EP1373905A2 - Verfahren zum nachweis chronisch-demenzieller erkrankungen, zugehörige peptide und nachweisreagenzien - Google Patents

Verfahren zum nachweis chronisch-demenzieller erkrankungen, zugehörige peptide und nachweisreagenzien

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Publication number
EP1373905A2
EP1373905A2 EP02742678A EP02742678A EP1373905A2 EP 1373905 A2 EP1373905 A2 EP 1373905A2 EP 02742678 A EP02742678 A EP 02742678A EP 02742678 A EP02742678 A EP 02742678A EP 1373905 A2 EP1373905 A2 EP 1373905A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptides
vgfarp
vgf
disease
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02742678A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Norbert Lamping
Hans-Dieter Zucht
Gabriele Heine
Michael JÜRGENS
Rüdiger HESS
Hartmut Selle
Markus Kellmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DIGILAB Inc
Original Assignee
Biovision AG
Biovision GmbH and Co KG
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Filing date
Publication date
Application filed by Biovision AG, Biovision GmbH and Co KG filed Critical Biovision AG
Publication of EP1373905A2 publication Critical patent/EP1373905A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/20—Screening for compounds of potential therapeutic value cell-free systems
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders

Definitions

  • the invention relates to a method for the detection of a chronic, dementia disease or a predisposition to a chronic dementia disease, in particular Alzheimer's disease or related neurological diseases, e.g. Lewy body dementia or vascular dementia.
  • the invention further relates to peptides which have been found for the detection of the presence of these diseases, for monitoring the course of the diseases and the degree of the diseases.
  • detection reagents such as antibodies and nucleic acids and the like, by means of which these peptides or the corresponding nucleic acids can be detected.
  • the invention further relates to pharmaceutical applications, which include VGF, VGF peptides, VGF antibodies, VGF nucleic acids, VGF protein antagonists, VGF protein agonists, VGF peptide agonists or VGF peptide antagonists, for therapy or Prevention of neurological diseases, especially Alzheimer's disease. Furthermore, the invention relates to methods for determining patients with neurological diseases, in particular Alzheimer's disease, which are suitable for taking part in clinical studies for examining these diseases.
  • the peptides are fragments of the protein VGF, which is also referred to as "neuroendocrine specific protein VGF".
  • VGF is also used for the protein "vaccinia growth factor” or for “vaccinia virus growth factor” and used for "vascular permeability factor", these proteins not corresponding to the VGF protein which is the subject of this invention.
  • Dementia is an increasing problem in industrialized countries due to the higher average life expectancy. Dementia is largely incurable and requires long-term care for the sick. About half of these patients are cared for in hospital. More than 60 dementia disorders are known, including those that cause dementia.
  • Alzheimer's disease Alzheimer's disease
  • AD Alzheimer's disease
  • non-Alzheimer's dementias are known, among others: vascular dementia, Lewy body dementia, Binswanger dementia and dementia diseases which are an accompanying effect of other diseases, such as Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's Disease, Gerstmann-St Hurssler-Scheinger disease, Wienfeldt-Jakob disease etc. occur.
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease characterized by the following symptoms: decrease in mental ability, confusion and reduced self-preservation and self-care.
  • a strongly limited short-term memory in particular is characteristic of Alzheimer's disease, while long-standing memories of the patient, for example of one's own childhood, are far less affected by the disease.
  • CERAD Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease
  • the following criteria-based diagnostic systems are currently used to diagnose Alzheimer's disease: The "International classification of Diseases, lOth revision" (ICD-10), the
  • Alzheimer's disease is also difficult because, like other dementia diseases, it begins insidiously and is associated with slowly progressive destruction of nerve cells in the brain.
  • Alzheimer's disease No causal therapy for the treatment of Alzheimer's disease is currently available.
  • the disease is only symptomatic e.g. treated by the administration of neurotransmitters such as acetylcholine.
  • neurotransmitters such as acetylcholine.
  • the administration of antioxidants, radical scavengers, calcium channel blockers, anti-inflammatory substances, secretase inhibitors, anti-amyloid antibodies etc. and immunization against amyloid peptides are currently being tested as further possible therapeutic strategies. So far, however, no causal therapy of this disease is possible.
  • the invention has for its object to avoid the disadvantages in the diagnosis of Alzheimer's disease in the prior art and an early and reliable method to provide evidence of chronic dementia diseases, especially Alzheimer's disease. It is also the object of the invention to provide a new therapy for the treatment of Alzheimer's disease, since so far only unsatisfactory therapeutic approaches for the treatment of Alzheimer's disease have been available.
  • VGF proteins or peptides according to Accession No. NM_003378 and Y12661:
  • VGF proteins The peptides derived from the nucleic acid sequences NM_003378 and Y12661 are also referred to as VGF proteins and include all naturally occurring alleles, mutants and polymorphisms of VGF proteins as well as tissue-specific expressed VGF variants.
  • VGF variants are also included which occur as a result of diseases or as a result of neurological diseases, in particular chronic dementia diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • VGF proteins with and without a signal sequence, pro-forms of VGF proteins that have not yet been processed, as well as VGF proteins that have already been processed, soluble VGF proteins and membrane-bound VGF proteins, the membrane-bound VGF proteins both can be connected to a cell or organelle membrane via transmembrane amino acid sequences, and also via a post-translational modification, for example a glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI) anchor.
  • GPI glycosyl-phosphatidyl-inositol
  • VGF peptides and VGF peptide variants are referred to as VGFARP ("VGF Alzheimer related peptide") peptides.
  • VGFARP peptides can be derived from both the VGF sequences mentioned above (NM_003378 and Y1266) and from further VGF protein variants which may occur in nature.
  • VGFARP peptides can contain two point-mutated, two deleted or two additionally inserted amino acids, as well as N-terminal and / or C-terminal extensions. However, they must retain at least 8 amino acids from the VGF protein sequence. Only those amino acids that occur in the VGF protein sequence at this sequence position in the VGF protein are suitable as N- or C-terminal extensions.
  • VGFARP peptides derived from naturally occurring VGF polymorphisms and from naturally occurring VGF mutants are referred to as VGFARP peptides.
  • VGFARP peptides can also be used with post-translational modifications such as Glycosylation and phosphorylation and / or in chemically modified form, preferably as
  • VGFARP-12 has been identified as both an unoxidized and an oxidized peptide.
  • a chemically or post-translationally modified peptide can consist of both D- and L-amino acids as well as combinations of D- and L-amino acids. These peptides can also contain unusual amino acids, ie amino acids that do not belong to the 20 standard amino acids. Examples of unusual amino acids include: alpha-aminobutyric acid, beta-aminobutyric acid, beta-alanine, beta-aminoisobutyric acid, norvaline, homoserine, norleucine, gamma-aminobutyric acid, thioproline, 4-hydroxyproline, alpha-aminoadipic acid, diaminobutyric acid, 4-
  • aminobenzoic acid homocysteine, alpha-aminopenicillanic acid, histamine, ornithine, glycine-proline dipeptide, hydroxylysine, proline-hydroxyproline dipeptide, cystathionine, ethionine, seleno-cysteine.
  • Post-translational or chemical modifications include modifications of the amino acid sequences by the following structures: Binding of free cysteine to one
  • Biotinyl, stearoyl, palmityl, lipoyl, C-mannosyl, phosphorus and sulfate groups, glycosylations, amidations, deamidations, pyroglutamic acid, citrulline, etc. are possible.
  • nucleic acids DNA, RNA and DNA-RNA hybrid molecules of natural origin as well as synthetically or recombinantly produced are regarded as nucleic acids. Also included are chemically modified nucleic acids that contain modified nucleotides with high in vivo stability, e.g. Phosphorothioates. Such stabilized nucleic acids are already used when using ribozyme, antisense and triplex nucleic acid techniques.
  • Sensitivity defines the proportion of sick patients who receive a positive diagnosis result when diagnosed with the disease, ie the diagnosis correctly indicates the disease. Specificity:
  • Specificity is defined as the proportion of healthy patients who receive a negative diagnosis result when diagnosed with the disease, i.e. the diagnosis correctly indicates that there is no disease.
  • the invention comprises a method for the detection of a neurological, in particular a chronic dementia, in particular of Alzheimer's disease or a predisposition to such a disease by identifying one or more VGF peptides which are of the sequence with the gene bank accession No. NM_003378 or Accession No. Y12661 of the DNA Data Bank of Japan are derived in a biological sample from an individual. Since these VGF peptides are thought to be causal with the disease
  • the present invention also includes the use of these peptides for the therapy of Alzheimer's disease or related neurological diseases.
  • These peptides or peptide fragments are called “VGF derived Alzheimer related peptide "(VGFARP) and are numbered VGFARP-1 to VGFARP-38.
  • the two VGF protein variants NM_003378 and Y12661 differ only in 13 positions of their amino acid sequence and VGF peptides were identified from both VGF proteins, one The VGFARP peptides VGFARP-11 and -32 come from the VGF variant with accession no.
  • the VGFARP peptides VGFARP-25, -30, -31, -36 and - 37 come from the VGF variant with the accession no. NM_003378 All other VGFARP peptides can be derived from both VGF variants based on their amino acid sequence, since VGFARP peptides derived from two different VGF variants have been identified so far that there are other VGFARP peptides derived from these or other VGF variants, and these VGFARP peptides are also the subject of the invention.
  • the invention provides a method for the detection of Alzheimer's disease by determining the relative concentration of at least one marker peptide in a biological sample of a patient, compared to the concentration of the marker peptide in a control sample, in which the following points must be fulfilled: 1. At least one VGFARP peptide or a peptide that is derived from the nucleic acids with the accession numbers NM_003378 or Y12661 or homologous sequences is used as the marker peptide. 2. A specific increase or decrease in the concentration of the marker peptide in the patient's sample relative to the concentration of the marker peptide in the control sample occurs for the respective marker peptide. 3.
  • a significant change in the concentration of the marker peptide in the aforementioned manner is regarded as a positive detection result for a neurological disease, preferably Alzheimer's disease.
  • a neurological disease preferably Alzheimer's disease.
  • only a rise in the peptide concentration in Alzheimer's disease patients can occur for a certain VGFARP peptide, or in principle only a decrease in the peptide concentration in Alzheimer's disease patients can occur for this VGFARP peptide.
  • an increased VGFARP petid concentration cannot occur simultaneously in an individual Alzheimer's patient and in another Alzheimer's patient a reduced concentration relative to the control group.
  • VGFARP peptides which can be regarded as fragments of the VGF sequence are referred to as VGFARP peptides. They include homologous peptides derived from the VGF. They include descendants of naturally occurring alleles of these peptides and homologous mutants, in particular point-mutated mutants with preferably no more than two amino acids other than VGF.
  • Preferred markers according to the invention are given in the sequence listing and are labeled VGFARP-1 to VGFARP-38, according to Seq. ID 1 to 35 named.
  • the sequences of the VGFARP peptides are shown in Figure 1 and Table 1. The assignment of the VGFARP peptides to their respective Seq. ID No. is shown in Table 1.
  • the method according to the invention is a method in which specific biomarkers are detected, in the case of neurodegenerative diseases, in particular in Alzheimer's disease, the concentration of which has changed and which also indicate the disease at a very early stage and an increased risk of disease. This is important in order to provide a reliable clinical marker for the diagnosis of these diseases.
  • the concentration of the VGFARP peptides in the sample can preferably be correlated with the severity of the disease.
  • These new markers therefore make it possible to develop and monitor therapies for the treatment of Alzheimer's disease, since the course and a possible healing success due to a therapy or a reduced progression of the disease can be determined.
  • An effective therapy for Alzheimer's disease is currently not possible, which underlines the urgency of providing a safe detection method for Alzheimer's disease, since reliable detection of the disease is a prerequisite for the development of a therapy.
  • VGFARP peptides also makes it possible to select, within the scope of clinical studies for the development of new therapies for the treatment of Alzheimer's disease with high specificity, only those patients who are suffering from Alzheimer's disease and not from other diseases. This is important in order to obtain meaningful study results. Patients misdiagnosed as Alzheimer's disease negatively affect the quality of the results of an Alzheimer's therapy study.
  • the detection of VGFARP peptides enables stratification of patients, whereby subgroups of Alzheimer's disease patients can be specifically selected for specific diseases Alzheimer's therapy strategies or clinical studies are particularly suitable.
  • VGFARP peptides In Alzheimer's disease, the concentrations of VGFARP peptides have changed significantly, relative to healthy individuals. Another aspect of the invention is therefore to bring the VGFARP concentrations in Alzheimer's patients to normal concentrations. This procedure can be used to treat Alzheimer's disease or related neurological diseases. With increased VGF protein or VGFARP peptide concentrations, the concentrations of these substances can be increased by therapeutic administration of e.g. VGF protein or VGFARP peptide-specific antibodies or VGF-specific antisense nucleic acids, ribozymes or triplex nucleic acids or VGFARP peptide antagonists, VGF protein antagonists can be reduced.
  • VGF protein or VGFARP peptide-specific antibodies or VGF-specific antisense nucleic acids, ribozymes or triplex nucleic acids or VGFARP peptide antagonists VGF protein antagonists can be reduced.
  • substances can also be administered which suppress the body's own expression of VGF protein or the processing of VGF protein into VGFARP peptides. If there is a lack of VGF protein or VGFARP peptides as the cause of the disease, therapeutic administration of VGF protein, VGFARP peptides, VGFARP peptide agonists or VGF protein agonists can be carried out.
  • the body's own production of VGF protein or VGFARP peptides can be achieved through the therapeutic administration of substances such as e.g. NGF, BNDF or NT-3 or other suitable substances can be increased as this
  • the invention therefore also includes the use of VGF proteins, VGFARP peptides, VGFARP peptide agonists and antigens. gonists, VGF protein agonists and antagonists, anti-VGF
  • antibody fragments, antibody fusion proteins, or other substances which bind selectively to VGF proteins, VGFARP peptides, NGF, BNDF or NT-3 can also be used.
  • proteins and peptides mentioned fusion proteins of the proteins mentioned can also be used.
  • the invention also includes the use of antisense nucleic acids, triplex nucleic acids and ribozymes which modulate the expression of the proteins and peptides mentioned.
  • the invention also includes agonists and antagonists which modulate the activity of the proteins mentioned.
  • VGF peptides, VGF proteins, nucleic acids, agonists or antagonists can be modified in such a way that they become, for example, lipophilic, which favors the passage into the subarachnoid space. This can be achieved by inserting hydrophobic molecular constituents or also by “packaging” the substances in hydrophobic agents, for example liposomes.
  • peptide sequences can be added to these peptides, proteins, nucleic acids, agonists or antagonists, which convert in the subarachnoid space favor or, conversely, make it difficult to move out of the subarachnoid space.
  • the invention also encompasses the administration of the said therapeutic agents in various ways, e.g. as an intravenous injection, as an orally administrable substance, as an inhalable gas or aerosol, or the administration in the form of direct injection into the subarachnoid space, or into tissues such as muscle, fat, brain, etc.
  • This can increase the biological availability and effectiveness of these therapeutic agents ,
  • Peptides or proteins that are administered orally can be protected against porteolytic degradation in the stomach by acid-resistant capsules. Strongly hydrophobic substances can be made more hydrophilic by suitable galenical preparations and therefore more suitable for e.g. intravenous injections, etc.
  • Another embodiment of the invention is the use of VGFARP peptides or VGF proteins to identify receptors that selectively bind these molecules. These receptors can also be modulated by administration of agonists or antagonists, which is expedient for the therapy of neurological diseases, in particular of Alzheimer's disease.
  • positions in the VGF protein can be experimentally detected for the first time at which the VGF protein is processed in vivo.
  • These processing sites are, based on the VGF protein sequence from NM_003378, the following sequence positions: 371/372, 418/419, 479/480, 480/481, 481/482, 482/483 and 483/484.
  • the following processing sites are involved: 371/372, 419/420, 480/481, 483/484, 484/485 and 485/486. All experimental identified positions of dosing represent dibasic
  • prohormone convertases convert prohormones to hormones, which creates new biologically active substances (peptide hormones).
  • biologically active peptides generated from their pro forms in this way are proNGF / NGF, proBDNF / BNDF etc. [1].
  • the VGFARP peptides according to the invention are peptide hormones which are suitable as targets for therapeutic agents in connection with neurological diseases, preferably Alzheimer's disease.
  • the modulation of the VGFARP peptide concentrations can thus be used for the therapy of neurological diseases, preferably Alzheimer's disease.
  • VGF proteins identified in the context of this invention are selectively synthesized as approximately 68 kDa proteins in neuroendocrine and neuronal cells, their expression decreasing with increasing age [2].
  • VGF gene deficient mice it was found that important functions in energy metabolism are affected [3].
  • VGF gene deficient mice are small in size, hypermetabolic and hyperactive.
  • VGF is also synthesized in the insulin-producing islet cells of the pancreas.
  • VGF was discovered when examining a rat pheochromocytoma cell line (PC12 cell line) and the stimulation of this This cell line with "nerve growth factor” (NGF) causes a
  • NGF is an important growth factor that regulates the differentiation of the peripheral and central nervous system.
  • Other factors that regulate VGF expression are the "brain-derived neurotrophic factor” (BDNF) and neurotropin-3 (NT-3) [6].
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • NT-3 neurotropin-3
  • VGF-mRNA is caused by neuronal activity, neuronal injuries and by biological Rhythm (circadian clock) regulates [2, 7-9].
  • VGF is proteolytically processed with increasing differentiation of neuronal cells via neuronally expressed endoproteases, which presumably recognize basic amino acids.
  • endoproteases As Trani et al. C-terminal VGF peptides with masses of 20, 18 and 10 kDa could be shown [10]. This VGF
  • VGFARP peptides we identified, however, surprisingly represent fragments with a molecular weight significantly lower than 10 to 20 kDa and are therefore different from those of Trani et al. VGF peptides described. In addition, Trani et al.
  • VGF peptides that recognize VGF epitopes that are different from the sequences of the VGFARP peptides.
  • the peptides we have identified represent new VGF processing products that have not yet been described.
