WO2012111775A1 - セリン、スレオニンの翻訳後修飾解析用標識剤 - Google Patents

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康郎 篠原
泰啓 武川
直樹 藤谷
潤一 古川
秀昭 坂井
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株式会社セルシード
国立大学法人北海道大学
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Definitions

  • the present invention relates to a novel analysis method of a post-translational modification group to serine or threonine that is useful in fields such as biochemistry, biology, pharmacy, drug discovery, and medicine.
  • the present invention selectively cleaves post-translationally modified O-phosphate groups, O-sulfate groups, O-glycans, etc. from serine or threonine of glycoproteins and / or glycopeptides that have undergone post-translational modifications.
  • the present invention relates to a labeling agent for labeling.
  • glycosylation is thought to play a role like cell-cell adhesion.
  • the sugar chains that modify proteins are roughly divided into three groups: N-glycans, O-glycans, and glycosaminoglycans (GAG).
  • the types of monosaccharides constituting the sugar chain are mannose (Man), glucose (Glc), galactose (Gal), xylose (Xyl), glucuronic acid (GlcA), N-acetylglucosamine (GlcNAc). ), N-acetylgalactosamine (GalNAc), fucose (Fuc), and sialic acid (SA).
  • N-glycans are N-linked sugar chains to asparagine (Asn), a peptide having the sequence of -asparagine-X-threonine or -asparagine-X-serine (where X is an amino acid residue other than proline (Pro)).
  • Asparagine Asn
  • O-glycans are those in which the first sugar is transferred to a threonine (Thr) or serine (Ser) residue through an O-linkage.
  • the first sugar of O-glycan is often N-acetylgalactosamine, but there are mannose, fucose, N-acetylglucosamine and the like.
  • glycosaminoglycan a sugar chain portion having the amino sugar (N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine) is called glycosaminoglycan (GAG).
  • GAG glycosaminoglycan
  • the characteristic of glycosaminoglycan is that disaccharide is one unit and its repeating structure makes it an extremely long sugar chain.
  • serine and threonine are phosphorylated, sulfated, and sugar chain modified (O-GalNAc type, O-GlcNAc type, O-Fuc type, O-Man type, O-Xyl type, O-Gal type, O- Glc type) and other post-translational modifications, and these post-translational modifications play an important role in the regulation of higher-order functions of various life such as signal transduction and differentiation control.
  • inhibitors of kinases responsible for phosphorylation of specific proteins have already been marketed as pharmaceuticals, and qualitative and quantitative fluctuations of O-linked sugar chains have been applied to the diagnosis of various diseases.
  • O-phosphorylation O-sulfation
  • O-GlcNAcation those in which a phosphate group, a sulfate group, and an O-GlcNAc group are combined, respectively.
  • O-linked sugar chain modifications such as O-GalNAcation, O-Fucation, O-Manylation, O-Xylation and the like further extend to take various structures.
  • a phosphorylation site can be labeled by the action of a compound having a thiol group such as dithiothreitol, which is used for peptide purification, on-beads, on-chip fluorescent labeling, etc. (Patent Document 3) reference).
  • the BEMA method contributes to research related to protein phosphorylation and has become a widely used method.
  • BEMA post-translational modification groups of serine and threonine including O-GlcNAcation
  • the Michael donor in BEMA a compound having a thiol group is generally used, and there are almost no application examples of other Michael donors, and the application range is narrow.
  • Non-patent Document 2 a method of metabolic labeling with a non-natural GlcNAc derivative having an azide group at the 2-position has been reported (Non-patent Document 2). Furthermore, when analyzing various structures of the sugar chain part of the O-GalNAc type (mucin type), an effective enzyme that cuts out a sugar chain from a protein has not been discovered. ⁇ elimination is widely used. In this case, the released sugar chain can also undergo ⁇ -elimination sequentially from the reducing end side to cause decomposition (peeling reaction), so a high concentration of reducing agent is added to reduce the reducing end to sugar alcohol simultaneously with ⁇ -elimination. .
  • An object of the present invention is to solve such problems, and post-translationally modified O-phosphate groups to serine residues and threonine residues of glycoproteins and / or glycopeptides subjected to post-translational modifications. It is an object of the present invention to provide a method for efficiently cleaving these post-translational modifications by using a labeling agent capable of commonly labeling O-sulfate group, O-glycan, etc. Furthermore, the object of the present invention is to provide a method for obtaining information on the type of modification and the modification position on the peptide, and at the same time chemically modifying the post-translational modification site, the released sugar chain does not cause a peeling reaction. Furthermore, it is to provide a method for recovering as an arbitrary derivative advantageous for separation and detection, and to provide a new group of compounds for labeling a peptide moiety by the BEMA method.
  • the present inventors have conducted research and development by adding studies from various angles. As a result, by adding a specific labeling agent to O-phosphate group, O-sulfate group, O-glycan, etc. that have been post-translationally modified to serine or threonine under basic conditions, heating is performed. Has been found to be cleaved selectively, and the cleaved post-translational modification group can be labeled efficiently. The present invention has been completed based on such findings.
  • the present invention is an analytical method that exceeds conventional methods in terms of convenience and selectivity, and includes post-translational modification groups from serine residues and / or threonine residues of glycoproteins and / or glycopeptides subjected to various post-translational modifications. Can be selectively cleaved from the amino acid residue and analyzed. Furthermore, in the present invention, the glycoprotein and / or glycopeptide that is the cleavage source can also be analyzed.
  • the present invention selectively cleaves a post-translational modification group from a serine residue and / or threonine residue of a glycoprotein and / or glycopeptide subjected to post-translational modification under basic conditions.
  • a labeling agent that labels at least one of a threonine residue and a post-translational modification group selectively cleaved from the amino acid residue.
  • the present invention is to dissolve or disperse the glycoprotein and / or glycopeptide of the test substance and the labeling agent in a solvent and heat them under basic conditions, so that the serine residue and / or the test substance is obtained.
  • the present invention provides a method for cleaving a post-translational modification group that selectively cleaves the post-translational modification group from a threonine residue. Furthermore, the present invention provides a method for analyzing post-translational modification groups of serine residues and / or threonine residues of glycoproteins and / or glycopeptides using the post-translational modification group cleavage method. .
