CN103773704B - 一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法 - Google Patents
一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103773704B CN103773704B CN201310723683.9A CN201310723683A CN103773704B CN 103773704 B CN103773704 B CN 103773704B CN 201310723683 A CN201310723683 A CN 201310723683A CN 103773704 B CN103773704 B CN 103773704B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- celery
- romt
- seq
- red sandalwood
- coumaric acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 240000007087 Apium graveolens Species 0.000 title claims abstract description 69
- 235000015849 Apium graveolens Dulce Group Nutrition 0.000 title claims abstract description 69
- 235000010591 Appio Nutrition 0.000 title claims abstract description 69
- 240000001606 Adenanthera pavonina Species 0.000 title claims abstract description 46
- 235000011470 Adenanthera pavonina Nutrition 0.000 title claims abstract description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000003570 biosynthesizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 9
- NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 4-coumaric acid Chemical compound OC(=O)C=CC1=CC=C(O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 58
- LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N Trans-resveratrol Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1\C=C\C1=CC(O)=CC(O)=C1 LUKBXSAWLPMMSZ-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims abstract description 42
- 235000018991 trans-resveratrol Nutrition 0.000 claims abstract description 42
- NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 4-Hydroxycinnamate Natural products OC1=CC=C(\C=C\C([O-])=O)C=C1 NGSWKAQJJWESNS-ZZXKWVIFSA-M 0.000 claims abstract description 29
- DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N Acetovanillone Natural products COC1=CC(C(C)=O)=CC=C1O DFYRUELUNQRZTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 19
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 52
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 29
- 241000219095 Vitis Species 0.000 claims description 27
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 25
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 24
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 22
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 claims description 16
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 claims description 16
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 14
- 235000009392 Vitis Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 9
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 7
- 238000005070 sampling Methods 0.000 claims description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 claims description 4
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 3
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 3
- 240000006365 Vitis vinifera Species 0.000 claims 2
- 241000894007 species Species 0.000 claims 1
- 238000005267 amalgamation Methods 0.000 abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 abstract description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 24
