CN116426555A - 一种制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，包括以下步骤：基于大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株，敲除其合成和代谢精氨酸的关键基因，形成工程菌株A；将目的蛋白的碱基序列构建到表达载体质粒上，并将表达载体质粒转入工程菌株A，形成菌株B；使用精氨酸缺陷培养基，并加入同位素标记精氨酸，作为标记培养基；将菌株B在标记培养基中多次传代，形成菌株C；使用菌株C在标记培养基中进行诱导表达，并分离纯化目标蛋白。与现有技术相比，本发明方法将大肠杆菌合成和代谢精氨酸的关键基因敲除，结合生物工程方法，可以将目标蛋白精氨酸的同位素标记效率提升至95％以上，以获得高纯度的同位素标记蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法。
背景技术
目前，随着关于蛋白质及蛋白质组相关研究的发展，对于特定蛋白在代谢、信号调控等各种通路中所起到作用的定性、定量研究需求正日益高涨。同位素标记的目标蛋白，可以加入到原生物体系内以标记蛋白的流转，也可以在检测前定量加入作为外标定量物质。目前这些研究后续定性定量的方法大多基于依赖于液相色谱-质谱法的蛋白质组学方法。其中，利用胰蛋白酶先将蛋白酶解成为带有精氨酸(R)或赖氨酸(K)末端的肽段混合物，再进行液相色谱-质谱法检测的方法，是最为通用的方法。因此，将这些蛋白中精氨酸和赖氨酸进行标记，即可保证从同位素标记的目标蛋白来源的所有肽段都具有同位素标记标签。
但是，目前合成具有同位素标记的精氨酸(R)的蛋白的方法，都存在一定局限性。首先，由于目前化学合成方法的局限性，目前虽然报道能够合成长达200个氨基酸的序列，但实际难度极其巨大，往往100个氨基酸即是极限，更不用说很多包含数百个氨基酸的特别大的蛋白。其次，对于生物学表达蛋白的方法来说，目前认为较为成熟的方法是SILAC，即细胞培养条件下稳定同位素标记技术(Stable isotope labeling with amino acids incell culture，SILAC)，其基本原理是在细胞培养时，采用含有同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养。但是由于SILAC方法只适用于细胞，其能够表达的蛋白多局限于真核生物，其他来源的蛋白往往不能够得到有效表达，从而造成目标蛋白表达回收失败。同时，对于其他蛋白表达工程生物，如酵母、细菌这类微生物，虽然蛋白表达种类的限制较少，且对于精氨酸标记没有问题，但是由于他们都存在精氨酸补偿合成途径，即会从其他营养物质转化生成精氨酸，造成精氨酸的标记效率低下。虽然有一些研究人员优化了一些培养基中氨基酸的比例，但是并不能有效保证精氨酸的标记效率。
对于常用的蛋白表达工程生物大肠杆菌(Escherichia coli)来说，其表达合成效率高，易于操作，是科研人员的优选。大肠杆菌中存在精氨酸合成途径，包括argA、argB、argC、argD、argE、argI、argG、argH基因，可以将谷氨酸转化为精氨酸。也存在精氨酸的代谢途径，包括astA、astB、astC、astD、astE，可以将精氨酸再转化为谷氨酸。由于存在精氨酸合成途径，在精氨酸缺陷培养基中加入同位素标记的精氨酸时，仍然会有一部分合成蛋白质的精氨酸原料来自于大肠杆菌自己合成的产物，从而造成精氨酸标记效率下降。同时，由于存在精氨酸代谢途径，会造成精氨酸利用效率的降低。由于以上两个通路的存在，造成了在利用大肠杆菌制备同位素精氨酸标记的蛋白时，成功率极大降低。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法。
技术方案：一种制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，包括以下步骤：
(1)基于大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株，敲除其合成和代谢精氨酸的关键基因，形成工程菌株A；
(2)将目的蛋白的碱基序列构建到表达载体质粒上，并将表达载体质粒转入工程菌株A，形成菌株B；
(3)使用精氨酸缺陷培养基，并加入同位素标记精氨酸，作为标记培养基；
(4)将菌株B在标记培养基中多次传代，形成菌株C；
(5)使用菌株C在标记培养基中进行诱导表达，并分离纯化目标蛋白。
作为优选或具体的实施方式：
步骤(1)中，所述大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株，包括但不限于BL21系列、DH5α、JM109、TOP10、HB101、M110等菌株，优选Escherichia coli BL21(DE3)菌株。
