KR101734863B1 - 당단백질의 부위-특이적 o-당펩타이드 생성 및 분석방법 - Google Patents

당단백질의 부위-특이적 o-당펩타이드 생성 및 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로는 비특이적 단백질분해효소 처리를 이용하여 O-당펩타이드를 생성하여 당사슬이 결합된 위치를 확인할 수 있을 뿐 아니라 당자리에 결합된 당사슬의 종류, 당사슬 변이체 및 당사슬의 구조를 포함한 O-당사슬의 다양성을 정량적으로 프로파일링 할 수 있는 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명은 종래 β-제거를 통한 O-당사슬 다양성 분석 방법에 비하여 시료 처리시간이 짧고, 생성된 O-당펩타이드는 펩타이드 길이가 짧아 질량분석기 적용이 용이하다.

Description

당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법{Site-specific O-glycopeptide producing method and analytic method thereof}
본 발명은 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것으로서, 고속으로 당단백질에서 시알산 변이체를 포함한 O-당사슬 다양성을 스크리닝하며 동시에 당자리 및 당자리 함량까지 확인할 수 있는 분석법에 관한 것이다.
당쇄화(Glycosylation)는 단백질의 번역 후 변형과정(Posttranslational modification)에 속하며 단백질의 기능을 결정하는 중요한 단계로서, 생화학적 환경에 매우 민감하게 반응하여 당사슬의 분해 및 합성 효소들의 경쟁에 의해 진행된다. 또한, 당쇄화는 경우에 따라 하나의 당자리에 여러 종류의 당사슬이 결합되어 당사슬의 다양성 (Glycan heterogeneity)을 나타내게 된다. 당단백질은 N-당사슬 또는 N-과 O-당사슬을 동시에 가지고 있다.
당사슬(Glycan)은 크게 N-당사슬과 O-당사슬로 나눌 수 있는데 그 중에서 N-당사슬은 아스파라긴(asparagine)에 결합되어 있고 2개의 GlcNAc (NAcetyGlucosamine) 과 3개의 만노스(Mannose)로 이루어진 코어를 가진다. 이러한 코어를 기준으로 전형적인 구조를 형성하고 있고, PNGase F라는 N-당사슬만을 선택적으로 분리할 수 있는 특이적 효소가 존재한다. O-당사슬은 세린(serine)이나 트레오닌(threonine)에 결합되어 있으며 N-당사슬과는 다르게 1개가 아닌 8개의 코어를 가진다.
O-당사슬의 경우 O-글라이카네이즈(O-glycanase)라는 O-당사슬 분리효소가 있지만, 시알산이 결합되어 있는 O-당사슬의 경우 이 효소가 작용하지 못한다. 따라서 이 효소를 이용하여 분석하기 위해서는 O-당사슬에서 시알산을 제거하는 과정이 필요하다. 또한, O-글라이카네이즈의 경우 코어 1 및 코어 3 구조를 가지는 중성 O-당사슬만 분리 분석할 수 있기 때문에 사용이 제한적이다.
이러한 이유들로 인하여 O-당사슬은 효소를 이용한 유리법보다는 화학적 처리 방법을 주로 사용하여 분석하고 있다. 현재 화학적 처리 방법 중 가장 대표적 방법인 β-제거(elimination) 방법을 이용하여 당단백질로부터 O-당사슬을 유리하여 분석하고 있지만, NaBH4 존재 하에 NaOH를 이용하여 단백질로부터 O-당사슬을 유리하는 이 방법은 화학적 처리 중 화학적 환경에 민감한 시알산 및 시알산 변이체가 분해되거나, 필링 반응(peeling reaction)과 같은 부반응이 일어날 수 있으며, 반응의 수율이 낮고, 당사슬이 결합되어 있는 당단백질의 구조가 분해되어 당자리 확인이 불가능하여(ref. Meth. Enzymol. 1994; 230:57-66) β-제거(elimination) 방법을 이용할 경우 정확한 O-당사슬 다양성 분석이 어렵다.
다양한 질병이나 암에 따라 O-당사슬의 시알산에 변화가 발생하기도 하며, 백혈병에서 O-아세틸화(acetylation)된 시알산 변이체는 약물 내성과 관련이 있다는 사실이 밝혀졌다. 또한, 당단백질 의약품의 경우에는 시알산 및 시알산의 변이체가 약효와 약효의 지속성에 영향을 미치는 주요 인자이다. 따라서, 질병의 바이오마커 발굴이나 당단백질 의약품의 약효 등을 평가하기 위하여 O-당사슬 및 그 변이체의 구조를 온전히 유지하며 프로파일링할 수 있는 분석법이 필요한 상황이다.