  • the concentrations of the VGFARP peptides can be in one for each peptide specific way in the patient group relative to the control group either consistently increased or consistently decreased. So far, only other VGF peptides of unknown sequence, derived from the C-terminal region of the VGF protein and with a significantly higher molecular weight than the peptides newly identified by us and sequenced for the first time, were known [10].
  • the chronic dementia disease detected by the method according to the invention is preferably Alzheimer's disease. So far, the change in the concentration of the peptides and peptide fragments according to the invention has been demonstrated in Alzheimer's patients. From this it can be concluded that the peptides according to the invention can be used for the detection and therapy of Alzheimer's disease and related neurological diseases.
  • the identification preferably focuses on certain peptide fragments of the VGF proteins with the GeneBank Accession No. NM_003378, or the DDBJ Accession No. Y12661 i.e. for peptides that comprise partial sequences of these VGF proteins.
  • VGF peptides VGF protein fragments
  • VGFARP VGF derived Alzheimer related peptides
  • Figure 1 The sequences of the peptides determined by us are given in the sequence listing.
  • VGF peptides For the first time, we have detected various VGF peptides in biological samples, derived from two VGF protein variants. These peptides, designated VGFARP-1 to VGFARP-38, represent defined fragments of VGF proteins. These Fragments occur naturally in nature and have not previously been described in the literature. These fragments are different from peptides, which are often produced in the literature by in vitro proteolysis (by adding proteases such as trypsin). They thus represent new, previously unknown substances. These peptides were initially enriched and purified from biological samples using reverse phase chromatography and then separated from accompanying other peptides by mass spectrometry, so that these VGFARP peptides could then be sequenced.
  • sequences of the peptides in the single letter amino acid code are as follows:
  • * rl represents a sequence which corresponds to the sequence or parts of the sequence of the VGF protein from amino acid 49-23, where rl, starting from amino acid 50 of the VGF protein, can be between 0 and 27 amino acids long.
  • r2 represents the VGF protein sequence from amino acid 58 to 64 or parts thereof, where r2, starting from VGF amino acid 57, can be between 0 and 7 amino acids long.
  • the other peptide chains r3 to rl6 are composed according to the scheme exemplified above.
  • ** VGFARP-12 was identified as an unoxidized and as a single oxidized peptide (molecular weight increased by approx. 16 Dal- ton) identified.
  • the peptides can be in post-translational or chemical modification forms, which can be on their masses and thus the mass spectrometric identification and also on the elution behavior in chromatography, e.g. in reverse phase chromatography.
  • the peptides can be glycosylated, phosphorylated, sulfated, amidated, oxidized, etc. in the sample to be examined.
  • Modified peptides are preferably present as peptide oxide, e.g. the peptide VGFARP-12, which was identified both as an unmodified peptide and as a peptide oxide.
  • the peptides are also regarded as VGFARP peptides in particular when individual amino acids differ from the corresponding sequence of the VGF protein, in particular when a maximum of 2 amino acids differ from the VGF protein sequence. Point mutations, deletions, internal insertions of amino acids, and N- and C-terminal extensions are permissible as long as the VGFARP peptide sequence contains at least 8 amino acids that are conserved relative to the amino acid sequence of the associated VGF protein, i.e. are unchanged.
  • a further development of the invention provides that the concentration of the identified peptide (s) for each of these peptides is increased or decreased in a specific manner relative to the concentration of the respective peptide in a control sample.
  • Concentration of the control sample can be used to determine the severity of the disease.
  • the control sample can be a pool sample of different different controls.
  • the sample to be examined can also be a pool sample, with individual examinations subsequently being carried out if the result is positive.
  • the biological sample can preferably be cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid, CSF) or a sample such as serum, plasma, urine, stool, tear fluid, synovial fluid, sputum etc. This depends, among other things. on the sensitivity of the chosen detection method (mass spectrometry, ELISA etc.). Homogenized tissue samples, tissue sections and biopsy specimens can also be used if necessary. It is therefore provided in a further embodiment of this invention that tissue homogenates are prepared for the preparation of the sample to be examined, e.g. from human tissue samples obtained from biopsies. These tissues can e.g.
  • aqueous solutions with e.g. 0.1 to 0.2 M acetic acid can be boiled for 10 minutes.
  • the extracts are then subjected to the respective detection method, e.g. subjected to a mass spectrometric examination.
  • the samples can be prepared in the usual way, e.g. optionally diluted or concentrated, and stored.
  • the invention comprises the use of at least one of the VGFARP peptides according to the invention or a VGF protein for the diagnosis of neurological diseases, in particular chronic dementia diseases, in particular Alzheimer's disease, and the use of VGFARP peptides for the production of antibodies or of other agents which are suitable for the development of diagnostic reagents for the detection of these diseases due to their VGFARP peptide-specific binding properties.
  • the invention also encompasses the use of VGFARP peptides to obtain phage particles which specifically bind these peptides or which, conversely, present VGFARP peptides on their surface and thus enable the identification of binding partners such as, for example, receptors of VGF proteins or VGFARP peptides.
  • VGFARP peptides can be used within the scope of the invention. All methods that make it possible to specifically detect VGFARP peptides in a patient's sample are suitable for this. Suitable methods include physical methods such as e.g. Mass spectrometry or liquid chromatography, molecular biological methods such as Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or immunological detection techniques, e.g. "Enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA).
  • physical methods such as e.g. Mass spectrometry or liquid chromatography
  • molecular biological methods such as Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or immunological detection techniques, e.g. "Enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA).
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • ELISA Enzyme linked immunosorbent assays
  • One embodiment of the invention is the use of physical methods which can indicate the peptides according to the invention qualitatively or quantitatively. These methods include mass spectrometry, liquid chromatography, thin-layer chromatography, NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy, etc.
  • quantitative measurement results are obtained from a sample to be examined with the measurement values that are present in a group of neurological diseases, in particular chronic dementia Diseases, preferably Alzheimer's disease, suffering patients and a control group were compared. From these results, the presence of a neurological disease, in particular a chronic dementia disease, in particular Alzheimer's disease and / or the severity of this disease can be derived.
  • the peptides in the sample are chromatographically separated before identification, preferably with reverse phase chromatography, and separation of the peptides in the sample with high-resolution reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) is particularly preferred.
  • RP-HPLC reverse phase high-performance liquid chromatography
  • Another embodiment of this invention is to carry out precipitation reactions to fractionate the sample using precipitants such as e.g. Ammonium sulfate, polyethylene glycol, trichloroacetic acid, acetone, ethanol etc. The fractions obtained in this way are then individually subjected to the respective detection method, e.g. the mass spectrometric examination.
  • Another embodiment of the invention is the use of liquid phase extraction. For this, the sample is e.g.
  • an organic solvent such as polyethylene glycol (PEG) and an aqueous saline solution. Due to their physical properties, certain constituents of the sample accumulate in the organic phase and others in the aqueous phase and can thus be separated from one another and then further analyzed.
  • PEG polyethylene glycol
  • a particularly preferred embodiment of this invention comprises the use of reverse phase chromatography, in particular a C18 reverse phase chromatography column using eluents consisting of trifluoroacetic acid and acetonitrile, for the separation of peptides in human cerebrospinal fluid. For example, fractions are collected, each containing 1/100 of the volume of eluent used.
  • the fractions obtained in this way are analyzed using a mass spectrometer, preferably using a MALDI Mass spectrometers (matrix-assisted laser desorption ionization) using a matrix solution consisting of, for example, L (-) fucose and alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid, dissolved in a mixture of acetonitrile, water, trifluoroacetic acid and acetone, analyzed and so the presence of certain masses is determined and the signal intensity quantified.
  • MALDI Mass spectrometers matrix-assisted laser desorption ionization
  • the VGFARP peptides can be identified with the aid of a mass spectrometric determination, preferably a MALDI (matrix assisted laser desorption and ionization) mass spectrometry.
  • the mass spectrometric determination preferably further comprises at least one of the following mass signals, each calculated on the basis of the theoretical, monoisotopic mass of the corresponding peptide. Slight deviations from the theoretical, mono-isotopic mass can occur due to the experimental error and the natural isotope distribution.
  • a proton is added to the peptides in MALDI mass determinations due to the measurement method, which increases the mass by 1 dalton.
  • the method according to the invention identified new, specific peptides of VGF proteins (VGFARP peptides) and recognized their importance. These VGFARP peptides and their descendants are referred to here as VGFARP-1 to VGFARP-38. Your Sequences are given in the sequence listing.
  • the VGFARP peptides VGFARP-15, 16, -17, -27, -35, and VGFARP-38 can contain additional amino acids at the N- and / or C-terminus corresponding to the corresponding sequence of the associated VGF protein.
  • the invention also encompasses the VGFARP peptides produced recombinantly or synthetically and isolated from biological samples in unmodified, chemically modified or post-translationally modified form. Two point mutations as well as other deviations are possible as long as the VGFARP peptide has at least 8 amino acids which correspond in their identity and their position within the peptide sequence to a VGF protein.
  • the invention also encompasses nucleic acids which correspond to VGFARP peptides, and in particular those which correspond to the VGFARP peptides according to the invention, and their use for the indirect determination and quantification of the associated VGF proteins and peptides.
  • This also includes nucleic acids that e.g. non-coding sequences, such as 5 - or 3 * -untranslated regions of the mRNA, or nucleic acids, which have a sequence matching the nucleic acid sequence of VGF that is sufficient for specific hybridization experiments, and therefore for the indirect detection of the associated proteins, in particular the VGFARP Peptides are suitable.
  • An embodiment of this includes obtaining tissue samples, e.g. of biopsy specimens, from patients and the subsequent determination of the concentration of an RNA
  • Transcripts corresponding to the gene with the GeneBank Accession No. NM_03378 or Accession No. Y12661 of the "DNA Data Bank of Japan", DDBJ or corresponding to homologous VGF variants are quantitative measurement results (intensity ) from a sample to be examined with the measured values obtained from a group of patients suffering from Alzheimer's disease and a control group.
  • Methods such as reverse transcriptase polymerease chain reaction (RT-PCR), quantitative real-time PCR (ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), in situ hybridizations or Northern blots in a person skilled in the art can be used for quantification known manner can be applied.
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerease chain reaction
  • ABS quantitative real-time PCR
  • in situ hybridizations or Northern blots in a person skilled in the art can be used for quantification known manner can be applied.
  • the identification of the VGFARP peptides or the VGF proteins can be carried out using an immunological detection system, preferably an ELISA ("enzyme linked immunosorbed assay").
  • an ELISA enzyme linked immunosorbed assay
  • a so-called “sandwich ELISA” can furthermore preferably be used, in which the detection of the VGFARP peptides is based on the specificity of two antibodies that have different epitopes within the same mo - recognize leküls, is dependent.
  • VGFARP- enzyme linked immunosorbed assay
  • peptides or VGF proteins can also use other ELISA systems, e.g. find direct or competitive ELISA.
  • Other ELISA-like detection techniques such as RIA ("radio immuno assay"), EIA (enzyme immunoassay), ELI spot etc. are suitable as immunological detection systems
  • VGFARP peptides or VGF proteins isolated, recombinantly produced or chemically synthesized can be used as standard for the quantification.
  • the identification of the VGFARP peptide or peptides can, for example, commonly with the help of an antibody directed to the VGFARP peptide or VGF protein.
  • Other methods suitable for such detection include western blotting, immunoprecipitation, dot blots, plasmon resonance spectrometry (BIACORE ® technology, Biacore International AB, Uppsala,
  • phage particles eg ABICAP technology, ABION Society for Biosciences and Technology mbH, Irishlich, Germany
  • affinity matrices eg ABICAP technology, ABION Society for Biosciences and Technology mbH, Irishlich, Germany
  • all substances / molecules are suitable as detection agents that allow one to build a specific detection system because they specifically bind a VGFARP peptide or VGF protein.
  • Another embodiment of the invention is the production of VGFARP peptides using recombinant expression systems, chromatography methods and chemical synthesis protocols, which are known to the person skilled in the art.
  • the VGFARP peptides obtained in this way can be used, inter alia, as standards for the quantification of the respective VGFARP peptides or as an antigen for the production of VGFARP peptide antibodies.
  • Recombinant expression of pepids is one of the methods known and suitable to the person skilled in the art for isolating and obtaining VGFARP peptides.
  • VGFARP peptides Cell systems such as bacteria such as Escherichia coli, yeast cells such as Saccharomyces cerevisiae, insect cells such as Spodoptera frugiperda (Sf-9) cells, or mammalian cells such as "Chinese Hamster Ovary" (CHO) cells can be used for the expression of the VGFARP peptides Cells are available from the American Tissue Culture Collection (ATCC).
  • ATCC American Tissue Culture Collection
  • nucleic acid sequences which code for VGFARP peptides are used in combination with suitable regulatory nucleic acid sequences such as, for example, promoter sequences. Ren, antibiotic selection markers, etc. inserted into an expression vector using molecular biological methods.
  • a suitable vector is, for example, the vector pcDNA3.1 from Invitrogen.
  • the VGFARP peptide expression vectors obtained in this way can then be inserted into suitable cells, for example by electroporation.
  • the VGFARP peptides produced in this way can be C- or N-terminal with heterologous sequences of peptides such as poly-histidine sequences, He agglutinin epitopes (HA-tag), or proteins such as maltose-binding proteins, glutathione-S-transferase (GST), or Protein domains such as the GAL-4 DNA binding domain or the GAL4 activation domain are fused.
  • the VGFARP peptides can be prepared by chemical synthesis, for example according to the Merrifield solid-phase synthesis protocol, using synthesizers which are available from various manufacturers.
  • a further embodiment of this invention is the isolation of VGFARP peptides from biological samples or from cell culture media or cell lysates from recombinant expression systems, for example with reverse phase chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, isoelectric focusing, etc. or with other methods such as preparative immunoprecipitation, Ammonium sulfate precipitation, extraction with organic solvents, etc.
  • a further embodiment of the invention is the production of monoclonal or polyclonal antibodies using VGFARP peptides. The antibodies are obtained in a customary manner familiar to the person skilled in the art.
  • a preferred embodiment is the production and recovery of VGFARP peptide-specific antibodies
  • a particularly preferred embodiment is the production of VGFARP peptide-specific antibodies which recognize neo-epitopes, that is to say epitopes which are only present on VGFARP peptides but which are not in a VGF protein.
  • Such anti-VGFARP peptide antibodies enable provided specific immunological evidence of VGFARP-
  • Polyclonal antibodies can be produced by immunizing experimental animals such as mice, rats, rabbits or goats. Monoclonal antibodies can be obtained, for example, by immunizing experimental animals and then using hybridoma techniques, or else using recombinant test approaches, such as, for example, using antibody banks such as the HuCAL ® antibody bank from MorphoSys, Martinsried, Germany, or other recombinant production processes known to the person skilled in the art be won. Antibodies can also be used in the form of antibody fragments, such as Fab fragments or Fab2 fragments, etc.
  • Another application example is the quantitative or qualitative determination of the abovementioned VGFARP peptides or VGF proteins for assessing the effectiveness of a therapy in development against neurological diseases, in particular chronic dementia diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • the invention can also be used to identify suitable patients for clinical studies to develop therapies for these diseases, particularly Alzheimer's disease.
  • the quantitative measurement results from a sample to be examined are compared with the measurement values obtained from a control group and a group of patients.
  • the effectiveness of a therapeutic agent or the suitability of the patient for a clinical study can be derived from these results.
  • the efficacy test and the selection of the right patients for therapies and for clinical studies is of outstanding importance for the successful application and development of a therapeutic agent and so far there is no clinically measurable parameter available for Alzheimer's disease that reliably enables [12].
  • VGF proteins vascular endothelial growth factor proteins
  • VGFARP peptides and agents that modulate the expression and bioavailability of these substances
  • An embodiment of this includes the cultivation of cell lines and their treatment with VGF proteins, VGFARP peptides or with substances which promote the expression of VGF protein, such as e.g. Promote NGF, BNDF or NT-3, or the processing of VGF protein to VGFARP peptides, e.g. Prohormone.
  • VGF protein and VGFARP peptides in connection with neurological diseases, in particular Alzheimer's disease, can be determined.
  • Fusion proteins and fusion peptides can also be used to treat the cell lines, e.g.
  • Fusion proteins consisting of prohormone convertases fused with peptide sequences that promote transport of the fusion protein into the interior of the cell.
  • prohormone convertases are HIV-TAT sequences or antenna napedia sequences, etc.
  • cell lines can be transfected with expression vectors which directly or indirectly cause expression of VGF protein or VGFARP peptides by the transfected cells.
  • expression vectors can encode, inter alia, for VGFARP peptides, VGF proteins, NGF, BNDF, NT-3 or for prohormone convertases. The transfection of combinations of the proteins mentioned can also be carried out.
  • suitable cell lines with anti-VGF protein or anti-VGFARP peptide antibodies or with nucleic acids which suppress the expression of VGF such as, for example, VGF antisense nucleic acids, VGF triplex nucleic acids or ribozymes directed against VGF mRNA .
  • VGF antisense nucleic acids such as, for example, VGF antisense nucleic acids, VGF triplex nucleic acids or ribozymes directed against VGF mRNA
  • VGF antisense nucleic acids such as, for example, VGF antisense nucleic acids, VGF triplex nucleic acids or ribozymes directed against VGF mRNA
  • VGF anti-NGF, anti-BNDF or anti-NT-3 antibodies could also be used to suppress VGF protein expression.
  • cell lines that are considered neurological Model systems in connection with VGF appear suitable can be used for such investigations.
  • Tests that can be used as read-out systems for these examinations include the rate of proliferation of the treated cells, their metabolic activity, the rate of cell apoptosis, changes in cell morphology, the expression of cell-specific proteins or reporter genes or the release of cytosolic cell components as a marker for cell death.
  • Suitable strains of experimental animals for example mice or rats, which are considered as a model for neurological diseases, in particular as a model for Alzheimer's disease, can be used as further test systems. These experimental animals can be used to investigate the effectiveness of therapy strategies which aim to modulate the concentration of VGFARP peptides or VGF proteins.