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101150003171 ROMT gene Proteins 0.000 description 4
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 2
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N Astraciceran Natural products C1OC2=CC(O)=CC=C2CC1C1=CC(OCO2)=C2C=C1OC PYIXHKGTJKCVBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N Betavulgarin Natural products O=C1C=2C(OC)=C3OCOC3=CC=2OC=C1C1=CC=CC=C1O NDVRQFZUJRMKKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N Gly-Ser-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SOEGEPHNZOISMT-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010045510 NADPH-Ferrihemoprotein Reductase Proteins 0.000 description 1
- 102100023897 NADPH-cytochrome P450 reductase Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N Phytoalexin Natural products COC1=CC=CC=C1C1OC(C=C2C(OCO2)=C2OC)=C2C(=O)C1 IHPVFYLOGNNZLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000000851 Vaccinium corymbosum Species 0.000 description 1
- 235000003095 Vaccinium corymbosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000017537 Vaccinium myrtillus Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 235000021014 blueberries Nutrition 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006575 hypertriglyceridemia Diseases 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 239000013067 intermediate product Substances 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000280 phytoalexin Substances 0.000 description 1
- 150000001857 phytoalexin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000005477 standard model Effects 0.000 description 1
- PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N stilbene Chemical group C=1C=CC=CC=1C=CC1=CC=CC=C1 PJANXHGTPQOBST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
本发明公开了一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法，属于代谢工程技术领域。本发明是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶的同时融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶，构建了能够以p-香豆酸或白藜芦醇为底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了原料和气候条件的制约，在可控条件下实现紫檀芹的生产，为工业化生产紫檀芹奠定基础。<pb pnum="1" />
Description
技术领域
本发明涉及一种利用O-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法，属于代谢工程技术领域。
背景技术
紫檀芹是一种在蓝莓和葡萄中发现的与白藜芦醇相关的二苯乙烯类化合物，属于植物用于抗传染病的植物抗毒素。动物实验表明，紫檀芹有抗癌、抗高胆固醇血症、抗高甘油三酯血症的特性，还能够抵御认知能力下降。除此之外，尽管鲜有研究，但紫檀芹还是被认为具有抗糖尿病的作用。
Schmidlin等的研究表明白藜芦醇O-甲基转移酶（ROMT）可以催化白藜芦醇直接转化为紫檀芹（Schmidlin等，2008；Accession No：FM178870）。如图1所示，紫檀芹可以由4-香豆酸-辅酶A-连接酶（4CL）、芹合酶（STS）以及O-甲基转移酶（ROMT）催化生成。
本发明的目的是在细胞系统中同时表达ROMT、4CL及STS，以实现白藜芦醇向紫檀芹的转化。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供能利用O-甲基转移酶合成紫檀芹的基因工程菌，是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶并融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的基因工程菌。
所述基因工程菌可以是以下4种：
（1）表达了源自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）、源自葡萄（Vitis vinife）的芹合酶（STS）的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄（Vitis vinife）的O-甲基转移酶的大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌基因工程菌是以E.coli BL21（DE3）为宿主，携带重组质粒pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT。所述pETDuet-4CLSTS是携带编码4CL::STS的融合基因的pETDuet-1重组载体，所述Sumo-ROMT是携带编码ROMT基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体。
