WO2003031983A2

WO2003031983A2 - Verfahren zum nachweis von aminosäuren

Info

Publication number: WO2003031983A2
Application number: PCT/EP2002/011255
Authority: WO
Inventors: Christian Wurzel; Ralf KRÜGER; Christoph Radcke; Michael Karas
Original assignee: Consequence Gmbh
Priority date: 2001-10-08
Filing date: 2002-10-08
Publication date: 2003-04-17
Also published as: DE10149583A1; WO2003031983A3; AU2002346974A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalzen zum Nachweisen und/oder Identifizieren einer Aminosäure, insbesondere einer α-Aminosäure. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung von 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalzen im Rahmen des Edman-Abbaus.

Description

Verfahren zum Nachweis von Aminosäuren

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalzen sowie Verfahren zum Nachweis und/oder Identifizieren von Aminosäuren.

Die Sequenzanalyse von Polypeptiden und Proteinen ist für die moderne Biotechnologie von zentraler Bedeutung. Obgleich mit zunehmender Kenntnis des Genoms von verschiedenen Organismen, einschließlich des Menschen, die Aminosäuresequenzen von Polypeptiden und Proteinen auf der Grundlage der Nukleinsäuresequenz vorhergesagt werden können, kommt der Polypeptidsequenzanalyse immer noch insoweit eine zentrale Bedeutung zu, als dass ausgehend von einer vorliegenden Probe die darin enthaltenen Polypeptide sequenziert oder zumindest ansequenziert werden müssen, um auf der Grundlage des ansequenzierten N-Terminus des Polypeptids eine Sonde zu konzipieren, die dann für das Screenen der Nukleinsäuren unter Rückgriff auf den umfangreichen Nukleinsäuredatenbestand, sei es in vivo, in vitro oder in silico, verwendet wird, um die mutmaßliche Gesamtnukleinsäuresequenz und damit auch die Gesamtsequenz des Proteins zu bestimmen.

Daneben besteht nach wie vor der Bedarf und die Notwendigkeit, Polypeptide oder Proteine zu sequenzieren, insbesondere dann, beispielsweise bei dem Aufsuchen von individuenspezifischen Abweichungen von der erwarteten oder in einer Population besonders verbreiteten Sequenz. Allgemein wird die Proteinanalyse in der jüngeren Zeit in der sogenannten Proteomanalyse verstärkt angewandt [1 Kahn, 1995]. Hierbei werden die Gesamtheit oder Teile, z.B. die Kernfraktion, der exprimierten Proteine eines Organismus oder eines Zelltypes zu einer bestimmten Wachstumsphase, unter dem Einfluss von Medikamenten oder in krankhaft verändertem Zustand untersucht. Die Proteine werden mit bekannten Verfahren, zum Beispiel der zwei dimensionalen Gelelektrophorese [2 Klose 1995], aufgetrennt und die Proteine mit geeigneten Färbemethoden im Gel sichtbar gemacht. Unterschiede im Proteinmuster zeigen sich beispielsweise zwischen den Wachstumsphasen oder bei krankhafter Veränderung. Es gilt hierbei z.B. die Proteine zu identifizieren, die eine unterschiedliche Expressionsrate aufweisen oder durch die krankhaften Veränderungen in der Zelle modifiziert werden [3 Brockstedt 1998]. Ein erstes Verfahren zur Sequenzanalyse von Polypeptiden stellt das Verfahren von Sanger dar, bei dem l-Fluor-2,4-dinitrobenzol zur Markierung N-terminaler Aminosäuren verwendet wurde. Nach vollständiger hydrolytischer Zerlegung des Proteins in einzelne Aminosäuren wurde die markierte (terminale) Aminosäure über chromatographische Techniken identifiziert. Dieses Verfahren war insbesondere bei größeren Peptiden mit Nachteilen verbunden, die daraus resultierten, dass die Polypeptide über partielle Hydrolyse oder enzymatischen Verdau in kleine Fragmente zerlegt und dann jeweils die N- terminale und C-terminale Aminosäure der Fragmente bestimmt und zusätzlich die Aminosäurezusammensetzung mittels Aminosäureanalyse ermittelt werden musste.

Ein gegenüber dem Sanger- Verfahren deutlich mit Vorteilen verbundenes Verfahren stellt der sog. Edman-Abbau dar, bei dem im Rahmen einer zyklischen Reaktion die jeweils N-terminale Aminosäure einer Peptidkette nach der anderen abgespalten wird [4 Edman 1950]. Im Rahmen des Edman-Abbaus wird unter basischen Bedingungen Phenylisothiocyanat an den Aminoterminus der Polypeptidkette angekuppelt. Es bildet sich ein Phenylthiocarbamyl- Polypeptid (PTC-Polypeptid). Im zweiten Schritt wird die endständige derivatisierte Aminosäure selektiv mit Hilfe von wasserfreier Säure, z.B. Trifluoressigsäure, abgespalten und dabei in das Anilinothiazolinon-Derivat (ATZ-Derivat) der Aminosäure umgewandelt. Im folgenden wird die solchermaßen derivatisierte AS extrahiert und mit Hilfe von wässriger Säure in das stabilere Phenylthiohydantoin-Derivat (PTH-Derivat) der Aminosäure isomerisiert. Das PTH-Derivat der Aminosäure wird in den heutzutage verfügbaren Sequenzierautomaten anschließend automatisch in ^"ein Hochdruckflüssigchromatographie-System injiziert. Hier erfolgt die Auftrennung der Aminosäuren nach ihrer Retentionszeit. Die Detektion erfolgt durch UV-Absorption. Der beschriebene Ablauf wird zyklisch wiederholt, so dass sukzessive die Primärstruktur der Polypeptidkette analysiert werden kann.