  • proteins and peptides such as, for example, VGF protein, VGFARP peptides, NGF, BNDF, NT-3, prohormone convertases etc. can also be investigated in experimental animals, these peptides and proteins possibly being galenically processed in such a way that they Brain barrier and / or the blood-liquor barrier can pass better.
  • Liposome-packed proteins and peptides, proteins and peptides fused with transport sequences, such as, for example, an HIV-TAT sequence, etc. can be used as a galenical preparation method.
  • peptides and proteins can be chemically modified in such a way that they acquire more lipophilic properties and can therefore penetrate cells more easily.
  • peptides that are only sparingly soluble in aqueous solutions can be chemically modified in such a way that they become more hydrophilic and can then be used, for example, as an intravenously injectable therapeutic agent.
  • Acid-resistant capsules can be used to protect sensitive substances in the stomach that are to be administered orally. Read-out parameters in experiments with animal models can
  • a memory test that is suitable for experimental animals is the "Morris water maze test”.
  • body function such as blood tests, the measurement of brain waves, metabolism test, the expression rate of VGF protein and VGFARP- can be used as further parameters.
  • FIG. 1 Alignment of the VGFARP peptides with the two known VGF proteins according to the database Accession No. NM_003378 and Y12661
  • Figure 2 Reverse phase chromatography for the separation and enrichment of the VGFARP peptides from liquor or cerebrospinalis
  • Figure 5 MS / MS fragment spectrum using the example of the peptide VGFARP-13
  • Figure 6a-C "Box whisker plots" for the quantitative comparison of the concentrations of VGFARP-1, VGFARP-2, VGFARP-18, VGFARP-3, VGFARP-4, VGFARP-5, VGFARP-6, VGFARP-7, VGFARP-19, VGFARP-20, VGFARP-21, VGFARP-10, VGFARP-22, VGFARP-28, VGFARP-29, VGFARP-30/32, VGFARP-31, VGFARP-12, VGFARP-13, VGFARP-36 VGFARP-37 in Alzheimer's disease patients compared with control patients.
  • FIG. 1 shows an alignment of the peptides according to the invention with two known variants of the VGF protein, which are shown in the figure with their database Accession No. NM_003378 and Y12661. Sequence positions that are identical in both variants of the VGF proteins are shown with an asterisk in the sequence of NM_003378. Differences in the sequences are shown by the amino acid code in white letters on a black background. The arrow at the end or at the beginning of partial sequences of VGFARP-12, -13 and 34 indicates that the respective sequence extends over two lines in the alignment.
  • Figure 2 shows a chromatogram, recorded with reverse phase chromatography according to Example 2, for the separation and enrichment of the VGF peptides from cerebrospinal fluid.
  • FIG 3 shows a spectrum that was obtained by MALDI mass spectrometric measurement according to Example 3 of VGFARP-7 with a theoretical, monoisotopic mass of 3686 Daltons, after reverse phase chromatography of human cerebrospinal fluid according to Example 2.
  • VGFARP- 7 corresponds to the VGF sequence (Accession No. Y12661) of amino acid 26-62.
  • Figure 4 shows by MALDI as relatively quantifying
  • Figure 5 shows an MS / MS fragment spectrum according to Example 4 of the peptide VGFARP-13 according to the invention.
  • VGFARP-13 corresponds to the VGF sequence (Accession No. Y12661) of amino acid 421-479.
  • Figures 6A to 6C show in the form of "box whisker plots" a comparison of the integrated MALDI mass spectrometric signal intensities of different
  • VGFARP peptides in controls compared to signal intensities in samples from Alzheimer's disease patients.
  • Example 1 Obtaining cerebrospinal fluid to determine VGFARP peptides
  • Cerebrospinal fluid or cerebrospinal fluid is that in the four brain ventricles and in the sub- fluid contained in the rachnoid space, mainly in the
  • Liquor cerebrospinalis is usually removed by lumbar puncture, more rarely by suboccipital puncture or ventricular puncture.
  • lumbar puncture spinal puncture
  • the spinal subarachnoid space between the 3rd and 4th or 4th and 5th lumbar spinous process is punctured with a long hollow needle and puncture is obtained.
  • the sample is then centrifuged for 10 minutes at 2000x g and the supernatant is stored at minus 80 ° C.
  • Reverse phase chromatography is used as the separation process.
  • Various RP chromatography resins and eluents are equally suitable.
  • the following is an example of the separation of VGF peptides using a C18 reverse phase chromatography column with the size 4 mm ⁇ 250 mm from Vydac.
  • the following compositions were used: solvent A: 0.06% (v / v) trifluoroacetic acid, solvent B: 0.05% (v / v) trifluoroacetic acid, 80% (v / v) acetonitrile.
  • Chromatography was carried out at 33 ° C. using an HP ChemStation 1100 from Agilent Technologies with a flow cell Micro from Agilent Technologies.
  • Human cerebrospinal fluid was used as the sample. 440 ⁇ l CSF were diluted to 1650 ⁇ l with water, the pH to 2-3 adjusted, the sample was centrifuged for 10 minutes at 18000x g and finally 1500 ⁇ l of the sample prepared in this way were applied to the chromatography column.
  • the chromatography conditions were as follows: 5% solvent B at the time 0 min., From time 1 to 45 min continuous increase in the solvent B concentration to 50%, from time 45 to 49 min continuous increase in the solvent B concentration to 100% and then to at the time 53 min 100% buffer B constant. 10 minutes after the beginning of the chromatography, 96 fractions of 0.5 ml each are started.
  • the chromatogram of a cerebrospinal fluid sample, produced under the test conditions described here, is shown in Figure 2.
  • Example 3 Determination of the masses of peptides using MALDI mass spectrometry
  • MALDI-TOF mass spectrometers are manufactured by PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager-DE, Voyager-DE PRO or Voyager-DE STR) or by Bruker Daltonik GmbH (BIFLEX).
  • a matrix substance typically consists of an organic acid.
  • Typical matrix substances which are suitable for peptides are 3, 5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid and 2, 5-dihydroxybenzoic acid.
  • a lyophilized equivalent obtained according to reverse phase chromatography, corresponding to 500 ⁇ l human cerebrospinal fluid, is used.
  • the chromatographed sample is dissolved in 15 ⁇ l of a matrix solution.
  • This matrix solution contains, for example, 10 g / 1 ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid and 10 g / 1 L (-) fucose dissolved in a solution.
  • mixed solvent consisting of acetonitrile, water, trifluoroacetic acid and acetone in a volume ratio of 49: 49: 1: 1.
  • 0.3 ⁇ l of this solution are transferred to a MALDI carrier plate and the dried sample is analyzed in the MALDI mass spectrometer Voyager-DE STR from PerSeptive Biosystems. The measurement is carried out in "Linear Mode" with "Delayed Extraction” TM.
  • Figure 3 shows an example of a measurement of one of the VGFARP peptides according to the invention.
  • MALDI-TOF mass spectrometry can be used to quantify peptides such as of the VGFARP peptides according to the invention are used when these peptides are present in a concentration which is in the dynamic measuring range of the mass spectrometer, thereby avoiding detector saturation. This is the case for the measurement of the VGFARP peptides according to the invention in cerebrospinal fluid with a liquor equivalent concentration of 33.3 ⁇ l per ⁇ l matrix solution. There is a specific relationship between the measurement signal and the concentration for each peptide, which means that MALDI mass spectrometry can preferably be used for the relative quantification of peptides. This is shown in Figure 4.
  • a VGFARP peptide ion is selected in the mass spectrometer on the basis of its specific m / z (mass / charge) value in a manner known to the person skilled in the art in the mass spectrometer. This selected ion is then extracted by applying collision energy with a collision gas, e.g. Helium or nitrogen, fragmented and the resulting VGFARP peptide fragments detected in the mass spectrometer in an integrated analysis unit and corresponding m / z values determined (principle of tandem mass spectrometry) [13].
  • a collision gas e.g. Helium or nitrogen
  • the fragmentation behavior of peptides enables a mass accuracy of e.g. 50ppm an unambiguous identification of the VGFARP peptides according to the invention using computer-assisted search methods [14] in sequence databases in which the sequence of a VGF protein was entered.
  • the mass spectrometric analysis was carried out using a quadrupole TOF instrument, model "QStar-Pulsar” from Applied Biosystems-Sciex, USA. Exemplary MS / MS fragment spectra are shown in Figure 5.
  • Example 5 Mass spectrometric quantification of VGFARP peptides to compare their relative concentration in control samples compared to patient samples
  • a subsequent MALDI measurement of the VGFARP peptides according to the invention according to Example 3 was carried out.
  • Exemplary MALDI signal intensities are visualized in the form of "box whisker plots" in Figures 6A to 6C.
  • the "box whisker plots" shown in Figure 6 are based on measured values, each based on 29 to 45 samples of Alzheimer's disease patients, or 13 to 44 control samples per experiment were carried out. A total of 4 experiments were carried out.
  • the "box whisker plots” shown enable comparison of the integrated MALDI mass spectrometric signal intensities of various VGFARP peptides in controls with the MALDI signal intensities in samples from Alzheimer's disease patients.
  • the “box” includes the columns in the diagrams in FIGS. 6A to 6C, the area of the MALDI signal intensities, in which 50% of the respective MALDI signal intensities are located, the lines pointing upwards and downwards from the “box” (“whiskers”) indicate the area, which contains the 25% of the measured values with the highest signal intensities (upper quartile) or the 25% of the measured values with the lowest signal intensities (lower quartile).
  • the solid line in the columns indicates the median and the dashed line in the columns indicates the mean.
  • VGF a novel role for this neuronal and neuroendocrine polypeptide in the regulation of energy balance. Front neuroendocrinol. 21: 199-219.
  • VGF vascular endothelial growth factor

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft definierte Peptide und deren quantitative Bestimmung in biologischen Proben von Patienten, die an Morbus Alzheimer erkrankt sind, relativ zu deren Konzentration in einer Kontrollgruppe. Ausserdem betrifft die Erfindung die Verwendung der Peptide zu therapeutischen Zwecken. Die erfindungsgemässen Peptide entstammen aus einem Proteinvorläufer mit dem korrespondierenden Gen und sind in spezifischer Art und Weise prozessiert und postranslational modifiziert. Änderungen der Konzentrationen dieser Peptide zeigen eine Morbus Alzheimer Erkrankung an. Dabei ist die Richtung der Konzentrationsänderung für jedes dieser Peptide spezifisch. Der Nachweis von Morbus Alzheimer erfolgt durch eine Identifizierung der Peptide einzeln oder in Kombinationen. Die Erfindung findet darüber hinaus Verwendung zur Verlaufskontrolle von Morbus Alzheimer, zur Prognose und zur Entwicklung von Therapeutika gegen Morbus Alzheimer.

Description

Verfahren zum Nachweis chronisch-demenzieller Erkrankungen, zugehörige Peptide und Nachweisreagenzien
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer chronischen, demenziellen Erkrankung oder einer Veranlagung für eine chronisch-demenzielle Erkrankung, insbesondere von Morbus Alzheimer oder verwandten neurologischen Erkrankungen, z.B. Lewy-Body Demenz oder vaskulare Demenz. Weiterhin betrifft die Erfindung Peptide, die für den Nachweis des vorhanden seins dieser Erkrankungen, zur Verlaufskontrolle der Erkrankungen und des Grades der Erkrankungen aufgefunden wurden. Außerdem betrifft die Erfindung Nachweisreagenzien wie Antikörper und Nukleinsäuren und dergleichen, über die diese Peptide, bzw. die entsprechenden Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Weiterhin betrifft die Erfindung pharmzeutische Anwendungen, die VGF, VGF-Peptide, VGF-Antikörper, VGF-Nukleinsäuren, VGF- Protein-Antagonisten, VGF-Protein-Agonisten, VGF-Peptid- Agonisten oder VGF-Peptid-Antagonisten beinhalten, zur Therapie oder Prophylaxe von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer. Weiterhin betrifft die Erfindung Methoden zur Ermittlung von Patienten mit neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, die geeignet sind, an klinischen Studien zur Untersuchung dieser Erkrankungen teil zu nehmen.
Bei den Peptiden handelt es sich um Fragmente des Proteins VGF, das auch als „neuroendocrine specific protein VGF" be- zeichnet wird. In der Literatur wird die Abkürzung VGF auch für das Protein „vaccinia growth factor" oder für „vaccinia virus growth factor" und für "Vascular Permeability Factor" verwendet, wobei diese Proteine nicht dem VGF-Protein entsprechen, das Gegenstand dieser Erfindung ist. Demenzielle Erkrankungen stellen in den Industrieländern aufgrund der höheren durchschnittlichen Lebenserwartung ein zunehmendes Problem dar. Demenzielle Erkrankungen sind größtenteils nicht heilbar und machen eine langanhaltende Pflege der Erkrankten erforderlich. Etwa die Hälfte dieser Patienten wird stationär gepflegt. Es sind mehr als 60 demenzielle Erkrankungen bekannt, einschließlich solcher Erkrankungen, die demenzielle Erscheinungen mit sich bringen.
Hiervon entfallen jedoch ca. 65 % auf Morbus Alzheimer (Alz- heimersche Krankheit , AD, Alzheimer' s Disease), deren Diagnose und Therapie deshalb ein hoher Stellenwert zukommt. Neben Morbus Alzheimer sind unter anderem folgende nicht-Alzheimer- Demenzen bekannt: die vaskulare Demenz, die Lewy-Body Demenz, die Binswanger-Demenz sowie Demenzielle Erkrankungen, die als Begleiteffekt anderer Krankheiten, wie Parkinsonscher Krankheit, Huntington-Desease, Pick' s-Disease, Gerstmann- Sträussler-Scheinger-Krankheit , Kreuzfeldt-Jakob-Krankheit usw. vorkommen.
Morbus Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung, die sich durch folgende Symptome auszeichnet: Abnahme der geistigen Fähigkeiten, Konfusion und herabgesetzte Selbsterhaltungs- und Selbstbetreuungsfähigkeit. Insbesondere ein stark eingeschränktes Kurzzeitgedächtnis ist charakteristisch für Morbus Alzheimer, während lange zurückliegende Erinnerungen des Patienten, z.B. an die eigene Kindheit, durch die Erkrankung weit weniger beeinträchtigt werden. Morphologisch kommt es zu Ver- änderungen im Gehirn, die sich u.a. in Form von Amyloidablage- rungen und degenerierten Nervenzellen äußern. Die morphologischen Veränderungen können nach dem Tode des Patienten histo- logisch diagnostiziert werden und sind bis heute der einzige sichere Nachweis der Erkrankung. Diese histopathologischen Diagnosen beruhen auf Kriterien, die das "Consortium to Esta- blish a Registry for Alzheimer' s Disease" (CERAD) festgelegt hat. Zur Diagnose von Morbus Alzheimer werden derzeit folgende kriterienbasierte Diagnosesysteme verwendet: Die "Internatio- nal classification of Diseases, lOth revision" (ICD-10) , das
„Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition" (DSM-IV) der „American Psychiatrie Association" , und die vom "National Institute of Neurological and Communicative
Disorders Association" NINCDS-ADRDA aufgestellten "Work Group crieria" .
Diese Systeme verwenden eine Reihe von neuropsychologischen Tests, um eine Morbus Alzheimer Diagnose treffen zu können, nicht jedoch objektiv messbare klinische Parameter.
Die Diagnose von Morbus Alzheimer ist auch deshalb schwierig, da sie, ebenso wie andere demenzielle Erkrankungen, schleichend einsetzt und mit langsam fortschreitender Zerstörung von Nervenzellen im Gehirn verbunden ist.
Derzeit steht keine ursächliche Therapie zur Behandlung von Morbus Alzheimer zur Verfügung. Die Erkrankung wird lediglich symptomatisch z.B. durch die Gabe von Neurotransmittern wie Acetylcholin behandelt. Als weitere möglichen Therapiestrate- gien werden derzeit die Gabe von Antioxidantien, von Radikal- fängern, von Calciumkanalblockern, von anti-inflammatorischen Substanzen, von Secretaseinhibitoren, von anti-Amyloid- Antikörpern usw. sowie die Immunisierung gegen Amyloid-Peptide erprobt. Es ist bisher aber noch keine ursächliche Therapie dieser Erkrankung möglich.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Nachteile bei der Morbus Alzheimer Diagnose im Stand der Technik zu vermeiden und ein frühzeitig und zuverlässig anwendbares Verfahren zum Nachweis chronisch-demenzieller Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, zur Verfügung zu stellen. Außerdem liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Therapie zur Behandlung von Morbus Alzheimer zur Verfügung zu stellen, da bisher nur unbefriedigende Therapieansätze zur Behandlung von Morbus Alzheimer zur Verfügung stehen.
