CN110346485A - 一种反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法 - Google Patents

一种反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法 Download PDF

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Abstract

本发明的方法采用分别向两份完全相同的阿斯巴甜和阿力甜混合标准液中加入不同体积的待测试液混合，在同一液相色谱条件下，注入到液相色谱仪中，以保留时间条件下组分信号是否有增加变化进行定性，以混合标准液加样后的出峰信号差比较进行定量；该方法效率高、成本低、干扰少、准确度高。

Description

一种反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿 力甜的方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法。
背景技术
阿斯巴甜和阿力甜是食品中常添加的甜味剂，甜度分别为蔗糖的200倍和2000倍。复合使用可以协同增效、降低成本、改善口感、提高甜味剂甜味的稳定性，不但甜度高、味质好、且储存期长、无热量。但若摄入过量会出现神经系统紊乱、人体肝脏被破坏等不良影响，因此是食品常测定的指标之一。
目前，食品中测定阿斯巴甜和阿力甜的方法有液相色谱法(GB5009.263-2016)、液相色谱-质谱法、离子色谱等，这些方法常用外标法、内标法或归一化法等进行定量分析。
外标法是在待测样品之外，用5-7个不同浓度的标准液绘制工作曲线后，另外再测定待测液。根据待测液中被测组分产生的信号值，由工作曲线查得待测组分的量或代入回归曲线方程求得待测组分含量。该法主要有以下缺点：(1)需要配制5-7份不同浓度的标准液，费时费力成本高；(2)多个标准液之间、标准液和待测液之间是分开测定的，不能实现同时、同步测定，当仪器条件和环境因素(如温度、湿度、大气压、电压、操作因素、仪器工作性能等)不可避免波动时，会存在一定的差异，对测定结果有不同程度的影响，引入一定的误差；(3)标准液和待测液的本底背景不同，差异较大，对测定结果的干扰程度或可能存在的副反应程度不同。将标准液和待测液分开测定，用扣空白的方法无法完全消除干扰；(4)用作图法绘制标准曲线会存在一定的作图误差；标准曲线需要时常校正或重新绘制，若样品中有多个待测组分，就需要绘制多个标准曲线，加大了工作量和成本的投入；(5)标准曲线法要求标准液和待测液的进样量十分精确，仪器操作也需要严格控制，高度一致，实际工作中很难做到。
内标法选择的内标物应是样品中不存在的、稳定易得的纯物质，理化性质与各待测定组分相近，与样品均匀互溶，又不发生任何化学反应。内标法的操作条件和进样量对分析结果的影响不大，但需要事先用标准液求得各待测组分和内标物的相对校正因子，才可代入相应公式进行计算；而且，对复杂样品，有时很难找到合适的内标物，也无法确定样品中是否不含所用内标物，因此，无法及时开展具体工作。
归一化法是相对含量分析法，操作和进样量对分析结果的影响不大，但需要样品中的所有组分全部出峰、并产生测定信号，样品中各组分的相对含量之和应为100％。这种测定方法需要用各组分的标准液测定出各自的定量校正因子和相对校正因子，准备工作量较大，而且当不能保证样品中的所有组分都出峰或缺少未知峰的校正因子时，不能用归一化法进行定量分析，应用受到限制。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对上述现有技术存在的不足，提供一种成本低、测定速度快、干扰少、适用范围广的反相液相色谱混标加样增量法同时定性和定量测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法。
本发明技术方案：
一种反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：用反相液相色谱混标加样增量法测定待测食品中是否含有阿斯巴甜和阿力甜，同时测定待测食品中阿斯巴甜和阿力甜的含量，具体方法包括以下步骤：
(1)选取待测食品；
(2)待测食品进行前处理得待测试液；
(3)配制标准液：分别配制阿斯巴甜标准储备液和阿力甜标准储备液，将阿斯巴甜标准储备液和阿力甜标准储备液逐级稀释分别得阿斯巴甜系列标准液和阿力甜系列标准液，用制备好的阿斯巴甜系列标准液和阿力甜系列标准液混合得阿力甜和阿斯巴甜混合标准液，混合标准液中阿力甜和阿斯巴甜的浓度相同；
(4)色谱分析：取两份完全相同的混合标准液置于离心管A和B，离心管A中加入体积为vA的待测试液，离心管B中加入体积为vB的待测试液，其中vB>vA；在同一色谱条件下，对离心管A中混合液进行色谱分析，得出阿斯巴甜保留时间tA1及对应的出峰信号hA1，阿力甜保留时间tA2及对应的出峰信号hA2；对离心管B中混合液进行色谱分析得出阿斯巴甜的保留时间tB1及对应的出峰信号hB1，阿力甜的保留时间tB2及对应的出峰信号hB2；
是否含有阿斯巴甜和阿力甜的测定方法：当tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则待测食品中含有阿斯巴甜；当tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则待测食品中含有阿力甜；
阿斯巴甜和阿力甜的含量的测定方法：
阿斯巴甜含量的测定：将vA、vB、hA1、hB1代入以下公式得出待测食品中阿斯巴甜的质量分数w1：
m1＝σ1×v样
阿力甜含量测定：将vA、vB、hA2、hB2代入以下公式得出待测食品中的阿力甜的质量分数w2：
m2＝σ2×v样
式中σ1为待测试液中阿斯巴甜的质量浓度，σ2为待测试液中阿力甜的质量浓度；
ms1为所用混合标准液中阿斯巴甜的质量，ms2为所用混合标准液中阿力甜的质量；
vA为离心管A中加入待测试液的体积，vB为离心管B中加入待测试液的体积；
v样为总的待测试液体积；
m1为体积是v样的待测试液中阿斯巴甜的质量；
m2为体积是v样的待测试液中阿力甜的质量；
m样为总的样品质量；
hA1为对应vA的待测试液中阿斯巴甜所测定的出峰信号，hB1为对应vB的待测试液中阿斯巴甜所测定的出峰信号；
hA2为对应vA的待测试液中阿力甜所测定的出峰信号，hB2为对应vB的待测试液中阿力甜所测定的出峰信号。
步骤(1)中选择阿力甜和阿斯巴甜质量分数范围在0.1mg/kg至45mg/kg之间的食品。
步骤(1)中选择待测食品为可口可乐、菊花晶、酸奶、糕点、浓缩果汁、巧克力制品、蜜饯中的任一种。
步骤(2)中所述待测食品处理是将液体或非液体食品，通过涡旋或/和超声、离心、定容，上清液通过滤膜处理得待测试液。
步骤(3)中阿斯巴甜和阿力甜混合标准液浓度为50μg/mL、45μg/mL、40μg/mL、35μg/mL、30μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL中任意一种。
步骤(4)中峰信号为峰高或峰面积。
步骤(4)中离心管A和B中加入待测试液的体积比为1:2。