Für die Analyse und die Identifikation des Polypeptids sind die Umsatzraten der einzelnen Teilschritte, z.B. Kupplung, Abspaltung oder Extraktion des sog. Edman-Abbaus, von entscheidender Bedeutung. Für den Gesamtprozess sollte dabei eine möglichst hohe Umsatzrate, bevorzugterweise von über 90% und bevorzugtererweise von über 95% erreicht werden, um eine Vielzahl von Abbaustufen eindeutig identifizieren zu können. Bei geringeren Umsatzraten führt der unvollständige Abbau dazu, dass in den darauf folgenden Abbauschritten die nun abgespaltene Aminosäure durch den Hintergrund der Aminosäuren aus dem vorhergehenden Schritten überlagert wird, dem sogenannten Overlap, so dass die Sequenz nicht mehr eindeutig identifizierbar ist. Ein Überblick über die Proteinsequenzierung findet sich in [5,6].

Das Verfahren wurde bis zur Einführung von Sequenzierautomaten durch Edman und Begg im Jahre 1967 [7 Edman 1967] manuell durchgeführt. Im Laufe der Jahre wurden mannigfaltige technische Verbesserungen an den Automaten vorgenommen. Hervorzuheben sind die Einführung von totvolumenfreien Ventilsystemen [8 Wittmann-Liebold 1973], mit denen die einzelnen Reagenzien und Lösemittel im Automaten unter Luftabschluss und ohne dass Flüssigkeitsreste in den Leitungen verbleiben, dosiert werden. Mit der On-line-Konvertierung [9 Wittmann-Liebold 1976] und der On-line Injektion [9 Wittmann-Liebold 1985] konnte der gesamte chemische Prozess und nicht nur ein Teil davon vollständig automatisiert werden. Hiermit konnten Verluste durch manuelle Handhabung minimiert und auch die sauerstoffempfindliche Konvertierung vollständig unter Luftabschluss durchgeführt werden, was zu insgesamt höheren Umsatzraten führte. Mit der Entwicklung der Reaktorcartridge und der damit verbundenen Einführung der Gasphasen-Sequenzierung, bei der einige Reagenzien gasförmig dosiert werden [11 Hewick 1981], gelang es die Nebenprodukte der Reaktion zu verringern und damit die Analyse empfindlicher durchzuführen. Alle technischen Verbesserungen hatten letztlich das Ziel, die Empfindlichkeit der Analyse zu erhöhen. So waren anfänglich Mikromolmengen eines gereinigten Proteins für eine erfolgreiche Analyse erforderlich. Inzwischen werden routinemäßig Analysen im Bereich von einem Picomol durchgeführt. Der eigentliche chemische Prozess blieb über die Jahre jedoch nahezu unverändert.

Für die Identifizierung und Charakterisierung von Proteinen und Peptiden mittels Edman- Abbau werden derzeit in Proteinsequenzierautomaten, wie beispielsweise das Gerät „Procise cLc" der Firma Applied Biosystems, Foster City, USA, oder das Gerät „Knauer 910" der Firma Knauer Wissenschaftlicher Gerätebau, Berlin, verwendet. (Technische Beschreibung der Geräte befinden sich in den jeweiligen Bedienungsanleitungen [12, 13]).

Die Geräte unterscheiden sich in der technischen Ausführung geringfügig. Gemein ist beiden Geräten, dass die Reagenzien und Lösemittel in einer Flaschenbatterie enthalten sind. Über ein Ventilsystem werden diese unter Luftabschluss in die Reaktorkammer und die Konverterkammer dosiert. Beide Geräte identifizieren die abgespaltene Aminosäure mit einem Flüssigchromatographen mit UV-Detektion. Die Geräte unterscheiden sich auch geringfügig in der Verwendung einzelner Reagenzien oder Lösemittel. Die Anwendung der Methode „Edman- Sequenzierung" oder Edman-Abbau mit dem „Edman-Reagenz" Phenylisothiocyanat als Standardmethode ist nicht nur diesen Vorrichtungen, sondern praktisch allen derzeit auf dem Markt befindlichen Geräten gemein. Es existiert jedoch eine Vielzahl von kleinen Verfahrensvarianten. Die Geräte sind weiterhin so ausgelegt, das der Benutzer Änderungen im Prozess nach eigenen Vorstellungen vornehmen kann, wie beispielsweise andere Lösemittel verwenden kann. Die Bezeichnungen Feuchtphasen-Sequenzierung (Knauer) oder Gasphase- und Pulsed-Liquid-Sequencing (Applied Biosystems) bedeuten, dass einzelne Reagenzien als Flüssigkeitstropfen, als feiner Sprühnebel oder gasförmig dosiert werden. Hierbei können für die verschiedenen Reagenzien im Prozeß auch unterschiedliche Dosierungsarten kombiniert werden. Gemein ist den Verfahren, dass das Protein in einer Reaktorkammer auf geeigneten Membranen nonkovalent, z.B. über hydrophobe Wechselwirkungen, immobilisiert wird und die Reagenzien in den Reaktor dosiert werden. Die Bindung des Proteins an die Membran wird durch einige Reagenzien gelöst bzw. gelockert, so dass eine ungünstige Prozessführung zu einem Auswaschen des Proteines führt und damit die Empfindlichkeit herabgesetzt wird bzw. die Weiterführung der Analyse unmöglich wird. Die Hersteller haben mit den einzelnen Dosierungsarten die chemische Reaktion auf hohe Umsatzraten und geringes Auswaschen optimiert. Prinzipiell können alle Sequenzierungsverfahren mit kleinen Änderungen an den Geräten durchgeführt werden. Es kann auch die Flüssigphasensequenzierung oder die Festphasensequenzierung, bei der das Protein kovalent an Trägermaterial gebunden wird, wenngleich mit Einschränkungen, durchgeführt werden.

