CN101634648A - 超高压液相色谱—飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用超高压液相色谱与飞行时间质谱联用技术对白酒中六种微量甜味剂进行同时检测的方法。尤为独特的是该方法采用超高压液相色谱－飞行时间质谱联用(UPLC－TOF－MS)技术，特别针对目前白酒行业中多种甜味剂同时微量添加的现象。本发明不但可同时检测安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜六种甜味剂，而且快速、简便，定性、定量准确、灵敏度高，行之有效的解决了以上问题。本发明方法安赛蜜检出限为0.05mg/L、糖精钠、甜蜜素、纽甜检出限为0.01mg/L、三氯蔗糖、阿斯巴甜检出限为0.1mg/L，且一次进样分析仅需10min，线性关系、重复性良好。经与权威部门检测数据对比本发明方法检测的数据同样准确可靠。

Description

超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法

技术领域

本发明涉及利用超高压液相色谱与飞行时间质谱联用技术对白酒中六种微量甜味剂同时进行检测的方法。属于发酵食品工业中的化学分析和仪器分析技术领域。

背景技术

甜味剂是一类重要的食品添加剂，它赋予食品以甜味，提高食品的品质，有着热量低、适合糖尿病人食用等优点。甜味剂按其来源可分为天然甜味剂和人工合成甜味剂。在现代食品工业中广泛应用的人工合成甜味剂主要包括乙酰磺胺酸钾(安赛蜜，Acesulfame-K)、邻苯甲酰磺酰胺钠(糖精钠，Saccharin sodium)、环己基氨基磺酸钠(甜蜜素，Sodium cyclamate)、三氯蔗糖(蔗糖素，Sucralose)、天冬氨酰苯丙氨酸甲酯(阿斯巴甜，Aspartame)和N-[N-(3，3-二甲基丁基)-L-α-天门冬氨酰]-L-苯丙氨酸1-甲酯(纽甜，Neotame)，这些甜味剂的甜度分别是蔗糖的200、300、50、600、150和10000倍。随着人工合成甜味剂在日常食品中应用范围的拓宽和使用量的不断加大，尤其是近年来有报道说某些甜味剂具有潜在致癌致畸、损害肾功能等副作用，各国政府和相关科研机构对人工合成甜味剂使用的安全性也越来越重视。我国2007年制定的《食品添加剂使用卫生标准》对人工甜味剂的加入量有严格规定。因此，人工合成甜味剂在生产中合理的使用，不仅关系到产品的品质，更关系到消费者的安全与健康。

白酒是我国特有的民族传统产品，有着上千年的历史，由于其风格独特，深受广大消费者喜爱，在国际上也享有盛誉，被称为“国宝”。现代研究表明，优质发酵的白酒之所以具有醇甜感，是由于白酒本身含有一定的多元醇或酮等甜味物质，如：2，3-丁二醇、丙三醇、正丁醇等。为保护我国民族传统产品，国家标准中明确规定其生产过程中不允许添加甜味剂。但个别生产企业为掩盖劣质酒口味的苦涩，使其口感干冽、醇厚、绵软，仍在酒的加工过程中违规的添加了甜味剂，达到降低成本、以次充好的目的。不但扰乱了正常的白酒市场次序而且严重的损害了广大消费者的健康。可见研究开发出快速、准确的检测白酒中甜味剂的方法十分必要。

目前关于食品中甜味剂的检测方法较多，最普遍的是高效液相色谱-紫外检测法，另外还有毛细管气相色谱法、超高压液相色谱-蒸发光散射检测法、紫外分光光度法。但基本上都是针对单一甜味剂或者对两种甜味剂进行测定，检测灵敏度也有待提高，无法应对目前个别企业为逃避监管，同时微量添加多种甜味剂的现象。而且由于甜蜜素与三氯蔗糖的紫外吸收较弱，不适宜使用紫外检测器，所以使多种甜味剂同时检测受到限制，而本发明方法则克服了上述方法的缺点，可同时检测目前常见的安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜六种人工合成甜味剂。

