JP5123848B2 - 人工タンパク質、タンパク質の絶対定量化の方法およびその使用 - Google Patents
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Description
これらの原則に基づいた分析は「AQUA」(絶対定量化)と称されており、化学的方法でデノボ合成した内部標準品を使用する(Gerber, PNAS 100 (2003), 6940−6945)。ただし、各Qペプチドを化学的に合成し、個々に定量化する必要があることから、この方法は大量のタンパク質を絶対定量化するのには向いていない。
(a)ペプチドを分離するための開裂配列によって結合した少なくとも2つの連続ペプチドと、
(b)タンパク質の絶対量の測定のための1つ以上のペプチドに対する単独マーカーと、
(c)ペプチドの保護のためのN末端およびC末端の延長部分とを包含し、
各ペプチドは試料、細胞または生体の1つの単独タンパク質であり、各ペプチドはあらかじめ化学量論的に規定されている。
(a)ペプチドを分離するための開裂配列によって結合した少なくとも2つの連続ペプチドと、
(b)タンパク質の絶対量の測定のための1つ以上のペプチドに対する単独マーカーと、
(c)ペプチドの保護のためのN末端およびC末端の延長部分とを包含し、
各ペプチドは試料、細胞または生体の1つの単独タンパク質であり、各ペプチドはあらかじめ化学量論的に規定されている。
<図1.サインペプチドとして選択するQペプチドの例>
一連のタンパク質のため、ニワトリ骨格筋の可溶性画分の豊富なタンパク質として同定されたタンパク質からペプチドを選択し(複数の基準を使用)、人工タンパク質またはQCATへと組み立てた。左側:クマシーブルーで染色された可溶性ニワトリ筋タンパク質のSDS−PAGE分析。中央:選択したタンパク質バンドに対応するゲルスライスのトリプシンによる分解のMALDI−ToFスペクトル。ovalで標識したペプチドイオンは、QCATタンパク質に含めるべく選択したペプチドである。右側:示された設計QCATタンパク質の範囲内のサインペプチドの質量および位置。ペプチドの詳細については表1に記載がある。
関連クローニング部位に関する合成遺伝子のDNA配列を上に、そこから派生したアミノ酸配列を下に示す。グレーで囲まれた部分は、ドナーニワトリタンパク質由来のトリプシンペプチドの範囲、トリプシンペプチドの帰属(T1−T25)および示されたペプチドの質量(Da)である。ホスホグリセリン酸キナーゼ中の非開裂Arg−Proトリプシン部位(囲み部分)を利用して、この部位が分解されないようにする。ペプチド(白い囲み部分)は開始剤のメチオニン、N末端の犠牲的配列およびスペーサー配列は、対象タンパク質由来ではない。黒い囲み部分は、定量化のための単独のシステイン残基および精製のためのHis6タグを運ぶ配列を強調している。T1およびT2は、最初の真のQペプチド(T3)のN末端を保護するべく設計された犠牲的ペプチドである。
pET21a/QCATプラスミドを大腸菌DE3細胞に変化させ、一定期間の指数関数的増殖の後、IPTGを用いてQCATの発現を惹起した。前誘導および誘導細胞から得た細胞溶解物をSDS−PAGE上で比較した(挿入画)。沈殿物を可溶化し、NiNTAカラムを用いた親和性クロマトグラフィーを行った後、精製されたQCATタンパク質を均等化し、トリプシン溶液で分解した。ペプチドをMALDI−ToF質量分析計で分析した。挿入画のトリプシン分解マップの影の部分は、質量スペクトルにおける各ペプチドに対応するシグナルの相対強度を示す。900Da未満のQCATの「犠牲的」部分に由来するペプチドは、この種の質量分析においては干渉イオンのためそれほど容易には検出されない。
QCATタンパク質を未標識のもの(L:軽)および15Nで均一に標識したもの(H:重)として調製した。HおよびL QCATタンパク質を別々に精製し、定量化し、種々の割合で混合した後、トリプシンで分解して、MALDI−ToF質量分析計でペプチドの強度を測定した。パネルa)は、アデニル酸キナーゼのためのQペプチドの質量スペクトルである(GFLIDGYPR、12個の窒素原子)。パネルb)では、測定したL:H比を、混合比に対してプロットし、3連の実験の個々の点を示す。下のパネルでは、7個のペプチドのデータを比較し、平均値±SD(n=18−21)で示した。点線はそれに沿う直線の95%信頼限界を示す。