본 발명은 상기 O-당사슬 분리방법의 문제점을 해결하고 O-당사슬만을 특이적으로 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 O-당사슬의 변형 없이 비파괴적으로 O-당사슬을 분리하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
위와 같은 과제를 해결하기 위하여 본 발명에서는 비특이적 단백질분해효소 처리를 이용하여 O-당펩타이드를 생성하여 당사슬이 결합된 위치를 확인할 수 있을 뿐 아니라 당자리에 결합된 당사슬의 종류, 당사슬 변이체 및 당사슬의 구조를 포함한 O-당사슬의 다양성을 정량적으로 프로파일링 할 수 있는 분석법을 발명하였다.
본 발명은 종래 β-제거를 통한 O-당사슬 다양성 분석 방법에 비하여 시료 처리시간이 짧고, 생성된 O-당펩타이드는 펩타이드 길이가 짧아 질량분석기 적용이 용이하다.
본 발명은
a) 당단백질에 대하여 비특이적 단백질 분해효소를 처리하여 당단백질을 펩타이드로 절단하는 단계;
b) 절단된 펩타이드 중 당펩타이드만을 분리하는 단계;
c) 분리된 당펩타이드를 각각 분획하는 단계; 및
d) 부위-특이적 O-당펩타이드 분획에 대하여 각각 질량분석하는 단계;를 포함하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 a) 단계 이전 당단백질과 혼합된 불순물을 제거하는 단계;가 부가되는 것을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 a) 단계 이전에 당단백질의 이황화 결합을 절단 처리하는 단계가 부가되는 것을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 a) 단계의 비특이적 단백질 분해효소가 엘라스테이즈 (elastase), 파파인 (papain), 펩신 (pepsin), 프로네이즈 (pronase), 프로티네이즈 K (proteinase K), 섭틸리신 (subtilisin) 및 써모라이신 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 b) 단계를 다공성 흑연화 탄소 카트리지를 이용한 고체상 추출로 수행함을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계를 다공성 흑연화 탄소 카트리지를 이용한 고체상 추출시 유기용매 농도구배를 이용하여 수행함을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 b) 단계와 c) 단계를 동시에 수행함을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 c) 단계의 질량분석을 LC/MS 및 LC/MS/MS임을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 생성 및 분석방법에 관한 것이다.
본 발명을 이용하면 일반적인 생물학적 환경과 당단백질 의약품에서 많이 발견되는 O-당사슬의 시알산 및 시알산 변이체를 비파과적으로 신속하게 스크리닝할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 단 한 번의 효소처리를 통하여 생성된 O-당펩타이드를 이용하여 분석을 진행하므로 시료처리 방법이 단순하고 시료처리 소요시간이 종래 O-당사슬 분석방법들보다 매우 짧아 신속하게 O-당사슬의 다양성을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 효소반응을 이용하여 생성된 O-당펩타이드에 대하여 분석을 진행하므로, β-제거 반응에서 확인할 수 없었던 시알산 및 시알산 변이체를 완벽히 스크리닝할 수 있다.
또한, 본 발명에 의하면 다량의 N-당사슬 존재 하에서도 N-당사슬의 방해 없이 O-당사슬을 고감도로 분석할 수 있다.
본 발명의 방법은 O-당사슬에 시알산 변이체가 존재하거나 존재하지 않거나 관계없이 모든 당단백질의 O-당사슬 다양성 프로파일링에 보편적으로 적용 가능하다.
또한, 본 발명에 의하면 생성된 O-당펩타이드를 이용하여 O-당사슬 스크리닝과 동시에 당자리 및 당자리 함량까지 확인할 수 있다.
