WO2004097420A1 - Verfahren zum nachweis einer neurologischen, demenziellen erkankung, die mit einer verschlechterung des kurz- oder langzeitgedächtnis einhergeht, zugehörige prosaas-peptide und nachweisreagenzien - Google Patents

Verfahren zum nachweis einer neurologischen, demenziellen erkankung, die mit einer verschlechterung des kurz- oder langzeitgedächtnis einhergeht, zugehörige prosaas-peptide und nachweisreagenzien Download PDF

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WO2004097420A1
WO2004097420A1 PCT/DE2004/000861 DE2004000861W WO2004097420A1 WO 2004097420 A1 WO2004097420 A1 WO 2004097420A1 DE 2004000861 W DE2004000861 W DE 2004000861W WO 2004097420 A1 WO2004097420 A1 WO 2004097420A1
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prosaas
peptide
seq
fragments
disease
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PCT/DE2004/000861
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Hans-Dieter Zucht
Hartmut Selle
Jens Lamerz
Thomas Möhring
Michael Schrader
Michael JÜRGENS
Gabriele Heine
Rüdiger HESS
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Biovision Ag
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Publication date
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4711—Alzheimer's disease; Amyloid plaque core protein
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G01N33/6896—Neurological disorders, e.g. Alzheimer's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/28—Neurological disorders
    • G01N2800/2814—Dementia; Cognitive disorders

Definitions

  • the invention relates to methods for detection, in particular for laboratory diagnostic detection, neurological, dementia diseases which are associated with a deterioration in short or long-term memory or a predisposition to such diseases or methods for the prognosis of such diseases.
  • concentration of certain proSAAS peptides or proSAAS nucleic acids in samples of an individual, in particular in body fluids is determined, in particular within a method that can be carried out in the laboratory.
  • the invention further relates to peptides and nucleic acids which have been found to determine the probability of the future occurrence of the disease, and / or the presence and / or the prognosis and / or the degree of the neurological, dementia disease.
  • Neurological and dementia diseases are an increasing problem in the industrialized countries due to the increasing average life expectancy. Most of these diseases are not curable and require long-term, costly care for the sick. More than 60 dementias are known, including those that cause dementia. About 65% of this is attributable to Alzheimer's disease (Alzheimer's disease, Alzheimer's disease, AD), the diagnosis and therapy of which is therefore of great importance.
  • AD Alzheimer's disease
  • non-Alzheimer's dementias are known, among others: vascular dementia, Lewy body dementia, Binswanger dementia and dementia diseases which are an accompanying effect of other diseases such as Parkinson's disease, Huntington's disease, Pick's disease, Gerstmann -St Hurssler-Scheinger disease, Creuzfeldt-Jakob-
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease that is particularly characterized by a very limited short-term memory. Morphologically there are changes in the brain, which manifest themselves in the form of amyloid deposits and degenerated nerve cells. The morphological changes can be diagnosed histologically after the patient's death and are still the only reliable evidence of the disease to this day. These histopathological diagnoses are based on criteria established by the "Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease" (CERAD).
  • the following criteria-based diagnostic systems are currently used to diagnose Alzheimer's disease: The "International Classification of Diseases, 10th revision” (ICD-10), the “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition” (DSM-IV) of the "American Psychiatry” Association ", and that of the" National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke / Alzheimer's Disease and Related Disorders Association "NINCDS-ADRDA” Work Group crieria ".
  • Alzheimer's disease No causal therapy for the treatment of Alzheimer's disease is currently available.
  • the disease is only treated symptomatically, for example by the administration of neurotransmitters such as acetylcholine or acetylcholinesterase inhibitors.
  • neurotransmitters such as acetylcholine or acetylcholinesterase inhibitors.
  • the administration of antioxidants, free radical scavengers, calcium channel blockers, anti-inflammatory substances, secretase inhibitors, anti-amyloid antibodies etc. and immunization against amyloid peptides are currently being tested as further possible therapy strategies. So far, however, no causal therapy of this disease is possible.
  • a generic method is already known from WO 02/090974, in which the presence and possibly the severity of a chronic dementia disease is indicated by a marker peptide. Other markers are also known from WO 02/082075.
  • the invention has for its object to provide additional markers for the diagnosis of Alzheimer's disease, thereby improving the diagnosis of neurological, dementia diseases which are associated with a deterioration of the short or long-term memory, an early and reliable method for To provide evidence of these diseases, in particular Alzheimer's disease, and to provide methods for the therapy of these diseases.
  • the invention comprises a method for the detection of a neurological, dementia disease which is accompanied by a deterioration of the short or long-term memory, in particular of a disease
  • Alzheimer's or a predisposition to such an illness by determination of proSAAS and / or one or more proSAAS fragments, which are derived from the sequence with the SwissProt Accession No. Q9UHG2 ( SEQ ID 28) are derived in a biological sample from an individual.
  • This is preferably a laboratory technique, the result of which can be used by a doctor for diagnosis. Since it can be assumed that the detected substances are causally related to the disease, the present invention also includes their gift for the therapy of Alzheimer's disease or related neurological, dementia diseases.
  • the invention provides a method for the detection or prognosis of a neurological, dementia disease which is accompanied by a deterioration of the short or long-term memory, in particular Alzheimer's disease.
  • a neurological, dementia disease which is accompanied by a deterioration of the short or long-term memory, in particular Alzheimer's disease.
  • at least proSAAS or proSAAS fragment is determined in a patient's biological sample.
  • Another embodiment is the diagnosis of such diseases at an early stage, e.g. in the diagnosis of mild cognitive impairment (MCI) or the diagnosis of neurological diseases that are different from Alzheimer's disease, such as Lewy body dementia, vascular dementia or depression.
  • MCI mild cognitive impairment
  • the presence of a peptide or a nucleic acid can generally be examined, and the absence or presence of this substance then enables a diagnosis of the disease. You can generally test for the absence or presence of the disease.
  • concentrations of these substances which are usually present in controls and in patients who suffer from the disease to be diagnosed are first determined, and on the basis of these measured values a limit value, often called the "cut-off" point, is determined, which the group of regarded as healthy from the group of those regarded as sick.
  • the limit value determined individually for each peptide or nucleic acid enables a clear differentiation between healthy and sick people.
  • the peptide or nucleic acid is by definition also reduced if these cannot be detected because they are not present in the sample or because they are present in a concentration below the detection limit.
  • an increase or decrease in the concentration of the marker in a sample of the patient specific to the respective marker is determined relative to the concentration of this marker in the control sample and a significant change in concentration is evaluated as a positive result of the disease.
  • the markers are reduced in the presence of the neurological, dementia disease, below the detection limit or are completely missing in the biological sample.
  • Preferred markers according to the invention are specified in the sequence listing and are named with the sequences corresponding to SEQ ID 1 to 35 and 37 to 52 of the sequence listing.
  • the sequences of the preferred peptides are shown in Table 1 and partly also in Figure 1.
  • the concentration of the proSAAS peptides or proSAAS nucleic acids in the biological sample, but also the characteristic pattern of the occurrence of several defined substances in this group, can preferably be correlated with the severity, the prognosis or the probability of the disease occurring.
  • proSAAS e.g. Laboratory diagnostic detection of proSAAS, proSAAS peptides or proSAAS nucleic acids
  • therapeutic and diagnostic agents can also be developed and used medically that are only effective in sub-groups of patients.
  • Another aspect of the invention is therefore to bring the reduced concentrations of proSAAS or proSAAS fragments in Alzheimer's disease patients to normal or possibly even increased concentrations, relative to the concentrations in persons not suffering from Alzheimer's disease. It should be borne in mind that it is possible that a certain proSAAS fragment is reduced in concentration, but that it may make sense to use the entire proSAAS
  • proSAAS fragment intended for diagnostic purposes can be a defined breakdown product of proSAAS or another proSAAS fragment and therefore only indicates indirectly which substance derived from proSAAS should be used therapeutically. This does not change the specificity of the diagnosis, because in this case, after determining, for example, a concentration value that is too low for a certain proSAAS fragment X, a precisely defined other proSAAS fragment Y or the entire proSAAS must be administered therapeutically. This procedure can be used to treat Alzheimer's disease or related neurological and dementia diseases.
  • proSAAS or proSAAS fragments are deficiency of proSAAS or proSAAS fragments as the cause of the disease.
  • therapeutic administration of proSAAS or proSAAS fragments or corresponding agonists can be carried out.
  • Substances that influence the processing of proSAAS can also be used therapeutically.
  • PEN As can be seen in Figure 1, for example "PEN”, “little LEN” and “little PEN-LEN” are flanked by two so-called di-basic amino acid sequences (in these cases Arg-Arg and Lys-Arg) and "Big SAAS” corresponds to the proSAAS amino acid sequence between the end of the proSAAS signal sequence and the first di-basic sequence in proSAAS and "big PEN-LEN” and “big LEN” are each from a di-basic sequence and the stop codon flanked by proSAAS.
  • Dibasic sequences are often targets for proteases, which play a role in the processing of proteins into biologically active peptides.
  • proSAAS it has already been shown that at least some proSAAS fragments can be generated from the parent molecule proSAAS by prohormone convertases.
  • Human proSAAS contains a total of 6 such dibasic sequences which can potentially be recognized by prohormone convertases.
  • proSAAS fragments and proSAAS nucleic acids in particular proSAAS fragments, which are processed by enzymes such as prohormone convertases such as PC-1, PC-2, PC-5, PC-7, PACE4 or furin can arise, as well as corresponding peptidomimetics for the treatment of neurological diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • fusion proteins of these proteins and protein fragments can also be used.
  • Two or more proteins or protein fragments can also be linked to one another or to further non-proSAAS sequences.
  • These peptides can be linked both covalently and non-covalently, and linear, branched or circular molecules or combinations of linear, branched or circular molecules can be produced from these proteins or protein fragments.
  • An example of a non-covalent linkage would be the linkage of a biotin-labeled proSAAS with a streptavidin-labeled antibody.
  • the invention includes agonists which increase the concentration or activity of the proteins and protein fragments mentioned. Examples of such agonists would be prohormone convertases which, for example, increase the formation of certain proSAAS fragments and thus increase the concentration of these proSAAS fragments.
  • Another embodiment of this invention is the galenical formulation or chemical modification of proSAAS, proSAAS fragments and proSAAS nucleic acids in a manner that enables them to more efficiently close the blood-brain barrier and / or the blood-CSF barrier happen or that enables them to get into the cell more efficiently.
  • these substances modified in this way are particularly suitable for therapeutic use.
  • proSAAS, proSAAS fragments, proSAAS nucleic acids, proSAAS agonists, etc. can be modified in such a way that they become lipophilic, for example, which favors the passage into the subarachnoid space.
  • hydrophobic molecular components such as hydrocarbon chains or also by “packaging” the substances in hydrophobic agents, for example liposomes.
  • non-proSAAS peptide sequences can be used which prevent the entry of proSAAS, proSAAS fragments, proSAAS nucleic acids, proSAAS agonists, etc. in the subarachnoid space, or, conversely, make it difficult to exit the subarachnoid space or that facilitate or promote the transport of these substances through the cell membrane, for example the HIV-Tat sequence, the Antennapedia sequence or the VP22 Sequence can cause.
  • the invention also includes the administration of the substances mentioned in various ways, e.g. as an intravenous injection, as an orally administrable substance, as an inhalable gas or aerosol, as a topical application or the administration in the form of direct injections into the subarachnoid space, or into tissue such as e.g. Muscle, adipose tissue, brain, etc.
  • tissue such as e.g. Muscle, adipose tissue, brain, etc.
  • tissue e.g. Muscle, adipose tissue, brain, etc.
  • proteins or protein fragments that are administered orally can be protected from proteolytic breakdown in the stomach by acid-resistant capsules. Strongly hydrophobic substances can be made more hydrophilic by suitable galenical preparations and therefore more suitable for e.g. intravenous injections.
  • these substances can e.g. with polymers such as Polyethylene glycol linked, that is to be pegylated.
  • Pegylated substances are often more soluble, less immunogenic and have a longer in vivo half-life.
  • Other possible dosage forms include the packaging of the active substances in polymers or gels (Atrix Labs, Fort Collins, CO, USA, Andrx Pharmaceuticals, Davie, FL USA) etc., which means that their continuous and controlled release can be achieved over a longer period of time.
  • Another embodiment of the invention is the use of proSAAS, proSAAS fragments, proSAAS nucleic acids or proSAAS agonists in Screening procedures to identify diagnostics or therapeutics against neurological diseases.
  • Screening procedures can be used, for example, to find molecules which bind proSAAS or proSAAS fragments (for example receptors) or which activate these molecules or increase their concentrations (for example prohormone convertases).
  • Receptors identified in this way can be modulated by administration of agonists or antagonists, which is useful for the therapy of neurological diseases, in particular Alzheimer's disease.
  • a peptide means at least 2 amino acids which are covalently linked to one another via a peptide bond, preferably at least 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, preferably at least more than 50 amino acids. There is no limit to the number of maximum possible amino acids, and a protein is therefore basically a peptide.
  • proSAAS proSAAS refers to peptides or nucleic acids that cover the entire
  • sequence of a naturally occurring proSAAS correspond, preferably human proSAAS, preferably the human proSAAS amino acid sequence corresponding to SEQ ID 28 or the human proSAAS nucleic acid sequence corresponding to SEQ ID 36. This includes all types of proSAAS that occur in nature, regardless of which species they come from.
  • Fragments of proSAAS or proSAAS nucleic acids are partial sequences of the respective amino acid or nucleic acid sequences. These fragments are in the
  • amino acid sequences at least 8 amino acids, in particular at least 9, 10, 12, 14, 20, 30, 50, in particular at least 100 amino acids long and in the case of nucleic acid sequences preferably at least 15, 18, 21, 24, 30, 45, 60, 90, 120, in particular at least 250 nucleotides, long.
  • proSAAS peptides all amino acid sequences of proSAAS or proSAAS fragments are meant.
  • Homologous proSAAS amino acid sequences preferably have a homology of at least 70%, 80%, 90%, 95%, preferably at least 99%.
  • Homologous proSAAS nucleic acids preferably have a homology of 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, preferably at least 99%. The percentage can be calculated in a manner known to those skilled in the art, as will be described below.
  • a complementary sequence is understood to mean a nucleic acid sequence which is capable of hybridizing with the sequence to which it is complementary.
  • adenine and thymidine, or uracil or guanine and cytosine interact with each other. This interaction is also known as hybridizing.
  • Specific hybridization is understood to mean that not random nucleic acid sequences interact with one another, but rather nucleic acids in which the complementary nucleic acid sequence of the one nucleic acid has sufficient homology, preferably at least 60% homology, 70%, 80%, 90%, 95%, preferably at least 99 % to the other nucleic acid sequence.
  • Corresponding protocols for carrying out a specific hybridization are known to the person skilled in the art and are described below by way of example. Degenerate nucleic acids
  • nucleic acids are understood to mean nucleic acids whose nucleic acid sequences are different from one another, but which code for identical amino acid sequences.
  • a derivative of a peptide or a nucleic acid means all types of changes in an amino acid or nucleic acid sequence, as long as the sequence retains its function and / or structure.
  • Derivatives of peptides include peptides with post-translational, modifications that are caused by enzymes such as e.g. Kinase, phosphatases, glycosidases, etc. arise.
  • a derivative of a proSAAS peptide is also a proSAAS amino acid sequence to which other amino acid sequences that do not correspond to proSAAS sequences are added or inserted at the N or C terminus or internally in the proSAAS sequence.
  • Such peptides are also referred to in the prior art as fusion peptides or fusion proteins.
  • proSAAS peptides are also those peptides in which different amino acid sequence regions of proSAAS peptides are joined together, which also includes chimeric proSAAS peptides, i.e. Peptides derived from e.g. proSAAS sequence regions of proSAAS peptides derived from different species are joined together.
  • Derivatives of peptides and nucleic acids also include linear, circular, and branched sequences of amino acids or nucleic acids.
  • proSAAS peptides or proSAAS nucleic acids can also result from chemical or enzymatic treatments such as biotin labeling, ubiquitin labeling, reduction, oxidation, labeling with radionuclides, dyes or fluorophores etc. Also included are peptides that contain amino acids that are not included in the genetically encoded standard set of 20 amino acids, D and L amino acids, or also structures that have the spatial structure of an amino acid chain, but are wholly or partly made up of other building blocks (also called mimetics or peptidomimetics).
  • Suitable for labeling are, for example, radionuclides such as phosphorus-32 or -33, sulfur-35, iodine-125, tritium, carbon-14, calcium-45, chromium-51, etc., dyes or other organic, inorganic or biological structures such as Digoxigenin, biotin, fluorophores such as fluorescein, rhodamine, Texas-Red, BODIPY, etc.
  • radionuclides such as phosphorus-32 or -33, sulfur-35, iodine-125, tritium, carbon-14, calcium-45, chromium-51, etc.
  • dyes or other organic, inorganic or biological structures such as Digoxigenin, biotin, fluorophores such as fluorescein, rhodamine, Texas-Red, BODIPY, etc.
  • derivatizations of peptides or nucleic acids can also be present in combinations of two or more derivatizations, they can contain all or part of the molecule, in particular a maximum of 1, 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 50, 100 , or concern more than 100 building blocks of these molecules (amino acids or nucleotides) and they can occur naturally in nature, or artificially by eg be prepared by chemical synthesis or molecular biological methods.
  • GCG program package Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, USA
  • GAP [2] Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, USA
  • BLASTP BLASTP
  • BLASTN BLASTN
  • FASTA [3] or the well-known Smith-Waterman algorithm for determining the homologies
  • Preferred parameters for amino acid sequence comparison include the algorithm by Needleman and Wunsch [4], the comparison matrix BLOSUM 62 [5], a gap value (gap penalty) of 12, a gap length value (gap length penalty) of 4 and a Homology threshold of 0.
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the above parameters are the default parameters for amino acid sequence comparisons, with gaps at the ends not reducing the homology value. With very short sequences compared to the reference
  • Sequence it may still be necessary to set the expected value up to Increase 100000 (expectation value) and, if necessary, reduce the word length to up to 2.
  • Further exemplary algorithms gap opening penalties, gap extension penalties, comparison matrices including those mentioned in the program manual, Wisconsin package, version 9, September 1997, can be used. The selection will depend on the comparison to be performed and also on whether the comparison is carried out between pairs of sequences, with GAP or the best fit being preferred, or between a sequence and an extensive sequence database, with FASTA or BLAST being preferred.
  • a 70% agreement determined using the above-mentioned algorithm is referred to as 70% homology in the context of this application. The same applies to higher or lower degrees of homology.
  • The% value for the homology relates to the respectively shorter sequence, that is to say a 70% homologous proSAAS fragment of 100 amino acids in length must be at least 70 of its amino acids homologous to the sequence of proSAAS.
  • Chemically or post-translationally modified proSAAS or proSAAS fragments can consist of both D- and L-amino acids, as well as combinations of D- and L-amino acids, and can occur naturally, recombinantly or enzymatically, or be chemically synthesized. It can also contain unusual amino acids, ie amino acids that do not belong to the 20 standard amino acids. Numerous examples of unusual amino acids and post-translational modifications such as phosphorus and sulfate groups, glycosylations, amidations, deamidations, pyroglutamate modifications etc. are described in the literature and in databases [6]. For example, we were able to identify a proSAAS fragment with the unusual amino acid hydroxyproline. Modifications such as phosphorylation and sulfation are known for proSAAS from the literature. More common with peptides Modifications that occur are pyroglutamate modifications, and also oxidized or amidated peptides.
  • Nucleic acids DNA, RNA and DNA-RNA hybrid molecules of natural origin as well as synthetically, enzymatically or recombinantly produced nucleic acids which code for proSAAS or for proSAAS fragments are regarded as proSAAS nucleic acids.
  • Nucleic acids encoding proSAAS or proSAAS fragments can also be a component of vectors, in particular plasmids, cosmids, phage particles, artificial chromosomes, viral vectors, retroviruses, adenoviruses, adeno-like viruses, bacculoviruses, etc.
  • these nucleic acids and vectors can have a linear or circular structure and be single or double-stranded.
  • nucleic acids and vectors which are made up entirely or in part of modified nucleotides in which modifications are present, for example, in the base portion, in the sugar portion or in the phosphate portion.
  • modified nucleic acids can occur in nature or can be produced synthetically.
  • modified nucleic acids are PNAs (peptide nucleic acids), 2'-o-methoxyethyl nucleic acids, 2'-fluoro nucleic acids, arabino nucleic acids and so-called "locked nucleic acids” or nucleic acids, the phosphothioates, N3 ', P5 Contain phosphoramidates, morpholino phosphoramidates, etc.
  • PCR polymerase
  • ProSAAS nucleic acids can also contain further N-terminal, C-terminal and / or internal sequences that do not correspond to proSAAS sequences, but rather code for certain structural elements that give the peptide encoded by the nucleic acid new properties.
  • sequences can be used, for example, for so-called tag sequences that enable isolation or detection of the peptide, for example His-tag, HA-tag, GST-tag, fluorescent proteins such as GFP (green flourescent protein), enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, Luciferase or for toxins, etc.
  • Mutants of nucleic acids or peptides in the sense of the invention are understood to mean sequences which have arisen from substitutions, deletions, insertions or inversions. In the case of nucleic acids, these mutations can relate to coding as well as non-coding regions of the sequence, for example promoters, introns, 3'- or ⁇ '-untranslated RNA regions etc. Mutations in nucleic acids can be both conservative, ie do not change the amino acid sequence, and non-conservative, ie lead to a change in the amino acid sequence. The resulting mutants of the proSAAS peptides can be functional as well as limited functional or inactive proSAAS peptides.
  • proSAAS peptides are also included that occur due to neurological diseases, in particular Alzheimer's disease. Included are both proSAAS peptides with and without a signal sequence, pro-forms of proSAAS that have not yet been processed, as well as already processed proSAAS, soluble proSAAS peptides and membrane-bound proSAAS peptides. sensitivity
  • Sensitivity is defined as the proportion of sick patients who receive a positive diagnosis result when diagnosed with the disease, i.e. the diagnosis correctly indicates the disease.
  • Specificity is defined as the proportion of healthy patients who receive a negative diagnosis result when diagnosed with the disease, i.e. the diagnosis correctly indicates that there is no disease.
  • ProSAAS is also described in the literature under the name "Granin-like neuroendocrine peptide precursor".
  • the name proSAAS is derived from an amino acid sequence serine-alanine-alanine-serine which is present in the N-terminus of proSAAS [7] the sequences of human (accession no .: Q9UHG2), murine (accession no .: Q9QXV0) and proSAAS from the rat (accession no .: Q9QXU9) are present in the protein database "SwissProt".