Definitionen:
VGF-Proteine oder Peptide entsprechend den Accession Nr. NM_003378 und Y12661:
Die von den Nukelinsäuresequenzen NM_003378 und Y12661 abge- leiteten Peptide werden auch als VGF-Proteine bezeichnet und schließen alle natürlich vorkommenden Allele, Mutanten und Po- lymorphismen von VGF-Proteinen sowie gewebespezifisch expre- mierte VGF-Varianten ein. Insbesondere sind auch VGF-Varianten eingeschlossen die aufgrund von Erkrankungen oder als Folge von neurologischen Erkrankungen, insbesondere chronisch demen- zeillen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer auftreten. Eingeschlossen sind sowohl VGF-Proteine mit, als auch ohne Signalsequenz, Pro-Formen von VGF-Proteinen die noch nicht prozessiert sind, sowie bereits prozessierte VGF-Proteine, lösliche VGF-Proteine und membranständige VGF-Proteine, wobei die membranständigen VGF-Proteine sowohl über transmembranare Aminosäuresequenzen mit einer Zeil- oder Organellmembran verbunden sein können, als auch über eine postranslationale Modifikation, z.B. einen Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol (GPI) -Anker. Ferner sind eingeschlossen Variationen der VGF-Sequenz, die durch alternatives Splicing, durch alternative Translationsstart- und -endpunkte, durch RNA-Editing, durch alternative postranslationale Modifizierungen, sowie weitere durch in der Natur vorkommende Mechanismen entstandene VGF-Protein- Varianten. VGFARP-Peptide:
Nachfolgend werden VGF-Peptide und VGF-Peptid-Varianten als VGFARP- ("VGF Alzheimer related peptide") Peptide bezeichnet. VGFARP-Peptide können sich von beiden eingangs genannten VGF- Sequenzen (NM_003378 und Y1266) sowie von weiteren VGF- Protein-Varianten, die möglicherweise in der Natur vorkommen, ableiten. Außerdem können VGFARP-Peptide zwei punktmutierte, zwei deletierte oder zwei zusätzlich intern eingefügte Ami- nosäuren, sowie N-terminale und/oder C-terminale Verlängerungen beinhalten. Dabei müssen sie jedoch mindestens 8 Aminosäuren aus der VGF-Proteinsequenz beibehalten. Als N- oder C- terminale Verlängerung kommen nur solche Aminosäuren in Frage, die in der VGF-Proteinsequenz an dieser Sequenzposition im VGF-Protein vorkommen. Außerdem werden Peptide, die sich aus natürlich vorkommenden VGF-Polymorphismen und aus natürlich vorkommenden VGF-Mutanten ableiten, als VGFARP-Peptide bezeichnet. VGFARP-Peptide können auch mit posttranslationalen Modifikationen, wie z.B. Glykosilierungen und Phosphorylierun- ge und/oder in chemisch modifizierter Form, vorzugsweise als
Peptid-Oxide, vorliegen. Zum Beispiel wurde VGFARP-12 sowohl als nicht oxidiertes, als auch als oxidiertes Peptid identifiziert .
Chemisch oder posttranslational modifizierte Peptide:
Ein chemisch oder posttranslational modifiziertes Peptid kann sowohl aus D- als auch aus L-Aminosäuren, sowie aus Kombinationen von D- und L-Aminosäuren bestehen. Außerdem können in diesen Peptiden ungewöhnliche Aminosäuren, d.h. Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standardaminosäuren gehören, enthalten sein. Als Beispiele für ungewöhnliche Aminosäuren sind unter anderem: alpha-Aminobuttersäure, beta-Aminobuttersäure, beta- Alanin, beta-Aminoisobuttersäure, Norvalin, Homoserin, Nor- leucin, gamma-Aminobuttersäure, Thioprolin, 4-Hydroxyprolin, alpha-Aminoadipinsäure, Diaminobuttersäure, 4-
Aminobenzoesäure, Homocystein, alpha-Aminopenicillansäure, Hi- stamin, Ornithin, Glycin-Prolin Dipeptid, Hydroxylysin, Pro- lin-Hydorxyprolin Dipeptid, Cystathionin, Ethionin, Seleno- Cystein. Als postranslationale oder chemische Modifikationen sind unter anderem Modifizierungen der Aminosäuresequenzen durch folgende Strukturen: Bindung von freiem Cystein an ein
Cystein in der Peptidsequenz, Methyl-, Acetyl-, Farnesyl-,
Biotinyl-, Stearoyl-, Palmityl-, Lipoyl-, C-Mannosyl-, Phos- phor- und Sulfatgruppen, Glycosilierungen, Amidierungen, Dea- midierungen, Pyroglutaminsäure, Citrullin, usw. möglich.
Nukleinsäuren:
Als Nukleinsäuren werden DNA, RNA und DNA-RNA-Hybridmoleküle sowohl natürlichen Ursprungs, als auch synthetisch oder rekom- binant hergestellt angesehen. Ferner eingeschlossen sind chemisch modifizierte Nukleinsäuren, die modifizierte Nukleotide mit hoher in vivo Stabilität, wie z.B. Phosphorthioaten, enthalten. Solche stabilisierten Nukleinsäuren finden bereits bei der Anwendung von Ribozym-, Antisense- und Triplexnukleinsäu- re-Techniken Verwendung.
Signifikanz :
Der Begriff signifikant wird im Sinne der Verwendung des Be- griffs der Signifikanz in der Statistik verwendet. In dieser Patentanmeldung wird eine Irrtumswahrscheinlichkeit von weniger als 90 %, vorzugsweise 95 % weiter vorzugsweise 99 % als signifikant definiert.
Sensitivität :
Als Sensitivität wird der Anteil an erkrankten Patienten definiert, die bei einer Diagnose auf die Erkrankung ein positives Diagnoseergebnis erhalten, d.h. die Diagnose zeigt die Erkrankung korrekt an. Spezifitä :
Als Spezifität wird der Anteil an gesunden Patienten definiert, die bei einer Diagnose auf die Erkrankung ein neganives Diagnoseergebnis erhalten, d.h. die Diagnose zeigt korrekt an, dass keine Erkrankung vorliegt.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass nur in Körperflüssigkeitsproben von an Morbus Alzheimer leidenden Patienten, ins- besondere in Liquor cerebrospinalis, die Konzentration bestimmter Peptide relativ zu ihrer Konzentration in Kontrollproben stark verändert ist und so einen Nachweis von Morbus Alzheimer ermöglicht. Veränderungen der Konzentration dieser Peptide relativ zu ihrer Konzentration in Kontrollgruppen zei- gen das Vorliegen einer Morbus Alzheimer Erkrankung an und sind daher zum Nachweis dieser Erkrankung bei hoher Sensitivität und Spezifität geeignet. Die Modulierung der VGF-Protein oder VGFARP-Peptid Konzentration, mit dem Ziel der Einstellung des Patienten auf normale VGF- oder VGFARP-Werte kann somit therapeutisch angewendet werden.
Zur Lösung der Aufgabe umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer neurologischen, insbesondere einer chronisch- demenziellen Erkrankung, insbesondere von Morbus Alzheimer oder einer Veranlagung für eine solche Erkrankung durch Identifizierung eines oder mehrerer VGF-Peptide, welche von der Sequenz mit der Gene Bank Accession No. NM_003378 oder der Accession No. Y12661 der DNA Data Bank of Japan abgeleitet sind in einer biologischen Probe eines Individuums. Da diese VGF- Peptide mit der Erkrankung vermutlich in einem ursächlichen
Zusammenhang stehen, beinhaltet die vorliegende Erfindung auch die Verwendung dieser Peptide zur Therapie von Morbus Alzheimer oder verwandter neurologischer Erkrankungen. Diese Peptide oder Peptidfragmente werden als "VGF derived Alzheimer related peptide" (VGFARP) bezeichnet und sind nummeriert mit VGFARP-1 bis VGFARP-38. Die beiden VGF-Protein-Varianten NM_003378 und Y12661 unterscheiden sich nur an 13 Positionen ihrer Aminosäuresequenz und von beiden VGF-Proteinen wurden VGF-Peptide identifiziert, die eine Unterscheidung zwischen Morbus Alzheimer und der Kontrollgruppe ermöglichen. Die VGFARP-Peptide VGFARP-11 und -32 stammen von der VGF-Variante mit der Accession Nr. Y12661 , die VGFARP-Peptide VGFARP-25, -30, -31, -36 und -37 stammen von der VGF-Variante mit der Accession Nr. NM_003378. Alle übrigen VGFARP-Peptide können aufgrund ihrer Aminosäuresequenz von beiden VGF-Varianten abstammen. Da bisher schon VGFARP-Peptide, abstammend von zwei verschiedenen VGF-Varianten identifiziert wurden, ist davon auszugehen, dass noch weitere VGFARP-Peptide existieren, die von diesen oder anderen VGF-Varianten abstammen. Diese VGFARP-Peptide sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Zur Lösung der Aufgabe gibt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Morbus Alzheimer unter Bestimmung der relativen Konzentration wenigstens eines Markerpeptids in einer biologischen Probe eines Patienten, verglichen mit der Konzentration des Markerpeptids in einer Kontrollprobe an, bei dem folgende Punkte erfüllt sein müssen: 1. Als Markerpeptid wird wenig- stens ein VGFARP-Peptid oder ein Peptid, dass von den Nukleinsäuren mit den Accession Nummern NM_003378 oder Y12661 oder homologen Sequenzen abgeleitet ist verwendet. 2. Es tritt eine für das jeweilige Markerpeptid spezifische Konzentrationserhöhung oder Konzentrationsverminderung des Markerpeptids in der Probe des Patienten relativ zu der Konzentration des Markerpeptids in der Kontrollprobe auf. 3. Eine signifikante Konzentrationsänderung des Markerpeptids in der vorgenannten Weise wird als positives Nachweisergebnis für eine neurologische Erkrankung, vorzugsweise Morbus Alzheimer, gewertet. Dabei kann für ein bestimmtes VGFARP-Peptid grundsätzlich entweder nur ein Anstieg der Peptidkonzentration bei Morbus Alzheimer Patienten auftreten, oder es kann für dieses VGFARP- Peptid grundsätzlich nur eine Verminderung der Peptidkonzentration bei Morbus Alzheimer Patienten auftreten. Für ein definiertes VGFARP-Peptid kann nicht gleichzeitig bei einem individuellen Morbus Alzheimer Patienten eine erhöhte und bei einem andren Morbus Alzheimer Patienten eine, relativ zur Kon- trollgruppe verminderte VGFARP-Petidkonzentration auftreten. Wie bei nahezu allen medizinischen Diagnosen von Erkrankungen sind falsch-positive oder falsch-negative Ergebnisse grundsätzlich möglich, d.h., dass in wenigen Einzelfällen eine falsche Diagnose erfolgt, da sich die Konzentration der VGFARP- Peptide bei Morbus Alzheimer Patienten nicht mit hundertprozentiger Wahrscheinlichkeit von der Konzentration der VGFARP- Peptide bei Kontrollproben unterscheidet. Dieses Problem kann jedoch durch Mehrfachkontrollen behoben werden.
Im Sinne dieser Erfindung werden Peptide, die als Fragmente der VGF-Sequenz aufgefasst werden können, als VGFARP-Peptide bezeichnet. Sie umfassen vom VGF abgeleitete homologe Peptide. Sie umfassen Abkömmlinge natürlich vorkommender Allele dieser Peptide und homologe Mutanten, insbesondere punktmutierte Mutanten mit vorzugsweise nicht mehr als zwei von VGF abweichenden Aminosäuren. Bevorzugte Marker nach der Erfindung sind im Sequenzprotokoll angegeben und sind mit VGFARP-1 bis VGFARP-38, entsprechend Seq. ID 1 bis 35 benannt. Die Sequenzen der VGFARP-Peptide sind in Abbildung 1 und in Tabelle 1 dargestellt. Die Zuordnung der VGFARP-Peptide zu ihrer jeweiligen Seq. ID No. ist in Tabelle 1 dargestellt.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um ein Verfahren, bei welchem spezifische Biomarker erfasst werden, die bei neurodegenerativen Erkrankungen, insbesondere bei Morbus Alzheimer, in ihrer Konzentration verändert sind und die die Krankheit auch bereits in einem sehr frühen Stadium und eine erhöhtes Erkrankungsrisiko frühzeitig anzeigen. Dies ist wichtig, um einen verlässlichen klinischen Marker zur Diagnose dieser Erkrankungen zur Verfügung zu stellen.
Vorzugsweise kann die Konzentration der VGFARP-Peptide in der Probe, aber auch das charakteristische Muster des Auftretens mehrerer bestimmter VGFARP-Peptide, mit dem Schweregrad der Krankheit korreliert werden. Diese neuen Marker ermöglichen daher die Entwicklung und die begleitende Kontrolle von Therapien zur Behandlung von Morbus Alzheimer, da der Verlauf und ein eventuell aufgrund einer Therapie einsetzender Heilungser- folg oder ein vermindertes Fortschreiten der Erkrankung ermittelt werden können. Eine effektive Therapie von Morbus Alzheimer ist derzeit nicht möglich, was die Dringlichkeit der Bereitstellung einer sicheren Nachweismethode für eine Morbus Alzheimer Erkrankung unterstreicht, da ein sicherer Nachweis der Erkrankung eine VorrausSetzung zur Entwicklung einer Therapie ist.
Der Nachweis von VGFARP-Peptiden ermöglicht es außerdem, im Rahmen von klinischen Studien zur Entwicklung von neuen Thera- pien zur Behandlung von Morbus Alzheimer mit hoher Spezifität nur solche Patienten auszuwählen, die an Morbus Alzheimer erkrankt sind und nicht an anderen Erkrankungen. Dieses ist wichtig, um aussagekräftige Studienergebnisse zu erhalten. Fälschlicherweise als Morbus Alzheimer Patienten diagnosti- zierte Patienten beeinflussen die Qualität der Ergebnisse einer Morbus Alzheimer Therapie-Studie negativ. Außerdem ermöglicht der Nachweis von VGFARP-Peptiden die Stratifizierung von Patienten, wodurch Subgruppen von Morbus Alzheimer Patienten gezielt ausgewählt werden können, die für bestimmte Morbus Alzheimer Therapiestrategien oder klinische Studien besonders geeignet sind.
Bei Morbus Alzheimer Patienten sind die Konzentrationen von VGFARP-Peptiden deutlich verändert, relativ zu gesunden Personen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es daher, die VGFARP-Konzentrationen bei Morbus Alzheimer Patienten auf normale Konzentrationen zu bringen. Dieses Verfahren kann zur Therapie von Morbus Alzheimer oder verwandten neurologischen Erkrankungen eingesetzt werden. Bei erhöhten VGF-Protein oder VGFARP-Peptid Konzentrationen können die Konzentrationen dieser Stoffe durch therapeutische Gabe von z.B. VGF-Protein oder VGFARP-Peptid spezifischen Antikörpern oder VGF-spezifischen Antisense-Nukleinsäuren, Ribozymen oder Triplex-Nukleinsäuren oder VGFARP-Peptid-Antagonisten, VGF-Protein-Antagonisten gesenkt werden. Zur Therapie können auch Substanzen verabreicht werden, die die körpereigene Expression von VGF-Protein oder die Prozessierung von VGF-Protein zu VGFARP-Peptiden unterdrücken. Liegt ein Mangel an VGF-Protein oder VGFARP-Peptiden als Erkrankungsursache vor, so können therapeutische Gaben von VGF-Protein, VGFARP-Peptiden, VGFARP-Peptid-Agonisten oder VGF-Protein-Agonisten vorgenommen werden. Die körpereigene Produktion von VGF-Protein oder VGFARP-Peptiden kann durch die therapeutische Gabe von Substanzen wie z.B. NGF, BNDF oder NT- 3 oder anderen geeigneten Stoffen erhöht werden, da diese
Stoffe die VGF-Expression erhöhen. Auch Substanzen, die die Prozessierung von VGF-Protein zu VGFARP-Peptiden fördern, wie z.B. Prohormonkonvertasen wie z.B. PCI, PC2 oder PC3 , können therapeutisch eingesetzt werden. Natürlich ist auch die Kombi- nation von verschiedenen Therapiestrategien möglich und unter Umständen sinnvoll.
Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung von VGF- Proteinen, VGFARP-Peptiden, VGFARP-Peptid-Agonisten und -Anta- gonisten, VGF-Protein-Agonisten und -Antagonisten, anti-VGF-
Protein Antikörpern, anti-VGFARP-Peptid Antikörpern, NGF, BNDF, NT-3, anti-NGF Antikörpern, anti-BNDF Antikörpern, anti- NT-3 Antikörpern und Antikörpern gegen Rezeptoren der genann- ten Proteine zur direkten oder indirekten Modulierung der Konzentration an VGF-Proteinen und VGFARP-Peptiden zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Alternativ zu Antikörpern können auch Antikörperfragmente, Antikörperfusionsproteine, oder andere selektiv an VGF- Proteine, VGFARP-Peptide, NGF, BNDF oder NT-3 bindende Substanzen Verwendung finden. Alternativ zu den genannten Proteinen und Peptiden können auch Fusionsproteine der genannten Proteine Verwendung finden. Weiterhin umfasst die Erfindung auch die Verwendung von Antisense-Nukleinsäuren, Triplex- Nukleinsäuren und Ribozymen, die die Expression der genannten Proteine und Peptide modulieren. Außerdem umfasst die Erfindung Agonisten und Antagonisten, die die Aktivität der genannten Proteine modulieren.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die galeni- sche Formulierung oder chemische Modifizierung der beschriebenen Peptide und Nukleinsäuren in einer Art und Weise, die es ihnen ermöglicht, die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut- Liquor-Schranke effizienter zu passieren. Dadurch eignen sie sich dann besonders zur therapeutischen Anwendung. Um dieses zu erreichen können z.B. VGF-Peptide, VGF-Proteine, Nukleinsäuren, Agonisten oder Antagonisten derart modifiziert werden, dass sie z.B. lipophiler werden was den Übertritt in den Suba- rachnoidalraum begünstigt. Dieses kann durch Einfügung von hy- drophoben Molekülbestandteilen oder auch durch die „Verpak- kung" der Stoffe in hydrophobe Agentien, z.B. Liposomen erreicht werden. Ausserdem können z.B. Peptidsequenzen an diese Peptide, Protein, Nukleinsäuren, Agonisten oder Antagonisten angefügt werden, die den Übertritt in den Subarachnoidalraum begünstigen, bzw. umgekehrt den Übertritt aus den Subarachnoi- dalraum heraus erschweren.
Die Erfindung umfasst auch die Verabreichung der genannten Therapeutika über verschieden Wege, wie z.B. als intravenöse Injektion, als oral applizierbare Substanz, als inhalierbares Gas oder Aerosol, oder die Verabreichung in Form von direkten Injektion in den Subarachnoidalraum, oder in Gewebe wie Muskel, Fett, Gehirn usw. Dadurch kann eine erhöht biologische Verfügbarkeit und Wirksamkeit dieser Therapeutika erreicht werden. Z.B. können Peptide oder Proteine, die oral verabreicht werden durch säureresistente Kapseln vor porteolyti- schen Abbau im Magen geschützt werden. Stark hydrophobe Substanzen können durch geeignete galenische Aufbereitungen hy- drophiler und somit besser geeignet für z.B. intravenöse Injektionen werden usw.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von VGFARP-Peptiden oder von VGF-Proteinen zur Identifizierung von Rezeptoren, die diese Moleküle selektiv binden. Auch diese Rezeptoren können durch Gabe von Agonisten oder Antagonisten moduliert werden, was zur Therapie von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, zweckmäßig ist.