도 1은 O-당사슬을 가지고 있는 당단백질에서 각 당자리에 당사슬이 결합된 O-당펩타이드의 생성 및 분리 방법에 대한 개념도 및 본 발명과 종래기술을 비교한 비교표이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 O-당펩타이드를 분리 및 분석하는 방법의 흐름도이다.
도 3은 O-당사슬의 시알산에 O-아세틸화된 변이체를 가진 당단백질을 본 발명 방법에 적용한 개념도이다.
도 4는 에리스로포이에틴에 관하여 종래 방법과 본 발명의 방법을 이용하여 O-당펩타이드 당사슬 프로파일링을 수행한 결과를 비교한 것이다.
도 5는 시판 중인 에리스로포이에틴을 당단백질 시료로 하여 O-아세틸화된 시알산 변이체를 갖는 O-당사슬의 구조를 텐덤 질량분석법을 이용하여 구조를 확인한 결과이다.
도 6은 서로 다른 배치(batch)의 다르베포에틴 알파(darbepoetin alfa: 에리스로포이에틴의 합성형)에 존재하는 O-당펩타이드의 양을 상대적으로 비교분석한 결과이다.
아래에서는 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀 더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에만 한정된 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실험방법 (도 2 참조)
1. 당단백질 의약품 (본 실시예에서는 에리스로포이에틴을 사용함)에 포함되어 있는 안정화제 및 보존제 등의 불순물을 Spin Column (MWCO 10kDa)을 이용하여 제거하였다.
2. 당단백질 의약품에 비특이적 단백질분해효소를 처리 (사용된 의약품과 동량의 비특이적 단백질분해효소를 첨가하여 37℃로 6시간 동안 반응시킴)하여 O-당사슬을 포함하는 당펩타이드를 확보하였다.
3. 얻어진 당펩타이드는 다공성 흑연화 탄소 카트리지(Porous Graphitized Carbon Cartridge)를 이용하여 고체상 추출 (Solid Phase Extraction) 하였다. 좀 더 자세히는 흑연화 탄소 카트리지를 80% 아세토나이트릴 및 0.1% TFA (trifluoroacetic acid) 수액으로 세척한 후 3차 증류수로 헹구었다. 당펩타이드 시료를 카트리지에 로딩한 후 염과 불순물 제거를 위해 3차 증류수로 세척하였다. 40% ACN (acetonitrile) 및 0.1% TFA (trifluoroacetic acid)를 함유한 용액을 이용하여 당펩타이드만 선택적으로 추출한 후 건조하였다. 이때 유기용매 농도구배를 이용하면 N-당펩타이드를 좀 더 효과적으로 배제할 수 있다. N-당펩타이드는 높은 농도의 유기용매 분획에서 용출된다.
4. nanoLC chip/Q-TOF MS 분석을 통하여 O-당펩타이드를 분리하고, 당사슬의 위치 확인 및 결합된 당사슬의 구조를 분석하여 에리스로포이에틴에 존재하는 O-당펩타이드의 구성을 확인하고 정량적으로 프로파일링하였다. 더 자세히는 분리된 O-당펩타이드를 물에 재용해하여 오토샘플러 (4℃로 유지됨), 세관 펌프, 나노펌프, HPLC-Chip/MS 인터페이스 및 6530 Q-TOF MS 탐지기를 갖춘 HPLC Chip/Q-TOF(Chip Quadrupole Time-of-Flight) MS system (Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 이용하여 분석하였다. 9×0.75㎜ 농축 컬럼 및 43×0.075㎜ 분석 컬럼의 정지상 (stationary phase)으로 통합된 나노-ESI 스프레이 팁과 함께 5㎛ 다공성 흑연화 탄소가 패킹된 칩을 사용하였다. 크로마토그래피 방법에 의한 분리는 최적화된 분리 조건에 따라 수행되었다. 간단히 설명하면, 시료를 로딩한 후 빠른 O-당펩타이드 용출 농도구배 용액을 분당 0.3㎕씩 흘려주었다. 농도구배액은 (A) 3.0% 아세토나이트릴 및 0.5% 포름산(v/v) 수액, 및 (B) 90.0% 아세토나이트릴 및 0.5% 포름산(v/v) 수액이고, 각각 아래 시각에 아래 농도로 처리하였다: 6% B, 0~2.5min; 6~35% B, 2.5~10min; 35~70% B, 10~40min; 및 70~99.9% B, 40~50min. 남아있는 N-당펩타이드는 99.9% B 액으로 10분간 씻어내었다. 최종적으로 분석 컬럼은 6% B로 20분간 재평형화하고, 농축 컬럼은 0% B로 20분간 재평형화하였다.