步骤(4)中所述色谱条件为流动相为甲醇：水＝40：60，流速为0.8mL/min，波长为200nm。
本发明的有益效果：
本发明的方法采用分别向两份完全相同的阿斯巴甜和阿力甜混合标准液中加入不同体积的待测试液混合，在同一液相色谱条件下，注入到液相色谱仪中，以保留时间条件下组分信号是否有增加变化进行定性，以混合标准液加样后的出峰信号差比较进行定量，实现了(1)工作效率高：混合标准溶液与样品中多组分在同体系、同背景、同机、同法、同步、同条件下进行同时定性、定量分析，只需测得溶液中组分的信号，不用绘制标准曲线、不用测定各组分定量校正因子，节省时间，也不用所有组分出峰和选择内标物即可快速获得测定结果，极大提高了工作效率；(2)成本低：所用标准液、待测试液、试剂量少；(3)干扰少、准确度高：实现了标准液和试液完全同条件下的分离分析和同时测定，减少了因环境波动因素及试液所引入的干扰；而且，无需测定空白溶液，空白信号在测定过程中已经予以抵消，在计算公式中基本得到了扣除，准确度得到极大提高。
说明书附图
图1为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液的保留时间色谱图；
图2为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入可口可乐样品液的色谱图；
图3为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入可口可乐样品液的色谱图；
图4为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入菊花晶样品液的色谱图；
图5为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入菊花晶样品液的色谱图；
图6为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入酸奶样品液的色谱图；
图7为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入酸奶样品液的色谱图；
图8为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入糕点样品液的色谱图；
图9为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入糕点样品液的色谱图；
图10为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入浓缩果汁样品液的色谱图；
图11为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入浓缩果汁样品液的色谱图；
图12为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入巧克力制品样品液的色谱图；
图13为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入巧克力制品样品液的色谱图；
图14为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入蜜饯样品液的色谱图；
图15为阿斯巴甜和阿力甜混合标准液加入蜜饯样品液的色谱图；
图16为阿斯巴甜标准曲线；
图17为阿力甜标准曲线。
具体实施方式
本方法涉及到的试剂和仪器均为现有技术，甲醇，色谱纯，来自于上海安谱实验科技股份有限公司；乙醇，优级纯，来自于上海安谱实验科技股份有限公司，所用水为怡宝纯净水(电导率：2.23μs/cm)。
乙醇-水(2+1)：取40mL的乙醇，用20mL的水均匀混合。
80％的甲醇水：取80mL甲醇，用水定容到100mL。
50％的甲醇水：取50mL的甲醇，用水定容到100mL。
阿斯巴甜标准品(C14H18N 2O5，CAS号：22839-47-0)，含量为95％，来自于BePune实验科技有限公司。
阿力甜标准品(C14H25N3O4S，CAS号：80863-62-3)，含量为99.2％，来自于上海安谱实验科技股份有限公司。
A100250多管涡旋混合仪，月旭科技股份有限公司；
电子天平(十万分之一)：MS150/MS205DU，长沙市秋龙仪器设备有限公司；
英国Dynamica V18R台式冷冻离心机，北京五洲东方科技发展有限公司；
SB25-12DTD型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司；
高效液相色谱仪：Utimate3000(2017LH131)，赛默飞科技股份有限公司；
色谱柱：Hypersil GOLD C18 150mm×4.6mm(SN：10567553)。
阿斯巴甜和阿力甜标准储备液的配制(0.50mg/mL)：称取阿斯巴甜0.02632g(精确至0.0001g)，称取阿力甜0.02520g(精确至0.0001g)，用水将阿斯巴甜和阿力甜分别溶解至50mL容量瓶内并定容至刻度，分别得到浓度0.50mg/mL的阿斯巴甜标准储备液和浓度为0.50mg/mL的阿力甜标准储备液，并置于4℃左右的冰箱中保存，配制的标准储备液有效期为90d。
阿斯巴甜和阿力甜混合标准液的配制：将阿力甜标准储备液用水逐级稀释，得浓度均分别为150μg/mL、100μg/mL、90μg/mL、80μg/mL、75μg/mL、70μg/mL、60μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的阿力甜系列标准液；将阿斯巴甜标准储备液用水逐级稀释，得浓度均分别为150μg/mL、100μg/mL、90μg/mL、80μg/mL、75μg/mL、70μg/mL、60μg/mL、50μg/mL、40μg/mL、30μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的阿斯巴甜系列标准液；将相同浓度的阿力甜系列标准液和相同浓度的阿斯巴甜系列标准液等体积混合配制成一半浓度的混合标准液，即1体积100μg/mL阿力甜标准液加1体积的100μg/mL阿期巴甜标准液混合配制成50μg/mL的阿力甜和阿斯巴甜混合标准溶液。同样方法制得45μg/mL、40μg/mL、35μg/mL、30μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL等的阿力甜和阿斯巴甜混合标准溶液，并置于4℃左右的冰箱保存，有效期为30d。
还可以选阿力甜系列标准液和阿斯巴甜系列标准液不同浓度和不同体积进行混合均匀得到以上阿力甜和阿斯巴甜混合标准溶液，比如1体积150μg/mL的阿力甜标准液加上2体积75μg/mL阿斯巴甜标准液混合均匀得50μg/mL的阿力甜和阿斯巴甜混合标准液。
由于阿力甜和阿斯巴甜混合标准液中阿力甜和阿斯巴甜浓度相同，因此阿力甜和阿斯巴甜混合标准液的浓度即是混合标准液中阿力甜的浓度也是阿斯巴甜的浓度。
选择流动相为甲醇：水＝40：60，流速为0.8mL/min。
基于阿斯巴甜和阿力甜在紫外光区的检测灵敏度，选择200nm波长检测，确定阿斯巴甜和阿力甜的保留时间如图1所示，阿斯巴甜与阿力甜出峰较好。
