described in the literature and are therefore new as substances.
  • MAC3-1 and MAC3-2 are already known from the literature [4, 1 1].
  • none of the peptides MAC3-1 to MAC3-16 have been discussed in connection with neurodegenerative diseases, and consequently their use as diagnostic markers for the detection of Alzheimer's disease is novel.
  • r1 - either represents the amino acid serine or there is no amino acid at this sequence position
  • r2- represents a sequence which corresponds to the sequence or parts of the sequence of complement C3 from amino acid 1313 to 1320, where r2, starting from amino acid 1312 des C3 precursor, can be between 0 and 8 amino acids long.
  • r3- represents the C3 precursor sequence from amino acid 1304 to 131 1 or parts thereof, where r3, starting from the C3 amino acid 1312, between 0 and 8 amino acids can be long.
  • r4 corresponds to the amino acid arginine or, alternatively, there is no further amino acid at this position in the peptide sequence.
  • the MAC3 peptides according to the invention can exist in post-translational or chemical modification forms, which among other things. on their masses and thus the mass spectrometric identification and also on their elution behavior in chromatography, e.g. in reverse phase chromatography.
  • the peptides can be oxidized, phosphorylated, glycosylated, sulfated, amidated etc. in the sample to be examined.
  • Naturally occurring C3f peptides and C3f peptide fragments derived from complement C3 polymorphisms or C3 mutants are also referred to as MAC3 peptides.
  • C3f sequence Seq. ID 1
  • the same computer programs and algorithms are used that are also used to determine the homology of sequences [5-8].
  • the peptides are also considered to be MAC3 peptides if a maximum of 2 of their amino acids differ from the corresponding sequence of the C3 precursor molecule. Point mutations, deletions, insertions of amino acids and N-terminal and / or C-terminal extensions are permitted as long as the peptide sequence is between 8 and 17 amino acids long, at least 8 amino acids are conserved relative to the C3 precursor sequence, and a maximum of 2 amino acids from the C3f sequence deviate.
  • the concentration of the identified MAC3 peptide (s) is changed for each of these peptides in a defined concentration that is either always specifically higher or always specifically lower for the respective peptide.
  • concentrations of the respective peptides can be used to determine the severity of Alzheimer's disease. especially as a replacement or supplement to the implementation of a "mini-mental status examination" (MMSE).
  • Control samples that may be used can be a pool sample from various controls.
  • the Alzheimer's disease sample to be examined can also be a pool sample, with individual examinations being carried out if the result is positive.
  • a reference value for the respective individual MAC3 peptide can be determined from the results of the determination of individual MAC3 peptides in control samples. In future measurements to differentiate between Alzheimer's disease patients and non-Alzheimer's disease patients, the determined measurement value can then be compared with this reference value in order to arrive at a diagnosis.
  • the body fluid sample can preferably be (human) cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid, CSF) or a sample of another biological material such as serum, plasma, urine, stool, tear fluid, synovial fluid, lymph fluid, etc. This depends, among other things, on the sensitivity of the chosen detection method ( Mass spectrometry, ELISA etc.). Line or tissue samples can also be used if necessary. It is therefore provided in a further embodiment of this invention that cell or tissue homogenates are prepared for the preparation of the sample to be examined, for example from human tissue samples obtained in the context of biopsies or from blood cells.
  • These tissues can be comminuted, for example, with manual homogenizers, with ultrasonic homogenizers or with electrically operated homogenizers such as Ultraturrax, and then in a manner known to the person skilled in the art in acidic, aqueous solutions with, for example, 0.1 to 0.2 M acetic acid for Be cooked for 10 minutes.
  • the extracts are then subjected to the respective detection method, for example a mass spectrometric examination.
  • the samples can be in the prepared in the usual way, eg diluted or concentrated if necessary, and stored.
  • the invention further comprises the use of at least one of the MAC3 peptides according to the invention for the diagnosis of neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease, and the use of MAC3 peptides for the production of antibodies or other agents which, owing to their MAC3 Peptide-specific binding properties are suitable for the development of diagnostic reagents for the detection of this disease.
  • the invention also encompasses the use of MAC3 peptides to obtain phage particles which specifically bind these peptides or which, conversely, present MAC3 peptides on their surface and thus enable the identification of binding partners of MAC3 peptides.
  • MAC3 peptides can be used within the scope of the invention. All methods are suitable for this purpose which make it possible to specifically detect MAC3 peptides in a sample from a patient. Suitable methods include physical methods such as e.g. Mass spectrometry or liquid chromatography, molecular biological methods such as Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or immunological detection techniques, e.g. "Enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA).
  • physical methods such as e.g. Mass spectrometry or liquid chromatography
  • molecular biological methods such as Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or immunological detection techniques, e.g. "Enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA).
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assays
  • One embodiment of the invention is the use of physical methods which can indicate the peptides according to the invention qualitatively or quantitatively. These methods include mass spectrometry, liquid chromatography,
  • the peptides in the sample are chromatographically separated before identification, preferably with reverse phase chromatography, and separation of the peptides in the sample with high-resolution reverse phase high-performance liquid chromatography (RP.) Is particularly preferred HPLC).
  • RP. reverse phase high-performance liquid chromatography
  • Another embodiment of this invention is to carry out precipitation reactions to fractionate the sample using precipitants such as e.g. Ammonium sulfate, polyethylene glycol, trichloroacetic acid, acetone, ethanol etc.
  • the fractions thus obtained are then subjected to the respective detection method, e.g. the mass spectrometric examination.
  • the liquid phase extraction is used.
  • the sample is e.g.
  • an organic solvent such as polyethylene glycol (PEG) and an aqueous saline solution. Due to their physical properties, certain constituents of the sample accumulate in the organic phase and others in the aqueous phase and can thus be separated from one another.
  • PEG polyethylene glycol
  • a particularly preferred embodiment of this invention comprises the use of reverse phase chromatography, in particular a C18 reverse phase chromatography column using eluents consisting of trifluoroacetic acid and acetonitrile, for the separation of peptides in human cerebrospinal fluid. For example, fractions are collected, each Include 1/100 of the volume of solvent used.
  • the fractions obtained in this way are analyzed using a mass spectrometer, preferably using a MALDI (“matrix-assisted laser desorption and ionization”) mass spectrometer using a matrix solution consisting of, for example, L (-) fucose and alpha Cyano-4-hydroxycinnamic acid, dissolved in a mixture of acetonitrile, water, trifluoroacetic acid and acetone, was analyzed to determine the presence of certain masses and to quantify the signal intensity, which correspond to the masses of the peptides MAC3-1 to MAC3-16 according to the invention.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption and ionization
  • the MAC3 peptides can be identified with the aid of a mass spectrometric determination, preferably a MALDI mass spectrometry.
  • the mass spectrometric determination further preferably comprises at least one of the following mass signals, each calculated on the basis of the theoretical, monoisotopic mass of the corresponding peptide. Slight deviations from the theoretical, monoisotopic mass can occur due to the experimental error and the natural isotope distribution.
  • a proton is added to the peptides in MALDI mass determinations due to the measurement method, which increases the mass by 1 dalton.
  • the following masses correspond to the theoretical, monoisotopic masses of the peptides we have identified; calculated with suitable software, here GPMAW 4.02.
  • the experimentally determined masses 2038 and / or 2054 occur.
  • These two experimentally determined masses are MAC3-1 as a single or double-oxidized peptide.
  • the symbol> (is larger or the same) is to be understood in such a way that not arbitrarily larger masses are possible for the MAC3 peptides concerned, but only the masses which can result from the amino acids which may also be located at the ends of these peptides.
  • the peptide can be a maximum of 17 amino acids in total. At the ends of these peptides it is not possible for any amino acids to be present in addition, but only those which, owing to the sequence of the complement C3 precursor molecule, can be located at this sequence position.
  • MAC3-1 to MAC3-16 C3f peptides and their descendants are referred to here as MAC3-1 to MAC3-16.
  • Their sequences are in the sequence listing under Seq. ID 1 to Seq. ID 16 specified.
  • the under Seq. MAC3 peptides (ID 15 and 16) (MAC3-15 and MAC3-16) may contain additional amino acids at the N and / or C terminus corresponding to the corresponding sequence of the complement C3f peptide (Seq. ID 1, MAC3-1).
  • the invention also includes the recombinantly or synthetically produced MAC3 peptides isolated from biological samples in unmodified, chemically modified or post-translationally modified form. Two point mutations as well as other deviations are possible as long as the MAC3 peptide has at least 8 amino acids which correspond in their identity and their position within the peptide sequence to the complement C3f peptide.
  • the invention also encompasses nucleic acids which correspond to complement C3 fragments, and in particular those which correspond to the MAC3 peptides according to the invention, and their use for the indirect determination and quantification of the associated protein molecules.
  • This also includes nucleic acids, e.g. non-coding sequences, such as 5'- or 3'-untranslated regions of the mRNA, or nucleic acids which have a sequence matching the nucleic acid sequence of Complement C3 which is sufficient for specific hybridization experiments and which therefore serve to indirectly detect the associated peptides, in particular the MAC3 Peptides are suitable.
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerease chain reaction
  • Northern blots can be used in a manner known to the person skilled in the art.
  • Results can be used to determine the likelihood of an Alzheimer's disease and / or its severity.
  • the identification of the MAC3 peptides can be carried out using an immunological detection system, preferably an ELISA (enzyme linked immunosorbent assay).
  • This immunological detection detects at least one MAC3 peptide.
  • a so-called “sandwich ELISA” should furthermore preferably be used, in which the detection of the MAC3 peptide depends on the specificity of two antibodies that recognize different epitopes within the same molecule.
  • MAC3 peptides can be used however, other immunological methods, for example direct or competitive immunological methods, can also be used, as well as other ELISA-like detection techniques, such as RIAs (radio immuno assays), ELI spot, luminescence, chemiluminescence, electrochemiluminescence, fluorescence or bioluminescence immunoassays - Methods etc. are suitable as immunological detection systems for MAC3 peptides, MAC3 peptides isolated, recombinantly produced or chemically synthesized from biological samples can be used as a standard for the quantification on the peptide or peptide fragment antibodies, i.e. an antibody specific for the peptide.
  • Other detection methods suitable for peptide detection include western blotting, immunoprecipitation, dot blots,
  • Plasmon resonance spectroscopy BIACORE TM
  • phage particles phage particles
  • PNAs Peptide Nucleic Acids
  • affinity matrices etc.
  • all substances / molecules are suitable as detection agents that allow a specific detection system to be set up.
  • Peptide-specific binding partners immobilized on a suitable carrier.
  • All known supports such as plastic tubes,
  • Microtiter plates, particles, microparticles, protein chips, etc. can be used.
  • the binding partner can be immobilized directly on this support or the solid phase in an adsorptive or covalently coupled manner.
  • Another possibility is to individually bind the MAC3 peptide via a pair of one
  • Immobilize binding pair such as biotin / avidin, biotin / streptavidin, antigen / antibody, etc.
  • Another object of the invention is a test kit for the detection of Alzheimer's disease or a predisposition to Alzheimer's disease, which contains at least one binding partner, preferably an antibody, which is directed against a MAC3 peptide.
  • This binding partner is present in an immobilized form bound to a suitable solid phase or a carrier or can be offered in a form which enables immobilization.
  • the binding partner can be biotinylated if the biotin / avidin interaction is to be used as indirect binding.
  • the binding partner can also be present in the test kit in a marked form or in a form which enables the marking.
  • the indirect labeling can be inserted via the interaction of a binding pair such as avidin / biotin, or streptavidin / biotin or digoxin / anti-digoxin antibodies. These methods are known to the person skilled in the art.
  • test kit can also contain a standard which consists of at least one MAC3 peptide.
  • MAC3 peptide concentrations are usually offered as standard.
  • a further embodiment of the invention is the extraction of MACSPeptides using recombinant expression systems, chromatography methods and chemical synthesis protocols which correspond to the Are known to those skilled in the art.
  • the MAC3 peptides obtained in this way can be used, inter alia, as standards for the quantification of the respective MAC3 peptides or as an antigen for producing MAC3 peptide-specific antibodies.
  • Recombinant expression of pepids is one of the methods known and suitable for the person skilled in the art for isolating and obtaining MAC3 peptides.
  • Cell systems such as bacteria such as Escherichia coli, yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae, insect cells such as Spodoptera frugiperda (Sf-9) cells or mammalian cells such as "Chinese Hamster Ovary" (CHO) cells can be used to express the MAC3 peptides are available from the American Tissue Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • nucleic acid sequences which code for MAC3 peptides are inserted in combination with suitable regulatory nucleic acid sequences such as, for example, promoters, antibiotic selection markers, etc. into an expression vector using molecular biological methods.
  • a suitable vector is, for example, the vector pcDNA3.1 from Invitrogen.
  • the MAC3 peptide expression vectors obtained in this way can then be inserted into suitable cells, for example by electroporation.
  • the MAC3 peptides can be prepared by chemical synthesis, for example according to the Merrifield solid-phase synthesis protocol, using synthesizers which are available from various manufacturers.
  • Another embodiment of this invention is the isolation of MAC3 peptides from biological samples or from cell culture media or cell lysates from recombinant expression systems, for example with reverse phase chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, isoelectric focusing, etc.
  • Another embodiment of the invention is the production of monoclonal or polyclonal antibodies using MAC3 peptides.
  • the antibodies are obtained in a conventional manner known to the person skilled in the art.
  • a preferred embodiment is Production and production of MAC3 peptide-specific antibodies which recognize neo-epitopes which are only present on MAC3 peptides but which do not occur in the complete complement C3 precursor molecule.
  • Such anti-MAC3 peptide antibodies enable the specific immunological detection of MAC3 peptides in the presence of the complement C3 precursor molecule.
  • Another application example is the quantitative determination of the above-mentioned peptides to assess the effectiveness of a therapy in development against neurodegenerative diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • the quantitative measurement results from a sample to be examined are compared with the measurement values obtained from a control group and a group of patients.
  • the effectiveness of a therapeutic agent can be derived from these results.
  • the efficacy test is of outstanding importance for the successful development of a therapeutic agent and so far there have been no clinically measurable parameters available for Alzheimer's disease that reliably enable this [3].
  • MAC3 peptides have changed significantly compared to healthy individuals.
  • Another aspect of the invention is therefore the MAC3 concentrations in Alzheimer's disease Bring patients to normal concentrations. This procedure can be used to treat Alzheimer's disease or related neurological diseases.
