CN118207146A

CN118207146A - 一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株及其应用

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Publication number: CN118207146A
Application number: CN202410375657.XA
Authority: CN
Inventors: 刘中美; 周哲敏; 李佶珊; 张一维; 崔文璟; 郭军玲
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2024-03-29
Filing date: 2024-03-29
Publication date: 2024-06-18

Abstract

本发明公开了一种生产γ‑氨基丁酸的工程菌株及其应用，属于酶工程技术领域。本发明的工程菌株可在3h内完成2moL·L^‑1L‑Glu的转化，产量为197.0g·L^‑1，与出发菌株相比产量提升了5.2倍。改造后工程菌株的生物量并未受到明显影响，且以1.5moL·L^‑1L‑Glu为底物催化时，可以在4h内完成两批次的转化，具有工业应用的潜力。

Description

一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株及其应用，属于酶工程技术领域。

背景技术

γ－氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)，又名4-氨基丁酸，是自然界中普遍存在的一种非蛋白质氨基酸，广泛分布在动植物和微生物中，且都发挥着重要作用。目前GABA的合成方法主要有化学合成法、植物富集法和生物合成法三种。由于化学合成法和植物富集法都具有产量低、操作复杂等缺点，因此生物转化法被广泛用于GABA的合成。生物转化法主要是L-谷氨酸在谷氨酸脱羧酶的作用下，依赖辅酶磷酸吡哆醛，脱去羧基形成一分子CO₂生成GABA。该方法具有可选择微生物种类多、转化率高、污染小、条件温和、分离提纯较为方便等优点。生物转化法的核心是谷氨酸脱羧酶(EC 2.4.1.13，glutamatedecarboxylase，GAD)，其活性受GAD辅酶—PLP以及底物谷氨酸浓度的影响，对温度敏感，在pH>6.0或pH<2.0时容易失去活性。如何利用分子生物学技术实现γ-氨基丁酸的高产受到了越来越多的关注。

发明内容

针对上述问题，本发明的第一个目的是提供一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，所述工程菌株以重组大肠杆菌为宿主，将编码谷氨酸脱羧酶酶突变体基因导入宿主，所述重组大肠杆菌进行了以下改造：

a过表达转运蛋白GadC^ΔC41，和b.可溶性表达的增强，和c.pepD基因敲除；

所述突变体是将SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列第200位的丙氨酸替换为亮氨酸，第449的天冬酰胺替换为天冬氨酸得到的。

在一种实施方式中，以重组大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

在一种实施方式中，所述谷氨酸脱羧酶酶突变体基因序列如SEQ ID NO.2。

在一种实施方式中，所述谷氨酸脱羧酶酶突变体的表达载体为pET28a(+)，转运蛋白GadC^ΔC41的表达载体为p15A。

在一种实施方式中，所述转运蛋白GadC^ΔC41的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

在一种实施方式中，编码所述转运蛋白GadC^ΔC41的基因序列如SEQ ID NO.4。

在一种实施方式中，利用促溶标签实现可溶性表达的增强。

在一种实施方式中，所述促溶标签包括SKII、NT11、T7A或T7A2，优选地为T7A2。

在一种实施方式中，pepD基因敲除所用的敲基因质粒为pKD46。

本发明的第二个目的在于提供上述工程菌株在食品、医药或化工领域生产γ-氨基丁酸中的应用。

在一种实施方式中，将上述工程菌住接种于2×YT培养基中，37℃培养至OD600为0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG至0.4mmoL·L^-1和L-阿拉伯糖至1mmoL·L^-125℃诱导16～20h。

在一种实施方式中，收集诱导后的菌体，取OD₆₀₀为15的菌体与1.5moL·L^-1的L-Glu混合，于37℃、200rpm下反应2h后，再次收集菌体重复上述操作。

有益效果：

本发明的谷氨酸脱羧酶突变体在pH 3.0下的稳定性相对野生型提高了35.1％，比酶活为139.8±1.9U·mg^-1，与野生酶接近。在所构建的工程菌株中过表达该突变体，其在3h内可完全催化2moL·L^-1的L-Glu，产量为197.0g·L^-1，与出发菌株相比产量提升了5.2倍。且该工程菌株以1.5moL·L^-1的L-Glu为底物时可以4h内完成两批次的转化，具有工业应用的潜力。