发明内容

本发明涉及利用超高压液相色谱与飞行时间质谱联用技术对白酒中六种微量甜味剂进行同时检测的方法。较为独特的是该方法采用超高效液相色谱-飞行时间质谱联用(UPLC-TOF-MS)技术，针对白酒中常被违规添加的甜味剂，不但可同时检测安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜六种甜味剂，而且快速、简便，定性、定量准确、灵敏度高。

本发明方法在样品经预处理后，通过BEH C18色谱柱分离以甲醇-20mmol/L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱，在ESI负离子模式下检测，选择安赛蜜m/z＝162([M-K]^-)；糖精钠m/z＝182([M-Na]^-)；甜蜜素m/z＝178([M-Na]^-)；三氯蔗糖m/z＝395([M-H]^-)；阿斯巴甜m/z＝293([M-H]^-)；纽甜m/z＝377([M-H]^-)为监测离子，一次进样分析仅需10min，且线性关系良好。本发明方法安赛蜜检出限为0.05mg/L、糖精钠、甜蜜素、纽甜检出限为0.01mg/L、三氯蔗糖、阿斯巴甜检出限为0.1mg/L，且一次进样分析仅需10min，线性关系、重复性良好。经与权威部门检测数据对比本发明方法检测的数据同样准确可靠。可以针对白酒企业使用的复配甜味剂组成进行定性定量检测，以弥补目前检测方法周期长、不能同时分析、定量检测等不足之处。

具体来说，本发明的主要分析步骤如下：

1样品预处理

由于白酒中乙醇含量较高，在进行液相色谱分离时，容易对甜味剂在色谱柱保留性能产生影响。所以利用物理或化学方法脱去待测酒样醇类等易挥发组分。

2色谱条件

(1)色谱柱型号：BEH C-18 2.1mm×50mm 1.7um；

(2)检测器：紫外检测器；

(3)检测波长：200～800nm；

(4)流动相：流动相A：甲醇，流动相B：20mmol/L乙酸铵溶液；

(5)梯度洗脱时流动相配比：(初始)0minA∶B比例为0∶100；4minA∶B比例为30∶70；6-8min A∶B比例为100∶0；8min后A∶B比例恢复到0∶100。10min内分析混合标样时，六种标准物质可完全分离，且峰形良好。

(6)压力范围：0～15000psi；

(7)流速：0.3ml/min；

(8)色谱柱温：30℃；

(9)进样体积：10μL。

3质谱条件

(1)ESI负离子检测模式；

(2)毛细管电压2.5kV；

(3)锥孔电压30V；

(4)二级锥孔电压4V；

(5)离子能量1；

(6)Detector电压：1600V；

(7)离子源温度100℃；

(8)脱溶剂气温度250℃；

(9)脱溶剂气(N₂)流量600L/h，

(10)锥孔气(N₂)流量50L/h；

(11)质量范围100～1000Da。

4流动相溶液配制

流动相A：甲醇，色谱纯；

流动相B：20mmol/L乙酸铵溶液，取1.54g乙酸铵用超纯水溶解至1000ml，再经0.2μm滤膜过滤。

5六种甜味剂标准曲线绘制

分别取安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜单标工作溶液配制成一定浓度的混标溶液，待仪器稳定后，分别对系列混标工作溶液取10μl进样，作UPLC-MS检测，以离子流的强度为纵坐标，样品进样量为横坐标，绘制标准曲线(或回归方程)。利用该方程和测得样品中的甜味剂的离子流强度计算出各种甜味剂的含量。

6样品检测

(1)按照1中方法对被测样品进行预处理，取处理好的样品进样。六种甜味剂的标准品按照所配标准曲线浓度进样10μL。

(2)按照2、3中的检测条件，分别得到样品的谱图和六种甜味剂标准品的谱图；将两者进行比较，样品谱图中与标准品保留时间相同的色谱峰即为相应的某种甜味剂，为了确保检测结果的准确性，采用各组分准分子离子作为监测离子，若在相同保留时间处，样品中某成份的检测离子与一种标准品的检测离子相同，可进一步肯定样品中甜味剂的成分。