选择阿力甜和阿斯巴甜质量分数范围在0.1mg/kg至45mg/kg之间的食品。购买市售可口可乐、糕点、原味酸奶、菊花晶固体饮料、浓缩果汁、巧克力制品、蜜饯于郑州市二七区马寨镇好又多超市。
实施例1
称取约5.000g(精确到0.001g)可口可乐碳酸饮料试样于50mL烧杯中，在超声波震荡器上除去二氧化碳，全部转入25mL容量瓶中用水定容，混匀后，被测组分达到浓度平衡，4000r/min离心机离心5min，上清液和下层液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度相同，离心是沉淀样品中可能存在的颗粒物质，取上清液用0.45μm的水系滤膜过滤后得待测试液，用于色谱分析。
取两个相同的离心管A、B，分别加入10μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液50μL，再向离心管A中加入100μL可口可乐待测试液，定容至1mL；另外再向离心管B中加入200μL可口可乐待测试液，定容至1mL。最后将A和B离心管中混合溶液通过色谱分析，A离心管得到的液相色谱图图2中阿斯巴甜保留时间tA1为3.643min，峰高hA1为10.188mAU，阿力甜的保留时间tA2为6.527min，峰高hA2为6.260mAU；B离心管得到的液相色谱图图3中阿斯巴甜保留时间tB1为3.633min，峰高hB1为11.464mAU，阿力甜的保留时间tB2为6.520min，峰高hB2为7.163mAU。
由图2和图3峰高的变化情况，观察到加入不同体积的可口可乐待测试液后阿斯巴甜和阿力甜在各自相同保留时间下，相对应的峰高有所增加，保留时间允许的误差范围内tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则可口可乐中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则可口可乐中含有阿力甜，以此进行定性分析。
由于一定条件下测定时，测定信号与待测组分的量呈正比，因此有：
(ms+mA)＝k×hA (1)
(ms+mB)＝k×hB (2)
在完全相同的条件下测定时，比例常数k相同，(1)式除以(2)式有：
即
因此
ρ×(vB×hA-vA×hB)＝ms×(hB-hA)
式中，ms为混合标准液中阿斯巴甜或阿力甜的质量，A和B中加入相同的混合标准液，则A和B中的ms完全相同，vA为加入到A离心管中待测试液的体积，vB为加入到B离心管中待测试液的体积，hA为A离心管中阿斯巴甜或者阿力甜测得峰高信号值，hB为B离心管中阿斯巴甜或者阿力甜测得峰高信号值。
ρ为待测试液中阿斯巴甜或者阿力甜的质量浓度，v样为总的待测试液体积；m样为总的样品质量。
由上述可知，加入离心管A、B混合标准溶液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度分别为10μg/mL，体积为50μL，则阿斯巴甜和阿力甜的质量均为0.5μg，即ms1＝0.5μg、ms2＝0.5μg；由于5g可口可乐经前处理后得25mL可口可乐待测试液，A离心管中加入的待测试液为100μL，B离心管中加入的待测试液为200μL。则总的待测试液为25mL＝25000μL。
根据(3)式计算可口可乐试液中：
阿斯巴甜质量浓度：
阿力甜质量浓度
根据(4)式计算可口可乐中：
阿斯巴甜质量分数：
阿力甜质量分数：
同样的步骤进行6次平行测定与计算，其结果见表1。
同样的步骤，分别在混合标准液不同浓度的情况下测定，各进行6次平行测定与计算，其结果见表2：其中混合标准液的浓度为50μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为45μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为40μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为35μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为15μL；混合标准液浓度为30μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为25μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为20μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为25μL；混合标准液浓度为15μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为30μL；混合标准液浓度为10μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为50μL；混合标准液浓度为5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为100μL；混合标准液浓度为2.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为200μL；混合标准液浓度为1μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为500μL；混合标准液浓度为0.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为600μL。
实施例2
称取约1.000g(精确到0.001g)菊花晶试样于50mL烧杯中，加10mL水，超声波震荡提取20min，将提取液移入25mL容量瓶中，残渣再加入10mL水超声波提取10min，将两次提取液移入同一个25mL的容量瓶中，用水定容，混匀后，被测组分达到浓度平衡，4000r/min离心机离心5min，上清液和下层液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度相同，离心是沉淀样品中可能存在的颗粒物质，取上清液用0.45μm的水系滤膜过滤后得待测试液，用于色谱分析。
取两个相同的离心管A、B，分别加入10μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液50μL，再向离心管A中加入100μL菊花晶待测试液，定容至1mL；另外再向离心管B中加入200μL菊花晶待测试液，定容至1mL；最后将离心管A和B中混合溶液通过色谱分析。A离心管得到的液相色谱图图4中阿斯巴甜保留时间tA1为3.633min，峰高hA1为10.138mAU，阿力甜的保留时间tA2为6.510min，峰高hA2为5.829mAU；B离心管得到的液相色谱图图5中阿斯巴甜保留时间tB1为3.633min，峰高hB1为10.465mAU，阿力甜的保留时间tB2为6.500min，峰高hB2为5.964mAU。
由4和图5峰高的变化情况，观察到加入不同体积的菊花晶待测试液后阿斯巴甜和阿力甜在各自保留时间下，相对应的峰高有所增加，在保留时间允许的误差范围内tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则菊花晶中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则菊花晶中含有阿力甜，以此进行定性分析。