Der Ablauf einer Proteinsequenzierung in einem Automaten verläuft im allgemeinen folgendermaßen. Das Protein wird in einem geeigneten Lösemittel aufgenommen und auf einen Filter aufgebracht. Dieser Filter besteht beispielsweise aus PVDF (Polyvinylidenfluorid) (Sequelon-Membran, Millipore, USA) oder aus vorbehandelter Glasfaser (Applied Biosystems, USA). Das Protein bindet nicht kovalent, z.B. über hydrophobe Wechselwirkungen, so dass es auf dem Filter bzw. der Membran immobilisiert ist. Das Filter bzw. die Membran mit dem Protein wird in eine Reaktorkammer eingebracht. Im Anschluss werden die Reagenzien und Lösemittel dosiert. Prinzipiell wird dabei erst eine Base (z.B. 6% Trimethylamin in Ethanol Wasser (1:1)) dosiert. Anschließend wird 5% Phenylisothiocyanat in Heptan und wieder Trimethylamin dosiert. In der Reaktorkammer findet die Kupplungsreaktion statt (ca. 20 min bei 45°C). Die überschüssigen Reagenzien werden mit einem organischen Lösemittel (beispielsweise Ethylacetat, Heptan, Butylchlorid) ausgewaschen. In die Reaktorkammer wird wasserfreie Säure (z.B. 100% Trifluoressigsäure) dosiert und es erfolgt die Abspaltung der endständigen Aminosäure. Die Extraktion der abgespaltenen derivatisierten Aminosäure wird mit einem organischen Lösemittel (z.B. Butylchlorid, Ethylacetat) durchgeführt. Hierbei wird das Lösemittel durch den Reaktor gespült und in dem Konverter in einem kleinen Behältnis wie einem Fläschchen aufgefangen. Im Reaktor steht das um eine Aminosäure verkürzte Protein für den nächsten Abbauschritt zur Verfügung. In den Konverter wird eine wässrige Säure (z.B. 25 % Trifluoressigsäure in Wasser) dosiert. Die Isomerisierungsreaktion findet bei ca. 55°C für 30 min statt. Anschließend wird das Reagenz getrocknet und in einem geeigneten Lösemittel (z.B. 20% Acetonitril in Wasser) wiederaufgenommen und über ein Injektionsventil mit sechs Anschlüssen in das HPLC System injiziert. Der Konverter ist damit bereit für die Aufnahme der zwischenzeitlich abgespaltenen Aminosäure und der Prozess wird zyklisch wiederholt. In dem gesamten Prozess sind eine Vielzahl weiterer Trocknungs-, Misch- oder Reinigungschritten für die Analyse vonnöten. Eine vollständige Beschreibung findet sich in den jeweiligen Gerätedokumentationen [12, 13].

Wie in der ursprünglichen Publikation von Edman [4] beschrieben, wird auch heute noch Phenylisothiocyanat als Kupplungsreagenz verwendet. Allerdings gab es in der Vergangenheit mannigfaltige Versuche diese Reagenz zu ersetzen, um eine höhere Empfindlichkeit der Analyse zu erreichen. Zu nennen sind hierbei zum Beispiel der Einsatz von 4-N.N- dimethylaminoazobenzene 4'-isothiocyanat [14 Chang, 1978], einem fluoreszierenden Isothiocyanat, oder der Einsatz von 311-PITC das von Aebersold und Mitarbeitern für die sensitive massenspektrometrische Detektion entwickelt wurde [15 Hess 1995].

Die Bemühungen, ein alternatives Edman-Reagenz bereitzustellen, dem ein kommerzieller Erfolg beschert ist oder das sich in der Anwendung durchgesetzt hätte, war allerdings bis zum heutigen Tage erfolglos.

In der Vergangenheit gab es auch einige Untersuchungen mit dem Ziel, eine Derivatisierung der abgespaltenen Aminosäure durchzuführen. Zu nennen sind hier der Ansatz von Tsugita [16], bei dem die im Prozess abgespaltene Anilinothiazolinonaminosäure einer Aminolyse unterzogen wird. Hierbei konnte gezeigt werden, dass bei einzelnen Aminosäuren die Addition eines fluoreszierenden Aminderivates, z.B. Aminofluoreszein, gelingen kann. Allerdings konnte diese Reaktion nicht bei allen abgespaltenen Aminosäurederivaten gezeigt werden, so dass die eindeutige und hochempfindliche Identifizierung von Proteinen nicht gelang. Aufbauend auf diesen Arbeiten schlug Farns worth [17] einen Prozess vor, in dem die abgespaltene derivatisierte Aminosäure über den Zwischenschritt der Phenylthiocarbamyl- Aminosäure zur Phenylthiohydantoin-Aminosäure konvertiert wird und anschließend die Phenylthiohydantoin-Aminosäure in die Anilinothiazolinonform isomerisiert wird, um anschließend mit der Aminosäure eine Aminolyse durchzuführen. Dieser aufwendige Prozeß führt dazu, dass zum einen durch Verluste in den manigfaltigen Reaktionsschritten und durch die harschen Reaktionsbedingungen die Ausbeuten einiger Aminosäuren sehr gering sind, was wiederum einen zuverlässigen Nachweis bei der Sequenzanalyse von Peptiden und Proteinen ausschließt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Mittel bereitzustellen, welches erlaubt, den Nachweis bzw. Identifizierung von Aminosäuren empfindlicher zu gestalten. In einem weitern Aspekt liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, einen modifizierten Edman- Abbau zur Verfügung zu stellen, bei dem in Folge der erhöhten Empfindlichkeit des Nachweises der einzelnen, zyklisch abgespaltenen Aminosäure von einem zu analysierenden Polypeptid derartige Polypeptide mit einem geringeren Aufwand an Aufreinigungsschritten oder Konzentrierungsschritten sequenziert werden können, zumindest aber die Menge an erforderlichem Polypeptid für die Bestimmung der Aminosäuresequenz verringert ist.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe in einem ersten Aspekt gelöst durch die Verwendung von 2- Halogen-N-Alkylpyridiniumsalzen zum Nachweis und/oder Identifizieren einer Aminosäure, insbesondere einer α-Aminosäure.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, das Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluor, Chlor Brom und Jod umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass der Alkyl-Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-Propyl, prim. Butyl, sek. Butyl und tert Butyl umfasst.