  • the present invention is in the world that makes it possible to comprehensively analyze O-phosphate groups, O-sulfate groups, O-glycans and the like that have been post-translationally modified to serine and threonine, which has been difficult with the prior art. This is an extremely important invention based on a new idea that has no idea.
  • an O-phosphate group, an O-sulfate group, an O-glycan, etc. are released from a glycoprotein with a simple operation and mild conditions without using harmful reagents.
  • both the sugar chain and the peptide can be labeled with the same or different reagents.
  • Such a label contributes to ease of subsequent separation and / or high sensitivity in detection and the like, and thus the labeled sugar chain and peptide can be easily purified.
  • Example 1 it is a figure which shows the result of the MALDI-TOF spectrum obtained when a model glycopeptide which has an O-GalNAc type sugar chain is heated with PMP, DP, and MTP, respectively, under basic conditions.
  • Example 1 it is a figure which shows the reaction path
  • Example 2 it is a figure which shows the profile of the O-linked sugar chain cut out from the model glycopeptide which has an O-GalNAc type sugar chain on various conditions.
  • Example 3 it is a figure which shows the TOF / TOF spectrum of the peptide each labeled by DP obtained in Example 1.
  • FIG. 3 it is a figure which shows the TOF / TOF spectrum of the peptide each labeled by PMP obtained in Example 1.
  • FIG. 3 it is a figure which shows the TOF / TOF spectrum of the peptide each labeled by MTP obtained in Example 1.
  • FIG. 1 it is a figure which shows the TOF / TOF spectrum of the peptide each labeled by MTP obtained in Example 1.
  • Example 4 it is a figure which shows the MALDI-TOF spectrum of a product when the model glycopeptide which has an O-GalNAc type
  • Example 4 it is a figure which shows the reaction pathway assumed when the model glycopeptide which has an O-GalNAc type
  • Example 5 it is a figure which shows the O-linked sugar chain profile obtained when bovine fetuin and porcine stomach mucin are heated with DP under basic conditions.
  • Example 6 it is a figure which shows the MALDI-TOF spectrum of a product when a phosphorylated model peptide (left figure) and an O-GlcNAc-ized model peptide (right figure) are heated with PMP and DP, respectively, under basic conditions.
  • Example 7 shows the MALDI-TOF spectrum of the reaction result when a model glycopeptide which has an O-GalNAc type sugar chain is heated with DTT, DP, DTT and DP, respectively, under basic conditions.
  • a mass spectrum is shown when a pyrazolone derivative (DP) and dithiothreitol (DTT) are added to a glycopeptide having an O-GlcNAc type sugar chain under basic conditions and heated at 70 ° C. for 16 hours.
  • DP pyrazolone derivative
  • DTT dithiothreitol
  • FIG. 3 is a diagram showing an O-linked glycan profile obtained when bovine fetuin and porcine submandibular gland mucin are heated with DP under basic conditions.
  • the circles in the figure indicate galactose, the light ⁇ marks indicate N-acetylgalactosamine, the dark ⁇ marks (black ⁇ marks) indicate N-acetylglucosamine, and the ⁇ marks indicate fucose.
  • ⁇ means N-acetylneuraminic acid.
  • FIG. 5 is a diagram showing a MALDI-TOF spectrum after sugar chain labeling with a novel pyrazolone reagent (the upper column is labeled with compound 5, the middle column is labeled with compound 10 and the lower column is labeled with compound 14). It is a reaction scheme which shows the synthetic pathway of an arginine addition pyrazolone reagent. It is another reaction scheme which shows the synthetic pathway of an arginine addition pyrazolone reagent. It is a reaction scheme which shows the synthetic pathway of a biotin addition pyrazolone reagent.
  • the present invention relates to a technique for analyzing post-translational modifications involving serine residues and / or threonine residues in glycoproteins and / or glycopeptides subjected to post-translational modifications.
  • the origin of the target glycoprotein and / or glycopeptide is not limited at all.
  • human, rat, mouse, guinea pig, marmoset, rabbit, dog, cat, sheep, pig, chimpanzee or immunodeficiency thereof Examples include animals such as animals, or plants.
  • the present invention analyzes post-translational modification groups modified to serine residues and / or threonine residues having hydroxyl groups as amino acids in glycoproteins and / or glycopeptides subjected to post-translational modifications.
  • a post-translational modification group is not particularly limited, and examples thereof include a phosphate group, a sulfate group, and a glycan through an O atom on the amino acid side. In the present invention, any one of them can be mentioned. It may be a seed or two or more.
  • a glycan bonded through an O atom on the amino acid side (hereinafter, a glycan bonded through an O atom on the amino acid side is sometimes referred to as an O-glycan. Similarly, it is bonded through an O atom on the amino acid side.
  • Phosphoric acid group and sulfuric acid group may be referred to as O-phosphoric acid group and O-sulfuric acid group, respectively.
  • O-phosphoric acid group and O-sulfuric acid group As sugars bonded to O atom, N-acetylgalactosamine, mannose, fucose, N-acetylglucosamine, Those starting from either xylose or glucose, or sugars binding to the O atom, starting from any of N-acetylgalactosamine, mannose, fucose, xylose and glucose, and further extended by binding of sugars may be used.
  • the cleavage reaction may be a ⁇ elimination reaction according to a conventional method, and the conditions are not particularly limited.
  • the cleavage reaction may be dissolved or dispersed in a post-translationally modified glycoprotein and / or glycopeptide solvent.
  • the method of heating on basic conditions is mentioned.
  • ⁇ -elimination conditions for example, it is allowed to stand at 4 to 60 ° C. for 10 minutes to 24 hours in 10 mM to 1 M lithium hydroxide, sodium hydroxide or barium hydroxide.
  • the post-translational modification of serine and threonine is labeled by Michael addition to the double bond formed when liberated by ⁇ elimination.
  • the Michael addition is generally performed in one pot, and is performed by adding a Michael addition reaction donor such as a pyrazolone derivative of about 20 mM to 1 M at the time of ⁇ elimination.
  • the post-translational modification group side that has been released can also be labeled.
  • only the serine residue and / or threonine residue side may be labeled, or both may be labeled, and further, the serine residue and / or threonine residue side and the post-translational modification group side May be labeled with different reagents.
