JP2000513439A

JP2000513439A - 遺伝的に引き起こされた病原性の局部変異体を直接診断的に検出する方法

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Publication number: JP2000513439A
Application number: JP10502314A
Authority: JP
Inventors: ボルフ―ゲオルグフォースマン; マンフレッドライダ; ベルンハルトブレンネル; フォルカーニール
Original assignee: ハエモペップファルマゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング; ボルフ―ゲオルグフォースマン
Priority date: 1996-06-21
Filing date: 1997-06-20
Publication date: 2000-10-10
Also published as: EP0914615A1; DE19624802A1; US6326163B1; WO1997049993A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物体に病原性と非病原性の影響を持つ単一アミノ酸の置換のタンパク質レベルにおける質的かつ量的な医学診断的の分析に対する迅速な方法に関する。医学診断的分析が、単離されたペプチドの酵素的化学的な切断、断片のクロマトグラフィー分離、質量分光測定による分析、間接的なＭＡＬＤＩ−ＭＳと直接的なＬＣ/ＭＳの両方、及び毛細電気泳動による分析の組み合わせにより行われる。健康な人がらのタンパク質サンプルと病気の人のそれらとを比較することにより、前述の方法は、新規でいまだ知られていない変異を確立すること、変異体に対する野生型の発現と組み込みを定量することに適している。

Description

【発明の詳細な説明】遺伝的に引き起こされた病原性の局部変異体を直接診断的に検出する方法本発明は、請求項１の包括的な部分に従った方法に関する。遺伝子レベルでの変異は、相当する変異した遺伝子断片にコードされたタンパク質に組み込まれるべき不適当なアミノ酸をしばしば生じる。これは、例えば、鎌状赤血球貧血などの病原性の現象を結果として生じるかもしれない。病原性の状態の原因である変異体の存在の検査は、通常ＤＮＡレベルで行われる。そのような検査は、扱いにくく、かつ、それらの評価は概して非常に長くかかる。それゆえ、本発明の目的は、変異の存在を迅速かつ確実に確立することができる方法を提供することにある。本発明によれば、この目的は、請求項１に規定されたような特徴を有する方法によって達成される。本発明による方法は、変異によって引き起こされ、変異の領域に発現されたタンパク質(検査されるべきタンパク質)と、変異を欠いている野生型により発現された相当するタンパク質とのアミノ酸組成の差異を比較することによって、生物体の中の変異を認知することに役立つ。この発明のよる方法は、以下の特徴がある。 −サンプルは、検査されるべきタンパク質が発現され、検出することができ、及び／又は生理学上の役割を演じる部位で生物体から採取される。 −タンパク質は、タンパク質分析の方法により濃縮され又は精製され、次いでその分子量が決定される。 −検査されるべきタンパク質の分子量の決定は、サンプルの前処理なしに行われる。本発明は、生物体への病原性又は非病原性の影響を持つ単一アミノ酸置換のタンパク質レベルでの質的、量的な医学診断分析のための迅速な方法に関する。医学診断分析は、好ましくは単離されたペプチドの酵素的又は化学的切断、断片のクロマトグラフィー分離、質量分光測定法による分析、直接ＬＣ/ＭＳ法や間接ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法の両方、分析、例えば、毛細電気泳動法などの組み合わせにより行われることが好ましい。健康的な被験者からのタンパク質サンプルと病気の被験者からのそれらを比較することにより、前述の方法は、新規のまだ知られていない変異を確立すること及び変異体に対する野生型の発現や組み込みを定量することに適している。生物体、特に生検からのサンプルを得ることは、本発明による方法の基礎と考えることができる。サンプルが採取される部位として、部位は、検査されるべきタンパク質が発現され、検出でき又は生理学的な役割を演ずるところ、例えば、筋肉繊維束又は臓器、特に心臓からの組織片において選択される。サンプルは、例えば、単一のアミノ酸置換が、質量分光測定法、クロマトグラフィー及び／又は電気泳動方法によりはっきり検出されることができ、かつ、変異体に対する野生型の発現と組み込みの割合が量的に決定されることができるような方法で、都合よく処理される。