ニワトリ骨格筋から可溶性タンパク質を1日目に調製し、27日目に[15N]QCATと混合し、トリプシンで分解して、MALDI−ToF MSで分析した。タンパク質のサブセットでは、内因性および標準ペプチドの強度を測定し、そこから各タンパク質の絶対量(nmol/組織g)を算出することができた。3例の動物を各時点で使用し、誤差はSEMである(n=3)。タンパク質の内訳は、AK:アデニル酸キナーゼ、ApoA1:アポリポタンパク質A1、LDHB:乳酸デヒドロゲナーゼB、Beta Trop:ベータトロポミオシン、Beta Eno:ベータエノラーゼ、GP:グリコーゲンホスホリラーゼ、ALDO B:アルドラーゼB、TPI:トリオースリン酸イソメラーゼ、GAPDH:グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ、Actin:アクチン、API:アクチン重合インヒビター、PK:ピルビン酸キナーゼおよびCK:クレアチンキナーゼであった。
発明者の主要な興味のひとつは、プロテオームの力学(Pratt, Mol Cell Proteomics 1 (2002), 579−591)および筋発達中のタンパク質の発現の変化(Doherty, Proteomics 4 (2004), 2082−2093; Doherty, Proteomics in press (2005))にある。タンパク質発現に劇的な発達的変化を示す系は、孵化後すぐに成熟に達するニワトリ胸筋である。したがって、QCATセットの説明のため、発明者らは、以前に骨格筋の発達において発現レベルの変化が確認されているニワトリのタンパク質20個を選択した(Doherty, Proteomics 4 (2004), 2082−2093)。単一のトリプシン断片を選択して各タンパク質を示したが(「Qペプチド」)、あらゆるタンパク質分解による断片または化学的断片によって複製的に生成することのできるペプチドであれば使用してもよいこととした。この実施例においては、Qペプチドの選択は、理論的および実験的基準に基づいた。最初の基準は、Qペプチドがシステイン残基に欠けていることであった。システイン残基はQCATの定量化に使用することができ、システイン残基がなければ、発現したタンパク質中で複雑な分子内および分子間ジスルフィド結合の形成を避けることができるためである。第二に、選択するペプチドはQペプチドのセット内で独特であることとした。第三に、選択するペプチドは、検出感度が通常は高く、干渉シグナルが低いMALDI−ToF質量スペクトルの領域に対応する、1000および2000Daの質量のものとした。最後に、発明者らがMALDI−ToF質量分析計で強いシグナルを発することがすでに明らかにされているペプチドを選択しているため、75%(20個中15個)は末端基がArgのトリプシンペプチドであるため、操作上の基準を追加した。こうしたペプチドがMALDI−ToF質量分析計でより強力なシグナルを発する性質は文献に詳細に記載されている(Brancia, Electrophoresis 22 (2001), 552−559)。最後の、より重要性の低い基準は、Qペプチドは、ロイシンまたはバリンなどの豊富かつ化学的に反応しにくいアミノ酸を少なくとも1個含有していることとした。これにより、安定同位体標識Qペプチドの調製のため、アミノ酸による代謝標識が容易になるためである。これらのペプチドを表1に要約する。
QCAT遺伝子を制限部位も含めて構築し、一定範囲の発現ベクターに挿入できるようにした(図2)。この例では、遺伝子(DNAシークエンシングで確認)をNdeIおよびHindIII部位でpET21aに挿入し、最初に栄養豊富な培地で増殖させた大腸菌(NovaBlue (DE3))で発現させた。IPTGによる誘導後、SDS−PAGE分析により、予測した質量(35kDa以下)のタンパク質が高レベルで発現していることを確認した。このタンパク質は超音波処理した細胞の不溶画分に存在し、封入体内にQCATタンパク質が存在することを仮定した。この調製物から、Ni−NTA樹脂を用いてQCATタンパク質を親和性クロマトグラフィーで精製した結果、均質な調製物が得られた(図2、挿入画)。