CN113671090A - 一种测定血清中唾液酸含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种测定血清中唾液酸含量的方法，包括：步骤S1：提供血清样本，血清样本包含游离唾液酸和缀合唾液酸；步骤S2‑1：对血清样本进行酸解，离心后得到缀合唾液酸的酸水解产物，干燥，加入内标物；和/或，步骤S2‑2：在血清样本中加入内标物，用有机溶剂进行蛋白沉淀，离心得到游离唾液酸的提取液，干燥；步骤S3：加入衍生试剂进行衍生，获得衍生产物；步骤S4：对衍生产物进行液相色谱质谱联用检测，得到唾液酸含量的测定结果。本申请的测定血清中唾液酸含量的方法，可用于准确测定复杂生物样本血清中的唾液酸。
Description
技术领域
本申请涉及检测技术领域，具体涉及一种测定血清中唾液酸含量的方法。
背景技术
唾液酸(Sialic acid，SA)是一类九碳单糖的衍生物，多位于糖缀合物糖链的端基，广泛存在于动植物以及微生物体内。它在许多生理学和病理学包括癌细胞转移、病毒受体以及神经系统的发育都起到重要作用，并且在婴儿营养品、药物载体、化学合成抗流感药物的关键前体、流感病毒神经氨酸苷酶的高亲和力抑制剂等方面具有潜在的应用价值。
生物样本中的唾液酸由于其结构含大量羟基，不容易离子化，在进行质谱分析时具有一定的挑战性，通常需要富集纯化之后再采取衍生化方法进行检测，操作较为复杂。
发明内容
本申请的目的在于提供一种测定血清中唾液酸含量的方法，具有高准确性和高灵敏度。
为了达到上述目的，根据本申请的一方面，提供一种测定血清中唾液酸含量的方法，包括：
步骤S1：提供血清样本，血清样本包含游离唾液酸和缀合唾液酸；
步骤S2-1：对血清样本进行酸解，离心后得到缀合唾液酸的酸水解产物，干燥，加入内标物；和/或，
步骤S2-2：在血清样本中加入内标物，用有机溶剂进行蛋白沉淀，离心得到游离唾液酸的提取液，干燥；
步骤S3：加入衍生试剂进行衍生，获得衍生产物；
步骤S4：对衍生产物进行液相色谱质谱联用检测，得到唾液酸含量的测定结果。
可选的，在本申请的一些实施例中，唾液酸含量包括游离唾液酸含量和总唾液酸含量。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S2-1中，酸解所用的酸包括三氟乙酸、硫酸、盐酸或甲酸。
可选的，在本申请的一些实施例中，酸的浓度可以为1～3mol/L，也可以为1.5～2.5mol/L，优选的，酸的浓度为1mol/L。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S2-1中，内标物为尤罗索尼克酸，也可以选择同位素标记的N-乙酰神经氨酸或同位素标记的N-羟乙酰神经氨酸中的一种或多种。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S2-1中，内标物的浓度可以为300～700μg/mL，也可以为400～600μg/mL，优选地，内标物的浓度为500μg/mL。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S2-2中，有机溶剂包括乙腈或甲醇。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S2-2中，内标物为尤罗索尼克酸，也可以选择同位素标记的N-乙酰神经氨酸或同位素标记的N-羟乙酰神经氨酸中的一种或多种。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S2-2中，内标物的浓度可以为3000～7000ng/mL，也可以为4000～6000ng/mL，优选的，内标物的浓度为5000ng/mL。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S3中，衍生试剂包括吉拉德试剂P或吉拉德试剂T。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S3中，衍生的反应温度可以为50～80℃，也可以为55～75℃，优选的，衍生的反应温度为65℃。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S3中，衍生的反应时间可以为2～15小时，也可以为3～10小时，优选的，衍生的反应时间为8小时。
可选的，在本申请的一些实施例中，步骤S4还包括将衍生产物的检测结果与标准曲线进行比较，得到唾液酸含量的测定结果。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，液相色谱质谱联用检测中所采用的色谱柱为C18柱或HILIC亲水作用色谱柱。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，色谱分析的参数流速为0.1～0.3mL/min，参数流速还可以为0.2mL/min。