In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz ein Salz ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Halogenide, insbesondere Jod, Brom, Chlor und Fluor umfasst, oder ein Tosylat ist . In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz 2-Chlor-l-Methyl-pyridiniumiodid ist.

In einer besonders bevorzugten alternativen Ausführungsform ist vorgesehen, dass das 2- Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz 2-Fluor- 1 -Methyl-pyridiniumiodid ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure ein Aminosäure-Derivat ist.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure oder das Aminosäure- Derivat mindestens ein S-Atom umfasst oder enthält.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz mit dem S-Atom des Aminosäure-Derivates reagiert.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Aminosäure-Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe, die Phenylthiohydantoinderivate einer Aminosäure, Anilinothiazolinon-Derivate einer Aminosäure und Phenylthiocarbamoyl-Derivate einer Aminosäure umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure ein Produkt eines Edman-Abbaus ist.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Reaktions- oder Additionsprodukt aus einem 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz und einer Aminosäure, insbesondere einem Aminosäurederivat. Hinsichtlich der Ausgestaltung des 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalzes gelten die hierin gemachten Ausführungen auch für diesen Aspekt der Erfindung.

In einem dritten Aspekt wir schließlich die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Nachweis und/oder Identifizieren einer Aminosäure umfassend die Schritte - Bereitstellen einer Aminosäure und/oder einer eine Aminosäure umfassenden Lösung,

- Umsetzen der Aminosäure mit einem 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz unter Bildung eines Reaktionsproduktes; und

- Nachweisen des Reaktionsproduktes.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure als Aminosäure-Derivat vorliegt,

In einer bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure das Produkt eines Edman-Abbaus ist.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Aminosäure oder das Aminosäure-Derivat ein S-Atom enthält, wobei besonders bevorzugt ist, dass die Reaktion des 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalzes am S-Atom erfolgt.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Reaktion unter zumindest einer der folgenden Reaktionsbedingungen durchgeführt wird:

Verwenden eines organischen Lösungsmittels zur Durchführung der Reaktion und/oder Durchführen der Reaktion unter Zugabe von Wasser; Verwenden eines pH- Wertes zwischen etwa 6,5 und 9; und/oder Verwenden einer Temperatur von zwischen 10°C und 80°C.

In einer Ausführungsform ist vorgesehen, dass dem Reaktionsansatz aus Aminosäure oder Aminosäure-Derivat und 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz ein Amin, bevorzugter Weise ein primäres Amin zugesetzt wird.

In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das primäre Amin die Struktur H₂N-R aufweist, wobei R eine fluoreszierende Verbindung ist oder eine Verbindung, die eine stationäre Ladung enthält, oder ein Rest, der mittels massenspektrometrischer Verfahren gut detektierbar ist. In einer noch weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Reaktionsprodukt weiter derivatisiert wird.

Schließlich ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass das Reaktionsprodukt weiter aufgearbeitet wird, wobei bevorzugter Weise ein Aufarbeitungsverfahren verwendet wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Flüssig-Flüssig-Extraktion, Fest-Flüssig-Extraktion, chromatographische und elektrophoretische Auftrennung umfasst.

In einer Ausführungsform ist auch vorgesehen, dass das Reaktionsprodukt nachgewiesen und/oder identifiziert wird durch ein Nachweis- oder Identifizierungsverfahren, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Massenspektroskopie und Fluoreszenzmessung umfasst.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass das Nachweis- und/oder Identifizierungsverfahren MALDI-Massenspektroskopie ist.

In einem vierten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch einen modifizierten Edman-Abbau, bei dem der Nachweis- oder Identifizierungsschritt gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis und/oder Identifizieren einer Aminosäure erfolgt.

In einer bevorzugten Ausführungsform sieht der Edman-Abbau dabei die folgenden Schritte vor:

1. Bereitstellen eines zu sequenzierenden Polypeptids oder Proteins,

2. Umsetzen des Polypeptids oder Proteins mit einem Kupplungsreagenz wie Phenylisothiocyanat;

3. Abspalten der endständig durch das Kupplungsreagenz derivatisierten Aminosäure;

4. Detektion der abgespaltenen endständig derivatisierten Aminosäure; und

5. optional zyklisches Wiederholen der Schritte 2, 3 und 4.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, dass durch eine Derivatisierung einer Aminosäure und insbesondere eines im Rahmen eines Edman-Abbaus anfallenden Aminosäurederivates, wie beispielsweise einem Phenylthiohydantoin-, Phenylthiocarbamoyl- oder Anilinothiazolinon-Derivat einer Aminosäure, durch Umsetzen mit einem 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz ein Reaktionsprodukt erzeugt werden kann, welches hochspezifisch und hochempfindlich nachgewiesen werden kann, beispielsweise durch Massenspektroskopie und insbesondere durch MALDI Massenspektroskopie. Bei der MALDI- Massenspektroskopie wird die derivatisierte Aminosäure zusammen mit einer sogenannten Matrixsubstanz, beispielsweise 2,5 Dihydroxybenzoesäure, in einem geeigneten Lösemittel auf einen Träger aufgetragen. Das Lösemittel wird verdampft und die Probe kristallisiert mit dem Probemolekülen, im vorliegenden Falle mit dem Aminosäurederivat. Die getrocknete Probe auf dem Träger wird in ein Massenspektrometer verbracht. Hier erfolgt durch einen Laserpuls auf die Probe eine Desorption und Ionisation der Probenmoleküle. Die Moleküle werden in einem Hochspannungsfeld beschleunigt und anschließend in einer feldfreien Flugstrecke aufgrund ihres Verhältnisses von Masse zu Ladung durch ihre unterschiedliche kinetische Energie aufgetrennt und können an einem geeigneten Detektor detektiert werden (sogenannte Time of Flight Detektion (weiterführende Erläuterungen finden sich beispielsweise in [18, 6])).