  • the concentrations of these substances can be given by therapeutic administration of, for example, anti-complement C3 or anti-MAC3 peptide antibodies or complement C3-specific antisense nucleic acids, ribozymes, RNAi nucleic acid molecules or triplex Nucleic acids or MAC3 peptide antagonists or complement C3 antagonists can be lowered.
  • substances can also be administered which suppress the body's own expression of complement C3 or the processing of complement C3 into MACS peptides. If there is a lack of complement C3 or MACS peptides as the cause of the disease, therapeutic additions of complement C3, MAC3 peptides, MAC3 peptide agonists or complement C3 agonists can be carried out. Substances that influence the processing of complement C3 into MAC3 peptides can also be used therapeutically. Of course, the combination of different therapy strategies may also be useful and possible.
  • the invention therefore also includes the use of complement C3 peptides, MAC3 peptides, MAC3 peptide agonists and MAC3 peptide
  • Antagonists anti-complement C3 antibodies and anti-MAC3 peptide
  • Complement C3 peptides and MAC3 peptides for the treatment of neurological diseases, especially Alzheimer's disease.
  • Antibodies can also be antibody fragments, antibody fusion proteins or other selectively binding to complement C3 peptides or MAC3 peptides
  • Peptides can also be used as fusion proteins of the proteins and peptides mentioned. Furthermore, the invention also includes the use of
  • the invention also includes agonists and antagonists which modulate the activity of the proteins mentioned.
  • Another embodiment of this invention is the galenical formulation or chemical modification of the peptides and nucleic acids described in a manner which enables them to cross the blood-brain barrier and / or the blood-liquor barrier more efficiently. This makes them particularly suitable for therapeutic use.
  • MAC3 peptides, complement C3 peptides, peptidomimetics, nucleic acids, agonists or antagonists are modified such that they e.g. lipophilic are what favors the passage into the subarachnoid space, the brain ventricles and the brain tissue. This can be done by inserting hydrophobic molecular components or by "packaging" the substances in hydrophobic agents, e.g. Liposomes can be achieved.
  • Peptide sequences are added to MAC3 or complement C3 peptides, nucleic acids, agonists or antagonists which favor entry into the subarachnoid space or, conversely, make it difficult to exit from the subarachnoid space.
  • the invention also encompasses the administration of the aforementioned therapeutic agents via various routes, such as, for example, as an intravenous injection, as an orally administrable substance, as an inhalable gas or aerosol, or as administration in the form of direct injection into the subarachnoid space, the brain ventricles, or into tissue such as muscle , Fat, brain, etc.
  • routes such as, for example, as an intravenous injection, as an orally administrable substance, as an inhalable gas or aerosol, or as administration in the form of direct injection into the subarachnoid space, the brain ventricles, or into tissue such as muscle , Fat, brain, etc.
  • peptides or proteins that are administered orally can be protected from proteolytic breakdown in the stomach by acid-resistant capsules. Strongly hydrophobic substances can be made more hydrophilic by suitable galenical preparations and thus more suitable for eg intravenous injections.
  • Dosage forms include the packaging of the active ingredients in polymers and gels (Atrix Labs, Fort
  • Another embodiment of the invention is the use of MACS peptides or of complement C3 peptides to identify receptors that selectively bind these molecules. These receptors can also be modulated by administration of agonists or antagonists, which is expedient for the therapy of neurological diseases, in particular of Alzheimer's disease.
  • Exemplary embodiments for checking the therapeutic effectiveness of complement C3 peptides, MAC3 peptides and of agents which modulate the expression and the biological availability of these substances include the cultivation of cell lines. These cell lines can be treated with complement C3 or MAC3 peptides or with peptidomimetics or with substances which promote the expression of complement C3 peptides or which promote the processing of complement C3 peptides into MAC3 peptides. In this way, biological properties of complement C3 and MAC3 peptides in connection with neurological diseases, in particular Alzheimer's disease, can be determined. Fusion proteins and fusion peptides can also be used to treat the cell lines, for example fusion proteins with peptide sequences which promote transport of the fusion protein into the interior of the cell.
  • cell lines can be transfected with expression vectors which directly or indirectly cause expression of complement C3 peptides or MAC3 peptides by the transfected cells.
  • expression vectors can encode, inter alia, MAC3 peptides or complement C3 peptides.
  • the simultaneous transfections with different MAC3 peptides and / or complement C3 peptides can also be carried out.
  • suitable cell lines can be used with anti-complement C3 peptide or anti-MAC3 peptide antibodies or with nucleic acids which suppress the expression of complement C3 peptides, such as, for example, complement C3 antisense nucleic acids, complement C3 triplex nucleic acids, complement C3 RNAi -Nucleic acids or ribozymes directed against complement C3 mRNA can be treated.
  • complement C3 antisense nucleic acids such as, for example, complement C3 antisense nucleic acids, complement C3 triplex nucleic acids, complement C3 RNAi -Nucleic acids or ribozymes directed against complement C3 mRNA
  • complement C3 peptides such as, for example, complement C3 antisense nucleic acids, complement C3 triplex nucleic acids, complement C3 RNAi -Nucleic acids or ribozymes directed against complement C3 mRNA.
  • cell lines that appear to be suitable as neurological model systems in connection with Complement C3 can be used for such
  • tests can be used, among other things, to determine the proliferation rate of the treated cells, their metabolic activity, the apoptosis rate of the cells, changes in cell morphology, the expression of cell-specific proteins or reporter genes or the release of cytosolic Identify cell components as markers for cell death.
  • Suitable strains of experimental animals for example mice, rats, or other species can be used as further test systems, which are considered to be a model for neurological diseases, in particular a model for Alzheimer's disease.
  • These experimental animals can be used to investigate the effectiveness of therapy strategies aimed at modulating the concentration of MAC3 peptides or of complement C3 peptides, and these peptides and proteins can possibly be galenically prepared in such a way that they Brain barrier and / or the blood-CSF barrier can pass better.
  • Liposome-packed proteins and peptides, proteins and peptides, covalently fused or non-covalently associated with transport peptides, such as the HIV-TAT sequence, etc. can be used as a galenical preparation method.
  • peptides and proteins can be chemically modified in such a way that they acquire lipophilic properties and are therefore easier to penetrate into cells.
  • Peptides that are only sparingly soluble in aqueous solutions can be chemically modified in such a way that they become more hydrophilic and can then be used, for example, as an intravenously injectable therapeutic agent.
  • Acid-resistant capsules can be used to protect sensitive substances to be administered orally in the stomach from being destroyed.
  • Read-out parameters in experiments with animal models can be the survival time of the animals, their behavior, their short-term memory performance, their ability to learn, etc.
  • An example of a memory test used for experimental animals such as Suitable for rats is the "Morris water maze test”.
  • experimental animals such as, for example, gene-deficient animals, or transgenic animals can be obtained using molecular biological methods, in whose organism complement C3 peptides or MAC3 peptides are not produced, or produced in reduced or increased quantities.
  • the expression can be changed both locally, for example in the brain, and in the entire organism of the test animal. Caenorhabditis elegans, Drosophila, zebra fish, mice, rats etc. are suitable as experimental animals.
  • Figure 1 Schematic representation of the complement C3 protein with the position of the identified MAC3 peptides
  • Figure 2 Reverse-phase chromatography for the separation and enrichment of the MAC3 peptides from cerebrospinal fluid
  • Figure 6 Box whisker plot for the quantitative comparison of the concentrations of MAC3-1 in healthy controls, in Alzheimer's disease patients and in patients with non-Alzheimer's dementia, and of chemically modified MAC3-1 (e.g. the single or double-oxidized peptide , as well as the double-charged MAC3-1 peptide ion)
  • chemically modified MAC3-1 e.g. the single or double-oxidized peptide , as well as the double-charged MAC3-1 peptide ion
  • Figure 7 Box whisker plot for quantitative comparison of the concentrations of MAC3-2 in healthy controls, in Alzheimer's disease patients and in patients with non-Alzheimer's dementias
  • Figure 8 Box-whisker plot for the quantitative comparison of the concentrations of MAC3-7 in healthy controls, in Alzheimer's disease patients and in patients with non-Alzheimer's dementias
  • Figure 9 Box whisker plot for the quantitative comparison of the concentrations of MAC3-8 in healthy controls, in Alzheimer's disease patients and in patients with non-Alzheimer's dementias
  • Figure 10 Box-whisker plot for the quantitative comparison of the concentrations of MAC3-9 in healthy controls, in Alzheimer's disease patients and in patients with non-Alzheimer's dementias
  • Figure 1 Box whisker plot for quantitative comparison of the concentrations of MAC3-13 in healthy controls, in Alzheimer's disease patients and in patients with non-Alzheimer's dementias
  • Figure 1 shows a schematic representation of the complement C3 protein with the position of the identified MAC3 peptides, which are shown with each other in the form of an alignment.
  • the Masses actually identified in the mass spectrometer deviate from these theoretical, monoisotopic masses due to the natural isotope distribution and a low measurement inaccuracy.
  • the measurement inaccuracy is 500 ppm for peptides in the mass range from 1000 to 4000 Daltons, the error of the measurement gradually increasing for peptides with a mass which is greater than 4000 Daltons.
  • peptide MAC3-1 could be identified in the form of peptide variants with one and with two additional, covalently linked oxygen atoms, with about 16 daltons corresponding to the mass of the peptide for each oxygen atom.
  • the experimentally determined masses for MAC3-1 are: 2038 and 2054 daltons, the mass of MAC3-1 being increased sequentially by the mass of one oxygen atom.
  • Figure 2 shows the elution profile of a sample that was subjected to reverse phase chromatography according to Example 2, for the separation and enrichment of the MAC3 peptides from cerebrospinal fluid.
  • the position at which MAC3-1 peptides elute is marked by an arrow.
  • Figure 3 shows a spectrum, which was created by MALDI mass spectrometric measurement of MAC3-1 according to Example 3, after reverse phase chromatography of human cerebrospinal fluid according to Example 2.
  • MAC3-1 corresponds to the sequence of the C3f peptide, derived of Complement C3, and is marked by an arrow.
  • Figure 4 shows an MS / MS fragment spectrum according to Example 4 of the peptide MAC3-1 according to the invention.
  • Figure 4A shows the raw data of
  • Figure 4B shows the converted, deconvoluted mass spectrum of MAC3-1.
  • the peak pattern in Figure 4B is characteristic of MAC3-1.
  • MAC3-1 corresponds to the C3f peptide of the complement C3 protein (Seq. ID 1).
  • Figure 5 shows data generated by MALDI as a relatively quantifying MS method.
  • Each peptide shows an individual, typical ratio of signal strength to concentration, which can be read in this diagram using the slope of the curve.
  • Figure 6 shows box whisker plots for the peptide MAC3-1 in its 2-fold oxidized form (Fig. 6A and B), in its simply oxidized form (Fig. 6C and D), in its non-oxidized form (Fig. 6E and F) and as a double-charged ion (Fig. 6G and H).
  • the single-charged ion is analyzed in Figs. 6A to F.
  • Each MAC3-1 variant is compared between Alzheimer's disease patients and healthy controls (Fig. 6A, C, E and G) and between Alzheimer's disease patients and non-Alzheimer's patients (Fig. 6B, D, F and H) shown.
  • Figures 7 to 1 1 show in the form of box whisker plots a comparison of the integrated MALDI mass spectral signal intensities of MAC3- 2, MAC3-7, MAC3-8, MAC3-9 and MAC3-13 in healthy controls compared to disease -Alzheimer's patients (Fig. A) and non-Alzheimer's dementias, compared to Alzheimer's disease patients (Fig. B).
  • Example 1 Obtaining cerebrospinal fluid to determine MACS peptides.
  • CSF or cerebrospinal fluid cerebrospinal fluid
  • cerebrospinal fluid cerebrospinal fluid
  • Liquor cerebrospinalis is usually removed by lumbar puncture, more rarely by suboccipital puncture or ventricular puncture.
  • lumbar puncture spinal puncture
  • the spinal subarachnoid space between the 3rd and 4th or 4th and 5th lumbar spinous process is punctured with a long hollow needle and puncture is obtained.
  • the sample is then centrifuged for 10 minutes at 2000x g and the supernatant is stored at minus 70 ° C.
  • Example 2 Separation of peptides in cerebrospinal fluid (CSF) for mass spectrometric measurement of MAC3 peptides
  • MAC3 peptides For the mass spectrometric detection of MAC3 peptides in CSF, a separation of the peptide ingredients is necessary in this example. This sample pretreatment serves to enrich the peptides according to the invention and to separate components which can interfere with the measurement. Reverse phase chromatography is used as the separation process. Various RP chromatography resins and eluents are equally suitable. The separation of MAC3 peptides using a C18 reverse-phase chromatography column with the size 4 mm ⁇ 250 mm from Vydac is shown by way of example.
  • compositions were used: solvent A: 0.06% (v / v) trifluoroacetic acid, solvent B: 0.05% (v / v) trifluoroacetic acid, 80% (v / v) acetonitrile.
  • the chromatography was carried out at 33 ° C. using an HP ChemStation 1 100 from Agilent Technologies with a flow cell Micro from Agilent Technologies. Human cerebrospinal fluid was used as the sample. 440 ⁇ l of CSF were diluted to 1650 ⁇ l with water, the pH was adjusted to 2-3, the sample was centrifuged for 10 minutes at 18000 ⁇ g and finally 1500 ⁇ l of the sample prepared in this way were applied to the chromatography column.
  • the chromatography conditions were as follows: 5% solvent B at the time 0 min, from time 1 to 45 min continuous increase in the solvent B concentration to 50%, from Time 45 to 49 min continuous increase in mobile phase B concentration to 100% and then constant until time 53 min 100% buffer B. 10 minutes after the beginning of the chromatography, 96 fractions of 0.5 ml each are started.
  • the chromatogram of a cerebrospinal fluid sample, produced under the test conditions described here, is shown in Figure 2.
  • Example 3 Determination of the Masses of Peptides Using MALDI Mass Spectrometry
  • MALDI-TOF mass spectrometer matrix-assisted laser desorption ionization
  • Suitable MALDI-TOF mass spectrometers are manufactured by PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager-DE, Voyager-DE PRO or Voyager-DE STR) or by Bruker Daltonik GmbH (BIFLEX). To prepare the samples, they are mixed with a matrix substance, which typically consists of an organic acid.
  • Typical matrix substances which are suitable for peptides are 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid.