  • the murine proSAAS is also described in the literature under the name PC3KIN (accession no .: Q91 W26). This proSAAS is a proSAAS mutant with a point mutation.
  • the protein IA4 accession no .: Q9ESU4
  • proSAAS has certain functional similarities with granines and is expressed in neuroendocrine cells.
  • a BLAST search shows that proSAAS is not related to the granules, at least because of its amino acid sequence.
  • the presumed biological function of proSAAS is the inhibition of prohormone convertase 1 (PC1). Therefore proSAAS is functionally related to 7B2, which is the Prohormone convertase 2 (PC2) inhibited.
  • PC1 prohormone convertase 1
  • PC2 Prohormone convertase 2
  • Both proteins, proSAAS and 7B2 have a number of so-called di-basic sequences (arginine-arginine or lysine-arginine) that can be cleaved by C-terminal prohormone convertases, for example.
  • proSAAS and 7B2 Such proteolytic activities cause proSAAS and 7B2 to split off C-terminal peptides (CT peptides), which are specific and efficient inhibitors of PC1 and PC2 [8, 9]. Both the complete proSAAS protein and the complete 7B2 protein also have a direct inhibitory effect. ProSAAS and 7B2 have a proline-rich domain.
  • proSAAS fragments which have the proSAAS amino acid sequence of amino acid 42 to 59 (“little SAAS”), 221 to 254 (“little PEN-LEN”), 245 to 254 (“little LEN”) and 245 to 260 (“Big LEN”) correspond to [10].
  • proSAAS amino acid sequence of amino acid 42 to 59 “little SAAS”), 221 to 254 (“little PEN-LEN”), 245 to 254 (“little LEN”) and 245 to 260
  • “Big LEN" correspond to [10].
  • proSAAS is not associated with neurological, dementia diseases that are associated with a deterioration in short or long-term memory, in particular with Alzheimer's disease.
  • Frontotemporal dementia is a disease that is primarily associated with behavioral disorders and less with cognitive impairments, while Alzheimer's disease is characterized by memory disorders, especially short-term memory, and by deposits in the brain (senile plaques). Such deposits do not occur in frontotemporal dementia [13, 14].
  • Glu proSAAS 235-244
  • Glu proSAAS 235-244
  • the two amino acids Leu-Glu at the C-terminus of this peptide are of particular importance for PC 1 specificity [18].
  • Averback et al. show that the so-called “dense microsp eres", ie small protein particles occur in the brain of healthy people as well as in the brain suffering from dementia. If the particles, also called Spherons, which have been isolated from brain tissue, burst, they cause proSAAS Fragments free, Averback et al. Speculates that these can be caused by
  • the disease detected by the method according to the invention is preferably a neurological, dementia disease which is associated with a deterioration of the short or long-term memory, such as e.g. Alzheimer's disease.
  • a neurological, dementia disease which is associated with a deterioration of the short or long-term memory, such as e.g. Alzheimer's disease.
  • the change in the concentration of proSAAS fragments according to the invention has been demonstrated using the example of patients suffering from Alzheimer's disease.
  • the proSAAS peptides according to the invention can also be used for laboratory diagnostic detection and for the therapy of Alzheimer's disease and related neurological diseases.
  • One embodiment of this method is the detection of neurological diseases at an early stage, e.g. laboratory diagnostic evidence of mild cognitive impairment (MCI).
  • MCI mild cognitive impairment
  • Protein fragments as found in the literature by in vitro proteolysis Adding proteases such as trypsin are often described. It therefore represents a new, previously unknown substance that has arisen naturally in nature.
  • This proSAAS fragment is a substance that is not man-made by manipulating proSAAS. It was first enriched and purified from biological samples using reverse phase chromatography and then separated from accompanying other substances by mass spectrometry so that it could then be quantified and sequenced.
  • This peptide is not an arbitrary fragment of the proSAAS, but is a fragment of the proSAAS that has arisen naturally.
  • the term “created naturally” means that the proSAAS fragments were created without the addition of proteases to the samples.
  • ProSAAS fragments are derived from the proSAAS sequence Q9UHG2 (SEQ ID 28) mentioned at the beginning, but can also be derived from other database entries for proSAAS It is possible that the proSAAS amino acid or nucleic acid sequences may differ from the amino acid sequence of the "SwissProf" entry with the number Q9UHG2 or the NCBI entry of the nucleic acid sequence with the
  • ProSAAS fragments can also contain one or two point mutated, deleted or additionally inserted amino acids, as well as N-terminal and / or C-terminal extensions. However, they must retain at least 8 amino acids from the proSAAS amino acid sequence. Exceptions to this are the peptides with the sequence Ala-Arg-Pro-Val-Lys-Glu-Pro (KEP peptide) and with the sequence Leu-Leu-Arg-Val-Lys-Arg (described by Apatalina et al. [12 ]), which are only seven or six amino acids long, as well as the other peptides mentioned in Table 1, which comprise less than 8 amino acids. As an N- or C-terminal extension of proSAAS fragments with r residues in
  • proSAAS prohormone convertases
  • PC1, PC2, PC5, PC7, P ACE4 or furin prohormone convertases
  • proteases usually cut directly at the C-terminal at the di-basic sequence position.
  • endoproteases such as, for example, carboxypeptidase E or carboxypeptidase D.
  • proSAAS fragments with C-terminal basic amino acids without C-terminal basic amino acids, or with some of these C-terminal basic amino acids occur, even if not all of these proSAAS fragments have yet been specifically identified.
  • the counting of the amino acids is always started from the proSAAS amino acid sequence with the signal sequence, that is to say starting with the N-terminal methionine.
  • the entire proSAAS including the signal sequence therefore has 260 amino acids. This applies to proSAAS from humans, mice and rats.
  • proSAAS fragments derived from proSAAS are described in the literature, which are caused, among other things, by prohormone convertases such as PC2 or furin [10, 1 1].
  • fragments with amino acids 1 -33 (signal sequence), 34-40 (KEP), 42-59 (little SAAS), 34-59 (big SAAS), 221 -242 (PEN), 245-260 (big LEN) , 245-254 (little LEN), 221-260 (big PEN-LEN), 221 -254 (little PEN-LEN), 34-260, 34-232, 34-174 (murines proSAAS; described in [1 1] ), 34-61, 62- 220, 34-220, 34-244, 34-260 (murine proSAAS; described in [10]), 239-244 (mouse / rat / human proSAAS; described in [12]), 246-260, 40-59, 186-218, 221-239 (PEN-19), 221-240 (PEN-20), (mouse / rat proSAAS; described in [7]), and fragments 66-77, 42-57, 91 -104, 105-1 1 1, 78- 90, 221 -241, 245-255, 20
  • sequences of the SAAS peptides in the one-letter amino acid code are as follows:
  • This peptide has been identified in the form of two different variants.
  • One variant is the unmodified peptide, while the other Variant at position 231 instead of a proline residue has a hydroxyproline residue and is also present at position 233 as a sodium adduct.
  • r1 represents a sequence which corresponds to the sequence or parts of the sequence of the human proSAAS amino acid sequence (SEQ ID 28) from amino acid 221 to 225, where r1, starting from amino acid 226, can be between 0 and 5 amino acids long
  • r2 represents the proSAAS amino acid sequence (SEQ ID 28) from amino acid 234 to 238 or parts thereof, where r2, added to amino acid 233, can be between O and 5 amino acids long.
  • All other amino acid sequences r3 to r16 are structured accordingly, with r3 at most the amino acids from 221 -243, r4 at most the amino acids from 252-260, r5 at most from 221-233, r6 at most from 244-260, r7 at most from 35-28, r ⁇ a maximum of amino acids from 47-59, r9 a maximum of 62-72, r10 a maximum of amino acids from 81-220, r1 1 a maximum of amino acids from 62-99, r12 a maximum of amino acids from 108-220, r13 a maximum of amino acids from 62- 150, r14 maximally corresponds to the amino acids from 159-220, r1 5 maximally to the amino acids from 62-197 and r16 maximally to the amino acids 206-220 of human proSAAS.
  • the peptides can be present in post-translational or chemical modification forms, which has an effect, among other things, on their masses and thus on the mass spectrometric identification and also on the elution behavior in chromatography, such as, for example, in reverse phase chromatography.
  • the peptides with hydroxyproline, phosphorylated, sulfated, N-glycosylated, O-glycosylated, with N-terminal pyroglutamate modification or oxidized etc. can be present in the sample to be examined.
  • proSAAS proSAAS fragments
  • the reduction in the concentration of the proSAAS peptides depends on the severity of the disease, the prognosis and the stage of the neurological, dementia disease, which is associated with a deterioration of the short or long-term memory, in particular Alzheimer's disease , correlate.
  • Another embodiment of the invention is therefore the determination of the proSAAS peptides also to determine the severity, the prognosis and to determine the stage of the disease, in particular as a replacement or as a supplement to carrying out a "mini-mental state examination” or other neuropsychological examinations .
  • control samples that may be used can be a pool sample from various controls.
  • the sample to be examined can also be a pool sample, with individual examinations being carried out if the result is positive.
  • At least one proSAAS peptide is reduced in its concentration, relative to the concentration of the same proSAAS peptide in a control sample of a person not suffering from a neurological dementia disease, preferably by at least 10%, 20%. , 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, at least 90%, more preferably reduced by up to 100%.
  • the biological sample can preferably be (human) cerebrospinal fluid (cerebrospinal fluid, CSF) or a sample such as serum, plasma,
  • tissue homogenates are prepared for the preparation of the sample to be examined, e.g. from human tissue samples obtained from biopsies.
  • These fabrics can e.g. with manual homogenizers, with ultrasonic homogenizers or with electrically operated homogenizers such as Ultraturrax are crushed, and then in a manner known to those skilled in the art in acidic, aqueous solutions with e.g. 0.1 to 0.2 M acetic acid are boiled for 10 minutes.
  • the extracts are then subjected to the respective laboratory diagnostic detection procedure, e.g. subjected to a mass spectrometric examination.
  • the samples can be prepared in the usual way, e.g. optionally diluted or concentrated, and stored.
  • the invention comprises the use of at least one proSAAS
  • Laboratory diagnostic methods for proSAAS or proSAAS fragments are suitable for laboratory diagnostic detection of these diseases.
  • Suitable methods include physical methods such as e.g. Mass spectrometry or liquid chromatography, molecular biological methods such as Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or immunological detection techniques, e.g. "Enzyme-linked immunosorbent assays" (ELISA).
  • physical methods such as e.g. Mass spectrometry or liquid chromatography
  • molecular biological methods such as Reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) or immunological detection techniques, e.g. "Enzyme-linked immunosorbent assays" (ELISA).
  • RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays
  • One embodiment of the invention is the use of physical methods which can indicate the substances according to the invention qualitatively or quantitatively. These methods include methods such as liquid chromatography, thin layer chromatography, circular dichroism (circular dicroism, CD spectroscopy), bio-chip technologies or related technologies in which substances are detected on surfaces using nucleic acids, proteins, antibodies etc., for example “ Surface Enhanced Laser Dsorption / Ionization "(SELDI) assays, Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA, USA [20] or” Fiber-Optic Nucleic Acid "(FONA) assays, Virtek Vision International, Waterloo, Ontario, Canada (US 650371 1) etc.
  • spectrometric methods that work, for example, with electromagnetic radiation in different wavelength ranges (eg wavelengths from 1 nm to 1 m).
  • These methods include, for example, atomic spectrometry, chemiluminescence spectrometry, electron spectrometry, X-ray spectrometry, infrared spectrometry, Fourier Transform IR spectrometry, Raman spectrometry, laser spectrometry, hole-burning spectrometry, luminescence spectrometry, plasma spectrometry, magnetic NMR spectrometry, magnetic resonance spectrometry, magnetic resonance spectrometry spectrometry, Mössbauer spectrometry, fluorescence spectrometry, UV / visible spectrometry, etc.
  • the substances in the sample are separated chromatographically prior to identification, preferably with reverse phase chromatography, and separation of the peptides in the sample with high-resolution reverse phase high-performance liquid chromatography (RP.) Is particularly preferred HPLC).
  • RP. reverse phase high-performance liquid chromatography
  • Another embodiment of this invention is the implementation of precipitation reactions for fractionating the sample using precipitation agents such as ammonium sulfate, polyethylene glycol, trichloroacetic acid, acetone, ethanol, etc.
  • precipitation methods such as immunoprecipitation with antibodies or precipitation reactions triggered by, for example, changes in physical factors such as temperature (Heat precipitation) can be used.
  • fractions obtained in this way are then subjected to the respective detection method individually or in groups, for example the mass spectrometric analysis.
  • Another embodiment of the invention is the use of extraction methods, such as liquid phase extraction.
  • the sample is mixed, for example, with a mixture of an organic solvent such as polyethylene glycol (PEG) and an aqueous salt solution. Because of their physical properties, certain constituents of the sample accumulate in the organic phase and others in the aqueous phase and can thus be separated from one another and then further analyzed.
  • Reverse-phase chromatography Reverse-phase chromatography
  • a particularly preferred embodiment of this invention comprises the use of reverse phase chromatography, in particular a C18 reverse phase chromatography column using eluents consisting of trifluoroacetic acid and acetonitrile, for the separation of substances in human cerebrospinal fluid. E.g. fractions were collected, each containing 1/96 of the volume of solvent used.
  • Mass spectrometry The fractions obtained in the chromatography are analyzed using a mass spectrometer, preferably using a MALDI mass spectrometer (matrix-assisted laser desorption ionization) using a matrix solution consisting of, for example, L (-) fucose and alpha-cyano- 4-hydroxycinnamic acid, dissolved in a mixture of acetonitrile, water, trifluoroacetic acid and acetone, was analyzed to determine the presence of certain masses and to quantify the signal intensity. These masses correspond to the masses of proSAAS and proSAAS fragments.
  • the identification of the substance or substances with the aid of a mass spectrometric determination such as a MALDI-TOF (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-and-ionization-Time-Of-Flight) mass spectrometry or an ESI (electro Spray ionization) mass spectrometry.
  • the mass spectrometric determination preferably comprises at least one of the following mass signals, each calculated on the basis of the theoretical monoisotopic mass of the corresponding proSAAS peptide. Deviations from the theoretical, monoisotopic mass can occur due to a low measurement inaccuracy of the mass spectrometer of at most 500 ppm and the natural isotope distribution.
  • proSAAS fragment with SEQ ID 1 in the form of a derivative in which the proline residue at position 231 is replaced by a hydroxyproline residue and in which a sodium adduct is present at position 233, can be identified (experimentally determined mass: 1770 Dalton). It is possible that this proSAAS fragment is present with only one of the two modifications mentioned, or that proSAAS fragments also occur in the form of other derivatives and can therefore be determined with masses which have been changed accordingly.
  • Mass spectrometric determination of the sequence of the substances In the further practical application of this embodiment, further verification of the detection result is possible and recommended by determining the identity of the substances corresponding to the masses, taking into account only signals derived from proSAAS or proSAAS fragments can be. This protection is carried out by identifying the peptide signals, preferably using mass spectrometric methods, e.g. an MS / MS analysis [21].
  • proSAAS fragments derived from proSAAS were identified and their significance was recognized. Sequences of substances that are accessible to this method are given in the sequence listing (SEQ ID 1 to 35 and SEQ ID 37 to 52). Some of the proSAAS fragments represent new substances that have not yet been described (SEQ ID 1 to 9).
  • the proSAAS fragments according to SEQ ID 2 to 9 can contain additional amino acids corresponding to the corresponding sequence of proSAAS at the N and / or C terminus. SEQ ID 1 was found in the form of two different variants, both of which represent new, previously unknown substances.
  • the proSAAS fragments which were previously known correspond to SEQ IDs 10 to 35 and SEQ ID 37 to 52.
  • the invention also includes recombinant (
  • the invention also encompasses nucleic acids which code for proSAAS or proSAAS fragments, and the corresponding complementary sequences, for the indirect determination and quantification of the associated proSAAS peptides, including corresponding derivatives.
  • This also includes nucleic acids, e.g. and non-coding sequences, such as 5'- or 3'-untranslated regions of the proSAAS mRNA, and nucleic acids which have a sequence match sufficient for specific hybridization or PCR experiments with a nucleic acid sequence from proSAAS or parts of the nucleic acid sequence from proSAAS, and which are therefore suitable for indirect detection of the associated substances.
  • quantitative measurement results (intensities) from a sample to be examined are compared with the
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • ABST quantitative real-time PCR
  • DNA chips for example available from Affimetrix, can be used for quantification , Inc., Santa Clara, CA, USA, in-situ hybridizations, Northern blots etc., as well as other methods known to the person skilled in the art.
  • hybridization under stringent conditions is preferred carried out.
  • stringent hybridization conditions can be found in the prior art. For example, stringent hybridization at 65 ° C in a buffer containing 3.5x SSC, 0.02% Vicoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin in 2.5 mM NaH2PO4, pH 7.0, 0, 5% sodium dodecyl sulfate (SDS), 2 mM ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA).
  • SSC consists of 150 mM NaCI and 150 mM sodium citrate, pH 7.0.
  • the membrane is washed at room temperature in 2x SSC and in 0.1-0.5x SSC with 0.1% SDS at temperatures up to 68 ° C.
  • a specific hybridization requires that at least 40%, preferably 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% of the hybridizing sequences are complementary to each other. It is not necessary for the entire nucleic acid sequences to hybridize with one another as long as the duplex nucleic acid is stable under the stringent experimental conditions. Other protocols for stringent hybridizations, also for special types of experiments such as DNA chip tests, are known to the person skilled in the art.
  • the results can be used to derive the presence of a neurological, dementia disease, which is associated with a deterioration of the short or long-term memory, preferably Alzheimer's disease and / or its severity and / or a prognosis of the occurrence of the disease.
  • a neurological, dementia disease which is associated with a deterioration of the short or long-term memory, preferably Alzheimer's disease and / or its severity and / or a prognosis of the occurrence of the disease.
  • the laboratory diagnostic determination of proSAAS and proSAAS fragments can be carried out using an immunological detection system, preferably an ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay").
  • This immunological detection detects at least one proSAAS or proSAAS fragment.
  • a so-called “sandwich ELISA” can furthermore preferably be used, in which the detection of the specificity of two antibodies which have different epitopes within the recognizing the same molecule is dependent.
  • other ELISA systems for example direct or competitive ELISA, can also be used for the laboratory diagnostic detection of these substances.
  • ELISA-like detection techniques such as RIA ("radio immuno assay”), EIA ("enzyme immuno assay”), ELI spot ("enzyme linked immuno spot”), etc.
  • RIA radio immuno assay
  • EIA enzyme immuno assay
  • ELI spot enzyme linked immuno spot
  • immunological detection systems for the quantification, isolated, recombinant or enzymatically produced or chemically synthesized proSAAS or proSAAS fragments can be used from biological samples.
  • the determination of these substances can, for example, generally be carried out with the help of a specific antibody directed at the respective substances, further for such laboratory diagnostic evidence
  • Suitable methods include Western emblotting, immunoprecipitations, dot blots, plasmon resonance spectrometry (BIACORE ® technology, Biacore International AB, Uppsala, Sweden), affinity matrices (e.g.
  • ABICAP technology ABION Society for Biosciences and Technology mbH, Jülich, Germany
  • protein Chips available, for example, from Affimetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA, etc.
  • Genere ll all substances / molecules (binders) are suitable as detection agents that allow a specific laboratory diagnostic detection system to be set up, since they bind specifically to proSAAS or proSAAS fragments.
  • Numerous immunological detection methods known to the person skilled in the art, which are not expressly mentioned here, are also suitable for this.
  • Another embodiment of the invention is the extraction of proSAAS and proSAAS fragments using recombinant expression systems, in vitro translation, chromatography methods and chemical synthesis protocols, etc., which are known to the person skilled in the art.
  • These substances can be obtained from natural biological samples or from recombinant expression systems, for example using reverse phase chromatography, affinity chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration, isoelectric focusing, preparative immunoprecipitation, Ammonium sulfate precipitation, extraction with organic solvents, etc. and other methods known to those skilled in the art.
  • ProSAAS or proSAAS fragments can be C- or N-terminally with heterologous sequences of foreign peptides such as poly-histidine sequences (His-tag), hemagglutinin epitopes (HA-tag), HIV-Tat sequences, Antennapedia sequences, VP22- Sequences or proteins such as, for example, maltose-binding proteins, glutathione-S-transferase (GST), “green fluorescent protein” (GFP), or protein domains such as the GAL4-DNA binding domain or the GAL4 activation domain can be fused.
  • heterologous sequences of foreign peptides such as poly-histidine sequences (His-tag), hemagglutinin epitopes (HA-tag), HIV-Tat sequences, Antennapedia sequences, VP22- Sequences or proteins such as, for example, maltose-binding proteins, glutathione-S-transferase (GST), “green fluorescent
  • proSAAS and proSAAS fragments can be used, for example, to be able to better isolate proSAAS or proSAAS fragments (His-tag, HA-tag, glutathione-S-transferase), in order to be able to prove them better in the laboratory (His-tag, HA- tag, GFP), to enable you to find binding partners, eg "yeast two-hybrid" system (GAL4 domains), to promote the uptake of these substances by cells (HIV-Tat, Antennapedia, VP22), etc.
  • proSAAS or proSAAS fragment-specific antibodies a particularly preferred embodiment is the use and production of specific antibodies which recognize neo-epitopes in proSAAS fragments, that is to say epitopes which are only present in proSAAS fragments but not in proSAAS , Such antibodies enable the specific immunological detection of proSAAS fragments in the presence of proSAAS.
  • Polyclonal antibodies can be immunized by experimental animals such as mice, rats, rabbits or Goats are made.
  • Monoclonal antibodies can be obtained, for example, by immunizing experimental animals such as mice or rats and then using hybridoma techniques or, for example, using recombinant experimental approaches such as using antibody banks such as the HuCAL ® antibody bank from MorphoSys, Martinsried, Germany, or other recombinant production processes known to the person skilled in the art become. These antibodies can also be used in the form of antigen-binding antibody fragments. Examples of such antibody fragments are intrabodies, Fab (fragment, antigen binding), Fab2 or scFv (single-chain Fv fragment) fragments.
  • the antibodies can also be used as fusion proteins, consisting of one or more antibody proteins or antibody protein fragments and one or more further proteins or protein fragments, such as, for example, enzymes such as peroxidase, alkaline phosphatase, luciferase, etc., fluorescent proteins such as, for example, “green fluorescent protein "(GFP), etc. can be produced recombinantly or synthetically, or chemical groups such as biotin, dyes such as digoxigenin, or fluorophores such as fluorescein, BODIPY etc., radioactive nuclides such as phosphorus-32, phosphorus-35, iodine 125, etc. Numerous reagents suitable for labeling antibodies and proteins are known to the person skilled in the art and are available, inter alia, from Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands.