Es ist auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, an Stelle des vorstehend beschriebenen 2- Halogen-N-Alkylpyridiniumsalzes solche Verbindungen auszuwählen, wodurch letzten Endes ausgehend von einem Aminosäurederivat, wie beispielsweise den vorstehend erwähnten Aminosäure-Derivaten, ein Guanidiniumion oder eine andere geladene oder stark basische Verbindung erzeugt wird. Derartige Verbindungen können beispielsweise durch die nachfolgenden Reaktionen erzeugt werden, wobei die folgenden Abkürzungen verwendet werden:

Halogenalkylpyridiniumsalz HAPS

Alkylpyridinium (Ion) AP

Alkylpyridinium mit Schwefel angelagert AP-S

Dervatisierte Aminosäure DAS

Derivatisierte Aminosäure mit abgespaltenem Schwefel DA

Wasseranlagerung -H20

Amin / nukleophile Reagenz ANR

Reaktion 1:

HAPS + DAS -> AP-DAS Komplex (+Halogensäure (HC1))

Der Komplex kann direkt detektiert und damit das Produkt nachgewiesen werden Reaktion 2 (Nachweis im Massenspektrometer ist möglich)

2 HAPS + DAS +H2O -> di-AP-DAS

-> di-AP-DAS-H20

-> AP-DAS-H2O

-> AP-DA

-> AP-DA-H20

Reaktion 3 (Zugabe von primärem Amin; Produkte aus 1 und 2 sind nachweisbar)

HAPS + DAS +H2O+ANR -> AP-DAS-H2O-ANR

-> AP-DA-H2O-ANR

-> DA-H2O-ANR

-> DA-ANR

Wie aus den vorstehenden Reaktionen ersichtlich kommt es bei Reaktion 1 zu einer direkten Anlagerung von HAPS an die derivatisierte Aminosäure, bei Reaktion 2 zu einer Anlagerung von ein oder zwei AP mit oder ohne Abspaltung von Schwefel, mit oder ohne Anlagerung von Wasser, und bei Reaktion 3 unter Zugabe von primärem Amin zu einer Anlagerung von AP und / oder Amin mit oder ohne Abspaltung von Schwefel, mit oder ohne Anlagerung von Wasser.

Ohne im Folgenden darauf festgelegt sein zu wollen, scheint in dem Falle, dass die Aminosäure eine derivatisierte Aminosäure darstellt und die Derivatisierung dergestalt vorliegt, dass ein Schwefelatom in dem Derivat enthalten ist, wie dies beispielsweise bei Phenylthiohydantoin- Derivaten von Aminosäuren der Fall ist, die Derivatisierung unter Verwendung des 2-Halogen- N-Alkypyridiniumsalzes typischerweise am Schwefel zu erfolgen und stellt somit einen neuen, auf einem gegenüber dem Stand der Technik verschiedenen chemischen Reaktionsweg beruhenden Nachweis von Aminosäuren dar.

Obgleich 2-Chlor-l-Methyl-pyridiniumiodid und 2-Fluor- 1- Methyl-pyridiniumiodid die bevorzugten 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalze sind, können auch andere Halogen-N- Alkylpyridiniumsalze verwendet werden. Die einzelnen, diese Verbindung aufbauenden Reste, d. h. der Halogen-Rest, der Alkyl-Rest sowie die Art. des Salzes können aus den folgenden Einzelelementen oder Resten beliebig kombiniert werden. Der Halogen-Rest kann ausgewählt sein aus der Gruppe, die Fluor, Chlor, Brom und Jod umfasst. Der Alkyl-Rest kann dabei eine Kohlenstoffkette von - C₄ und bevorzugterweise Ci - C₂ sein. Hierbei können die Alkylreste geradkettzige oder verzweigt-kettige Kohlenstoffketten sein. Darüber hinaus ist es im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass ein oder mehrere der Kohlenstoffatome einfach oder mehrfach substituiert sind. Diese Substitution kann beispielsweise durch OH-Gruppen, F-Gruppen oder NH₂-Gruppen erfolgen.

Die Salze liegen bevorzugterweise als Halogenide vor. Jedoch ist es auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Salze solche von z.B. Toluensulfonsäure oder weiteren organischen oder anorganischen Säuren sind. Die Umsetzung der Aminosäure mit dem 2- Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz erfolgt bevorzugterweise unter Luft- und insbesondere Sauerstoffabschluss. Bevorzugterweise wird ein organisches Lösungsmittel, wie beispielsweise Acetonitril, verwendet. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Lösung eine Base, vorzugsweise eine Stickstoffbase und bevorzugtererweise Triethylamin enthält. Als geeignete Schutzatmosphäre wird eine Stickstoff- oder Argon-Atmosphäre verwendet. Die Reaktion erfolgt bevorzugterweise bei Raumtemperatur.

