CN112461987A - 一种糖蛋白唾液酸链接特异分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，包括如下步骤：制备物种组织蛋白质溶液；制备酶切N‑糖肽；富集完整N‑糖肽；对完整N‑糖肽中的唾液酸α2,6链接异构体进行戊基酰胺化标记，对完整N‑糖肽中的唾液酸α2,3链接异构体进行甲基酰胺化标记；对唾液酸链接特异标记完整N‑糖肽混合物进行色谱‑质谱联用分析；建立完整N‑糖肽理论数据库；基于GPSeekerPro数据库搜索引擎对色谱‑质谱联用分析得到的数据进行搜索分析和定性鉴定。该方法可以实现对唾液酸链接异构体的精准分析和定性，且在分析过程中，不会产生唾液酸的丢失，并提高了分析检测的准确度、灵敏度和效率。
Description
技术领域
本发明属于蛋白结构精准解析技术领域，尤其涉及一种糖蛋白唾液酸链接特异分析方法。
背景技术
糖基化是人体内最丰富的蛋白质翻译后修饰之一，糖蛋白结构的精准解析是理解其生化性质和生理功能的必要条件。作为广泛存在于糖蛋白修饰支链末端的单糖，唾液酸在人体各生物识别过程中发挥着关键作用，其2号位与半乳糖的3或6号位链接，分别形成α2,3和α2,6链接异构。带有唾液酸的糖蛋白在功能和活性上具备链接特异性，所以确定唾液酸的链接方式是深入研究糖蛋白的必需表征。
高通量糖蛋白分析通常在质谱中进行；然而，正离子模式电离要求样本保持在酸性介质中，不稳定的唾液酸在样本制备、电离和串级质谱解离过程中易发生部分或全部丢失，使得糖链的鉴定信息有所缺失。此外，糖蛋白的α2,3和α2,6链接异构体分子量相同，无法直接在质谱中进行区分；亲水色谱分离技术能针对部分未经衍生的α2,3和α2,6链接异构体，但与质谱在线联用分析检测时，灵敏度低。因此，针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，该方法可以实现对唾液酸链接异构体的精准分析和定性，且在分析过程中，不会产生唾液酸的丢失，并提高了分析检测的准确度、灵敏度和效率。
为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：
一种糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，包括如下步骤：制备物种组织蛋白质溶液；制备酶切N-糖肽；富集完整N-糖肽；对完整N-糖肽中的唾液酸α2,6链接异构体进行戊基酰胺化标记，对完整N-糖肽中的唾液酸α2,3链接异构体进行甲基酰胺化标记；对唾液酸链接特异标记完整N-糖肽混合物进行色谱-质谱联用分析；建立完整N-糖肽理论数据库；基于GPSeekerPro数据库搜索引擎对色谱-质谱联用分析得到的数据进行搜索分析和定性鉴定。
进一步的，完整N-糖肽中的唾液酸α2,6链接异构体采用戊胺进行标记；完整N-糖肽中的唾液酸α2,3链接异构体采用甲胺进行标记。
进一步的，制备酶切N-糖肽的过程为：物种组织蛋白质溶液中的蛋白质依次还原烷基化反应后，再经淬灭反应处理，然后利用Trypsin酶切蛋白质。
进一步的，所述酶切N-糖肽还经过除盐处理。
更进一步的，经过除盐处理后的酶切N-糖肽利用ZIC-HILIC富集柱进行富集。
进一步的，在建立理论数据库时，根据标记在数据库中预先设定唾液酸链接特异标签，以使所有唾液酸链接组合均具有静态标签。
进一步的，完整N-糖肽理论数据库的建立所需输入或选择的数据包括理论数据库方向、蛋白酶类别、最多允许漏切位点、最小多肽长度、从UniProt上下载的理论蛋白质数据库.fasta文件、人类理论N-连接糖组数据库.txt文件、动态N-糖基化位点、静态标签、二级质谱解离方法及碎片离子类型、一级质谱m/z采集范围。