(3)将样品中所测得的甜味剂的色谱峰带入5中的线性回归方程中，计算样品中各种甜味剂的浓度。

本发明只需对被测酒样做简单的预处理工作，利用超高压液相可以对被测定的六种甜味剂进行快速分离，整个过程只需10min，利用飞行时间质谱进行定性、定量分析。所以本发明的分析方法简便快捷，灵敏度高，选择性好，适用于对白酒中六种微量甜味剂的同时检测。

本发明以大量实验和理论分析，找到了一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，丰富了白酒中甜味剂测定手段。

附图说明

图1安赛蜜样品标准曲线图

图2糖精钠样品标准曲线图

图3甜蜜素样品标准曲线图

图4三氯蔗糖样品标准曲线图

图5阿斯巴甜样品标准曲线图

图6纽甜样品标准曲线图

图7六种甜味剂的选择离子色谱图

图8安赛蜜样品质谱图

图9糖精钠样品质谱图

图10甜蜜素样品质谱图

图11三氯蔗糖样品质谱图

图12阿斯巴甜样品质谱图

图13纽甜样品质谱图

图14样品1中甜蜜素选择离子色谱图

图15样品1中甜蜜素质谱图

图16样品2中糖精钠选择离子色谱图

图17样品2中糖精钠质谱图

图18样品3中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素三种甜味剂选择离子色谱图

图19样品3中安赛蜜质谱图

具体实施方式

下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。实例1市售某品牌白酒甜味剂检测

1材料

1.1仪器

超高压液相色谱：WATERS ACQUITY UPLC，检测器：WATERS ACQUITYPDA，色谱柱：BEH C-18 2.1mm×50mm 1.7um，飞行时间质谱仪：WATERSSYNAPT MS，Masslynx 4.1质谱色谱管理软件。

1.2试剂和样品

甲醇：色谱纯(国药集团)；20mmol/L乙酸铵溶液：取1.54g乙酸铵(国药集团)用超纯水溶解至1000ml，再经0.2μm滤膜过滤；六种甜味剂标样：糖精钠，甜蜜素，安赛蜜纯度为99.9％(美国Sigma公司)；阿斯巴甜纯度为99.0％(美国Sigma公司)；三氯蔗糖；纽甜纯度为99.0％(深圳唐正生物科技有限公司)。被测样品为市售白酒。

1.3标准品储备液

精确称取100mg单个甜味剂(安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜)标准品分别于100mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，混匀。得到1mg/ml单标储备溶液，于4℃冰箱中保存。

2方法

2.1色谱条件

(1)超高压液相色谱：WATERS ACQUITY UPLC；

(2)色谱柱：BEH C-18 2.1mm×50mm 1.7um；

(3)检测器：WATERS ACQUITY PDA；

(4)检测波长：选用200～800nm作为检测波长；

(5)流动相配比：采用梯度洗脱，流动相A：甲醇，流动相B：20mmol/L乙酸铵溶液。初始A∶B比例为(0∶100)，4minA∶B比例为(30∶70)，6-8minA∶B比例为(100∶0)，8min后A∶B比例恢复到(0∶100)。10min内分析混合标样时，六种标准物质可完全分离，且峰形良好。

(6)压力范围：0～15000psi；

(7)流速：0.3ml/min；

(8)色谱柱温：30℃；

(9)进样体积：10μL。

2.2质谱条件

(1)ESI负离子检测模式；

(2)毛细管电压2.5kV；

(3)锥孔电压30V；

(4)二级锥孔电压4V；

(5)离子能量1；

(6)Detector电压：1600V；

(7)离子源温度100℃；

(8)脱溶剂气温度250℃；

(9)脱溶剂气(N₂)流量600L/h，

(10)锥孔气(N₂)流量50L/h；

(11)质量范围100～1000Da；

(12)监测离子：安赛蜜m/z＝162([M-K]^-)；糖精钠m/z＝182([M-Na]^-)；甜蜜素m/z＝178([M-Na]^-)；三氯蔗糖m/z＝395([M-H]^-)；阿斯巴甜m/z＝293([M-H]^-)；纽甜m/z＝377([M-H]^-)。