  • the reagent used in such a Michael addition reaction is not particularly limited, and examples thereof include thiol compounds, pyrazolone derivatives, isoxazolone derivatives, hydantoin derivatives, rhodanine derivatives, maleimide derivatives, and the like in the present invention. Any one of them may be used, or two or more of them may be used in combination. Among them, pyrazolone derivatives, isoxazolone derivatives, hydantoin derivatives, rhodanine derivatives, maleimide derivatives and the like are advantageous as the present invention because they can be labeled simultaneously with the Michael addition reaction.
  • the labeling agent of the present invention means a preparation containing such a reagent.
  • a pyrazolone derivative is further useful as a labeling agent of the present invention and is not particularly limited as long as it is a compound having a pyrazolone group.
  • PMP 3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone
  • DP 1,3-dimethyl-pyrazolone
  • MTP 3-methyl-1-p-tolyl-5-pyrazolone
  • 4-H 4-H
  • Examples of the isoxazolone derivative include 3 (2H) -isoxazolone, 5-methyl-3 (2H) -isoxazolone, 2,5-dimethyl3 (2H) -isoxazolone, and the like.
  • Examples of hydantoin derivatives include 2,4-imidazolidinedione, 3-methyl-2,4-imidazolidinedione, 3- (2-propyn-1-yl) -2,4-imidazolidinedione, and the like.
  • Examples of rhodanine derivatives include 2-thioxo-4-thiazolidinone and 3-methyl-2-thioxo-4-thiazolidinone.
  • a thiol compound may be used in combination with the labeling agent described above.
  • the thiol compound used in that case is not particularly limited as long as it is a compound having a thiol group.
  • DTT dithiothreitol
  • 2-aminoethanethiol 2-aminoethanethiol
  • thiocholine 2- (pyridin-4-yl)
  • Ethanethiol and the like.
  • both cases may be labeled and can be appropriately selected according to the purpose.
  • DP 1,3-dimethyl-pyrazolone
  • DTT dithiothreitol
  • the post-translational modification group is a sugar chain, it is labeled when DP is added, but is not labeled when DTT is added, and when both DP and DTT are added, only the DP label is added. Detected. On the protein or peptide side, a DTT label was detected when DTT was added, and a DP label was detected when DP was added. It is empirically known that when DTT and DP are used in combination, only the DTT label reacts with the peptide, and DP does not react with the protein or peptide.
  • the state of the reaction solution when cleaving the post-translational modification group from the glycoprotein and / or glycopeptide of the test substance in the present invention is not particularly limited, but it may be dissolved in a solvent and dispersed. It may be in a state of letting it go.
  • a method in which the glycoprotein and / or glycopeptide and the labeling agent are dissolved in water is advantageous because the reaction can be efficiently advanced. Further, the reaction solution may be stirred in order to further advance the reaction efficiently.
  • the post-translational modification group is cleaved from the serine residue or threonine residue of the test substance thus obtained and labeled from the post-translational modification group or the serine residue or threonine residue of the test substance.
  • Either the post-translational modification group is cleaved, and either or both of the labeled test substances can be analyzed using liquid chromatography or high performance liquid chromatography.
  • an appropriate method can be used depending on the type of target molecule.
  • mass spectrometry MS
  • nuclear magnetic resonance NMR
  • UV ultraviolet absorptiometer
  • ELS evaporative light scattering detector
  • electrochemical detector electrochemical detector
  • the analysis may be performed by any one of these methods, or two or more methods may be combined and analyzed.
  • post-translational modification of a glycoprotein and / or glycopeptide of a test substance can be analyzed with high sensitivity and quantitative analysis, and post-translational modification of serine and threonine is comprehensively analyzed. Will be able to.
  • Example 1 A glycopeptide having an O-GalNAc type sugar chain was synthesized according to a report. An aqueous solution of glycopeptide (4 ⁇ g / mL, 5 ⁇ L) in 45 ⁇ L of water, 50 ⁇ L of 0.6 M NaOH, 100 ⁇ L of 0.5 M 3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone (PMP) in methanol or 0.5 M 1 Then, an aqueous solution of 3-dimethyl 5-pyrazolone (DP) or a methanol solution of 0.5 M 3-methyl-1-p-tolyl-5-pyrazolone (MTP) was added, and the mixture was allowed to stand at 70 ° C. for 16 hours.
  • PMP 3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone
  • MTP 3-methyl-1-p-tolyl-5-pyrazolone
  • glycopeptide 4 ⁇ g / mL, 5 ⁇ L
  • 12 ⁇ L of water and 3.4 ⁇ L of ⁇ -elimination reagent mix (Sigma) were added and allowed to stand at 4 ° C. or room temperature for 24 hours (B, C).
  • 18 ⁇ L of dimethylamine was added to an aqueous solution of glycopeptide (4 ⁇ g / mL, 5 ⁇ L) and allowed to stand at 50 ° C. or 70 ° C. for 16 hours (D, E).
  • glycopeptide 4 ⁇ g / mL, 5 ⁇ L
  • 50 ⁇ L of 0.6 M NaOH 50 ⁇ L of 0.6 M NaOH
  • 100 ⁇ L of 0.5 M 3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone (PMP) in methanol 50 ° C. (F).
  • PMP 3-methyl-1-phenyl-5-pyrazolone
  • the sugar chain part was purified by Dowex50x8 and ZipTipC18, respectively, and analyzed by MALDI-TOF (/ TOF) (UltraFlex II, Bruker) using 2,5-dihydrobenzoic acid (10 mg / mL) as a matrix. went. F was analyzed for sugar chains by the method described in Experimental Details 1. The result of the obtained mass spectrum is shown in FIG. In either case, the signal of the glycopeptide as a raw material was remarkably lowered, and the signal of the peptide and sugar chain labeled with the newly added pyrazolone derivative appeared. The expected reaction is shown in FIG.
  • Example 2 The sugar chain profiles obtained when sugar chains were released from glycopeptides having O-GalNAc type sugar chains were compared by various existing methods.
  • the obtained mass spectrum results are shown in FIG.
  • the glycopeptide used has mainly a trisaccharide structure called sialyl T (Neu5Ac ⁇ 2-3Gal ⁇ 1-3GalNAc) and is known to contain a small amount of a disaccharide structure called T antigen (Gal ⁇ 1-3GalNAc).