由上述可知，加入离心管A、B混合标准溶液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度分别为10μg/mL，体积为50μL则阿斯巴甜和阿力甜的质量均为0.5μg，即ms1＝0.5μg、ms2＝0.5μg；由于1g菊花晶经前处理后得25mL菊花晶待测试液，A离心管中加入的待测试液为100μL，B离心管中加入的待测试液为200μL，则总的待测试液为25mL＝25000μL，
根据(3)式计算菊花晶待测试液中：
阿斯巴甜质量浓度：
阿力甜质量浓度：
根据(4)式计算中菊花晶中：
阿斯巴甜质量分数：
阿力甜质量分数：
同样的步骤进行6次平行测定与计算，其结果见表1。
同样的步骤，分别在混合标准液不同浓度的情况下测定，各进行6次平行测定与计算，其结果见表2：其中混合标准液的浓度为50μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为45μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为40μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为35μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为15μL；混合标准液浓度为30μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为25μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为20μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为25μL；混合标准液浓度为15μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为30μL；混合标准液浓度为10μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为50μL；混合标准液浓度为5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为100μL；混合标准液浓度为2.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为200μL；混合标准液浓度为1μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为500μL；混合标准液浓度为0.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为600μL。
实施例3
称取5.000g(精确到0.001g)酸奶试样于50mL离心管中，加入10mL乙醇，沉淀酸奶试样中的蛋白质，盖紧盖子，上下轻轻颠倒离心管5次(不能振摇)，将离心管混匀涡旋10s后，静置1min，用4000r/min离心机离心5min，取上清液滤入25mL容量瓶中，滤渣用8mL乙醇-水(2+1)洗涤，离心后上清液移入同一个容量瓶，离心是便于过滤少量蛋白质沉淀等滤渣，待测样品中的待测组分完全提取至上清液中后，用乙醇-水(2+1)定容至25mL，用0.45μm有机系滤膜过滤后得待测试液，用于液相色谱分析。
取两个相同的离心管A、B，分别加入10μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液50μL，再向离心管A中加入100μL酸奶待测试液，定容至1mL；另外再向离心管B中加入200μL酸奶待测试液，定容至1mL；最后将离心管A和B中混合溶液通过色谱分析。A离心管得到的液相色谱图图6中阿斯巴甜保留时间tA1为3.720min，峰高hA1为9.257mAU，阿力甜的保留时间tA2为6.730min，峰高hA2为6.495mAU；B离心管得到的液相色谱图图7中阿斯巴甜保留时间tB1为3.713min，峰高hB1为9.787mAU，阿力甜的保留时间tB2为6.730min，峰高hB2为6.672mAU。
由6和图7峰高的变化情况，观察到加入不同体积的酸奶待测试液后阿斯巴甜和阿力甜在各自保留时间下，相对应的峰高有所增加，在保留时间允许的误差范围内tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则酸奶中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则酸奶中含有阿力甜，以此进行定性分析。
由上述可知，加入离心管A、B混合标准溶液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度分别为10μg/mL，体积为50μL则阿斯巴甜和阿力甜的质量均为0.5μg，即ms1＝0.5μg、ms2＝0.5μg；由于5g酸奶经前处理后得25mL酸奶待测试液，A离心管中加入的待测试液为100μL，B离心管中加入的待测试液为200μL。则总的待测试液为25mL＝25000μL。
根据(3)式计算酸奶待测试液中：
阿斯巴甜质量浓度：
阿力甜质量浓度：
根据(4)式计算中酸奶中：
阿斯巴甜质量分数：
阿力甜质量分数：
同样的步骤进行6次平行测定与计算，其结果见表1。
同样的步骤，分别在混合标准液不同浓度的情况下测定，各进行6次平行测定与计算，其结果见表2：其中混合标准液的浓度为50μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为45μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为40μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为35μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为15μL；混合标准液浓度为30μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为25μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为20μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为25μL；混合标准液浓度为15μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为30μL；混合标准液浓度为10μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为50μL；混合标准液浓度为5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为100μL；混合标准液浓度为2.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为200μL；混合标准液浓度为1μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为500μL；混合标准液浓度为0.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为600μL。