  • a further embodiment of the invention is the quantitative or qualitative determination of the above-mentioned proSAAS or of proSAAS fragments in order to estimate the effectiveness of a therapy in development against neurological, dementia diseases , especially Alzheimer's disease.
  • the invention can also be used to stratify participants in clinical trials to develop therapies for such diseases, particularly Alzheimer's disease.
  • the effectiveness test and choosing the right patient for therapy and clinical trials is critical to the successful development and use of a therapeutic. So far, there is no clinically measurable parameter available for Alzheimer's disease that reliably enables this [22],
  • An exemplary embodiment comprises the cultivation of living cells with proSAAS or -proSAAS fragments and agents which express, process or modulate the bioavailability of these substances.
  • Substances that promote processing can, for example, be proteases such as prohormone convertases that recognize dibasic sequence motifs. This enables biological properties of proSAAS and proSAAS fragments in connection with neurological diseases, in particular Alzheimer's disease, to be determined.
  • Fusion molecules can also be used to examine the cell lines, such as proSAAS fusion peptides which contain sequences which, for example, promote the transport of the fusion peptide into the cell interior.
  • sequences that can be used for this are, for example: HIV-Tat, Antennapedia, Herpes Simplex VP22 sequences, etc.
  • cell lines can be transfected with expression vectors which directly or indirectly express proSAAS or release - Increase proSAAS fragments, for example, by coding directly for these substances or, for example, by coding for prohormone convertases or expression factors.
  • the simultaneous transfection with several different expression vectors can also be carried out.
  • cell lines that appear to be suitable as neurological model systems in connection with proSAAS can be used for such studies.
  • Tests which determine the proliferation rate of the treated cells, their metabolic activity, the apoptosis rate of the cells, changes in the Measure cell morphology, changes in the expression of the cell's own proteins or changes in the expression of reporter genes added by the cells, etc., or which determine the release of cytosolic cell components as markers for cell death.
  • Suitable strains of experimental animals e.g. of mice or rats, which are used as a model for neurological diseases, in particular as a model for Alzheimer's disease. These experimental animals can be used to study the effectiveness of therapy strategies aimed at increasing the concentration of proSAAS or proSAAS fragments.
  • suitable laboratory animals e.g. Mice, rats, rabbits, dogs, monkeys, etc. the in vivo effects of these substances are examined.
  • proSAAS or proSAAS fragments e.g. by intravenous injections, and their effects on the test animal are determined, especially if it is an animal model for neurological, dementia diseases.
  • Measurement parameters for experiments with experimental animals can be, for example, the survival time of the animals, their behavior, their short-term memory performance and their ability to learn.
  • An example of a memory test that is suitable for experimental animals, such as rats, is the "Morris water maze test”.
  • body function temperature, respiratory rate, heart rate etc.
  • neurological mediators from e.g.
  • proSAAS and ProSAAS fragments are used as experimental animals.
  • experimental animals can be obtained using molecular biological methods, in whose organism these substances are not produced, or produced in reduced or increased quantities. For this purpose, the expression can be changed both locally and in the entire organism of the test animal in a targeted manner. Caenorhabditis elegans, Drosophila, zebra fish, mice, rats, etc. are suitable as experimental animals.
  • Another embodiment of the invention relates to methods for finding substances which express, express or concentrate proSAAS or proSAAS fragments, or proSAAS agonists such as e.g. of proteases such as Modulate prohormone convertases or nucleic acids that code for these substances.
  • the invention includes methods in which a sample which contains proSAAS or a proSAAS fragment or a corresponding nucleic acid is associated with a test substance. These methods then examine whether the test substance has the ability to modulate the expression of proSAAS or the generation of proSAAS fragments, or whether the test substance influences the activity or concentration of proSAAS or proSAAS fragments.
  • Figure 1 The sequence of human proSAAS, both new and already known in the art proSAAS fragments are shown
  • Figure 2 Elution profile of a reverse phase chromatography for the separation and enrichment of proSAAS fragments from cerebrospinal fluid
  • Figure 3 Mass spectrometric measurement (MALDI) using the example of a proSAAS fragment that corresponds to the proSAAS amino acid sequence from 221 to 238, whereby this proSAAS fragment is determined in unmodified form or a derivative of the proSAAS fragment (the mass data are determined experimentally Values, not monoisotopic, theoretical masses)
  • Figure 5 MS / MS fragment spectrum using the example of the proSAAS fragment, which corresponds to the proSAAS amino acid sequence from 221 to 238, this proSAAS fragment being determined in unmodified form or a derivative of the proSAAS fragment
  • Figure 6 "Box whisker plots" for the quantitative comparison of the concentrations of the proSAAS fragment, which corresponds to the proSAAS amino acid sequence from 221 to 238, in Alzheimer's disease patients compared with control patients.
  • the analyzed proSAAS fragment contains Position 231 is a hydroxyproline residue and position 233 is a sodium adduct
  • Figure 1 shows the human sequence of proSAAS according to the SwissProt Accession No. Q9UHG2 (SEQ ID 28).
  • the positions of the newly identified proSAAS fragment SEQ ID 1 corresponding to the proSAAS amino acid sequence 221-238
  • the positions of eight proSAAS fragments with variable sequence lengths in the form of dashed lines with a ,, - r "at the end are entered.
  • the signal sequence is marked and dibasic sequence positions are underlined.
  • Figure 2 shows an elution profile of a sample analyzed with reverse phase chromatography according to Example 2, for the separation and enrichment of the proSAAS fragments from cerebrospinal fluid.
  • Figure 3 shows a spectrum, which was obtained by MALDI mass spectrometric measurement according to Example 3 of proSAAS fragments, after reverse phase chromatography of human cerebrospinal fluid according to Example 2.
  • the proSAAS fragment corresponds to the proSAAS sequence of amino acid 221 -238.
  • the 1733 Dalton mass peak corresponds to the unmodified sequence, while the 1772 Dalton mass peak corresponds to one
  • Figure 4 shows data generated by MALDI mass spectrometry as a relatively quantifying mass spectrometry method.
  • Each peptide shows an individual, typical ratio of signal strength to concentration, which can be read in this diagram using the slope of the curve.
  • MW relative molecular mass.
  • Figure 5 shows MS / MS fragment spectra according to Example 4 of the proSAAS fragment according to the invention corresponding to the amino acid sequence of 221-238 without modifications ( Figures 5A and B) and the corresponding derivative of said proSAAS fragment with a hydroxyproline residue at position 231 and a sodium -Adduct at position 233 ( Figure 5C and D).
  • Figures A and C raw data of the measurements.
  • Figures B and D Converted, deconvoluted mass spectra of the proSAAS fragments.
  • Figure 6 shows "box whisker plots" for the quantitative comparison of the concentrations of the proSAAS fragment, which corresponds to the proSAAS sequence of amino acid 221-238, in Alzheimer's disease patients compared with
  • Example 1 Obtaining Liguor cerebrospinalis for the determination of proSAAS and proSAAS fragments
  • Liquor cerebrospinalis is the fluid contained in the four brain ventricles and in the cerebral and spinal subarachnoid space, which is primarily formed in the choroid plexus of the side ventricles. Liquor cerebrospinalis is usually removed by lumbar puncture, more rarely by suboccipital puncture or ventricular puncture. With lumbar puncture (spinal puncture) for the removal of cerebrospinal fluid, the spinal subarachnoid space between the 3rd and 4th or 4th and 5th lumbar spine process is punctured with a long hollow needle and puncture is obtained. The sample is then centrifuged at 2000 x g for 10 minutes and the supernatant is stored at minus 80 ° C. For 279 clinical samples, i.e. A sample preparation according to Example 1 was carried out for 86 passive control samples, 66 active control samples and 127 samples from patients suffering from Alzheimer's disease.
  • Example 2 Separation of peptides in cerebrospinal fluid (CSF) for the mass spectrometric measurement of proSAAS fragments
  • CSF cerebrospinal fluid
  • This sample pretreatment serves to enrich the peptides according to the invention and to separate components that can interfere with the measurement.
  • Reverse phase chromatography is used as the separation process. Different RP chromatography resins and eluents are equally suitable.
  • the example below shows the separation of proSAAS fragments using a C18 reverse phase chromatography column with the size 4 mm ⁇ 250 mm from Vydac.
  • compositions were used: solvent A: 0.06% (v / v) trifluoroacetic acid, solvent B: 0.05% (v / v) trifluoroacetic acid, 80% (v / v) acetonitrile.
  • Chromatography was performed at 33 ° C using a HP-ChemStation 1 100 from Agilent Technologies with a flow cell Micro from Agilent Technologies. Human cerebrospinal fluid was used as the sample. 440 ⁇ l of CSF was diluted to 1650 ⁇ l with water, the pH was adjusted to 2-3, the sample was centrifuged for 10 minutes at 18000 ⁇ g and finally 1500 ⁇ l of the sample thus prepared was applied to the chromatography column.
  • the chromatography conditions were as follows: 5% solvent B at the time 0 min., From time 1 to 45 min continuous increase in the solvent B concentration to 50%, from time 45 to 49 min continuous increase in the solvent B concentration to 100% and then to at the time 53 min 100% buffer B. Constantly 10 minutes after the start of the chromatography, 96 fractions of 0.5 ml each are started.
  • the chromatogram of a cerebrospinal fluid sample, produced under the test conditions described here, is shown in Figure 2.
  • MALDI-TOF Matrix-Assisted-Laser Desorption-Ionization-Time-Of-Flight
  • Mass spectrometers are manufactured by PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager-DE, Voyager-DE PRO or Voyager-DE STR) or by Bruker Daltonik GmbH (BIFLEX).
  • a matrix substance typically consists of an organic acid.
  • Typical matrix substances which are suitable for peptides are 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid and 2,5-dihydroxybenzoic acid.
  • a lyophilized equivalent obtained after reverse phase chromatography, corresponding to 500 ⁇ ⁇ human cerebrospinal fluid, is used.
  • the chromatographed sample is dissolved in 15 ⁇ ⁇ of a matrix solution.
  • This matrix solution contains, for example, 10 g / L of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid and 10 g / LL (-) fucose dissolved in a solvent mixture consisting of acetonitrile, water, trifluoroacetic acid and acetone in a volume ratio of 49: 49: 1: 1.
  • 0.3 ⁇ l of this solution are transferred to a MALDI carrier plate and the dried one Sample analyzed in the MALDI mass spectrometer Voyager-DE STR from PerSeptive Biosystems. The measurement is carried out in "Linear Mode" with "Delayed Extraction” TM.
  • FIG. 3 shows an example of a measurement of one of the proSAAS fragments according to the invention (SEQ ID 1).
  • MALDI-TOF mass spectrometry can be used to quantify peptides such as the proSAAS fragments according to the invention if these peptides are present in a concentration , which is in the dynamic measuring range of the mass spectrometer, thereby avoiding detector saturation. This is the case for the measurement of the proSAAS fragments according to the invention in cerebrospinal fluid with a liquor equivalent concentration of 33.3 ⁇ l per ⁇ ⁇ matrix solution.
  • MALDI mass spectrometry can preferably be used for the relative quantification of peptides. This is shown in Figure 4. If different amounts of different standard peptides are added to a sample, the intensity of both these standard signals and the sample signals can be determined. Exemplary shows
  • Example 4 Mass spectrometric identification of proSAAS fragments To quantify the proSAAS fragments according to the invention, it must be ensured that the mass signals to be analyzed are present in the fractions obtained by reverse phase chromatography of cerebrospinal fluid cerebrospinalis, according to Example 2, is actually the proSAAS fragments according to the invention.
  • a proSAAS-lon or a proSAAS-fragment-ion is selected in the mass spectrometer based on its specific m / z value (mass / charge) in a manner known to the person skilled in the art in the mass spectrometer.
  • This selected ion is then extracted by applying collision energy with a collision gas, e.g. Helium or nitrogen, fragmented and the resulting proSAAS fragment fragments detected in the mass spectrometer in an integrated analysis unit and corresponding m / z values determined (principle of tandem mass spectrometry) [23].
  • a collision gas e.g. Helium or nitrogen
  • the fragmentation behavior of peptides enables a mass accuracy of e.g. 50ppm an unambiguous identification of the proSAAS fragments according to the invention using computer-assisted search methods [24] in sequence databases in which the sequence of proSAAS was entered.
  • the mass spectrometric analysis was carried out using a quadrupole TOF instrument, model "QStar-Pulsar” from Applied Biosystems-Sciex, USA. Exemplary MS / MS fragment spectra are shown in Figure 5.
  • a so-called deconvolution of the fragment spectra is usually carried out. To do this, the measured mass (m) of each fragment is divided by the number of its charges (z). As a result, the measured masses of the individual fragments are converted into their real masses, which reduces the complexity of the fragment spectra and facilitates their evaluation.
  • a fragment with the mass of 1000 daltons can e.g. with one and two charges in the raw data set of the measurement. A mass of 1000 Da is then measured for the fragment with one charge and a mass of 500 Da is measured for the double-charged, otherwise identical fragment. You share both
  • Mass signals by the number of charges so both have the right one Mass of 1000 Da and they now only appear as a homogeneous mass signal with their real mass.
  • Example 5 Mass spectrometric quantification of proSAAS fragments to compare their relative concentration in control samples compared to patient samples
  • a subsequent MALDI measurement of the proSAAS fragments according to the invention according to Example 3 was carried out.
  • Exemplary MALDI signal intensities are shown in the form of a "box whisker plot" in Figure 6.
  • the "box whisker plots” shown in Figure 6 are based on measurement values which were carried out using 29 to 45 samples from Alzheimer's disease patients or 13 to 44 control samples per measurement series. A total of 4 independent series of measurements were carried out in the sense of cross-validation, the series of measurements each containing Alzheimer's disease and control samples.
  • the box whisker plots shown enable the comparison of the integrated MALDI mass spectrometric signal intensities of various proSAAS fragments in controls with the MALDI signal intensities in samples from Alzheimer's disease patients.
  • the "box”, i.e. the boxes in the diagrams in Figure 6 each show the area of the MALDI signal intensities, in which there are 50% of the respective MALDI signal intensities ( 2nd and 3rd quartile), which point upwards and downwards from the "box" Lines ("whiskers") indicate the area in which the 25% of the measured values with the highest signal intensities are located (upper quartile) or in which the 25% of the measured values with the lowest signal intensities are located ( lower quartile).
  • the solid line in the boxes indicates the median and the dashed line in the boxes indicates the mean.
  • Alzheimer's type Structural characteristics, diagnostic eriteria and relation to other frontotemporal dementias. Acta Neurol Scand Suppl. 168: 28-30.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft definierte Fragmente abstammend von proSAAS und deren Bestimmung in biologischen Proben von Patienten, die an neurologischen, demenziellen Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergehen, insbesondere Morbus Alzheimer leiden. Die proSAAS-Fragmente entstammen aus dem Protein proSAAS mit dem zugehörigen Gen und sind in spezifischer Art und Weise prozessiert und ggf. modifiziert, und schließen insbesondere Hydroxyprolin-Aminosäuren beinhaltende Peptide mit ein. Ein Verminderung der Konzentrationen dieser proSAAS-Fragmente oder des zugehörigen proSAAS zeigt eine neurologische Erkrankung an. Der Nachweis dieser Erkrankung erfolgt durch Bestimmung von proSAAS, proSAAS-Fragmenten sowie von Derivaten derselben. Die Erfindung findet darüber hinaus Verwendung zur Verlaufskontrolle von neurologischen Erkrankungen und zu ihrer Prognose, sowie zur Entwicklung von Therapeutika gegen neurologische, demenzielle Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergehen wie z.B. Morbus Alzheimer.

Description

Verfahren zum Nachweis einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, zugehörige proSAAS-Peptide und Nachweisreagenzien
Erfindungsgebiet
Die Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis, insbesondere zum labordiagnostischen Nachweis, neurologischer, demenzieller Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnisses einhergehen oder einer Veranlagung für solche Erkrankungen oder Verfahren zur Prognose solcher Erkrankungen. Dazu wird die Konzentration bestimmter proSAAS- Peptide oder proSAAS-Nukleinsäuren in Proben eines Individuums, insbesondere in Körperflüssigkeiten, ermittelt, insbesondere innerhalb eines labortechnisch durchführbaren Verfahrens. Weiterhin betrifft die Erfindung Peptide und Nukleinsäuren, die zur Bestimmung der Wahrscheinlichkeit des zukünftigen Auftretens der Erkrankung, und/oder des Vorhandenseins und/oder der Prognose und/oder des Grades der neurologischen, demenziellen Erkrankung aufgefunden wurden.
Außerdem betrifft die Erfindung Nachweisreagenzien wie Antikörper und Nukleinsäuren und dergleichen, über die diese proSAAS-Peptide, bzw. die entsprechenden Nukleinsäuren nachgewiesen werden können. Weiterhin betrifft die Erfindung Zubereitungen, die proSAAS, proSAAS-Peptide wie z.B. „little SAAS" ( = proSAAS 42-59), „big SAAS ( = proSAAS 34-59), „KEP" ( = proSAAS 34-40), „PEN" ( = proSAAS 221 -242), „big PEN-LEN" ( = proSAAS 221 -260), „little PEN-LEN" ( = proSAAS 221 -254), „big LEN" ( = proSAAS 245-260), „little LEN" ( = proSAAS 245-254), proSAAS-Antikörper, proSAAS- Nukleinsäuren, oder proSAAS-Agonisten enthalten, zur Therapie, Diagnose, Prognose oder Prophylaxe von neurologischen, demenziellen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer. Weiterhin betrifft die Erfindung Methoden zur Stratifizierung von Patienten oder Teilnehmern klinischer Studien. Hintergrund der Erfindung
Neurologische, demenzielle Erkrankungen stellen in den Industrieländern aufgrund der steigenden durchschnittlichen Lebenserwartung ein zunehmendes Problem dar. Diese Erkrankungen sind größtenteils nicht heilbar und machen eine langanhaltende, kostspielige Pflege der Erkrankten erforderlich. Es sind mehr als 60 demenzielle Erkrankungen bekannt, einschließlich solcher Erkrankungen, die demenzielle Erscheinungen mit sich bringen. Hiervon entfallen ca. 65 % auf Morbus Alzheimer (Alzheimersche Krankheit , Alzheimer's Disease, AD), deren Diagnose und Therapie deshalb ein hoher Stellenwert zukommt. Neben Morbus Alzheimer sind unter anderem folgende nichtAlzheimer-Demenzen bekannt: die vaskuläre Demenz, die Lewy-Body-Demenz, die Binswanger-Demenz sowie demenzielle Erkrankungen, die als Begleiteffekt anderer Krankheiten, wie Parkinsonscher Krankheit, Huntington-Disease, Pick's- Disease, Gerstmann-Sträussler-Scheinger-Krankheit, Creuzfeldt-Jakob-
Krankheit, Depression usw. vorkommen.
Morbus Alzheimer ist eine neurodegenerative Erkrankung, die sich insbesondere durch ein stark eingeschränktes Kurzzeitgedächtnis auszeichnet. Morphologisch kommt es zu Veränderungen im Gehirn, die sich u.a. in Form von Amyloidablagerungen und degenerierten Nervenzellen äußern. Die morphologischen Veränderungen können nach dem Tode des Patienten histologisch diagnostiziert werden und sind bis heute der einzige sichere Nachweis der Erkrankung. Diese histopathologischen Diagnosen beruhen auf Kriterien, die das "Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease" (CERAD) festgelegt hat. Zur Diagnose von Morbus Alzheimer werden derzeit folgende kriterienbasierte Diagnosesysteme verwendet: Die "International Classification of Diseases, 10th revision" (ICD-10), das „Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition" (DSM-IV) der „American Psychiatrie Association", und die vom "National Institute of Neurological and Communicative Disorders and Stroke/Alzheimer's Disease and Related Disorders Association" NINCDS-ADRDA aufgestellten "Work Group crieria".
Diese Systeme verwenden eine Reihe von neuropsychologischen Tests, um eine Morbus-Alzheimer-Diagnose treffen zu können, nicht jedoch objektiv messbare klinische Parameter. Es ist von besonderem Interesse, die aktuelle Ausprägung des Schweregrads der Erkrankung zu erfassen, was z.B. durch Bestimmung des „Mini-Mental Scores" erfolgen kann. Der „Mini-Mental Score" wird mit Hilfe einer „Mini-Mental State Examination" (MMSE), eines psychologischen Tests, ermittelt. Dadurch wird u.a. ermöglicht, den Verlauf der Erkrankung und die Wirksamkeit von Therapien zu beobachten. Clark et al. konnten jedoch zeigen, dass z.B. zur Ermittlung des Verlaufs von Morbus Alzheimer die Bestimmung des „Mini-Mental Scores" nur begrenzt aussagekräftig ist, da große Messungenauigkeiten und große Variationen in der Höhe des Scores auftreten [1 ]. Daher ist die Bereitstellung eines verlässlichen, klinisch messbaren Parameters, der die „Mini-Mental State Examination" oder andere bisher zur Diagnose von Erkrankungen wie Morbus Alzheimer verwendete neuropsychologische Tests ergänzen oder ersetzen kann, von großer medizinischer und wirtschaftlicher Bedeutung. Diese kognitiven Tests werden außerdem nur von spezialisierten Zentren durchgeführt. Ein biochemischer Test hätte den Vorteil, auch für nicht spezialisierte Ärzte leicht zugänglich zu sein.