  • FIG. 3A shows a sugar chain profile obtained by the Carlson method in which the reducing end of a sugar chain is reduced to a sugar alcohol simultaneously with ⁇ elimination in the presence of a reducing agent (NaBH4) in order to prevent decomposition of the sugar chain.
  • NaBH4 reducing agent
  • Example 3 The TOF / TOF spectra of the peptides labeled with DP, PMP and MTP obtained in Example 1 are shown in FIGS. 4, 5, and 6, respectively. In either case, peptide sequence information and sugar chain modification position information were given in a good manner. From this result, it was shown that by adding a pyrazolone derivative to the ⁇ elimination reaction, both structure and sequence information can be obtained well for both sugar chains and peptides.
  • Example 4 A pyrazolone derivative (DP) and dithiothreitol (DTT) were added to a glycopeptide having an O-GalNAc type sugar chain under basic conditions and heated at 70 ° C. for 16 hours. Specifically, 5 ⁇ L of 0.6 M NaOH was added to an aqueous solution (4 ⁇ g / mL, 5 ⁇ L) of a glycopeptide having an O-GalNAc type sugar chain. Furthermore, 10 ⁇ L of 0.5 M DTT or 10 ⁇ L of 0.5 M DP or 5 ⁇ L of 0.5 M DTT + 5 ⁇ L of 0.5 MDP was added and allowed to stand at 70 ° C. for 16 hours.
  • DP pyrazolone derivative
  • DTT dithiothreitol
  • each reaction solution was diluted, mixed with DHB, and analyzed by MALDI-TOF (/ TOF) (UltraFlex II, Bruker).
  • MALDI-TOF UltraFlex II, Bruker
  • the result of the mass spectrum at that time is shown in FIG.
  • the sugar chain was labeled only when DP was added (FIG. 7, upper left figure), but was not labeled when DTT was added (FIG. 7, middle left figure).
  • both DP and DTT were added, only the DP label was detected (FIG. 7, lower left figure, FIG. 8).
  • the peptide was detected as a DTT derivative when DTT was added and as a DP derivative when DP was added (upper right figure and middle figure in FIG. 7).
  • Example 5 Profiling of O-linked glycans was performed on bovine fetuin, porcine stomach mucin and human IgA, which are known to have O-linked glycans, using the technique described in the present invention. The results are shown in FIG. 50 ⁇ g of bovine fetuin, porcine gastric mucin or human IgA was added, 50 ⁇ L of water, 100 ⁇ L of 0.5 M DP solution and 50 ⁇ L of 0.6 M NaOH were added, and the mixture was allowed to stand at 70 ° C. for 16 hours.
  • FIG. 10 is a mass spectrum obtained when the technique of the present invention is applied to two types of peptides each having phosphorylation modification and O-GlcNAc type sugar chain modification (FIG. 10).
  • phosphorylated glycopeptide FQpSEEEQQQTEDELQDK
  • bovine ⁇ -casein was purchased from ANASPEC.
  • O-GlcNAc-ized peptide TAPT (O-GlcNAc) STIAPG
  • 10 ⁇ L of 0.5 M PMP and 5 ⁇ L of 0.6 M NaOH were added to 50 ⁇ g (5 ⁇ L) of the phosphorylated glycopeptide and allowed to stand at 70 ° C. for 16 hours.
  • Example 7 5 ⁇ L of 0.6 M NaOH was added to an aqueous solution of a glycopeptide having an O-GalNAc type sugar chain (4 ⁇ g / mL, 5 ⁇ L). Furthermore, 10 ⁇ L of 0.5 M DTT or 10 ⁇ L of 0.5 M DP or 5 ⁇ L of 0.5 M DTT + 5 ⁇ L of 0.5 MDP was added and allowed to stand at 70 ° C. for 16 hours. After the reaction, each reaction solution was diluted, mixed with DHB, and analyzed by MALDI-TOF (/ TOF) (UltraFlex II, Bruker).
  • FIG. 12 is a mass spectrum when a pyrazolone derivative (DP) and dithiothreitol (DTT) are added to a glycopeptide having an O-GlcNAc type sugar chain under basic conditions and heated at 70 ° C. for 16 hours.
  • the sugar chain was labeled only when DP was added, but not when DTT was added.
  • both DP and DTT were added, only DP label was detected.
  • the peptide was detected as a DTT derivative when DTT was added and as a DP derivative when DP was added (FIG. 11, upper and middle stages).
  • Example 8 50 ⁇ g each of bovine fetuin or porcine submandibular gland mucin was added, 50 ⁇ L of water, 100 ⁇ L of 0.5 M DP solution, 50 ⁇ L of 0.6 M NaOH were added, and the mixture was allowed to stand at 70 ° C. for 16 hours. After the reaction, the reaction mixture was neutralized, and a 1 ⁇ 4 volume (50 ⁇ L) of the reaction solution was purified by Dowex 50 ⁇ 8 and ZipTipC18, and the sugar chain portion was purified once and then dissolved in DHB. Analysis). The results are shown in FIG.
  • FIG. 13 shows the results of profiling of O-linked sugar chains using this method for bovine fetuin and porcine submandibular mucin that are known to have O-linked sugar chains. In both cases, the results were qualitatively and quantitatively equivalent to those reported in the literature, indicating that this method is useful for the analysis of O-linked glycans of glycoproteins. It was. Bovine fetuin is known to have both O-linked sugar chains and N-linked sugar chains. In this method, only O-linked sugar chains are detected, and N-linked sugar chains are detected. No strands were detected. From this result, it was shown that this method does not act on N-linked sugar chains but acts on O-linked sugar chains with high selectivity.
  • FIG. 14 is a mass spectrum of a sugar chain labeled with a novel pyrazolone reagent.
  • a reagent having a pyrazolone skeleton was used, it was confirmed that it was derivatized mono or bis.
  • FIG. 15, FIG. 16 and FIG. 17 are synthesis schemes of novel pyrazolone reagents.
  • 3-Hydrazinobenzoylarginine methyl ester (29 mg, 0.09 mmol) was dissolved in 1 mL of ethanol, 1 M ethyl acetoacetate in ethanol (80 ⁇ L, 0.08 mmol) and 200 ⁇ L of acetic acid were added and reacted at 65 ° C. for 30 minutes.