  • a dried equivalent obtained according to reverse phase chromatography corresponding to 400 ⁇ ⁇ human cerebrospinal fluid, is used.
  • the chromatographed sample is dissolved in 15 ⁇ ⁇ of a matrix solution.
  • This matrix solution contains, for example, 10 g / l of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid and 10 g / l of L (-) fucose dissolved in a solvent mixture consisting of acetonitrile, water, trifluoroacetic acid and acetone in a volume ratio of 49:49: 1: 1.
  • 0.3 ⁇ ⁇ of this solution are transferred to a MALDI carrier plate and the dried sample is analyzed in the MALDI mass spectrometer Voyager-DE STR from PerSeptive Biosystems. The measurement is carried out in "Linear Mode" with "Delayed Extraction TM".
  • Figure 3 shows the spectrum of MAC3-1 as an example of a measurement of one of the MAC3 peptides according to the invention.
  • the peak corresponding to the MAC3-1 peptide is marked by an arrow.
  • MALDI-TOF mass spectrometry can be used to quantify peptides such as, for example, the MAC3 peptides according to the invention, if these peptides are present in a concentration that is in the dynamic measuring range of the mass spectrometer, thereby avoiding detector saturation. This is the case for the measurement of the MAC3 peptides according to the invention in cerebrospinal fluid with a liquor equivalent concentration of 33.3 ⁇ per ⁇ matrix solution.
  • MAC3 peptides according to the invention To quantify the MAC3 peptides according to the invention, it must be ensured that the mass signals to be analyzed of peptides in the fractions, obtained by reverse phase chromatography of cerebrospinal fluid, according to Example 2, are actually the MAC3 peptides according to the invention.
  • the peptides according to the invention are identified in these fractions, for example using nanoSpray-MS / MS [14].
  • a MAC3 peptide ion is selected in the mass spectrometer on the basis of its specific m / z (mass / charge) value in a manner known to the person skilled in the art in the mass spectrometer.
  • This selected ion is then fragmented by supplying collision energy with a collision gas, for example argon or nitrogen, and the resulting MAC3 peptide fragments in the Mass spectrometer detected in an integrated analysis unit and corresponding m / z values determined (principle of tandem mass spectrometry) [15].
  • a collision gas for example argon or nitrogen
  • the fragmentation behavior of peptides given the mass accuracy of the devices used of 50 ppm, enables the MAC3 peptides according to the invention to be clearly identified using computer-assisted search methods [16] in sequence databases in which the sequence of the precursor molecule Complement C3 has been entered. Taking into account the positive shift of the molecular mass by approx.
  • oxidized peptides can also be identified with this method.
  • Other chemically or post-translationally modified peptides can also be identified accordingly.
  • the mass spectrometric analysis was carried out using a quadrupole TOF instrument, model "QStar-Pulsar” from Applied Biosystems-Sciex, USA. Exemplary MS / MS fragment spectra of MAC3-1 are shown in Figure 4.
  • a MALDI measurement of the MAC3 peptides according to the invention according to Example 3 was carried out after sample preparation according to Examples 1 and 2.
  • Exemplary MALDI signal intensities are visualized in the form of "box whisker plots" in Figures 6 to 1 1.
  • the "box whisker plots" shown enable comparison of the integrated MALDI mass spectrometric signal intensities of various MAC3 peptides in controls (healthy subjects, patients with non-Alzheimer's dementias) with the MALDI signal intensities in samples from Alzheimer's disease patients.
  • the solid line in the columns indicates the median and the dashed line in the columns indicates the mean.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft definierte Peptide und deren quantitative Bestimmung in Körperflüssigkeiten von Patienten, die an Morbus Alzheimer leiden, relativ zu deren Konzentration in einer Kontrollgruppe von Patienten, die gesund sind oder an anderen demenziellen Erkrankungen leiden. Die erfindungsgemäßen Peptide entstammen aus dem C3f-Fragment des Proteinvorläufers Complement C3 mit dem korrespondierenden Gen und sind in spezifischer Art und Weise prozessiert und ggf. posttranslational oder chemisch modifiziert. Sie sind in einer für jedes Peptid spezifischen Weise in ihren Konzentrationen in Patienten relativ zur Kontrollgruppe verändert. Eine spezifische und signifikante Veränderung der Konzentrationen dieser Peptide relativ zu ihrer Konzentration in gesunden Personen zeigt eine Erkrankungen durch Morbus Alzheimer an. Die Erfindung findet darüber hinaus Verwendung zur Verlaufskontrolle, sowie zur Entwicklung von Diagnostika und Therapeutika.

Description

Verfahren zum Nachweis von Morbus Alzheimer und zur Unterscheidung von Morbus Alzheimer gegenüber anderen demenziellen Erkrankungen, zugehörige Peptide und deren Verwendungen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Morbus Alzheimer, insbesondere ein Verfahren, das eine Unterscheidung von Morbus Alzheimer gegenüber anderen demenziellen Erkrankungen ermöglicht. Dazu wird die Konzentration bestimmter Peptide in Körperflüssigkeiten oder anderen Proben des Patienten ermittelt. Weiterhin betrifft die Erfindung Peptide, Antikörper, Nukleinsäuren usw. die zur Bestimmung des Vorhandenseins und/oder des Grades der Erkrankung aufgefunden wurden, sowie deren Verwendungen für die Diagnostik und Therapie.
Demenzielle Erkrankungen stellen aufgrund der demographischen Verschiebung hin zu einer immer höheren Lebenserwartung ein zunehmendes Problem dar, da sie mit erhöhtem Alter in zunehmenden Maße auftreten. Demenzielle Erkrankungen sind größtenteils nicht heilbar und machen eine langanhaltende Pflege der Erkrankten erforderlich.
Etwa die Hälfte dieser Patienten wird stationär gepflegt. Es sind mehr als 60 demenzielle Erkrankungen bekannt, einschließlich solcher Erkrankungen, die demenzielle Erscheinungen mit sich bringen. Morbus Alzheimer stellt die häufigste Erkrankung in der Gruppe der demenziellen Erkrankungen dar [1 ]. Die Diagnose und Therapie von Morbus Alzheimer hat deshalb einen besonders hohen Stellenwert. Morbus Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung, die sich durch folgende Symptome auszeichnet: Abnahme der geistigen Fähigkeiten, Kurzzeit- und Langzeitgedächtnisstörungen, Konfusion und herabgesetzte Selbsterhaltungs- und Selbstbetreuungsfähigkeit. Die Verschlechterung der geistigen Leistungsfähigkeit tritt zusätzlich zur altersbedingten Verschlechterung der geistigen Fähigkeiten auf [1 ]. Die Diagnose der Morbus-Alzheimer-Erkrankungist deshalb schwierig, da sie, ebenso wie andere demenzielle Erkrankungen, schleichend einsetzt und mit langsam fortschreitender Zerstörung von Nervenzellen im Gehirn und damit einhergehender verminderter mentaler Leistungsfähigkeit verbunden ist. Verschiedene andere demenzielle Erkrankungen, wie z.B. vaskuläre Demenz, weisen sehr ähnliche Symptome auf, was eine diagnostische Unterscheidung von Morbus Alzheimer und anderen demenziellen Erkrankungen sehr erschwert.
Eine verbreitete Methode zur Erkennung demezieller Erkrankungen ist die Bestimmung des „MMSE Score" („Mini-Mental Status Examination", MMSE) [2]. Dieser Test ermöglicht jedoch nicht eine sichere Unterscheidung verschiedener demenzieller Erkrankungen. Als klinisch messbare Laborparameter kann die Bestimmung der Konzentration des Proteins Tau und der 42 Aminosäuren großen Isoform des beta-Amyloids herangezogen werden, wobei im Liquor cerebrospinalis von Morbus-Alzheimer-Patienten Tau erhöht und beta- Amyloid vermindert ist. Zwar weisen beide Marker eine hohe Sensitivität, jedoch nur eine geringe Spezifität auf. Dieses schränkt ihren diagnostischen Wert sehr stark ein, so dass man sagen kann, dass derzeit kein diagnostischer Marker zur sicheren Diagnose von Morbus Alzheimer zur Verfügung steht [3],
Da bisher weder eine sichere Diagnose von Morbus Alzheimer, noch eine wirkungsvolle Therapie möglich ist, stellt die Bereitstellung eines verlässlichen, klinisch messbaren Parameters zum Nachweis von Morbus Alzheimer und zur Unterscheidung dieser neurodegenerativen Erkrankung von anderen demenziellen Erkrankungen einen wichtigen medizinischen Fortschritt dar. Die vorliegende Erfindung hat außerdem zur Entwicklung von Therapien zur Behandlung von Morbus Alzheimer eine große Bedeutung, da die Entwicklung von Therapien eine sichere Diagnose der zu behandelnden Erkrankung voraussetzt. Dieses ist insbesondere dann von Bedeutung, wenn verschiedene Erkrankungen mit ähnlichen Symptomen existieren, diese Erkrankungen aber vermutlich verschiedene Ursachen haben und daher unterschiedliche Therapien erfordern. Morbus Alzheimer ist bisher nicht sicher von anderen demenziellen Erkrankungen zu unterscheiden [3].
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile bei der Alzheimer- Diagnose im Stand der Technik zu vermeiden und ein frühzeitig und zuverlässig anwendbares Verfahren zum Nachweis und zur Unterscheidung von Morbus Alzheimer von anderen demenziellen Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass nur in Körperflüssigkeitsproben von an Morbus Alzheimer leidenden Patienten, insbesondere in Liquor cerebrospinalis, die Konzentration bestimmter Peptide von einem Referenzwert abweicht und einen Nachweis von Morbus Alzheimer sowie eine Unterscheidung von Morbus-Alzheimer-Patienten von Patienten mit anderen demenziellen Erkrankungen und gesunden Personen ermöglicht. Veränderungen der Konzentration dieser Peptide relativ zum Referenzwert, der beispielsweise anhand von Kontrollproben ermittelt werden kann, zeigen das Vorliegen einer Morbus-Alzheimer-Erkrankung an und sind daher zum selektiven Nachweis dieser Krankheit bei hoher Sensitivität und Spezifität geeignet.
Bei den Peptiden handelt es sich um Fragmente des Vorläufermoleküls Complement C3, insbesondere um ein 17 Aminosäuren langes, definiertes Peptid, abstammend von Complement C3, das als C3f bezeichnet wird [4]. Außerdem konnte ein weiteres C3f-Peptid, bei dem die C-terminale Aminosäure Arginin abgespalten ist (C3f-des-Arg), in Liquor cerebrospinalis von Morbus- Alzheimer-Patienten in Konzentrationen nachgewiesen werden, die von den Konzentrationen des jeweiligen Peptids in nicht-Alzheimer-dementen oder gesunden Personen abweicht.
Weitere neuartige, bisher nicht bekannte Varianten des C3f-Peptids konnten von uns in humanem Hämofiltrat und Plasma nachgewiesen und identifiziert werden und können daher auch zu diagnostischen Zwecken bei Morbus- Alzheimer-Patienten herangezogen werden.
In der Literatur tritt nicht nur die Bezeichnung C3f, sondern auch die Bezeichnung C3F auf, wobei C3F nicht identisch mit C3f ist. C3F steht vielmehr für „C3-fast", ein Complement C3-Polymorphismus, der bewirkt, dass das komplette Vorläufermolekül dieser C3-Variante sich im elektrischen Feld der Gelelektrophorese schneller voran bewegt.
Nachfolgend werden das C3f-Peptid und die aus ihnen abgeleiteten C3f-Peptid- Varianten als "Morbus-Alzheimer-Complement C3-Peptide" (MAC3-Peptide) bezeichnet. Die Sequenz von C3f ist identisch mit der Sequenz zu Seq. ID 1 aus dem Sequenzprotokoll, sowie mit der Sequenz von MAC3-1. MAC3-Peptide beinhalten mindestens 8 und höchstens 17 Aminosäuren, die identisch mit den Aminosäuren an den entsprechenden Sequenzpositionen in der Sequenz von C3f, entsprechend Seq. ID 1 , sind. Außerdem können MAC3-Peptide zwei punktmutierte, zwei deletierte oder zwei zusätzlich intern eingefügte Aminosäuren, sowie N-terminale und/oder C-terminale Verlängerungen entsprechend Seq. ID 1 beinhalten. Dabei müssen sie jedoch mindestens 8 Aminosäuren aus der Sequenz aus Seq. ID 1 an den entsprechenden Sequenzpositionen beibehalten. Außerdem werden auch C3f-Peptide und C3f- Peptidfragmente als MAC3-Peptide bezeichnet, die sich aus natürlich vorkommenden Complement C3-Polymorphismen und aus natürlich vorkommenden C3-Mutanten ableiten.
Zur Lösung der Aufgabe umfasst die Erfindung bei einem Verfahren zum Nachweis von Morbus Alzheimer unter Bestimmung der Konzentration wenigstens eines Markerpeptids in einer biologischen Probe eines Patienten, dass als Markerpeptid wenigstens ein MAC3-Peptid verwendet wird, eine für das jeweilige Markerpeptid spezifische Konzentrationserhöhung oder Konzentrationsverminderung des Markerpeptids in der Probe festgestellt wird und eine Konzentrationsänderung des Markerpeptids in der vorgenannten Weise als positives Nachweisergebnis für eine Morbus-Alzheimer-Erkrankung gewertet wird.
Dabei kann für jedes MAC3-Peptid grundsätzlich entweder nur ein Anstieg der Peptidkonzentration bei Morbus-Alzheimer-Patienten auftreten, oder es kann für ein MAC3-Peptid grundsätzlich nur eine Verminderung der Peptidkonzentration bei Morbus-Alzheimer-Patienten auftreten. Für ein definiertes MAC3-Peptid kann nicht gleichzeitig bei einem individuellen Morbus-Alzheimer-Patienten eine erhöhte und bei einem andren Morbus-Alzheimer-Patienten eine verminderte MAC3-Peptidkonzentration auftreten. Wie bei nahezu allen medizinischen Diagnosen von Erkrankungen, ist es jedoch möglich, dass in wenigen Einzelfällen eine falsche Diagnose erfolgt, da sich die Konzentration der MAC3- Peptide nicht bei jedem individuellen Morbus-Alzheimer-Patienten mit hundertprozentiger Wahrscheinlichkeit von der Konzentration der MAC3-Peptide bei Kontrollproben unterscheidet.