Derzeit steht keine ursächliche Therapie zur Behandlung von Morbus Alzheimer zur Verfügung. Die Erkrankung wird lediglich symptomatisch z.B. durch die Gabe von Neurotransmittern wie Acetylcholin oder Acetylcholinesterase- Inhibitoren behandelt. Als weitere mögliche Therapiestrategien werden derzeit die Gabe von Antioxidantien, von Radikalfängern, von Calciumkanalblockern, von anti-inflammatorischen Substanzen, von Secretaseinhibitoren, von anti- Amyloid Antikörpern usw. sowie die Immunisierung gegen Amyloid-Peptide erprobt. Es ist bisher aber noch keine ursächliche Therapie dieser Erkrankung möglich. Aus der WO 02/090974 ist bereits ein gattungsgemäßes Verfahren bekannt, bei dem das Vorhandensein und ggf. der Schweregrad einer chronisch- demenziellen Erkrankung durch ein Markerpeptid angezeigt wird. Weiterhin sind auch andere Marker aus der WO 02/082075 bekannt. Es besteht jedoch weiterhin ein großer Bedarf an zusätzlichen Marker-Substanzen für diesen Krankheits-Bereich, die u.a. zur Absicherung des Ergebnisses zusätzlich oder in Kombination mit schon bekannten Markern angewendet werden könnten, die evtl. andere Unterformen der Krankheit anzeigen könnten, die zusätzlich Aufschluss über die biochemischen Abläufe der Krankheit geben oder die eine Therapie durch Gabe oder Abfangen bestimmter Peptide ermöglichen.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, weitere Marker für die Morbus- Alzheimer-Diagnose zur Verfügung zu stellen, hierdurch die Diagnose neurologischer, demenzieller Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergehen weiter zu verbessern, ein frühzeitig und zuverlässig anwendbares Verfahren zum Nachweis dieser Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, zur Verfügung zu stellen, sowie Methoden zur Therapie dieser Erkrankungen bereit zu stellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass in Körperflüssigkeitsproben von an Morbus Alzheimer leidenden Patienten, insbesondere in Liquor cerebrospinalis, die Konzentration bestimmter von proSAAS abstammender Proteinfragmente relativ zu ihrer Konzentration in Kontrollproben vermindert ist und so einen z.B. labordiagnostischen Nachweis von Morbus Alzheimer ermöglicht.
Zur Lösung der Aufgabe umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, insbesondere von Morbus
Alzheimer oder einer Veranlagung für eine solche Erkrankung durch Bestimmung von proSAAS und/oder eines oder mehrerer proSAAS-Fragmente, welche von der Sequenz mit der SwissProt Accession No. Q9UHG2 ( = Seq.-ID 28) abgeleitet sind, in einer biologischen Probe eines Individuums. Dabei handelt es sich vorzugsweise um ein labortechnisches Verfahren, dessen Ergebnis von einem Arzt für die Diagnose verwendet werden kann. Da davon ausgegangen werden kann, dass die nachgewiesenen Stoffe mit der Erkrankung in einem ursächlichen Zusammenhang stehen, beinhaltet die vorliegende Erfindung auch ihre Gabe zur Therapie von Morbus Alzheimer oder verwandter neurologischer, demenzieller Erkrankungen.
Zur Lösung der Aufgabe gibt die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis oder zur Prognose einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, insbesondere Morbus Alzheimer an. Bei diesem Verfahren wird wenigstens proSAAS oder proSAAS-Fragment in einer biologischen Probe eines Patienten bestimmt. Eine weitere Ausführungsform ist die Diagnose derartiger Erkrankungen bereits zu einem frühen Zeitpunkt, z.B. bei Diagnose von „Mild Cognitive Impairment" (MCI) oder die Diagnose neurologischer Erkrankungen die verschieden zu Morbus Alzheimer sind, wie z.B. Lewy-Body-Demenz, vaskuläre Demenz oder Depression.
Dazu sind verschiedene Lösungsansätze in der medizinischen Diagnostik möglich und üblich:
Zum einen kann generell auf das Vorhandensein eines Peptids oder einer Nukleinsäure untersucht werden und die Abwesenheit, bzw. Anwesenheit dieses Stoffes ermöglicht dann eine Diagnose der Erkrankung. Dabei kann generell auf die Abwesenheit oder auf die Anwesenheit der Erkrankung getestet werden. Bei einer anderen Diagnosestrategie werden zunächst die üblicherweise vorhandenen Konzentrationen dieser Stoffe bei Kontrollen und bei Patienten, die an der zu diagnostizierenden Erkrankung leiden, bestimmt und anhand dieser Messwerte ein Grenzwert, häufig auch "cut-off" Punkt genannt, ermittelt, der die Gruppe der als gesund betrachteten von der Gruppe der als krank betrachteten trennt. Der für jedes -Peptid oder jede Nukleinsäure individuell ermittelte Grenzwert ermöglicht eine eindeutige Unterscheidung von gesunden und kranken Personen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung liegt per Definition eine Verminderung des Peptids oder der Nukleinsäure auch dann vor, wenn diese nicht nachweisbar sind, weil sie in der Probe nicht vorhanden sind, oder weil sie in einer Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze vorhanden sind.
Bei einer weiteren Diagnosestrategie wird eine für den jeweiligen Marker spezifische Konzentrationserhöhung oder Konzentrationsverminderung des Markers in einer Probe des Patienten relativ zu der Konzentration dieses Markers in der Kontrollprobe ermittelt und eine signifikante Konzentrationsänderung als positives Nachweisergebnis für die Erkrankung gewertet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind die Marker (proSAAS, proSAAS- Fragmente und proSAAS-Nukleinsäuren) bei vorliegen der neurologischen, demenziellen Erkrankung vermindert, unterhalb der Nachweisgrenze oder fehlen ganz in der biologischen Probe.
Bevorzugte Marker nach der Erfindung sind im Sequenzprotokoll angegeben und sind mit den Sequenzen entsprechend Seq.-ID 1 bis 35 und 37 bis 52 des Sequenzprotokolls benannt. Die Sequenzen der bevorzugten Peptide sind in Tabelle 1 und teilweise auch in Abbildung 1 dargestellt. Vorzugsweise kann die Konzentration der proSAAS-Peptide oder proSAAS- Nukleinsäuren in der biologischen Probe, aber auch das charakteristische Muster des Auftretens mehrerer definierter Stoffe dieser Gruppe, mit dem Schweregrad, der Prognose oder der Wahrscheinlichkeit des Auftretens der Erkrankung korreliert werden. Diese neuen Marker ermöglichen daher die Entwicklung und die begleitende Kontrolle von Therapien zur Behandlung neurologischer, demenzieller Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergehen, insbesondere von Morbus Alzheimer, da der Verlauf und ein eventuell aufgrund einer Therapie einsetzender Heilungserfolg oder ein vermindertes Fortschreiten der Erkrankung frühzeitig ermittelt werden können (Surrogatmarker). Eine effektive Therapie von Morbus Alzheimer, einer der häufigsten neurologischen Erkrankungen, ist derzeit nicht möglich, was die Dringlichkeit der Bereitstellung einer frühzeitigen, sensitiven labordiagnostischen Nachweismethode unterstreicht.
Der z.B. labordiagnostische Nachweis von proSAAS, proSAAS-Peptiden oder proSAAS-Nukleinsäuren ermöglicht außerdem die Stratifizierung von Patienten und von Teilnehmern klinischer Studien. Dadurch können auch Therapeutika und Diagnostika entwickelt und medizinisch eingesetzt werden, die nur in Sub- Gruppen von Patienten wirksam sind.
Bei Morbus-Alzheimer-Patienten sind die Konzentrationen von proSAAS- Fragmenten deutlich verringert, verglichen mit nicht an Morbus-Alzheimer erkrankten Personen. Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist es daher, die verminderte Konzentrationen von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten bei Morbus-Alzheimer-Patienten auf normale oder eventuell sogar erhöhte Konzentrationen zu bringen, relativ zu den Konzentrationen in nicht an Morbus- Alzheimer Erkrankten Personen. Dabei ist zu bedenken, dass es möglich ist, dass ein bestimmtes proSAAS-Fragment in seiner Konzentration vermindert ist, dass es zur Therapie aber unter Umständen sinnvoll ist das gesamte proSAAS-
Protein oder ein anderes proSAAS-Fragment als Therapeutikum zu verabreichen und nicht das aufgefundene, in seiner Konzentration verminderte proSAAS- Fragment. Der Grund hierfür ist, dass das zu Diagnosezwecken bestimmte proSAAS-Fragment ein definiertes Abbauprodukt von proSAAS oder eines anderen proSAAS-Fragments sein kann und daher nur indirekt anzeigt, welcher von proSAAS abgeleitete Stoff therapeutisch eingesetzt werden sollte. Dieses ändert nichts an der Spezifität der Diagnose, da in diesem Fall zukünftig nach Bestimmung eines z.B. zu niedrigen Konzentrationswertes für ein bestimmtes proSAAS-Fragment X ein ganz genau definiertes anderes proSAAS-Fragment Y oder das gesamte proSAAS therapeutisch verabreicht werden muss. Dieses Verfahren kann zur Therapie von Morbus Alzheimer oder verwandten neurologischen, demenziellen Erkrankungen eingesetzt werden. Liegt ein Mangel an proSAAS oder proSAAS-Fragmenten als Erkrankungsursache vor, so können therapeutische Gaben von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten oder entsprechender Agonisten vorgenommen werden. Auch Substanzen, die die Prozessierung von proSAAS beeinflussen, können therapeutisch eingesetzt werden. Wie in Abbildung 1 zu sehen ist, sind z.B. „PEN", „little LEN" und „little PEN-LEN" von je zwei sogenannten di-basischen Aminosäure-Sequenzen flankiert (in diesen Fällen Arg-Arg bzw. Lys-Arg) und „big SAAS" entspricht der proSAAS-Aminosäuresequenz zwischen dem Ende der proSAAS-Signalsequenz und der ersten di-basischen Sequenz in proSAAS und „big PEN-LEN" und „big LEN" sind je von einer di-basischen Sequenz und dem Stop-Codon von proSAAS flankiert. Di-basischen Sequenzen sind häufig Angriffspunkte von Proteasen, die bei der Prozessierung von Proteinen zu biologisch aktiven Peptiden eine Rolle spielen. Für proSAAS ist bereits gezeigt worden, dass zumindest einige proSAAS-Fragmente durch Prohormonkonvertasen aus dem Muttermolekül proSAAS generiert werden können. Humanes proSAAS enthält insgesamt 6 solcher di-basischen Sequenzen, die potentiell von Prohormonkonvertasen erkannt werden können. Natürlich ist auch die Kombination von verschiedenen Therapiestrategien möglich und unter Umständen sinnvoll. Die Erfindung umfasst daher auch die Verwendung von proSAAS, proSAAS- Fragmenten und proSAAS-Nukleinsäuren, insbesondere proSAAS-Fragmenten die durch Prozessierung durch Enzyme wie z.B. Prohormonkonvertasen wie PC- 1 , PC-2, PC-5, PC-7, PACE4 oder Furin entstehen können, sowie entsprechende Peptidomimetika zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Alternativ zu den genannten Proteinen und Proteinfragmenten können auch Fusionsproteine dieser Proteine und Proteinfragmente Verwendung finden. Es können auch zwei oder mehr Proteine oder Proteinfragmente miteinander oder mit weiteren nicht-proSAAS-Sequenzen verknüpft werden. Diese Peptide können sowohl kovalent als auch nicht kovalent verknüpft werden, und es können sowohl lineare, als auch verzweigte oder zirkuläre Moleküle oder Kombinationen aus linearen, verzweigten oder zirkulären Molekülen aus diesen Proteinen oder Proteinfragmenten hergestellt werden. Ein Beispiel für eine nicht kovalente Verknüpfung wäre z.B. die Verknüpfung eines Biotin-markierten proSAAS mit einem Streptavidin- markierten Antikörper. Außerdem umfasst die Erfindung Agonisten, die die Konzentration oder Aktivität der genannten Proteine und Proteinfragmente verstärken. Beispiele für solche Agonisten wären Prohormonkonvertasen, durch die z.B. bestimmte proSAAS-Fragmente verstärkt gebildet werden und so die Konzentration dieser proSAAS-Fragmente erhöht wird.
Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die galenische Formulierung oder chemische Modifizierung von proSAAS, proSAAS-Fragmenten und proSAAS-Nukleinsäuren in einer Art und Weise, die es ihnen ermöglicht, die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut-Liquor-Schranke effizienter zu passieren oder die es ermöglicht, dass sie effizienter ins Zellinnere gelangen können. Dadurch eignen sich diese derart modifizierten Stoffe dann besonders zur therapeutischen Anwendung. Um dieses zu erreichen, können z.B. proSAAS, proSAAS-Fragmenten, proSAAS-Nukleinsäuren, proSAAS-Agonisten, usw. derart modifiziert werden, dass sie z.B. lipophiler werden, was den Übertritt in den Subarachnoidalraum begünstigt. Dieses kann durch Einfügung von hydrophoben Molekülbestandteilen wie z.B. Kohlenwasserstoff-Ketten oder auch durch die „Verpackung" der Stoffe in hydrophobe Agentien, z.B. Liposomen, erreicht werden. Außerdem können z.B. proSAAS-fremde Peptidsequenzen verwendet werden, die den Eintritt von proSAAS, proSAAS- Fragmenten, proSAAS-Nukleinsäuren, proSAAS-Agonisten, usw. in den Subarachnoidalraum begünstigen, bzw. umgekehrt den Austritt aus dem Subarachnoidalraum heraus erschweren oder die den Transport dieser Stoffe durch die Zellmembran erleichtern oder fördern, was z.B. die HIV-Tat-Sequenz, die Antennapedia-Sequenz oder die VP22-Sequenz bewirken kann.
Die Erfindung umfasst auch die Verabreichung der genannten Stoffe über verschieden Wege, wie z.B. als intravenöse Injektion, als oral applizierbare Substanz, als inhalierbares Gas oder Aerosol, als topische Anwendung oder die Verabreichung in Form von direkten Injektionen in den Subarachnoidalraum, oder in Gewebe wie z.B. Muskel, Fettgewebe, Gehirn usw. Dadurch kann eine erhöhte biologische Verfügbarkeit und Wirksamkeit, sowie eine erhöhte lokale Konzentration dieser Stoffe erreicht werden. Zum Beispiel können Proteine oder Proteinfragmente, die oral verabreicht werden, durch säureresistente Kapseln vor proteolytischem Abbau im Magen geschützt werden. Stark hydrophobe Substanzen können durch geeignete galenische Aufbereitungen hydrophiler und somit besser geeignet für z.B. intravenöse Injektionen werden. Dazu können diese Stoffe z.B. mit Polymeren wie z.B. Polyethylenglykol verknüpft, das heißt pegyliert werden. Pegylierte Stoffe sind oft besser löslich, weniger immunogen und weisen eine längere In-vivo-Halbwertszeit auf. Weitere mögliche Darreichungsformen sind unter anderem die Verpackung der Wirkstoffe in Polymere oder Gele (Atrix Labs, Fort Collins, CO, USA, Andrx Pharmaceuticals, Davie, FL USA) usw. wodurch ihre kontinuierliche und kontrollierte Freisetzung über einen längeren Zeitraum erreicht werden kann.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von proSAAS, proSAAS-Fragmenten, proSAAS-Nukleinsäuren oder proSAAS-Agonisten in Screeningverfahren, um Diagnostika oder Therapeutika gegen neurologisch Erkrankungen zu identifizieren. Durch solche Screeningverfahren können z.B. Moleküle aufgefunden werden, die proSAAS oder proSAAS-Fragmente binden (z.B. Rezeptoren) oder die diese Moleküle aktivieren oder in ihren Konzentrationen erhöhen (z.B. Prohormonkonvertasen). Auf diese Weise identifizierte Rezeptoren können durch Gabe von Agonisten oder Antagonisten moduliert werden, was zur Therapie von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, zweckmäßig ist.
Definitionen:
Peptid
Unter Peptid versteht man zumindest 2 Aminosäuren, die über eine Peptidbindung kovalent miteinander verknüpft sind, vorzugsweise zumindest 4, 6, 8, 10, 12, 15, 20, vorzugsweise zumindest mehr als 50 Aminosäuren. Es gibt dabei keine Limitierung hinsichtlich der Anzahl der maximal möglichen Aminosäuren, und ein Protein ist daher grundsätzlich auch ein Peptid.
proSAAS Mit proSAAS sind Peptide oder Nukleinsäuren gemeint, die der gesamten
Sequenz eines in der Natur vorkommenden proSAAS entsprechen, vorzugsweise humanem proSAAS, vorzugsweise der humanen proSAAS- Aminosäuresequenz entsprechend Seq.-ID 28 bzw. der humanen proSAAS Nukleinsäuresequenz entsprechend Seq.-ID 36 entsprechen. Darin eingeschlossen sind alle Arten von proSAAS, die in der Natur vorkommen, unabhängig von welcher Spezies sie stammen.
Fragmente von proSAAS
Fragmente von proSAAS oder proSAAS-Nukleinsäuren sind Teilsequenzen der jeweiligen Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen. Diese Fragmente sind im
Falle von Aminosäuresequenzen mindestens 8 Aminosäuren, insbesondere mindestens 9, 10, 12, 14, 20, 30, 50, insbesondere mindestens 100 Aminosäuren lang und im Falle von Nukleinsäuresequenzen vorzugsweise mindestens 15, 18, 21 , 24, 30, 45, 60, 90, 120, insbesondere mindestens 250 Nukleotide, lang.
proSAAS-Peptid
Mit proSAAS-Peptide sind alle Aminosäuresequenzen von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten gemeint.
Homologe Sequenzen
Homologe proSAAS-Aminosäuresequenzen weisen vorzugsweise eine Homologie von mindestens 70 %, 80 %, 90 %, 95 % vorzugsweise mindestens 99 % auf. Homologe proSAAS-Nukleinsäuren weisen vorzugsweise eine Homologie von 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, vorzugsweise mindestens 99 % auf. Der %-Anteil kann wie nachfolgend noch beschrieben wird, in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise berechnet werden.
Komplementäre Sequenzen
Unter einer komplementären Sequenz versteht man eine Nukleinsäuresequenz, die in der Lage ist mit der Sequenz, zu der sie komplementär ist, zu hybridisieren. Dazu treten jeweils Adenin und Thymidin, bzw. Uracil oder Guanin und Cytosin miteinander in Wechselwirkung. Diese Wechselwirkung wird auch als hybridisieren bezeichnet. Unter spezifisch hybridisieren versteht man, das nicht zufällige Nukleinsäuresequenzen miteinander in Wechselwirkung treten, sondern Nukleinsäuren bei denen die komplementäre Nukleinsäuresequenz der einen Nukleinsäure eine ausreichende Homologie, vorzugsweise mindestens 60 % Homologie, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, vorzugsweise mindestens 99 % zur anderen Nukleinsäuresequenz aufweist. Entsprechende Protokolle zur Durchführung einer spezifischen Hybridisierung sind dem Fachmann bekannt und werden nachfolgend noch exemplarisch beschrieben. Degenerierte Nukleinsäuren
Unter degenerierten Nukleinsäuren versteht man Nukleinsäuren, deren Nukleinsäuresequenzen unterschiedlich zueinander sind, die aber für identische Aminosäuresequenzen kodieren.
Derivate von Peptiden und Nukleinsäuren
Unter einem Derivat eines Peptids oder einer Nukleinsäure versteht man alle Arten von Veränderungen einer Aminosäure- bzw. Nukleinsäuresequenz, solange die Sequenz dabei ihre Funktion und/oder Struktur behält. Derivate von Peptiden sind unter anderem Peptide mit postranslationalen, Modifikationen, die durch Enzyme wie z.B. Kinase, Phosphatasen, Glykosidasen, usw. entstehen. Ein Derivat eines proSAAS-Peptids ist auch eine proSAAS-Aminosäuresequenz, an der am N- oder C-Terminus oder intern in der proSAAS-Sequenz andere Aminosäuresequenzen angefügt oder eingefügt sind, die nicht proSAAS- Sequenzen entsprechen. Solche Peptide werden im Stand der Technik auch als Fusionspeptide oder Fusionsproteine bezeichnet. Derivate von proSAAS- Peptiden sind auch solche Peptide, bei denen verschiedene Aminosäuresequenzbereiche von proSAAS-Peptiden zusammengefügt werden, wobei auch chimäre proSAAS-Peptide eingeschlossen sind, d.h. Peptide, die aus z.B. proSAAS-Sequenzbereichen von proSAAS-Peptiden, die aus verschiedenen Spezies stammen, zusammengefügt sind. Ferner beinhalten Derivate von Peptiden und Nukleinsäuren lineare, zirkuläre, und verzweigte Sequenzen aus Aminosäuren oder Nukleinsäuren.
Derivate von proSAAS-Peptiden oder proSAAS-Nukleinsäuren können auch durch chemische oder enzymatisch Behandlungen wie z.B. Biotin-Markierung, Ubiquitin-Markierung, Reduktion, Oxidation, Markierung mit Radionukliden, Farbstoffen oder Fluorphoren usw. entstehen. Eingeschlossen sind auch Peptide die Aminosäuren beinhalten, die nicht in dem genetisch kodierten Standard-Set der 20 Aminosäuren enthalten sind, D- und L-Aminosäuren, oder auch Strukturen, die zwar die räumliche Struktur einer Aminosäurekette aufweisen, aber ganz oder Teilweise aus anderen Bausteinen aufgebaut sind (auch Mimetika oder Peptidomimetika genannt). Zur Markierung geeignet sind zum Beispiel Radionuklide wie Phospohr-32 oder -33, Schwefel-35, lod-125, Tritium, Kohlenstoff- 14, Calcium-45, Chrom-51 , usw., Farbstoffe oder andere organische, anorganische oder biologische Strukturen wie Digoxigenin, Biotin, Fluorophore wie Fluorescein, Rhodamin, Texas-Red, BODIPY, usw.
Die vorstehend genannten Derivatisierungen von Peptiden oder Nukleinsäuren können auch in Kombinationen von zwei oder mehr Derivatisierungen vorhanden sein, sie können das gesamte Moleküle oder Teile davon, insbesondere maximal 1 , 2, 4, 6, 8, 10, 20, 30, 50, 100, oder mehr als 100 Bausteine dieser Moleküle (Aminosäuren oder Nukleotide) betreffen und sie können natürlich in der Natur vorkommen, oder künstlich durch z.B. durch chemische Synthese oder molekularbiologische Methoden hergestellt werden.
Homologie von Sequenzen
Zur Bestimmung der Homologie zwischen Sequenzen können Computerprogramme wie z.B. das GCG Programmpaket (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wl, USA), einschließlich GAP [2], BLASTP, BLASTN, FASTA [3] oder der bekannte Smith-Waterman-Algorithmus zur Bestimmung der Homologien verwendet werden. Dabei wird generell nach größtmöglicher Sequenzübereinstimmung gesucht. Bevorzugte Parameter für den Aminosäuresequenz-Vergleich umfassen den Algorithmus von Needleman und Wunsch [4], die Vergleichsmatrix BLOSUM 62 [5], ein Lücken-Wert (Gap Penalty) von 12, ein Lückenlängen-Wert (Gap Length Penalty) von 4 und ein Homologie-Schwellenwert (Threshold of Similarity) von 0. Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Fehler-Parameter (default parameters) für Aminosäuresequenz-Vergleiche, wobei Lücken an den Enden den Homologie- Wert nicht verringern. Bei sehr kurzen Sequenzen im Vergleich zur Referenz-
Sequenz kann es weiterhin notwendig sein, den Erwartungswert auf bis zu 100000 (expectation value) zu erhöhen und gegebenenfalls die Wortlänge (word size) auf bis zu 2 zu verkleinern. Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm- Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten, können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder der Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird. Eine mit dem oben genannten Algorithmus ermittelte Übereinstimmung von 70 % wird im Rahmen dieser Anmeldung als 70 % Homologie bezeichnet. Entsprechendes gilt für höhere oder geringere Homologie-Grade. Der %-Wert für die Homologie bezieht sich auf die jeweils kürzere Sequenz, das heißt ein 70 % homologes proSAAS-Fragment von 100 Aminosäuren Länge muss zumindest in 70 seiner Aminosäuren homolog zur Sequenz von proSAAS sein.