5. 질량분석 후, LC/MS의 원래 데이터는 Mass Hunter Qualitative Analysis software (version B.06.00 SP2, Agilent Technologies)에 포함된 분자 특성 추출 알고리즘 (Molecular Feature Extractor algorithm)을 이용하여 처리하였다.
<결과 및 데이터 설명>
1. 도 1은 O-당사슬을 가지고 있는 당단백질에서 각 당자리에 당사슬이 결합된 O-당펩타이드의 생성 및 분리 방법에 대한 개념도 및 본 발명과 종래기술을 비교한 비교표이다.
종래 O-당사슬 분석방법은 β-제거를 이용하여 당단백질로부터 O-당사슬을 분리하나 다음과 같은 한계점이 있다. 첫째, 시알산 O-아세틸화 (acetylation)와 같이 화학적 처리에 민감한 시알산 변이체의 분해가 일어날 수 있다. 둘째, β-제거 반응이 당단백질로부터 O-당사슬을 유리하는데 그치지 않고, 유리된 당사슬 말단부분의 당을 추가적으로 유리하는 필링 반응 (peeling reaction)이 일어날 수 있다. 셋째, β-제거에 의하여 당단백질의 구조를 분해하기 때문에 당사슬 구조 외에 단백질 내에 O-당사슬이 위치하고 있던 당자리를 확인할 수 없다.
이를 극복하기 위해 본 발명은 당단백질 시료에 비특이적 단백질분해효소를 처리하여 당펩타이드를 생성한 후 O-당펩타이드를 확보한다. 본 발명법의 장점은 첫째, O-당펩타이드 생성시 비특이적 단백질분해효소가 당사슬의 구조에 영향을 미치지 않아 O-당사슬 및 그 변이체를 완벽히 프로파일링 할 수 있고 둘째, 비특이적 단백질분해효소에 의하여 O-당펩타이드가 생성되므로, O-당사슬 프로파일링과 동시에 O-당사슬이 위치한 당자리를 확인할 수 있으며, 셋째, 종래의 β-제거 O-당사슬 유리방법과 비교하여 시료처리가 간편하며, 빠르고 정확하게 다양한 O-당사슬을 정량적으로 프로파일링 할 수 있다. 뿐만 아니라, 다량의 N-당사슬이 함께 존재하더라도 별도의 시료 처리과정 없이 O-당사슬을 고감도로 분석할 수 있다.
2. 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 O-당펩타이드를 분리 및 분석하는 방법의 흐름도이다. 이 실시예에서는 당단백질 시료로서 당단백질 의약품을 선택하여 이를 비특이적 단백질분해효소로 처리하여 O-당펩타이드를 생성하였다. 이때 O-당사슬의 영향으로 짧은 펩타이드가 꼬리표처럼 붙은 형태인 O-당펩타이드가 생성되게 된다. 또한 비특이적 단백질분해효소 처리에 의하여 생성된 O-당펩타이드는 질량분석기 적용에 용이한 질량값을 갖는다.
비특이적 단백질분해효소를 이용할 경우 당이 붙어있지 않은 부분의 펩타이드는 하나 또는 두 개의 아미노산 단위로 잘리게 되므로, O-당펩타이드 분석시 당사슬이 없는 펩타이드에 의한 영향을 받지 않는다. 또한, 생성된 N-당펩타이드는 3~6개의 아미노산과 12~21개의 단당류의 결합으로 이루어져 질량값이 2,500~5,000의 값을 가지는 반면, O-당펩타이드의 경우 7~11개의 아미노산과 2~4개의 단당류의 결합으로 이루어져 1,200~2,000의 질량값을 가지므로 질량분석시 이온화에 적합한 크기로 생성된다. 또한, O-당펩타이드의 펩타이드 길이가 N-당펩타이드의 펩타이드보다 길어 질량분석시 이온화 효율이 높기 때문에 상대적으로 N-당펩타이드 신호는 억제되는 현상이 발생한다. 따라서, 본 발명의 방법을 이용하면 N-당펩타이드가 다량 존재하더라도 O-당펩타이드를 고감도로 분석할 수 있다.
효소 처리 이후에는 당을 효과적으로 용리할 수 있는 특징을 가진 다공성 흑연화 탄소 카트리지 (Porous Graphitized Carbon Cartridge)를 이용하여 고체상 추출 (Solid Phase Extraction)을 하여 당펩타이드만 선택적으로 추출하였다. 다공성 흑연화 탄소 카트리지를 사용할 경우 펩타이드 및 아미노산은 세척과정 중에 제거되어 당펩타이드를 선택적으로 추출할 수 있다. 또한, N-당펩타이드의 경우 O-당펩타이드보다 유기용매 함량이 높은 부분에서 용출되기 때문에 고체상 추출 과정에서 유기용매 함량을 조절하여 용출할 경우 질량분석시 N-당펩타이드의 영향을 최소화할 수 있다. 정제한 O-당펩타이드에 대하여 LC/MS를 이용하여 시알산 및 시알산 변이체를 포함한 O-당사슬을 프로파일링하고, LC/MS/MS를 통하여 정확한 구조분석을 진행하였다.