Im Sinne dieser Erfindung werden Peptide, die als Fragmente der Complement C3f-Sequenz aufgefasst werden können oder das C3f-Peptid selbst als MAC3- Peptide bezeichnet. Sie umfassen vom Complement C3f-Fragment abgeleitete homologe Peptide und Peptidfragmente. Sie umfassen Abkömmlinge natürlich vorkommender Allele dieser Peptide und homologe Mutanten, insbesondere punktmutierte Mutanten mit vorzugsweise nicht mehr als zwei von Complement C3 abweichenden Aminosäuren. Bevorzugte Marker nach der Erfindung sind im Sequenzprotokoll angegeben und sind nummeriert mit MAC3-1 bis MAC3-16, entsprechend Seq. ID 1 bis 16, wobei MAC3-1 der Seq. ID 1 , MAC3-2 der Seq. ID 2, MAC3-3 der Seq. ID 3, usw. entsprechen.
Wird in der vorliegenden Anmeldung von homologen Sequenzen gesprochen, so sind damit Sequezen gemeint, die mindestens eine 70-prozentige Homologie aufweisen. Zur Bestimmung der Homologie zwischen Sequenzen können Computerprogramme wie z.B. das GCG Programmpaket (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, USA), einschließlich GAP [5], BLASTP, BLASTN, FASTA [6] oder der bekannte Smith Waterman-Algorithmus zur Bestimmung der Homologien verwendet werden. Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen den Algorithmus von Needleman und Wunsch [7], die Vergleichsmatrix BLOSUM 62 [8], ein Lücken-Wert (Gap Penalty) von 12, ein Lückenlängen-Wert (Gap Length Penalty) von 4 und ein Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity) von 0. Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default Parameters) für Aminosäuresequenz- Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie- Wert nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenz- Sequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu 100 000 (expectation value) zu erhöhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern. Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken- Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm- Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten, können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder der Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird. Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von z.B. 70 % wird als 70 % Homologie bezeichnet. In der vorliegenden Anmeldung versteht man unter homologen Sequenzen grundsätzlich alle Sequenzen, die mindestens eine 70-prozentige Übereinstimmung aufweisen, wobei die Übereinstimmung entsprechend der vorgenannten Beschreibung berechnet wird. Dieses bezieht sich sowohl auf Aminosäure- als auch auf Nukleinsäuresequenzen.
Die Markerpeptide können in posttranslationalen Modifikationen und/oder in enzymatisch und/oder chemisch modifizierter Form vorliegen, vorzugsweise als Peptid-Oxide, und in dieser Form nachgewiesen werden. Ein chemisch oder posttranslational modifiziertes Complement C3-Peptid oder MAC3-Peptid kann sowohl aus D- als auch aus L-Aminosäuren, sowie aus Kombinationen von D- und L-Aminosäuren bestehen und kann sowohl natürlich vorkommen, rekombinant oder enzymatisch hergestellt oder chemisch synthetisiert werden. Außerdem können in diesen Peptiden ungewöhnliche Aminosäuren, d.h. Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standardaminosäuren gehören, enthalten sein. Zahlreiche Beispiele für ungewöhnliche Aminosäuren und postraslationale Modifikationen wie z.B. Phosphor- und Sulfatgruppen, Glykosilierungen, Amidierungen, Deamidierungen, Pyroglutaminsäure usw. sind in der Literatur und in Datenbanken beschrieben [9].
Außerdem können im Sinne der Erfindung einzelne oder mehrere Aminosäuren oder das gesamte Peptid durch Strukturen, bestehend aus Peptidomimetics, ersetzt werden. Der Begriff Peptidomimetics wird in der vorliegenden Anmeldung in Form der am weitesten möglichen Definition verwendet. Ein Peptidomimetikum ist eine Substanz, die nicht-peptidische Strukturelemente enthält und in der Lage ist, die biologische Wirkung des natürlichen Muttermoleküls zu imitieren oder zu antagonisieren. Im Stand der Technik sind zahlreiche Arbeiten bekannt, die ausführlich auf Möglichkeiten der Nutzung von Peptidomimetics als Ersatz für herkömmliche Peptidstrukturen eingehen.
Als Nukleinsäuren werden DNA, RNA und DNA-RNA-Hybridmoleküle sowohl natürlichen Ursprungs, als auch synthetisch, enzymatisch oder rekombinant hergestellt angesehen. Ferner eingeschlossen sind Nukleinsäuren, die modifizierte Nukleotide mit veränderter In-vivo-Stabilität, wie z.B. Phosphorthioaten, enthalten. Solche stabilisierten Nukleinsäuren finden bereits bei der Anwendung von Ribozym-, Antisense- RNAi- ("RNA-mediated interference") und Triplexnukleinsäure-Techniken Verwendung. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren, bei welchem spezifische Biomarker erfasst werden, die bei neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere bei Morbus Alzheimer, in ihrer Konzentration verändert sind und die die Krankheit auch bereits in einem sehr frühen Stadium und eine erhöhte Wahrscheinlichkeit für ein Erkrankungsrisiko frühzeitig anzeigen. Dies ist wichtig, um einen verlässlichen klinischen Marker zur Diagnose dieser Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.
Vorzugsweise kann die Konzentration der MAC3-Peptide in der Probe, aber auch das charakteristische Muster des Auftretens mehrerer bestimmter MAC3-
Peptide, mit dem Schweregrad der Krankheit korreliert werden. Diese neuen
Marker ermöglichen daher die Entwicklung und die begleitende Kontrolle von
Therapien zur Behandlung von Morbus Alzheimer, da der Verlauf und ein eventuell aufgrund einer Therapie einsetzender Heilungserfolg oder ein vermindertes Fortschreiten der Erkrankung ermittelt werden können. Eine effektive Therapie von Morbus Alzheimer ist derzeit nicht möglich, was die
Dringlichkeit der Bereitstellung einer sicheren Nachweismethode für eine
Morbus-Alzheimer-Erkrankung Morbus-Alzheimer-Erkrankung unterstreicht, da ein sicherer Nachweis der Erkrankung eine Vorraussetzung zur Entwicklung einer Therapie ist.
Der Nachweis von MAC3-Peptiden ermöglicht es außerdem, im Rahmen von klinischen Studien zur Entwicklung von neuen Therapien zur Behandlung von Morbus Alzheimer mit hoher Spezifität nur solche Patienten auszuwählen, die an Morbus-Alzheimer-Erkrankt sind und nicht an anderen, ähnlichen Erkrankungen. Dieses ist wichtig, um aussagekräftige Studienergebnisse zu erhalten, da fälschlicherweise als Morbus-Alzheimer-Patienten diagnostizierte Patienten die Qualität der Ergebnisse einer Morbus Alzheimer Therapie-Studie negativ beeinflussen. Complement C3 Biologie
Das Complementsystem spielt eine zentrale Rolle bei der spezifischen und der unspezifischen Immunabwehr und besteht aus mehr als 30 Proteinen, von denen einige Proteasen, andere wiederum Substrate dieser Proteasen sind. Die Funktionsweise des Complementsystems beruht auf einer Art Kettenreaktion, an deren Anfang eine Substanz, z.B. eine bakterielle Zellmembran, eine Komponente des Complementsystems aktiviert, dieser Complementfaktor aktiviert wiederum den nächsten Complementfaktor usw. Die Complementaktivierung kann auch zur Lyse von gesunden, wirtseigenen Zellen, die sich zufällig in der Nähe der Complementaktivierungs-Stelle befinden, führen. Diesen Vorgang nennt man auch „bystander"-Effekt, und er kann weitreichende Gewebezerstörungen zur Folge haben. Einige Peptide, die im Verlauf der Complementkaskade durch proteolytische Spaltung einzelner Complementproteine freigesetzt werden, insbesondere die Anaphylatoxine C3a und C5a stimulieren auf vielfältige Weise Immunzellen und führen so zu einer lokalen Entzündungsreaktion [10]. Das Anaphylatoxin C3a hat z.B. zytotoxische, blutgefäßerweiternde und zellstimulatorische Eigenschaften. Neben dem Anaphylatoxin C3a sind eine Reihe weiterer Complement C3- Spaltprodukte, wie z.B. C3b, C3c, C3d, C3g, C3e und C3f bekannt (Abb. 1 ). Von diesen C3-Peptiden ist für einige, nicht jedoch für alle, eine biologische Funktion bekannt.
Von C3b wird durch den Faktor I zunächst ein kleines Peptid von 17 Aminosäuren Länge, C3f, und anschließend mehrere andere, definierte C3 Peptide, u.a. C3dg abgespalten. C3dg wird dann weiter in C3d und C3g gespalten. Auf diese Weise wird C3b inaktiviert [1 1 ]. Das C3d-Peptid ist das C3-Peptid, in dem beim intakten C3-Molekül die Thiolestergruppe vorhanden ist und das daher kovalent mit complementaktivierenden Stoffen verknüpft vorkommt. Wissenschaftliche Untersuchungen zeigen, dass C3f z.T. ähnliche biologische Effekte wie C3a vermittelt. C3f und C3a führen zur Kontraktion glatter Muskulatur und erhöhen die vaskuläre Permeabilität [1 1 ]. Außerdem ist bei C3a und bei C3f die C-terminale Aminosäure ein Arginin, und die Abspaltung dieser Aminosäure verändert die biologische Aktivität sowohl von C3a, als auch von C3f. Die resultierenden Produkte werden C3a-des-Arg bzw. C3f-des-Arg genannt. Vermutlich verwenden C3f und C3a, zumindest teilweise, die gleichen Rezeptoren, was ihre ähnlichen biologischen Wirkungen erklären könnte [1 1 ].
C3 wird vorwiegend von der Leber, aber auch lokal von monozytären Zellen und Makrophagen synthetisiert. Im Verlauf von bakteriellen Meningitiden, d.h. bei bakteriellen Infektionen im Gehirn, treten ca. 20-fach erhöhte C3- Konzentrationen im Liquor cerebrospinalis auf. Bei Morbus Alzheimer steigt die C3-Konzentration im Liquor ebenfalls an, jedoch nur um den Faktor zwei, während bei anderen entzündlichen Reaktionen im Gehirn, wie z.B. einer aseptischen Meningitis die C3-Konzentration im Liquor cerebrospinalis unverändert bleibt [12]. Complementproteine und ihre Rezeptoren werden unter anderem auch von Mikroglia, Astrozyten und von Neuronen synthetisiert. Die Menge an mRNA und Protein der Complementproteine C1 bis C9 ist im Gehirn von Morbus-Alzheimer-Patienten relativ zum Gehirn gesunder Personen erhöht. Die Konzentration von C3 und C4 ist mit 2-facher Erhöhung im Gehirn und unveränderten Konzentrationen in der Leber, relativ zu gesunden Personen, am geringsten verändert. Verschiedene andere Complementproteine sind, relativ zu gesunden Personen, im Gehirn von Morbus-Alzheimer-Patienten erheblich stärker erhöht: C1 q mRNA ist 23-fach erhöht, C1 r 5-fach, C7 6-fach und C9 ist 22-fach erhöht [12]. Daher ist es überraschend und unerwartet, dass Fragmente vom Complement C3 Protein und nicht Fragmente von anderen Complement Proteinen als Marker für Morbus Alzheimer geeignet sind.
Ablagerungen, die in Form von „Plaques" und „Tangles" im Gehirn von Morbus- Alzheimer-Patienten vorhanden sind, bestehen vornehmlich aus beta-Amyloid und Tau-Protein. Neben diesen Hauptkomponenten ist jedoch eine große Anzahl an weiteren Proteinen immunhistologisch in diesen Ablagerungen identifiziert worden. Zu diesen Proteinen gehören unter anderem 1 -Anti-Chymotrypsin, Synaptophysin, Cystatin C, Heme-Oxigenase, verschiedene Apolipoproteine wie Apo E4, Apo J und Apo A1 , IL-6, das AMY-Antigen, Prion-Protein, beta- Spektrin, alpha-2-Makroglobulin, Lactoferrin und verschiedene
Complementproteine wie C1 q, C3 und C4d. Zusätzlich zu Proteinen enthalten dieseAblagerungen auch Zuckerstrukturen, wie z.B. Heparansulfat. Diese Ablagerungen stellen somit komplexe Strukturen aus Proteinen und anderen Substanzen dar. Bereits 1982 haben Eikelenboom et al. entdeckt, dass Ablagerungen im Gehirn von Morbus-Alzheimer-Patienten unter anderem Complement C3 enthalten und dass beta-Amyloid die Complementkaskade vermutlich aktiviert, was in nachfolgenden Arbeiten experimentell gezeigt werden konnte [13].
Vorzugsweise Ausführungsformen der Erfindung
Wir haben in verschiedenen Körperflüssigkeiten, wie z.B. Hämofiltrat, Plasma oder Liquor cerebrospinalis das Complement C3-Peptid C3f sowie verschiedene Teilsequenzen von C3f nachgewiesen. Die Peptide MAC3-3 bis MAC3-16 stellen C3f-Peptidfragmente dar, die in der Literatur bisher nie beschrieben wurden und daher als Stoffe neu sind. MAC3-1 und MAC3-2 sind aus der Literatur bereits bekannt [4, 1 1 ]. Jedoch ist bisher keines der Peptide MAC3-1 bis MAC3-16 im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen diskutiert worden und folglich ist ihre Verwendung als diagnostische Marker zum Nachweis von Morbus Alzheimer neuartig. Dieses ist insbesondere daher der Fall, da bekannt ist, dass das Vorläufermolekül Complement C3 in zahlreiche bekannte und genau definierte Peptide prozessiert wird und es daher unerwartet und nicht vom Fachmann vorhersehbar war, dass vom Vorläufermolekül Complement C3 einzig das C3f-Peptid und bisher unbekannte C3f-Peptidfragmente zur Diagnose von Morbus Alzheimer herangezogen werden können, während keine anderen Complement C3 Peptide als geeignete Marker identifiziert wurden.
* r1 - steht entweder für die Aminosäure Serin oder an dieser Sequenzposition befindet sich keine Aminosäure, r2- stellt eine Sequenz, die der Sequenz oder Teilen der Sequenz von Complement C3 von Aminosäure 1313 bis 1320 entspricht dar, wobei r2, ausgehend von Aminosäure 1312 des C3-Vorläufers, zwischen 0 und 8 Aminosäuren lang sein kann. Entsprechend stellt r3- die C3- Vorläufersequenz von Aminosäure 1304 bis 131 1 oder Teile davon dar, wobei r3, ausgehend von der C3-Aminosäure 1312 zwischen 0 und 8 Aminosäuren lang sein kann. r4 entspricht der Aminosäure Arginin oder alternativ befindet sich an dieser Position der Peptidsequenz keine weitere Aminosäure.