实施例4
糕点试样需用食品加工机粉碎均匀，称取1.000g(精确到0.001g)于50mL离心管中，加入12mL 50％甲醇水溶液，涡旋使其均匀，超声波提取10min，在4000r/min离心机离心5min，离心起到将固体残渣过滤的作用，上清液移入25mL容量瓶中。残渣再加10mL50％甲醇水溶液，涡旋混匀，超声波提取5min，将待测组分充分提取，4000r/min离心机离心5min，离心起到将固体残渣快速沉淀的作用，上清液移入同一个25mL容量瓶中，待测样品中的待测组分完全提取至上清液中后，用水定容，用0.45μm有机系滤膜过后得待测试液，用于液相色谱分析。
取两个相同的离心管A、B，分别加入10μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液50μL，再向离心管A中加入100μL糕点待测试液，定容至1mL；另外再向离心管B中加入200μL糕点待测试液，定容至1mL。最后将A和B离心管中混合溶液通过色谱分析，A离心管得到的液相色谱图图8中阿斯巴甜保留时间tA1为3.633min，峰高hA1为10.270mAU，阿力甜的保留时间tA2为6.277min，峰高hA2为3.092mAU；B离心管得到的液相色谱图图9中阿斯巴甜保留时间tB1为3.630min，峰高hB1为10.935mAU，阿力甜的保留时间tB2为6.260min，峰高hB2为3.448mAU。
由图8和图9峰高的变化情况，观察到加入不同体积的糕点待测试液后阿斯巴甜和阿力甜在各自相同保留时间下，相对应的峰高有所增加，保留时间允许的误差范围内tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则糕点中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则糕点中含有阿力甜，以此进行定性分析。
由上述可知，加入离心管A、B混合标准溶液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度分别为10μg/mL，体积为50μL则阿斯巴甜和阿力甜的质量均为0.5μg，即ms1＝0.5μg、ms2＝0.5μg；由于1g糕点经前处理后得25mL糕点待测试液，A离心管中加入的待测试液为100μL，B离心管中加入待测试液为200μL，则总的待测试液体积为25mL＝25000μL。
根据(3)式计算糕点待测试液中：
阿斯巴甜质量浓度：
阿力甜质量浓度：
根据(4)式计算中糕点中：
阿斯巴甜质量分数：
阿力甜质量分数：
同样的步骤进行6次平行测定与计算，其结果见表1。
同样的步骤，分别在混合标准液不同浓度的情况下测定，各进行6次平行测定与计算，其结果见表2：其中混合标准液的浓度为50μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为45μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为40μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为35μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为15μL；混合标准液浓度为30μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为25μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为20μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为25μL；混合标准液浓度为15μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为30μL；混合标准液浓度为10μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为50μL；混合标准液浓度为5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为100μL；混合标准液浓度为2.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为200μL；混合标准液浓度为1μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为500μL；混合标准液浓度为0.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为600μL。
实施例5
称取2.000g浓缩果汁(精确到0.001g)于50mL离心管中，加10mL水，超声波震荡提取20min，待测组分将充分提取，将提取液移入25mL容量瓶中，残渣再加入10mL水超声波提取10min，将两次提取液移入同一个25mL的容量瓶中，用水定容，混匀后，被测组分达到浓度平衡，4000r/min离心机离心5min，上清液和下层液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度相同，离心是沉淀样品中可能存在的颗粒物质。取上清液用0.45μm的水系滤膜过滤后得待测试液，用于色谱分析。
取两个相同的离心管A、B，分别加入10μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液50μL，再向离心管A中加入100μL浓缩果汁待测试液，定容至1mL；另外再向离心管B中加入200μL浓缩果汁待测试液，定容至1mL。最后将A和B离心管中混合溶液通过色谱分析，A离心管得到的液相色谱图图10中阿斯巴甜保留时间tA1为3.707min，峰高hA1为10.089mAU，阿力甜的保留时间tA2为6.717min，峰高hA2为5.489mAU；B离心管得到的液相色谱图图11中阿斯巴甜保留时间tB1为3.710min，峰高hB1为12.375mAU，阿力甜的保留时间tB2为6.717min，峰高hB2为6.866mAU。
由图10和图11峰高的变化情况，观察到加入不同体积的浓缩果汁待测试液后阿斯巴甜和阿力甜在各自相同保留时间下，相对应的峰高有所增加，保留时间允许的误差范围内tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则浓缩果汁中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则浓缩果汁中含有阿力甜，以此进行定性分析。