Aufgrund der zahlreichen, im Rahmen dieser Erfindung neu identifizierten VGF-Peptide, können erstmals Positionen im VGF- Protein experimentell nachgewiesen werden, an denen eine Prozessierung des VGF-Proteins in vivo statt findet. Bei diesen Prozessierungsstellen handelt es sich, bezogen auf die VGF- Proteinsequenz von NM_003378 um folgende Sequenzpositionen: 371/372, 418/419, 479/480, 480/481, 481/482, 482/483 und 483/484. Bezogen auf die VGF-Proteinsequenz von Y12661 handelt es sich um folgende Prozessierungsstellen: 371/372, 419/420, 480/481, 483/484, 484/485 und 485/486. Alle experimentell identifizierten Porzessierungspositionen stellen dibasische
Positionen, d.h. direkt aufeinander folgende Aminosäuren mit positiv geladenen Aminosäureseitenketten (Arginin = R, Lysin = K) dar. Solche Sequenzmotive werden z.B. von Prohormonkonver- tasen erkannt und geschnitten, wobei zusätzlich die beiden basischen Aminosäuren endoproteolytisch entfernt werden. Wie der Name der Prohormonkonvertasen schon andeutet, konvertieren Prohormonkonvertasen Prohormone zu Hormonen, wodurch neue biologisch aktive Stoffe (Peptid-Hormone) entstehen. Beispiele für biologische aktive Peptide, die auf diese Weise aus ihren Pro-Formen generiert werden sind proNGF/NGF, proBDNF/BNDF usw. [1] . Folglich stellen die erfindungsgemäßen VGFARP-Peptide Peptidhormone dar, die im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen, vorzugsweise Morbus Alzheimer, als Angriffspunkte für Therapeutika geeignet sind. Die Modulierung der VGFARP- Peptid Konzentrationen kann somit zur Therapie von neurologischen Erkrankungen, vorzugsweise Morbus Alzheimer Verwendung finden.
VGF-Biologie
Die im Rahmen dieser Erfindung identifizierten VGF-Proteine (Vorläufermoleküle zu VGF-Peptiden) werden als ca. 68 kDa große Proteine selektiv in neuroendokrinen und neuronalen Zellen synthetisiert, wobei ihre Expression mit zunehmenden Alter abnimmt [2] . Bei der Untersuchung von VGF-Gen defizienten Mäusen stellte sich heraus, dass wichtige Funktion im Energiestoffwechsel betroffen sind [3] . VGF-Gen defiziente Mäuse weisen eine geringe Körpergröße auf, sind hypermetabolisch und hy- peraktiv. VGF wird auch in den insulinproduzierenden Inselzellen der Bauchspeicheldrüse synthetisiert .
VGF wurde bei der Untersuchung einer Pheochomozytom-Zelllinie der Ratte (PC12-Zelllinie) entdeckt und die Stimulierung die- ser Zelllinie mit „Nerven Wachstumsfaktor" (NGF) bewirkt eine
12- bis 14-fache Steigerung der Konzentration von VGF [4, 5] . NGF ist ein wichtiger Wachstumsfaktor, der die Differenzierung des peripheren und zentralen Nervensystems reguliert. Weitere Faktoren, die die VGF-Expression regulieren sind der „Brain- derived Neurotrophic Factor" (BDNF) und Neurotropin-3 (NT-3) [6] . In vivo wird VGF-mRNA durch neuronale Aktivität, neuronale Verletzungen und durch den biologischen Rhythmus (circadian clock) reguliert [2, 7-9] .
VGF wird mit zunehmender Differenzierung neuronaler Zellen über neuronalspezifisch expremierte Endoproteasen, die vermutlich basische Aminosäuren erkennen, proteolytisch prozessiert. Wie Trani et al . zeigen konnten entstehen C-terminale VGF- Peptide mit den Massen 20, 18 und 10 kDa [10] . Diese VGF-
Prozessierung findet im Postendoplasmatischen Retikulum statt. Diese Peptide werden in sekretorischen Vesikeln angereichert, vorzugsweise nach Membran-Depolymerisation freigesetzt und könnten eventuell eine Rolle in der neuronalen Kommunikation spielen [10]. Prohormonkonvertasen wie z.B. die PCI, PC2 oder PC3 sind aus der Literatur als Beispiele für Endoproteasen, die Protein-Vorläufermoleküle an dibasischen Sequenzstellen proteolytisch spalten bekannt. Die von uns identifizierten VGFARP-Peptide stellen jedoch überraschenderweise Fragmente mit deutlich geringerem Molekulargewicht als 10 bis 20 kDa dar und sind daher verschieden zu den von Trani et al . beschriebenen VGF-Peptiden. Außerdem verwendeten Trani et al . zum Nachweis dieser VGF-Peptide anti-VGF Antikörper, die VGF-Epitope erkennen, die verschieden zu den Sequenzen der VGFARP-Peptide sind. VGFARP-Peptide haben wir sowohl in Morbus Alzheimer Patienten, als auch in der Kontrollgruppe nachgewiesen. Die von uns identifizierten Peptide stellen neue, bisher nicht beschriebene Prozessierungs-Produkte von VGF dar. Die Konzentrationen der VGFARP-Peptide können in einer für jedes Peptid spezifischen Weise in der Patientengruppe relativ zur Kontrollgruppe entweder einheitlich erhöht oder aber einheitlich erniedrigt sein. Bisher waren ausschließlich andere VGF- Peptide unbekannter Sequenz, abstammend vom C-terminalen Bereich des VGF-Proteins und mit deutlich höherem Molekulargewicht als die von uns neu identifizierten und erstmalig sequenzierten Peptide bekannt [10] .
Vorzugsweise Ausführungsformen der Erfindung
Vorzugsweise ist die durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesene chronisch-demenzielle Erkrankung Morbus Alzheimer. Bislang konnte die Veränderung der Konzentration der erfindungsgemäßen Peptide und Peptidfragmente bei Morbus Alzhei- mer Patienten nachgewiesen werden. Hieraus kann geschlossen werden, dass die erfindungsgemäßen Peptide zum Nachweis und zur Therapie von Morbus Alzheimer und verwandten neurologischen Erkrankungen herangezogen werden können.
Die Identifizierung konzentriert sich vorzugsweise auf bestimmte Peptidfragmente der VGF-Proteine mit der GeneBank Accession No. NM_003378, oder der DDBJ Accession No. Y12661 d.h. auf Peptide, die Teilsequenzen dieser VGF-Proteine umfassen. Diese VGF-Peptide (VGF-Proteinfragmente) werden als "VGF de- rived Alzheimer related peptide" (VGFARP) bezeichnet und sind durchnumeriert mit VGFARP-1 bis VGFARP-38. Der Zusammenhang zwischen den VGF-Proteinen und VGFARP-1 bis VGFARP-38 ist in Abbildung 1 dargestellt. Die von uns ermittelten Sequenzen der Peptide sind im Sequenzprotokoll angegeben.
Wir haben in biologischen Proben verschiedene VGF-Peptide, abstammend von zwei VGF-Protein-Varianten, erstmals nachgewiesen. Diese mit VGFARP-1 bis VGFARP-38 bezeichneten Peptide stellen definierte Fragmente von VGF-Proteinen dar. Diese Fragmente entstehen auf natürliche Weise in der Natur und wurden bisher in der Literatur nicht beschrieben. Diese Fragmente sind verschieden zu Peptiden, die in der Literatur oft durch in vitro Proteolyse (durch Zugabe von Proteasen wie z.B. Tryp- sin) erzeugt werden. Sie stellen somit neue, bisher unbekannte Stoffe dar. Diese Peptide wurden zunächst über Reverse Phase Chromatographie aus biologischen Proben angereichert und gereinigt und anschließend massenspektrometrisch von begleitenden anderen Peptiden getrennt, so dass diese VGFARP-Peptide anschließend sequenziert werden konnten.
TABELLE 1
Die Sequenzen der Peptide im Einbuchstaben-Aminosäurecode sind wie folgt:
* rl stellt eine Sequenz, die der Sequenz oder Teilen der Sequenz des VGF-Proteins von Aminosäure 49-23 entspricht dar, wobei rl, ausgehend von Aminosäure 50 des VGF-Proteins, zwischen 0 und 27 Aminosäuren lang sein kann. Entsprechend stellt r2 die VGF-Proteinsequenz von Aminosäure 58 bis 64 oder Teile davon dar, wobei r2, ausgehend von VGF-Aminosäure 57 zwischen 0 und 7 Aminosäuren lang sein kann. Die weiteren Peptid-Ketten r3 bis rl6 sind entsprechend dem oben exemplarisch erläutertem Schema zusammengesetzt.
** VGFARP-12 wurde als nicht oxidiertes und als einfach oxidiertes Peptid (Zunahme des Molekulargewichts um ca. 16 Dal- ton) identifiziert.
Geeignete Peptide
Die Peptide können in posttranslationalen oder chemischen Mo- difikationsformen vorliegen, was sich u.a. auf ihre Massen und damit die massenspektrometrische Identifizierung und auch auf das Eluationsverhalten bei der Chromatographie, wie z.B. bei Reverse Phase Chromatographie auswirkt . Insbesondere können die Peptide glykosiliert , phosphoryliert , sulfatiert, ami- diert, oxidiert usw. in der zu untersuchenden Probe vorliegen. Vorzugsweise liegen modifizierte Peptide als Peptidoxid vor, wie z.B. das Peptid VGFARP-12, das sowohl als nicht modifiziertes Peptid, als auch als Peptidoxid identifiziert wurde.
Die Peptide werden insbesondere auch dann als VGFARP-Peptide angesehen, wenn einzelne Aminosäuren von der entsprechenden Sequenz des VGF-Proteins abweichen, insbesondere wenn maximal 2 Aminosäuren von der VGF-Proteinsequenz abweichen. Dabei sind Punktmutationen, Deletionen, interne Einfügungen von Aminosäu- ren, sowie N- und C-terminale Verlängerungen zulässig, solange die VGFARP-Peptidsequenz mindestens 8 Aminosäuren enthält, die relativ zur Aminosäuresequenz des zugehörigen VGF-Proteins konserviert, d.h. unverändert, sind.
Für einen positiven Nachweis der Erkrankung ist in Weiterbildung der Erfindung ferner vorgesehen, dass die Konzentration des oder der identifizierten Peptide für jedes dieser Peptide in spezifischer Weise relativ zur Konzentration des jeweiligen Peptides in einer Kontrollprobe erhöht oder erniedrigt ist. Das Verhältnis der Konzentrationen der jeweiligen Peptide zur
Konzentration der Kontrollprobe kann zur Bestimmung des Schweregrades der Erkrankung herangezogen werden.
Bei der Kontrollprobe kann es sich um eine Poolprobe aus ver- schiedenen Kontrollen handeln. Auch die zu untersuchende Probe kann eine Poolprobe sein, wobei bei positivem Ergebnis anschließend Einzeluntersuchungen durchgeführt werden.
Geeignete biologische Proben
Die biologische Probe kann vorzugsweise Liquor cerebrospinalis (Cerebrospinalflüssigkeit , CSF) sein oder eine Probe wie Serum, Plasma, Urin, Stuhl, Tränenflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Sputum usw. Dies hängt u.a. von der Empfindlichkeit des gewählten Nachweisverfahrens (Massenspektrometrie, ELISA etc.) ab. Auch homogenisierte Gewebeproben, Gewebeschnitte und Biop- siepräparate können gegebenenfalls verwendet werden. Daher ist in einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung vorgesehen, das zur Vorbereitung der zu untersuchenden Probe Gewebehomo- genate hergestellt werden, z.B. aus menschlichen Gewebeproben, die im Rahmen von Biopsien erhalten wurden. Diese Gewebe können z.B. mit manuellen Homogenisatoren, mit Ultraschall Homogenisatoren oder mit elektrisch betriebenen Homogenisatoren wie z.B. Ultraturrax zerkleinert werden, und anschließend in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise in sauren, wässri- gen Lösungen mit z.B. 0,1 bis 0,2 M Essigsäure für 10 Minuten gekocht werden. Anschließend werden die Extrakte dem jeweiligen Nachweisverfahren, z.B. einer massenspektrometrischen Untersuchung, unterzogen. Die Proben können in der üblichen Wei- se vorbereitet, z.B. gegebenenfalls verdünnt oder aufkonzentriert, und gelagert werden.
Verwendung der VGFARP-Peptide zur Herstellung von Diagnostika
Weiterhin umfasst die Erfindung die Verwendung wenigstens ei- nes der erfindungsgemäßen VGFARP-Peptide oder eines VGF- Proteins zur Diagnose von neurologischen Erkrankungen, insbesondere chronisch-demenziellen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, sowie die Verwendung von VGFARP-Peptiden zur Gewinnung von Antikörpern oder von anderen Agenzien, welche aufgrund ihrer VGFARP-Peptid-spezifischen Bindungseigenschaften zur Entwicklung von Diagnosereagenzien zum Nachweis dieser Erkrankungen geeignet sind. Die Erfindung umfaßt auch die Verwendung von VGFARP-Peptiden zur Gewinnung von Phagenpartikeln, die spezifisch diese Peptide binden, oder die umgekehrt VGFARP-Peptide auf ihre Oberfläche präsentieren und so die Identifizierung von Bindungspartnern wie z.B. Rezeptoren von VGF-Proteinen oder VGFARP-Peptiden ermöglichen.
Nachweismethoden für VGFARP-Peptide
Im Rahmen der Erfindung können verschiedene Methoden zum Nachweis der VGFARP-Peptide verwendet werden. Dazu sind alle Methoden geeignet, die es ermöglichen, VGFARP-Peptide spezifisch in einer Probe eines Patienten nachzuweisen. Geeignete Metho- den sind unter anderem physikalische Methoden wie z.B. Massenspektrometrie oder Flüssigkeits-Chromatographie, molekularbiologische Methoden wie z.B. Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) oder immunologische Nachweistechniken, wie z.B. „Enzyme linked immunosorbent assays" (ELISA).
Physikalische Nachweismethoden
Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung physikalischer Methoden, welche die erfindungsgemäßen Peptide qualitativ oder quantitativ anzeigen können. Zu diesen Methoden ge- hören unter anderem Massenspektrometrie, Flüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie, NMR (Nuclear-Magnetic- Resonance) Spektroskopie usw. Dabei werden quantitative Messergebnisse aus einer zu untersuchenden Probe mit den Messwerten, die bei einem Kollektiv an neurologischen Erkrankungen, insbesondere chronisch-demenziellen Erkrankungen, vorzugsweise Morbus Alzheimer, leidenden Patienten und einem Kontrollkollektiv gewonnen wurden, verglichen. Aus diesen Ergebnissen kann das Vorliegen einer neurologischen Erkrankungen, insbesondere einer chronisch-demenziellen Erkrankung, insbesondere Morbus Alzheimer und/oder der Schweregrad dieser Erkrankung abgeleitet werden.
Gemäß bevorzugter Ausführungsform dieser Erfindung werden die Peptide in der Probe vor der Identifizierung chromatographisch getrennt, und zwar vorzugsweise mit Reverse Phase Chromatographie, besonders bevorzugt ist eine Trennung der Peptide in der Probe mit hochauflösender Reverse Phase High-Performance- Flüssigchromatografie (RP-HPLC) . Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die Durchführung von Fällungsreaktionen zur Fraktionierung der Probe unter Verwendung von Fällungsmitteln wie z.B. Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol , Trichlores- sigsäure, Aceton, Ethanol usw. Die so gewonnenen Fraktionen werden dann einzeln dem jeweiligen Nachweisverfahren unterzo- gen, z.B. der massenspektrometrischen Untersuchung. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Flüssigkeitsphasenextraktion. Dazu wird die Probe z.B. mit einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel wie etwa Polyethylenglykol (PEG) und einer wässrigen Salzlösung gemischt. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften reichern sich dann bestimmte Inhaltsstoffe der Probe in der organischen und andere in der wässrigen Phase an und können so voneinander getrennt und anschließend weiter analysiert werden.
Reverse Phase Chromatographie
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Verwendung von Reverse Phase Chromatographie, insbesondere einer C18 Reverse Phase Chromatographiesäule unter Verwendung von Laufmitteln bestehend aus Trifluoressigsäure und Acetonitril, zur Trennung von Peptiden in humaner Liquor- flüssigkeit. Es werden z.B. jeweils Fraktionen gesammelt, die je 1/100 des verwendeten Volumens an Laufmittel beinhalten. Die so gewonnenen Fraktionen werden mit Hilfe eines Massen- spektrometers, vorzugsweise mit Hilfe eines MALDI- Massenspektrometers (Matrix-unterstützte Laserdesorption- Ionisation) unter Verwendung einer Matixlösung, bestehend aus z.B. aus L(-) Fucose und alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, gelöst in einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressig- säure und Aceton, analysiert und so das Vorliegen bestimmter Massen festgestellt und die Signalintensität quantifiziert. Diese Massen entsprechen den Massen der erfindungsgemäßen Peptide VGFARP-1 bis VGFARP-38.