Die erfindungsgemäßen MAC3-Peptide können in posttranslationalen oder chemischen Modifikationsformen vorliegen, was sich u.a. auf ihre Massen und damit die massenspektrometrische Identifizierung und auch auf ihr Elutionsverhalten bei der Chromatographie, wie z.B. bei Reverse-Phase- Chromatographie auswirkt. Insbesondere können die Peptide oxidiert, phosphoryliert, glykosiliert, sulfatiert, amidiert usw. in der zu untersuchenden Probe vorliegen. Natürlich vorkommende, von Complement C3-Polymorphismen oder C3-Mutanten abgeleitete C3f-Peptide und C3f-Peptidfragmente werden ebenfalls als MAC3-Peptide bezeichnet. Zur Bestimmung, dass mindestens 8 Aminosäuren mit der C3f-Sequenz (Seq. ID 1 ) übereinstimmen, werden die gleichen Computerprogramme und Algorithmen verwendet, die auch zur Bestimmung der Homologie von Sequenzen herangezogen werden [5-8].
Die Peptide werden insbesondere auch dann als MAC3-Peptide angesehen, wenn maximal 2 ihrer Aminosäuren von der entsprechenden Sequenz des C3- Vorläufermoleküls abweichen. Dabei sind Punktmutationen, Deletionen, Einfügungen von Aminosäuren und N-terminale und/oder C-terminale Verlängerungen zulässig, solange die Peptidsequenz zwischen 8 und 17 Aminosäuren lang ist, mindestens 8 Aminosäuren relativ zur C3- Vorläufersequenz konserviert sind, und maximal 2 Aminosäuren von der C3f- Sequenz abweichen.
Für einen positiven Nachweis der Erkrankung ist vorgesehen, dass die Konzentration des oder der identifizierten MAC3-Peptide für jedes einzelne dieser Peptide in definierter, für das jeweilige Peptid entweder immer spezifisch höherer oder immer spezifisch niedrigerer Konzentration verändert ist. Die Konzentrationen der jeweiligen Peptide können zur Bestimmung des Schweregrades der Morbus-Alzheimer-Erkrankung herangezogen werden, insbesondere als Ersatz oder als Ergänzung zur Durchführung einer "Mini-Mental Status Examination" (MMSE).
Bei eventuell verwendeten Kontrollproben kann es sich um eine Poolprobe aus verschiedenen Kontrollen handeln. Auch die zu untersuchende Morbus- Alzheimer-Probe kann eine Poolprobe sein, wobei bei positivem Ergebnis Einzeluntersuchungen angestellt werden. Aus den Ergebnissen der Bestimmung von individuellen MAC3-Peptiden in Kontrollproben kann ein Referenzwert für das jeweilige individuelle MAC3-Peptid bestimmt werden. Bei zukünftigen Messungen zur Unterscheidung von an Morbus-Alzheimer-Erkrankten und von nicht an Morbus-Alzheimer-Erkrankten Patienten kann dann der bestimmte Messwert mit diesem Referenzwert verglichen werden, um zu einer Diagnose zu kommen.
Die Körperflüssigkeitsprobe kann vorzugsweise (humaner) Liquor cerebrospinalis (Cerebrospinalflüssigkeit, CSF) sein oder eine Probe eines anderen biologischen Materials wie z.B. Serum, Plasma, Urin, Stuhl, Tränenflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, usw. Dies hängt u.a. von der Empfindlichkeit des gewählten Nachweisverfahrens (Massenspektrometrie, ELISA etc.) ab. Auch Zeil- oder Gewebeproben können gegebenenfalls verwendet werden. Daher ist in einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung vorgesehen, das zur Vorbereitung der zu untersuchenden Probe Zelloder Gewebehomogenate hergestellt werden, z.B. aus menschlichen Gewebeproben, die im Rahmen von Biopsien erhalten wurden oder aus Blutzellen. Diese Gewebe können z.B. mit manuellen Homogenisatoren, mit Ultraschall-Homogenisatoren oder mit elektrisch betriebenen Homogenisatoren wie z.B. Ultraturrax zerkleinert werden, und anschließend in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise in sauren, wässrigen Lösungen mit z.B. 0, 1 bis 0,2 M Essigsäure für 10 Minuten gekocht werden. Anschließend werden die Extrakte dem jeweiligen Nachweisverfahren, z.B. einer massenspektrometrischen Untersuchung, unterzogen. Die Proben können in der üblichen Weise vorbereitet, z.B. ggf. verdünnt oder aufkonzentriert, und gelagert werden.
Verwendung der MAC3-Peptide Weiterhin umfasst die Erfindung die Verwendung wenigstens eines der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide zur Diagnose von neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, sowie die Verwendung von MAC3-Peptiden zur Gewinnung von Antikörpern oder von anderen Agenzien, welche aufgrund ihrer MAC3-Peptid-spezifischen Bindungseigenschaften zur Entwicklung von Diagnosereagenzien zum Nachweis dieser Erkrankung geeignet sind. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von MAC3-Peptiden zur Gewinnung von Phagenpartikeln, die spezifisch diese Peptide binden, oder die umgekehrt MAC3-Peptide auf ihre Oberfläche präsentieren und so die Identifizierung von Bindungspartnern von MAC3-Peptiden ermöglichen.
Nachweismethoden für MAC3-Peptide
Im Rahmen der Erfindung können verschiedene Methoden zum Nachweis der MAC3-Peptide verwendet werden. Dazu sind alle Methoden geeignet, die es ermöglichen, MAC3-Peptide spezifisch in einer Probe eines Patienten nachzuweisen. Geeignete Methoden sind unter anderem physikalische Methoden wie z.B. Massenspektrometrie oder Flüssigkeitschromatographie, molekularbiologische Methoden wie z.B. Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) oder immunologische Nachweistechniken, wie z.B. „Enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA).
Physikalische Nachweismethoden
Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung physikalischer Methoden, welche die erfindungsgemäßen Peptide qualitativ oder quantitativ anzeigen können. Zu diesen Methoden gehören unter anderem Massenspektrometrie, Flüssigkeitschromatographie,
Dünnschichtchromatographie und NMR (Nuclear-Magnetic-Resonance) Spektro etrie usw. Dazu werden quantitative Messergebnisse aus einer zu untersuchenden Probe, die bei einem Kollektiv an neurodegenerativen Erkrankungen, vorzugsweise Morbus Alzheimer, leidenden Patienten gewonnen wurden, herangezogen. Aus diesen Ergebnissen kann die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens einer Erkrankung und/oder der Schweregrad dieser Erkrankung abgeleitet werden.
Gemäß bevorzugter Ausführungsform dieser Erfindung werden die Peptide in der Probe vor der Identifizierung chromatographisch getrennt, und zwar vorzugsweise mit Reverse-Phase-Chromatographie, besonders bevorzugt ist eine Trennung der Peptide in der Probe mit hochauflösender Reverse-Phase- High-Performance-Flüssigkeitschromatografie (RP-HPLC). Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die Durchführung von Fällungsreaktionen zur Fraktionierung der Probe unter Verwendung von Fällungsmitteln wie z.B. Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol, Trichloressigsäure, Aceton, Ethanol usw. Die so gewonnenen Fraktionen werden dann dem jeweiligen Nachweisverfahren unterzogen, z.B. der massenspektrometrischen Untersuchung. Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird die Flüssigkeitsphasenextraktion verwendet. Dazu wird die Probe z.B. mit einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel wie etwa Polyethylenglykol (PEG) und einer wässrigen Salzlösung gemischt. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften reichern sich dann bestimmte Inhaltsstoffe der Probe in der organischen und andere in der wässrigen Phase an und können so voneinander getrennt werden.
Reverse-Phase-Chromatographie
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Verwendung von Reverse-Phase-Chromatographie, insbesondere einer C18 Reverse-Phase-Chromatographiesäule unter Verwendung von Laufmitteln bestehend aus Trifluoressigsäure und Acetonitril, zur Trennung von Peptiden in humaner Liquorflüssigkeit. Es werden z.B. jeweils Fraktionen gesammelt, die je 1 /100 des verwendeten Volumens an Laufmittel beinhalten. Die so gewonnenen Fraktionen werden mit Hilfe eines Massenspektrometers, vorzugsweise mit Hilfe eines MALDI-(„Matrix-assisted-laser-desorption-and- ionisation") -Massenspektrometers unter Verwendung einer Matrixlösung, bestehend aus z.B. aus L(-) Fucose und alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, gelöst in einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Aceton, analysiert und so das Vorliegen bestimmter Massen festgestellt und die Signalintensität quantifiziert. Diese Massen entsprechen den Massen der erfindungsgemäßen Peptide MAC3-1 bis MAC3-16.
Massenspektrometrie
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Identifizierung der MAC3-Peptide mit Hilfe einer massenspektrometrischen Bestimmung, vorzugsweise einer MALDI-Massenspektrometrie, vorgenommen werden. Dabei umfasst die massenspektrometrische Bestimmung weiter vorzugsweise wenigstens eines der folgenden Massensignale, jeweils berechnet anhand der theoretischen, monoisotopischen Masse des entsprechenden Peptids. Dabei können leichte Abweichungen von der theoretischen, monoisotopischen Masse aufgrund des experimentellen Fehlers und der natürlichen Isotopenverteilung auftreten. Außerdem wird bei MALDI- Massenbestimmungen aufgrund der Messmethodik den Peptiden ein Proton hinzugefügt, wodurch sich die Masse um 1 Dalton erhöht. Folgende Massen entsprechen den theoretischen, monoisotopischen Massen der von uns identifizierten Peptide; berechnet mit geeigneter Software, hier GPMAW 4.02. Diese theoretischen, monoisotopischen Massen können einzeln oder in Kombinationen in einer Probe auftreten: MAC3-1 = 2020, 1 / MAC3-2 = 1863,9 / MAC3-3 = 1637,8 / MAC3-4 = 1479,7 / MAC3-5 = 1263,6 / MAC3-6 = 1077,6 / MAC3-7 = 1933,0 / MAC3-8 = 1776,9 / MAC3-9 = 1846,0 / MAC3-10 = 1689,9 / MAC3-1 1 = 1717,9 / MAC3-12 = 1561 ,8 / MAC3-13 = 1448,7/ MAC3-14 = 1210,6 / MAC3-15 > 990,5 und MAC3-16 941 ,4 Dalton. Zusätzlich können die experimentell bestimmten Massen 2038 und/oder 2054 auftreten. Bei diesen beiden experimentell bestimmten Massen handelt es sich um MAC3-1 als einfach, bzw. zweifach oxidiertes Peptid. Das Symbol > (ist größer oder gleich) ist so zu verstehen, dass nicht beliebig größere Massen für die betroffenen MAC3-Peptide möglich sind, sondern lediglich die Massen, die sich aufgrund der möglicherweise zusätzlich an den Enden dieser Peptide befindlichen Aminosäuren ergeben können. Das Peptid kann insgesamt maximal 17 Aminosäuren lang sein. An den Enden dieser Peptide können nicht beliebige Aminosäuren zusätzlich vorhanden sein, sondern nur solche, die sich aufgrund der Sequenz des Complement C3 Vorläufermoleküls an dieser Sequenzposition befinden können.
Massenspektrometrische Bestimmung der Seguenz der MAC3-Peptide
Bei der weiteren praktischen Anwendung dieser Ausführungsform ist eine weitere Absicherung des Nachweisergebnisses dadurch möglich und empfehlenswert, dass die Identität der den Massen entsprechenden Peptide ermittelt wird, wobei ausschließlich Peptidsignale berücksichtigt werden, die von dem Complement C3f-Peptid abgeleitet werden können. Diese Absicherung erfolgt über eine Identifizierung der Peptidsignale vorzugsweise mit massenspektrometrischen Verfahren, z.B. einer MS/MS-Analyse [14].
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wurden erstmals spezifische Peptidfragmente des Complement C3f-Peptids, sowie das C3f-Peptid selbst (entsprechend MAC3-1 ) identifiziert und in ihrer Bedeutung erkannt. Diese C3f- Peptide und ihre Abkömmlinge werden hier mit MAC3-1 bis MAC3-16 bezeichnet. Ihre Sequenzen sind im Sequenzprotokoll unter Seq. ID 1 bis Seq. ID 16 angegeben. Die unter Seq. ID 15 und 16 genannten MAC3-Peptide (MAC3-15 und MAC3-16) können am N- und/oder C-Terminus zusätzliche Aminosäuren entsprechend der korrespondierenden Sequenz des Complement C3f-Peptids (Seq. ID 1 , MAC3-1 ) beinhalten. Die Erfindung umfasst auch die rekombinant oder synthetisch hergestellten, sowie aus biologischen Proben isolierten MAC3-Peptide in unmodifizierter, chemisch modifizierter oder posttranslational modifizierter Form. Dabei sind zwei Punktmutationen sowie andere Abweichungen möglich, solange das MAC3-Peptid mindestens 8 Aminosäuren aufweist, die in ihrer Identität und ihrer Position innerhalb der Peptidsequenz mit dem Complement C3f-Peptid übereinstimmen.
Molekularbiologische Nachweistechniken
Schließlich umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuren, die mit Complement C3- Fragmenten korrespondieren, und insbesondere solche, die mit den erfindungsgemäßen MAC3-Peptiden korrespondieren, und deren Verwendung zur indirekten Bestimmung und Quantifizierung der zugehörigen Proteinmoleküle. Darin eingeschlossen sind auch Nukleinsäuren, die z.B. nicht codierende Sequenzen, wie etwa 5'- oder 3'-untranslatierte Bereiche der mRNA darstellen, oder Nukleinsäuren, die eine für spezifische Hybridisierungsexperimente ausreichende Sequenzübereinstimmung mit der Nukleinsäuresequenz von Complement C3 aufweisen, und die daher zum indirekten Nachweis der zugehörigen Peptide, insbesondere der MAC3-Peptide geeignet sind.