由上述可知，加入离心管A、B混合标准溶液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度分别为10μg/mL，体积为50μL则阿斯巴甜和阿力甜的质量均为0.5μg，即ms1＝0.5μg、ms2＝0.5μg；由于2g浓缩果汁经前处理后得25mL浓缩果汁待测试液，A离心管中加入的待测试液为100μL，B离心管中加入的待测试液为200μL，则总的待测试液体积为25mL＝25000μL。
根据(3)式计算浓缩果汁待测试液中：
阿斯巴甜质量浓度：
阿力甜质量浓度：
根据(4)式计算浓缩果汁中：
阿斯巴甜质量分数：
阿力甜质量分数：
同样的步骤进行6次平行测定与计算，其结果见表1。
同样的步骤，分别在混合标准液不同浓度的情况下测定，各进行6次平行测定与计算，其结果见表2：其中混合标准液的浓度为50μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为45μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为40μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为35μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为15μL；混合标准液浓度为30μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为25μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为20μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为25μL；混合标准液浓度为15μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为30μL；混合标准液浓度为10μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为50μL；混合标准液浓度为5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为100μL；混合标准液浓度为2.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为200μL；混合标准液浓度为1μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为500μL；混合标准液浓度为0.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为600μL。
实施例6
用食品加工机按巧克力制品与水的质量比为1比4进行匀浆，称取5.000g(精确到0.001g)巧克力制品匀浆于25mL离心管中，加入10mL水超声振荡提取20min，静置1min，4000r/min离心5min，上清液转入100mL的分液漏斗中，离心管中再加入10mL水超声振荡提取10min，静置和离心后将上清液再次转入分液漏斗中，向分液漏斗加入15mL正己烷，振摇30s，静置分层约5min，阿斯巴甜和阿力甜不溶于脂溶性溶剂，将下层水相放入25mL容量瓶，待测样品中的待测组分完全提取至下层水相中，用水定容至刻度，用0.45μm的水系滤膜过滤后得待测试液，用于液相色谱分析。
取两个相同的离心管A、B，分别加入10μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液50μL，再向离心管A中加入100μL巧克力制品待测试液，定容至1mL；另外再向离心管B中加入200μL巧克力制品待测试液，定容至1mL。最后将A和B离心管中混合溶液通过色谱分析，A离心管得到的液相色谱图图12中阿斯巴甜保留时间tA1为3.647min，峰高hA1为12.268mAU，阿力甜的保留时间tA2为6.570min，峰高hA2为8.963mAU；B离心管得到的液相色谱图图13中阿斯巴甜保留时间tB1为3.633min，峰高hB1为14.539mAU，阿力甜的保留时间tB2为6.500min，峰高hB2为10.561mAU。
由图12和图13峰高的变化情况，观察到加入不同体积的巧克力制品待测试液后阿斯巴甜和阿力甜在各自相同保留时间下，相对应的峰高有所增加，保留时间允许的误差范围内tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则巧克力制品中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则巧克力制品中含有阿力甜，以此进行定性分析。
由上述可知，加入离心管A、B混合标准溶液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度分别为10μg/mL，体积为50μL则阿斯巴甜和阿力甜的质量均为0.5μg，即ms1＝0.5μg、ms2＝0.5μg；由于5g巧克力制品匀浆中，水和巧克力制品比是4比1，所以5g匀浆中有1g巧克力制品，A离心管中加入的待测试液为100μL，B离心管中加入的待测试液为200μL，则总试液体积为25mL＝25000μL。
根据(3)式计算巧克力制品待测试液中：
阿斯巴甜质量浓度：
阿力甜质量浓度：
根据(4)式计算巧克力制品中：
阿斯巴甜质量分数：
阿力甜质量分数：
同样的步骤进行6次平行测定与计算，其结果见表1。
同样的步骤，分别在混合标准液不同浓度的情况下测定，各进行6次平行测定与计算，其结果见表2：其中混合标准液的浓度为50μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为45μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为40μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为35μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为15μL；混合标准液浓度为30μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为25μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为20μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为25μL；混合标准液浓度为15μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为30μL；混合标准液浓度为10μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为50μL；混合标准液浓度为5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为100μL；混合标准液浓度为2.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为200μL；混合标准液浓度为1μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为500μL；混合标准液浓度为0.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为600μL。