（2）表达了源自葡萄（Vitis vinife）的O-甲基转移酶（ROMT）的大肠杆菌基因工程菌。所述大肠杆菌基因工程菌是以E.coli BL21（DE3）为宿主，携带重组质粒Sumo-ROMT；所述Sumo-ROMT是携带编码ROMT基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体。
（3）表达了源自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的4-香豆酸-辅酶A连接酶（4CL）、源自葡萄（Vitis vinife）的芹合酶（STS）的融合蛋白4CL::STS以及源自葡萄（Vitis vinife）的O-甲基转移酶的酵母基因工程菌。酵母基因工程菌是以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11为宿主，携带重组质粒pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT。所述pAG304GPD-4CLSTS是携带编码融合基因的pAG304GPD-ccdB重组载体；所述pAG305GPD-ROMT是携带编码ROMT的基因的pAG305GPD-ccdB重组载体。
（4）表达了源自葡萄（Vitis vinife）的O-甲基转移酶（ROMT）的酵母基因工程菌。所述酵母基因工程菌是以酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11为宿主，携带pAG305GPD-ROMT重组质粒；所述重组质粒pAG305GPD-ROMT是携带编码ROMT的基因的pAG305GPD-ccdB重组载体。
所述4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥（Arabidopsis thaliana，生态型哥伦比亚-0）的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述芹合酶是由源自葡萄（Vitisvinife）的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。上述两个基因融合获得编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白4CL::STS的基因，核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示。O-甲基转移酶（ROMT）是由源自葡萄（Vitis vinife）的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11的构建方法参照文献Urban P,MignotteC,Kazmaier M,Delorme F,Pompon D(1997)Cloning,yeast expression,and characterization ofthe coupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductaseswith P450CYP73A5.J Biol Chem272(31):19176-19186。
本发明要解决的第二个技术问题是提供利用所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，包括以下4种具体方法：
（1）以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养携带重组质粒pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT的E.coliBL21（DE3）至OD600=0.6，添加终浓度1mM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养以合成紫檀芹。所述p-香豆酸乙醇溶液是以纯乙醇为溶剂，p-香豆酸浓度为0.5g/mL。
（2）以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养携带重组质粒Sumo-ROMT的E.coliBL21（DE3）至OD600=0.6，添加终浓度1mM的IPTG诱导培养2h，将白藜芦醇DMSO溶液添加到培养物中至白藜芦醇终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养以合成紫檀芹。所述白藜芦醇DMSO溶液是以DMSO为溶剂，白藜芦醇的浓度为0.228g/mL。
（3）以SD drop-out培养基在30℃条件下培养携带pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞至OD600=0.2，然后添加p-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，继续振荡培养4天以合成紫檀芹。所述p-香豆酸乙醇溶液是以纯乙醇为溶剂，p-香豆酸浓度为0.5g/mL。
（4）以SD drop-out培养基在30℃条件下培养携带pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞至OD600=0.2，将白藜芦醇DMSO溶液添加到培养物中至白藜芦醇终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养。所述白藜芦醇DMSO溶液是以DMSO为溶剂，白藜芦醇的浓度为0.228g/mL。
所述改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%（v/v）甘油得到的。
本发明还提供了能够以p-香豆酸为底物生物合成白藜芦醇的基因工程菌，包括（1）融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶（SEQ ID NO.3）的E.coliBL21（DE3），（2）融合表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶（SEQ ID NO.3）的S.cerevisiae WAT11细胞。