可选的，在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，色谱分析的流动相包含水相和有机溶剂。
可选的，在本申请的一些实施例中，方法的唾液酸检测信噪比为3～200；对于5fg的样品，唾液酸检测信噪比大于10。
本申请提供一种测定血清中唾液酸含量的方法，具有以下有益效果：
1)操作简单，重现性好，应用范围广，可以用作唾液酸及其衍生物的准确测定；
2)本申请方法具有良好的重现性和稳定性，并且灵敏度极高，5fg的信噪比远大于10，因此在复杂血清样本中的基质效应极小；
3)唾液酸标准品以及内标物可与实际样品同步进行处理，定量准确度高，该方法的加标回收率较高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是唾液酸经吉拉德试剂P衍生的反应原理；
图2是实施例一和实施例二的检测色谱图以及质谱图；
图3是绘制的标准曲线图；
图4是定量限和图谱。
具体实施方式
下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请提供一种测定血清中唾液酸含量的方法。以下对本申请所述的方法进行详细说明。需说明的是，以下实施例的描述顺序不作为对实施例优选顺序的限定。
本申请中，游离唾液酸指、N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac)或N-羟乙酰神经氨酸(Neu5Gc)。
本申请中，缀合唾液酸指唾液酸聚糖、唾液酸糖肽和唾液酸糖蛋白糖链端基上的唾液酸。
本申请实施例提供一种测定血清中唾液酸含量的方法，包括：
步骤S1：提供血清样本，血清样本包含游离唾液酸和缀合唾液酸；
步骤S2-1：对血清样本进行酸解，离心后得到缀合唾液酸的酸水解产物，干燥，加入内标物；
步骤S2-2：在血清样本中加入内标物，用有机溶剂进行蛋白沉淀，离心得到游离唾液酸的提取液，干燥；
步骤S3：加入衍生试剂进行衍生，获得衍生产物；
步骤S4：对衍生产物进行液相色谱质谱联用检测，得到唾液酸含量的测定结果，其中唾液酸含量包括总唾液酸含量和游离唾液酸含量。
在本申请的一些实施例中，测定血清中游离唾液酸含量的方法包括：
步骤S1：提供血清样本，血清样本包含游离唾液酸；
步骤S2-2：在血清样本中加入内标物，用有机溶剂进行蛋白沉淀，离心得到游离唾液酸的提取液，干燥；
步骤S3：加入衍生试剂进行衍生，获得衍生产物；
步骤S4：对衍生产物进行液相色谱质谱联用检测，得到游离唾液酸含量的测定结果。
在本申请的一些实施例中，测定血清中总唾液酸含量的方法包括：
步骤S1：提供血清样本，血清样本包含缀合唾液酸；
步骤S2-1：对血清样本进行酸解，离心后得到缀合唾液酸的酸水解产物，干燥，加入内标物；
步骤S3：加入衍生试剂进行衍生，获得衍生产物；
步骤S4：对衍生产物进行液相色谱质谱联用检测，得到总唾液酸含量的测定结果。
在本申请的一些实施例中，在步骤S2-1中，酸解所用的酸包括三氟乙酸、硫酸、盐酸或甲酸；优选的，酸解所用的酸为三氟乙酸。
在本申请的一些实施例中，酸的浓度可以为1～3mol/L，也可以为1.5～2.5mol/L，优选的，酸的浓度为1mol/L。
在本申请的一些实施例中，在步骤S2-1中，内标物选自尤罗索尼克酸(KDN)、同位素标记的N-乙酰神经氨酸或同位素标记的N-羟乙酰神经氨酸中的一种或多种；在待测的样本中准确加入一定量的内标物，分别测定内标物和待测组分的峰面积(或峰高)，即可求出待测组分的含量，消除了由于进样量、仪器不稳定等因素带来的系统误差。
在本申请的一些实施例中，在步骤S2-1中，内标物的浓度可以为300～700μg/mL，也可以为400～600μg/mL，优选的，内标物的浓度为500μg/mL。
在本申请的一些实施例中，在步骤S2-2中，有机溶剂包括乙腈或甲醇；优选地，有机溶剂为乙腈。
在本申请的一些实施例中，在步骤S2-2中，内标物选自同位素标记的尤罗索尼克酸、同位素标记的N-乙酰神经氨酸或同位素标记的N-羟乙酰神经氨酸中的一种或多种。
在本申请的一些实施例中，在步骤S2-2中，内标物的浓度可以为3000～7000ng/mL，也可以为4000～6000ng/mL，优选的，内标物的浓度为5000ng/mL。
在本申请的一些实施例中，在步骤S3中，衍生试剂包括吉拉德试剂P(GP)或吉拉德试剂T(GT)；优选的，衍生试剂为GP。唾液酸由于其结构含大量羟基，不容易离子化，因此需要进行衍生。唾液酸经GP试剂衍生的反应原理如图1所示，吉拉德试剂P自身带永久正电荷，在质谱中响应较好，经过GP衍生反应，唾液酸的酮基与吉拉德试剂P的氨基发生席夫碱反应，衍生产物也带上永久正电荷，在质谱中的响应很强，而不会存在别的一些加合离子峰例如金属加合离子峰。经吉拉德试剂P衍生后能够提高检测灵敏度，稳定唾液酸结构，增强色谱分离度等。
在本申请的一些实施例中，在步骤S2-1和步骤S2-2中，离心为5000～20000g离心1～15分钟，例如15000g离心5分钟。
在本申请的一些实施例中，在步骤S3中，衍生的反应条件为50～80℃搅拌反应2～15小时，较佳的为55～75℃搅拌反应3～10小时，更佳的为65℃搅拌反应8小时。