实施例7
用食品加工机按蜜饯与水的质量比为1比2进行匀浆，称取3.000g(精确到0.001g)蜜饯匀浆于25mL离心管中，加入10mL 50％的甲醇水溶液，摇匀，超声10min，4000r/min离心5min，上清液转入25mL容量瓶，再加10mL50％的甲醇水溶液重复操作一次，上清液转入同一个25mL容量瓶，待测样品中的待测组分完全提取至上清液中后，用50％的甲醇水溶液定容，经0.45μm有机系滤膜过滤后，用于液相色谱分析。
取两个相同的离心管A、B，分别加入10μg/mL阿斯巴甜和阿力甜混合标准液50μL，再向离心管A中加入100μL蜜饯待测试液，定容至1mL；另外再向离心管B中加入200μL蜜饯待测试液，定容至1mL。最后将A和B离心管中混合溶液通过色谱分析，A离心管得到的液相色谱图图14中阿斯巴甜保留时间tA1为3.633min，峰高hA1为13.169mAU，阿力甜的保留时间tA2为6.520min，峰高hA2为9.225mAU；B离心管得到的液相色谱图图15中阿斯巴甜保留时间tB1为3.637min，峰高hB1为15.198mAU，阿力甜的保留时间tB2为6.530min，峰高hB2为11.613mAU。
由图14和图15峰高的变化情况，观察到加入不同体积的蜜饯待测试液后阿斯巴甜和阿力甜在各自相同保留时间下，相对应的峰高有所增加，保留时间允许的误差范围内tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则蜜饯中含有阿斯巴甜，tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则蜜饯中含有阿力甜，以此进行定性分析。
由上述可知，加入离心管A、B混合标准溶液中阿斯巴甜和阿力甜的浓度分别为10μg/mL，体积为50μL则阿斯巴甜和阿力甜的质量均为0.5μg，即ms1＝0.5μg、ms2＝0.5μg；由于3g蜜饯匀浆中，水和蜜饯比是2比1，所以3g匀浆中有1g蜜饯，A离心管中加入的待测试液为100μL，B离心管中加入的待测试液为200μL，则总试液体积为25mL＝25000μL。
根据(3)式计算蜜饯待测试液中：
阿斯巴甜质量浓度：
阿力甜质量浓度：
根据(4)式计算蜜饯中：
阿斯巴甜质量分数：
阿力甜质量分数：
同样的步骤进行6次平行测定与计算，其结果见表1。
同样的步骤，分别在混合标准液不同浓度的情况下测定，各进行6次平行测定与计算，其结果见表2：其中混合标准液的浓度为50μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为45μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为40μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为10μL；混合标准液浓度为35μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为15μL；混合标准液浓度为30μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为25μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为20μL；混合标准液浓度为20μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为25μL；混合标准液浓度为15μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为30μL；混合标准液浓度为10μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为50μL；混合标准液浓度为5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为100μL；混合标准液浓度为2.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为200μL；混合标准液浓度为1μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为500μL；混合标准液浓度为0.5μg/mL时，加入离心管A、B中的体积均为600μL。
表1待测食品6次平行测定结果
由表1可知，7个实施例测定结果的相对标准偏差RSD均小于5％，表明精密度较好。通过色谱图比较分析，以及峰高信号的变化值，可简便、快速计算出待测食品中待测组分的含量。同时通过色谱图比较分析，也可用峰面积信号的数据代入到上述相应公式中计算结果。
表2不同浓度混合标准液下测定值
本发明方法学考察实验
1.检出限和定量限
根据表1，按3倍标准偏差计算检出限，按10倍标准偏差计算定量限。7种待测食品的阿斯巴甜和阿力甜的检出限、定量限见表3。
表3检出限和定量限
由卫生部国家食品安全标准GB 5009.263-2016食品中阿斯巴甜和阿力甜的测定[S]的检出限和定量限可知，碳酸饮料、液态乳饮料中的阿斯巴甜和阿力甜的检出限为1mg/kg，定量限为3mg/kg，巧克力制品、水果及其制品、固体饮料及其制品中的阿斯巴甜和阿力甜的检出限为5mg/kg，定量限为15mg/kg；本发明方法检出限和定量限均低于卫生部国家食品安全标准中的检出限和定量限。
2.阿斯巴甜和阿力甜加标回收率
以酸奶测定加标回收率，分别对样品进行三个水平的加标回收，每个水平做6次平行测定，取平均值，结果如表4。
表4阿斯巴甜回收率测定结果
由表4测定结果可知，本发明方法测定酸奶中的阿斯巴甜回收率在90.5％-98.3％之间，测定结果较好。
分别对样品中的阿力甜进行三个水平的加标回收率试验，每一个水平做6次平行测定，取平均值计算回收率，如表5所示。
表5阿力甜回收率测定结果
由表5测定结果可知，样品中阿里甜的回收率为93.2％-95.8％。该法尤其适用于多组分的色谱定性和定量分析，因为各组分在色谱柱中得到了充分分离，相互之间互不干扰。在色谱分析中，各组分依次出峰，通过出峰信号测定值，便可分别快速计算含量；本发明实施例所用出峰信号为峰高，还可以用出峰面积代入实施例中的公式进行计算。
3.国标法对比实验
3.1试验浓度范围、检出限和定量限
按国标法规定的波长和色谱条件，以50μg/mL、45μg/mL、40μg/mL、35μg/mL、30μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL的标准混合使用液统一进样5μL进行测定，以组分的质量浓度为横坐标，以峰高或峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得出线性回归方程，如图16、图17所示。阿斯巴甜的回归直线方程为Y＝4.6921x-1.4649，测定系数(相关度)R2＝0.9998，阿力甜的回归直线方程为Y＝2.8836x-1.1944，测定系数(相关度)R2＝0.9998。