附图说明

图1为野生酶和突变酶的酶学性质，WT为野生型。(A：最适温度；B：热稳定性；C：最适pH；D：pH稳定性)

图2为野生酶的表达优化电泳图。(M：Marker；uninduced：未诱导细胞；-：PfGAD；s：破碎后上清；p：破碎后沉淀)

图3为野生菌株和改造后菌株的催化历程图，PfGAD为出发菌株。

图4为野生菌株和改造后菌株的细胞生长曲线，WT为野生型。

图5为突变体工程菌株的催化历程图。(A：1moL·L^-1；B：2moL·L^-1C：3moL·L^-1)

图6为工程菌株重复使用次数的柱状图。(A：1moL·L^-1；B：1.5moL·L^-1C：2moL·L^-1)

具体实施方式

培养基

LB培养基：蛋白胨10g·L^-1，酵母浸膏5g·L^-1，NaCl 10g·L^-1。

2×YT发酵培养基：蛋白胨10g·L^-1、酵母提取物5g·L^-1、NaCl 10g·L^-1。

谷氨酸脱羧酶酶活及其酶学性质测定方法

(1)谷氨酸脱羧酶酶活的测定方法

酶活的定义(U)：在60℃、pH 4.5的条件下，1min内生成1μmol GABA所需的酶量为1个酶活力单位U。每毫克蛋白所含有的酶活力单位定义为比酶活。

酶活反应体系：1mL反应体系，将适量的酶溶解在含有0.1mmoL·L^-1PLP的10mmoL·L^-1磷酸-柠檬酸缓冲液(pH 4.5)中。向反应体系中加入0.1moL·L^-1的谷氨酸钠，置于60℃孵育10min后，在100℃下灭活10min。

(2)最适温度检测方法：在不同温度(45℃-75℃)下测定酶活。将最高的酶活定义为100％，分析不同温度下酶活的变化情况。

(3)最适pH检测方法：在pH 3.0-4.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液和pH 5.0-7.0的Tris-HCl缓冲液中测定酶活。将最高的酶活定义为100％，分析不同pH条件下酶活的变化情况。

(4)温度稳定性检测方法：将酶液置于40℃金属浴中处理30min～120min后于冰上冷却5min，按照上述方法在pH 4.5、60℃条件下测定残余酶活，以纯化后的原始酶活定义为100％，分析纯酶的温度稳定性。

(5)pH稳定性的确定：将酶液置于pH 3.0 3.0-4.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液和pH5.0-7.0的Tris-HCl缓冲液中，于冰上过夜孵育。按照上述方法pH 4.5、60℃条件下测定残余酶活，将纯化后的原始酶活定义为100％，分析纯酶的pH稳定性。

(6)氨基酸检测方法

谷氨酸钠和GABA的浓度均采用HPLC进行检测。样品首先经过苯基异硫酸酯(PITC)衍生处理：取500μL稀释后的反应液，分别加入250μL 1mol·L^-1的三乙胺-乙腈溶液和250μL0.1mol·L^-1的PITC-乙腈溶液，混匀后避光衍生50min；随后加入750μL的正己烷，充分振荡以终止反应、静置后待溶液分层。用1mL的注射器吸取下层溶液并用0.22μm的有机滤膜进行过滤后所制得的溶液用于氨基酸的检测。然后使用色谱柱La Chrom C18(4.6mm×250mm,5μm)进行检测，流动相A为80％的乙腈溶液，流动相B为97％的0.1mol·L^-1乙酸钠和3％的乙腈的混合溶液，流速为0.6mL·min^-1，检测波长为254nm，进样量10μL。梯度洗脱条件为：0～35min，流动相B由95％降至70％；35～40min，流动相B由70％升至95％；40～45min，B流动相浓度不变。

菌体培养条件及全细胞催化方法：

将-80℃保存的重组菌株在LB平板(含50μg·mL^-1卡那霉素)上划线活化，挑取单菌落接种至LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养6-8h，然后以2％的接种量转接入50mL的2×YT摇瓶液体培养基中，于37℃、200rpm振荡培养2～3h至OD₆₀₀约为0.6～0.8时，加入0.4mmoL·L^-1IPTG和1.0mmoL·L^-1L-阿拉伯糖，于25℃、200rpm诱导培养12～16h，收集诱导结束的菌体(8000rpm，10min，4℃)。