2.3标准曲线

分别取安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜单标工作溶液，用超纯水定容至10mL，得到安赛蜜浓度为0.1μg/ml～1.0μg/ml；糖精钠、甜蜜素、纽甜浓度为0.05μg/ml～1.0μg/ml；三氯蔗糖、阿斯巴甜浓度为0.2μg/ml～1.0μg/ml的混合系列标准溶液。待仪器稳定后，分别对系列混标工作溶液取10μl进样，作UPLC-MS检测，以离子流的强度为纵坐标，样品进样量为横坐标，绘制标准曲线(或回归方程)。

表1.六种甜味剂的线性方程与检出限

2.4样品检测

取100mL白酒样品1利用旋转蒸发器蒸脱酒中的挥发性物质，取10μL供实验进样，利用2.1、2.2中的条件进行检测，获得样品色谱图(图14)、质谱图(图15)。

3结果分析

由六种甜味剂标准品的色谱图(图7)可以看出，利用2.1、2.2检测条件得到的六种甜味剂之一甜蜜素的保留时间为2.91min，样品(图14)中在2.89min处有一色谱峰与甜蜜素色谱峰保留时间相近，因此可以初步确定样品色谱图中2.89min处的色谱峰为甜蜜素。再根据样品在m/z＝178处特征分子离子峰(图15)，与甜蜜素的特征分子离子峰相同(图10)，可进一步确定保留时间为2.89min的组分为甜蜜素。

将样品中甜蜜素的峰面积174.01mm²带入甜蜜素线性回归方程中，即可得到此中白酒样品中的甜蜜素浓度为0.82mg/L。通过六次平行实验，此方法的检出限为0.01mg/L，回收率在96.73％～116.90％之间，相对标准偏差为0.43％。说明该品牌白酒违规添加了甜蜜素。

该结果与同时送至江南大学食品科学与技术国家重点实验室，利用毛细管气相色谱法分析获得的数据“检出甜蜜素”的实验结果相比，该方法对样品预处理简单不需要做衍生化处理，检测灵敏度更高，一次检测所需时间更短，可见方法更为先进。与现有文献报道各种其他方法(高效液相-紫外检测，超高压液相色谱-蒸发光散射检测法、紫外分光光度法等)相比在检测限、检测速度和同时检测方面也都有很大的优势。

实例2市售某品牌白酒甜味剂检测

用上述实例1大致相同的方法检测了市售另一品牌白酒样品，实例2中预处理方法、色谱质谱条件、检测仪器、标准曲线均参照实例1。

结果分析

由六种甜味剂标准品的色谱图(图7)可以看出，六种甜味剂之一糖精钠的保留时间为2.43min，样品(图16)中在2.41min处有一色谱峰与糖精钠色谱峰保留时间相近，因此可以初步确定样品色谱图(图16)中2.41min处的色谱峰为糖精钠。再根据样品在m/z＝182处特征分子离子峰(图9)，与糖精钠的特征分子离子峰相同(图17)，可进一步确定保留时间为2.41min的组分为甜蜜素。

将样品中糖精钠的峰面积177.97mm²带入甜蜜素线性回归方程中，即可得到此中白酒样品中的糖精钠浓度为1.016mg/L。通过六次平行实验，此方法的检出限为0.01mg/L，回收率在93.55％～116.42％之间，相对标准偏差为0.76％。说明该品牌白酒违规添加了糖精钠。