进一步的，在进行搜索分析和定性鉴定时，需要输入或选择的搜索数据包括质谱原始数据文件、理论数据库类别、MS前体离子参数、二级质谱碎片离子参数、完整N-糖肽谱图匹配参数。
本发明的有益效果是：
本发明在样本制备阶段对唾液酸常见的α2,6和α2,3两种链接进行特异衍生标记，即为：唾液酸α2,6链接异构体采用戊胺进行标记；唾液酸α2,3链接异构体采用甲胺进行标记；如此，α2,6和α2,3两种链接异构分别被衍生嫁接上不同大小及物化性质的基团标签，使得分析过程具有以下优点：(1)可以有效防止唾液酸在样本制备阶段的酸性介质中以及质谱电离、串级质谱前体离子解离过程中发生部分或全部丢失；(2)可以提高连接糖部分的疏水性，从而提高电喷雾电离效率；(3)易于被反相色谱和质谱分离；上述优点的综合大提高了唾液酸糖蛋白的分析准确度和效率，为相关结构和功能研究提供了基础。
本发明的分析方法采用了液谱-质谱联用分析的方法，基于得到的实验数据，并结合所建立的理论数据库和GPSeekerPro数据库搜索引擎对实验数据进行解析和定性鉴定；本发明基于分子结构指纹碎片离子的靶向筛选来实现有效串级质谱的选择性搜索，从而节省现有的“先搜索-后筛选”流程中用在无效串级质谱上的搜索时间，大大提高串级质谱的解析速度，尤其是复杂混合物色谱-质谱联用分析中产生的数以万计串级质谱的解析速度和通量。
本发明的分析方法可适用于人、植物等所有物种糖蛋白的分析。
附图说明
图1为本发明分析方法的流程示意图。
图2示出本发明实施例的代表性含唾液酸复杂型N-连接糖的完整N-糖肽的可能链接异构体。
图3为本发明实施例的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法中的GPSeekerPro完整N-糖肽理论数据库建立图形用户界面。
图4为本发明实施例的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法中的GPSeekerPro完整N-糖肽数据库搜索图形用户界面。
图5为本发明实施例中的高效液相色谱-质谱联用分析所得到的数据组的基峰色谱图。
图6示出本发明实施例得到的关于人体肺部组织层粘连蛋白伽马1单元第576号N-糖基化位点完整N-糖肽唾液酸α2,3链接异构体的鉴定图组。
图7示出本发明实施例得到的关于人体肺部组织层粘连蛋白伽马1单元第576号N-糖基化位点完整N-糖肽唾液酸α2,6链接异构体的鉴定图组。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
如图1所示，下面以人体肺部组织完整N-糖蛋白的唾液酸链接特异分析为例说明本发明的分析方法。
人体肺部组织完整N-糖蛋白溶液的制备：
将肺部组织从-80℃冰箱中取出，于干净培养皿的冰上解冻；解冻后，将肺部组织剪碎，并加入4℃预冷的1×PBS清洗至无血色。吸干水分，将肺部组织转移至匀浆瓶上称湿重。
往含肺部组织的匀浆瓶中按照组织:缓冲液＝1g:10mL的比例加入4℃预冷的裂解缓冲液(4％SDS，0.1M Tris/HCl，pH＝8.0)以及蛋白酶抑制剂混合物(1％v/v)；在匀浆机中以8000万转/分匀浆60秒。匀浆结束后，将匀浆瓶置于冰浴烧杯中在4℃和60rpm转速下的摇床中裂解30分钟。裂解完成后，将裂解液从匀浆瓶转移至离心管中，在4℃和14000rpm转速下离心30分钟，弃去沉淀，保留清液。
向裂解上清液中加入六倍体积预冷的丙酮，置于-20℃冰箱中过夜沉淀。带沉淀的溶液在10000g下离心10分钟，去掉上清液后收集蛋白质沉淀。用8M尿素溶液重溶蛋白质沉淀；待完全溶解后，用50mM NH4HCO3将蛋白质溶液稀释至尿素浓度小于1M。用BCA法测定蛋白质浓度。