Chemisch oder posttranslational modifizierte Peptide
Chemisch oder posttranslational modifiziertes proSAAS oder proSAAS- Fragmente können sowohl aus D- als auch aus L-Aminosäuren, sowie aus Kombinationen von D- und L-Aminosäuren bestehen und können sowohl natürlich vorkommen, rekombinant oder enzymatisch hergestellt oder chemisch synthetisiert werden. Außerdem können ungewöhnliche Aminosäuren, d.h. Aminosäuren, die nicht zu den 20 Standardaminosäuren gehören, enthalten sein. Zahlreiche Beispiele für ungewöhnliche Aminosäuren und postranslationale Modifikationen wie z.B. Phosphor- und Sulfatgruppen, Glykosilierungen, Amidierungen, Deamidierungen, Pyroglutamat-Modifizierungen usw. sind in der Literatur und in Datenbanken beschrieben [6]. Zum Beispiel konnten wir ein proSAAS-Fragment mit der ungewöhnlichen Aminosäure Hydroxyprolin identifizieren. Modifikationen, wie z.B. Phosphorylierungen und Sulfatierungen sind für proSAAS aus der Literatur bekannt. Weitere häufig bei Peptiden auftretende Modifizierungen sind Pyroglutamat-Modifizierungen, sowie oxidierte oder amidierte Peptide.
Nukleinsäuren Als proSAAS-Nukleinsäuren werden DNA, RNA und DNA-RNA-Hybridmoleküle sowohl natürlichen Ursprungs, als auch synthetisch, enzymatisch oder rekombinant hergestellte Nukleinsäuren angesehen, die für proSAASoder für proSAAS-Fragmente kodieren. Für proSAASoder für proSAAS-Fragmente kodierende Nukleinsäuren können auch ein Bestandteil von Vektoren, insbesondere von Plasmiden, Cosmiden, Phagenpartikeln, künstlichen Chromosomen, viralen Vektoren, Retroviren, Adenoviren, adenoähnlichen Viren, Bacculoviren, usw. sein. Ferner können diese Nukleinsäuren und Vektoren eine lineare oder zirkuläre Struktur aufweisen und einzel- oder doppelsträngig vorliegen. Eingeschlossen sind auch Nukleinsäuren und Vektoren, die ganz oder in Teilen aus modifizierten Nukleotiden aufgebaut sind, bei denen z.B. im Basen- Anteil, im Zucker-Anteil oder im Phosphat-Anteil Modifizierungen vorliegen. Diese modifizierten Nukleinsäuren können in der Natur vorkommen oder synthetisch hergestellt werden. Beispiele für modifizierte Nukleinsäuren sind PNAs (Peptide-Nucleic-Acids), 2'-o-methoxyethyl-Nukleinsäuren, 2'-fluoro- Nukleinsäuren, arabino-Nukleinsäuren und sogenannte „locked nucleic acids" oder Nukleinsäuren, die Phosphothioate, N3',P5'-Phosphoramidate, Morpholino- Phosphoramidate, usw. enthalten. Nukleinsäuren können im Sinne der Erfindung z.B. als Primer für Polymerase-Ketten-Reaktionen (PCR) verwendet werden oder als Target-Sequenz auf DNA-Chips ( = DNA-Arrays = DNA-Mikroarrays) gebunden sein, wobei die Länge der Sequenzen vorzugsweise 8-60 Nukleotide, vorzugsweise 8-60, 8-50, 8-40, vorzugsweise 8-30 Nukleotide beträgt. Die Nukleinsäuresequenzen auf DNA-Chips können aber auch erheblich länger sein, insbesondere wenn sie nicht direkt auf der Chip-Oberfläche synthetisiert werden. Sequenzlängen von vorzugsweise 100 bis 10000, 100 bis 5000, 100 bis 3000, 100 bis 1000, insbesondere 100 bis 300 Nukleotiden sind möglich. Nukleinsäuren können im Sinne der Erfindung auch als Sonden zur Detektion von proSAAS-Nukleinsäuresequnezen verwendet werden, z.B. bei Northern oder Southern-Blots, oder bei in situ Hybridisierungen, oder auf DNA-Chips, wobei diese Sonden vorzugsweise bis zu 30, bis zu 40, 50, 60, 80, 100, 200, 300, 400, 800 Nukleotiden oder eine Länge von mehr als 800 Nukleotiden aufweisen. ProSAAS Nukleinsäuren können außerdem weitere Sequenzen N- terminal, C-terminal und/oder intern beinhalten, die nicht proSAAS-Sequenzen entsprechen, sondern z.B. für bestimmte Strukturelemente kodieren, die dem von der Nukleinsäure kodiertem Peptid neue Eigenschaften verleihen. Solche Sequenzen können z.B. für sogenannte Tag-Sequenzen, die eine Isolierung oder die Detektion des Peptids ermöglichen, z.B. His-tag, HA-tag, GST-tag, fluoreszierende Proteine wie GFP (green flourescent protein), Enzyme wie Peroxidase, Alkalische Phosphatase, Luciferase oder für Toxine, usw.
Mutanten Unter Mutanten von Nukleinsäuren oder Peptiden im Sinne der Erfindung versteht man Sequenzen die durch Substitutionen, Deletionen, Insertionen oder Inversionen entstanden. Bei Nukleinsäuren können diese Mutationen sowohl kodierende als auch nicht kodierende Bereiche der Sequenz, z.B. Promotoren, Introns, 3'- oder δ'-untranslatierte RNA-Bereiche usw. betreffen. Mutationen in Nukleinsäuren können sowohl konservativ, d.h. nicht die Aminosäuresequenz verändernd, als auch nicht konservativ sein, d.h. zur Veränderung der Aminosäuresequenz führen. Die resultierenden Mutanten der proSAAS-Peptide können sowohl funktionelle, als auch eingeschränkt funktionelle oder inaktive proSAAS-Peptide sein. Insbesondere sind auch proSAAS-Peptide eingeschlossen, die aufgrund von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer auftreten. Eingeschlossen sind sowohl proSAAS-Peptide mit als auch ohne Signalsequenz, Pro-Formen von proSAAS, die noch nicht prozessiert sind, sowie bereits prozessiertes proSAAS, lösliche proSAAS- Peptide und membranständige proSAAS-Peptide. Sensitivität
Als Sensitivität wird der Anteil an erkrankten Patienten definiert, die bei einer Diagnose auf die Erkrankung ein positives Diagnoseergebnis erhalten, d.h. die Diagnose zeigt die Erkrankung korrekt an.
Spezifität
Als Spezifität wird der Anteil an gesunden Patienten definiert, die bei einer Diagnose auf die Erkrankung ein negatives Diagnoseergebnis erhalten, d.h. die Diagnose zeigt korrekt an, dass keine Erkrankung vorliegt.
ProSAAS - Biologischer Hintergrund
ProSAAS ist auch unter dem Namen „Granin-like neuroendocrine peptide precursor" in der Literatur beschrieben. Der Name proSAAS leitet sich von einer Aminosäuresequenz Serin-Alanin-Alanin-Serin ab, die im N-Terminus vom proSAAS vorhanden ist [7]. Bisher sind in der Protein-Datenbank „SwissProt" die Sequenzen von humanem (Accession-Nr.: Q9UHG2), murinem (Accession- Nr.: Q9QXV0)und von proSAAS aus der Ratte (Accession-Nr.: Q9QXU9) vorhanden. Das murine proSAAS ist auch unter dem Namen PC3KIN (Accession-Nr.: Q91 W26) in der Literatur beschrieben, wobei es sich bei diesem proSAAS um eine proSAAS-Mutante handelt, die eine Punktmutation aufweist. In der Maus wurde außerdem das mit proSAAS aufgrund seiner Aminosäuresequenz eng verwandtes Protein IA4 (Accession-Nr.: Q9ESU4) identifiziert.
Wie der Name andeutet, weist das proSAAS auf funktioneller Ebene gewisse Ähnlichkeiten mit Graninen auf und wird in neuroendokrinen Zellen expremiert. Eine BLAST-Suche ergibt jedoch, das proSAAS zumindest aufgrund seiner Aminosäuresequenz nicht mit den Graninen verwandt ist. Die vermutliche biologische Funktion von proSAAS ist die Inhibierung der Prohormonkonvertase 1 (PC1 ). Daher ist proSAAS funktioneil mit 7B2 verwandt, das die Prohormonkonvertase 2 (PC2) inhibiert. Beide Proteine, proSAAS und 7B2, weisen eine Reihe sogenannter di-basische Sequenzen auf (Arginin-Arginin oder Lysin-Arginin) die von z.B. Prohormonkonvertasen C-terminal gespalten werden können. Durch solche proteolytischen Aktivitäten werden von proSAAS und 7B2 unter anderem C-terminale Peptide abgespalten (CT-Peptide), die spezifische und effiziente Inhibitoren von PC1 bzw. PC2 sind [8, 9]. Sowohl das komplette proSAAS-Protein als auch das komplette 7B2-Protein wirken auch direkt inhibitorisch. ProSAAS und 7B2 weisen eine prolinreiche Domäne auf.
Es sind verschiedene Fragmente vom proSAAS in der Literatur beschieben. Diese Fragmente wurden z.B. aus murinem Gewebeextrakten gewonnen, und es stellte sich bei vielen dieser Fragmente heraus, dass sie aus Prozessierungs- Vorgängen, an denen vermutlich Prohormonkonvertasen beteiligt sind, hervorgegangen sind [10]. Unter anderem sind proSAAS-Fragmente beschrieben, die der proSAAS-Aminosäuresequenz von Aminosäure 42 bis 59 („little SAAS"), 221 bis 254 („little PEN-LEN"), 245 bis 254 („little LEN") und 245 bis 260 („big LEN") entsprechen [10]. Für „little SAAS" und „big LEN" gibt es Anhaltspunkte, dass sie von stimulierten Zellen sezerniert werden, so dass es daher möglich ist, dass diese Fragmente von proSAAS als z.B. Neurotransmitter wirken könnten [1 1 ]. In anderen Studien wurde beim Durchsuchen einer Peptid-Bibliothek ein Hexapeptid (Leu-Leu-Arg-Val-Lys-Arg) identifiziert, das der proSAAS-Sequenz von Aminosäure 239 bis 244 entspricht und ein starker Inhibitor von PC1 ist [12]. Dieses Peptid ist ein Teil des little PEN-LEN Peptids. In einer weiteren Studie wurde Liquor cerebrospinalis (CSF) von Patienten, die an frontotemporaler Demenz (FTD) leiden, mit den Ergebnissen von CSF-Untersuchungen gesunder Probanden verglichen. Bei diesen Untersuchungen zeigte sich, dass proSAAS eines von sechs verschiedenen Proteinen ist, das bei Patienten mit frontotemporaler Demenz im CSF in verminderten Konzentration vorhanden ist [13]. Die gleiche Arbeitsgruppe hat in einer anderen Studie CSF von Morbus Alzheimer Patienten untersucht und dort, wie sie selbst ausdrücklich betonen, keine veränderten proSAAS-Konzentrationen festgestellt [14]. Daher steht nach dem bisherigen Stand der Technik proSAAS nicht im Zusammenhang mit neurologischen, demenziellen Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergehen, insbesondere mit Morbus Alzheimer. Frontotemporale Demenz ist eine Erkrankung, die primär mit Verhaltensstörungen einher geht und weniger mit kognitiven Beeinträchtigungen, während Morbus Alzheimer durch Gedächtnisstörungen, insbesondere des Kurzzeitgedächtnis, sowie durch Ablagerungen im Gehirn (Senile Plaques) charakterisiert ist. Solche Ablagerungen treten bei frontotemporaler Demenz nicht auf [13, 14]. Die für andere neurologische Erkrankungen charakteristischen strukturellen Veränderungen des Gehirns wie amyloide Ablagerungen und „Lewy-Bodies" treten bei frontotemporaler Demenz nicht auf. Auch treten bei frontotemporaler Demenz nur im frontotemporalen Gehirnbereichen Synapsenverluste von ca. 50 % auf, während diese bei z.B. Morbus Alzheimer in allen Gehirnregionen auftreten [15-17]. Beim Durchsuchen einer Peptid-Bank nach PC 1 -Inhibitoren wurde das Hexapeptid (Leu-Leu-Arg-Val- Lys-Arg) identifiziert, das eine Teilsequenz des little PEN-LEN Peptids darstellt [12]. Dieses proSAAS-Fragment ist jedoch nicht so PC2-spezifisch wie proSAAS, da es auch PC1 und Furin inhibiert. In weiteren Studien konnte gezeigt werden, dass das Peptid Val-Leu-Gly-Ala-Leu-Leu-Arg-Val-Lys-Arg-Leu-
Glu ( = proSAAS 235-244) der wirksamste PC1 -Inhibitor ist, wobei die beiden Aminosäuren Leu-Glu am C-Terminus dieses Peptids für die PC 1 -Spezifität von besonderer Bedeutung sind [18].
In dem nachveröffentlichten Stand der Technik (US 2004/0002460 A1 ) konnten Averback et al. zeigen, das sogenannte „dense microsp eres", d.h. kleine Protein-Partikel im Gehirn gesunder, als auch im Gehirn an demenziellen Erkrankungen leidender Personen auftreten. Wenn die auch Spherons genannten Partikel, die aus Gehirngewebe isoliert wurden, zerplatzen, setzen sie unter anderem proSAAS Fragmente frei. Averback et al. spekuliert, dass diese durch
Freisetzung erhöhte Menge an proSAAS Fragmenten für ein Fortschreiten der cerebralen Amyloidose verantwortlich ist und schlägt Antagonisten dieser Moleküle als Therapeutika in der Behandlung von cerebraler Amyloidose vor.
Vorzugsweise Ausführungsformen der Erfindung
Vorzugsweise ist die durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesene Erkrankung eine neurologische, demenzielle Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, wie z.B. Morbus Alzheimer. Bislang konnte die Veränderung der Konzentration von erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente am Beispiel von Patienten, die an Morbus Alzheimer erkrankt waren, nachgewiesen werden. Hieraus kann geschlossen werden, dass die erfindungsgemäßen proSAAS-Peptide auch zum labordiagnostischen Nachweis und zur Therapie von Morbus Alzheimer und verwandten neurologischen Erkrankungen herangezogen werden können. Eine Ausführungsform dieses Verfahrens ist die Ermittlung neurologischer Erkrankungen bereits zu einem frühen Zeitpunkt, wie z.B. der labordiagnostische Nachweis von „Mild Cognitive Impairment" (MCI).
Die Identifizierung konzentriert sich vorzugsweise auf bestimmte Fragmente von proSAAS mit der SwissProt („Swiss Institute of Bioinformatics", Basel,
Schweiz) Nummer Q9UHG2 ( = Seq. ID 28), dass heißt auf Peptide, die Teilsequenzen von proSAAS darstellen und auf das komplette proSAAS-Protein ( = proSAAS). Die entsprechende Nukleinsäuresequenz von proSAAS ist unter der Nummer AF181562 ( = Seq. ID 36) in der Datenbank des „National Center for Biotechnology Information „ (NCBI), Bethesda, MD, USA zu finden. Der Zusammenhang zwischen proSAAS und proSAAS-Fragmenten ist in Abbildung 1 dargestellt. Die Sequenzen von beispielhaften proSAAS-Fragmenten sind im Sequenzprotokoll angegeben. Das von uns bestimmte proSAAS-Fragment mit den Seq.-ID 1 entsteht auf natürliche Weise in der Natur und wurde bisher in der Literatur nicht beschrieben. Dieses proSAAS-Fragment ist verschieden zu
Proteinfragmenten, wie sie in der Literatur durch In-vitro-Proteolyse nach Zugabe von Proteasen wie z.B. Trypsin oft beschrieben werden. Es stellt somit einen neuen, auf natürliche Weise in der Natur entstandenen, bisher unbekannten Stoff dar. Dieses proSAAS-Fragment ist ein nicht vom Menschen durch Manipulation von proSAAS hergestellter Stoff. Es wurde zunächst über Reverse-Phase-Chromatographie aus biologischen Proben angereichert und gereinigt und anschließend massenspektrometrisch von begleitenden anderen Stoffen getrennt, so dass es anschließend quantifiziert und sequenziert werden konnte. Dieses Peptid stellt nicht ein beliebiges Fragment des proSAAS dar, sondern ist ein Fragment des proSAAS, das auf natürliche Weise entstanden ist. Unter dem Begriff „auf natürliche Weise entstanden" wird im Rahmen dieser Anmeldung verstanden, dass die proSAAS-Fragmente ohne Zugabe von Proteasen zu den Proben entstanden sind. Das heißt, sie entstehen entweder schon in vivo, oder sie entstehen im Verlauf der Gewinnung und Untersuchung der Proben, jedoch ohne dass der Probe z.B. Proteasen wie Trypsin zugesetzt werden. ProSAAS-Fragmente leiten sich von der eingangs genannten proSAAS- Sequenz Q9UHG2 (Seq.-ID 28) ab. Alternativ können sie jedoch auch von anderen Datenbank-Einträgen für proSAAS abgeleitet werden. Dabei ist es möglich, dass sich die proSAAS-Aminosäure- oder Nukleinsäure-Sequenzen eventuell von der Aminosäure-Sequenz des „SwissProf'-Eintrags mit der Nummer Q9UHG2 oder des NCBI-Eintrags der Nukleinsäure-Sequenz mit der
Nummer AF181562 unterscheiden. Außerdem können proSAAS-Fragmente ein oder zwei punktmutierte, deletierte oder zusätzlich intern eingefügte Aminosäuren, sowie N-terminale und/oder C-terminale Verlängerungen beinhalten. Dabei müssen sie jedoch mindestens 8 Aminosäuren aus der proSAAS-Aminosäuresequenz beibehalten. Ausnahmen hiervon stellen die Peptide mit der Sequenz Ala-Arg-Pro-Val-Lys-Glu-Pro (KEP-Peptid) und mit der Sequenz Leu-Leu-Arg-Val-Lys-Arg (beschrieben von Apatalina et al. [12]) dar, die nur sieben, bzw. sechs Aminosäuren lang sind, sowie die weiteren in der Tabelle 1 genannten Peptide, die weniger als 8 Aminosäuren umfassen. Als N- oder C-terminale Verlängerung von proSAAS-Fragmenten, die mit r-Resten in
Tabelle 1 oder in Abb. 1 markiert sind kommen für den r-Rest nur solche Aminosäuren in Frage, die in der proSAAS-Aminosäuresequenz an dieser Sequenzposition vorkommen. Zur Bestimmung, ob mindestens 8 Aminosäuren mit der proSAAS-Aminosäuresequenz übereinstimmen, werden die im vorstehenden Absatz „Homologie von Sequenzen" beschriebenen Verfahren angewendet, um Sequenz-Alignments herzustellen. Neben dem KEP-Peptid sind eine Reihe weiterer, definierter in der Natur „auf natürliche Weise entstandene" proSAAS-Fragmente in der Literatur beschrieben. Zu diesen gehören unter anderem die proSAAS-Fragmente big SAAS, little SAAS, big PEN-LEN, little PEN-LEN, PEN, big LEN und little LEN. Viele dieser Peptide entstehen aus proSAAS durch Spaltung von proSAAS an di-basischen Aminsäuresequenzen, die z.B. von Prohormonkonvertasen wie PC1 , PC2, PC5, PC7, P ACE4 oder Furin erkannt und geschnitten werden. Diese Proteasen schneiden in der Regel direkt C-terminal an der di-basischen Sequenzposition. Anschließend werden in der Regel die C-terminal vorhandenen basischen Aminosäuren (Arginin und/oder Lysin) durch Endoproteasen wie z.B. Carboxypeptidase E oder Carboxypeptidase D entfernt. Daher ist davon auszugehen, dass alle proSAAS- Fragmente mit C-terminalen basischen Aminosäuren, ohne C-terminale basische Aminosäuren , oder mit einzelnen dieser C-terminalen basischen Aminosäuren vorkommen, auch wenn bisher noch nicht alle dieser proSAAS-Fragmente konkret identifiziert wurden. Bei der Benennung von Sequenzpositionen in der vorliegenden Patentanmeldung wird die Zählung der Aminosäuren immer ausgehend von der proSAAS-Aminosäuresequenz mit der Signalsequenz, also beginnend mit dem N-terminalen Methionin, begonnen. Das gesamte proSAAS einschließlich der Signalsequenz hat demnach 260 Aminosäuren. Dieses trifft auf proSAAS von Mensch, Maus und Ratte zu. In der Literatur sind verschiedene von proSAAS abstammende proSAAS-Fragmente beschrieben, die u.a. durch Prohormonkonvertasen wie PC2 oder Furin entstehen [10, 1 1 ]. Konkret sind Fragmente mit den Aminosäuren 1 -33 (Signalsequenz), 34-40 (KEP), 42-59 (little SAAS), 34-59 (big SAAS), 221 -242 (PEN), 245-260 (big LEN), 245-254 (little LEN), 221 -260 (big PEN-LEN), 221 -254 (little PEN-LEN), 34-260, 34-232, 34-174 (murines proSAAS; beschrieben in [1 1 ]), 34-61 , 62- 220, 34-220, 34-244, 34-260 (murines proSAAS; beschrieben in [10]), 239- 244 (Maus/Ratte/Mensch proSAAS; beschrieben in [12]), 246-260, 40-59, 186-218, 221 -239 (PEN-19), 221 -240 (PEN-20), (Maus/Ratte proSAAS; beschrieben in [7]), sowie die Fragmente 66-77, 42-57, 91 -104, 105-1 1 1 , 78- 90, 221 -241 , 245-255, 202-216, 60-70, 105-120, 121 -138, 136-152, 153- 173, 174-186, 187-200 und 235-246, beschrieben in (US 2004/0002460 A1 )und 221 -238 (ein neues, erstmals in dieser Patentanmeldung beschriebenes, proSAAS-Fragment) in der Literatur und in dem vorliegenden Patent beschrieben. Außerdem haben Sayah et al. mit In-vitro-Experimenten unter Verwendung von rekombinantem proSAAS und rekombinantem Furin oder Prohormonkonvertase 2 eine zusätzliche Schnittstelle zwischen Aminosäure 90 und 91 ermittelt [10]. Daraus ergeben sich zumindest 2 weitere proSAAS- Fragmente die vermutlich den proSAAS-Fragmenten 62-90 und 91 -220 entsprechen.