  • the reaction solution was concentrated and separated by silica gel column chromatography (chloroform: methanol, 9: 1 ⁇ 5: 1) to obtain 3-arginine-added pyrazolone (21.7 mg, 70%) as the final target product.
  • the target [M + H] + ion was observed at m / z: 389.2.
  • Boc-4-hydrazinobenzoic acid (252 mg, 1.00 mmol) was dissolved in 10 mL of methanol and 4- (4,6-dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl) -4-methylmorpholinium chloride was dissolved. (295 mg, 1.00 mmol) was added (solution 1).
  • Solution 2) Methylarginine dihydrochloride (261 mg, 1.00 mmol) was dissolved in 2 mL of water, and a solution containing triethylamine (100 ⁇ L, 1.00 mmol) was added to Solution 1 and reacted at room temperature for 2 hours.
  • reaction solution was concentrated, separated by silica gel column chromatography (chloroform: methanol, 9: 1 ⁇ 5: 1), and the target N- (Boc-4-hydrazinobenzoyl) -biotin hydrazide (2) (120 mg, 63%).
  • target [M + Na] + ion was observed at m / z: 515.4.
  • N- (4-hydrazinobenzoyl) -biotin hydrazide (3) (39 mg, 0.1 mmol) was dissolved in 1 mL of ethanol, 1 M ethyl acetoacetate in ethanol (90 ⁇ L, 0.09 mmol) and 200 ⁇ L of acetic acid were added at 65 ° C. Reacted for 30 minutes.
  • the reaction mixture was concentrated and separated by silica gel column chromatography (chloroform: methanol, 9: 1 ⁇ 5: 1) to obtain the final target product, biotin-added pyrazolone (4) (38 mg, 92%).
  • the target [M + H] + ion was observed at m / z: 459.4.
  • the present invention is an extremely effective method for analyzing O-linked sugar chains, for which development of methodologies has long been desired. Moreover, a new option will be brought about with respect to the BEMA method which has been conventionally used for the analysis of phosphate modification.
  • the present invention enables comprehensive analysis of post-translational modifications of serine and threonine, and is expected to make a great contribution to the fields of biochemistry, biology, pharmacy, drug discovery, medicine, and the like.

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Abstract

　被検物質である糖タンパク質及び／又は糖ペプチドをピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体等と共に塩基性溶液条件下で加熱し、翻訳後修飾基を切断、並びに標識して分析することにより、セリン残基及び／又はスレオニン残基の翻訳後修飾を解析することが可能になる。

Description

セリン、スレオニンの翻訳後修飾解析用標識剤
　本発明は、生化学、生物学、薬学、創薬、医学等の分野において有用なセリンやスレオニンへの翻訳後修飾基の新規な解析方法に関するものである。特に、本発明は、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリンやスレオニンから翻訳後修飾されたＯ－リン酸基、Ｏ－硫酸基、Ｏ－グリカン等を選択的に切断し、標識させる標識剤に関するものである。
　生体内のタンパク質がさまざまな生理活性を示すのは、遺伝子によって翻訳されたタンパク質がリン酸化、硫酸化、或いは糖鎖修飾等の多様な翻訳後修飾がなされた結果と考えられている。その中でリン酸化、硫酸化は一般的な翻訳後修飾であり、多くのタンパク質にとって、この修飾により生物学的活性や機能を持つようになる。その中でグリコシル化は最近、注目を浴び始めている領域であり、修飾された類鎖はさまざまな機能をタンパク質へ付与させる。例えば、いくつかのタンパク質は最初にグリコシル化されない限り正確に折りたたまれない。また、オリゴ糖がアスパラギンに結合されることによってタンパク質に安定性を与え、糖タンパク質の体内動態を制御する例が知られている。さらに、グリコシル化は細胞間の接着のような役割も担うとされている。タンパク質を修飾する糖鎖はＮ－グリカン、Ｏ－グリカン、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の３つに大別される。また、その糖鎖を構成する単糖の種類は高等生物の場合、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｃ）、ガラクトース（Ｇａｌ）、キシロース（Ｘｙｌ）、グルクロン酸（ＧｌｃＡ）、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、フコース（Ｆｕｃ）、シアル酸（ＳＡ）とされている。Ｎ－グリカンは、－アスパラギン－Ｘ－スレオニン、或いは－アスパラギン－Ｘ－セリン（Ｘはプロリン（Ｐｒｏ）以外のアミノ酸残基）の配列を持つペプチドのアスパラギン（Ａｓｎ）にＮ－結合型で糖鎖が転移されたものである。Ｏ－グリカンはスレオニン（Ｔｈｒ）やセリン（Ｓｅｒ）残基に、Ｏ－結合で最初の糖が転移されたものである。Ｏ－グリカンの最初の糖はＮ－アセチルガラクトサミンの場合が多いが、他にもマンノース、フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン等がある。しばしば最初の糖の後に次から次へと糖が転移され、Ｏ－グリカン糖鎖が伸長していく。プロテオグリカンはタンパク質に多本数の極めて長い糖鎖が付加された形をとる。そのアミノ糖（Ｎ－アセチルグルコサミンやＮ－アセチルガラクトサミン）を持つ糖鎖部分をグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）という。グリコサミノグリカンの特徴は２糖が１単位となって、その繰り返し構造により極めて長い糖鎖になっている点が挙げられる。