3. 도 3은 O-당사슬의 시알산에 O-아세틸화된 변이체를 가진 당단백질을 본 발명 방법에 적용한 개념도이다. 시알산 O-아세틸화 변이체를 가진 대표적인 당단백질 의약품으로 에리스로포이에틴(EPO)을 들 수 있다. 본 발명에 따른 분석방법을 적용한 경우, 시알산 변이체를 포함한 O-당사슬을 구조 분해 없이 완벽하게 프로파일링할 수 있다. 또한, 다량의 N-당사슬 존재하에서도 별도의 시료처리 과정 없이 O-당사슬을 고감도로 분석할 수 있다. 종래의 β-제거 방법과 비교하여 시료 처리방법이 간단하고, 시료 처리시간이 짧아 신속하게 O-당사슬을 스크리닝할 수 있으며, 당사슬에 붙어있는 펩타이드 조각을 이용하여 당쇄화 자리를 확인할 수 있다.
4. 도 4는 에리스로포이에틴에 관하여 종래 방법과 본 발명의 방법을 이용하여 O-당펩타이드 당사슬 프로파일링을 수행한 결과를 비교한 것이다. 현재 시판되고 있는 당단백질 의약품 에리스로포이에틴 (erythropoietin; EPO)은 하나의 O-당자리를 가지고 있는 당단백질이다. 또한, EPO의 당사슬에는 시알산 하나당 최대 2개의 O-아세틸화된 변이체가 존재한다. 종래 방법인 β-제거 방법을 이용하여 O-당사슬을 유리하게 되면 화학반응에 의하여 시알산의 변이체가 분해되어 온전한 당사슬 프로파일링이 불가능하다. 종래 방법을 이용할 경우 시알산 변이체의 존재를 확인할 수 없었으며, 1_1_1_0 (Hexose1_HexNAc1_NeuAc1_OAc0) 및 1_1_2_0(Hexose1_HexNAc1_NeuAc2_OAc0)의 구성을 갖는 O-당사슬만을 확인할 수 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 분석법을 적용한 경우 시알산에 O-아세틸화된 변이체를 포함한 O-당사슬을 온전히 확보할 수 있었으며, O-당사슬에 최대 4개까지 O-아세틸화된 시알산 변이체를 확인할 수 있었다. 뿐만 아니라, O-당쇄화 자리(아미노산 126번 위치)를 가진 O-당펩타이드를 확보할 수 있어 O-당사슬 다양성 프로파일링과 동시에 당자리를 확인할 수 있었다.
5. 도 5는 시판 중인 에리스로포이에틴을 당단백질 시료로 하여 O-아세틸화된 시알산 변이체를 갖는 O-당사슬의 구조를 텐덤 질량분석법을 이용하여 구조를 확인한 결과이다. 본 발명의 방법을 이용할 경우 화학적 환경에 민감한 시알산 및 시알산 변이체의 구조에 영향 없이 분리 분석이 가능함을 확인하였다.
예컨대, m/z 948.88 (z2)에 해당되는 당펩타이드는 아미노산 126번 세린 (Ser)에 당사슬이 결합되어 있으며, 당사슬은 1_1_2_2 (Hex1_HexNAc1_NeuAc2_OAc2) 구조로서 2개의 시알산에 각각 O-아세틸화 되어 있다. 시알산에 하나의 O-아세틸화가 된 변이체의 경우 텐덤 질량스펙트럼에서 m/z 316 또는 m/z 334의 피크를 확인할 수 있으며, 두 개가 O-아세틸화된 변이체는 m/z 358 또는 m/z 376 피크를 확인할 수 있다. 이러한 진단 이온 (diagnostic ion)을 통하여 시알산 변이체를 빠르게 스크리닝할 수 있다. 본 발명자들은 이와 같은 LC/MS/MS 방법으로 당자리에 각각의 당사슬 및 그의 변이체들이 분해되지 않고 존재한다는 직접적인 결과를 확보하였다.
6. 도 6은 서로 다른 배치(batch)의 다르베포에틴 알파(darbepoetin alfa: 에리스로포이에틴의 합성형)에 존재하는 O-당펩타이드의 양을 상대적으로 비교분석한 결과이다. EPO의 O-당사슬은 아미노산 126번 세린에 결합되어 있으며, 다르베포에틴 알파의 O-당사슬의 87%가 두 개의 시알산을 가지고 있다. 시알산 하나를 갖는 O-당사슬의 경우 최대 두 개의 O-아세틸화된 변이체가 존재하고, 시알산 두 개를 갖는 O-당사슬의 경우 최대 네 개의 O-아세틸화된 시알산 변이체가 존재하는 것을 확인하였다.
아래 표 1은 본 발명의 방법과 종래의 β-제거 방법을 비교한 것이다.
구분 본 발명 방법 종래 O-당사슬 분석방법
시료처리과정 비특이적 단백질 분해효소 처리 (6 hours)->
탈염 (4 hours) ->
LC/MS/MS (1 hour)		 β-elimination (16 hours)->
탈염(4 hours) ->
LC/MS/MS (1 hour)
분석소요시간 총 11.5시간 총 21시간
특징 - 다량의 N-당사슬 존재하에서도 O-당사슬을 고감도로 분석할 수 있음 -> N-당펩타이드 분리하는 과정 불필요함.