人体肺部组织酶切N-糖蛋白多肽的制备：
向1mg所得的完整N-糖蛋白溶液中加入200mM DTT母液使其终浓度为10mM，置于55℃的电热鼓风干燥箱中还原20分钟。冷却至室温后，加入200mM IAA母液使其终浓度为20mM，室温下避光反应30分钟。最后加入200mM DTT母液于室温下淬灭反应30分钟。
按照1:50(w/w)的比例向蛋白质溶液加入0.1mg/mL trypsin溶液，在37℃摇床中过夜反应。向酶解完成的样本中加入0.5％(v/v)的TFA，充分振荡。将酶解样本在14000g条件下离心1分钟，保留上清液，去掉酶解不完全的沉淀，制得酶切N-糖蛋白多肽。
酶切N-糖蛋白多肽的除盐：
酶切多肽利用实验室自制的C18除盐柱进行除盐。根据样本量来选择除盐柱的规格。用2μm筛板堵住1000μL枪头，样本量与填料比为1：50(w/w)。利用医用注射器辅助推出缓冲液。分别用100μL乙腈、100μL 0.1％TFA活化、平衡C18柱，各重复3次；向C18柱中加入酶切多肽样本，再利用医用注射器辅助推出缓冲液，流经液再重复上样4次(共上样5次)；用100μL 0.1％TFA除盐，重复操作8次；用100μL洗脱液1(50％ACN，0.1％TFA和49.9％H2O)洗脱4次，100μL洗脱液2(80％ACN，0.1％TFA和19.9％H2O)洗脱4次。组合8次洗脱液，真空浓缩至干，用80％ACN/5％TFA水溶液重溶样本(以便后续富集处理)，终浓度为5μg/μL。
人体肺部组织完整N-糖肽的富集：
完整N-糖肽利用实验室自制的ZIC-HILIC富集柱进行富集。根据样本量来选择富集柱的规格。用2μm筛板堵住1000μL枪头，样本量与填料比为1:30(w/w)。利用医用注射器辅助推出缓冲液。分别用100μL 0.1％TFA、100μL80％ACN/5％TFA活化、平衡ZIC-HILIC柱，各重复3次；向ZIC-HILIC柱中加入多肽溶液，利用医用注射器辅助推出缓冲液，流经液再重复上样4次(共上样5次)；用100μL 80％ACN/5％TFA洗去非糖肽，重复操作8次；用100μL 0.1％TFA，洗脱3次；100μL 50mM NH4HCO3洗脱2次；合并所有洗脱液。用BCA法测定完整N-糖肽浓度。
唾液酸链接特异衍生标记：
含糖基化修饰及唾液酸的糖蛋白样本在一步或多步化学反应中，唾液酸α2,6和α2,3链接分别发生链接选择性反应，被接上不同的化学标签基团。
第一步，将40μg完整N-糖肽溶于40μL二甲基亚砜(DMSO)反应溶液中，该反应溶液中还含有0.5M 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，0.2M HOBt，1M戊胺(iPA)，60℃反应3h，对α2,6链接异构进行戊基酰胺化处理；然后将经过第一步反应处理的完整N-糖肽再经亲水富集后重新溶解于19μL 30％甲胺溶液中，于60℃反应2h，对α2,3链接异构体进行甲基酰胺化处理。反应式如式(Ⅰ)和式(Ⅱ)所示。
式(Ⅰ)表示完整N-糖肽唾液酸α2,3链接异构体的特异衍生标记反应；式(Ⅱ)表示完整N-糖肽唾液酸α2,6链接异构体的特异衍生标记反应。
唾液酸链接特异标记的完整N-糖肽的色谱-质谱联用分析：
完整N-糖肽混合物在Dionex Ultimate 3000RSLCnano高效液相色谱仪上进行RPLC色谱分离。C18分析柱(360μod×75μid，75cm长)和囚禁柱(360μod×200μid，5cm长)均为自制，固定相为Phenomenex Jupiter C18(5μm，
)。流动相A为0.1％甲酸，99.9％超纯水；流动相B为0.1％甲酸，95％乙腈；上样流动相(2％B)流速为5μL/min，洗脱流动相流速为0.3μL/min。洗脱梯度为：2～40％B，190min；40～95％B，10min；95％B，5min。