Wird als mit dem 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz umzusetzende Aminosäure ein Aminosäurederivat und insbesondere das Phenylthiohydantoin-Derivat der Aminosäure eingesetzt, wie es beispielsweise im Rahmen des Edman-Abbaus erhalten wird, kann das Reaktionsprodukt aus besagtem 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz und der Aminosäure bzw. dessen Derivat hochempfindlich nachgewiesen werden. Als besonders geeignetes Nachweisverfahren hat sich dabei die Massenspektrometrie und insbesondere die MALDI- Massenspektrometrie erwiesen. Das besagte Reaktionsprodukt führte dabei zu Massenpeaks, die der Masse des Phenylthiohydantoin-Derivates der jeweiligen Aminosäure entsprechen. Zusätzliche Peaks sind ebenfalls vorhanden, die eindeutig mit der jeweiligen Aminosäure korreliert werden können. Auf der Grundlage dieser Zuordnung ist somit die Identifizierung und damit letzten Endes auch der Nachweis einer entsprechenden Aminosäure, wie sie beispielsweise in einer Probe oder als Reaktionsprodukt eines Edman-Abbaus vorliegt, möglich.

Neben der unmittelbaren Umsetzung des 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalzes mit der Aminosäure bzw. einer Lösung, die mutmaßlich eine Aminosäure enthält, ist in einer weiteren Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgesehen, dass dem Reaktionsansatz zusätzlich ein Amin, bevorzugterweise ein primäres Amin, oder eine andere nukleophile Verbindung zugegeben wird. Das primäre Amin ist dabei bevorzugterweise ein solches der Form H₂N-R, wobei R eine fluoreszierende Verbindung wie beispielsweise Fluoreszein oder Rhodamin oder Rosaminderivate sein können. In einer weiteren Anwendung stellt R eine Verbindung dar, die hochempfindlich mit massenspektrometrischen Methoden dargestellt werden kann. Derartige Reste können beispielsweise sein ein Guanidiniumrest, ein Pyridiniumrest, ein Tritylammoniumrest oder Arginin. Weitere geeignete Reste R sind beispielsweise jene, die eine stationäre Ladung enthalten.

Die alternativ zu dem primären Amin zu verwendende nukleophile Verbindung ist eine solche, die ein freies Elektronenpaar aufweist und damit eine nukleophile Substitutionsreaktion ablaufen kann.

Bei dieser Art der Reaktionsführung wird derzeit davon ausgegangen, dass 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz die funktionellen Gruppen der Aminosäure bzw. des Aminosäurederivates aktiviert, beispielsweise Thioharnstoff- oder Carbonsäurefunktionen. Diese Aktivierung ermöglicht dann die Substitution / Anlagerung des primären Amins unter Abspaltung der Aktivierungsreagenz. Dabei können Teile der aktivierten Gruppe, beispielsweise ein Schwefelatom, mit abgespalten werden. Das entsprechende Amin wird so ausgewählt, dass ein hochempfindlicher Nachweis, beispielsweise unter Verwendung von massenspektrometrischen Detektionsverfahren oder Fluoreszenzmessung, ermöglicht wird.

In ^"einer weiteren Ausführungsform liegt das Aminosäurederivat als Phenylthiocarbamoyl- Derivat vor. Dies kann beispielsweise im Rahmen des Edman-Abbaus leicht durch entsprechende Ausgestaltung erreicht werden, indem die abgespaltene Aminosäre mit einer Base vermischt wird oder in neutraler, wässriger Lösung aufgefangen wird. Ausgehend von diesem Aminosäure-Derivat erfolgt unter dem Einfluss von 2-N-Alkylpyridiniumsalzen eine Aktivierung des Carboxyterminus oder des Schwefels und erlaubt die direkte Messung des solchermaßen erhaltenen Reaktionsproduktes. Auch hier ist, wie vorstehend im Zusammenhang mit den Phenylthiohydantoin-Aminosäurederivaten beschrieben, eine weitergehende Umsetzung mit einem primären Amin oder einem anderen nukleophilen Reagens möglich.

Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass wenn immer die Verwendung einer Aminosäure in einer der erfindungsgemäßen Verwendungen oder Verfahren vorgesehen ist, diese ersetzt sein kann durch ein Aminosäurederivat, insbesondere durch die hierin beschriebenen Aminosäure-Derivate.

Das erhaltene Reaktionsprodukt kann entweder direkt den vorstehend beschriebenen Analyseverfahren, wie Massenspektrometrie und insbesondere MALDI-Massenspektrometrie, zugeführt werden. Darüber hinaus ist ggf. eine weitere Aufarbeitung durch Flüssig-Flüssig- Extraktion, Fest-Flüssig-Extraktion, chromatographische oder elektrophoretische Auftrennung möglich. Diese Aufarbeitung erlaubt, dass das Derivat von Nebenprodukten oder im Überschuss zugegebenen Reagenzien abgetrennt werden kann und somit eine empfindlichere Messung möglich wird. Vor oder nach dieser Auftrennung kann eine Weiterderivatisierung erfolgen. Unabhängig davon, welche der weiteren Derivatisierungen oder Aufreinigungsschritte erfolgt, kann die Detektion durch Massenspektrometrie oder Fluoreszenzmessung erfolgen.

Die hierin offenbarte weitere Derivatisierung kann dabei zu verschiedenen Zeitpunkten während der Reaktion erfolgen. So ist in einer Ausführungsform vorgesehen, dass die Derivatisierung nach dem Umsetzen des 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz aber vor der Aufreinigung erfolgt. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, dass die Derivatisierung vor der Aufreinigung erfolgt. Des weiteren ist vorgesehen, dass die Derivatisierung vor oder nach dem Umsetzen mit dem primären Amin erfolgt.