在本申请的一些实施例中，步骤S4还包括将衍生产物的检测结果与标准曲线进行比较，得到唾液酸含量的测定结果。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，液相色谱质谱联用检测中所采用的色谱柱为C18柱或HILIC亲水作用色谱柱。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，液相色谱质谱联用检测中所采用的色谱柱为Hypersil Gold column(2.1×100mm,granulation of 3μm,Thermo Fisher)。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，色谱分析的参数流速为0.1～0.3mL/min，参数流速还可以为0.2mL/min；优选的，色谱分析的参数流速为0.3mL/min。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，色谱分析的参数运行时间可以为为2～15分钟，也可以为5～12分钟，优选的，色谱分析的参数运行时间为10分钟。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，色谱分析的参数进样量可以为0.5～10μL，也可以为2～7μL，优选的，色谱分析的参数进样量为1μL。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，色谱分析的参数进样盘温度为10℃以下，优选的，色谱分析的参数进样盘温度为4℃。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，色谱分析的流动相包含水相和有机溶剂。
在本申请的一些实施例中，在步骤S4中，水相的起始比例不高于10％，优选地，水相的起始比例为5％。
在本申请的一些实施例中，血清样本体积大于等于10μL。
在本申请的一些实施例中，上述方法的唾液酸检测信噪比为3～200；上述方法具有较高的灵敏度，能够检测小于等于5fg的样品；对于5fg的样品，上述方法的唾液酸检测信噪比大于10。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例一、测定血清中总唾液酸含量
本实施例提供测定血清中总唾液酸含量的方法，具体包括如下步骤：
1)取10μL人血清与90μL超纯水混合均匀；
2)加入100μL的1mol/L的三氟乙酸，混合均匀后，置于80℃烘箱进行酸解1小时，冷却后1500g离心5min后，取上清液，分装，每管20μL，室温下真空干燥，加入98μL超纯水，2μL内标物；
3)再加入100μL的GP试剂(1mg/mL,溶于水：乙酸：甲醇＝6:3:1，v/v/v)，得到衍生产物；
4)从衍生产物中取出20μL于60℃下真空干燥，进而用1mL甲醇复溶后，液质上样1μL。
色谱柱：流速0.3mL/min；运行时间10分钟；进样量1μL。进样盘温度为4℃。流动相：A相为含0.1％甲酸的水溶液，B相为乙腈，洗脱梯度：0-4min，5％-30％B，4-6min,30％-95％B，6-8min，保持95％B不变，8.0-8.1min，95％-5％B，8.1-10min，保持5％B不变。
实施例二、测定血清中游离唾液酸含量
本实施例提供测定血清中游离唾液酸含量的方法，具体包括如下步骤：
1)取40μL人血清加入8μL内标物(5000ng/mL)混合均匀后，加入144μL乙腈，混合均匀，15000g，离心10分钟后取上清液，分装每管4.8μL体积，室温下真空干燥，加入95.2μL超纯水；
2)再加入100μL GP试剂(1mg/mL,溶于水：乙酸：甲醇＝6:3:1，v/v/v)5000g，离心5分钟，取出20μL，于60℃下真空干燥，进而用100μL甲醇复溶后，液质上样1μL。
色谱柱：流速0.3mL/min；运行时间10分钟；进样量1μL。进样盘温度为4℃。洗脱梯度：0-4min，5％-30％B，4-6min,30％-95％B，6-8min，保持95％B不变，8.0-8.1min，95％-5％B，8.1-10min，保持5％B不变。
实施例一和实施例二所得到的产物色谱图和质谱图如图2所示。图2a为经GP衍生的产物色谱图，图2b-c分别为经GP衍生的唾液酸及其同位素标记的唾液酸产物一级质谱图，图2d-f依次为经GP衍生的唾液酸，内标物(KDN)，同位素标记唾液酸的产物二级质谱图。由图2可知，在本方法中，GP试剂可成功衍生唾液酸，内标以及同位素标记唾液酸，并且在定量检测过程中不存在其他的干扰物，特异性较好。
实施例三、方法验证
本实施例应用唾液酸标准溶液，对测定方法进行验证，具体包括如下步骤：
1)取5μL唾液酸标准溶液(10μg/ml)与93μL超纯水混合，再加入2μL内标物，均匀混合，制得低浓度加标溶液；
2)取5μL唾液酸标准溶液(100μg/ml)与93μL超纯水混合，再加入2μL内标物，均匀混合，制得中浓度加标溶液；