Ein Ausführungsbeispiel hierfür umfasst die Gewinnung von Gewebeproben von Patienten und die nachfolgende Bestimmung der Konzentration eines RNA-
Transkriptes korrespondierend zum Gen von Complement C3 oder korrespondierend zu homologen Genen. Dabei werden quantitative
Messergebnisse (Intensitäten) aus einer zu untersuchenden Probe mit den
Messwerten, die bei einem Kollektiv an einer Morbus-Alzheimer-Erkrankung Morbus-Alzheimer-Erkrankung leidender Patienten und einem Kontrollkollektiv gewonnen wurden, verglichen. Zur Quantifizierung können Methoden wie z.B.
Reverse Transkriptase Polymerease Kettenreaktion (RT-PCR) oder Northernblots in einer dem Fachmann bekannten Weise angewendet werden. Aus den
Ergebnissen kann die Wahrscheinlichkeit des Vorliegens einer Erkrankung an Morbus Alzheimer und/oder deren Schweregrad abgeleitet werden. Immunologische Nachweismethoden
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Identifizierung der MAC3-Peptide unter Verwendung eines immunologischen Nachweissystems, vorzugsweise eines ELISAs (enzyme linked immuno sorbent assay) durchgeführt werden. Dabei erfasst dieser immunologische Nachweis wenigstens ein MAC3-Peptid. Zur Erhöhung der Spezifität sollte weiterhin bevorzugt ein sogenannter „Sandwich-ELISA" verwendet werden, bei dem der Nachweis des MAC3-Peptids von der Spezifität von zwei Antikörpern, die unterschiedliche Epitope innerhalb des selben Moleküls erkennen, abhängt. Zum Nachweis von MAC3-Peptiden können jedoch auch andere immunologische Verfahren, z.B. direkte oder kompetitive immunologische Verfahren Verwendung finden. Auch weitere, ELISA-ähnliche Nachweistechniken, wie z.B. RIAs (radio immuno assays), ELI-Spot, Lumineszenz- Chemolumineszenz-, Elektrochemilumineszenz-, Fluoreszenz- oder Biolumineszenz-Immunoassay- Verfahren usw. sind geeignet als immunologische Nachweissysteme für MAC3- Peptide. Als Standard für die Quantifizierung können aus biologischen Proben isolierte, rekombinant hergestellte oder chemisch synthetisierte MAC3-Peptide verwendet werden. Die Identifizierung des oder der MAC3-Peptide kann z.B. allgemein mit Hilfe eines auf das Peptid oder Peptidfragment gerichteten Antikörpers, d.h., eines für das Peptid spezifischen Antikörpers, erfolgen. Weitere für den Peptidnachweis geeignete Nachweismethoden sind unter anderem Westernblotting, Immunpräzipitation, Dot-Blots,
Plasmonresonanzspektroskopie (BIACORE™), Phagenpartikel, PNAs (Peptide Nucleic Acids), Affinitätsmatrizen usw. Generell sind alle Substanzen/Moleküle als Nachweisagenzien geeignet, die es erlauben, ein spezifisches Nachweissystem aufzubauen.
Bei allen diesen Immunoassay-Verfahren wird bevorzugt der für das MAC3-
Peptid spezifische Bindungspartner auf einem geeigneten Träger immobilisiert. Als Träger können alle bekannten Träger wie beispielsweise Plastikröhrchen,
Mikrotiterplatten, Partikel, Mikropartikel, Protein-Chips usw. verwendet werden. Der Bindepartner kann direkt auf diesem Träger oder der Festphase adsorptiv oder kovalent gekoppelt immobilisiert werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, den Bindepartner für das MAC3-Peptid individuell über ein Paar eines
Bindepaares, wie beispielsweise Biotin /Avidin, Biotin/Streptavidin, Antigen/Antikörper usw. zu immobilisieren. Diese Methoden sind dem
Fachmann bekannt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Testkit zum Nachweis von Morbus Alzheimer oder einer Veranlagung für Morbus Alzheimer, der mindestens einen Bindepartner, bevorzugt einen Antikörper, der gegen ein MAC3-Peptid gerichtet ist, enthält. Dieser Bindepartner liegt in immobilisierter Form an eine geeignete Festphase oder einen Träger gebunden vor oder kann in einer Form angeboten werden, die die Immobilisierung ermöglicht. Beispielsweise kann der Bindepartner biotinyliert sein, falls als indirekte Bindung die Biotin/Avidin-Interaktion genutzt werden soll.
Der Bindungspartner kann aber ebenso im Testkit in markierter Form vorliegen oder in einer Form, die die Markierung ermöglicht. Die indirekte Markierung kann über die Interaktion eines Bindepaares wie Avidin/Biotin, bzw. Streptavidin/Biotin oder Digoxin/anti-Digoxin-Antikörper eingefügt werden. Diese Methoden sind dem Fachmann bekannt.
Zusätzlich kann in dem Testkit neben dem immobilisierten oder markierten Bindepartner ein Standard enthalten sein, der aus mindestens einem MAC3- Peptid besteht. Üblicherweise werden als Standard mehrere Lösungen mit unterschiedlichen, bekannten MAC3-Peptidkonzentrationen angeboten.
Gewinnung von MAC3-Peptiden und von anti-MAC3-Peptid Antikörpern Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Gewinnung von MACSPeptiden unter Verwendung von rekombinanten Expressionssystemen, Chromatographiemethoden und chemischen Syntheseprotokollen, die dem Fachmann bekannt sind. Die so gewonnenen MAC3-Peptide können unter anderem als Standards zur Quantifizierung der jeweiligen MAC3-Peptide oder als Antigen zur Herstellung MAC3-Peptid spezifischer Antikörper Verwendung finden. Zu den dem Fachmann bekannten und geeigneten Methoden zur Isolierung und Gewinnung von MAC3-Peptiden gehören die rekombinante Expression von Pepiden. Zur Expression der MAC3-Pepide können unter anderem Zellsysteme wie z.B. Bakterien wie Escherichia coli, Hefezellen wie Saccharomyces cerevisiae, Insektenzellen wie z.B. Spodoptera frugiperda (Sf-9) Zellen oder Säugerzellen wie „Chinese Hamster Ovary" (CHO) Zellen verwendet werden. Diese Zellen sind von der „American Tissue Culture Collection" (ATCC) erhältlich. Zur rekombinanten Expression von MAC3-Peptiden werden z.B. Nukleinsäuresequenzen, die für MAC3-Peptide kodieren in Kombination mit geeigneten regulatorischen Nukleinsäuresequenzen wie z.B. Promotoren, antibiotischen Selektionsmarkern usw. mit molekularbiologischen Methoden in einen Expressionsvektor eingefügt. Ein dazu geeigneter Vektor ist z.B. der Vektor pcDNA3.1 von der Firma Invitrogen. Die so gewonnenen MAC3-Peptid- Expressionsvektoren können dann in geeignete Zellen, z.B. durch Elektroporation, eingefügt werden. Die Herstellung der MAC3-Peptide durch chemische Synthese kann z.B. nach dem Merrifield-Festphasen- Syntheseprotokoll unter Verwendung von Syntheseautomaten, die von verschiedenen Herstellern erhältlichen sind, erfolgen. Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die Isolierung von MAC3-Peptiden aus biologischen Proben oder aus Zellkulturmedien oder Zelllysaten von rekombinanten Expressionssystemen z.B. mit Reverse-Phase-Chromatographie, Affinitätschromatographie, lonenaustausch-Chromatographie, Gelfiltration, Isoelektrischer Fokussierung, usw. oder mit anderen Methoden wie präparativer Immunpräzipitation, Ammoniumsulfatfällung, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln usw. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Gewinnung monoklonaler oder polyklonaler Antikörper unter Verwendung von MAC3-Peptiden. Die Gewinnung der Antikörper geschieht in üblicher, dem Fachmann bekannter Weise. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Herstellung und Gewinnung von MAC3-Peptid spezifischen Antikörpern, die neo-Epitope erkennen, die nur auf MAC3-Peptiden vorhanden sind, die jedoch nicht im kompletten Complement C3-Vorläufermolekül auftreten. Solche anti- MAC3-Peptid-Antikörper ermöglichen den spezifischen immunologischen Nachweis von MAC3-Peptiden in Gegenwart des Complement C3 Vorläufermoleküls.
Therapieentwicklung und Überwachung durch MAC3-Peptid Bestimmungen Ein weiteres Anwendungsbeispiel ist die quantitative Bestimmung der oben genannten Peptide zur Abschätzung der Wirksamkeit einer sich in der Entwicklung befindlichen Therapie gegen neurodegenerative Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Dabei werden quantitative Messergebnisse aus einer zu untersuchenden Probe mit den Messwerten, die bei einem Kontrollkollektiv und einer Gruppe von Patienten gewonnen wurden, verglichen. Aus diesen Ergebnissen kann die Wirksamkeit eines Therapeutikums abgeleitet werden. Die Wirksamkeitsprüfung ist für eine erfolgreiche Entwicklung eines Therapeutikums von herausragender Bedeutung und bisher stand für Morbus Alzheimer kein klinisch messbarer Parameter zur Verfügung, der dieses zuverlässig ermöglicht [3].
Unter Verwendung dieser Methodik wurden definiert prozessierte und definiert posttranslational modifizierte, von der Aminosäuresequenz des Complement C3f-Moleküls abgeleitete Peptide, sowie das C3f-Peptid selbst, identifiziert, die in Liquor cerebrospinalis von Patienten mit Morbus Alzheimer, in einer für jedes Peptid spezifisch positiv oder negativ veränderten Konzentration relativ zur Kontrollgruppe vorhanden sind.
Entwicklung therapeutischer Anwendungen von MAC3-Peptiden Bei Morbus-Alzheimer-Patienten sind die Konzentrationen von MAC3-Peptiden deutlich verändert, verglichen mit gesunden Personen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es daher, die MAC3-Konzentrationen bei Morbus-Alzheimer- Patienten auf normale Konzentrationen zu bringen. Dieses Verfahren kann zur Therapie von Morbus Alzheimer oder verwandten neurologischen Erkrankungen eingesetzt werden. Bei erhöhten Complement C3- oder MAC3-Peptid- Konzentrationen können die Konzentrationen dieser Stoffe durch therapeutische Gabe von z.B. anti-Complement C3 oder anti-MAC3-Peptid-Antikörpern oder Complement C3-spezifischen Antisense-Nukleinsäuren, Ribozymen, RNAi- Nukleinsäuremolekülen oder Triplex-Nukleinsäuren oder MAC3-Peptid- Antagonisten oder Complement C3-Antagonisten gesenkt werden. Zur Therapie können auch Substanzen verabreicht werden, die die körpereigene Expression von Complement C3 oder die Prozessierung von Complement C3 zu MACS- Peptiden unterdrücken. Liegt ein Mangel an Complement C3 oder MACS- Peptiden als Erkrankungsursache vor, so können therapeutische Gaben von Complement C3, MAC3-Peptiden, MAC3-Peptid-Agonisten oder Complement C3-Agonisten vorgenommen werden. Auch Substanzen, die die Prozessierung von Complement C3 zu MAC3-Peptiden beeinflussen, können therapeutisch eingesetzt werden. Natürlich ist auch die Kombination von verschiedenen Therapiestrategien unter Umständen sinnvoll und möglich.
Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung von Complement C3- Peptiden, MAC3-Peptiden, MAC3-Peptid-Agonisten und MAC3-Peptid-
Antagonisten, Complement C3-Peptid-Agonisten und Complement C3-Peptid-
Antagonisten, anti-Complement C3 Antikörper und anti-MAC3-Peptid
Antikörper zur direkten oder indirekten Modulierung der Konzentration an
Complement C3-Peptiden und MAC3-Peptiden zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Alternativ zu
Antikörpern können auch Antikörperfragmente, Antikörperfusionsproteine oder andere selektiv an Complement C3-Peptide oder MAC3-Peptide bindende
Substanzen Verwendung finden. Alternativ zu den genannten Proteinen und
Peptiden können auch Fusionsproteine der genannten Proteine und Peptide Verwendung finden. Weiterhin umfasst die Erfindung auch die Verwendung von
Antisense-Nukleinsäuren, Triplex-Nukleinsäuren, RNAi Nukleinsäuremolekülen, Ribozymen und weiteren Nukleinsäuren, die die Expression der genannten Proteine und Peptide modulieren. Außerdem umfasst die Erfindung Agonisten und Antagonisten, die die Aktivität der genannten Proteine modulieren.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die galenische Formulierung oder chemische Modifizierung der beschriebenen Peptide und Nukleinsäuren in einer Art und Weise, die es ihnen ermöglicht, die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut-Liquor-Schranke effizienter zu passieren. Dadurch eignen sie sich dann besonders zur therapeutischen Anwendung. Um dieses zu erreichen, können z.B. MAC3-Peptide, Complement C3-Peptide, Peptidomimetics, Nukleinsäuren, Agonisten oder Antagonisten derart modifiziert werden, dass sie z.B. lipophiler werden was den Übertritt in den Subarachnoidalraum, die Hirnventrikel sowie des Hirngewebes begünstigt. Dieses kann durch Einfügung von hydrophoben Molekülbestandteilen oder auch durch die "Verpackung" der Stoffe in hydrophobe Agentien, z.B. Liposomen erreicht werden. Außerdem können z.B. Peptidsequenzen an MAC3- oder Complement C3-Peptiden, Nukleinsäuren, Agonisten oder Antagonisten angefügt werden, die den Eintritt in den Subarachnoidalraum begünstigen, bzw. umgekehrt den Austritt aus den Subarachnoidalraum heraus erschweren.
Die Erfindung umfasst auch die Verabreichung der genannten Therapeutika über verschiede Wege, wie z.B. als intravenöse Injektion, als oral applizierbare Substanz, als inhalierbares Gas oder Aerosol, oder die Verabreichung in Form von direkten Injektion in den Subarachnoidalraum, die Hirnventrikel, oder in Gewebe wie Muskel, Fett, Gehirn usw. Dadurch kann eine erhöht biologische Verfügbarkeit und Wirksamkeit, sowie einer erhöhte lokale Konzentration dieser Therapeutika erreicht werden. Zum Beispiel können Peptide oder Proteine, die oral verabreicht werden durch säureresistente Kapseln vor proteolytischem Abbau im Magen geschützt werden. Stark hydrophobe Substanzen können durch geeignete galenische Aufbereitungen hydrophiler und somit besser geeignet für z.B. intravenöse Injektionen werden. Weitere mögliche Darreichungsformen sind u.a. die Verpackung der Wirkstoffe in Polymeren und Gelen (Atrix Labs, Fort Collins, CO, USA, Andrx Pharmaceuticals, Davie, FL USA) usw.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von MACS- Peptiden oder von Complement C3-Peptiden zur Identifizierung von Rezeptoren, die diese Moleküle selektiv binden. Auch diese Rezeptoren können durch Gabe von Agonisten oder Antagonisten moduliert werden, was zur Therapie von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, zweckmäßig ist.