Die weitere Derivatisierung kann beispielsweise durch ein bifunktionales Reagenz erfolgen, das zum einen eine nukleophile Gruppe wie beispielsweise ein primäres Amin enthält, an das die Aminosäure oder deren Derivat addiert, und weiterhin eine zweite - im wesentlichen beliebige - Gruppe enthält, die sich in geeigneter Weise, insbesondere für Nachweiszwecke oder Identifizierungszwecke, derivatisieren lässt. Ein Beispiel hierfür stellt eine weitere Aminofunktion dar, die mit einem Isothiocyanat zur Reaktion gebracht werden kann. Ggf. kann die zweite Gruppe bereits selbst für die Nachweis- oder Identifizierung geeignet sein.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Zeichnungen und Beispiele weiter erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Ausführungsformen und Vorteile der Erfindung ergeben. Dabei zeigt Fig. 1 die Strukturformel von 2-Chlor-l-Methyl-pyridiniumiodid;

Fig. 2 ein Massenspektrum des Reaktionsproduktes aus der Reaktion PTH-Leu + HAPS

+ Wasser + Amin (Arginin);

Fig. 3 ein Massenspektrum des Reaktionsproduktes aus der Reaktion PTH-Leu + HAPS

+ Amin (Arginin);

Fig. 4 ein Massenspektrum des Reaktionsproduktes aus der Reaktion PTH-Phe + HAPS

+ Wasser + Amin (Arginin);

Fig. 5 ein Massenspektrum des Reaktionsproduktes aus der Reaktion PTH-Phe + HAPS;

Fig. 6 ein Massenspektrum des Reaktionsproduktes aus der Reaktion PTH-Leu + HAPS

+ Amin (Aminofiuoreszein);

Fig. 7 ein Massenspektrum des Reaktionsproduktes aus der Reaktion PTH-Phe + HAPS

+ Wasser; und

Fig. 8 ein Massenspektrum des Reaktionsansatzes aus der Reaktion PTH-Val + HAPS.

Für die im folgenden beschriebenen Beispiele wurden die folgenden Lösungen verwendet:

1 mM (1 nmol/μl) PTH-AA in Acetonitril (ACN) primäres Amin (Anilin, Aminofloureszein, oder Arginin) in 50% ACN / Wasser oder in

100% ACN verdünnt (1 nmol/μl)

Triethylamin (TEA) 7,2 M (7,2 μmol/μl); 1:72 in ACN verdünnt (200 nmol/μl)

157 mM 2-Chlor-l-Methyl-ρyridiniumiodid in ACN (4 mg/100 μl), sofort mit N₂ bubbeln; 2:157 (10+780) in ACN verdünnt (2 nmol/ l) sofort mit N₂ begasen

Diethylether

TFA (Triflouressigsäure) Beispiel 1: Umsetzung einer Aminosäure unter Verwendung von 2-Chlor-l-Methyl- pyridiniumiodid unter Zusatz von primären Aminen

Folgender Reaktionsansatz wurde gewählt:

10 μ\ Lösung 1 (10 nmol) wurden mit 60 μl Lösung 2 (60 nmol) und 30 μl Lösung 4 (6 mmol) vereinigt, gemischt und mit Stickstoff begast. 100 μl Lösung 4 (200 nmol), die ebenfalls mit Stickstoff begast wurden, wurden hinzugegeben, zwei Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt, nochmals gemischt und anschließend unter Verwendung einer Gefriertrocknungsanlage (Speed-Vac) getrocknet.

Die Analyse ergab, dass alle getesteten Phenylthiohydantoin- Aminosäurederivate von Leucin, Phenylalanin, Methionin, Arginin, Asparagin, Isoleucm, Valin und Alanin umgesetzt und einzeln nachgewiesen werden konnten. Als primäre Amine wurden Anilin, Aminofluorescein und Arginin getestet, wobei die besten Reaktionsergebnisse bei Verwendung von Arginin erhalten wurden. Alle der vorstehend genannten Amine eignen sich grundsätzlich für die Verwendung in den erfindungsgemäßen Verfahren. Weiterhin wurde festgestellt, dass eine Extraktion des mit 2-Chlor-l-Methyl-pyridiniumiodid umgesetzten Aminosäurederivates aus dem Reaktionsansatz nicht erforderlich ist. Gleiches gilt für den Gefriertrocknungsschritt.

Beispiel 2: Umsetzung einer Aminosäure unter Verwendung von 2-Chlor-l-Methyl- pyridiniumiodid ohne Zusatz von primären Aminen

Folgender Reaktionsansatz wurde gewählt:

10 μl Lösung 1 (10 nmol) wurden mit 30 μl Lösung 4 (6 mmol) und 60 μl 50 % Acetonitril vereinigt, gemischt und mit Stickstoff begast. 100 μl Lösung 4 (200 nmol), die ebenfalls mit Stickstoff begast wurde, wurde hinzugegeben, zwei Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt, nochmals gemischt und anschließend gefriergetrocknet unter Verwendung einer Speed-Nac.

Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ohne Zusatz von primären Aminen konnten die in Beispiel beschriebenen Ergebnisse ebenfalls erhalten werden. Beispiel 3: Umsetzen von 2-Chlor-l-Methyl-pyridiniumiodid ohne Zusatz von Aminosäuren

In diesem Beispiel wurden die vorstehend beschriebenen Reaktionen ohne Zusatz von Aminosäuren durchgeführt mit dem Ziel, einen internen Standard bereitzustellen. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:

10 μl Acetonitril wurden mit 30 μl Lösung 4 (6 mmol) und 60 μl 50 % Acetonitril vereinigt, gemischt, mit Stickstoff begast und hierzu 100 μl Lösung 4 (100 nmol) hinzugegeben, sofort mit Stickstoff begast und zwei Stunden unter Mischen bei Raumtemperatur umgesetzt. Anschließend wurde der Reaktionsansatz getrocknet. Das getrocknete Reaktionsprodukt wurde wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben vermessen. Damit konnte überprüft werden, ob die in Beispiel 1 und 2 erhaltenen Massen spezifisch den Aminosäuren zugeordnet werden können.

Die hierin in eckigen Klammem angegebenen Literaturstellen werden aus Gründen der Übersicht zusammenfassend im folgenden angegeben.