それゆえ、その上直接タンパク質分析により早期の段階に遺伝的に引き起こされる病気の原因を診断すること又は病気の被験者からのサンプルと健康な被験者からのサンプルとの比較分析によりまだ知られていない変異を同定することが可能となる。液体クロマトグラフィー、特に、1ｍｍ以下の内径を持つカラム(微細孔かつ毛細カラム)を使用する、との組み合わせによる好感度ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法(matrix-a ssisted laser-induced desorption and ionization time-of-flight mas ssepctrometry)を使用することにより、検出は、微少なサンプル量でさえ実施することができる。これまでに行われてきたタンパク質を暗号化するＤＮＡ分析と比較するとき、この方法は、変異の検出、発現及び組み込みの割合の決定はかなり短い時間内に行われるという特徴がある。分析は、数週間から半年の範囲であるＤＮＡ分析に要求される通常の時間とは対照的に、一週間以内に行うことができる。診断目的のために生検サンプルから回収されたタンパク質の特異的切断が、選択的な酵素、エンドプロテイナーゼ、または化学試薬により行われ、かつ、そのような切断により得られた断片が、クロマトグラフィー法により分離され、直接的 (ＬＣ/ＭＳ法)又は間接的(ＭＡＬＤＩ−ＭＳ法)のどちらかによるそれらの分子量によって特性が示されることは有利である。分離における分配と、質量分光測定法によって決定され分子量とは、タンパク質のそれぞれの断片についての明確な証拠である。より小さいタンパク質、即ち、10万ダルトンまでの分子量を持つタンパク質について、アミノ酸置換は、断片に予め切断することなしに前述の方法で直接決定されることができる。この測定の正確さは、５ダルトン未満の分子量での差異の正確な決定を可能にし、かつそれゆえお互いの存在下における野生型及び変異体の両方の検出を可能にする。アミノ酸置換の正確な位置測定(localization)は、上述した切断により実行される。それゆえ、遺伝的に引き起こされた病原性及び非病原性のアミノ酸置換によって、例えば、筋肉等の生理学的に機能的な構造に関係するすべてのタンパク質を特徴づけることができる。ヒトゲノムの配列決定により多くのタンパク質のアミノ酸配列が、既に知られており、そしてすべてのヒトタンパク質は数年の内に解明されるであろう。それ故、タンパク質は、それ自体公知の方法により当業者によりなされることができる適切な切断法を選択することにより、前述の方法によって変異について分析されることができる。この方法は、病気の原因の発見における臨床診断的使用に対して適用され、かつ、分離と検出状態の最適化を通して、特定の明確な変異に対する患者サンプルの系統的なスクリーニングにもまた適用されることは非常に重要であることができる。適当な装置を使用すると、前述の方法は、かなりの範囲で自動化されることもできる。前述したような手順に対して、分析の期間は、２、３日の範囲である一方、ＤＮＡ分析は、数週間から数ヶ月間かかる。同時に、生理学的に機能的な構造に関係するすべてのタンパク質は、この方法により分析されることができる。ゲノムのＤＮＡ又はｃＤＮＡを分析することによる点変異の検出のための従来的な方法と違って、この方法は、特に核中の染色体の二組の存在のために、それぞれのタンパク質の両方の形態が発現され、二つの形態が機能的な形態の中にどのような割合で存在しているか分らない場合であっても、生理学的に機能的な構造中の変異の発現及び組み込みの定量化を可能にする。この発明は、さらにアミノ酸分析又は化学的配列分析により供給されるべき変異体及び野生型の同一性の証拠をも与える。この発明の方法の好ましい具体例は、適切な酵素又は化学試薬での検査されるべきタンパク質の切断、並びに、クロマトグラフィー法、特に毛細孔カラムを有する高速液体クロマトグラフィー(ＭＢ−ＨＰＬＣ)、及び質量分光測定法の組み合わせからなる。本発明は、さらに、一例として、ミオシンのβ−アイソフオーム(β−isoform) の重鎖を使用することにより説明される。ミオシンのβ−アイソフォームの重鎖中の点変異、例えば、６０６の位置にあるアミノ酸バリンに対するアミノ酸メチオニンの置換が、突然の死に導くかもしれないある心臓壁の遺伝的に引き起こされた肥厚化、肥大な心臓病に起因するかもしれない。本発明によれば、変異の検出は、酵素的な切断とＬＣ/ＭＳ法の組み合わせにより可能である。