Massenspektrometrie
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Identifizierung der VGFARP-Peptide mit Hilfe einer massenspek- trometrischen Bestimmung, vorzugsweise einer MALDI- (Matrix- assisted-laser-desorption-and-ionisation-) Massenspektrome- trie, vorgenommen werden. Dabei umfasst die massenspektrome- trische Bestimmung weiter vorzugsweise wenigstens eines der folgenden Massensignale, jeweils berechnet anhand der theoretischen, monoisotopischen Masse des entsprechenden Peptids. Dabei können leichte Abweichungen von der theoretischen, mo- noisotopischen Masse aufgrund des experimentellen Fehlers und der natürlichen Isotopenverteilung auftreten. Außerdem wird bei MALDI -Massenbestimmungen aufgrund der Messmethodik den Peptiden ein Proton hinzugefügt, wodurch sich die Masse um 1 Dalton erhöht. Folgende Massen entsprechen den theoretischen, monoisotopischen Massen der von uns identifizierten Peptide; berechnet mit geeigneter Software, hier GPMAW 4.02. Diese theoretischen, monoisotopischen Massen können einzeln oder in Kombinationen in einer Probe auftreten: VGFARP-1 = 3666,8278 / VGFARP-2 = 3950,9875 / VGFARP-18 = 3567,7594 / VGFARP-3 = 3595,7907 / VGFARP-4 = 3879,9504 / VGFARP-5 = 3401,6852 / VGFARP-6 = 3614,8077 / VGFARP-7 = 3685,8448 / VGFARP-19 = 3302,6167 / VGFARP-20 = 3173,5741/ VGFARP-21 = 3955,9889 / VGFARP-10 = 1336,6735 / VGFARP-22 = 2503,1827/ VGFARP-15 = > 727,3501/ VGFARP-23 = > 851,4137 / VGFARP-24 = > 730,3246 / VGFARP-25 = 3745,7343 / VGFARP-26 = 1235,5782 / VGFARP-27 = >
833,4395 / VGFARP-11 = 7518,2744 / VGFARP-28 = 2031,8981 / VGFARP-29 = 2418,0419 / VGFARP-30 = 4806,0408 / VGFARP-31 = 3456,5513 / VGFARP-32 = 4806,0408 / VGFARP-33 = 4058,7043 / VGFARP-12 = 5776,6294 / VGFARP-13 = 6618,0363 / VGFARP-34 = 1380,7249 / VGFARP-35 = > 946,4468 / VGFARP-16 = > 862,3192 / VGFARP-17 = > 961,4063 / VGFARP-36 = 3903,0180 / VGFARP-37 = 3787,9911 / VGFARP-38 = > 920,4828 Das Symbol > (ist größer oder gleich) ist so zu verstehen, dass nicht beliebig größere Massen für die betroffenen VGFARP- Peptide möglich sind, sondern lediglich die Massen, die sich aufgrund der möglicherweise zusätzlich an den Enden dieser Peptide befindlichen Aminosäuren ergeben können. An den Enden dieser Peptide können nicht beliebige Aminosäuren zusätzlich vorhanden sein, sondern nur solche, die sich aufgrund der Sequenz des VGF-Proteins an dieser Sequenzposition befinden können.
Massenspektrometrische Bestimmung der Sequenz der VGFARP- Peptide
Bei der weiteren praktischen Anwendung dieser Ausführungsform ist eine weitere Absicherung des Nachweisergebnisses dadurch möglich und empfehlenswert, dass die Identität der den Massen entsprechenden Peptide ermittelt wird, wobei ausschließlich Peptidsignale berücksichtigt werden, die von einem VGF-Protein abgeleitet werden können. Diese Absicherung erfolgt über eine Identifizierung der Peptidsignale vorzugsweise mit massenspek- trometrischen Verfahren, z.B. einer MS/MS-Analyse [11].
Durch das erfindungsgemäße Verfahren wurden neue, spezifische Peptide von VGF-Proteinen (VGFARP-Peptide) identifiziert und in ihrer Bedeutung erkannt. Diese VGFARP-Peptide und ihre Abkömmlinge werden hier mit VGFARP-1 bis VGFARP-38 bezeichnet. Ihre Sequenzen sind im Sequenzprotokoll angegeben. Die VGFARP- Peptide VGFARP-15, 16, -17, -27, -35, und VGFARP-38 können am N- und/oder C-Terminus zusätzliche Aminosäuren entsprechend der korrespondierenden Sequenz des zugehörigen VGF-Proteins beinhalten. Die Erfindung umfasst auch die rekombinant oder synthetisch hergestellten, sowie aus biologischen Proben isolierten VGFARP-Peptide in unmodifizierter, chemisch modifizierter oder posttranslational modifizierter Form. Dabei sind zwei Punktmutationen sowie andere Abweichungen möglich, solan- ge das VGFARP-Peptid mindestens 8 Aminosäuren aufweist, die in ihrer Identität und ihrer Position innerhalb der Peptidsequenz mit einem VGF-Protein übereinstimmen.
Molekularbiologische Nachweistechniken Schließlich umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuren, die zu VGFARP-Peptiden korrespondieren, und insbesondere solche, die zu den erfindungsgemäßen VGFARP-Peptiden korrespondieren, und deren Verwendung zur indirekten Bestimmung und Quantifizierung der zugehörigen VGF-Proteine und -Peptide. Darin eingeschlos- sen sind auch Nukleinsäuren, die z.B. nicht codierende Sequenzen, wie etwa 5 - oder 3 * -untranslatierte Bereiche der mRNA darstellen, oder Nukleinsäuren, die eine für spezifische Hy- bridisierungsexperimente ausreichende Sequenzübereinstimmung mit der Nukleinsäuresequenz von VGF aufweisen, und die daher zum indirekten Nachweis der zugehörigen Proteine, insbesondere der VGFARP-Peptide geeignet sind.
Ein Ausführungsbeispiel hierfür umfasst die Gewinnung von Gewebeproben, z.B. von Biopsiepräparaten, von Patienten und die nachfolgende Bestimmung der Konzentration eines RNA-
Transkriptes korrespondierend zum Gen mit der GeneBank Accession No. NM_03378 oder der Accession No. Y12661 der „DNA Data Bank of Japan" , DDBJ oder korrespondierend zu homologen VGF- Varianten. Dabei werden quantitative Messergebnisse (Intensi- täten) aus einer zu untersuchenden Probe mit den Messwerten, die bei einem Kollektiv an einer Morbus Alzheimer Erkrankung leidender Patienten und einem Kontrollkollektiv gewonnen wurden, verglichen. Zur Quantifizierung können Methoden wie z.B. reverse Transkriptase Polymerease Kettenreaktion (RT-PCR) , quantitative real-time PCR (ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) , in situ Hybridisierungen oder Northernblots in einer dem Fachmann bekannten Weise angewendet werden. Aus den Ergebnissen kann das Vorliegen einer chronisch demenziellen Erkrankung, vorzugsweise Morbus Alzheimer und/oder deren Schweregrad abgeleitet werden.
Immunologische Nachweismethoden Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Identifizierung der VGFARP-Peptide oder der VGF- Proteine unter Verwendung eines immunologischen Nachweissystems, vorzugsweise eines ELISAs („enzyme linked immuno sor- bent assay" ) durchgeführt werden. Dabei erfasst dieser immuno- logische Nachweis wenigstens ein VGFARP-Peptid oder VGF- Protein. Zur Erhöhung der Spezifität kann weiterhin bevorzugt ein sogenannter „Sandwich-ELISA" verwendet werden, bei dem der Nachweis der VGFARP-Peptide von der Spezifität von zwei Antikörpern, die unterschiedliche Epitope innerhalb des selben Mo- leküls erkennen, abhängig ist. Zum Nachweis von VGFARP-
Peptiden oder VGF-Proteinen können jedoch auch andere ELISA- Systeme, z.B. direkte oder kompetitive ELISA Verwendung finden. Auch weitere, ELISA-ähnliche Nachweistechniken, wie z.B. RIA („radio immuno assay" ) , EIA (Enzymimmunoassay) , ELI-Spot usw. sind geeignet als immunologische NachweisSysteme. Als
Standard für die Quantifizierung können aus biologischen Proben isolierte, rekombinant hergestellte oder chemisch synthetisierte VGFARP-Peptide oder VGF-Proteine verwendet werden. Die Identifizierung des oder der VGFARP-Peptide kann z.B. all- gemein mit Hilfe eines auf das VGFARP-Peptid oder VGF-Protein gerichteten Antikörpers, erfolgen. Weitere für solche Nachweise geeignete Methoden sind unter anderem Westernblotting, Im- munpräzipitation, Dot-Blots, Plasmonresonanzspektrometrie (BIACORE®-Technologie, Biacore International AB, Uppsala,
Schweden) , Phagenpartikel, PNAs (Peptide Nucleic Acids) , Affinitätsmatrizen (z.B. ABICAP-Technologie, ABION Gesellschaft für Biowissenschaften und Technik mbH, Jülich, Deutschland) usw. Generell sind alle Substanzen/Moleküle als Nachweisagen- zien geeignet, die es erlauben, ein spezifisches Nachweissystem aufzubauen, da sie spezifisch ein VGFARP-Peptid oder VGF- Protein binden.
Gewinnung von VGFARP-Peptiden und von anti-VGFAR -Peptid Anti- körpern
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Gewinnung von VGFARP-Peptiden unter Verwendung von rekombinanten Expressionssystemen, Chromatographiemethoden und chemischen Syntheseprotokollen, die dem Fachmann bekannt sind. Die so gewonnen VGFARP-Peptide können unter anderem als Standards zur Quantifizierung der jeweiligen VGFARP-Peptide oder als Antigen zur Herstellung von VGFARP-Peptid-Antikörpern Verwendung finden. Zu den dem Fachmann bekannten und geeigneten Methoden zur Isolierung und Gewinnung von VGFARP-Peptiden gehören die rekombi- nante Expression von Pepiden. Zur Expression der VGFARP- Peptide können unter anderem Zellsysteme wie z.B. Bakterien wie Escherichia coli, Hefezellen wie Saccharomyces cerevisiae, Insektenzellen wie z.B. Spodoptera frugiperda (Sf-9) Zellen, oder Säugerzellen wie „Chinese Hamster Ovary" (CHO) Zellen verwendet werden. Diese Zellen sind von der „American Tissue Culture Collection" (ATCC) erhältlich. Zur rekombinanten Expression von VGFARP-Peptiden werden z.B. Nukleinsäuresequen- zen, die für VGFARP-Peptide kodieren in Kombination mit geeigneten regulatorischen Nukleinsäuresequenzen wie z.B. Promoto- ren, antibiotischen Selektionsmarkern usw. mit molekularbiologischen Methoden in einen Expressionsvektor eingefügt. Ein dazu geeigneter Vektor ist z.B. der Vektor pcDNA3.1 von der Firma Invitrogen. Die so gewonnenen VGFARP-Peptid Expressionsvek- toren können dann in geeignete Zellen, z.B. durch Elektropora- tion, eingefügt werden. Die so hergestellten VGFARP-Peptide können C- oder N-terminal mit heterologen Sequenzen von Peptiden wie Poly-Histidinsequenzen, He agglutinin-Epitopen (HA- tag) , oder Proteinen wie z.B. Maltosebindenden Proteinen, Glutathion-S-Transferase (GST) , oder Proteindomähnen wie der GAL-4 DNA-Bindungsdomähne oder der GAL4-Aktivierungsdomähne fusioniert sein. Die Herstellung der VGFARP-Peptide durch chemische Synthese kann z.B. nach dem Merrifield-Festphasen- Syntheseprotokoll unter Verwendung von Syntheseautomaten, die von verschiedenen Herstellern erhältlichen sind, erfolgen.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die Isolierung von VGFARP-Peptiden aus biologischen Proben oder aus Zellkulturmedien oder Zelllysaten von rekombinanten Expressi- onssystemen z.B. mit Reverse Phase Chromatographie, Affinitätschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration, Isoelektrischer Fokussierung, usw. oder mit anderen Methoden wie präparativer Immunpräzipitation, Ammoniumsulfatfäl- lung, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln usw. Eine wei- tere Ausführungsform der Erfindung ist die Gewinnung monoklo- naler oder polyklonaler Antikörper unter Verwendung von VGFARP-Peptiden. Die Gewinnung der Antikörper geschieht in üblicher, dem Fachmann vertrauter Weise. Eine bevorzugte Ausführungsform ist die Herstellung und Gewinnung von VGFARP-Peptid spezifischen Antikörpern, eine insbesondere bevorzugte Ausführungsform ist die Herstellung von VGFARP-Peptid spezifischen Antikörpern die neo-Epitope erkennen, das heißt Epitope, die nur auf VGFARP-Peptiden vorhanden sind, die jedoch nicht in einem VGF-Protein. Solche anti-VGFARP-Peptid Antikörper ermög- liehen den spezifischen immunologischen Nachweis von VGFARP-
Peptiden in Gegenwart von VGF-Protein. Polyklonale Antikörper können durch Immunisierungen von Versuchstieren wie z.B. Mäusen, Ratten, Kaninchen oder Ziegen hergestellt werden. Mono- klonale Antikörper können z.B. durch Immunisierungen von Versuchstieren und anschließender Anwendung von Hybridomatechniken oder aber über rekombinante Versuchsansätze wie z.B. über Antikörperbanken wie die HuCAL® -Antikörperbank der Firma Mor- phoSys, Martinsried, Deutschland, oder andere dem Fachmann be- kannte, rekombinante Herstellungsverfahren gewonnen werden. Antikörper können auch in Form von Antikörperfragmente wie z.B. Fab-Fragmente oder Fab2-Fragmente usw. Verwendung finden.
Therapieentwicklung und Überwachung durch VGFARP-Peptid Be- Stimmungen
Ein weiteres Anwendungsbeispiel ist die quantitative oder qualitative Bestimmung der oben genannten VGFARP-Peptide oder VGF-Proteine zur Abschätzung der Wirksamkeit einer sich in der Entwicklung befindlichen Therapie gegen neurologische Erkran- kungen, insbesondere chronisch-demenzielle Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Die Erfindung kann auch zur Identifizierung von geeigneten Patienten für klinische Studien zur Entwicklung von Therapien für diese Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, verwendet werden. Dabei werden quantitative Messergebnisse aus einer zu untersuchenden Probe mit den Messwerten, die bei einem Kontrollkollektiv und einer Gruppe von Patienten gewonnen wurden, verglichen. Aus diesen Ergebnissen kann die Wirksamkeit eines Therapeutikums, bzw. die Eignung des Patienten für eine klinische Studie, abgeleitet werden. Die Wirksamkeitsprüfung und die Auswahl der richtigen Patienten für Therapien und für klinische Studien ist für eine erfolgreiche Anwendung und Entwicklung eines Therapeutikums von herausragender Bedeutung und bisher steht für Morbus Alzheimer kein klinisch messbarer Parameter zur Verfügung, der dieses zuverlässig ermöglicht [12].
Überprüfung der therapeutischen Wirksamkeit von VGF-Proteinen, VGFARP-Peptiden und von Agenzien, die die Expression und die biologische Verfügbarkeit dieser Substanzen modulieren
Ein Ausführungsbeispiel hierfür umfasst die Kultivierung von Zelllinien, und ihre Behandlung mit VGF-Proteinen, VGFARP- Peptiden oder mit Substanzen, die die Expression von VGF- Protein fördern, wie z.B. NGF, BNDF oder NT-3, oder die Pro- zessierung von VGF-Protein zu VGFARP-Peptiden fördern, wie z.B. Prohormonkonvertasen. Dadurch können biologische Eigenschaften von VGF-Protein und VGFARP-Peptiden im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, ermittelt werden. Auch Fusionsproteine und Fusionspeptide können zur Behandlung der Zelllinien verwendet werden, z.B.
Fusionsproteine bestehend aus Prohormonkonvertasen fusioniert mit Peptidsequenzen, die einen Transport des Fusionsproteins ins Zellinnere fördern. Beispiele für mögliche Fusionspartner von z.B. Prohormonkonvertasen sind HIV-TAT-Sequenzen oder An- tennapedia-Sequenzen usw. Ebenso können Zelllinien mit Expressionsvektoren transfiziert werden, die direkt oder indirekt eine Expression von VGF-Protein oder VGFARP-Peptiden durch die transfizierten Zellen bewirken. Diese Expressionsvektoren können u.a. für VGFARP-Peptide, VGF-Proteine, NGF, BNDF, NT-3 oder für Prohormonkonvertasen kodieren. Auch die Transfektion von Kombinationen der genannten Proteine können durchgeführt werden. Alternativ können geeignete Zelllinien mit anti-VGF- Protein- oder anti-VGFARP-Peptid-Antikörpern oder mit Nukleinsäuren, die die Expression von VGF unterdrücken, wie z.B. VGF- Antisense-Nukleinsäuren, VGF-Triplex-Nukleinsäuren oder gegen VGF-mRNA gerichteten Ribozymen, behandelt werden. Auch die Behandlung mit anti-NGF, anti-BNDF oder anti-NT-3 Antikörpern könnte zur Unterdrückung der VGF-Protein Expression durchgeführt werden. Insbesondere Zelllinien, die als neurologische Modellsysteme im Zusammenhang mit VGF als geeignet erscheinen, können zu solchen Untersuchungen herangezogen werden. Als read-out Systeme für diese Untersuchungen können unter anderem Tests verwendet werden, die die Proliferationsrate der behan- delten Zellen, ihre StoffWechselaktivität, die Apoptoserate der Zellen, Änderungen der Zellmorphologie, der Expression von zelleigenen Proteinen oder Reportergenen oder die die Freisetzung von zytosolischen Zellbestandteilen als Marker für Zell- sterben ermitteln. Als weitere Testsysteme können geeignete Stämme von Versuchtieren, z.B. von Mäusen oder Ratten, die als Modell für neurologische Erkrankungen, insbesondere als Modell für Morbus Alzheimer, gelten, verwendet werden. Diese Versuchstiere können zur Untersuchung der Wirksamkeit von Therapiestrategien die die Modulation der Konzentration von VGFARP- Peptiden oder von VGF-Proteinen zum Ziel haben, herangezogen werden. Außerdem können in Versuchstieren auch Proteine und Peptide wie z.B. VGF-Protein, VGFARP-Peptide, NGF, BNDF, NT-3, Prohormonkonvertasen usw. untersucht werden, wobei diese Peptide und Proteine unter Umständen so galenisch aufbereitet werden können, dass sie die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut-Liquor-Schranke besser passieren können. Als galenische Aufbereitungsmethode können unter anderem liposomen-verpackte Proteine und Peptide, Proteine und Peptide fusioniert mit TransportSequenzen, wie z.B. einer HIV-TAT-Sequenz usw. ver- wendet werden. Außerdem können Peptide und Proteine chemisch derart modifiziert werden, dass sie lipophilere Eigenschaften erhalten und daher leichter in Zellen eindringen können. Peptide, die in wässrigen Lösungen nur schwer löslich sind können umgekehrt chemisch derart modifiziert werden, das sie hydro- philer werden und dann als z.B. intravenös injizierbares Therapeutikum verwendet werden können. Säureresitstente Kapseln können verwendet werden, um empfindliche Substanzen, die oral verabreicht werden sollen, im Magen zu schützen. Read-out Parameter bei Versuchen mit Tiermodellen können die
Überlebensdauer der Tiere, ihr Verhalten und ihre Kurzzeitgedächtnisleistung sein. Ein Beispiel für einen Gedächtnistest, der für Versuchstiere geeignet ist, ist der „Morris water maze test" . Als weitere Parameter kann die Bestimmung von Körperfunktion, wie z.B. Bluttests, die Messung von Gehirnströmen, Stoffwechseltest, die Expressionsrate von VGF-Protein und VGFARP-Peptiden und anderen mit der Erkrankung im Zusammenhang stehenden Proteinen, sowie morphologische und histologische Untersuchungen an Geweben, wie z.B. dem Gehirn herangezogen werden.