Ausführungsbeispiele zur Überprüfung der therapeutischen Wirksamkeit von Complement C3-Peptiden, MAC3-Peptiden und von Agenzien, die die Expression und die biologische Verfügbarkeit dieser Substanzen modulieren, umfassen die Kultivierung von Zelllinien. Diese Zelllinien können mit Complement C3- oder MAC3-Peptiden oder mit Peptidomimetics oder mit Substanzen, die die Expression von Complement C3-Peptiden fördern, oder die die Prozessierung von Complement C3-Peptiden zu MAC3-Peptiden fördern, behandelt werden. Dadurch können biologische Eigenschaften von Complement C3- und MAC3-Peptiden im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, ermittelt werden. Auch Fusionsproteine und Fusionspeptide können zur Behandlung der Zelllinien verwendet werden, z.B. Fusionsproteine mit Peptidsequenzen, die einen Transport des Fusionsproteins ins Zellinnere fördern. Beispiele für mögliche Fusionspartner sind HIV-TAT-, Antennapedia-, Herpes Simplex VP22-Sequenzen usw. Ebenso können Zelllinien mit Expressionsvektoren transfiziert werden, die direkt oder indirekt eine Expression von Complement C3-Peptiden oder MAC3-Peptiden durch die transfizierten Zellen bewirken. Diese Expressionsvektoren können u.a. für MAC3-Peptide oder Complement C3-Peptide kodieren. Auch die gleichzeitige Transfektionen mit verschiedenen MAC3-Peptiden und/oder Complement C3- Peptiden können durchgeführt werden. Alternativ können geeignete Zelllinien mit anti-Complement C3-Peptid- oder anti-MAC3-Peptid-Antikörpem oder mit Nukleinsäuren, die die Expression von Complement C3-Peptiden unterdrücken, wie z.B. Complement C3-Antisense-Nukleinsäuren, Complement C3-Triplex- Nukleinsäuren, Complement C3-RNAi-Nukleinsäuren oder gegen Complement C3-mRNA gerichteten Ribozymen, behandelt werden. Insbesondere Zelllinien, die als neurologische Modellsysteme im Zusammenhang mit Complement C3 als geeignet erscheinen, können zu solchen Untersuchungen herangezogen werden. Als "Read-out"-Systeme für diese Untersuchungen können unter anderem Tests verwendet werden, die die Proliferationsrate der behandelten Zellen, ihre Stoffwechselaktivität, die Apoptoserate der Zellen, Änderungen der Zellmorphologie, der Expression von zelleigenen Proteinen oder Reportergenen oder die die Freisetzung von zytosolischen Zellbestandteilen als Marker für Zellsterben ermitteln.
Als weitere Testsysteme können geeignete Stämme von Versuchtieren, z.B. von Mäusen, Ratten, oder anderen Spezies verwendet werden, die als Modell für neurologische Erkrankungen, insbesondere als Modell für Morbus Alzheimer, gelten. Diese Versuchstiere können zur Untersuchung der Wirksamkeit von Therapiestrategien, die die Modulation der Konzentration von MAC3-Peptiden oder von Complement C3-Peptiden zum Ziel haben, herangezogen werden, wobei diese Peptide und Proteine unter Umständen so galenisch aufbereitet werden können, dass sie die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut-Liquor- Schranke besser passieren können. Als galenische Aufbereitungsmethode können unter anderem Liposomen-verpackte Proteine und Peptide, Proteine und Peptide kovalent fusioniert oder nicht kovalent assoziiert mit Transportpeptiden, wie z.B. der HIV-TAT-Sequenz usw. verwendet werden. Außerdem können Peptide und Proteine chemisch derart modifiziert werden, dass sie lipophile Eigenschaften erhalten und daher leichter in Zellen eindringen können. Peptide, die in wässrigen Lösungen nur schwer löslich sind, können chemisch derart modifiziert werden, dass sie hydrophiler werden und dann als z.B. intravenös injizierbares Therapeutikum verwendet werden können. Säureresistente Kapseln können verwendet werden, um empfindliche Substanzen, die oral verabreicht werden sollen, im Magen vor ihrer Zerstörung zu schützen.
"Read-out"-Parameter bei Versuchen mit Tiermodellen können die Überlebensdauer der Tiere, ihr Verhalten, ihre Kurzzeitgedächtnisleistung, ihre Lernfähigkeit, usw. sein. Ein Beispiel für einen Gedächtnistest, der für Versuchstiere wie z.B. Ratten geeignet ist, ist der "Morris water maze test" . Als weitere Parameter kann die Bestimmung von Körperfunktionen, wie z.B. Bluttests, die Messung von Gehirnströmen, Stoffwechseltests, die Expression von Complement C3-Peptiden und MAC3-Peptiden und anderen mit der Erkrankung im Zusammenhang stehenden Proteinen, sowie morphologische und histologische Untersuchungen an Geweben, wie z.B. dem Gehirn herangezogen werden.
Als weitere Möglichkeit zur Untersuchung der Funktion von Complement C3- Peptiden und MAC3-Peptiden können unter Anwendung von molekularbiologischen Methoden Versuchstiere, wie z.B. gendefiziente Tiere, oder transgene Tiere erhalten werden, in deren Organismus Complement C3- Peptide oder MAC3-Peptide nicht produziert werden, oder in verminderter oder erhöhter Menge produziert werden. Dabei kann die Expression sowohl lokal, z.B. im Gehirn, als auch im gesamten Organismus des Versuchstieres verändert werden. Als Versuchstiere sind unter anderem Caenorhabditis elegans, Drosophila, Zebrafische, Mäuse, Ratten usw. geeignet.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher illustriert. Dabei wird auch Bezug auf die Abbildungen genommen.
Abbildung 1 Schematische Darstellung des Complement C3 Proteins mit der Position der identifizierten MAC3-Peptide
Abbildung 2: Reverse-Phase-Chromatographie zur Separation und Anreicherung der MAC3-Peptide aus Liquor cerebrospinalis
Abbildung 3: Massenspektrometrische Messung (MALDI) am Beispiel des Peptids MAC3-1
Abbildung 4: MS/MS-Fragmentspektrum zur Identifizierung von Peptiden am Beispiel von MAC3-1
Abbildung 5: MALDI als relativ quantifizierende massenspektroskopische Methode
Abbildung 6: Box-Whisker-Plot zum quantitativen Vergleich der Konzentrationen von MAC3-1 in gesunden Kontrollen, in Morbus-Alzheimer-Patienten und in Patienten mit nichtAlzheimer-Demenzen, sowie von chemisch modifizierten MAC3-1 (z.B. das einfach oder zweifach oxidierte Peptid, sowie das zweifach geladene MAC3-1 Peptid- lon)
Abbildung 7: Box-Whisker-Plot zur quantitativen Vergleich der Konzentrationen von MAC3-2 in gesunden Kontrollen, in Morbus-Alzheimer-Patienten und in Patienten mit nichtAlzheimer Demenzen Abbildung 8: Box-Whisker-Plot zur quantitativen Vergleich der Konzentrationen von MAC3-7 in gesunden Kontrollen, in Morbus-Alzheimer-Patienten und in Patienten mit nichtAlzheimer-Demenzen
Abbildung 9: Box-Whisker-Plot zur quantitativen Vergleich der Konzentrationen von MAC3-8 in gesunden Kontrollen, in Morbus-Alzheimer-Patienten und in Patienten mit nichtAlzheimer Demenzen
Abbildung 10: Box-Whisker-Plot zur quantitativen Vergleich der Konzentrationen von MAC3-9 in gesunden Kontrollen, in Morbus-Alzheimer-Patienten und in Patienten mit nichtAlzheimer Demenzen
Abbildung 1 1 Box-Whisker-Plot zur quantitativen Vergleich der Konzentrationen von MAC3-13 in gesunden Kontrollen, in Morbus-Alzheimer-Patienten und in Patienten mit nicht-Alzheimer-Demenzen
Die Abbildung 1 zeigt eine Schematische Darstellung des Complement C3 Proteins mit der Position der identifizierten MAC3-Peptide, die untereinander in Form eines Alignments dargestellt sind. Die theoretischen, monoisotopischen Massen der Peptide, angegeben in Dalton, wurden berechnet mit der Software GPMAW 4.02. Es sind: MAC3-1 = 2020,1 / MAC3-2 = 1863,9 / MAC3-3 = 1637,8 / MAC3-4 = 1479,7 / MAC3-5 = 1263,6 / MAC3-6 = 1077,6 / MAC3-7 = 1933,0 / MAC3-8 = 1776,9 / MAC3-9 = 1846,0 / MAC3-10 = 1689,9 / MAC3-1 1 = 1717,9 / MAC3-12 = 1561 ,8 / MAC3-13 = 1448,7/ MAC3-14 = 1210,6 / MAC3-15 > 990,5 und MAC3-16 > 941 ,4 Dalton. Die im Massenspektrometer tatsächlich identifizierten Massen weichen aufgrund der natürlichen Isotopenverteilung, sowie einer geringen Messungenauigkeit von diesen theoretischen, monoisotopischen Massen ab. Die Messungenauigkeit beträgt 500 ppm für Peptide im Massenbereich von 1000 bis 4000 Dalton, wobei der Fehler der Messung für Peptide mit einer Masse, die größer als 4000 Dalton ist, graduell zunimmt. Außerdem ist die gemessene Masse aller Peptide zusätzlich, aufgrund der verwendeten Messmethode um die Masse eines Protons ( = 1 Dalton) erhöht. Zusätzlich konnte das Peptid MAC3-1 in Form von Peptid-Varianten mit einem und mit zwei zusätzlichen, kovalent verknüpften Sauerstoff -Atomen identifiziert werden, wobei für jedes Sauerstoff atom entsprechend ca. 16 Dalton zur Masse des Peptids hinzukommen. Die dabei experimentell bestimmten Massen für MAC3-1 betragen: 2038 und 2054 Dalton, wobei die Masse von MAC3-1 jeweils sequenziell um die Masse eines Sauerstoffatoms erhöht ist.
Die Abbildung 2 zeigt das Elutionsprofil einer Probe, die einer Reverse-Phase- Chromatographie gemäß Beispiel 2, zur Separation und Anreicherung der MAC3-Peptide aus Liquor cerebrospinalis unterzogen wurde. Die Position, an der MAC3-1 Peptide eluieren, ist durch einen Pfeil markiert.
Die Abbildung 3 zeigt ein Spektrum, das durch MALDI-massenspektrometrische Messung von MAC3-1 gemäß Beispiel 3 entstanden ist, nach erfolgter Reverse- Phase-Chromatographie von humanem Liquor cerebrospinalis gemäß Beispiel 2. MAC3-1 entspricht der Sequenz des C3f-Peptids, abstammend von Complement C3, und ist durch einen Pfeil markiert.
Die Abbildung 4 zeigt ein MS/MS-Fragmentspektrum gemäß Beispiel 4 des erfindungsgemäßen Peptids MAC3-1 . Abbildung 4A zeigt die Rohdaten der
Messung, Abbildung 4B zeigt das konvertierte, dekonvolutiertes Massenspektrum von MAC3-1 . Das Peak-Muster in Abbildung 4B ist charakteristisch für MAC3-1. MAC3-1 entspricht dem C3f-Peptid des Complement C3 Proteins (Seq. ID 1 ).
Die Abbildung 5 zeigt durch MALDI als relativ quantifizierende MS-Methode erzeugte Daten. Eine Probe wurde mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt und die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch repräsentativer Probensignale ermittelt. Alle Signal-Intensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0,64 μM ( = 1 ) normiert. Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typisches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was in diesem Diagramm anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist.
Die Abbildung 6 zeigt Box-Whisker-Plots für das Peptid MAC3-1 in seiner 2- fach oxidierten Form (Abb. 6A und B), in seiner einfach oxidierten Form (Abb. 6C und D), in seiner nicht oxidierten Form (Abb. 6E und F) und als 2-fach geladenes Ion (Abb. 6G und H). In Abb. 6A bis F ist jeweils das einfach geladene Ion analysiert. Jede MAC3-1 Variante wird im Vergleich zwischen Morbus-Alzheimer-Patienten und gesunden Kontrollen (Abb. 6A, C, E und G) und zwischen Morbus-Alzheimer-Patienten und nicht-Alzheimer-Patienten (Abb. 6B, D, F und H) dargestellt.
Die Abbildung 7 bis 1 1 zeigen in Form von Box-Whisker-Plots einen Vergleich der integrierten MALDI-massenspektroskopischen Signalintensitäten von MAC3- 2, MAC3-7, MAC3-8, MAC3-9 und MAC3-13 in gesunden Kontrollen, verglichen mit Morbus-Alzheimer-Patienten (Abb. A) und von nicht-Alzheimer Demenzen, verglichen mit Morbus-Alzheimer-Patienten (Abb. B).
Beispiel 1 : Gewinnung von Liquor cerebrospinalis zur Bestimmung von MACS- Peptiden Liquor oder Liquor cerebrospinalis (Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit) ist die in den vier Hirnventrikeln und im Subarachnoidalraum enthaltene Flüssigkeit, die vor allem in den Plexus choroidei der Seitenventrikel gebildet wird. Die Entnahme von Liquor cerebrospinalis erfolgt meist durch Lumbaipunktion, seltener durch Subokzipitalpunktion oder Ventrikelpunktion. Bei der Lumbaipunktion (Spinalpunktion) zur Entnahme von Liquor cerebrospinalis wird bei der Punktion der spinale Subarachnoidalraum zwischen dem 3. und 4. oder dem 4. und 5. Lendenwirbeldornfortsatz mit einer langen Hohlnadel punktiert und so Liquor gewonnen. Anschließend wird die Probe 10 Minuten bei 2000x g zentrifugiert und der Überstand bei minus 70° C gelagert.