4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥（Arabidopsis thaliana，生态型哥伦比亚-0）的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。芹合酶是由源自葡萄（Vitis vinife）的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将上述两个基因融合获得编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。O-甲基转移酶（ROMT）是由源自葡萄（Vitis vinife）的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQID NO.4所示。4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，芹合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，O-甲基转移酶（ROMT）的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
目前，紫檀芹的获得方法主要是依赖从少数几种植物中提取，还没有微生物合成紫檀芹的方法。本发明构建了能够以p-香豆酸或白藜芦醇为底物合成紫檀芹的基因工程菌，避免了原料和气候条件的制约，在可控条件下实现紫檀芹的生产，为工业化生产紫檀芹奠定基础。
附图说明
图1紫檀芹的生物合成途径。
图2p-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芹三种物质的标样的HPLC图谱。
图3融合表达了4CL和STS的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。
图4表达了ROMT的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。
图5共表达了4CL、STS和ROMT的E.coil细胞提取物的HPLC图谱。
图6融合表达了4CL和STS的酵母细胞提取物的HPLC图谱。
图7表达了ROMT的酵母细胞提取物的HPLC图谱。
图8共表达了4CL、STS和ROMT的酵母细胞提取物的HPLC图谱。
具体实施方式
4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥（Arabidopsis thaliana，生态型哥伦比亚-0）的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。芹合酶是由源自葡萄（Vitis vinife）的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将上述两个基因融合获得编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。O-甲基转移酶（ROMT）是由源自葡萄（Vitis vinife）的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQID NO.5所示。4-香豆酸-辅酶A连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，芹合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.7所示，O-甲基转移酶（ROMT）的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
一种制备紫檀芹的方式是在细胞系统中表达白藜芦醇O-甲基转移酶，以含有白藜芦醇的培养基培养细胞系统产紫檀芹。
一种制备白藜芦醇的方式是在细胞系统中表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶，以含p-香豆酸的培养基培养细胞系统产白藜芦醇。
另一种制备紫檀芹的方式是在第一细胞系统中表达4-香豆酸-辅酶A-连接酶（4CL）、芹合酶（STS），以含p-香豆酸的培养基培养该第一细胞系统产白藜芦醇。在第二细胞系统中表达O-甲基转移酶（ROMT），以含有白藜芦醇的培养基培养该第二细胞系统产紫檀芹。
菌种、质粒
HI-Control10G和DH5α用于质粒扩增，BL21（DE3）用于在大肠杆菌中重组表达蛋白，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11用于在酵母中表达蛋白。P-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芹标样均从Sigma购买获得。pETite N-His SUMO Kan载体从Lucigen（Middleton，WI）购买。pETDuet-1从Novagen购买获得，并用于重组蛋白表达。pAG304GPD-ccdB、pAG305GPD-ccdB从Addgene（Boston，MA）获得。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）WAT11的构建方法参照文献Urban P,Mignotte C,Kazmaier M,Delorme F,Pompon D(1997)Cloning,yeast expression,and characterization of thecoupling of two distantly related Arabidopsis thaliana NADPH-cytochrome P450reductases withP450CYP73A5.J Biol Chem272(31):19176-19186。
改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5%（v/v）甘油得到的。
DNA操作
所有DNA操作均参照标准程序。限制性酶和T4DNA连接酶均从New England Biolabs购买。所有PCR扩增和克隆反应均采用Phusion高保真DNA聚合酶（New England Biolabs）。
RNA提取和cDNA合成
ROMT（O-甲基转移酶）、4CL（4-香豆酸-辅酶A-连接酶）、STS（芹合酶）克隆于不同的植物。用于克隆ROMT和STS的葡萄RNA，以及用于克隆4CL的拟南芥RNA均采用TrizolPlus RNA纯化试剂盒（Invitrogen）。cDNA的合成是利用Promega Inc.的Im Prom-ⅡTM反向转录系统，按照其使用说明完成的。基因扩增是利用表1所示引物借助New England BiolabsPhusionPCR试剂盒完成的。
产物的提取
发酵培养液（400μL）用800μL乙酸乙酯进行萃取，然后将提取物用Eppendorf Vacufuge（Eppendorf Scientific Westbury，NY）在室温下进行蒸发干燥，然后再复溶于200μL80%（v/v）的甲醇中。
HPLC分析
利用Dionex Ultimate3000系统对所提取的产物中的白藜芦醇和紫檀芹进行分析。中间产物通过反相色谱Kinetex C18（粒径为2.6μm；150×4.6mm）进行分离，洗脱液为0.1%（v/v）的蚁酸（溶液A）和100%的乙腈（溶液B）。样品用80%的甲醇进行稀释，梯度洗脱程序如下：10%的溶液B洗脱2min，10%-70%的溶液B线性洗脱18min，70%-30%的溶液B线性洗脱1min，30%-10%的溶液B线性洗脱2min，10%的溶液B洗脱以流速0.8ml/min洗脱5min。为了定量分析，所有中间体都通过外标法测定。化合物通过HPLC系统的二极管阵列检测器检测的滞留时间和相应的光谱进行定性。3个标准样品（p-香豆酸、白藜芦醇和紫檀芹）经HPLC分析得到了3个分离效果良好的峰（图2）。