Die Erfindung wird im folgenden anhand von Beispielen näher illustriert. Dabei wird auch Bezug auf die Abbildungen genom- men.
Abbildung 1: Alignment der VGFARP-Peptide mit den beiden bekannten VGF-Proteinen entsprechend den Datenbank Accession No. NM_003378 und Y12661
Abbildung 2 Reverse Phase Chromatographie zur Separation und Anreicherung der VGFARP-Peptide aus Liqu- or cerebrospinalis
Abbildung 3 Massenspektrometrische Messung (MALDI) am Beispiel von VGFARP-7
Abbildung 4 MALDI als relativ quantifizierende massen- spektroskopische Methode
Abbildung 5 MS/MS-Fragmentspektrum am Beispiel des Pep- tids VGFARP-13 Abbildung 6a - C: „Box-Whisker-Plots" zum quantitativen Vergleich der Konzentrationen von VGFARP-1, VGFARP-2, VGFARP-18, VGFARP-3, VGFARP-4, VGFARP-5, VGFARP-6, VGFARP-7, VGFARP-19, VGFARP-20, VGFARP-21, VGFARP-10, VGFARP-22, VGFARP-28, VGFARP-29, VGFARP-30/32 , VGFARP- 31, VGFARP-12, VGFARP-13, VGFARP-36 und VGFARP-37 in Morbus Alzheimer Patienten verglichen mit Kontrollpatienten.
Die Abbildung 1 zeigt ein Alignment der erfindungsgemäßen Peptide mit zwei bekannten Varianten des VGF-Proteins, die in der Abbildung mit ihren Datenbank Accession No. NM_003378 und Y12661 bezeichnet sind. Sequenzpositionen, die in beiden Varianten der VGF-Proteine identisch sind, sind in der Sequenz von NM_003378 mit einem Stern dargestellt. Unterschiede in den Sequenzen sind durch den Aminosäurecode in weißer Schrift auf schwarzem Hintergrund dargestellt. Der Pfeil am Ende oder am Anfang von Teilsequenzen von VGFARP-12, -13 und 34 zeigt an, das die jeweilige Sequenz sich über zwei Zeilen im Alignment erstreckt .
Die Abbildung 2 zeigt ein Chromatogramm, aufgenommen mit Reverse Phase Chromatographie gemäß Beispiel 2, zur Separation und Anreicherung der VGF-Peptide aus Liquor cerebrospinalis.
I
Die Abbildung 3 zeigt ein Spektrum, das durch MALDI- massenspektrometische Messung gemäß Beispiel 3 von VGFARP-7 entstanden ist, mit einer theoretischen, monoisotopischen Mas- se von 3686 Dalton, nach erfolgter Reverse Phase Chromatographie von humanem Liquor cerebrospinales gemäß Beispiel 2. VGFARP-7 entspricht der VGF-Sequenz (Accession No. Y12661) von Aminosäure 26-62. Die Abbildung 4 zeigt durch MALDI als relativ quantifizierende
MS-Methode erzeugte Daten. Eine Probe wurde mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt und die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch repräsenta- tiver Probensignale ermittelt. Alle Signal-Intensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0,64 μM (= 1) normiert. Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typisches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was in diesem Diagramm anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist.
I
Die Abbildung 5 zeigt ein MS/MS-FragmentSpektrum gemäß Beispiel 4 des erfindungsgemäßen Peptids VGFARP-13.
Obere Spur: Rohdaten der Messung.
Untere Spur: Konvertiertes, dekonvolutiertes Massenspektrum von VGFARP-13.
Das Peak-Muster ist charakteristisch für VGFARP-13. VGFARP-13 entspricht der VGF-Sequenz (Accession No. Y12661) von Aminosäure 421-479.
Die Abbildungen 6A bis 6C zeigen in Form von „Box-Whisker- Plots" einen Vergleich der integrierten MALDI- massenspektrometrischen Signalintensitäten verschiedener
VGFARP-Peptide in Kontrollen, verglichen mit den Signalintensitäten in Proben von Morbus Alzheimer Patienten.
Beispiel 1: Gewinnung von Liquor cerebrospinalis zur Bestimmung von VGFARP-Peptiden
Liquor oder Liquor cerebrospinalis (Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit) ist die in den vier Hirnventrikeln und im Suba- rachnoidalraum enthaltene Flüssigkeit, die vor allem in den
Plexus choroidei der Seitenventrikel gebildet wird. Die Entnahme von Liquor cerebrospinalis erfolgt meist durch Lumbai- punktion, seltener durch Subokzipitalpunktion oder Ventrikel- punktion. Bei der Lumbaipunktion (Spinalpunktion) zur Entnahme von Liquor cerebrospinalis wird bei der Punktion der spinale Subarachnoidalraum zwischen dem 3. und 4. oder dem 4. und 5. Lendenwirbeldornfortsatz mit einer langen Hohlnadel punktiert und so Liquor gewonnen. Anschließend wird die Probe 10 Minuten bei 2000x g zentrifugiert und der Überstand bei minus 80°C gelagert.
Beispiel 2. Trennung von Peptiden in Liquor cerebrospinalis (CSF) zur massenspektrometrischen Messung von VGFARP-Peptiden
Zum massenspektrometrischen Nachweis von VGF-Peptiden in CSF ist in diesem Beispiel eine Trennung der peptidischen Inhalts- Stoffe notwendig. Diese Probenvorbehandlung dient der Anrei- cherung der erfindungsgemäßen Peptide und zur Abtrennung von
Komponenten, die die Messung stören können. Als Trennverfahren wird eine Reverse Phase Chromatographie durchgeführt. Hierbei eignen sich verschiedene RP-Chromatographie-Harze und Eluati- onsmittel gleichermaßen. Im Folgenden ist beispielhaft die Trennung von VGF-Peptiden unter Verwendung einer C18 Reverse Phase Chromatographiesäule mit der Größe 4 mm x 250 mm der Firma Vydac . Es wurden Laufmittel folgender Zusammensetzung verwendet: Laufmittel A: 0,06 % (v/v) Trifluoressigsäure, Laufmittel B: 0,05 % (v/v) Trifluoressigsäure, 80 % (v/v) Ace- tonitril. Die Chromatographie erfolgte bei 33 °C unter Verwendung einer HP-ChemStation 1100 der Firma Agilent Technologies mit einer Flusszelle Micro der Firma Agilent Technologies. Als Probe wurde humaner Liquor cerebrospinalis verwendet. 440 μl Liquor wurden mit Wasser auf 1650 μl verdünnt, der pH auf 2-3 eingestellt, die Probe für 10 Minuten bei 18000x g zentrifugiert und schließlich 1500 μl der so vorbereiteten Probe auf die Chromatographiesäule aufgetragen. Die Chromatographiebedingungen waren wie folgt: 5 % Laufmittel B zum Zeitpunkt 0 min., vom Zeitpunkt 1 bis 45 min kontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 50 %, von Zeitpunkt 45 bis 49 min kontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 100 % und anschließend bis zum Zeitpunkt 53 min konstant 100 % Puffer B. 10 Minuten nach Beginn der Chromatogra- phie wird mit dem Sammeln von 96 Fraktionen zu je 0,5 ml begonnen. Das Chromatogramm einer Liquor cerebrospinalis Probe, hergestellt unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen, ist in Abbildung 2 dargestellt.
Beispiel 3: Ermittlung der Massen von Peptiden mit Hilfe von MALDI-Massenspektrometrie
Zur Massenanalyse werden typische Positiv-Ionen-Spektren von Peptiden in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer (Matrix- unter- stützte Laserdesorptions-Ionisation) erstellt. Geeignete
MALDI-TOF-Massenspektrometer werden von PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager-DE, Voyager-DE PRO oder Voyager-DE STR) oder von Bruker Daltonik Bremen (BIFLEX) hergestellt. Zur Präparation der Proben werden sie mit einer Matrixsubstanz ver- mischt, die typischerweise aus einer organischen Säure besteht. Typische Matrix-Substanzen, die sich für Peptide eignen, sind die 3, 5-Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure, die α-Cyano-4- hydroxyzimtsäure und die 2 , 5-Dihydroxybenzoesäure. Zur Messung der erfindungsgemäßen VGFARP-Peptide wird ein lyophylisiertes, nach Reverse Phase Chromatographie gewonnenes Äquivalent entsprechend 500 μl humanem Liquor cerebrospinalis, verwendet. Die chromatographierte Probe wird in 15 μl einer Matrix-Lösung gelöst. Diese Matrix-Lösung enthält z.B. 10 g/1 α-Cyano-4- hydroxyzimtsäure und 10 g/1 L(-)Fucose gelöst in einem Lö- sungsmittelgemisch bestehend aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Aceton im Volumenverhältnis 49:49:1:1. Von dieser Lösung werden 0,3 μl auf eine MALDI-Trägerplatte transferiert und die getrocknete Probe im MALDI-Massenspektrometer Voyager-DE STR von PerSeptive Biosystems analysiert. Die Messung erfolgt im "Linear Mode" mit "Delayed Extraction" ™. Ein Beispiel für eine Messung eines der erfindungsgemäßen VGFARP- Peptide zeigt Abbildung 3.
Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie kann zur Quantifizierung von Peptiden wie z.B. der erfindungsgemäßen VGFARP-Peptide eingesetzt werden, wenn diese Peptide in einer Konzentration vorliegen, die sich im dynamischen Messbereich des Massenspektro- meters befindet, wodurch Detektorsättigung vermieden wird. Dieses ist für die Messung der erfindungsgemäßen VGFARP- Peptide in Liquor cerebrospinalis bei einer Liquor- Äquivalentkonzentration von 33,3 μl pro μl Matrixlösung der Fall. Für jedes Peptid gibt es ein spezifisches Verhältnis zwischen Messsignal und Konzentration, was bedeutet, dass die MALDI-Massenspektrometrie vorzugsweise zur relativen Quantifizierung von Peptiden herangezogen werden kann. Dieser Sachverhalt ist in Abbildung 4 dargestellt. Wird eine Probe mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt, so kann die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch der Probensignale ermittelt werden. Beispielhaft zeigt Abbildung 4 eine MALDI-Messung als relativ quantifizierende MS-Methode. Alle Signal-Intensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0,64 μM (= 1) normiert. Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typi- sches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist.
Beispiel 4: Massenspektrometrische Identifizierung von VGFARP- Peptiden
Zur Quantifizierung der erfindungsgemäßen VGFARP-Peptide muss sichergestellt werden, dass es sich bei den zu analysierenden Massensignalen von Peptiden in den Fraktionen, gewonnen durch Reverse Phase Chromatographie von Liquor cerebrospinalis, gemäß Beispiel 2, tatsächlich um die erfindungsgemäßen VGFARP- Peptide handelt .
Die Identifikation der erfindungsgemäßen Peptide, in diesen Fraktionen erfolgt z.B. mit nanoSpray-MS/MS [11]. Dabei wird ein VGFARP-Peptid-Ion im Massenspektrometer anhand seines spezifischen m/z (Masse/Ladung) Wertes in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise im Massenspektrometer selektioniert . Dieses selektierte Ion wird anschließend durch Zuführung von Kollisionsenergie mit einem Stoßgas, z.B. Helium oder Stickstoff, fragmentiert und die resultierenden VGFARP-Peptid Bruchstücke im Massenspektrometer in einer integrierten Analyseneinheit detektiert und korrespondierende m/z-Werte bestimmt (Prinzip der Tandem-Massenspektrometrie) [13] . Das Fragmentierungsverhalten von Peptiden ermöglicht bei einer Massengenauigkeit von z.B. 50ppm eine eindeutige Identifizierung der erfindungsgemäßen VGFARP-Peptide unter Verwendung von computergestützten Suchverfahren [14] in Sequenzdatenbanken, in die die Sequenz eines VGF-Proteins eingetragen wurde. In diesem speziellen Fall erfolgte die massenspektrometrische Analyse mit einem Quadrupol-TOF-Instrument , Modell "QStar-Pulsar" der Firma Applied Biosystems-Sciex, USA. Beispielhafte MS/MS Fragmentspektren sind in Abbildung 5 gezeigt.
Beispiel 5: Massenspektrometrische Quantifizierung von VGFARP- Peptiden zum Vergleich ihrer relativen Konzentration in Kontrollproben verglichen mit Patientenproben Für 222 klinische Proben, d.h. 82 Kontrollproben und 130 Proben von Patienten, die an Morbus Alzheimer erkrankt sind, wurde nach einer Probenvorbereitung gemäß Beispiel 1 und 2 eine nachgeschaltete MALDI-Messung der erfindungsgemäßen VGFARP- Peptide gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Exemplarische MALDI- Signalintensitäten sind in Form von „Box-Whisker-Plots" in den Abbildungen 6A bis 6C visualisiert . Die in Abbildung 6 dargestellten „Box-Whisker-Plots" beruhen auf Messwerten, die je- weils anhand von 29 bis 45 Proben von Morbus Alzheimer Patienten, bzw. 13 bis 44 Kontrollproben je Experiment durchgeführt wurden. Insgesamt wurden 4 Experimente durchgeführt. Die dargestellten „Box-Whisker-Plots" ermöglichen den Vergleich der integrierten MALDI-massenspektrometrischen Signalintensitäten verschiedener VGFARP-Peptide in Kontrollen, mit den MALDI- Signalintensitäten in Proben von Morbus Alzheimer Patienten. Dabei umfasst die „Box" , d.h. die Säulen in den Diagrammen in den Abbildungen 6A bis 6C jeweils den Bereich der MALDI- Signalintensitäten, in dem sich 50 % der jeweiligen MALDI- Signalintensitäten befinden, die von der „Box" ausgehenden nach oben und nach unten weisenden Linien („Whisker" ) geben den Bereich an, in dem sich jeweils die 25 % der Messwerte befinden, die die höchsten Signalintensitäten aufweisen (oberes Quartil) , bzw. in dem sich die 25 % der Messwerte befinden, die die niedrigsten Signalintensitäten aufweisen (unteres Quartil) . Die durchgezogene Linie in den Säulen gibt den Medianwert und die gestrichelte Linie in den Säulen gibt den Mittelwert an.
Die Überschriften in diesem Dokument sind lediglich zur Strukturierung des Textes bestimmt. Sie sind nicht dazu bestimmt, die beschriebenen Sachverhalte zu limitieren oder ein zu schränken. Alle Beispiele sollen den Erfindungsgedanken näher charakterisieren, sollen jedoch den Äquivalenzbereich der Erfindung nicht eingrenzen.