- 기존의 O-당사슬 분석법 및 이전 발명법에 비하여 시료 처리 방법이 단순하며, 시료 처리 시간이 매우 짧아 좀 더 빠른 스크리닝이 가능함.

- 화학적 반응에 민감한 시알산 및 그 변이체 구조의 손상 없이 당사슬 다양성을 완벽히 프로파일링할 수 있음.

- 당펩타이드 생성으로 O-당사슬 다양성 뿐만 아니라 당사슬이 결합되어있는 당자리까지 동시에 확인 가능함. 		- 당단백질에서 O-당사슬을 유리하기 위하여 보편적으로 사용되는 방법.

- 화학적으로 당사슬을 유리하는 과정에서 O-당사슬에 존재하는 시알산 및 그 변이체 구조가 분해되어 O-당사슬 다양성 분석을 완벽히 할 수 없음.

- 당사슬 유리 중 단백질 구조의 분해로 당자리 확인이 불가능함.

Claims (8)

  1. a) 당단백질에 대하여 비특이적 단백질 분해효소를 처리하여 당단백질을 펩타이드로 절단하는 단계;
    b) 다공성 흑연화 탄소 카트리지를 이용한 고체상 추출시 유기용매 농도구배를 이용하여 상기 a) 단계에서 절단된 펩타이드 중 당펩타이드만을 분리함과 동시에 당펩타이드를 각각 분획하는 단계; 및
    c) 분획된 당펩타이드 중 부위-특이적 O-당펩타이드 분획에 대하여 각각 질량분석하는 단계;를 포함하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 분석방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 a) 단계 이전 당단백질과 혼합된 불순물을 제거하는 단계;가 부가되는 것을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 분석방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 a) 단계 이전에 당단백질의 이황화 결합을 절단 처리하는 단계가 부가되는 것을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 분석방법.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 a) 단계의 비특이적 단백질 분해효소는 엘라스테이즈 (elastase), 파파인 (papain), 펩신 (pepsin), 프로네이즈 (pronase), 프로티네이즈 K (proteinase K), 섭틸리신 (subtilisin) 및 써모라이신 중 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 분석방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 c) 단계의 질량분석은 LC/MS 또는 LC/MS/MS 방법으로 수행함을 특징으로 하는 당단백질의 부위-특이적 O-당펩타이드 분석방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Peter Hufnagel 외 4명,"AUTOMATED DETECTION AND IDENTIFICATION OF N- AND O-GLYCOPEPTIDES", Proceeding of the Beilstein Glyco-Bioinformatics Symposium 2013(2014.12.22.)*

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