図１ａと１ｂは、質量分光測定法(ＭＳ)と高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)の連結による、ヒトの心臓病のβ−ミオシン重鎖(β−ＭＨＣ)のペプチド断片の分析を示す。この例において、ヘテロ接合体の変異体Val６０６Met、即ち、 β−ＭＨＣの６０６の位置でのバリンの置換の存在が調べられた。図１ａは、遺伝子レベルで置換が証明されたある人の元の断片、１４７５．５の分子量を持つ野生型断片に加えて、置換アミノ酸と分子量１５０７．５とを持つ断片を検出できた２つのマークを付した範囲を示す。比較のために、図１ｂは、遺伝子に点変異のない人のβ−ＭＨＣサンプルの分析を示す。この場合には、野生型断片だけが検出され、図１ａで変異された断片が溶出された範囲では、このペプチドは、完全に欠如している。それゆえ、人の筋肉繊維中の変異β−ＭＨＣの検出が可能になる。メチオニン(Met)によるバリン(Val)のアミノ酸置換による＋３２の分子量の観測された変化によってのみ実証されるこの検出を補強するために、酵素的に切断された断片がＨＰＬＣにより分離され、かつ、分画は、質量分光測定法を使用して１４７５．５と１５０７．５の分子量を持つペプチドの存在が調べられた。これらのペプチドは、上に示されたＬＣ/ＭＳ分析に相当するものとしてそのような分画の中に発見することができた。図２ａと図２ｂは、検出されるべきペプチドに加えて、β−ＭＨＣからの多数の他のペプチドも存在する、これらペプチド分画の質量スペクトルを示す。これら分画中に検出されるペプチドの配列は、２つの質量分光測定法(ＣＩＤ− ＭＳ/ＭＳ)の組合わせによって行われる、衝突誘発された切断により確実にされる。ｂ及びｙとして示された断片イオン間の距離は、高い特異性を有するペプチドのアミノ酸に相当する。これらの距離からペプチドの配列を完全に又は部分的に確立することができる。分子量が全く違わないアミノ酸ロイシン(Leu)とイソロイシン(Ile)、及び0.04単位質量だけ違うリシン(Lys)とグリシン(Gln)との場合だけ問題がある。酵素的切断は、リシン(Lys)の後ろで特異的に切断する酵素によって行われるので、配列決定は、ペプチドの末端でのアミノ酸がリシンであるという仮定に基づくことができる。ＣＩＤ−ＭＳ/ＭＳスペクトルが図３ａと図３ｂに示されている。ｂ５とｂ６の距離は、アミノ酸置換により引き起こされた変化を明確に示している一方、すべての他の断片イオン間の距離は、変化しないままである。評価は、野生型の配列としてＤＰＬＮＥＴＶＶＧＬＹＱＫ、そして、変異体の配列としてＤＰＬＮＥＴＶＭＧＬＹＱＫを与えた。データベースで行われた比較は、他の種からの非常に相同性のβ−ＭＨＣsを除いて、他のタンパク質とのＣＩＤ−ＭＳ/ＭＳスペクトルの非相同性を与えた。それゆえ、筋肉繊維の中の変異の存在は、分子レベルではっきりと証明され得る。述べられた技術は、変異体に対する野生型の組み込み程度を測ることに対しては適当ではない。異なったイオン化率と混合物の中の他のペプチドの存在による妨害のために、ペプチドの量は質量分光の結果から決定することができない。定量化のために、別の分離方法、即ち、毛細領域電気泳動が、量的な検出方法として推奨される。ＨＰＬＣのそれらより他の特別のパラメータに基づくこの方法においては、ペプチドは、強い電界中で５０ｃｍの長さと０．０５〜０．０７５の内径を持ち、緩衝液で満たされた非修飾ガラス毛細管で分離される。使用される緩衝液は、緩衝液それ自体の電気的流動を排除し、かつ、すべてのペプチドにプラス電荷を与えるために、２．５のｐＨ値を持つ(１００ｍＭリン酸緩衝液)。このシステムで、同定された分画のペプチドが分離された。商業的に利用できるペプチド(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)の低ｐＨ移動マーカー )が、内部標準として同じ量で加えられた。これは、一方では、比較されるべきペプチドのピーク領域を比較することができるようにし、かつ、異なる操作での溶出時間の多様性を考慮するためである。検出されるべきペプチドそれら自身は、同じ配列の合成ペプチドの注入による更なる分離で同定された。ピーク高さから、及びピーク領域がらも、全β−ＭＨＣの１０〜１５％の変異体の相対的な組み込みが算出された。この実験は、一人の患者からであるが、５つの異なった組織標本を用いて行われた。変異体β−ＭＨＶVal６０６Metについてのこのような測定値は、常に１０〜１５％の間であった。毛細領域電気泳動は、図４ａと図４ｂに示され、マークされたペプチド(^*)は、加えられた内部標準であり、ペプチド( 1)は、β−ＭＨＣの野生型の断片であり、ペプチド(2)は、β−ＭＨＣの変異体の断片である。