　その中で、セリンとスレオニンはリン酸化や硫酸化、糖鎖修飾（Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ型、Ｏ－Ｆｕｃ型、Ｏ－Ｍａｎ型、Ｏ－Ｘｙｌ型、Ｏ－Ｇａｌ型、Ｏ－Ｇｌｃ型）等の多様な翻訳後修飾を受けるアミノ酸残基であり、これらの翻訳後修飾がシグナル伝達や分化制御などのさまざまな生命の高次機能調節において重要な役割を担っている。例えば、特定のタンパク質のリン酸化を担うキナーゼの阻害剤は既に医薬品として上市されており、また、Ｏ－結合型糖鎖の定性、定量的な変動が種々の疾患の診断に応用されている。セリンとスレオニンの翻訳後修飾のうち、Ｏ－リン酸化、Ｏ－硫酸化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化は、それぞれリン酸基、硫酸基、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ基が単独に結合したものであるが、一般に、Ｏ－ＧａｌＮＡｃ化、Ｏ－Ｆｕｃ化、Ｏ－Ｍａｎ化、Ｏ－Ｘｙｌ化等のＯ－結合型糖鎖修飾は、さらに伸長して多様な構造をとることが知られている。
　ここで、リン酸化セリンおよびリン酸化スレオニンのリン酸化結合部位の切断、標識方法の一つとして、β脱離・マイケル付加（ＢＥＭＡ）法が挙げられる。塩基性条件下に、リン酸基がβ脱離し、不飽和カルボニルが生成され、これがマイケル反応受容体となることを応用したものである（特許文献１、２、非特許文献１参照）。例えば、ジチオトレイトールのようなチオール基を有する化合物を作用させることで、リン酸化部位を標識させられ、ペプチドの精製やオンビーズ、オンチップ上の蛍光標識化等に利用されている（特許文献３参照）。ＢＥＭＡ法はタンパク質のリン酸化に関わる研究に貢献し、広く使われる手法となっているが、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化を含めた他のセリン、スレオニンの翻訳後修飾基もＢＥＭＡで切断されるため、どの修飾基がどのような状態で存在していたのかを区分することができない問題があった。また、ＢＥＭＡにおけるマイケル供与体としては、チオール基を有する化合物が一般的であり、他のマイケル供与体の応用例はほとんどなく応用範囲が狭いものであった。また、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化を受けるタンパク質の解析法として、２位にアジド基を有する非天然型のＧｌｃＮＡｃ誘導体によりメタボリックラベルする方法が報告されている（非特許文献２）。さらに、Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型（ムチン型）の糖鎖部分の多様な構造を解析する場合、タンパク質から糖鎖を切り出す有効な酵素が発見されていないため、糖鎖を切り出すためには、強アルカリ下のβ脱離が広く用いられる。この場合、遊離した糖鎖も還元末端側から順次β脱離を受け分解（ピーリング反応）を起こし得るため、高濃度の還元剤を加えて、β脱離と同時に還元末端を糖アルコールに還元する。この方法は１９６８年にＣａｒｌｓｏｎによって報告されたものであり、今もＯ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖の遊離の標準的な方法となっている（非特許文献３）。しかしながら、本法には（１）還元剤存在下のβ脱離はペプチド部分の分解を引き起こすため、タンパク質部分の解析を行うことが困難であること、（２）還元により糖鎖の還元末端が失われるため、糖鎖の分離や高感度分析のための誘導体化が困難であること等の問題点があった。従って、以前よりＯ－結合型糖鎖を分解せずに高収率でペプチドやタンパク質から遊離して、分離、高感度化のために誘導体化する方法論の開発が強く求められていた。
特表２００７－５１５６２５号公報 米国特許第７８０３７５１号 特開２００９－１９００２号公報 米国特許公開公報２００６－００９９６０４　Ａ１ 米国特許公開公報２００５－０１７６０９３　Ａ１ 米国特許公開公報２００５－００９５７２５　Ａ１ 米国特許公開公報２００５－００１４１９７　Ａ１ 米国特許公開公報２００４－００３８３０６　Ａ１ 米国特許公開公報２００３－０２１９８３８　Ａ１
Nature Biotechnology、19(4), 379-382（2001） Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America, 100(16), 9116-9121（2003） J. Biol. Chem.，243， 616-626（1968）
　タンパク質の構造解析技術が進歩し、種々の翻訳後修飾基を分析する機会が増えているが、従来技術では、セリンやスレオニンへ翻訳後修飾されたＯ－リン酸基のみが上述したＢＥＭＡ法によって解析されてきた。その他のＯ－硫酸基、Ｏ－グリカン等の翻訳後修飾の解析は、このＢＥＭＡ法でそれぞれを切断することができても、その後の標識化ができず、例えば、Ｏ－グリカンがどの位置のアミノ酸残基に結合していたのか、さらにはそのＯ－グリカンの構造を解析することはできなかった。本発明の目的は、このような課題を解決するためものであり、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基やスレオニン残基へ翻訳後修飾されたＯ－リン酸基、Ｏ－硫酸基、Ｏ－グリカン等を共通に標識できる標識剤を利用してこれらの翻訳後修飾を選択的に切断し、効率良く解析する方法を提供することにある。更に、本発明の目的は、修飾の種類とペプチド上の修飾位置に関する情報が得られる方法を提供すること、翻訳後修飾部位を化学的に修飾すると同時に、遊離した糖鎖もピーリング反応を起こさずに、分離や検出に有利な任意の誘導体として回収する方法を提供すること、及びＢＥＭＡ法によるペプチド部分の標識のために新たな化合物群を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために、種々の角度から検討を加えて研究開発を行ってきた。その結果、塩基性条件下でセリンやスレオニンへ翻訳後修飾されたＯ－リン酸基、Ｏ－硫酸基、Ｏ－グリカン等に対し特定の標識剤を加えて加熱することで、翻訳後修飾基が選択的に切断され、切断された翻訳後修飾基を効率良く標識できることを見出した。本発明はかかる知見に基づいて完成されたものである。本発明は、簡便性、選択性において従来法を上回る分析法であり、種々の翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基から、翻訳後修飾基を選択的に当該アミノ酸残基より切断し、解析を行うことができるようになる。さらに本発明では、切断元である糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの解析を行うこともできるようになる。
　すなわち、本発明は、塩基性条件下で、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を選択的に切断し、セリン残基、スレオニン残基、および当該アミノ酸残基より選択的に切断された翻訳後修飾基のうち少なくとも１つを標識する標識剤を提供するものである。また、本発明は、被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと標識剤を溶媒中に溶解、若しくは分散させ、塩基性条件下で加熱することで、被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を選択的に切断する、翻訳後修飾基切断方法を提供するものである。さらに、本発明は、その翻訳後修飾基切断方法を利用して、糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基の翻訳後修飾基を解析する方法を提供するものである。本発明は、従来技術では困難であった、セリンやスレオニンへ翻訳後修飾されたＯ－リン酸基、Ｏ－硫酸基、Ｏ－グリカン等を総合的に解析することを可能とする世界に類のない新規な発想による極めて重要な発明と考えている。