Die Sequenzen der SAAS-Peptide im Einbuchstaben-Aminosäurecode sind wie folgt:
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* Die Massen sind als monoisotopische, theoretische Massen berechnet und angegeben.
** Dieses Peptid ist in Form von zwei verschiedene Varianten identifiziert worden. Eine Variante ist das nicht modifizierte Peptid, während die andere Variante an Position 231 anstatt eines Prolinrestes einen Hydroxyprolinrest aufweist und zusätzlich an Position 233 als Natrium-Addukt vorliegt.
-:;-«--;:- pas Symbol > (größer gleich) zeigt an, dass die Masse dieses Peptids mindestens dem angegebenen Wert aufweist, aber auch größer sein kann.
**** r1 repräsentiert eine Sequenz, die der Sequenz oder Teilen der Sequenz der humanen proSAAS-Aminosäuresequenz (Seq.-ID 28) von Aminosäure 221 bis 225 entspricht, wobei r1 , ausgehend von Aminosäure 226 zwischen 0 und 5 Aminosäuren lang sein kann. Entsprechend stellt r2 die proSAAS- Aminosäuresequenz (Seq.-ID 28) von Aminosäure 234 bis 238 oder Teile davon dar, wobei r2, angefügt an Aminosäure 233 zwischen O und 5 Aminosäuren lang sein kann. Alle weiteren Aminosäuresequenzen r3 bis r16 sind entsprechend aufgebaut, wobei r3 maximal den Aminosäuren von 221 -243, r4 maximal den Aminosäuren von 252-260, r5 maximal von 221 -233, r6 maximal von 244-260, r7 maximal von 35-28, rδ maximal den Aminosäuren von 47-59, r9 maximal 62-72, r10 maximal den Aminosäuren von 81 -220, r1 1 maximal den Aminosäuren von 62-99, r12 maximal den Aminosäuren von 108-220, r13 maximal den Aminosäuren von 62-150, r14 maximal den Aminosäuren von 159-220, r1 5 maximal den Aminosäuren von 62-197 und r16 maximal den Aminosäuren 206-220 von humanem proSAAS entspricht.
Geeignete Peptide
Die Peptide können in posttranslationalen oder chemischen Modifikationsformen vorliegen, was sich u.a. auf ihre Massen und damit die massenspektrometrische Identifizierung und auch auf das Elutionsverhalten bei der Chromatographie, wie z.B. bei Reverse-Phase-Chromatographie auswirkt. Insbesondere können die Peptide mit Hydroxyprolin, phosphoryliert, sulfatiert, N-glykosiliert, O- glykosiliert, mit N-terminaler Pyroglutamat-Modifizierung oder oxidiert usw. in der zu untersuchenden Probe vorliegen. Es ist davon auszugehen, dass die Konzentrationsverminderung der proSAAS- Peptide (proSAAS, proSAAS-Fragmente) mit dem Schweregrad der Erkrankung, der Prognose und dem Stadium der neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, insbesondere Morbus Alzheimer, korrelieren. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher die Bestimmung der proSAAS-Peptide auch zur Ermittlung des Schweregrades, der Prognose und zur Bestimmung des Stadiums der Erkrankung heranzuziehen, insbesondere als Ersatz oder als Ergänzung zur Durchführung einer "Mini-Mental State Examination" oder anderer neuropsychologischer Untersuchungen. In Weiterbildung der Erfindung ist außerdem vorgesehen, die Bestimmung der proSAAS-Peptide zur Ermittlung von Vorstufen neurologischer Erkrankungen, insbesondere von "Mild Cognitive Impairment" (MCI), oder zur Prognose des Verlaufs der Erkrankung heran zu ziehen.
Bei den eventuell verwendeten Kontrollproben kann es sich um eine Poolprobe aus verschiedenen Kontrollen handeln. Auch die zu untersuchende Probe kann eine Poolprobe sein, wobei bei positivem Ergebnis Einzeluntersuchungen angestellt werden.
Bei der Verminderung der Konzentration an proSAAS-Peptiden ist zumindest ein proSAAS-Peptid in seiner Konzentration, relativ zur Konzentration des selben proSAAS-Peptids in einer Kontrollprobe einer nicht an einer neurologischen, demenziellen Erkrankung leidenden Person vermindert, vorzugsweise um zumindest 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, zumindest um 90 %, weiter vorzugsweise um bis zu 100 % reduziert.
Geeignete biologische Proben
Die biologische Probe kann vorzugsweise (humaner) Liquor cerebrospinalis (Cerebrospinalflüssigkeit, CSF) sein oder eine Probe wie Serum, Plasma,
Vollblut, Urin, Lymphe, Zellen, Gewebeproben, Stuhl, Tränenflüssigkeit, Sputum, Salvia, Synovialflüssigkeit usw. Serum, Plasma, Vollblut, Urin, Stuhl, Tränenflüssigkeit und Saliva sind insbesondere daher von Interesse, da dieses Probenmaterial bei Standarduntersuchungen häufig und ohne großen Aufwand von Patienten gewonnen wird. Insbesondere flüssige biologische Proben sind geeignet.
Auch homogenisierte Gewebeproben, gewonnen z.B. aus Biopsiepräparaten, können verwendet werden. Daher ist in einer weiteren Ausführungsform dieser Erfindung vorgesehen, dass zur Vorbereitung der zu untersuchenden Probe Gewebehomogenate hergestellt werden, z.B. aus menschlichen Gewebeproben, die im Rahmen von Biopsien erhalten wurden. Diese Gewebe können z.B. mit manuellen Homogenisatoren, mit Ultraschall-Homogenisatoren oder mit elektrisch betriebenen Homogenisatoren wie z.B. Ultraturrax zerkleinert werden, und anschließend in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise in sauren, wässrigen Lösungen mit z.B. 0,1 bis 0,2 M Essigsäure für 10 Minuten gekocht werden. Anschließend werden die Extrakte dem jeweiligen labordiagnostischen Nachweisverfahren, z.B. einer massenspektrometrischen Untersuchung, unterzogen. Die Proben können in der üblichen Weise vorbereitet, z.B. gegebenenfalls verdünnt oder aufkonzentriert, und gelagert werden.
Verwendung von proSAAS und -proSAAS-Fragmenten zur Herstellung von
Diagnostika
Weiterhin umfasst die Erfindung die Verwendung wenigstens eines proSAAS-
Peptids zur Diagnose von neurologischen, demenziellen Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergehen, insbesondere von Morbus Alzheimer, sowie die Verwendung von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten zur Gewinnung von Antikörpern oder von anderen Bindern, welche aufgrund ihrer spezifischen Bindungseigenschaften zur Entwicklung von Diagnosereagenzien zum labordiagnostischen Nachweis dieser Erkrankungen geeignet sind. Labordiagnostische Nachweismethoden für proSAAS oder -proSAAS- Fragmente
Im Rahmen der Erfindung können verschiedene Methoden zum labordiagnostischen Nachweis von proSAAS oder proSAAS-Fragmenten verwendet werden. Dazu sind alle Methoden geeignet, die es ermöglichen, diese Stoffe spezifisch in einer Probe eines Patienten nachzuweisen. Geeignete Methoden sind unter anderem physikalische Methoden wie z.B. Massenspektrometrie oder Flüssigkeitschromatographie, molekularbiologische Methoden wie z.B. Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) oder immunologische Nachweistechniken, wie z.B. „Enzyme-Iinked immunosorbent assays" (ELISA).
Physikalische Nachweismethoden
Eine Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung physikalischer Methoden, welche die erfindungsgemäßen Stoffe qualitativ oder quantitativ anzeigen können. Zu diesen Methoden gehören unter anderem Methoden wie Flüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie, Circulardichroismus (Circular dicroism, CD spectroscopy), Bio-Chip-Technologien oder verwandte Technologien, bei denen Stoffe auf Oberflächen detektiert werden unter Verwendung von Nukleinsäuren, Proteinen, Antikörpern usw., z.B. „Surface Enhanced Laser Dsorption/Ionisation" (SELDI)-Assays, Ciphergen Biosystems, Inc., Fremont, CA, USA [20] oder „Fiber-Optic Nucleic Acid" (FONA)-Assays, Virtek Vision International, Waterloo, Ontario, Kanada (US 650371 1 ) usw. sowie zahlreiche verschiedene spektrometrische Methoden, die z.B. mit elektromagnetischer Strahlung in verschieden Wellenlängenbereichen arbeiten (z.B. Wellenlängen von 1 nm bis 1 m). Zu diesen Methoden zählen z.B. Atomspektrometrie, Chemolumineszenzspektrometrie, Elektronenspektrometrie, Röntgenspektrometrie, Infrarotspektrometrie, Fourier Transform IR- Spektrometrie, Ramanspektrometrie, Laserspektrometrie, Lochbrenn- spektrometrie, Lumineszenzspektrometrie, Plasmaspektrometrie, Magnetische Resonanzspektrometrie (NMR), Massenspektrometrie, Mikrowellen- spektrometrie, Mössbauerspektrometrie, Fluoreszenzspektrometrie, UV/Visible- Spektrometrie, usw. Dabei werden quantitative Messergebnisse aus einer zu untersuchenden Probe mit den Messwerten, die bei einem Kollektiv an neurologischen, demenziellen Erkrankungen, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergehen, vorzugsweise Morbus Alzheimer, leidenden Patienten und einem Kontrollkollektiv gewonnen wurden, verglichen. Aus diesen Ergebnissen kann das Vorliegen dieser Erkrankung und/oder ihr Schweregrad und/oder eine Prognose für diese Erkrankung abgeleitet werden.
Gemäß bevorzugter Ausführungsform dieser Erfindung werden die Stoffe in der Probe vor der Identifizierung chromatographisch getrennt, und zwar vorzugsweise mit Reverse-Phase-Chromatographie, besonders bevorzugt ist eine Trennung der Peptide in der Probe mit hochauflösender Reverse-Phase- High-Performance-Flüssigchromatografie (RP-HPLC). Eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung ist die Durchführung von Fällungsreaktionen zur Fraktionierung der Probe unter Verwendung von Fällungsmitteln wie z.B. Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol, Trichloressigsäure, Aceton, Ethanol usw. Auch andere Fällungsmethoden, wie z.B. Immunpräzipitationen mit Antikörpern oder Fällungsreaktionen ausgelöst durch z.B. Änderung physikalischer Faktoren wie Temperatur (Hitzefällung) können verwendet werden. Die so gewonnenen Fraktionen werden dann einzeln oder in Gruppen dem jeweiligen Nachweisverfahren unterzogen, z.B. der massenspektrometrischen Untersuchung. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung von Extraktionsmethoden, wie z.B. Flüssigkeitsphasenextraktion. Dazu wird die Probe z.B. mit einem Gemisch aus einem organischen Lösungsmittel wie etwa Polyethylenglykol (PEG) und einer wässrigen Salzlösung gemischt. Aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften reichern sich dann bestimmte Inhaltsstoffe der Probe in der organischen und andere in der wässrigen Phase an und können so voneinander getrennt und anschließend weiter analysiert werden. Reverse-Phase-Chromatographie
Eine besonders bevorzugte Ausführungsform dieser Erfindung umfasst die Verwendung von Reverse-Phase-Chromatographie, insbesondere einer C18- Reverse-Phase-Chromatographiesäule unter Verwendung von Laufmitteln bestehend aus Trifluoressigsäure und Acetonitril, zur Trennung von Stoffen in humaner Liquorflüssigkeit. Es werden z.B. jeweils Fraktionen gesammelt, die je 1/96 des verwendeten Volumens an Laufmittel beinhalten.
Massenspektrometrie Die bei der Chromatographie gewonnenen Fraktionen werden mit Hilfe eines Massenspektrometers, vorzugsweise mit Hilfe eines MALDI- Massenspektrometers (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation) unter Verwendung einer Matrixlösung, bestehend aus z.B. aus L(-) Fucose und alpha- Cyano-4-hydroxyzimtsäure, gelöst in einem Gemisch aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Aceton, analysiert und so das Vorliegen bestimmter Massen festgestellt und die Signalintensität quantifiziert. Diese Massen entsprechen den Massen von proSAAS und proSAAS-Fragmenten. Gemäß weiterer bevorzugter Ausführungsformen der Erfindung kann die Identifizierung des oder der Stoffe mit Hilfe einer massenspektrometrischen Bestimmung wie z.B. einer MALDI-TOF (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-and-lonisation-Time- Of-Flight) -Massenspektrometrie oder einer ESI (Elektro-Spray-Ionisation) -Massenspektrometrie vorgenommen werden. Dabei umfasst die massenspektrometrische Bestimmung vorzugsweise wenigstens eines der folgenden Massensignale, jeweils berechnet anhand der theoretischen monoisotopischen Masse des entsprechenden proSAAS-Peptids. Dabei können Abweichungen von der theoretischen, monoisotopischen Masse aufgrund einer geringen Messungsungenauigkeit des Massenspektrometers von maximal 500 ppm und der natürlichen Isotopenverteilung auftreten. Außerdem wird bei MALDI-Massenbestimmungen aufgrund der Messmethodik den Proteinen und Proteinfragmenten ein Proton hinzugefügt, wodurch sich die Masse um 1 Da erhöht. Folgende Massenangaben entsprechen den theoretischen monoisotopischen Massen der von uns identifizierten Stoffe, sowie von proSAAS und weiteren proSAAS-Fragmenten, die mit dieser Methodik bestimmt werden können. Die Massen wurden berechnet mit geeigneter Software, hier GPMAW 4.02, Lighthouse data, Odense, Dänemark. Die folgenden theoretischen, monoisotopischen Massen können einzeln, oder in Kombinationen in einer Probe auftreten: Seq.-ID 1 = 1732,8 oder 1770,8 (mit Hydroxyprolin und Natrium-Addukt) / Seq.-ID 2 > 826,4 / Seq.-ID 3 > 910,5 / Seq.-ID 4 > 1024,7/ Seq.-ID 5 > 799,4/ Seq.-ID 6 > 870,5 / Seq.-ID 7 > 899,5 / Seq.-ID 8 > 765,4 / Seq.-ID 9 > 81 1 ,5 / Seq.-ID 10 = 4234,4 / Seq.-ID 1 1 = 3501 ,9 / Seq.-ID 12 = 2214,2 / Seq.-ID 13 = 1959,0 / Seq.-ID 14 = 1845,9 / Seq.-ID 15 = 783,5 / Seq.-ID 16 = 1 123,8 / Seq.-ID 17 = 1754,0 / Seq.-ID 18 = 1640,9 / Seq.-ID 19 = 1021 ,5 / Seq.-ID 20 = 3548,9 / Seq.-ID 21 = 3352,9 / Seq.-ID 22 = 3042,7 / Seq.-ID 23 = 2730,5 / Seq.-ID 24 = 795,5 / Seq.-ID 25 = 2050,1 / Seq.-ID 26 = 1797,0 / Seq.-ID 27 = 3126,7 / Seq.-ID 28 = 27354,8 / Seq.-ID 29 = 24019,9 / Seq.-ID 30 = 22283,9 / Seq.-ID 31 = 20992,0 / Seq.-ID 32 = 19803,5 / Seq.-ID 33 = 14951 ,0 / Seq.-ID 34 = 16778,8 / Seq.-ID 35 = 13670,2 / Seq.-ID 37 = 1 170,6 / Seq.-ID 38 = 1493,8 / Seq.-ID 39 = 1571 ,7 / Seq.-ID 40 = 81 1 ,5 / Seq.-ID 41 = 1534,8 / Seq.-ID 42 = 21 15,1 / Seq.-ID 43 = 1 177,6 / Seq.-ID 44 = 1412,7 / Seq.-ID 45 = 1 154,6 / Seq.-ID 46 = 1794,0 / Seq.-ID 47 = 1804,9 / Seq.-ID 48 = 1761 ,1 / Seq.-ID 49 = 2241 ,2 / Seq.-ID 50 = 1213,5/ Seq.-ID 51 = 1756,0 und Seq.-ID 52 = 1365,9 Dalton. Liegen die proSAAS-Peptide in Form von in der Natur vorkommenden Derivaten vor, so verändert sich ihre Masse entsprechend und es wird die entsprechend veränderte Masse zum Nachweis verwendet.
Das Symbol > (ist größer oder gleich) ist bei den Massen-Angaben so zu verstehen, dass nicht beliebig größere Massen für die betroffenen proSAAS- Fragmente möglich sind, sondern lediglich die Massen, die sich aufgrund der r- Reste möglicherweise zusätzlich an den Enden dieser Fragmente befindlichen Aminosäuren ergeben. An den Enden dieser Stoffe können nicht beliebige Aminosäuren zusätzlich vorhanden sein, sondern nur solche, die sich aufgrund der Sequenz von proSAAS an dieser Sequenzposition befinden können (Abbildung 1 ). Zusätzlich konnte das proSAAS-Fragment mit der Seq.-ID 1 (Masse = 1732,8 Dalton) in Form eines Derivats, bei der der Prolinrest an Position 231 durch einen Hydroxyprolinrest ersetzt ist und bei dem an Position 233 ein Natrium-Addukt vorliegt, identifiziert werden (experimentell bestimmte Masse: 1770 Dalton). Es ist möglich, dass dieses proSAAS-Fragment mit nur einer der beiden genannten Modifizierungen vorhanden ist oder proSAAS- Fragmente auch in Form von anderen Derivaten vorkommen und daher mit jeweils entsprechend veränderten Massen bestimmt werden können.
Massenspektrometrische Bestimmung der Seguenz der Stoffe Bei der weiteren praktischen Anwendung dieser Ausführungsform ist eine weitere Absicherung des Nachweisergebnisses dadurch möglich und empfehlenswert, dass die Identität der den Massen entsprechenden Stoffe ermittelt wird, wobei ausschließlich Signale berücksichtigt werden, die von proSAAS oder -proSAAS-Fragmenten abgeleitet werden können. Diese Absicherung erfolgt über eine Identifizierung der Peptidsignale vorzugsweise mit massenspektrometrischen Verfahren, z.B. einer MS/MS-Analyse [21].
Es wurden, spezifische von proSAAS abgeleitete proSAAS-Fragmente identifiziert und in ihrer Bedeutung erkannt. Sequenzen von Stoffen die diesem Verfahren zugänglich sind, sind im Sequenzprotokoll angegeben (Seq.-ID 1 bis 35 und Seq.-ID 37 bis 52). Einige der proSAAS-Fragmente stellen neue, bisher nicht beschriebene Stoffe dar (Seq.-ID 1 bis 9). Die proSAAS-Fragmente entsprechend Seq.-ID 2 bis 9 können am N- und/oder C-Terminus zusätzliche Aminosäuren entsprechend der korrespondierenden Sequenz von proSAAS beinhalten. Seq.-ID 1 wurde in Form von zwei verschiedenen Varianten aufgefunden, die beide neue, bisher nicht bekannte Stoffe darstellen. Die proSAAS-Fragmente, die bisher schon bekannt waren, entsprechen den Seq.- IDs 10 bis 35 und Seq.-ID 37 bis 52. Die Erfindung umfasst auch rekombinant, (
- 36 - enzymatisch oder synthetisch hergestelltes, sowie aus biologischen Proben isolierten proSAAS und -proSAAS-Fragmente sowie entsprechende Derivate.
Molekularbioloqische Nachweistechniken Schließlich umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuren, die für proSAAS oder proSAAS-Fragmente kodieren, sowie die entsprechenden komplementären Sequenzen, zur indirekten Bestimmung und Quantifizierung der zugehörigen proSAAS-Peptide einschließlich entsprechender Derivate. Darin eingeschlossen sind auch Nukleinsäuren, die z.B. nicht codierende Sequenzen, wie etwa 5'- oder 3'-untranslatierte Bereiche der proSAAS mRNA darstellen, und Nukleinsäuren, die eine für spezifische Hybridisierungs- oder PCR-Experimente ausreichende Sequenzübereinstimmung mit einer Nukleinsäuresequenz von proSAAS oder Teilen der Nukleinsäuresequenz von proSAAS aufweisen, und die daher zum indirekten Nachweis der zugehörigen Stoffe geeignet sind.
Ein Ausführungsbeispiel hierfür umfasst die Gewinnung von Gewebeproben, z.B. von Biopsiepräparaten, von Patienten und die nachfolgende Bestimmung der Konzentration einer proSAAS-RNA, die mindestens 70 % Homologie zu AF181562 (= Seq.-ID 26) aufweisen. Dabei werden quantitative Messergebnisse (Intensitäten) aus einer zu untersuchenden Probe mit den
Messwerten, die bei einem Kollektiv von Morbus-Alzheimer-Patienten und einem Kontrollkollektiv gewonnen wurden, verglichen. Zur Quantifizierung können Methoden wie z.B. Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), quantitative Echtzeit-PCR (ABI PRISM® 7700 Sequence Detection System, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), DNA-Chips z.B. erhältlich von Affimetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA, In-situ-Hybridisierungen, Northernblots usw., sowie weitere dem Fachmann bekannte Methoden angewendet werden.
Viele molekularbiologische Nachweismethoden funktionieren über Hybridisierungen von Nukleinsäuren. Um eine spezifische Hybridisierung zu erreichen wird vorzugsweise eine Hybridisierung unter stringenten Bedingungen durchgeführt. Beispiele für stringente Hybridisierungsbedingungen können im dem Stand der Technik gefunden werden. Zum Beispiel kann eine stringente Hybridisierung bei 65 °C in einem Puffer enthaltend 3,5x SSC, 0,02 % Vicoll, 0,02 % Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % Rinderserumalbumin in 2,5 mM NaH2PO4, pH 7,0, 0,5 % Natrimudodecylsulfat (SDS), 2 mM Ethylen-Diamin-Tetra- Essigsäure (EDTA) durchgeführt werden. SSC besteht aus 150 mM NaCI und 150 mM Natrimucitrat, pH 7,0. Nach der Hybridisierung wird die Membran bei Raumtemperatur in 2x SSC und in 0,1 -0,5x SSC mit 0,1 % SDS bei Temperaturen bis zu 68 °C gewaschen. Eins spezifische Hybridisierung erfordert, das zumindest 40 %, vorzugsweise 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 99 % der hybridisierenden Sequenzen komplementär zueinander sind. Es ist nicht notwendig, dass die gesamten Nukleinsäuresequenzen miteinander hybridisieren, solange die Duplex-Nukleinsäure unter den stringenten Versuchsbedingungen stabil ist. Weitere Protokolle für stringente Hybridisierungen, auch für spezielle Arten von Versuchen wie z.B. DNA-Chip Tests sind dem Fachmann bekannt.