調べられたサンプルが、一族に特有の肥大な心臓病のいくつかの兆候を示さなかったことは興味深いことである。それゆえ、低い程度での組み込みは、筋肉の機能に外見上は明らかな変化を結果として生じなかったと考えられる。本発明による方法は、一般にすべてのβ−ＭＨＣ変異体に適用されることができる。今までのところでは、変異の潜在的なキャリアーであるいくらかの断片がうまく同定された。これら断片は図５中に下線が引かれて、かつ、連続的な配列の下に書かれたアミノ酸は、今までに知られた置換である。本発明による方法は、病原性の影響を持つすべての変異にも適用することができる。診断目的のために、この方法は、遺伝的な病気の発達の早期発見のために使用することができ、遺伝子分析に加えて、いくらかの病気の危険又は病気の進行の直接的な予測が、生物体から得た機能しているタンパク質を分析することによりすべての患者のために提供される。実施例１エンドプロテイナーゼLys−Ｃを用いて得られたミオシンのβ−アイソフォーム( β−ＭＨＣ)の重鎖の断片のＬＣ/ＭＳ分析選択的切断の基本は、塩濃度を減少することによるβ−ＭＨＣの沈降と高い塩緩衝液での分解により生検がら得られたひらめ筋(soleus)の筋肉繊維からのβ−ＭＨＣの単離である。集められたβ−ＭＨＣは、妨害していろ可溶性成分を取り除くために、水で洗われても良い。分析されるべき断片を準備するために、沈降されたβ−ＭＨＣは、100ｍＭアンモニウム炭酸水素塩緩衝液、ｐＨ８．２、２００μｌに懸濁され、２４時間以上の間37℃でエンドプロテイナーゼLys−Ｃ(Boehringer Mannheim)とともにインキュベートされた。この溶液は次いで凍結乾燥され、残部は、０．１Ｍトリフルオロ酢酸水溶液の１００μｌに溶解される。溶解されない成分を取り除くために、サンプルは、最大値１０、０００ｘｇで０．２μｍ酢酸セルロースフィルターを通して濾過され、かつ２０〜５０μｌのアリコートがＭＢ−ＨＰＬＣカラムに適用される。分離は、２０μｌ/minの流速で１ｍｍの内径、かつ、１００ｍｍの長さの逆相Ｃl8カラムを通して行われる。ペプチドの溶出は、０．０６％ＴＦＡ水溶液の１０％アセトニトリルから０．０５％ＴＦＡ水溶液の８０％のアセトニトリルまで、緩衝液中のアセトニトリル濃度を０．５％/minで直線的に増加させることにより実施される。溶出するペプチドは、溶融シリカ毛細管とＵＶ検出器を通して、直接的に四重極質量分光計の電気噴霧イオン化装置(ＳＣＩＥＸＡＰＩ III、 Perkin−Elmer、Langen)の中に注入される。質量分光計において、m/z(電荷に対する質量)値は、４．２秒毎に４００〜２４００ amu(atomic mass units)の範囲上で決定される。記録された全イオンクロマトグラムと相対的な質量スペクトルから、野生型と変異体の断片は、コンピューター評価により検出することができる。前述の分離の後、変異していないβ−ＭＨＣのサンプルが、同じ条件の下で非変異及び変異断片の配列を有する合成ペプチドと共に分析された。見出された分子は、合成ペプチドが溶出される範囲である。図１：上部：エンドプロテイナーゼLys−Ｃを用いて得られた変異β−ＭＨＣの断片の分離の全イオンクロマトグラム。中間部：図上部の斜交平行線模様の範囲（１）中の非変異断片の検出。非変異断片は、１４７５．５ａｍｕの分子量を持つ。下部：図上部の斜交平行線模様の範囲（２）中の変異断片の検出。変異断片は、１５０７．５ａｍｕの分子量を持つ。実施例２ＭＡＬＤＩ−ＭＳ技術によるβ−ＭＨＣの変異体と野生型の断片の検出実施例１で述べたように、β−ＭＨＣの切断は、エンドプロテイナーゼ Lys−Ｃを用いたインキュベーションと、上述した条件下で行われる逆相Ｃ１８カラムでのその後の分離によって実施される。この例において、質量分光測定との直接連結の代わりに、自動分画収集器がそれぞれ２分間分画を集め、そして、これら分画の各０．５μｌがＭＡＬＤＩ−ＭＳの支持体上で適当な母材物質、通常０．２％ＴＦＡと60％アセトニトリルで溶解されたα−ヒドロキシ珪皮酸又はシナピン酸の１μｌと混合される。分子量の決定は、次いで、測定を換算するために外部標準、即ち、二つの知られた合成ペプチドを使用してＭＡＬＤＩ−ＭＳ(Vestec 、Houston)で行われる。実施例１からの相当する分画において、これら測定は、予想された１４７７．５と１５０７．５ａｍｕの質量を与えた。それゆえ、変異断片が十分にＭＡＬＤＩ−ＭＳによって明確に検出されることができる。実施例３毛細電気泳動による実施例２からの分画の分析実施例２からの分画は、１５〜１７ｋＶの電圧で、１００ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．