步骤(1)中，所述合成和代谢精氨酸的关键基因包括合成基因argA、argB、argC、argD、argE、argI、argG、argH和代谢基因astA、astB、astC、astD、astE，优选敲除合成起始基因argA和代谢起始基因astA。
步骤(1)中，所述敲除手段包括但不限于同源重组、CRISP/Cas基因敲除、插入突变，优选使用CRISP/Cas基因敲除方法。
步骤(2)中，所述目的蛋白可以为微生物、动物、植物、病毒来源，也可以为人工设计，目的蛋白的基因序列优选进行大肠杆菌偏好性密码子优化。
步骤(2)中，所述目的蛋白的基因序列可以为全合成，也可以为使用PCR技术扩增获得。
步骤(2)中，所述表达载体质粒包括但不限于pET、pEX、GST、PEZZ18、PKK223等各系列用于蛋白表达的载体质粒。
步骤(2)中，所述将表达载体质粒导入工程菌株的方法包括但不限于钙转法、电转法。
步骤(3)中，所述营养缺陷型培养基，包含大肠杆菌生长所需的盐、糖、氮源及除精氨酸以外的其他所有必须氨基酸，不能包含蛋白质、肽段，优选精氨酸缺陷的DMEM forSILAC商业培养基，以保证培养基稳定性。
步骤(3)中，所述同位素标记的精氨酸，包括标记精氨酸上的C、N、H、O元素，其同位素包括13C，15N，2H，17O，18O，可以为一个或多个原子同时标记，可以为一个或多种元素同时标记。
步骤(3)中，所述加入同位素标记的精氨酸浓度，为从0.1～1000mg/L，依据最终所需目标蛋白产量及同位素标记精氨酸价格成本综合而定，优选为20～100mg/L。
步骤(4)中，所述多次传代，包括1～10次传代，优选3次，将绝大多数未标记精氨酸从菌体去除。每次传代包括在步骤(3)培养基中接入菌株，包括使用固体培养基上的菌落、甘油保存菌株或新鲜培养的菌液，菌液按照0.1-10％的体积比例加入到培养基中，于4～40℃培养2-72h，取一些培养好的菌液加入步骤(3)中新的培养基中作为下一次传代的开始。优选取1％体积进行接入菌株，37℃过夜培养。
步骤(5)中，所述在标记培养基中进行诱导表达，指将步骤(4)得到的菌株C的菌液或离心收集到的菌体，转移到新的步骤(3)所述的培养基中，并采取菌株诱导表达蛋白所需的培养条件，如采取16℃培养、加入诱导剂(包括乳糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷IPTG等)等，培养至合适收获时间。
步骤(5)中，所述分离纯化蛋白，包括收集目标蛋白所在组分，对目标蛋白进行纯化、浓缩。收集目标蛋白所在组分，依据表达菌体及载体的差异，可以在菌体内或上清液中，可以通过离心方法进行两者分离、收获。对目标蛋白纯化、浓缩，包括将目标蛋白所在组分均匀分布在缓冲液中，如果目标蛋白在菌体内则将菌体进行破碎，如果目标蛋白在上清液中，可适当浓缩后进行复溶，再将含有目标蛋白的缓冲液使用亲和层析、离子交换和分子筛层析、或依据蛋白所带的标签进行相应方法的纯化，如带组氨酸标签使用金属螯合亲和层析法、带GST标签使用亲和层析方法等，含有高纯度目标蛋白的缓冲液可以进行浓缩或形成干粉。
有益效果：与现有技术相比，本发明方法将大肠杆菌合成和代谢精氨酸的关键基因敲除，结合生物工程方法，可以将目标蛋白精氨酸的同位素标记效率提升至95％以上，以获得高纯度的同位素标记蛋白。
附图说明
图1为本发明方法步骤流程示意图。
图2为针对argA设计的gRNA敲除引物。
图3为针对argA设计的gRNA敲除后验证引物。
图4为argA敲除后PCR验证产物电泳结果。
图5为针对astA设计的gRNA敲除引物。
图6为针对astA设计的gRNA敲除后验证引物。
图7为astA敲除后PCR验证产物电泳结果。
图8为pET-28载体质粒示意图。
图9为Western-blot验证纯化效果。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例
1.构建表达菌株
1)选取Escherichia coli BL21(DE3)作为表达菌株初始菌株；
2)针对argA基因设计引物argA-gRNA1:TGTGACCGACGCCAAAACACTGGargA-gRNA2:GGAAGAGAAGATTGGGGAAATGG，如图2所示。
3)利用上述引物及CRISPR-Cas9技术对Escherichia coli BL21(DE3)中argA基因进行敲除，得到Escherichia coli BL21(DE3)-△argA；
4)设计引物进行PCR验证argA基因敲除成功，所需引物设计位置如图3，所使用的引物及PCR结果如下表1及电泳图图4：
表1
(6)针对astA基因设计引物astA-gRNA1:TCGATGTCACACTCAAGCGTTGGastA-gRNA2:CAACTATCGCGTCGGCACGTTGG，如图5所示：