实施例1在E.coliBL21（DE3）中融合表达4CL、STS产白藜芦醇
为融合表达4CL及STS，两个基因通过PCR扩增策略融合在一起。4CL的终止子被敲除，并在4CL和STS的开放阅读框之间插入一个由3个氨基酸组成的连接肽（Gly-Ser-Gly），以此获得了一个大小为2.87kb的编码4CL、3肽连接子和STS的融合基因，融合基因4CL：：STS的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4CL：：STS融合基因通过pCR8/GW/TOPO TA克隆试剂盒连接到入门载体（Gateway entry vector）然后转化进入One Shot大肠杆菌感受态细胞，并测序验证。4CL：：STS融合基因通过扩增、BamHⅠ和HindⅢ双酶切连接到pETDuet-1载体上，得到重组质粒pETDuet-4CLSTS，转化进入E.coliBL21（DE3）。
挑选E.coli BL21单菌落到3mL含100μL/mL氨苄霉素的LB培养基中37℃过夜培养获得种子培养液，将种子培养液转接到50mL含有100μL/mL氨苄霉素的改良M9培养基中在200rpm、37℃条件下培养至OD600=0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液（纯乙醇为溶剂）至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
我们检测了以改良M9培养基摇瓶培养携带pETDuet-4CLSTS质粒的E.coliBL21（DE3）时白藜芦醇的产量，如图3所示，p-香豆酸可被成功转化为白藜芦醇。
实施例2在E.coliBL21（DE3）中表达ROMT
编码O-甲基转移酶（ROMT）的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，将ROMT的基因扩增产物按照pETite N-His SUMO Kan载体的使用说明连接到pETite N-His SUMO Kan载体上。通过测序验证正确插入基因的重组质粒命名为Sumo-ROMT，并将该该重组质粒转化到BL21（DE3）中进行异源表达。
将携带Sumo-ROMT质粒的E.coliBL21（DE3）以改良M9培养基在37℃条件下培养至OD600=0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，将白藜芦醇溶解于DMSO添加到培养物中至终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC分析。
如图4所示，摇瓶培养时，将白藜芦醇添加到表达ROMT的E.coli培养物中，白藜芦醇可转化为紫檀芹，转化率为30%。HPLC分析结果也证明了这一点，然而，出现了一个未知的峰，可能是原白藜芦醇上的甲基。
实施例3在E.coliBL21（DE3）中融合表达4CL：：STS并同时表达ROMT
携带pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT质粒的E.coliBL21（DE3）以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养至OD600=0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液（纯乙醇为溶剂）至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
向共表达了4CL：：STS融合蛋白和ROMT的E.coli培养物中添加p-香豆酸，如图5的HPLC图谱所示，24h时p-香豆酸成功转化为白藜芦醇和紫檀芹，p-香豆酸到紫檀芹的转化率为20%。样品在96h内进行HPLC检测。
实施例4在酵母中融合表达4CL：：STS
将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的4CL：：STS融合基因连接到载体pAG304GPD-ccdB（Addgene，Boston，MA）上，得到重组质粒pAG304GPD-4CLSTS，并将该重组质粒并转入S.cerevisiae WAT11。酵母转化借助Frozen-EZ酵母转化Ⅱ试剂盒（Zymmo Research，Orange，CA）进行。阴性对照质粒为pAG304GPD-ccdB。
携带pAG304GPD-4CLSTS的S.cerevisiae WAT11细胞以SD drop-out培养基在30℃条件下培养至OD600=0.2，然后添加p-香豆酸（0.5g/L），继续振荡培养4天，间歇取样用HPLC进行分析。
将携带pAG304GPD-4CLSTS的新鲜酵母菌落以3ml含0.5g/Lp-香豆酸的drop-out培养基在30℃条件下培养4天。细胞提取物经HPLC分析，如图6所示，几乎所有的p-香豆酸在4天内都被转化为了白藜芦醇。与E.coli相比，酵母的转化效率更高。
实施例5在酵母中表达ROMT
将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ROMT基因通过LR ClonaseⅡ酶混合试剂盒替换连接到pAG305GPD-ccdB（Addgene），得到重组质粒pAG305GPD-ROMT，转入S.cerevisiaeWAT11细胞用于发酵。
将携带pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞以SD drop-out培养基在30℃条件下培养至OD600=0.2，然后添加白藜芦醇（0.228g/L），相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
如图7所示，摇瓶培养时，将白藜芦醇添加到表达ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞培养物中，白藜芦醇可转化为紫檀芹，转化率30%。HPLC分析结果也证明了这一点，然而，出现了一个未知的峰，可能是原白藜芦醇上的甲基。
实施例6在酵母中融合表达4CL：：STS并同时表达ROMT
将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的4CL：：STS融合基因连接到载体pAG304GPD-ccdB。将核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示的ROMT基因通过LR ClonaseⅡ酶混合试剂盒替换连接到pAG305GPD-ccdB（Addgene）。上述两步得到的重组质粒分别命名为pAG304GPD-4CLSTS和pAG304GPD-ROMT。这些质粒含有组成型启动子GPD。将这些质粒转入S.cerevisiaeWAT11细胞用于发酵。阴性对照质粒为pAG304GPD-ccdB和pAG305GPD-ccdB。