全细胞催化体系：将OD＝15的菌体与1moL·L^-1的L-Glu混合，在37℃，200rpm下进行催化，每隔0.5h或1h取一次样，反应6h。然后在100℃下灭活10min。灭活的混合物在12000rpm下离心2min，上清液用高效液相色谱(HPLC)检测L-Glu和GABA的浓度。

实施例1：重组大肠杆菌BL21/pET28-PfGAD-A200L/N449D的构建与纯化

1.重组质粒pET28-PfGAD的构建

从基因文库中获取弯曲芽孢杆菌Priestia flexa来源的GAD基因(PfGAD,GenBank:WP_210610082.1)。PfGAD由AZENTA(中国苏州)合成。大肠杆菌BL21(DE3)用于表达酶(PfGAD)。

2.突变体A200L/N449D的构建：

以上述的pET28-PfGAD为模板，使用表1所示引物P1和P2在表2所示条件下PCR，PCR产物转化E.coli JM109后获得携带编码突变体基因的重组质粒pET28-PfGAD-A200L。再以pET28-PfGAD-A200L为模版，使用表1所示引物P3和P4重复上述操作后，获得重组质粒pET28-PfGAD-A200L/N449D。将重组质粒pET28-PfGAD-A200L/N449D转化E.coli BL21(DE3)菌株，获得重组菌株BL21/pET28-PfGAD-A200L/N449D。

表1引物

表2全质粒PCR扩增反应体系

PCR扩增反应条件为：

PCR产物用琼脂糖凝胶电泳方法鉴定。然后将PCR产物纯化、消化后转入大肠杆菌BL21感受态细胞。

(2)将重组大肠杆菌BL21/pET28-PfGAD和BL21/pET28-PfGAD-A200L/N449D分别接种于5mL卡那霉素浓度为100μg·mL^-1的LB培养基，37℃、200rpm振荡培养6-8h。

将上述培养物按上述方式培养得到菌体，8000rpm离心10min收集菌体。

(3)将重组菌体用15mL结合缓冲溶液(50mmoL·L^-1Na₂HPO₄、50m moL·L^-1NaH₂PO₄、500m moL·L^-1NaCl、20m moL·L^-1咪唑)，超声破碎，破碎菌液于12000rpm离心25min，上清用0.22μm水系滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡1mL的His Trap HP柱，用15倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，用27倍柱体积的500mmoL·L^-1咪唑的缓冲液线性洗脱蛋白，收集纯酶液并用SDS-PAGE分析鉴定。测得突变体A200L/N449D纯酶比酶活为139.8±1.9U·mg^-1，与野生型接近。

实施例2：最适温度的测定

将实施例1中的突变体和野生型酶的纯酶液均稀释到终浓度为0.1mg·mL^-1的浓度，在1mL缓冲反应体系中加入100μL实施例1的酶液，终浓度20mmoL·L^-1pH 4.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，终浓度100mmoL·L^-1谷氨酸钠，终浓度0.1mmoL·L^-1PLP，分别在45、50、55、60、70、75℃下反应10min，100℃灭活蛋白后，检测相应酶活。

如图1A所示，以突变体和野生酶各自的最高酶活为100％，突变体的相对酶活在55℃条件下最高，且在60～75℃下，相对酶活均保持在80％以上。在75℃反应10min后，突变体还能保持82％的相对酶活，而野生型的相对酶活只剩下33％。

实施例3：热稳定性测定

将实施例1中的突变体和野生型酶的纯酶液均稀释到终浓度为0.5mg·mL^-1的浓度，并置于40℃水浴锅中孵育30min～120min。在1mL反应体系中，包括终浓度100mmoL·L^-1谷氨酸钠、0.1mmoL·L^-1PLP和20mmoL·L^-1mM pH 4.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，加入100μL上述处理过的酶液，在55℃和pH 4.5条件下反应10min，100℃灭活蛋白后，测剩余酶活。