(7)利用上述引物及CRISPR-Cas9技术对上述敲除了argA的EscherichiacoliBL21(DE3)-△argA中astA基因进行敲除，得到Escherichia coli BL21(DE3)-△
argA-△astA，简称为Escherichia coli BL21(DE3)-do；
(8)设计引物进行PCR验证astA基因是否敲除成功，所需引物设计位置如图6，所使用的引物及PCR结果如下表2及电泳图图7：
表2
2.构建表达质粒
1)选取目标蛋白HSP20的改造蛋白，其氨基酸序列如下：
MEIPVPVQPSWLRRASAPLPGISTPGRLFDQRFGEGLLEAELAALCPAAFAPY
YLRAPSVALPTAQVPTDPGHFSVLLDVKHFSPEEIAVKVVGEHVEVHARHEE
RPDEHGFIAREFHRRYRLPPGVDPAAVTSALSPEGVLSIQAAPASSQAPLPPPP
AAKTPVISGGPYEYRTPVITGAPYEYRVPTEFTAGGNESDAPDDLGADYSYV
PAPGIFTIGPDAIVRDGLDAASYYAPVRADVTPADFSEWSKGTFIIDPGGVIR
2)将上述氨基酸序列按照大肠杆菌密码子优化，并在首部加上NcoI酶切位点(ccATGG)，末端加上XhoI酶切位点(ctcgag)，得到碱基序列，大写序列为目的蛋白序列：
ccATGGAAATTCCGGTGCCGGTTCAACCGTCATGGCTGCGTCGTGCCA
GCGCACCGCTGCCGGGCATTAGCACCCCGGGCCGTCTGTTTGATCAGCGC
TTTGGTGAAGGCCTGCTGGAAGCGGAACTGGCGGCACTGTGCCCGGCGG
CCTTTGCGCCGTACTACCTGCGTGCACCGAGTGTTGCGCTGCCGACCGCG
CAGGTGCCGACCGATCCGGGCCACTTTAGCGTTCTGCTGGATGTGAAACA
TTTTTCGCCGGAAGAAATTGCGGTGAAAGTGGTTGGTGAACATGTGGAA
GTGCATGCGCGTCATGAAGAACGTCCGGATGAACATGGCTTTATCGCGCG
TGAATTTCATCGTCGTTATCGTCTGCCGCCGGGCGTGGACCCGGCCGCGG
TGACCAGCGCGCTGTCCCCGGAAGGTGTGCTGAGCATTCAGGCTGCACC
GGCCAGCAGCCAGGCGCCGCTGCCGCCGCCGCCCGCGGCCAAAACGCCG
GTTATTAGCGGTGGCCCGTATGAATATCGTACCCCGGTCATCACCGGTGCC
CCGTATGAATATCGCGTGCCGACCGAATTTACCGCCGGCGGTAATGAAAG
CGATGCCCCGGATGATCTGGGTGCGGACTATTCATATGTGCCGGCACCGGG
CATTTTTACCATTGGCCCGGATGCCATTGTGCGCGATGGCCTGGATGCGGC
CAGCTATTATGCCCCGGTGCGCGCCGATGTTACCCCAGCCGATTTTAGCGA
ATGGAGCAAAGGCACCTTTATTATTGATCCGGGCGGCGTGATTCGCTAActc
gag
3)将碱基序列进行合成并连接到载体质粒上，选取pET-28b(+)载体质粒，使用NcoI/XhoI酶切位点将质粒连接到载体质粒上，保留质粒上后部组氨酸标签(HisTag)，连接到蛋白末端。如图8所示。
3.将表达质粒使用电转方法转移到Escherichia coli BL21(DE3)-do菌株中，得到表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)-do-HSPB6，并进行甘油保存；
4.购买Thermo公司DMEM for SILAC培养基，单独添加同位素标记的赖氨酸(L-LysineHCl-[13C6])、精氨酸(L-Arginine HCl-[13C6])，添加量为50mg/L，并加入卡那霉素(50μg/mL)，配置好的培养基称为培养基A；
5.取培养基A 10mL加入试管，加入10uL甘油菌保，37℃震荡培养过夜；
6.再取培养基A 10mL加入试管，加入10uL第5步菌液，37℃震荡培养过夜；
7.重复第6步一次，取部分进行甘油菌保；
8.取培养基A 1L加入5L摇瓶，加入1mL第7步得到的菌液，37℃进行培养至OD600值到达0.4～0.6区间内，加入终浓度1mM的IPTG诱导剂，16℃过夜培养；
9.将所有菌液进行离心，由于目标蛋白在菌体中，收集菌体沉淀；
10.基于His Tag标签进行蛋白纯化：
1)超声破菌于40mL破菌缓冲液，离心取上清；