将携带pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11以SD drop-out培养基在30℃条件下培养至OD600=0.2，然后添加p-香豆酸（0.5g/L），相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
向共表达了4CL：：STS融合蛋白和ROMT的S.cerevisiae WAT11的培养物中添加p-香豆酸，如图8的HPLC图谱所示，24h时p-香豆酸成功转化为白藜芦醇和紫檀芹，p-香豆酸到紫檀芹的转化率为30%。样品在96h内进行HPLC检测。
表1 引物序列
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。此外，除特别说明之外，本发明所涉及的科学术语具有本领域技术人员一般理解的含义。尽管有很多与本发明的相似、等同的材料方法均可以使用，但本发明优选上述实施方式。
其他方面，本发明的目的及优势可以从本发明记载的附图、权利要求中得到。
Claims (9)
1.一种利用O-甲基转移酶合成紫檀芹的基因工程菌，是单独表达O-甲基转移酶或表达O-甲基转移酶的同时表达4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白的基因工程菌；
所述基因工程菌是以E.coli BL21(DE3)为宿主，携带重组质粒pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT；所述pETDuet-4CLSTS是携带SEQ ID NO.3所示融合基因的pETDuet-1重组载体；所述Sumo-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体；
或者，是以S.cerevisiae WAT11为宿主，携带重组质粒pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT；所述pAG304GPD-4CLSTS是携带SEQ ID NO.3所示融合基因的pAG304GPD-ccdB重组载体；所述pAG305GPD-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pAG305GPD-ccdB重组载体；
或者，是以E.coli BL21(DE3)为宿主，携带重组质粒Sumo-ROMT；所述Sumo-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pETite N-His SUMO Kan重组载体；
或者，是以S.cerevisiae WAT11为宿主，携带重组质粒pAG305GPD-ROMT；所述pAG305GPD-ROMT是携带SEQ ID NO.4所示基因的pAG305GPD-ccdB重组载体。
2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述4-香豆酸-辅酶A连接酶是由来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的4CL基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述芹合酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的STS基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；将上述两个基因融合获得了编码4-香豆酸-辅酶A连接酶和芹合酶的融合蛋白4CL::STS的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述O-甲基转移酶是由源自葡萄(Vitis vinife)的基因编码的，该基因核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.一种利用权利要求1所述基因工程菌生物合成紫檀芹的方法，是以p-香豆酸为底物生物合成紫檀芹，或以白藜芦醇为底物生物合成紫檀芹。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养携带重组质粒pETDuet-4CLSTS和Sumo-ROMT的E.coliBL21(DE3)至OD600＝0.6，添加1mM的IPTG诱导培养2h，添加p-香豆酸乙醇溶液至终浓度为0.5g/L，在相同条件下继续培养以合成紫檀芹。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以SD drop-out培养基在30℃条件下培养携带pAG304GPD-4CLSTS和pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞至OD600＝0.2，然后添加0.5g/L p-香豆酸，继续振荡培养4天以合成紫檀芹。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是以改良M9培养基在200rpm、37℃条件下培养携带重组质粒Sumo-ROMT的E.coliBL21(DE3)至OD600＝0.6，添加1mM的IPTG诱
导培养2h，将白藜芦醇溶解于DMSO添加到培养物种至终浓度为0.228g/L，相同条件下继续培养以合成紫檀芹。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，是以SD drop-out培养基在30℃条件下培养携带pAG305GPD-ROMT的S.cerevisiae WAT11细胞至OD600＝0.2，然后添加0.228g/L白藜芦醇，相同条件下继续培养，间歇取样用HPLC进行分析。
8.根据权利要求4或6所述的方法，其特征在于，所述改良M9培养基是在标准M9培养基的基础上添加1.25g/L酵母提取物和0.5％(v/v)甘油得到的。
9.权利要求1所述基因工程菌在紫檀芹生产中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310723683.9A CN103773704B (zh) | 2013-12-25 | 2013-12-25 | 一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310723683.9A CN103773704B (zh) | 2013-12-25 | 2013-12-25 | 一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103773704A CN103773704A (zh) | 2014-05-07 |
| CN103773704B true CN103773704B (zh) | 2015-10-28 |
Family
ID=50566471