1. Kahn, K. (1995) From genome to proteome: looking at a celLs proteins. Science 270, 369-370.

2. Klose, J.; Kobalz, U. (1995) Two-dimensional electrophoresis of proteins: An updated protocol and implications for a functional analysis of the genome. Electrophoresis, 16, 1034 - 1059

3. Brockstedt, E., Rickers, A., Kostka, S., Laubersheimer, A., Dörken, B., Wittmann- Liebold, B., Bommert, K. and Otto, A. (1998) Identification of apoptosis-associated proteins in a human Burkitt Lymphoma cell Hne, cleavage of hnRNP AI by caspase 3. J. Biol. Chem., 273, 28057-28064

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9. Wittmann-Liebold, B.; Graffunder, H. & Kohls, H. (1976) A device coupled to a modified sequenator for the automated conversion of anilinothiazolinones into PTH- amino acids. Analyt. Biochem. 75, 621-633;

10. Wittmann-Liebold, B.; Ashman, K. (1985) On-line detection of amino acid derivatives released by automatic Edman degradation of polypeptides. in Tschesche, H. (ed): Modern Methods in Protein Chemistry, Walter de Gruyter, Berlin, New York, 303-327

11. Hewick, R.,M., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E., Dreyer, W.J. (1981) A gas-liquid solid phase peptide and protein sequenator. J. Biol. Chem. 256, 7990-7997

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13. Handbuch Knauer 910, Knaur Wissenschaftlicher Gerätebau, Berlin

14. Chang, J.Y., Brauer, D., Wittmann-Liebold, B. (1978) Micro-sequence analysis of peptides and proteins using 4-N,N-dimethylaminoazobenzene 4'-isothiocyanate/ phenylisothiocyanate double coupling method. FEBS Lett., 93, 205-214.

15. Hess, D., Nika, H., Chow, D.T., Bures, E.J., Morrison, H.D. and Aebersold, R. (1995) Liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry of 4-(3- pyridinylmethylaminocarboxypropyl) phenylthiohydantoins. Anal. Biochem, 224, 373- 381

16. Tsugita 1988, Detection method for amino acid derivative, US Patent No 5,051,369

17. Farnsworth 1991 Protein Sequencing, US Patent No 5,270,213

18. Karas, M.; Hillenkamp, F. (1988) Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exeeding 10 000 dalton. Anal. Chem. 60, 2299

Die in der vorangehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination zur Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche

1. Verwendung von 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalzen zum Nachweis und/oder Identifizieren einer Aminosäure, insbesondere einer α-Aminosäure.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Halogen ausgewählt ist aus der Gruppe, die Fluor, Chlor Brom und Jod umfasst.

3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Alkyl-Rest ausgewählt ist aus der Gruppe, die Methyl, Ethyl, Propyl und Butyl umfasst.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das 2- Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz ein Salz ist, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Halogenide, insbesondere Jod, Brom, Chlor und Fluor umfasst, oder ein Tosylat ist .

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das 2- Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz 2-Chlor- 1 -Methyl-pyridiniumiodid ist.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das 2- Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz 2-Fluor- 1 -Methyl-pyridiniumiodid ist.

.

7, . Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure ein Aminosäure-Derivat ist.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure oder das Aminosäure-Derivat mindestens ein S-Atom umfasst oder enthält.

9. Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz mit dem S-Atom des Aminosäure-Derivates reagiert.

10. Verwendung nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Aminosäure- Derivat ausgewählt ist aus der Gruppe, die Phenylthiohydantoinderivate einer Aminosäure, Anilinothiazolinon-Derivate einer Aminosäure und Phenylthiocarbamoyl-Derivate einer Aminosäure umfasst.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure ein Produkt eines Edman-Abbaus ist.

12. Reaktionsprodukt aus einem 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz und einer Aminosäure, insbesondere einem Aminosäure-Derivat.

13. Verfahren zum Nachweis und/oder Identifizieren einer Aminosäure umfassend die Schritte

Bereitstellen einer Aminosäure und/oder einer eine Aminosäure umfassenden Lösung Umsetzen der Aminosäure mit einem 2-Halogen-N-Alkylpyridiniumsalz unter Bildung eines Reaktionsproduktes; und Nachweisen des Reaktionsproduktes.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure als Aminosäure-Derivat vorliegt, bevorzugter Weise als Produkt eines Edman-Abbaus.

15. Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäure oder das Aminosäure-Derivat ein S-Atom enthält, bevorzugter Weise die Reaktion des 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalzes am S-Atom erfolgt.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion unter folgenden Bedingungen durchgeführt wird:

Verwenden eines organischen Lösungsmittels zur Durchführung der Reaktion und/oder Durchführen der Reaktion unter Zugabe von Wasser; der pH- Wert beträgt zwischen etwa 6,5 und 9; und/oder die Temperatur beträgt zwischen 10°C und 80°C.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass dem Reaktionsansatz aus Aminosäure oder Aminosäure-Derivat und 2-Halogen-N- Alkylpyridiniumsalz ein Amin, bevorzugter Weise ein primäres Amin zugesetzt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 17 dadurch gekennzeichnet, dass das primäre Amin die Struktur H₂N-R aufweist, wobei R eine fluoreszierende Verbindung ist oder eine Verbindung, die eine stationäre Ladung enthält, oder ein Rest, der mittels massenspektrometrischer Verfahren gut detektierbar ist.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprodukt weiter derivatisiert wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprodukt weiter aufgearbeitet wird, wobei ein Aufarbeitungsverfahren verwendet wird, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Flüssig-Flüssig-Extraktion, Fest-Flüssig-Extraktion, chromatographische und elektrophoretische Auftrennung umfasst.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 13 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsprodukt nachgewiesen und/oder identifiziert wird durch ein Nachweis- oder Identifizierungsverfahren, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die Massenspektroskopie und Fluoreszenzmessung umfasst.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Nachweis- und/oder Identifizierungsverfahren MALDI-Massenspektroskopie ist.