Aus den Ergebnissen kann das Vorliegen einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, vorzugsweise Morbus Alzheimer und/oder deren Schweregrad und/oder eine Prognose des Auftretens der Erkrankung abgeleitet werden.
Immunologische Nachweismethoden
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die labordiagnostische Bestimmung von proSAAS und proSAAS-Fragmenten unter Verwendung eines immunologischen Nachweissystems, vorzugsweise eines ELISAs ("Enzyme-Iinked immunosorbent assay") durchgeführt werden. Dabei erfasst dieser immunologische Nachweis wenigstens ein proSAAS oder proSAAS-Fragment. Zur Erhöhung der Spezifität kann weiterhin bevorzugt ein sogenannter "Sandwich-ELISA" verwendet werden, bei dem der Nachweis von der Spezifität von zwei Antikörpern, die unterschiedliche Epitope innerhalb des selben Moleküls erkennen, abhängig ist. Zum labordiagnostischen Nachweis dieser Stoffe können jedoch auch andere ELISA-Systeme, z.B. direkte oder kompetitive ELISA Verwendung finden. Auch weitere, ELISA-ähnliche Nachweistechniken, wie z.B. RIA ("radio immuno assay"), EIA ("enzyme immuno assay"), ELI-Spot („Enzyme Linked Immuno-Spot") usw. sind geeignet als immunologische Nachweissysteme. Als Standard für die Quantifizierung kann aus biologischen Proben isoliertes, rekombinantes oder enzymatisch hergestelltes oder chemisch synthetisiertes proSAAS oder proSAAS-Fragmente verwendet werden. Die Bestimmung dieser Stoffe kann z.B. allgemein mit Hilfe eines auf die jeweiligen Stoffe gerichteten, spezifischen Antikörpers, erfolgen. Weitere für solche labordiagnostischen Nachweise geeignete Methoden sind unter anderem Westemblotting, Immunpräzipitationen, Dot-Blots, Plasmonresonanzspektrometrie (BIACORE®-Technologie, Biacore International AB, Uppsala, Schweden), Affinitätsmatrizen (z.B. ABICAP-Technologie, ABION Gesellschaft für Biowissenschaften und Technik mbH, Jülich, Deutschland), Protein-Chips z.B. erhältlich von Affimetrix, Inc., Santa Clara, CA, USA, usw. Generell sind alle Substanzen/Moleküle (Binder) als Nachweisagenzien geeignet, die es erlauben, ein spezifisches labordiagnostisches Nachweissystem aufzubauen, da sie spezifisch an proSAAS oder -proSAAS-Fragmente binden. Zahlreiche dem Fachmann bekannte, hier nicht ausdrücklich genannte immunologische Nachweismethoden sind dazu ebenfalls geeignet.
Gewinnung von proSAAS und -proSAAS-Fragmenten
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Gewinnung von proSAAS und -proSAAS-Fragmenten unter Verwendung von rekombinanten Expressionssystemen, In-vitro-Translation, Chromatographiemethoden und chemischen Syntheseprotokollen, usw., die dem Fachmann bekannt sind. Diese Stoffe können aus natürlichen biologischen Proben oder aus rekombinanten Expressionssystemen z.B. unter Verwendung von Reverse-Phase- Chromatographie, Affinitätschromatographie, lonenaustauschchromatographie, Gelfiltration, isoelektrischer Fokussierung, präparativer Immunpräzipitation, Ammoniumsulfatfällung, Extraktion mit organischen Lösungsmitteln usw. sowie mit weiteren dem Fachmann bekannten Methoden gewonnen werden. Die so erhaltenen Stoffe können unter anderem als Therapeutikum zur Behandlung von neurologischen Erkrankungen, insbesondere von Morbus Alzheimer, als Standards zur Quantifizierung der jeweiligen Stoffe oder als Antigen zur Herstellung von Antikörpern gegen diese Stoffe verwendet werden. ProSAAS oder proSAAS-Fragmente können C- oder N-terminal mit heterologen Sequenzen von fremden Peptiden wie z.B. Poly-Histidinsequenzen (His-tag), Hemagglutinin- Epitopen (HA-tag), HIV-Tat-Sequenzen, Antennapedia-Sequenzen, VP22- Sequenzen oder Proteinen wie z.B. Maltose-bindenden Proteinen, Glutathion-S- Transferase (GST), „Green Fluorescent Protein" (GFP), oder Proteindomänen wie der GAL4-DNA-Bindungsdomäne oder der GAL4-Aktivierungsdomäne fusioniert sein. Diese zusätzlichen Bestandteile von proSAAS und proSAAS- Fragmenten können z.B. dazu genutzt werden, um proSAAS oder proSAAS- Fragmente besser isolieren zu können (His-tag, HA-tag, Glutathion-S- Transferase), um sie besser labordiagnostisch nachweisen zu können (His-tag, HA-tag, GFP), um mit Ihnen das Auffinden von Bindungspartnern zu ermöglichen z.B. „yeast two-hybrid" System (GAL4-Domähnen), um die Aufnahme dieser Stoffe durch Zellen zu fördern (HIV-Tat, Antennapedia, VP22), USW.
Verwendung und Gewinnung von anti-proSAAS Antikörpern
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung und
Herstellung von proSAAS oder proSAAS-Fragment-spezifischen Antikörpern, eine insbesondere bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung und Herstellung von spezifischen Antikörpern die neo-Epitope in proSAAS- Fragmenten erkennen, das heißt Epitope, die nur in proSAAS-Fragmenten vorhanden sind, nicht jedoch in proSAAS. Solche Antikörper ermöglichen den spezifischen immunologischen Nachweis von proSAAS-Fragmenten in Gegenwart von proSAAS. Polyklonale Antikörper können durch Immunisierungen von Versuchstieren wie z.B. Mäusen, Ratten, Kaninchen oder Ziegen hergestellt werden. Monoklonale Antikörper können z.B. durch Immunisierungen von Versuchstieren wie z.B. Mäusen oder Ratten und anschließender Anwendung von Hybridomatechniken oder z.B. über rekombinante Versuchsansätze wie z.B. über Antikörperbanken wie die HuCAL® -Antikörperbank der Firma MorphoSys, Martinsried, Deutschland, oder andere dem Fachmann bekannte, rekombinante Herstellungsverfahren gewonnen werden. Diese Antikörper können auch in Form von Antigen-bindenden Antikörperfragmenten Verwendung finden. Beispiele für solche Antikörperfragmente sind Intrabodies, Fab- (fragment, antigen binding-) , Fab2- oder scFv- (single-chain Fv fragment) Fragmente. Die Antikörper können auch als Fusionsproteine, bestehend aus einem oder mehreren Antikörper-Proteinen oder Antikörper-Proteinfragmenten und einem oder mehreren weiteren Proteinen oder Proteinfragmenten, wie z.B. Enzymen wie Peroxidase, alkalische Phosphatase, Luciferase, usw., fluoreszierenden Proteinen wie z.B. „green fluorescent protein" (GFP), usw. rekombinant oder synthetisch hergestellt werden, oder es können chemische Gruppen wie z.B. Biotin, Farbstoffe wie z.B. Digoxigenin, oder Fluorophore wie z.B. Fluorescein, BODIPY usw., radioaktive Nuklide wie Phosphor-32, Phosphor-35, lod-125, usw. angefügt werden. Zahlreiche zur Markierung von Antikörpern und Proteinen geeignete Reagenzien sind dem Fachmann bekannt und unter anderem von der Firma Molecular Probes Europe BV, Leiden, The Netherlands erhältlich.
Therapieentwicklung und Überwachung durch proSAAS- und -proSAAS- Fragment-Bestimmungen Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die quantitative oder qualitative Bestimmung des oben genannten proSAAS oder -von proSAAS-Fragmenten zur Abschätzung der Wirksamkeit einer sich in der Entwicklung befindlichen Therapie gegen neurologische, demenzielle Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer. Die Erfindung kann auch zur Stratifizierung von Teilnehmern klinischer Studien zur Entwicklung von Therapien gegen derartige Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, verwendet werden. Die Wirksamkeitsprüfung und die Auswahl der richtigen Patienten für Therapien und für klinische Studien ist für eine erfolgreiche Entwicklung und Anwendung eines Therapeutikums von herausragender Bedeutung. Bisher steht für Morbus Alzheimer kein klinisch messbarer Parameter zur Verfügung, der dieses zuverlässig ermöglicht [22],
Überprüfung der therapeutischen Wirksamkeit von proSAAS und und von proSAAS-Fragmenten und von Agenzien, die die Expression und die biologische Verfügbarkeit dieser Stoffe modulieren Ein Ausführungsbeispiel hierfür umfasst die Kultivierung lebender Zellen mit proSAAS oder -proSAAS-Fragmenten und Agenzien, die die Expression, Prozessierung oder die biologische Verfügbarkeit dieser Stoffe modulieren. Substanzen, die die Prozessierung fördern, können z.B. Proteasen wie Prohormonkonvertasen sein, die di-basische Sequenzmotive erkennen. Dadurch können biologische Eigenschaften von proSAAS und proSAAS-Fragmenten im Zusammenhang mit neurologischen Erkrankungen, insbesondere Morbus Alzheimer, ermittelt werden. Auch Fusionsmoleküle können zur Untersuchung der Zelllinien verwendet werden, wie z.B. proSAAS-Fusionspeptide die Sequenzen beinhalten, die z.B. den Transport des Fusionspeptids ins Zellinnere fördern. Beispiele für Sequenzen, die dafür verwendet werden können sind z.B.: HIV-Tat-, Antennapedia-, Herpes-Simplex-VP22-Sequenzen usw. Ebenso können Zelllinien mit Expressionsvektoren transfiziert werden, die direkt oder indirekt die Expression von proSAAS oder die Freisetzung von -proSAAS- Fragmenten erhöhen, indem sie z.B. direkt für diese Stoffe kodieren oder indem sie z.B. für Prohormonkonvertasen oder Expressionsfaktorenkodieren. Auch die gleichzeitige Transfektion mit mehreren verschiedenen Expressionsvektoren kann durchgeführt werden. Insbesondere Zelllinien, die als neurologische Modellsysteme im Zusammenhang mit proSAAS als geeignet erscheinen, können zu solchen Untersuchungen herangezogen werden. Als „read-out" Systeme für diese Untersuchungen können unter anderem Tests verwendet werden, die die Proliferationsrate der behandelten Zellen, ihre Stoffwechselaktivität, die Apoptoserate der Zellen, Änderungen der Zellmorphologie, Änderungen in der Expression von zelleigenen Proteinen oder Änderungen der Expression von den Zellen zugefügten Reportergenen usw., messen oder die die Freisetzung von zytosolischen Zellbestandteilen als Marker für Zellsterben ermitteln.
Als weitere Testsysteme können geeignete Stämme von Versuchstieren, z.B. von Mäusen oder Ratten, die als Modell für neurologische Erkrankungen, insbesondere als Modell für Morbus Alzheimer, gelten, verwendet werden. Diese Versuchstiere können zur Untersuchung der Wirksamkeit von Therapiestrategien, die die Erhöhung der Konzentration von proSAAS oder - proSAAS-Fragmenten zum Ziel haben, herangezogen werden. Außerdem kann in geeigneten Versuchstieren, wie z.B. Mäusen, Ratten, Kaninchen, Hunden, Affen usw. die In-vivo-Wirkung dieser Stoffe untersucht werden. Dazu können proSAAS oder proSAAS-Fragmente z.B. durch intravenöse Injektionen, verabreicht werden und ihre Wirkung auf das Versuchstier ermittelt werden, insbesondere wenn es sich um ein Tiermodell für neurologische, demenzielle Erkrankungen handelt.
Messparameter bei Experimenten mit Versuchstieren können z.B. die Überlebensdauer der Tiere, ihr Verhalten, ihre Kurzzeitgedächtnisleistung und ihre Lernfähigkeit sein. Ein Beispiel für einen Gedächtnistest, der für Versuchstiere, wie z.B. Ratten, geeignet ist, ist der "Morris water maze test". Als weitere Parameter können die Bestimmung von Körperfunktion (Temperatur, Atemfrequenz, Herzfrequenz usw.), die Bestimmung von z.B. neurologischen Mediatoren aus z.B. dem Blut, Urin, Gewebeproben oder Liquor, die Messung von Gehirnströmen (EEG), Stoffwechseltests, die Expression von proSAAS oder -von proSAAS-Fragmenten und anderen mit der Erkrankung im Zusammenhang stehenden Stoffen wie Proteinen, Peptiden, „Second-Messengern", Hormonen, Lipiden, Steroiden, usw., sowie morphologische und histologische Untersuchungen an Geweben, wie z.B. dem Gehirn herangezogen werden. Als weitere Möglichkeit zur Untersuchung der Funktion von proSAAS und proSAAS-Fragmenten können mit molekularbiologischen Methoden Versuchstiere erhalten werden, in deren Organismus diese Stoffe nicht produziert werden, oder in verminderter oder erhöhter Menge produziert werden. Dazu kann die Expression sowohl lokal als auch im gesamten Organismus des Versuchstieres gezielt verändert werden. Als Versuchstiere sind unter anderem Caenorhabditis elegans, Drosophila, Zebrafische, Mäuse, Ratten usw. geeignet.
Screeningverfahren
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zum Auffinden von Substanzen, die die Expression, Konzentration oder Aktivität von proSAAS oder -proSAAS-Fragmenten, oder von proSAAS-Agonisten wie z.B. von Proteasen wie z.B. Prohormonkonvertasen oder von Nukleinsäuren, die für diese Stoffe kodieren, modulieren. Insbesondere schließt die Erfindung Verfahren ein, bei denen eine Probe, die proSAAS oder ein proSAAS-Fragment oder eine entsprechende Nukleinsäure enthält, mit einer Testsubstanz in Verbindung gebracht wird. In diesen Verfahren wird dann untersucht, ob die Testsubstanz die Fähigkeit hat, die Expression von proSAAS oder die Generierung von proSAAS-Fragmenten zu modulieren, oder ob die Testsubstanz die Aktivität oder Konzentration von proSAAS oder -proSAAS-Fragmenten beeinflusst.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen näher illustriert. Dabei wird auch Bezug auf die Abbildungen genommen.
Abbildung 1 : Die Sequenz von humanem proSAAS, wobei sowohl neue als auch im Stand der Technik bereits bekannte proSAAS-Fragmente dargestellt sind Abbildung 2: Elutionsprofil einer Reverse-Phase-Chromatographie zur Separation und Anreicherung von proSAAS-Fragmenten aus Liquor cerebrospinalis
Abbildung 3: Massenspektrometrische Messung (MALDI) am Beispiel eines proSAAS-Fragments, das der proSAAS- Aminosäuresequenz von 221 bis 238 entspricht, wobei dieses proSAAS-Fragment in nicht modifizierter Form oder ein Derivat des proSAAS-Fragments bestimmt wird (die Massenangaben sind experimentell ermittelte Werte, nicht monoisotopische, theoretische Massen)
Abbildung 4: MALDI-Massenspektrometrie als relativ quantifizierende massenspektrometrische Methode
Abbildung 5: MS/MS-Fragmentspektrum am Beispiel des proSAAS- Fragments, das der proSAAS-Aminosäuresequenz von 221 bis 238 entspricht, wobei dieses proSAAS-Fragment in nicht modifizierter Form oder ein Derivat des proSAAS-Fragments bestimmt wird
Abbildung 6: „Box-Whisker-Plots" zum quantitativen Vergleich der Konzentrationen des proSAAS-Fragments, das der proSAAS-Aminosäuresequenz von 221 bis 238 entspricht, in Morbus-Alzheimer-Patienten verglichen mit Kontrollpatienten. Bei dem analysierten proSAAS- Fragment befinden sich an Position 231 ein Hydroxyprolinrest und an Position 233 ein Natrium- Addukt Die Abbildung 1 zeigt die humane Sequenz von proSAAS entsprechend der SwissProt Accession No. Q9UHG2 (Seq.-ID 28). Zusätzlich sind die Positionen des von uns neu identifizierten proSAAS-Fragments (Seq.-ID 1 )entsprechend der proSAAS-Aminosäuresequenz 221 -238) sowie die Positionen von acht proSAAS-Fragmenten mit variablen Sequenzlängen in Form von gestrichelten Linien mit einem ,,-r" am Ende eingetragen. Außerdem sind die Sequenzen von einigen der aus der Literatur bereits bekannten proSAAS-Fragmente wie z.B. PEN, LEN, PEN-LEN, usw. eingetragen. Die Signalsequenz ist markiert und di- basische Sequenzpositionen sind unterstrichen.
Die Abbildung 2 zeigt ein Elutionsprofil einer mit Reverse-Phase- Chromatographie gemäß Beispiel 2, zur Separation und Anreicherung der proSAAS-Fragmenten aus Liquor cerebrospinalis analysierten Probe.
Die Abbildung 3 zeigt ein Spektrum, das durch MALDI-massenspektrometrische Messung gemäß Beispiel 3 von proSAAS-Fragmenten entstanden ist, nach erfolgter Reverse-Phase-Chromatographie von humanem Liquor cerebrospinales gemäß Beispiel 2. Das proSAAS-Fragment entspricht der proSAAS-Sequenz von Aminosäure 221 -238. Der Massenpeak von 1733 Dalton entspricht der nicht modifizierten Sequenz, während der Massenpeak von 1772 Dalton einem
Derivat des besagten proSAAS-Fragments entspricht, das einen Hydroxyprolinrest und Natrium-Addukt beinhaltet. Die Massen entsprechen den experimentell bestimmten Massen der beiden Peptide, die von den theoretischen mit GPMAW 4.02 berechneten Massen im Rahmen der Messungenauigkeit von MALDI-Massenspektrometern gringfügig abweichen. 1733 Dalton entspricht der berechneten Masse von 1732,8 Dalton und 1772 Dalton entspricht der berechneten Masse 1770,8 Dalton.
Die Abbildung 4 zeigt durch MALDI-Massenspektrometrie als relativ quantifizierende Massenspektrometrie-Methode erzeugte Daten. Eine Probe wurde mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt und die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch repräsentativer Probensignale ermittelt. Alle Signal-Intensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0,64 μM ( = 1 ) normiert (siehe Pfeil in Abbildung 4). Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typisches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was in diesem Diagramm anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist. MW = relative molekulare Masse.
Die Abbildung 5 zeigt MS/MS-Fragmentspektren gemäß Beispiel 4 des erfindungsgemäßen proSAAS-Fragments entsprechend der Aminosäurensequenz von 221 -238 ohne Modifizierungen (Abbildung 5A und B) und des entsprechenden Derivats des besagten proSAAS-Fragments mit einem Hydroxyprolinrest an Position 231 und einem Natrium-Addukt an Position 233 (Abbildung 5C und D). Abbildung A und C: Rohdaten der Messungen. Abbildung B und D: Konvertierte, dekonvolutierte Massenspektren der proSAAS-Fragmente.
Die Abbildung 6 zeigt „Box-Whisker-Plots" zum quantitativen Vergleich der Konzentrationen des proSAAS-Fragments, das der proSAAS-Sequenz von Aminosäure 221 -238 entspricht, in Morbus-Alzheimer-Patienten verglichen mit
Kontrollpatienten. Es werden Daten gezeigt, die mit dem Derivat des proSAAS- Fragments 221-238 mit einer Hydroxyprolin-Aminosäure an Position 231 und einem Natrium-Addukt an Position 233 erhalten wurden. Die Abbildung zeigt in Form eines „Box-Whisker-Plots" einen Vergleich der integrierten MALDI- massenspektrometrischen Signalintensitäten. Die linke Hälfte von Abbildung 6 A zeigt die Ergebnisse, die beim Vergleich von Morbus-Alzheimer-Proben mit Proben von Patienten mit anderen Demenzen erhalten wurden (aktive Kontrolle). Die rechte Hälfte der Abbildung 6 A zeigt die Ergebnisse, die beim Vergleich von Morbus-Alzheimer-Proben mit Proben von gesunden Personen gleichen Alters erhalten wurden (passive Kontrolle). Abbildung 6 B zeigt die
Peptidsequenz, einschließlich vorhandener Modifizierungen. Beispiel 1 : Gewinnung von Liguor cerebrospinalis zur Bestimmung von proSAAS und proSAAS-Fragmenten
Liquor cerebrospinalis ist die in den vier Hirnventrikeln und im cerebralen und spinalen Subarachnoidalraum enthaltene Flüssigkeit, die vor allem in den Plexus choroidei der Seitenventrikel gebildet wird. Die Entnahme von Liquor cerebrospinalis erfolgt meist durch Lumbaipunktion, seltener durch Subokzipitalpunktion oder Ventrikelpunktion. Bei der Lumbaipunktion (Spinalpunktion) zur Entnahme von Liquor cerebrospinalis wird bei der Punktion der spinale Subarachnoidalraum zwischen dem 3. und 4. oder dem 4. und 5. Lendenwirbeldornfortsatz mit einer langen Hohlnadel punktiert und so Liquor gewonnen. Anschließend wird die Probe 10 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert und der Überstand bei minus 80° C gelagert. Für 279 klinische Proben, d.h. 86 passive Kontrollproben, 66 aktive Kontrollproben und 127 Proben von Patienten, die an Morbus Alzheimer erkrankt sind, wurde eine Probenvorbereitung gemäß Beispiel 1 durchgeführt.