3)取10μL唾液酸标准溶液(100μg/ml)与88μL超纯水混合，再加入2μL内标物，均匀混合，制得高浓度加标溶液；
4)之后加入100μL GP溶液，混合均匀之后，5000g，离心5min,取出20μL，于60℃下，真空干燥，进而用1mL甲醇复溶。LC-MS进样1μL。
色谱柱：流速0.3mL/min；运行时间10分钟；进样量1μL。进样盘温度为4℃。洗脱梯度：0-4min，5％-30％B，4-6min,30％-95％B，6-8min，保持95％B不变，8.0-8.1min，95％-5％B，8.1-10min，保持5％B不变。
经方法学验证得到低、中、高三个浓度的加标回收率均在98.1％-114.0％范围内，RSD值(相对标准偏差)也均低于5％，符合方法学验证要求。
如图3所示为根据标准样品建立的标准曲线，根据实际样品里唾液酸浓度配制一系列唾液酸标准溶液：5-200ng/mL(总唾液酸)，100-1500pg/mL(游离唾液酸)。其中图3a显示了总唾液酸的标准曲线，图3b显示了游离唾液酸的标准曲线，均具有良好的线性关系，说明本申请方法检测标准样品具有较宽的线性范围。
如图3c所示使用13C同位素标记唾液酸与唾液酸建立标准曲线，通过斜率的比值来考察基质效应的干扰程度。经比较，二者斜率比值接近1，标准曲线重叠良好，基质效应可忽略不计。
如图4所示为本申请方法的定量限和图谱，定量限通过对一系列已知质量样品进行分析，在准确度和精密度都符合要求的情况下，来确定样品能被定量的最小量。由图4可知，当样品为5fg时，也能对样品进行较好的分离，此时信噪比为47，说明本申请的唾液酸测定方法灵敏度很高，能够实现微小质量样品的检测。
本申请测定血清中唾液酸含量的方法可实现血清中游离唾液酸和总唾液酸的定量检测，定量范围广，灵敏度高，在检测中有着很好的应用前景。
以上对本申请实施例所提供的一种测定血清中唾液酸含量的方法进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
Claims (11)
1.一种测定血清中唾液酸含量的方法，其特征在于，包括：
步骤S1：提供血清样本，所述血清样本包含游离唾液酸和缀合唾液酸；
步骤S2-1：对所述血清样本进行酸解，离心后得到所述缀合唾液酸的酸水解产物，干燥，加入内标物；和/或，
步骤S2-2：在所述血清样本中加入内标物，用有机溶剂进行蛋白沉淀，离心得到所述游离唾液酸的提取液，干燥；
步骤S3：加入衍生试剂进行衍生，获得衍生产物；
步骤S4：对所述衍生产物进行液相色谱质谱联用检测，得到唾液酸含量的测定结果。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述唾液酸含量包括游离唾液酸含量和总唾液酸含量。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2-1中，所述酸解所用的酸包括三氟乙酸、硫酸、盐酸或甲酸，所述酸的浓度为1～3mol/L。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2-1中，所述内标物选自尤罗索尼克酸、同位素标记的N-乙酰神经氨酸或同位素标记的N-羟乙酰神经氨酸中的一种或多种；和/或，所述内标物的浓度为300～700μg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2-2中，所述有机溶剂为乙腈或甲醇。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S2-2中，所述内标物选自尤罗索尼克酸、同位素标记的N-乙酰神经氨酸或同位素标记的N-羟乙酰神经氨酸中的一种或多种；和/或，所述内标物的浓度为3000～7000ng/mL。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述衍生试剂包括吉拉德试剂P或吉拉德试剂T。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S3中，所述衍生的反应温度为50～80℃，所述衍生的反应时间为2～15小时。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S4还包括将所述衍生产物的检测结果与标准曲线进行比较，得到唾液酸含量的测定结果。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S4中，所述液相色谱质谱联用检测中所采用的色谱柱为C18柱或HILIC亲水作用色谱柱，色谱分析的参数流速为0.1～0.3mL/min，色谱分析的流动相包含水相和有机溶剂。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法的唾液酸检测信噪比为3～200。
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