结果如图1B所示，突变体在40℃处理不同时间后，相对酶活均高于野生型酶活；处理60min后，仍保留62％的相对酶活，而野生型的相对酶活剩余47％。

实施例4：最适pH的测定

将实施例1中的突变体和野生型酶的纯酶液均稀释到终浓度为0.1mg·mL^-1的浓度，在1mL缓冲反应体系中加入100μL实施例1的酶液，终浓度100mmoL·L^-1谷氨酸钠、终浓度0.1mmoL·L^-1PLP和终浓度20m moL·L^-1不同pH的缓冲液。不同pH的缓冲液为：pH 3.0～4.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液和pH 5.0～pH 7.0的Tris-HCl缓冲溶液。将野生酶和突变体酶分别在含有不同pH缓冲溶液的反应体系中55℃下反应10min后，100℃灭活蛋白后，检测相应酶活。

如图1C所示，以突变体和野生酶各自的最高酶活为100％，突变体A200L/N449D的最适反应pH为4.0，野生型最适反应pH为4.5。

实施例5：pH稳定性测定

将实施例1中的突变体和野生型酶的纯酶液均稀释到终浓度为0.1mg·mL^-1的浓度，并置于pH 3.0-4.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液和pH 5.0～pH 7.0的Tris-HCl缓冲溶液中，于冰上孵育过夜。在1mL反应体系中，包括终浓度100mmoL·L^-1谷氨酸钠、0.1mmoL·L^- ¹PLP和20mmoL·L^-1mM pH 4.5的柠檬酸-磷酸盐缓冲溶液，加入200μL上述处理过的酶液，在55℃和pH 4.5条件下反应10min，100℃灭活蛋白后，测剩余酶活。

结果如图1D所示，突变体在pH 3.0下的剩余酶活为90％，而野生型的残余酶活仅为54％。

实施例6：工程菌株的构建

1.转运蛋白GadC^ΔC41的过表达

(1)重组质粒p15A-GadC^ΔC41的构建

用引物对P5/P6构建质粒p15A的线性化载体，用引物对P7/P8，以E.coli基因组为模板，扩增GadC^ΔC41基因片段，扩增体系及条件如实施例1所示。利用Gibson组装构建质粒p15A-GadC^ΔC41。

表3引物

表4Gibson组装体系

Gibson组装反应反应条件为：50℃，30min。

将组装后的体系全部转入大肠杆菌JM109中用于构建质粒(p15A-GadC^ΔC41)，再将pET28a-PfGAD与p15A-ΔGadC^ΔC41一同转入大肠杆菌BL21(DE3)中用于表达PfGAD和ΔGadC。

2.PfGAD可溶性表达的增强

PfGAD的可溶性表达较低。有研究表明，在蛋白的N端添加一系列短肽可改善蛋白的可溶性表达，这一类短肽被称为促溶标签。因此，为了提高PfGAD的可溶性表达，从文献中获取了四种促溶标签(SKII、NT11、T7A、T7A2)，并利用引物对P9/P10、P11/P12、P13/P14和P15/P16将其克隆至PfGAD基因的N端，并对PfGAD的表达进行了测定，结果如图2所示。根据SDS-PAGE的结果可发现，T7A2标签的引入明显提高了PfGAD的可溶性表达。

表5引物

3.pepD基因的敲除

pepD基因敲除方法：

采用CRISPR-Cas9系统进行pepD基因的敲除，所用的敲基因质粒为pKD46(温度敏感型，含有阿拉伯糖启动子调控的AID-dCas9，P43启动子调控的sgRNA，Amp^r)。利用chopchop网站(http://chopchop.cbu.uib.no)设计了sgRNA，用引物对P17/P18进行PCR扩增，得到两端为同源臂、中间为UGI-AID-dCas9-Amp基因片段的线性同源重组片段(大小为9770bp)。将同源重组片段化转入E.coli JM109菌株中构建质粒，送至金唯智公司测序，将测序正确的质粒化转入E.coli BL21(DE3)菌株中。在氨苄青霉素抗性平板上挑取转化子接入5mL试管中，在30℃下培养6～8h后，加入终浓度为10mmoL·L^-1的阿拉伯糖，过夜培养。将过夜培养的菌液稀释10⁶倍后涂布至无抗平板，在42℃下培养至形成单菌落。挑取5～10个单克隆用引物P19/P20进行菌落PCR，PCR产物送至金唯智测序，将测序正确的菌落进行保菌。