以上两个实例说明本发明方法具有快速、简便，定性、定量准确、灵敏度高的优点。

实例3市售某品牌白酒甜味剂检测

用上述实例1大致相同的方法检测了市售另一品牌白酒样品，实例3中预处理方法、色谱质谱条件、检测仪器、标准曲线均参照实例1。

结果分析

由六种甜味剂标准品的色谱图(图7)可以看出，六种甜味剂之中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素的保留时间分别为1.75min、2.43min、2.91min，样品(图18)中在1.73min、2.43min、2.91min的色谱峰可以初步判定为安赛蜜、糖精钠、甜蜜素三种甜味剂，再根据样品在各自对应的保留时间处有m/z＝162(图19)、m/z＝178、m/z＝182特征分子离子峰与三种甜味剂标准样品中特征分子离子峰吻合，可进一步说明保留时间在1.73min、2.43min、2.91min处的色谱峰分别为安赛蜜、糖精钠、甜蜜素这三种甜味剂。

分别将样品中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素三者的峰面积82.45mm²、154.65mm²、129.18mm²带入各自的线性回归方程中，即可得到此中白酒样品中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素的浓度分别为0.651mg/L、0.917mg/L、0.645mg/L。同样通过六次平行实验，此方法安赛蜜检出限为0.05mg/L，糖精钠、甜蜜素检出限都为0.01mg/L，安赛蜜回收率在104.79％～113.40％之间，相对标准偏差为0.82％；糖精钠回收率在92.62％～99.79％之间，相对标准偏差为0.90％；甜蜜素回收率在93.73％～111.22％之间，相对标准偏差为2.45％。说明该品牌白酒违规添加了安赛蜜、糖精钠、甜蜜素三种甜味剂。

实例3说明本发明可以针对白酒中添加的多种甜味剂进行同时检测，同样具有分辨率高、快速、准确等优点，克服了其他检测方法易对同时微量添加多种甜味剂漏检的缺点。

Claims (7)

1一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，其特征在于：

①利用物理或化学方法对白酒样品进行预处理，脱除影响检测的醇类物质；

②采用超高压液相为分离手段，以甲醇-乙酸铵水溶液为流动相，采用梯度洗脱的方式；

③采用飞行时间质谱仪，以六种甜味剂的特征分子离子为监测离子进行分析。

2如权利要求1所述的一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，其特征在于可以同时对白酒中安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜六种人工合成甜味剂进行检测。

3如权利要求1所述的一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，其特征在于采用超高压液相色谱与飞行时间质谱联用技术。

4如权利要求1所述的一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，其特征在于采用梯度洗脱，流动相A：甲醇，流动相B：20mmol/L乙酸铵溶液。初始A∶B比例为(0∶100)，4minA∶B比例为(30∶70)，6-8min A∶B比例为(100∶0)，8min后A∶B比例恢复到(0∶100)。完成整个检测过程仅需10min。

5如权利要求1所述的一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，其特征在于使用超高压液相色谱压力可达到15000psi；最佳流速：0.3ml/min；色谱柱温：30℃；进样体积：10μL。

6如权利要求1所述的一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，其特征在于使用飞行时间质谱仪最佳条件为毛细管电压2.5kV；锥孔电压30V；二级锥孔电压4V；离子能量1；Detector电压：1600V；离子源温度100℃；脱溶剂气温度250℃；脱溶剂气(N₂)流量600L/h，锥孔气(N₂)流量50L/h。

7如权利要求1所述的一种超高压液相色谱-飞行时间质谱同时测定白酒中六种微量甜味剂的方法，其特征在于对样品根据保留时间和六种甜味剂的特征分子离子：安赛蜜m/z＝162([M-K]^-)；糖精钠m/z＝182([M-Na]^-)；甜蜜素m/z＝178([M-Na]^-)；三氯蔗糖m/z＝395([M-H]^-)；阿斯巴甜m/z＝293([M-H]^-)；纽甜m/z＝377([M-H]^-)进行定性分子，根据外标法利用标准品绘制标准曲线进行定量分析。

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