０、中で内径７５μｍを有する溶融シリカ毛細管を使用する毛細電気泳動(Beckmann Ｐ/ＡＣＥ２０００、Beckmann、Munich)により分離された。ペプチドの検出は、200ｎｍでのＵＶ検出器によって実施された。第二の分離操作において合成ペプチドを注入することにより、天然の非変異断片と変異断片の同定を示すことができた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１０年６月２２日（１９９８．６．２２）【補正内容】請求の範囲(補正) １．変異の領域に発現されたタンパク質(検査されるべきタンパク質)の変異によって引き起こされたアミノ酸組成の差異を変異を有さない野生型により発現された相当するタンパク質と比較することによる異なった組織と器官領域の中で変異体に対する野生型の割合、発現と組み込みの医学診断的分析のための方法であって、 −サンプルは、検査されるべきタンパク質が発現され、検出することができ、及び／又は生理学上の役割を演じる部位で生物体から採取され、 −タンパク質は、タンパク質分析の方法により濃縮され又は精製され、次いでその分子量が決定され、 −検査されるべきタンパク質の分子量の決定は、サンプルの前処理なしに行われること −変異体に対する野生型の組み込みと発現が定量される方法。２．請求項１による方法であって、検査されるべきタンパク質がタンパク質断片に切断されることを特徴とする方法。３．請求項１及び／又は２による方法であって、検査されるべきタンパク質がミオシンのβ−アイソフォームの重鎖又はそのものからエンドペプチターゼ Lys− Ｃを用いて得ることができる断片であること特徴とする方法。４．請求項１〜３の少なくとも１項による方法であって、分子量の決定がＬＣ/ ＭＳ組合せ又はＭＡＬＤＩ−ＭＳによって実施されることを特徴とする方法。５．タンパク質レベルにおける生理学的に機能的な構造中の野生型及び変異体の発現と組み込みを医学診断的に定量化するための請求項1〜4の少なくとも１項による方法。６．タンパク質レベルで今までのところ知られていない病原性及び非病原性の変異の直接的な医学診断的検出のための請求項１〜４の少なくとも１項による方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ライダマンフレッドドイツ連邦国、ハノーファーＤ―30625、フェオドール―リネン―シュトラーセ 31 (72)発明者ブレンネルベルンハルトドイツ連邦国、ハノーファーＤ―30625、コンスタンティ―グーシャウ―シュトラーセ８ (72)発明者ニールフォルカードイツ連邦国、ハノーファーＤ―30625、コンスタンティ―グーシャウ―シュトラーセ８【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．変異の領域に発現されたタンパク質(検査されるべきタンパク質)の変異によって引き起こされたアミノ酸組成の差異を変異を有さない野生型により発現された相当するタンパク質と比較することによる生物体の変異を認知する方法であって、 −サンプルは、検査されるべきタンパク質が発現され、検出することができ、及び／又は生理学上の役割を演じる部位で生物体から採取され、 −タンパク質は、タンパク質分析の方法により濃縮され又は精製され、次いでその分子量が決定され、 −検査されるべきタンパク質の分子量の決定は、サンプルの前処理なしに行われることを特徴とする方法。２．請求項１による方法であって、検査されるべきタンパク質がタンパク質断片に切断されることを特徴とする方法。３．請求項１及び／又は２による方法であって、検査されるべきタンパク質がミオシンのβ−アイソフォームの重鎖又はそのものからエンドペプチターゼ Lys− Ｃを用いて得ることができる断片であること特徴とする方法。４．請求項１〜３の少なくとも１項による方法であって、分子量の決定がＬＣ/ ＭＳ組合せ又はＭＡＬＤＩ−ＭＳによって実施されることを特徴とする方法。５．ヒト又は動物の組織の生検から得られた組織標本中のタンパク質レベルにおけるお互いの存在下での野生型及び変異体の両方の発現と組み込みを直接、医学診断的に検出するための請求項１〜４の少なくとも１項による方法。６．タンパク質レベルにおける生理学的に機能的な構造中の野生型と変異体の発現と組み込みを医学診断的に定量化するための請求項１〜４の少なくとも１項による方法。７．異なった組織と器官領域の中で変異体に対する野生型の割合、発現と組み込みの医学診断的分析のための請求項１〜４の少なくとも１項による方法。８．タンパク質レベルで今までのところ知られていない病原性及び非病原性の変異の直接的な医学診断的検出のための請求項１〜４の少なくとも１項による方法。