Beispiel 2. Trennung von Peptiden in Liquor cerebrospinalis (CSF) zur massenspektrometrischen Messung von MAC3-Peptiden
Zum massenspektrometrischen Nachweis von MAC3-Peptiden in CSF ist in diesem Beispiel eine Trennung der peptidischen Inhaltsstoffe notwendig. Diese Probenvorbehandlung dient der Anreicherung der erfindungsgemäßen Peptide und zur Abtrennung von Komponenten, welche die Messung stören können. Als Trennverfahren wird eine Reverse-Phase-Chromatographie durchgeführt. Hierbei eignen sich verschiedene RP-Chromatographie-Harze und Eluationsmittel gleichermaßen. Im Folgenden ist beispielhaft die Trennung von MAC3-Peptiden unter Verwendung einer C18 Reverse-Phase-Chromatographiesäule mit der Größe 4 mm x 250 mm der Firma Vydac dargestellt. Es wurden Laufmittel folgender Zusammensetzung verwendet: Laufmittel A: 0,06 % (v/v) Trifluoressigsäure, Laufmittel B: 0,05 % (v/v) Trifluoressigsäure, 80 % (v/v) Acetonitril. Die Chromatographie erfolgte bei 33 °C unter Verwendung einer HP-ChemStation 1 100 der Firma Agilent Technologies mit einer Flusszelle Micro der Firma Agilent Technologies. Als Probe wurde humaner Liquor cerebrospinalis verwendet. 440 μ\ Liquor wurden mit Wasser auf 1650 μ\ verdünnt, der pH auf 2-3 eingestellt, die Probe für 10 Minuten bei 18000x g zentrifugiert und schließlich 1500 μ\ der so vorbereiteten Probe auf die Chromatographiesäule aufgetragen. Die Chromatographiebedingungen waren wie folgt: 5 % Laufmittel B zum Zeitpunkt 0 min, vom Zeitpunkt 1 bis 45 min kontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 50 %, von Zeitpunkt 45 bis 49 min kontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 100 % und anschließend bis zum Zeitpunkt 53 min konstant 100 % Puffer B. 10 Minuten nach Beginn der Chromatographie wird mit dem Sammeln von 96 Fraktionen zu je 0,5 ml begonnen. Das Chromatogramm einer Liquor cerebrospinalis Probe, hergestellt unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen, ist in Abbildung 2 dargestellt.
Beispiel 3: Ermittlung der Massen von Peptiden mit Hilfe von MALDI- Massenspektrometrie Zur Massenanalyse werden typische Positiv-Ionen-Spektren von Peptiden in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer (Matrix-unterstützte Laserdesorptions- lonisation) erstellt. Geeignete MALDI-TOF-Massenspektrometer werden von PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager-DE, Voyager-DE PRO oder Voyager-DE STR) oder von Bruker Daltonik Bremen (BIFLEX) hergestellt. Zur Präparation der Proben werden sie mit einer Matrixsubstanz vermischt, die typischerweise aus einer organischen Säure besteht. Typische Matrix- Substanzen, die sich für Peptide eignen, sind die 3,5-Dimethoxy-4- hydroxyzimtsäure, die α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und die 2,5- Dihydroxybenzoesäure. Zur Messung der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide wird ein getrocknetes, nach Reverse-Phase-Chromatographie gewonnenes Äquivalent entsprechend 400 μ\ humanem Liquor cerebrospinalis, verwendet. Die chromatographierte Probe wird in 15 μ\ einer Matrix-Lösung gelöst. Diese Matrix-Lösung enthält z.B. 10 g/l α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und 10 g/l L(- )Fucose gelöst in einem Lösungsmittelgemisch bestehend aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Aceton im Volumenverhältnis 49:49: 1 : 1. Von dieser Lösung werden 0,3 μ\ auf eine MALDI-Trägerplatte transferiert und die getrocknete Probe im MALDI-Massenspektrometer Voyager-DE STR von PerSeptive Biosystems analysiert. Die Messung erfolgt im „Linear Mode" mit „Delayed Extraction™". Als Beispiel für eine Messung eines der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide zeigt Abbildung 3 das Spektrum von MAC3- 1 . Der Peak, der dem Peptid MAC3-1 entspricht, ist durch einen Pfeil markiert. Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie kann zur Quantifizierung von Peptiden wie z.B. der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide eingesetzt werden, wenn diese Peptide in einer Konzentration vorliegen, die sich im dynamischen Messbereich des Massenspektrometers befindet, wodurch Detektorsättigung vermieden wird. Dieses ist für die Messung der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide in Liquor cerebrospinalis bei einer Liquor-Äquivalentkonzentration von 33,3 μ\ pro μ\ Matrixlösung der Fall. Für jedes Peptid gibt es ein spezifisches Verhältnis zwischen Messsignal und Konzentration, was bedeutet, dass die MALDI- Massenspektrometrie vorzugsweise zur relativen Quantifizierung von Peptiden herangezogen werden kann. Dieser Sachverhalt ist in Abbildung 5 dargestellt. Wird eine Probe mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt, so kann die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch der Probensignale ermittelt werden. Beispielhaft zeigt Abbildung 5 eine MALDI- Messung als relativ quantifizierende MS-Methode. Alle Signalintensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0,64 mol ( = 1 ) normiert. Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typisches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist.
Beispiel 4: Massenspektrometrische Identifizierung von MAC3-Peptiden
Zur Quantifizierung der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide muss sichergestellt werden, dass es sich bei den zu analysierenden Massensignalen von Peptiden in den Fraktionen, gewonnen durch Reverse-Phase-Chromatographie von Liquor cerebrospinalis, gemäß Beispiel 2, tatsächlich um die erfindungsgemäßen MAC3-Peptide handelt. Die Identifikation der erfindungsgemäßen Peptide, in diesen Fraktionen erfolgt z.B. mit nanoSpray-MS/MS [14]. Dabei wird ein MAC3-Peptid-lon im Massenspektrometer anhand seines spezifischen m/z (Masse/Ladung) Wertes in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise im Massenspektrometer selektiert. Dieses selektierte Ion wird anschließend durch Zuführung von Kollisionsenergie mit einem Stoßgas, z.B. Argon oder Stickstoff, fragmentiert und die resultierenden MAC3-Peptid-Bruchstücke im Massenspektrometer in einer integrierten Analyseneinheit detektiert und korrespondierende m/z-Werte bestimmt (Prinzip der Tandem- Massenspektrometrie) [15]. Das Fragmentierungsverhalten von Peptiden ermöglicht bei der Massengenauigkeit der verwendeten Geräte von 50 ppm eine eindeutige Identifizierung der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide unter Verwendung von computergestützten Suchverfahren [16] in Sequenzdatenbanken, in die die Sequenz des Vorläufermoleküls Complement C3 eingetragen wurde. Unter Berücksichtigung der positiven Verschiebung der molekularen Masse um ca. 16 Dalton, was der Masse eines Sauerstoffatoms entspricht, können mit dieser Methode auch oxidierte Peptide identifiziert werden. Entsprechend lassen sich auch andere chemisch oder posttranslational modifizierte Peptide identifizieren. In diesem speziellen Fall erfolgte die massenspektrometrische Analyse mit einem Quadrupol-TOF-Instrument, Modell "QStar-Pulsar" der Firma Applied Biosystems-Sciex, USA. Beispielhafte MS/MS Fragmentspektren von MAC3-1 sind in Abbildung 4 dargestellt.
Beispiel 5: Massenspektrometrische Quantifizierung von MAC3-Peptiden zum
Vergleich ihrer relativen Konzentration in Kontroll- und Patientenproben
Für Kontrollproben und für Proben von Patienten, die an Morbus-Alzheimer- Erkrankt sind, wurde nach einer Probenvorbereitung gemäß Beispiel 1 und 2 eine nachgeschaltete MALDI-Messung der erfindungsgemäßen MAC3-Peptide gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Exemplarische MALDI-Signalintensitäten sind in Form von "Box-Whisker-Plots" in den Abbildungen 6 bis 1 1 visualisiert. Die dargestellten "Box-Whisker-Plots" ermöglichen den Vergleich der integrierten MALDI-massenspektrometrischen Signalintensitäten verschiedener MAC3- Peptide in Kontrollen (gesunde Probanden, Patienten mit nicht-Alzheimer Demenzen), mit den MALDI-Signalintensitäten in Proben von Morbus-Alzheimer- Patienten. Dabei umfasst die "Box", d.h. die Säulen in den Diagrammen in den Abbildungen 6 bis 1 1 jeweils den Bereich, in dem sich 50 % der jeweiligen MALDI-Signalintensitäten befinden (2. und 3. Quartil) und die von der "Box" ausgehenden nach oben und nach unten weisenden Linien ("Whisker") geben den Bereich an, in dem sich jeweils die 25 % der Messwerte befinden, die die höchsten Signalintensitäten aufweisen (oberes Quartil), bzw. in dem sich die 25 % der Messwerte befinden, die die niedrigsten Signalintensitäten aufweisen (unteres Quartil). Die durchgezogene Linie in den Säulen gibt den Medianwert und die gestrichelte Linie in den Säulen gibt den Mittelwert an.
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Claims

Patentansprüche:
1 . Verfahren zum Nachweis von Morbus Alzheimer oder einer Veranlagung für Morbus Alzheimer durch Bestimmung wenigstens eines MAC3- Markerpeptids oder eines Peptids, welches von der Sequenz mit der Swiss
Prot Accession No. P01024 oder einer hierzu homologen Sequenz abgeleitet ist, in einer biologischen Probe eines Individuums.
2. Verfahren zum Nachweis von Morbus Alzheimer oder einer Veranlagung für Morbus Alzheimer unter Bestimmung der Konzentration wenigstens eines
Markerpeptids in einer biologischen Probe eines Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass a) als Markerpeptid wenigstens ein MAC3-Peptid oder ein Markerpeptid, abgeleitet von der Sequenz mit der Swiss Prot Accession No. P01024 oder einer hierzu homologen Sequenz=verwendet wird, b) eine für das jeweilige Markerpeptid spezifische Konzentrationserhöhung oder Konzentrationsverminderung in der Probe festgestellt wird, c) eine signifikante Konzentrationsänderung des Markerpeptids in der unter b) genannten Weise als positives Nachweisergebnis für Morbus Alzheimer ge wertet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid in der Probe in posttranslationalen Modifikationen oder in chemisch modifizierter Form, vorzugsweise als Peptid-Oxid vorliegt und in dieser Form nachgewiesen wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Liquor cerebrospinalis, Serum, Plasma, Urin, Synovialflüssigkeit, Stuhl, Tränenflüssigkeit Lymphflüssigkeit oder eine Gewebe- oder Zellprobe ist oder durch Aufbereitung hieraus erhalten wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der MAC3-Peptide mit Hilfe eines massenspektrometrischen oder eines biologischen Aktivitätstests oder eines molekularbiologischen oder eines immunologischen Tests, vorzugsweise mit Hilfe von MAC3-Peptid bindenden Phagenpartikeln, PNAs, Antikörpern,
Affinitätsmatrizen oder eines ELISA-Tests erfolgt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe vor der Bestimmung chromatografisch fraktioniert und/oder einer Fällungsreaktion und/oder einer Flüssigphasentrennung unterworfen wird, wobei die erhaltenen Fraktionen nachfolgend getrennt untersucht werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, a) dass das Verfahren zur Erhöhung der Sensitivität und/oder Spezifität der Diagnose in Kombination mit anderen Diagnoseverfahren durchgeführt wird oder b) dass die Konzentration des Markerpeptids als Maß für den Schweregrad der Krankheit herangezogen wird.
8. Verfahren zur Gewinnung eines MAC3-Peptids, einschließlich postranslational oder chemisch modifizierter Peptide durch Isolierung aus einer biologischen Probe, durch rekombinante Herstellung oder durch chemische Synthese, wobei die MAC3-Peptide a) Peptide gemäß Seq. ID 1 bis Seq. ID 16 sind, oder b) Abkömmlinge von natürlich vorkommenden Complement C3Allelen dieser
Peptide sind, oder c) MAC3-Mutanten mit vorzugsweise nicht mehr als 2 abweichenden Aminosäuren gegenüber dem entsprechenden Abschnitt der Complement C3-Sequenz sind.
9. Peptide gemäß Seq. ID 3 bis Seq. ID 16, oder Peptide die homolog zu Peptiden entsprechend Seq. ID 1 bis Seg. ID 16 sind, insbesondere Abkömmlinge natürlich vorkommender Complement C3 Allele oder punktmutierte, oder posttranslational, enzymatisch oder chemisch modifizierte, vorzugsweise oxidierte MAC3-Peptide oder den vorgenannten
Petiden entsprechende Peptidomimetika.
10. Verwendung wenigstens eines der Peptide gemäß Anspruch 9 oder von Peptiden die homolog sind zum Peptid mit der Swiss Prot Accession No. P01024 zur Herstellung oder Entwicklung eines diagnostischen Reagenzes oder eines Therapeutikums, insbesondere zur Gewinnung von Antikörpern als Diagnosereagenz für Morbus Alzheimer.
1 1 . Antikörper, die gegen MAC3-Peptide gerichtet sind.
12. Verwendung von zu den Peptiden gemäß Seq. ID 1 bis Seq. ID 16 oder zur Sequenz mit der NCBI Accession No. XM 009010 korrespondierenden Nukleinsäuren zur indirekten Bestimmung der relativen Konzentration der zugehörigen Peptide und Peptidfragmente zur Diagnose von Morbus Alzheimer.
13. Nukleinsäuren, die für MAC3-Peptide kodieren oder Nukleinsäuren die komplementär zu Nukleinsäuren sind, die für MAC3-Peptide kodieren.
14. Medikamente oder Diagnostika enthaltend MAC3-Peptide oder entsprechende Peptidomimetika oder enthaltend Antikörper gegen MAC3- Peptide oder enthaltend Nukleinsäuren die für MAC3-Peptide kodieren oder Nukleinsäuren die Komplementär zu Nukleinsäuren sind, die für MAC3- Peptide kodieren.
15. Medikamente oder Diagnostika enthaltend Substanzen entsprechend Anspruch 14 und zumindest eine weitere pharmakologisch akzeptable Substanz, vorzugsweise ein Lösungsmittel, einen Füllstoff, ein Konservierungsmittel, einen Farbstoff oder einen Geschmacksstoff.
16. Testkit zum Nachweis von Morbus Alzheimer oder einer Veranlagung für Morbus Alzheimer enthaltend mindestens einen Antikörper, der gegen ein MAC3-Peptid gerichtet ist und der in immobilisierter oder markierter Form vorliegt, oder in einer Form, welche die Immobilisierung oder Markierung ermöglicht.
17. Testkit gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich ein Standard, bestehend aus mindestens einem MAC3-Peptid, enthalten ist.
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