ESI−MSで測定したこのタンパク質の無傷の平均質量は、33036±2Da(データは示していない)であり、QCATタンパク質に対し予測した質量33167Daと比較した場合、131Daの差はN末端からのメチオニン残基の喪失量と完全に合致する。約35kDaのゲルバンドはトリプシンによるゲル内分解の対象であり、MALDI−ToF MSで分析した。予測したQCATペプチドはすべて、MALDI−ToF質量スペクトルで容易に観察されたが、産生されたNおよびC末端の犠牲的ペプチド材料は、その設計上、MALDI−ToF質量スペクトルでは小さすぎて確認できない断片であった(図3)。ペプチドはMALDI−ToFで良好なシグナルを産生するべく選択されたが、他に比べて明らかに強度の低いペプチドもあった。これらはすべて末端リジン含有ペプチドだったが、開裂不能のArg−Pro部位を含むもののやはり末端にリジンを有し、やはりMALDI−ToF質量分析計で強力なシグナルが産生されたT17は例外とした。これは特に、乳酸デヒドロゲナーゼAおよびB(それぞれQVVESAYEVIRおよびQVVDSAYEVIK)に由来するアイソフォーム特異的QペプチドであるT8およびT18において明らかであった。末端リジン含有ペプチドは、末端アルギニン含有ペプチドのシグナル強度の10%未満であり、このことはQペプチドが主として末端がアルギニンのペプチドから引き出されたか、あるいはグアニジン化といった段階を用いてリジン残基をホモアルギニン残基に変換し、強いシグナルを得るためにこの性質を強化する必要があるかのいずれかであることを示唆した(Brancia, Electrophoresis 22 (2001), 552−559)。QCATはきわめて効率的にトリプシンで分解され、定量化段階の障害となるようなQペプチドの部分的タンパク質分解生成物が存在する証拠は勿論なかった。次に、発明者らは、唯一の窒素源として15NH4Clを含有する最少培地でタンパク質を発現させた。トリプシンで分解した結果得られるMALDI−ToF質量スペクトルは高品質であり、ペプチド中の窒素原子の数に応じたしかるべき質量シフトで、すべてのQペプチドが検出可能であった(データは示していない)。
発明者らはこの特殊なQCATを、ニワトリ骨格筋のタンパク質発現の孵化後1日目および27日目の分析に応用した(図4)。この調製物に存在する12種類のタンパク質は、QCATにおいても示された。トリプシンペプチドのMALDI−ToFデータは容易に得ることができ、孵化後、最初の3乃至4週間のタンパク質レベルの変化を測定した。
コンカテマーの使用には2つの方法がある。第一は、内部標準品としてコンカテマーを使用する、直接Qペプチド法である。安定同位体標識コンカテマーを、タンパク質分解段階前に、試料または細胞調製物に直接添加することができる。あるいは、いくつかの細胞系では、注意深く既定した条件下で増殖した参照菌株の絶対定量化を達成するために、コンカテマーの定量化を使用することができる。これが間接Qペプチド法である。この参照菌株は、次からは安定同位体標識の菌株として、その生体を用いた将来のあらゆるプロテオミクス定量化試験において、絶対定量化標準品として使用することができる。参照菌株を一度正確に定量化したら、Qペプチドとして制限されたセットを用いるのではなく、あらゆるペプチドを用いて任意のタンパク質を報告することができるため、これは明らかにきわめて魅力的な提案である。これによりさまざまなプロテオミクス戦略の一般性が広がり、完全に定量化された菌株に対する未知の試料のプロテオミクスの比較分析において、ICAT(Gygi, J Proteome Res 1 (2002), 47−54)およびITRAQ(Ross, Molecular and Cellular Proteomics in press (2004))などの標識法の新たな分野が創造される。