唾液酸链接特异标记完整N-糖肽的nanoESI-MS/MS分析。唾液酸链接特异标记完整N-糖肽混合物经RPLC分离后在线进行质谱(Orbitrap Exploris480，ThermoScientific)分析。电喷雾电压为1.9kV。一级质谱采集参数为：m/z 700-1800，质量分辨率60k(m/z 200)，AGC 3×105，最大离子注入时间20ms；二级质谱采集参数为：质量分辨率30k，Top20，囚禁窗口3.0m/z，动态排除20s，HCD阶梯能量为20％/30％/31％。经过质谱分析，得到质谱原始数据文件。
完整N-糖肽理论数据库的建立：
图2示出了人体肺部组织代表性含唾液酸复杂型N-连接糖的完整N-糖肽的可能链接异构体。其仅列举了代表性复杂型N-连接糖且唾液酸数量和支链数相等的情况，也就是每条支链都带一个唾液酸；对于唾液酸数量小于支链数量的情况，可以从图2的结构中将唾液酸依次减少生成所有可能的组合，如其中的3天线结构含2个唾液酸的组合为12种，仅含1个唾液酸的组合为6种。人类理论N-连接糖组数据库.txt文件包括75888条序列；为758个组成，其中含1，2，3和4个唾液酸的组成个数分别为252，147，49和10。按照表1，在单糖信息数据库中预先设定唾液酸链接特异衍生标签，以便于生成带静态衍生标签的包括所有可能唾液酸链接组合的完整N-糖肽理论数据库。
表1
利用GPSeekerPro数据库搜索引擎软件建立理论数据库，依次在图3所示的图形用户界面上选择理论数据库方向(本实施例设置为靶向-F)、蛋白酶类别(本实施例设置为Trypsin)、最多允许漏切位点(本实施例设置为0)、最小多肽长度(本实施例设置为6个氨基酸)，输入从UniProt(www.uniprot.org)下载的理论蛋白质数据库.fasta文件、人类理论N-连接糖组数据库.txt文件(包括75888条序列；758个组成，其中含1，2，3和4个唾液酸的组成个数分别为252，147，49和10)，设置动态N-糖基化位点、静态衍生标签、二级质谱解离方法及碎片离子类型、一级质谱m/z采集范围等，最终形成完整N-糖肽理论数据库。
利用GPSeekerPro数据库搜索引擎软件进行搜索解析和定性鉴定：
在图4所示的图形用户界面上，输入质谱原始数据文件，并选择理论数据库，设置MS前体离子参数、二级质谱碎片离子参数、完整N-糖肽谱图匹配(GPSMs)参数等，进行数据搜索。靶向-诱饵GPSMs组合(正库与反库组合)并按P score升序排序后，选取P score阈值使谱图水平FDR≤1％；小于该阈值的靶向GPSMs去重后得到最后的完整N-糖肽鉴定列表IDs。
人肺组织完整N-糖肽经过高效液相色谱-质谱联用分析得到的数据组的基峰色谱图如图5所示。该数据组在经过完整N-糖肽数据库搜索引擎GPSeeker数据库搜索并控制谱图水平FDR≤1％的情况下，共鉴定到含唾液酸α2,3链接异构体的完整N-糖肽121条，其中含一个唾液酸的糖肽95条，含2个唾液酸的完整N-糖肽13条；鉴定到含唾液酸α2,6链接异构体的完整N-糖肽156条，其中含一个唾液酸的糖肽132条，含2个唾液酸的完整N-糖肽24条。α2,3和α2,6链接均得到了成功的鉴定。举例来说，如图6和图7所示，在层粘连蛋白伽马1单元第576号N-糖基化位点上，成功地鉴定了相同多肽骨架(QVLSYGQNLSFSFRVDR)和相同N-连接糖组成(N4H5S2)的α2,3和α2,6唾液酸链接异构体；这两个异构体分别出现在第35740张(保留时间132.28分钟)和第35993张MS/MS谱图(保留时间133.31分钟)。