由国标法文献可知，碳酸饮料、液态乳饮料中的阿斯巴甜和阿力甜的检出限为1mg/kg，定量限为3mg/kg，固体饮料及其制品中的阿斯巴甜和阿力甜的检出限为5mg/kg，定量限为15mg/kg
3.2国标法加标回收率和精密度
为了考察国标方法的相对标准偏差RSD和回收率，对同一种样品取相同两份，其中一份中加入5mg/kg标准液，一份不加标准液，每个样品进行6次平行测定，取平均值，结果见表6。
表6样品的国标法加标回收率及相对标准偏差
由表6数据可知，国标法针对食品不同基质特性，采用外标法绘制标准曲线，定量确定样品中待测物质的含量。结果表明，阿斯巴甜和阿力甜的回收率在76.2％-92.8％之间，相对标准偏差RSD在0.45％-4.8％。
3.3本发明方法和国标法显著性检验的结果与结论
以酸奶为样品，样品前处理依据GB5009.263-2016，用本法和国标法进行对照试验，每个样品进行6次平行测定，测定结果如表7。
表7对照试验测定结果
用显著性检验的方法，对国标法和混标加样增量法进行方差分析和T检验，同时进行科学评价。由表7数据和参考文献(张仲欣，杜双奎.食品试验设计与数据处理[M].郑州:郑州大学出版社，2011.)可知，计算出的F值小于F检验表中F0.05＝4.95，表明混标加样增量法与国标法之间不存在显著的偶然误差。因此，具备进行T检验的前提和基础，由表7数据和参考文献(张仲欣，杜双奎.食品试验设计与数据处理[M].郑州:郑州大学出版社，2011.)可知，计算出的T值小于T检验表中T0.05＝2.23，表明混标加样增量法与国标法间也不存在显著的系统误差，结论的置信度为95％。因此，本发明的有益效果、科学性、创新性、方法的突出优势和应用前景十分明显。
本发明以上实施例中，均采用离心管A和B中加入待测试液的体积比为1:2，离心管A和B中待测试液的体积比，只要能让两个离心管中待测试液的出峰信号产生明显差异，均可通过以上方法达到本发明的技术效果；同时，只要被测组分在定量限以上，本法均可适用。
该法不仅适用于液相色谱法，也适用于气相色谱、离子色谱、超临界流体色谱、毛细管电动色谱等分离分析法，不仅适用于分离分析法，也适用于化学发光分析法、荧光分析法、磷光分析法、生物发光分析法等分子发光分析法，不仅适用于分子发光分析法，也适用于原子发射光谱、原子吸收光谱、原子荧光光谱和紫外、可见分子吸收光谱，不仅适用于测定阿斯巴甜和阿里甜的测定，也适用于其他物质组分的测定，尤其适用于分离分析技术。根据所用方法不同，测定信号可以是色谱峰峰高h、色谱峰峰面积、相对发光强度I、吸光度A等等，可行性和应用领域十分广泛。

Claims (8)

1.一种反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：用反相液相色谱混标加样增量法测定待测食品中是否含有阿斯巴甜和阿力甜，同时测定待测食品中阿斯巴甜和阿力甜的含量，具体方法包括以下步骤：
(1)选取待测食品；
(2)待测食品进行前处理得待测试液；
(3)配制标准液：分别配制阿斯巴甜标准储备液和阿力甜标准储备液，将阿斯巴甜标准储备液和阿力甜标准储备液逐级稀释分别得阿斯巴甜系列标准液和阿力甜系列标准液，用制备好的阿斯巴甜系列标准液和阿力甜系列标准液混合得阿力甜和阿斯巴甜混合标准液，混合标准液中阿力甜和阿斯巴甜的浓度相同；
(4)色谱分析：取两份完全相同的混合标准液置于离心管A和B，离心管A中加入体积为vA的待测试液，离心管B中加入体积为vB的待测试液，其中vB>vA；在同一色谱条件下，对离心管A中混合液进行色谱分析，得出阿斯巴甜保留时间tA1及对应的出峰信号hA1，阿力甜保留时间tA2及对应的出峰信号hA2；对离心管B中混合液进行色谱分析得出阿斯巴甜的保留时间tB1及对应的出峰信号hB1，阿力甜的保留时间tB2及对应的出峰信号hB2；
是否含有阿斯巴甜和阿力甜的测定方法：当tA1＝tB1，hB1-hA1>0，则待测食品中含有阿斯巴甜；当tA2＝tB2，hB2-hA2>0，则待测食品中含有阿力甜；
阿斯巴甜和阿力甜的含量的测定方法：
阿斯巴甜含量的测定：将vA、vB、hA1、hB1代入以下公式得出待测食品中阿斯巴甜的质量分数w1：
m1＝ρ1×v样
阿力甜含量测定：将vA、vB、hA2、hB2代入以下公式得出待测食品中的阿力甜的质量分数w2：
m2＝ρ2×v样
式中ρ1为待测试液中阿斯巴甜的质量浓度，ρ2为待测试液中阿力甜的质量浓度；
ms1为所用混合标准液中阿斯巴甜的质量，ms2为所用混合标准液中阿力甜的质量；
vA为离心管A中加入待测试液的体积，vB为离心管B中加入待测试液的体积；
v样为总的待测试液体积；
m1为体积是v样的待测试液中阿斯巴甜的质量；
m2为体积是v样的待测试液中阿力甜的质量；
m样为总的样品质量；
hA1为对应vA的待测试液中阿斯巴甜所测定的出峰信号，hB1为对应vB的待测试液中阿斯巴甜所测定的出峰信号；
hA2为对应vA的待测试液中阿力甜所测定的出峰信号，hB2为对应vB的待测试液中阿力甜所测定的出峰信号。
2.根据权利要求1所述的反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：所述步骤(1)中选择阿力甜和阿斯巴甜质量分数范围在0.1mg/kg至45mg/kg之间的食品。
3.根据权利要求2所述的反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：所述步骤(1)中选择待测食品为可口可乐、菊花晶、酸奶、糕点、浓缩果汁、巧克力制品、蜜饯中的任一种。
4.根据权利要求1所述的反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：所述步骤(2)中所述待测食品处理是将液体或非液体食品，通过涡旋或/和超声、离心、定容，上清液通过滤膜处理得待测试液。
5.根据权利要求1中所述的反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：所述步骤(3)中阿斯巴甜和阿力甜混合标准液浓度为50μg/mL、45μg/mL、40μg/mL、35μg/mL、30μg/mL、25μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2.5μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL中任意一种。
6.根据权利要求1中所述的反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：所述步骤(4)中峰信号为峰高或峰面积。
7.根据权利要求1中所述的反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：所述步骤(4)中离心管A和B中加入待测试液的体积比为1:2。
8.根据权利要求1所述的反相液相色谱混标加样增量法测定食品中阿斯巴甜和阿力甜的方法，其特征在于：所述步骤(4)中所述色谱条件为流动相为甲醇：水＝40：60，流速为0.8mL/min，波长为200nm。
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