発明者らが提唱する戦略は、通常は安定同位体の形態をとる個々のQペプチドを化学合成するよりも優れたものである。化学合成は1回限りの応用に使用されてきており、ペプチド合成の過程は、生成物の過度の精製を回避できるほど十分に「クリーン」ではない。第二に、複合アッセイでは、各ペプチドを使用前に個々に定量化する必要がある。最後に、化学合成したQペプチドは有限の資源であるのに対し、QCAT遺伝子を繰り返し発現させることは容易である。高品質の絶対定量化は、ゲル分析に基づくものであろうと、質量分析に基づくものであろうと、比較プロテオミクスでの現在の方法に関連する困難に打ち勝つための有効な方法でありうる。特別な細胞系を対象としてそれぞれを定量化した参照QCATと比較する一連の比較試験は、個々に定量化するだけではなく、データセットが成長するにつれ、あらゆる二つ一組の比較が頑健で、個々の研究室間の輸送も可能で、時間を経ても安定であるために十分に厳密なものである必要がある。
[材料]
[15N]H4Cl(99% atom percent excess)はCK Gas Products Ltd. Hampshire, UKから提供された。ほとんどの試薬は、本明細書に一覧にしたものを除き、以前に記載されている(Doherty, Proteomics 4 (2004) 2082−2093; Pratt, Proteomics 2 (2002), 157−160)。ヒヨコ(layer, Hi−Sex Brown)骨格筋タンパク質は、1日齢および27日齢のヒヨコから、20.000gの10%(w/v)ホモジネートの上澄み液として調製した(Doherty, Proteomics 4 (2004) 2082−2093; Doherty, Proteomics 5 (2005) 5, 522−533)。
質量の単独性、イオン化および質量分析計で検出可能な傾向、特異的アミノ酸残基(ロイシンまたはバリン)の存在、他のアミノ酸残基(システイン、ヒスチジン、メチオニン)の非存在という点からQペプチドを選択した。次に、ペプチド配列を無作為にコンピュータで連結し、大腸菌で発現させるのに至適化した遺伝子およびコドンの設計に用いた。予測された転写生成物の、発現を抑えるおそれのあるRNA二次構造を分析し、もしそれが存在する場合はペプチドの順序を変更した。NおよびC末端配列を犠牲構造として付加し、発現中の外部タンパク質分解による攻撃から真のQペプチドの集合体を保護した。追加のペプチド配列を付加して、定量化のための開始剤のメチオニンおよびC末端のシステイン残基を提供した。人工遺伝子を一連の重複するオリゴヌクレオチドからデノボで合成し(Entelechon GmbH, Germany)、DNAシークエンシングによって確認し、pET21a発現ベクターのNdeIおよびHindIII部位に結合させ、QCATプラスミドのpET21a QCATを産生した。His6精製標識を融合によってベクターに付けた。
QCATプラスミドのpET21a QCATを用いて、NovaBlue(DE3)(K−12 endA1, hsdR17(rK12 -mK12 +), supE44, thi−1, recA1, gyrA96, relA1, lac, F‘[proA+B+, LaclqZ□M15 :: Tn10(TcR)]細胞にアンピシリン耐性を付与した。細胞をLuriaブロスで37℃で培養し、アンピシリン100μg/mLをA600 0.4乃至0.6に、IPTGを添加して1mMにした。培養をさらに5時間続け、細胞を遠心分離によって沈殿させ(5.000g、4分間、4℃)、10mLのpH8.0の20mM Tris/HCl緩衝液中で再懸濁し、リゾチーム(100μg/mL)を室温で10分間添加した。次に氷上で細胞に超音波処理を行い(30秒の破砕を3回)、14000gで10分間遠心分離した。誘導および非誘導培養物の沈殿物および上澄み液を、12.5%(w/v)SDS PAGE/クマシーブルー染色で分析した。15N標識のために、[15N]H4Cl(20mM)を用いて調製したM9最少培地で細胞を培養し、上述のように誘導および加工を行った。
超音波処理した細胞の沈殿物を、20mMイミダゾールおよび8M尿素を含有する20mMリン酸緩衝液(pH7.5)(緩衝液A)中に溶解し、NiNTAカラム(GE Healthcare)に塗布した。10本のカラムを同じ緩衝液中で洗浄した後、結合材料をイミダゾールの濃度を上昇させた緩衝液A(500mM)で溶出させた。この材料を、Sephadex G25スパンカラムで脱塩し、溶出したタンパク質の質量を、Waters−Micromass Q−ToFマイクロ質量分析計を用いて、エレクトロスプレーイオン化質量分析で測定した。質量スペクトルをMaxEnt Iアルゴリズムを用いて加工した。精製し脱塩したタンパク質をトリプシンで分解し、結果得られたペプチドの質量を、Waters−Micromass MALDI−ToF質量分析計を用いて測定した(Doherty, Proteomics 4 (2004) 2082−2093)。QCATの重い変異体および軽い変異体の反応比を評価するため、トリプシンによる分解およびMALDI−ToF質量分析の前に、精製した「重い」および「軽い」タンパク質を異なる比率で混合した。[14N]および[15N]ペプチドの重心スペクトル上の強度を測定した。