图6为层粘连蛋白伽马1单元第576号N-糖基化位点完整N-糖肽唾液酸α2,3链接异构体的鉴定图组，其中的(6A)图为对应该α2,3异构体的N-连接糖部分图形解离图，(6B)图为对应该α2,3异构体的多肽骨架图形解离图；(6C)图为对应该α2,3异构体的前体离子同位素轮廓指纹比对图；(6D)图为对应该α2,3异构体的带匹配碎片离子注释的二级质谱图。图7为层粘连蛋白伽马1单元第576号N-糖基化位点完整N-糖肽唾液酸α2,6链接异构体的鉴定图组，其中的(7A)图为对应该α2,6异构体的N-连接糖部分图形解离图，(7B)图为对应该α2,6异构体的多肽骨架图形解离图；(7C)图为对应该α2,6异构体的前体离子同位素轮廓指纹比对图；(7D)图为对应该α2,6异构体的带匹配碎片离子注释的二级质谱图。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的修改或等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，包括如下步骤：制备物种组织蛋白质溶液；制备酶切N-糖肽；富集完整N-糖肽；对完整N-糖肽中的唾液酸α2,6链接异构体进行戊基酰胺化标记，对完整N-糖肽中的唾液酸α2,3链接异构体进行甲基酰胺化标记；对唾液酸链接特异标记完整N-糖肽混合物进行色谱-质谱联用分析；建立完整N-糖肽理论数据库；基于GPSeeke rPro数据库搜索引擎对色谱-质谱联用分析得到的数据进行搜索分析和定性鉴定。
2.根据权利要求1所述的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，完整N-糖肽中的唾液酸α2,6链接异构体采用戊胺进行标记；完整N-糖肽中的唾液酸α2,3链接异构体采用甲胺进行标记。
3.根据权利要求1所述的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，制备酶切N-糖肽的过程为：物种组织蛋白质溶液中的蛋白质经过还原烷基化反应后，再经淬灭反应处理，然后利用Trypsin酶切蛋白质。
4.根据权利要求3所述的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，所述酶切N-糖肽还经过除盐处理。
5.根据权利要求4所述的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，经过除盐处理后的酶切N-糖肽利用ZIC-HILIC富集柱进行富集。
6.根据权利要求1所述的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，建立理论数据库时，根据标记在数据库中预先设定唾液酸链接特异标签，以使所有唾液酸链接组合均具有静态标签。
7.根据权利要求6所述的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，完整N-糖肽理论数据库的建立所需输入或选择的数据包括理论数据库方向、蛋白酶类别、最多允许漏切位点、最小多肽长度、从UniProt上下载的理论蛋白质数据库.fasta文件、人类理论N-连接糖组数据库.txt文件、动态N-糖基化位点、静态标签、二级质谱解离方法及碎片离子类型、一级质谱m/z采集范围。
8.根据权利要求7所述的糖蛋白唾液酸链接特异分析方法，其特征在于，在进行搜索分析和定性鉴定时，需要输入或选择的搜索数据包括质谱原始数据文件、理论数据库类别、MS前体离子参数、二级质谱碎片离子参数、完整N-糖肽谱图匹配参数。
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