2)上样于预先平衡好的纯化柱(10倍柱体积上样缓冲液平衡)；
3)样品上完以后，使用上样缓冲液洗柱10个柱体积；
4)使用10-20倍柱体积洗杂缓冲液将杂蛋白从纯化柱上洗去；
5)使用4-10倍柱体积洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱。通常目标蛋白会在第二个柱体积中开始流出。
11.使用超滤方法对目标蛋白进行浓缩；
12.经Western-blot验证纯化效果如图9所示；
13.将蛋白纯化物使用胰蛋白酶酶解、除盐后，使用基于液相色谱-质谱法的蛋白质组学DIA方法进行检测，选取目标蛋白中以R做结尾的肽段，如TPVISGGPYEYR，其TPVISGGPYEYR和TPVISGGPYEYR(+6)的两种形式的定量值比较如下表3，显示其标记效率高达99.72％。同时检测以K作为结尾的肽段标记效率也合格。
表3肽段TPVISGGPYEYR在蛋白质组学验证中定量强度
| 肽段 | 定量值 |
| TPVISGGPYEYR | 2.08E+07 |
| TPVISGGPYEYR(+6) | 7.42E+09 |
。
Claims (10)
1.一种制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)基于大肠杆菌表达菌株，敲除其合成和代谢精氨酸的关键基因，形成工程菌株A；
(2)将目的蛋白的碱基序列构建到表达载体质粒上，并将表达载体质粒转入工程菌株A，形成菌株B；
(3)使用精氨酸缺陷培养基，并加入同位素标记精氨酸，作为标记培养基；
(4)将菌株B在标记培养基中多次传代，形成菌株C；
(5)使用菌株C在标记培养基中进行诱导表达，并分离纯化目标蛋白。
2.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述大肠杆菌表达菌株，包括BL21系列、DH5α、JM109、TOP10、HB101、M110菌株。
3.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述合成和代谢精氨酸的关键基因包括合成基因argA、argB、argC、argD、argE、argI、argG、argH和代谢基因astA、astB、astC、astD、astE；优选敲除合成起始基因argA和代谢起始基因astA。
4.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述目的蛋白为微生物、动物、植物或病毒来源，或者为人工设计；所述目的蛋白的基因序列为全合成，或者为使用PCR技术扩增获得。
5.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(2)中，表达载体质粒选自pET、pEX、GST、PEZZ18或PKK223系列载体质粒。
6.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述精氨酸缺陷型培养基，包含大肠杆菌生长所需的盐、糖、氮源及除精氨酸以外的其他所有必须氨基酸，不能包含蛋白质、肽段；优选精氨酸缺陷的DMEM forSILAC商业培养基。
7.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述同位素标记的精氨酸，包括标记精氨酸上的C、N、H或O元素，其同位素包括13C，15N，2H，17O或18O，可以为一个或多个原子同时标记，可以为一个或多种元素同时标记。
8.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加入同位素标记的精氨酸浓度为0.1～1000mg/L；优选为20～100mg/L。
9.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述多次传代，包括1～10次传代，优选3次；每次传代包括在步骤(3)培养基中接入菌株，包括使用固体培养基上的菌落、甘油保存菌株或新鲜培养的菌液，菌液按照0.1-10％的体积比例加入到培养基中，于4～40℃培养2-72h，取培养好的菌液加入步骤(3)中新的标记培养基中作为下一次传代的开始。
10.根据权利要求1所述的制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述在标记培养基中进行诱导表达，指将步骤(4)得到的菌株C的菌液或离心收集到的菌体，转移到步骤(3)中新的标记培养基中，并采取菌株诱导表达蛋白所需的培养条件，培养至收获时间；所述分离纯化蛋白，包括收集目标蛋白所在组分，对目标蛋白进行纯化、浓缩。
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