組織100mgに由来するニワトリ可溶性たんぱく質を含有する上澄み液画分を、[15N]QCAT 290μgと混合し、タンパク質アッセイで定量化し、トリプシンで一晩分解した。QCATは体内の筋タンパクよりも速く分解された(結果は示していない)。各時点で、3例の動物で実験を再現した。次に、[14N]−(筋)および[15N]−(QCAT)ペプチドを質量によって同定し、その相対強度をMALDI−ToF質量分析計で測定した。
この実施例における分析は、MALDI−ToF質量分析計を用いて実施したが、この方法は、ペプチド分析に好適な他のあらゆる質量分析法にも同様に適用できる。
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WO 03/102220 (Aebersold, R.)
Claims (14)
- 試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析のための人工タンパク質であって、
(a)ペプチドを分離するための開裂配列によって結合した少なくとも2つの連続ペプチドと、
(b)タンパク質の絶対量の測定のための1つのペプチドに対する単独マーカーと、
(c)ペプチドの保護のためのN末端およびC末端の延長部分とを包含し、
各ペプチドは試料、細胞または生体に含まれる個々の単独タンパク質にそれぞれ由来するものであり、各ペプチドはあらかじめ化学量論的に規定されている人工タンパク質。 - タンパク質が10乃至200個のペプチドを包含する、請求項1に記載の人工タンパク質。
- 開裂配列がプロテアーゼによって開裂される、請求項1または2に記載の人工タンパク質。
- 開裂配列がトリプシンによって開裂される、請求項1乃至3のいずれかに記載の人工タンパク質。
- 単独マーカーがシステイン残基である、請求項1乃至4のいずれかに記載の人工タンパク質。
- 1つ以上のペプチドが少なくとも1回以上同一反復して、すべてのペプチド配列間で特殊な化学量論を達成できるようにする、請求項1乃至5のいずれかに記載の人工タンパク質。
- タンパク質がタンパク質の精製のための親和性タグを包含する、請求項1乃至6のいずれかに記載の人工タンパク質。
- タンパク質が同位体で標識される、請求項1乃至7のいずれかに記載の人工タンパク質。
- 各ペプチドが3乃至40個のアミノ酸を包含する、請求項1乃至8のいずれかに記載の人工タンパク質。
- ペプチドがタンパク質の種々の配座、代謝または変化状態を表す、請求項1乃至9のいずれかに記載の人工タンパク質。
- ペプチドが規定された分子量分布および定量化比を有する、請求項1乃至10のいずれかに記載の人工タンパク質。
- 請求項1乃至11のいずれかに記載の人工タンパク質をコードする核酸を包含するベクター。
- 請求項12のベクターおよび/または請求項1乃至11のいずれかに記載人工タンパク質を包含するキット。
- 試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析法であって、
(a)絶対的な方法で単独マーカーを含有するタンパク質または1個のペプチドの量を定量化する段階と、
(b)定量化するタンパク質の調剤を生成する段階と、
(c)段階(a)及び(b)の生成物を混合する段階と、
(d)請求項1乃至10の何れかに記載の人工タンパク質および段階(b)の定量化対象のタンパク質を、開裂配列において完全に開裂する段階と、
(e)ペプチドを定量化する段階、
(f)ペプチドの絶対量を算出する段階とを包含し、
そのなかで人工タンパク質および/またはペプチドが同位体で標識されている、試料、細胞または生体のプロテオームの定量化分析法。
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