Beispiel 2. Trennung von Peptiden in Liquor cerebrospinalis (CSF) zur massenspektrometrischen Messung von proSAAS-Fragmenten Zum massenspektrometrischen Nachweis von proSAAS-Fragmenten in CSF ist in diesem Beispiel eine Trennung der peptidischen Inhaltsstoffe notwendig. Diese Probenvorbehandlung dient der Anreicherung der erfindungsgemäßen Peptide und zur Abtrennung von Komponenten, die die Messung stören können. Als Trennverfahren wird eine Reverse-Phase-Chromatographie durchgeführt. Hierbei eignen sich verschiedene RP-Chromatographie-Harze und Elutionsmittel gleichermaßen. Im Folgenden ist beispielhaft die Trennung von proSAAS- Fragmenten unter Verwendung einer C18-Reverse-Phase-Chromatographiesäule mit der Größe 4 mm x 250 mm der Firma Vydac dargestellt. Es wurden Laufmittel folgender Zusammensetzung verwendet: Laufmittel A: 0,06 % (v/v) Trifluoressigsäure, Laufmittel B: 0,05 % (v/v) Trifluoressigsäure, 80 % (v/v) Acetonitril. Die Chromatographie erfolgte bei 33 °C unter Verwendung einer HP-ChemStation 1 100 der Firma Agilent Technologies mit einer Flusszelle Micro der Firma Agilent Technologies. Als Probe wurde humaner Liquor cerebrospinalis verwendet. 440 μ\ Liquor wurden mit Wasser auf 1650 μ\ verdünnt, der pH auf 2-3 eingestellt, die Probe für 10 Minuten bei 18000 x g zentrifugiert und schließlich 1500 μ\ der so vorbereiteten Probe auf die Chromatographiesäule aufgetragen. Die Chromatographiebedingungen waren wie folgt: 5 % Laufmittel B zum Zeitpunkt 0 min., vom Zeitpunkt 1 bis 45 min kontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 50 %, von Zeitpunkt 45 bis 49 min kontinuierliche Steigerung der Laufmittel B Konzentration auf 100 % und anschließend bis zum Zeitpunkt 53 min konstant 100 % Puffer B. 10 Minuten nach Beginn der Chromatographie wird mit dem Sammeln von 96 Fraktionen zu je 0,5 ml begonnen. Das Chromatogramm einer Liquor-cerebrospinalis-Probe, hergestellt unter den hier beschriebenen Versuchsbedingungen, ist in Abbildung 2 dargestellt.
Beispiel 3: Ermittlung der Massen von Peptiden mit Hilfe von MALDI-
Massenspektrometrie
Zur Massenanalyse werden typische Positiv-Ionen-Spektren von Peptiden in einem MALDI-TOF-Massenspektrometer (MALDI-TOF = Matrix-Assisted- Laserdesorption-Ionisation-Time-Of-Flight). Geeignete MALDI-TOF-
Massenspektrometer werden von PerSeptive Biosystems Framingham (Voyager- DE, Voyager-DE PRO oder Voyager-DE STR) oder von Bruker Daltonik Bremen (BIFLEX) hergestellt. Zur Präparation der Proben werden diese mit einer Matrixsubstanz vermischt, die typischerweise aus einer organischen Säure besteht. Typische Matrix-Substanzen, die sich für Peptide eignen, sind die 3,5- Dimethoxy-4-hydroxyzimtsäure, die α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und die 2,5- Dihydroxybenzoesäure. Zur Messung der erfindungsgemäßen proSAAS- Fragmente wird ein lyophylisiertes, nach Reverse-Phase-Chromatographie gewonnenes Äquivalent entsprechend 500 μ\ humanem Liquor cerebrospinalis, verwendet. Die chromatographierte Probe wird in 15 μ\ einer Matrix-Lösung gelöst. Diese Matrix-Lösung enthält z.B. 10 g/L α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure und 10 g/L L(-)Fucose gelöst in einem Lösungsmittelgemisch bestehend aus Acetonitril, Wasser, Trifluoressigsäure und Aceton im Volumenverhältnis 49:49:1 : 1. Von dieser Lösung werden 0,3 μ\ auf eine MALDI-Trägerplatte transferiert und die getrocknete Probe im MALDI-Massenspektrometer Voyager- DE STR von PerSeptive Biosystems analysiert. Die Messung erfolgt im "Linear Mode" mit "Delayed Extraction" ™. Ein Beispiel für eine Messung eines der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente (Seq.-ID 1 ) zeigt Abbildung 3. Die MALDI-TOF-Massenspektrometrie kann zur Quantifizierung von Peptiden wie z.B. der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente eingesetzt werden, wenn diese Peptide in einer Konzentration vorliegen, die sich im dynamischen Messbereich des Massenspektrometers befindet, wodurch Detektorsättigung vermieden wird. Dieses ist für die Messung der erfindungsgemäßen proSAAS- Fragmente in Liquor cerebrospinalis bei einer Liquor-Äquivalentkonzentration von 33,3 μl pro μ\ Matrixlösung der Fall. Für jedes Peptid gibt es ein spezifisches Verhältnis zwischen Messsignal und Konzentration, was bedeutet, dass die MALDI-Massenspektrometrie vorzugsweise zur relativen Quantifizierung von Peptiden herangezogen werden kann. Dieser Sachverhalt ist in Abbildung 4 dargestellt. Wird eine Probe mit unterschiedlichen Mengen verschiedener Standard-Peptide versetzt, so kann die Intensität sowohl dieser Standardsignale, als auch der Probensignale ermittelt werden. Beispielhaft zeigt
Abbildung 4 eine MALDI-Messung als relativ quantifizierende massenspektroskopische (MS) Methode. Alle Signalintensitäten der Standards wurden auf ihre Signalintensität bei einer Konzentration von 0,64 μM ( = 1 ) normiert. Jedes Peptid zeigt ein individuelles, typisches Verhältnis von Signalstärke zu Konzentration, was anhand der Steigung der Kurve ablesbar ist.
Beispiel 4: Massenspektrometrische Identifizierung von proSAAS-Fragmenten Zur Quantifizierung der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente muss sichergestellt werden, dass es sich bei den zu analysierenden Massensignalen in den Fraktionen, gewonnen durch Reverse-Phase-Chromatographie von Liquor cerebrospinalis, gemäß Beispiel 2, tatsächlich um die erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente handelt.
Die Identifikation der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente, in diesen Fraktionen erfolgt z.B. mit nanoSpray-MS/MS [21 ]. Dabei wird ein proSAAS-lon oder ein proSAAS-Fragment-lon im Massenspektrometer anhand seines spezifischen m/z -Wertes (Masse/Ladung) in einer dem Fachmann bekannten Art und Weise im Massenspektrometer selektiert. Dieses selektierte Ion wird anschließend durch Zuführung von Kollisionsenergie mit einem Stoßgas, z.B. Helium oder Stickstoff, fragmentiert und die resultierenden proSAAS-Fragment- Bruchstücke im Massenspektrometer in einer integrierten Analyseneinheit detektiert und korrespondierende m/z-Werte bestimmt (Prinzip der Tandem- Massenspektrometrie) [23]. Das Fragmentierungsverhalten von Peptiden ermöglicht bei einer Massengenauigkeit von z.B. 50ppm eine eindeutige Identifizierung der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente unter Verwendung von computergestützten Suchverfahren [24] in Sequenzdatenbanken, in die die Sequenz von proSAAS eingetragen wurde. In diesem speziellen Fall erfolgte die massenspektrometrische Analyse mit einem Quadrupol-TOF-Instrument, Modell "QStar-Pulsar" der Firma Applied Biosystems-Sciex, USA. Beispielhafte MS/MS Fragmentspektren sind in Abbildung 5 gezeigt. Um die Auswertung der
Fragmentspektren zu vereinfachen wird in der Regel eine sogenannte Dekonvolutierung der Fragmentspektren durchgeführt. Dazu wird die gemessene Masse (m) jedes Fragments durch die Anzahl seiner Ladungen (z) dividiert. Dadurch werden die gemessenen Massen der einzelnen Fragmente in ihre realen Massen umgerechnet, was die Komplexität der Fragmentspektren verringert und ihre Auswertung erleichtert. Ein Fragment mit der Masse 1000 Dalton kann z.B. mit einer und mit zwei Ladungen im Rohdatensatz der Messung vorhanden sein. Für das Fragment mit einer Ladung wird dann eine Masse von 1000 Da und für das zweifach geladene, ansonsten identische Fragment wird jedoch eine Masse von 500 Da gemessen. Teilt man beide
Massensignale durch die Anzahl der Ladungen, so haben beide die richtige Masse von 1000 Da und sie treten nun nur noch als ein homogenes Massensignal mit ihrer realen Masse auf.
Beispiel 5: Massenspektrometrische Quantifizierung von proSAAS-Fragmenten zum Vergleich ihrer relativen Konzentration in Kontrollproben verglichen mit Patientenproben
Nach einer Probenvorbereitung gemäß Beispiel 1 und 2 wurde eine nachgeschaltete MALDI-Messung der erfindungsgemäßen proSAAS-Fragmente gemäß Beispiel 3 durchgeführt. Exemplarische MALDI-Signalintensitäten sind in Form eines "Box-Whisker-Plots" in der Abbildung 6 dargestellt. Die in Abbildung 6 dargestellten "Box-Whisker-Plots" beruhen auf Messwerten, die jeweils anhand von 29 bis 45 Proben von Morbus-Alzheimer-Patienten, bzw. 13 bis 44 Kontrollproben je Messreihe durchgeführt wurden. Insgesamt wurden 4 unabhängige Messreihen im Sinn einer Kreuzvalidierung durchgeführt, wobei die Messreihen jeweils Morbus-Alzheimer-Proben und Kontrollproben beinhalteten . Die dargestellten "Box-Whisker-Plots" ermöglichen den Vergleich der integrierten MALDI-massenspektrometrischen Signalintensitäten verschiedener proSAAS-Fragmente in Kontrollen, mit den MALDI-Signalintensitäten in Proben von Morbus-Alzheimer-Patienten. Dabei umfasst die "Box", d.h. die Kästen in den Diagrammen in Abbildung 6 jeweils den Bereich der MALDI- Signalintensitäten, in dem sich 50 % der jeweiligen MALDI-Signalintensitäten befinden ( = 2. und 3. Quartil), die von der "Box" ausgehenden nach oben und nach unten weisenden Linien ("Whisker") geben den Bereich an, in dem sich jeweils die 25 % der Messwerte befinden, die die höchsten Signalintensitäten aufweisen (oberes Quartil), bzw. in dem sich die 25 % der Messwerte befinden, die die niedrigsten Signalintensitäten aufweisen (unteres Quartil). Die durchgezogene Linie in den Kästen gibt den Medianwert und die gestrichelte Linie in den Kästen gibt den Mittelwert an.
Die Überschriften und Beispiele in diesem Dokument sind lediglich zur Strukturierung des Textes und zur exemplarischen Veranschaulichung bestimmt. Sie sind nicht dazu bestimmt, die beschriebenen Sachverhalte zu limitieren oder einzuschränken. Alle Beispiele sollen den Erfindungsgedanken näher charakterisieren, sollen jedoch den Äquivalenzbereich der Erfindung nicht eingrenzen.
Falls in dieser Patenschrift ein Begriff nicht eindeutig definiert ist oder dem Fachmann auf dem jeweiligem Fachgebiet nicht bekannt sein sollte oder ein Begriff aus dem Textzusammenhang nicht eindeutig definiert werden kann, so gilt die jeweils in den nachfolgenden Standardwerken genannte Definition des jeweiligen Begriffs. Falls ein Begriff in mehreren der nachfolgend zitierten Werke mit verschiedenen Definitionen aufgeführt wird, so gilt jeweils die Definition, die in dem zuerst in der nachfolgenden Liste aufgeführten Werk genannt wird. Folgende Publikationen werden zu diesem Zweck zitiert:
• The Merck Mannual of Diagnosis and Therapy [25] • Molecular Cloning - A Laboratory Manual [26]
• Current Protocols in Immunology [27]
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Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Diagnose, Prognose des Verlaufs und/oder zur Ermittlung einer Veranlagung einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder
Lanzgzeitgedächnis einhergeht, dadurch gekennzeichnet, dass in einer biologischen Probe eines Individuums ein Peptid bestimmt wird, wobei das besagte Peptid in einer biologischen Probe gleichen Ursprungs eines Individuums, das keine neurologische, demenzielle Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, vermindert vorhanden ist und wobei das besagte Peptid a) proSAAS, bevorzugt humanes proSAAS, insbesondere ein Peptid entsprechend Seq. ID 28 ist, oder b) ein homologes Peptid, das zumindest 70 % Homologie zu proSAAS oder zur Sequenz entsprechend Seq. ID 28 aufweist ist, oder c) ein Fragment oder Derivat eines der unter a) bis b) genannten Peptide ist.
2. Verfahren entsprechend Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass in der besagten biologischen Probe eine vermindert vorhandene
Nukleinsäure bestimmt wird, a) die für proSAAS kodiert, bevorzugt humanes proSAAS, insbesondere die der Seq. ID 36 entspricht, oder b) die einer homologen Nukleinsäure entspricht, die zumindest 60 % Homologie zu einer Sequenz entsprechend a) oder entsprechend
Seq. ID 36 aufweist, oder c) die ein Fragment oder Derivat der unter a) bis b) genannten Nukleinsäuren ist, oder d) die komplementär zu einer der unter a) bis c) genannten Nukleinsäuren ist, oder e) die spezifisch mit einer der unter a) bis d) genannten Nukleinsäuren hybridisiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das in dem Verfahren bestimmte Peptid a) ein Peptid entsprechend Seg. ID 1 bis 27, Seq.-ID 29 bis 35 oder Seq.-ID 37 bis 52 ist, oder b) ein Fragment oder Derivat eines Peptids entsprechend a) ist, oder c) ein Fragment von Seq.-ID 28 ist, das durch Prozessierung der Sequenz entsprechend Seq. ID 28 durch eine
Prohormonkonvertase entsteht, oder d) ein Peptid ist, das mindestens 70 % Homologie mit der Sequenz eines Peptides entsprechend a) bis c) aufweist, insbesondere ein Mutante eines Peptides entspechend a) bis c) ist, wobei die Mutante in ein oder zwei Aminosäuren von der entsprechenden nicht mutierten Sequenz abweicht.
4. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet, dass es a) in Kombination mit anderen Diagnose- oder Prognoseverfahren zur
Erhöhnung von Sensitivität und/oder Spezifität der Diagnose- oder Prognoseverfahren führt, oder b) zur Identifizierung von Subgruppen neurologisch erkrankter Individuen, vorzugsweise an Morbus Alzheimer erkrankter, Individuen geeignet ist, die auf bestimmte Therapieformen ansprechen werden (Stratifizierung).
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass die besagte biologische Probe a) Liquor cerebrospinalis, Serum, Plasma, Vollblut, Urin,
Tränenflüssigkeit, Saliva, Lymphflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Sputum, Stuhl oder eine Zeil- oder Gewebeprobe oder ein Homogenat einer Zeil- oder Gewebeprobe ist, und/oder b) vor der Identifizierung chromatografisch oder elektrophoretisch fraktioniert oder aufgetrennt wird, vorzugsweise mit Reverse- Phase-Chromatographie, und/oder c) vor der Identifizierung durch Fällungsreaktionen oder Extraktionsmethoden fraktioniert wird.
6. Verfahren nach zumindest einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung der besagten Peptide mit Hilfe eines Aktivitätstests, eines immunologischen, molekularbiologischen, physikalischen oder chemischen Tests erfolgt.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zur physikalischen Bestimmung zumindest einers der besagten Peptide a) die Masse der besagten Peptide herangezogen wird, oder b) Massenspektrometrie verwendet wird, oder c) MALDI oder ESI Massenspektrometrie verwendet wird, oder d) zumindest ein Peptid mit einer Masse, ausgewählt aus der Gruppe der theoretischen, monoisotopischen Massen von 1732,8 / 1770,8 / > 826,4 / > 910,5 / ≥ 1024,7 / > 799,4 / > 870,5 / ≥ 765,4 / > 899,5 / > 81 1 ,5 / 4234,4 / 3501 ,9 / 2214,2 / 1959,0 / 1845,9 / 783,5 / 1 123,8 / 1754,0 / 1640,9 / 1021 ,5 / 3548,9 / 3352,9 / 3042,7 / 2730,5 / 795,5 / 2050,1 / 1797,0 / 3126,7 / 27354,8 /
24019,9 / 22283,9 / 20992,0 / 19803,5 / 14951 ,0 / 16778,8 / 13670,2 / 1 170,6 / 1493,8 / 1571 ,7 / 81 1 ,5 / 1534,8 / 21 15,1 / 1 177,6 / 1412,7 / 1 154,6 / 1794,0 / 1804,9 / 1761 ,1 / 2241 ,2 / 1213,5 / 1756,0 / 1365,9 Dalton bestimmt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein ELISA (Enzyme-Iinked immunosorbent assay), ein Radioimmunoassay, ein Protein-Chip-Assay oder ein Westemblot zur Bestimmung zumindest eines der besagten Peptide eingesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass eine Nukleinsäure, kodierend für oder komplementär zu zumindest einem der besagte Peptide, unter Verwendung von Northernblots, DNA-Chip Assays, Reverse-Transkriptase-PCR oder quantitativer PCR bestimmt wird.
10. Ein Peptid, enthaltend ein Fragment der Sequenz von proSAAS, dadurch gekennzeichnet, dass es sich nicht um Peptide entsprechend Seq. ID 10 bis 35 oder 37 bis 52 handelt und das femer dadurch gekennzeichnet ist, dass das besagtes Peptid in biologischen Proben eines Individuums mit einer neurologischen, demenziellen Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, in verminderten Konzentrationen vorhanden ist, relativ zu der Konzentration des besagten Peptids in biologischen Proben eines Individuums, das keine neurologische, demenzielle Erkrankung, die mit einer Verschlechterung des Kurz- oder Langzeitgedächtnis einhergeht, aufweist.
1 1. Ein Peptid entsprechend Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass a) es sich um ein Fragment von humanem proSAAS handelt, bevorzugt es sich um ein Fragment von Seq. ID 28, insbesondere um Seq. ID 1 bis 9 oder ein Fragment hiervon handelt, oder b) es sich um ein Peptid handelt, dessen Sequenz zumindest 70 % Homologie zu einem Peptid entsprechend a) aufweist, insbesondere um ein Peptid entsprechend a) handelt, bei dem 1 oder 2 Aminosäuren mutiert sind, oder c) es sich um Derivate der Peptide entsprechend a) bis b) handelt.
12. Ein Peptid gemäß Anspruch 10 oder 1 1 weiterhin umfassend Bestandteile zur Aufreinigung und/oder Markierung des Peptids.
13. Eine Nukleinsäure, a) die für ein Peptid entsprechend Ansprüche 10 bis 12 kodiert, oder b) die komplementär zu einer der unter a) genannten Nukleinsäuren ist, oder c) die spezifisch mit einer der unter a) oder b) genannten
Nukleinsäuren hybridisiert, oder d) die degeneriert ist, bezogen auf eine der Nukleinsäuresequenzen entsprechend a) bis c), oder e) die ein Derivat einer der Nukleinsäuresequenzen entsprechend a) bis d) ist, oder f) die zu 60 % homolog zu einer der Nukleinsäuresequenzen entsprechend a) bis e) ist, oder g) die ein Fragment einer der Nukleinsäuresequenzen entsprechend a) bis f) ist.
14. Eine Nukleinsäure gemäß Anspruch 13, die weiterhin eine Nukleinsäuresequenz aufweist, die die Aufreinigung, Detektion oder den Transport der Nukleinsäure oder des der Nukleinsäure entsprechenden Peptids erlaubt.
15. Vektor enthaltend zumindest eine der unter Anspruch 13 oder 14 genannten Nukleinsäuresequenzen.
16. Zelllinie enthaltend zumindest eine der unter Anspruch 13 oder 14 genannten Nukleinsäuresequenzen und/oder einen Vektor entsprechend Anspruch 15.
17. Verwendung von a) einem spezifischen Binder oder Antikörper oder ein Fragment oder Derivat davon, der proSAAS oder ein Peptid entsprechend Anspruch 10 oder 12 bindet, wobei der Binder oder Antikörper in immobilisierter oder markierter Form vorliegt, oder in einer Form vorliegt, welche die Immobilisierung oder Markierung ermöglicht und/oder b) eines Peptids entsprechend proSAAS oder entsprechend Anspruch 10 bis 12, und/oder c) eine Arbeitsanleitung in einem Testkit zur Durchführung eines Verfahrens entsprechend einem der Ansprüche 1 bis 1 1 .
18. Zubereitung enthaltend wenigstens einen Stoff nach Anspruch 10 bis
12 , sowie eine Transporteinheit, wodurch Inhaltsstoffe der Zubereitung a) die Blut-Hirn-Schranke und/oder die Blut-Liquor-Schranke passieren können, oder b) vom extrazellulären Raum in den intrazellulären Raum gelangen können, oder c) für spezielle Applikationswege optimiert sind, insbesondere für die Gabe in den Blutkreislauf, den Gastrointestinaltrakt, den Urogenitaltrakt, das lymphatische System, den Subarachnoidalraum, zur topischen Anwendung, zur Inhalation oder zur direkten Injektion in Gewebe wie z.B. Muskelgewebe, Fettgewebe oder Gehirn oder zur In-vitro-Behandlung von Zellen, oder d) eine verlängerte oder verkürzte In-vivo-Halbwertszeit aufweisen, z.B. durch Pegylierung dieser Stoffe, oder e) eine verlängerte Haltbarkeit bei Raumtemperatur, bei 4 °C, bei -20 °C oder bei -70 °C aufweisen, oder eine verlängerte Halbwertszeit aufweisen, wenn sie sich in flüssiger oder fester Phase befinden.
9. Zubereitung zur Therapie, Diagnose oder Prophylaxe enthaltend a) mindestens ein Peptid entsprechend Anspruch 10 oder 12, und/oder b) mindestens eine Nukleinsäure entsprechend Anspruch 13 oder 14, und c) mindestens eine weitere pharmakologisch akzeptable Substanz, vorzugsweise ein Konservierungsmittel, einen Füllstoff, ein Lösungsmittel, einen Farbstoff, einen Geschmacksstoff oder einen Geruchsstoff.
20. Verwendung von Peptiden entsprechend Anspruch 10 bis 12 zur Herstellung einer Zubereitung entsprechend Anspruch 19.
21. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die in der Lage sind, die Expression, Halbwertszeit oder Wirksamkeit mindestens einer der in
Anspruch 10 bis 12 genannten Substanzen zu verstärken.
PCT/DE2004/000861 2003-04-25 2004-04-23 Verfahren zum nachweis einer neurologischen, demenziellen erkankung, die mit einer verschlechterung des kurz- oder langzeitgedächtnis einhergeht, zugehörige prosaas-peptide und nachweisreagenzien WO2004097420A1 (de)

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PCT/DE2004/000861 WO2004097420A1 (de) 2003-04-25 2004-04-23 Verfahren zum nachweis einer neurologischen, demenziellen erkankung, die mit einer verschlechterung des kurz- oder langzeitgedächtnis einhergeht, zugehörige prosaas-peptide und nachweisreagenzien

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