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SEQUENCE LISTING
<110> BioVisioN AG BioVisioN AG
<120> Verfahren zum Nachweis chronisch-demenzieller Erkrankungen , zu-gehörige Peptide und Nachweisreagenzien
<130> VGF-PCT
<160> 35
<170> Patentin version 3.1
<210> 1
<211> 37
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Ala Pro Pro Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu 1 5 10 15
His Lys Glu Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly 20 25 30
Ser Ala Pro Glu Val 35
<210> 2
<211> 40
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 2
Ala Pro Pro Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu 1 5 10 15
His Lys Glu Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly 20 25 30
Ser Ala Pro Glu Val Arg Gly Ala 35 40 <210> 3
<211> 36
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 3
Ala Pro Pro Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu 1 5 10 15
His Lys Glu Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly 20 25 30
Ser Ala Pro Glu 35
<210> 4
<211> 36
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 4
Pro Pro Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His 1 5 10 15
Lys Glu Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser 20 25 30
Ala Pro Glu Val 35
<210> 5
<211> 39
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400>
Pro Pro Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His 1 5 10 15
Lys Glu Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser 20 25 30 Ala Pro Glu Val Arg Gly Ala 35
<210> 6
<211> 34
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 6
Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His Lys Glu 1 5 10 15
Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro 20 25 30
Glu Val
<210> 7
<211> 36
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 7
Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His Lys Glu 1 5 10 15
Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro 20 25 30
Glu Val Arg Gly 35
<210> 8
<211> 37
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 8
Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His Lys Glu 1 5 10 15 Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro 20 25 30
Glu Val Arg Gly Ala 35
<210> 9
<211> 33
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400>
Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His Lys Glu 1 5 10 15
Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro 20 25 30
Glu
<210> 10
<211> 32
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 10
Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His Lys Glu 1 5 10 15
Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro 20 25 30
<210> 11
<211> 39
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 11
Gly Arg Pro Glu Ala Gin Pro Pro Pro Leu Ser Ser Glu His Lys Glu 5 10 15
Pro Val Ala Gly Asp Ala Val Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro 20 25 30
Glu Val Arg Gly Ala Arg Asn 35
<210> 12
<211> 14
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 12
Pro Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro Glu Val Arg Gly Ala 1 5 10
<210> 13
<211> 25
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 13
Leu Asp Arg Pro Ala Ser Pro Pro Ala Pro Ser Gly Ser Gin Gin Gly 1 5 10 15
Pro Glu Glu Glu Ala Ala Glu Ala Leu 20 25
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 14
Gly Pro Lys Asp Gly Ser Ala Pro 1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens <400> 15
His Lys Glu Pro Val Ala Gly Asp 1 5
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 16
Ala Pro Ser Gly Ser Gin Gin Gly 1 5
<210> 17
<211> 36
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 17
Ser Gin Thr His Ser Leu Pro Ala Pro Glu Ser Pro Glu Pro Ala Ala 1 5 10 15
Pro Pro Arg Pro Gin Thr Pro Glu Asn Gly Pro Glu Ala Ser Asp Pro 20 25 30
Ser Glu Glu Leu 35
<210> 18
<211> 11
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 18
Gin Glu Leu Arg Asp Phe Ser Pro Ser Ser Ala 1 5 10
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens <400> 19
Glu Pro Ala Ala Pro Pro Arg Pro 1 5
<210> 20
<211> 68
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 20
Leu Gin Glu Ala Ala Glu Glu Arg Glu Ser Ala Arg Glu Glu Glu Glu 1 5 10 15
Ala Glu Gin Glu Arg Arg Gly Gly Glu Glu Arg Val Gly Glu Glu Asp 20 25 30
Glu Glu Ala Ala Glu Ala Ala Glu Ala Glu Ala Asp Glu Ala Glu Arg 35 40 45
Ala Arg Gin Asn Ala Leu Leu Phe Ala Glu Glu Glu Asp Gly Glu Ala 50 55 60
Gly Ala Glu Asp 65
<210> 21
<211> 18
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 21
Gly Leu Gin Glu Ala Ala Glu Glu Arg Glu Ser Ala Arg Glu Glu Glu 1 5 10 15
Glu Ala
<210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> homo sapiens
<400> 22
Gly Leu Gin Glu Ala Ala Glu Glu Arg Glu Ser Ala Arg Glu Glu Glu 1 5 10 15
Glu Ala Glu Gin Glu 20
<210> 23
<211> 45
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 23
Gly Gly Glu Glu Arg Val Gly Glu Glu Asp Glu Glu Ala Ala Glu Ala 1 5 10 15
Glu Ala Glu Ala Glu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Gin Asn Ala Leu Leu 20 25 30
Phe Ala Glu Glu Glu Asp Gly Glu Ala Gly Ala Glu Asp 35 40 45
<210> 24
<211> 32
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 24
Gly Gly Glu Glu Arg Val Gly Glu Glu Asp Glu Glu Ala Ala Glu Ala 1 5 10 15
Glu Ala Glu Ala Glu Glu Ala Glu Arg Ala Arg Gin Asn Ala Leu Leu 20 25 30
<210> 25
<211> 45
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 25 Gly Glu Glu Arg Val Gly Glu Glu Asp Glu Glu Ala Ala Glu Ala Ala 1 5 10 15
Glu Ala Glu Ala Asp Glu Ala Glu Arg Ala Arg Gin Asn Ala Leu Leu 20 25 30
Phe Ala Glu Glu Glu Asp Gly Glu Ala Gly Ala Glu Asp 35 40 45
<210> 26
<211> 36
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 26
Ser Gin Glu Glu Thr Pro Gly His Arg Arg Lys Glu Ala Glu Gly Thr 1 5 10 15
Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Met Asp Pro Gin Thr 20 25 30
Ile Asp Ser Leu 35
<210> 27
<211> 52
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 27
Ser Gin Glu Glu Thr Pro Gly His Arg Arg Lys Glu Ala Glu Gly Thr 1 5 10 15
Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Met Asp Pro Gin Thr 20 25 30
Ile Asp Ser Leu Ile Glu Leu Ser Thr Lys Leu His Leu Pro Ala Asp 35 40 45
Asp Val Val Ser 50
<210> 28
<211> 59
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 21
Ser Gin Glu Glu Thr Pro Gly His Arg Arg Lys Glu Ala Glu Gly Thr 1 5 10 15
Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu Asp Asp Glu Glu Met Asp Pro Gin Thr 20 25 30
Ile Asp Ser Leu Ile Glu Leu Ser Thr Lys Leu His Leu Pro Ala Asp 35 40 45
Asp Val Val Ser Ile Ile Glu Glu Val Glu Glu 50 55
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 29
Ser Thr Lys Leu His Leu Pro Ala Asp Asp Val Val Ser 1 5 10
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 30
Ala Glu Glu Arg Glu Ser Ala Arg 1 5
<210> 31
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens <400> 31
Glu Asp Glu Glu Ala Ala Glu Ala 1 5
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 32
Glu Glu Met Asp Pro Gin Thr Ile 1 5
<210> 33
<211> 38
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 33
Asn Ala Pro Pro Glu Pro Val Pro Pro Pro Arg Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15
Thr His Val Arg Ser Pro Gin Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30
Arg Asp Glu Leu Pro Asp 35
<210> 34
<211> 37
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 34
Asn Ala Pro Pro Glu Pro Val Pro Pro Pro Arg Ala Ala Pro Ala Pro 1 5 10 15
Thr His Val Arg Ser Pro Gin Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala 20 25 30 Arg Asp Glu Leu Pro 35
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> homo sapiens
<400> 35
Pro Thr His Val Arg Ser Pro Gin 1 5

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis einer chronisch-demenziellen Erkrankung oder einer Veranlagung für eine chronisch-demenzielle Erkrankung durch Bestimmung der relativen Konzentration wenigstens eines Markerpeptids, verglichen mit der Konzentration des Markerpeptids in einer Kontrollprobe, dadurch gekennzeichnet dass: a) als Markerpeptid wenigstens ein Peptid, abgeleitet von der Sequenz mit der Accession No. Y12661 aus der DNA Data Bank of Japan verwendet wird, und b) eine für das jeweilige Markerpeptid spezifische Konzentrationsänderung in der Probe relativ zu einer Kontroll- probe festgestellt wird, und c) eine signifikante Konzentrationsänderung des Markerpeptids in der unter b) genannten Weise als positives Nachweisergebnis für die chronisch-demenzielle Erkrankung gewertet wird.
2. Verfahren zum Nachweis einer chronisch-demenziellen Erkrankung oder einer Veranlagung für eine chronisch-demenzielle Erkrankung durch Bestimmung der relativen Konzentration wenigstens eines Markerpeptids, verglichen mit der Konzentration des Markerpeptids in einer Kontrollprobe, dadurch gekenn- zeichnet dass: a) als Markerpeptid wenigstens ein Peptid, abgeleitet von der Sequenz mit der Gene Bank Accession No. NM_003378 verwendet wird, und b) eine für das jeweilige Markerpeptid spezifische Konzen- trationsänderung in der Probe relativ zu einer Kontroll- probe festgestellt wird, und c) eine signifikante Konzentrationsänderung des Markerpeptids in der unter b) genannten Weise als positives Nachweisergebnis für die chronisch-demenzielle Erkrankung ge- wertet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Peptid a) Ein VGFARP-Peptid ist, oder b) ein Peptid entsprechend der Accession No. Y12661 der DDBJ-Datenbank ist, oder c) ein Peptid entsprechend der Gene Bank Accession No. NM_003378 ist, oder d) ein Abkömmling eines natürlich vorkommenden Alles der unter a) bis c) genannten Peptide ist, oder e) eine VGFARP-Mutante ist, wobei die VGFARP-Mutante vorzugsweise in maximal 2, Aminosäuren von der entsprechenden nicht mutierten VGFARP-Sequenz abweicht, oder f) eine Mutante einer der unter b) oder c) genannten Peptide ist, wobei die Aminosäuresequenz maximal 20 % von den unter b) oder c) genannten Aminosäuresequenz abweicht, oder g) ein chemisch modifiziertes, oder postranslational modifiziertes Peptid entsprechen a) bis f) ist
4. Verfahren zum Nachweis einer chronisch-demenziellen Erkrankung gemäß Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es in Kombination mit anderen Diagnoseverfahren für chronisch- demenzielle Erkrankungen zur Erhöhnung von deren Sensitivität und/oder Spezifität durchgeführt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die demenzielle Erkrankung Morbus Alzheimer oder eine verwandte neurologische Erkrankung, insbesondere Le- wy-Body Demenz oder vaskulare Demenz ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein identifiziertes VGFARP-Peptid ausgewählt wird, wobei das Peptid in nicht modifizierter Form, mit posttranslationalen Modifikationen oder in chemisch modifizierter Form, vorzugsweise als Peptid-Oxid vorliegt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekenn- zeichnet, dass die Peptid Konzentration für einen positiven Nachweis der Erkrankung für jedes der Peptide in spezifischer Richtung relativ zur Konzentration des jeweiligen Peptides in einer Kontrollprobe erhöht oder erniedrigt ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass es zur Bestimmung der Schwere der Erkrankung, zur Prognose des Verlaufs, oder zur Diagnose von Vorstufen neurologischer Erkrankungen, insbesondere von "mild cognitive impairment" (MCI) herangezogen wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe Liquor cerebrospinalis, Serum, Plasma, Urin, Synovialflüssigkeit , Stuhl, Tränenflüssigkeit, Sputum oder ein Gewebehomogenat ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Peptide mit Hilfe einer massenspektrometrischen Bestimmung vorgenommen wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung die massenspektrometrische Bestimmung wenigstens einen der theoretischen, monoisotopischen Massenpeaks von 3666,8278 / 3950,9875 / 3567,7594 / 3595,7907 / 3879,9504 / 3401,6852 / 3614,8077 / 3685,8448 / 3302,6167 / 3173,5741 / 3955,9889 / 1336,6735 / 2503,1827 / > 727,3501 / > 851,4137 / > 730,3246 / 3745,7343 / 1235,5782 / > 833,4395 / 7518,2744 / 2031,8981 / 2418,0419 / 4806,0408 / 3456,5513 / 4806,0408 / 4058,7043 / 5776,6294 / 6618,0363 / 1380,7249 / 946,4468 / > 862,3192 / > 961,4063 / 3903,0180 / 3787,9911 / > 920,4828 Dalton umfasst.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Identifizierung der Peptide mit Hilfe eines immunologischen, molekularbiologischen, physikalischen oder chemischen Tests vorgenommen wird.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologische Test ein ELISA (Enzyme Linked Immuno Sor- bent Assay), ein Radioimmunoassay oder ein Westernblot ist.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Peptide mit Hilfe eines auf ein Peptid oder ein Peptidfragment gerichteten Antikörpers, Antikörperfragments, Phagenpartikels, PNAs oder einer Affinitätsmatrize geschieht.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch ge- kennzeichnet, dass die Probe vor der Identifizierung chromato- grafisch fraktioniert wird, vorzugsweise mit Reverse Phase Chromatographie, weiter vorzugsweise mit hochauflösender Reverse Phase Chromatographie .
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe vor der Identifizierung durch Fällungsreaktionen oder Flüssigphasentrennungen fraktioniert wird.
17. Ein Peptid, dass a) ein VGFARP-Peptid ist, oder b) ein VGFARP-Abkömmling eines VGF-Proteins ist, insbesondere ein Abkömmling von NM_003378 oder Y12661, oder c) ein VGFARP-Abkömmling eines VGF-Allels ist, oder d) eine VGFARP-Mutante ist, wobei die VGFARP-Mutante vorzugsweise in maximal 2, Aminosäuren von der entsprechenden nicht mutierten VGFARP-Sequenz abweicht, oder e) ein chemisch, oder postranslational modifiziertes Peptid entsprechend a) bis f) ist
18. Verwendung wenigstens eines der Peptide gemäß Anspruch 17 zur Gewinnung von Antikörpern und zur Entwicklung von Diagno- sereagentien zum Nachweis neurologischer Erkrankungen, insbe- sondere chronisch-demenzieller Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer.
19. Antikörper, die die Peptide gemäß Anspruch 17 binden.
20. Verwendung von Antikörpern gegen VGF oder von Antikörpern gemäß Anspruch 19 zur Diagnose neurologischer Erkrankungen, insbesondere chronisch-demenzieller Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer.
21. Verwendung von Nukleinsäuren, die zu VGFARP-Peptiden oder zu VGF-Proteinen korrespondieren zur indirekten Bestimmung und Quantifizierung der zugehörigen Proteine und Peptide geeignet sind.
22. Verwendung eines Verfahrens entsprechend Anspruch 21, bei dem der Nachweis der VGF-Nukleinsäuren unter Verwendung von Northernblots, von Reverse Transkriptase PCR oder von quantitativer PCR erfolgt.
23. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis 16 oder gemäß Anspruch 20 bis 22 zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Therapie für eine neurologische Erkrankung, insbesondere einer chronisch-demenziellen Erkrankung, insbesondere bei Morbus Alzheimer.
24. Verwendung eines Verfahrens gemäß Anspruch 1 bis 16 oder gemäß Anspruch 20 bis 22 zur Stratifizierung von Patienten die für Therapien oder klinische Studien neurologischer Erkrankun- gen, insbesondere chronisch-demenzieller Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer geeignet sind.
25. Nukleinsäuren, die zu VGFARP-Peptiden korrespondieren.
26. Nukleinsäuren, die als VGF-spezifische Antisense- Nukleinsäuren oder als VGF-spezifische Ribozyme, oder als VGF- spezifische Triplex-Nukleinsäuren geeignet sind.
27. Synthetische Agonisten oder Antagonisten der in Anspruch 3 genannten VGF-Peptide.
28. Peptide gemäß den in Anspruch 3 genannten Peptiden, oder Stoffe gemäß Anspruch 25 bis 27 wobei diese Peptide, Nuklein- säure, Agonisten und Antagonisten in einer Art und Weise galenisch aufbereitet oder chemisch oder biologisch modifiziert sind, dass sie die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut- Liquor-Schranke passieren können.
29. Peptide gemäß den in Anspruch 3 genannten Peptiden, oder Stoffe gemäß Anspruch 25 bis 27, wobei diese Stoffe in einer Art und Weise galenisch aufbereitet oder chemisch oder biologisch modifiziert sind, dass sie für spezielle Applikationswe- ge optimiert sind, insbesondere für die Gabe in den Blutkreislauf, den Gastrointestinaltrakt, den Urogenitaltrakt, das lymphatische System, in den Subarachnoidalraum, zur Inhalation oder zur direkten Injektion in Gewebe wie z.B. Muskelgewebe, Fettgewebe, Gehirn usw.
30. Verwendung wenigstens eines der in Anspruch 3 angegebenen Peptide oder der Nukleinsäuren, Peptide, Agonisten oder Anta- gonisten gemäß Anspruch 25 bis 27 als Arzneimittel oder Arzneimittel-Wirkstoff .
31. Verwendung von wenigstens eines der in Anspruch 3 angegebenen Peptide oder von Nukleinsäuren, Peptiden, Antagonisten oder Agonisten gemäß Anspruch 25 bis 27 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Behandlung neurologischer Erkrankungen, insbesondere chronisch-demenzieller Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer.
32. Verwendung wenigstens einer Substanz, die die Expression von VGF-Proteinen moduliert, z.B. NGF, BNDF oder NT-3, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Behandlung neurologischer Erkrankungen, insbesondere chronisch- demenzieller Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer.
33. Verwendung wenigstens einer Substanz, die selektiv die Transkription oder Expression einer einzelnen VGF-Gen- Variante, insbesondere NM_003378 oder Y12661, inhibiert oder stimuliert zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Behandlung neurologischer Erkrankungen, insbesondere chronisch-demenzieller Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer.
34. Verwendung einer Substanz, die wenigstens an eines der in Anspruch 3 angegebenen Peptide bindet, insbesondere von Antikörpern, Antikörperfragmenten, PNAs oder Affinitätsmatrizen zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe oder Behandlung neurologischer Erkrankungen, insbesondere chronisch- demenzieller Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer.
35. Verwendung wenigstens eines der in Anspruch 3 genannten Peptide oder der Nukleinsäuren, Peptide, Antagonisten oder Agonisten gemäß Anspruch 25 bis 27 zur Therapie von neurologi- sehen Erkrankungen, insbesondere chronisch-demenziellen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer.
36. Verfahren zur therapeutischen Modulierung der Konzentrati- on von mindestens einem der in Anspruch 3 genannten Peptide oder von Nukleinsäuren gemäß Anspruch 25 in einem Patienten mit einer neurologischen Erkrankung, insbesondere chronisch- demenziellen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer.
37. Verfahren entsprechend Anspruch 36, bei dem eine Verminde- rung der Konzentrationen an VGF-Peptiden oder Nukleinsäuren angestrebt wird.
38. Verfahren entsprechend Anspruch 36, bei dem eine Erhöhung der Konzentrationen an VGF-Proteinen oder an VGFARP-Peptide angestrebt wird.
39. Verfahren entsprechend Anspruch 37, bei dem einem Patienten a) Antikörper, die gegen VGF-Proteine, VGFARP-Peptide, NGF, BNDF oder NT-3 gerichtet sind, verabreicht werden, oder b) Antisense-Nukleinsäuren, Triplex-Nukleinsäuren oder Ribozyme verabreicht werden um die Expression von VGF-Proteinen, VGFARP-Peptiden, NGF, BNDF oder NT-3 zu vermindern, oder c) Substanzen, die die Prozessierung von VGF-Proteinen inhi- bieren, verabreicht werden, oder d) Antagonisten der in Anspruch 3 genannten VGF-Peptide verabreicht werden
40. Verfahren entsprechend Anspruch 38, bei dem einem Patien- ten a) VGF-Proteine, VGFARP-Peptide, NGF, BNDF oder NT-3 verabreicht wird, oder b) Nukleinsäuren verabreicht werden, die für VGF-Proteine, VGFARP-Peptide, NGF, BNDF oder NT-3 zu kodieren, oder c) Substanzen verabreicht werden, die die Prozessierung von
VGF-Proteinen fördern, oder d) Agonisten der in Anspruch 3 genannten VGF-Peptide verabreicht werden
41. Screenigverfahren zur Identifizierung von Substanzen, die in der Lage sind die Expression mindestens eines der in An- spruch 3 genannten Peptidezu vermindern oder zu verstärken.
42. Screeningverfahren zur Identifizierung von Rezeptoren, oder Inhibitoren die mindestens eines der in Anspruch 3 genannten Peptide binden.
43. Screeningverfahren zur Identifizierung von Agonisten oder Antagonisten mindestens eines der in Anspruch 3 genannten Peptide.
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