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310723683.9A Active CN103773704B (zh) | 2013-12-25 | 2013-12-25 | 一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103773704B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106102454B (zh) * | 2013-11-01 | 2020-07-31 | 康纳根有限公司 | 使用o-甲基转移酶生物合成生成紫檀芪的方法 |
| CN104611354B (zh) * | 2015-02-05 | 2017-09-05 | 北京农学院 | 融合蛋白Nt4CL5aPcSTS的相关生物材料及其应用 |
| CN110628657B (zh) * | 2019-09-19 | 2022-09-13 | 广州蓝星生物工程有限公司 | 一种用于合成白藜芦醇的酿酒酵母工程菌及其制备方法与应用 |
| CN117587045B (zh) * | 2024-01-16 | 2024-04-16 | 云南农业大学 | 一种藜芦胆固醇22（R）-羟化酶VnCYP90B27基因及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7732666B1 (en) * | 2006-09-01 | 2010-06-08 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | O-methyltransferase gene from sorghum cloning, expression, transformation and characterization |
| CN102120996A (zh) * | 2010-12-03 | 2011-07-13 | 西北农林科技大学 | 葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法 |
| KR101520912B1 (ko) * | 2012-09-26 | 2015-05-18 | 한국생명공학연구원 | Ｒｏｍｔ 및 ｓｔｓ 유전자를 이용한 식물의 스틸벤 함량을 증가시키고 화색을 변화시키는 방법 |
-
2013
- 2013-12-25 CN CN201310723683.9A patent/CN103773704B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103773704A (zh) | 2014-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103773704B (zh) | 一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法 | |
| CN108690854B (zh) | 一种利用化学-酶法生产l-草铵膦的方法 | |
| CN106102454B (zh) | 使用o-甲基转移酶生物合成生成紫檀芪的方法 | |
| CN114836495B (zh) | 利用烟酰胺发酵生产nmn的基因工程菌的构建与应用 | |
| CN108103038B (zh) | 一种合成l-苯甘氨酸的单细胞工厂及其构建与应用 | |
| CN113151024A (zh) | 一种发酵合成四氢嘧啶的酿酒酵母工程菌株 | |
| CN112522228B (zh) | 一种来源于氨氧化假诺卡氏单胞菌的r-转氨酶及其合成方法 | |
| CN112391300B (zh) | 水飞蓟来源的黄酮3β-羟化酶及其辅酶的应用 | |
| WO2019246488A1 (en) | Compositions and methods for the production of pyruvic acid and related products using dynamic metabolic control | |
| CN106754979B (zh) | 一种调控热带假丝酵母的长链脂肪酸转运的基因及其应用 | |
| CN108998401B (zh) | 一种生产3-氨基异丁酸的方法 | |
| CN116426555A (zh) | 一种制备纯品蛋白并使用同位素标记其中精氨酸的方法 | |
| CN113249240B (zh) | 一种高产羟基酪醇的酿酒酵母及其构建方法 | |
| CN110305855A (zh) | 天麻GeCPR基因及其应用 | |
| CN114107354A (zh) | 构建稳定遗传的β-熊果苷高效生物合成的基因工程菌株的方法及其应用 | |
| CN110951760B (zh) | 一种蛋白延时表达开关及其在葡萄糖二酸生产中应用 | |
| CN102277327B (zh) | 过表达RimL的大肠杆菌及其在制备N-乙酰化胸腺素α中的应用 | |
| CN112489738A (zh) | 高活性苯丙素类衍生物的定向设计及其生物合成方法 | |
| CN114395053B (zh) | 一种虫黄藻来源的DHQS-OMT融合基因及其在高效合成MAAs中的应用 | |
| CN114921463B (zh) | 一种调控萜类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiY及其应用 | |
| CN109825516B (zh) | 一种提高乙醇产率的酿酒酵母定点饱和突变基因spt15-N及其应用 | |
| CN114525215B (zh) | 产萜类化合物的重组菌株及其构建方法和发酵产萜类化合物的方法及应用 | |
| CN114921464B (zh) | 一种调控胡萝卜素类化合物合成产量的人工非编码RNA分子CsiX及其应用 | |
| CN114921465B (zh) | 一种调控元件CsiZ及其在提高萜类化合物合成产量中的应用 | |
| CN109097374A (zh) | 一种铜绿假单胞菌工程菌株的制备方法、菌株及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20240419 Address after: G05-119, 7th Floor, Building 11, No. 1569 Yushu Road, Songjiang District, Shanghai, 200000 Patentee after: Zhentian (Shanghai) Biotechnology Co.,Ltd. Country or region after: China Address before: Room 1105, Beichuang Phase I Building, 401 Xingyuan North Road, Wuxi City, Jiangsu Province, 214043 Patentee before: WUXI XINHEYUAN FERMENTATION TECHNOLOGY RESEARCH INSTITUTE Co.,Ltd. Country or region before: China |