　本発明の方法によれば、簡単な操作、穏和な条件で、有害な試薬を用いずに糖タンパク質からＯ－リン酸基、Ｏ－硫酸基、Ｏ－グリカン等を遊離するのと同時に、遊離した糖鎖およびペプチドの両者をそれぞれ同じ、または別々の試薬で標識することができるようになる。このような標識により、その後の分離の容易さ及び／又は検出における高感度化等に寄与するため、標識された糖鎖およびペプチドを容易に精製することができるようになる。また標識された糖鎖およびペプチドを液体クロマトグラフィーや質量分析装置により、高感度に構造解析、定量分析を行うことが可能になり、セリンとスレオニンの翻訳後修飾を総合的に解析することができるようになる。
実施例１において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを、塩基性条件下にＰＭＰ, ＤＰ，ＭＴＰとそれぞれ加熱したときに得られるＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルの結果を示す図である。 実施例１において、想定される反応経路を示す図である。 実施例２において、Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドから種々の条件下で切り出したＯ－結合型糖鎖のプロファイルを示す図である。Ａ：還元的β脱離（Ｃａｒｌｓｏｎ法）、Ｂ：β－Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ），４℃、２４時間、Ｃ：β－Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ），室温、２４時間、Ｄ：ジメチルアミン、５０℃、１６時間、Ｅ：ジメチルアミン、７０℃、１６時間、Ｆ：塩基性条件下ＰＭＰ、７０℃、１６時間 実施例３において、実施例１で得られたＤＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを示す図である。 実施例３において、実施例１で得られたＰＭＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを示す図である。 実施例３において、実施例１で得られたＭＴＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルを示す図である。 実施例４において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを塩基性条件下でＤＴＴ、ＤＰ、ＤＴＴ／ＤＰと共に加熱したときの生成物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルを示す図である。 実施例４において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを塩基性条件下でＤＴＴ／ＤＰと共に加熱したときの想定される反応経路を示す図である。 実施例５において、ウシフェチュイン、ブタ胃ムチンを塩基性条件下にＤＰと加熱したときに得られるＯ－結合型糖鎖プロファイルを示す図である。図中の○印はガラクトースを意味し、薄い色の□印はＮ－アセチルガラクトサミンを意味し、濃い色の□印(黒塗りの□印)はＮ－アセチルグルコサミンを意味し、△印はフコースを意味し、◇印はＮ－アセチルノイラミン酸を意味する。 実施例６において、リン酸化モデルペプチド（左図）およびＯ－ＧｌｃＮＡｃ化モデルペプチド（右図）を塩基性条件下にそれぞれＰＭＰ，ＤＰと加熱したときの生成物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルを示す図である（上図が原料、下図が生成物をそれぞれ示す。）。 実施例７において、Ｏ-ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有するモデル糖ペプチドを塩基性条件下にＤＴＴ，ＤＰ、ＤＴＴとＤＰとそれぞれ加熱したときの反応成績物のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦスペクトルを示す図である。 実施例７において、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下にピラゾロン誘導体（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、70℃で１６時間加熱したときのマススペクトルを示す図である。 ウシフェチュイン、ブタ顎下腺ムチンを塩基性条件下にＤＰと加熱したときに得られるＯ－結合型糖鎖プロファイルを示す図である。図中の○印はガラクトースを意味し、薄い色の□印はＮ－アセチルガラクトサミンを意味し、濃い色の□印(黒塗りの□印)はＮ－アセチルグルコサミンを意味し、△印はフコースを意味し、◇印はＮ－アセチルノイラミン酸を意味する。 新規ピラゾロン試薬による糖鎖標識後のＭＡＬDI－ＴＯＦスペクトルを示す図である（上段が化合物５、中段が化合物１０、下段が化合物１４で標識）。 アルギニン付加ピラゾロン試薬の合成経路を示す反応スキームである。 アルギニン付加ピラゾロン試薬の合成経路を示す他の反応スキームである。 ビオチン付加ピラゾロン試薬の合成経路を示す反応スキームである。
　本発明は、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの中で、セリン残基及び／又はスレオニン残基が係わる翻訳後修飾の解析を実施するための技術に関するものである。その対象となる糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの由来は全く限定されるものではなく、例えば、ヒト、ラット、マウス、モルモット、マーモセット、ウサギ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、チンパンジーあるいはそれらの免疫不全動物等の動物、或いは植物が挙げられるが、本発明の成果をヒトの治療に用いる場合はヒト、ブタ、チンパンジー由来の細胞を用いる方が望ましい。上述のように、本発明は、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの中のアミノ酸として水酸基有するセリン残基及び／又はスレオニン残基へ修飾された翻訳後修飾基を解析するための手段を提供するものである。そのような翻訳後修飾基も特に限定されるものではないが、例えば、アミノ酸側のＯ原子を介して、リン酸基、硫酸基、グリカン等が挙げられるが、本発明ではそれらのいずれか１種でも良く、２種以上のものでも良い。特に、アミノ酸側のＯ原子を介して結合したグリカン（以後、アミノ酸側のＯ原子を介して結合したグリカンをＯ－グリカンと呼ぶときがある。同様に、アミノ酸側のＯ原子を介して結合したリン酸基、硫酸基をそれぞれＯ－リン酸基、Ｏ－硫酸基と呼ぶことがある。）としては、Ｏ原子と結合する糖として、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、キシロース、グルコースのいずれかから始まるものや、さらにＯ原子と結合する糖として、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、キシロース、グルコースのいずれかから始まり、さらに糖が結合して伸長したものでも良い。
　本発明では、こうしたセリン残基及び／又はスレオニン残基に対して修飾された翻訳後修飾基をセリン残基及び／又はスレオニン残基から切断することが必要である。その切断反応は常法に従ってβ脱離反応を行えば良く、その条件は特に限定されるものではないが、例えば、翻訳後修飾された糖タンパク質及び／又は糖ペプチド溶媒中に溶解、若しくは分散させ、塩基性条件下で加熱する方法が挙げられる。β脱離条件として、たとえば１０ｍＭ～１Ｍの水酸化リチウムまたは水酸化ナトリウムまたは水酸化バリウム中で、４℃～６０℃程度で１０分～２４時間程度静置する。