表5引物

4.工程菌株的构建及催化验证

将pET28a-T7A2-PfGAD和p15A-GadC^ΔC41质粒转入ΔpepD菌株中，并对其全细胞催化历程进行了检测，结果如图3所示。改造后的工程菌株可在催化4h后转化率可达73.6％，与出发菌株相比转化率提升了37.5％，且转化率提前了8h达到平衡。

实施例7：敲除pepD基因对菌体生长的影响

目前用于提高GABA产量、抑制GABA消耗的主要方法是敲除编码4-氨基丁酸氨基转移酶的基因(gabT)，即抑制GABA进入TCA循环。但伴随着gabT基因的敲除，细胞生长受到了严重影响，研究表明gabT基因敲除菌株的细胞生物量仅为未敲除菌株的62.9％。我们对ΔpepD菌株和野生型菌株(WT)进行了细胞生物量的测定，结果如图4所示。ΔpepD菌株和WT菌株在前12h中OD₆₀₀值逐渐提升，且二者增幅相似；12h后二者OD₆₀₀值均达到7.3左右，后期逐渐趋于平缓。通过对比二者的生长曲线可以发现pepD基因的敲除对于大肠杆菌的生长没有显著影响，该菌株具有工业应用潜力。

实施例8：突变体工程菌株的全细胞催化工艺

1.L-Glu浓度优化

将pET28a-T7A2-PfGAD-A200L/N449D和p15A-GadC^ΔC41质粒转入ΔpepD菌株中，完成突变体工程菌株的构建。并将其分别以1moL·L^-1、2moL·L^-1和3moL·L^-1的L-Glu为底物进行全细胞催化，结果如图5所示。当以1moL·L^-1的L-Glu为底物时，转化率可在2h内达到96.5％，但在反应4h后转化率降至78.0％；当以2moL·L^-1的L-Glu为底物时，转化率可在3h内达到95.6％，同样在反应4h后转化率降至82.2％。这是因为我们保留了GABA下游的其他代谢途径，随着反应的持续进行，GABA仍会被消耗。当谷氨酸浓度增加至3.0moL·L^-1时，其3h内的转化率仅能达到59.41％。这是因为，随着底物浓度的增加，GABA的生成和消耗同时进行，因此其转化率未能增至100％。

2.细胞重复使用次数

为了进一步提升GABA的产量，我们对检测了工程菌株的重复使用次数，结果如图6所示。当以1moL·L^-1的L-Glu为底物时，该菌株可以在6h内重复使用3次。当底物浓度提升至1.5moL·L^-1时，该菌株可以在4h内重复使用2次。而当底物浓度提升至2moL·L^-1时，该菌株重复使用次数减少为1次。这可能是由于随着菌体内部的GABA浓度的上升，抑制了GAD的活性，导致后续批次无法实现L-Glu的完全转化。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株以重组大肠杆菌为宿主，将编码谷氨酸脱羧酶酶突变体基因导入宿主，所述重组大肠杆菌进行了以下改造：

2.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶酶突变体基因序列如SEQ ID NO.2。

3.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶酶突变体的表达载体为pET28a(+)，转运蛋白GadC^ΔC41的表达载体为p15A。

4.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，所述转运蛋白GadC^ΔC41的氨基酸序列如SEQ ID NO.3。

5.根据权利要求1或4所述一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，编码所述转运蛋白GadC^ΔC41的基因序列如SEQ ID NO.4。

6.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，利用促溶标签实现可溶性表达的增强。

7.根据权利要求1或6所述的一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，所述促溶标签包括SKII、NT11、T7A或T7A2，优选地为T7A2。

8.根据权利要求1所述的一种生产γ-氨基丁酸的工程菌株，其特征在于，pepD基因敲除所用的敲基因质粒为pKD46。

9.如权利要求1-8所述任一工程菌株在食品、医药或化工领域生产γ-氨基丁酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将所述工程菌株接种于2×YT培养基中培养，加入诱导剂IPTG和L-阿拉伯糖诱导；收集菌体，取OD₆₀₀为15的菌体与L-Glu粉末混合，于37℃、200rpm下反应，吸取反应液离心后检测上清液中GABA浓度。