　本発明は、このセリン、スレオニンの翻訳後修飾をβ脱離で遊離する際に生成した二重結合に対してマイケル付加により標識する。本マイケル付加は一般に、ワンポットで行われ、β脱離時にたとえば２０ｍＭ～１Ｍ程度のピラゾロン誘導体等のマイケル付加反応供与体を添加することで行われる。また、遊離した翻訳後修飾基側も標識させることができるものである。本発明とは、セリン残基及び／又はスレオニン残基側だけを標識しても良く、両者を標識することでも良く、さらに、セリン残基及び／又はスレオニン残基側と翻訳後修飾基側とを異なった試薬で標識することでも良い。そのようなマイケル付加反応の際に用いる試薬は特に限定されるものではないが、例えば、チオール化合物、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体等が挙げられ、本発明ではそれらのいずれか１種でも良く、２種以上のものを併用しても良い。その中でピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体等についてはマイケル付加反応と同時に標識化できるため本発明として好都合である。本発明の標識剤とは、こうした試薬を含む製剤を意味している。本発明では、さらにピラゾロン誘導体が本発明の標識剤として有用で、これらはピラゾロン基を有した化合物であれば特に限定されないが、例えば、３－メチル－１－フェニル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）、１，３－ジメチル－ピラゾロン（ＤＰ）、３－メチル－１－ｐ－トリル－５－ピラゾロン（ＭＴＰ）、３-メチル－１－（キノリン－８－イル）－１Ｈ－ピラゾール－５（４Ｈ）－オン等が挙げられる。イソキサゾロン誘導体としては、例えば３（２Ｈ）－イソキサゾロン、５－メチル－３（２Ｈ）－イソキサゾロン、２，５－ジメチル３（２Ｈ）－イソキサゾロン等が挙げられる。ヒダントイン誘導体としては、例えば２，４－イミダゾリジンジオン、３－メチル－２，４－イミダゾリジンジオン、３－（２－プロピン－１－イル）－２，４－イミダゾリジンジオン等があげられる。ローダニン誘導体としては、２－チオキソ－４－チアゾリジノン、３－メチル－２－チオキソ－４－チアゾリジノン等があげられる。
　本発明では、上述した標識剤と共にチオール化合物を併用することでも良い。その際に用いられるチオール化合物はチオール基を有した化合物であれば特に限定されるものでないが、例えば、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２－アミノエタンチオール、チオコリン、２－（ピリジン－４－イル）エタンチオール等が挙げられる。その組み合わせによって、上述したようにセリン残基及び／又はスレオニン残基側だけを標識する場合、両者を標識する場合が起こり、目的に合わせて適宜選択できる。このことを、標識剤として上述した１，３－ジメチル－ピラゾロン（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を例に取り具体的に説明する。翻訳後修飾基を糖鎖としたとき、ＤＰを加えたときに標識されるが、ＤＴＴを加えた場合には標識されず、ＤＰとＤＴＴの両者を加えた場合には、ＤＰ標識体のみが検出される。また、タンパク質、或いはペプチド側は、ＤＴＴを添加したときにＤＴＴ標識体が検出され、ＤＰを添加したときにはＤＰ標識体として検出された。ＤＴＴとＤＰを併用した場合には、ＤＴＴ標識体のみがペプチドと反応し、ＤＰはタンパク質、或いはペプチドに反応しないことが経験的に分かっている。
　本発明における被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドからの翻訳後修飾基を切断する際の反応液の状態は特に限定されるものではないが、溶媒中に溶解させた状態でも良く、分散させた状態でも良い。本発明では、糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと標識剤を水中で溶解させた条件下で行う方法が反応を効率良く進められ好都合である。また、さらに反応を効率良く進めるために反応液を撹拌しても良い。
　本発明では、こうして得られた被検物質のセリン残基やスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた当該翻訳後修飾基、或いは被検物質のセリン残基やスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた被検物質のいずれか、若しくは両者を液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーを用いて分析することができる。さらには、目的分子の種類に応じて適宜の方法を使用することができるが、例えば、質量分析（MS）や核磁気共鳴（NMR）を用いることができそれら以外にも、紫外吸光光度計（UV）、エバポレイテイブ光散乱検出器（ELS）、電気化学検出器等を用いることができる。本発明においてはそれらのいずれかの方法で分析しても良く、２つ以上の方法を組み合わせて分析しても良い。
　本発明により、被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドの翻訳後修飾を高感度に構造解析、定量分析を行うことが可能になり、セリンとスレオニンの翻訳後修飾を総合的に解析することができるようになる。
　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。
［実施例１］
(実験詳細１)
　Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドは既報に従い合成した。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に４５μＬの水、５０μＬの０．６Ｍ ＮａＯＨ、１００μＬの０．５Ｍ　３－メチル－１－フェニル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液または０．５Ｍ　１、３－ジメチル５－ピラゾロン（ＤＰ）の水溶液または０．５Ｍ　３－メチル－１－ｐ－トリル－５－ピラゾロン（ＭＴＰ）のメタノール溶液を加え、７０℃で１６時間静置した。反応後、０．３Ｍ塩酸で中和し、反応液を直接２、５－ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ/ｍＬ）と混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。
(実験詳細２)
　次に、そのＯ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下に３種類の異なるピラゾロン誘導体を加え、７０℃で１６時間加熱、分解した。具体的には、Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に１０μＬの１Ｍ　ＮａＢＨ４（１００ｍＭ　ＮａＯＨ溶液）、水５μＬを添加し、５０℃で１５時間静置した（Ａ）。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に１２μＬの水および３．４μＬのβ―エリミネーションリエージェントミックス（シグマ社）を加え、４℃または室温で２４時間静置した（Ｂ、Ｃ）。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に１８μＬのジメチルアミンを加え、５０℃または７０℃で１６時間静置した（Ｄ、Ｅ）。糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に４５μＬの水、５０μＬの０．６Ｍ ＮａＯＨ、１００μＬの０．５Ｍ　３－メチル－１－フェニル－５－ピラゾロン（ＰＭＰ）のメタノール溶液を加え、７０℃で１６時間静置した（Ｆ）。それぞれ反応後に中和し、Ａは１％酢酸メタノール溶液を加え繰り返し乾固した。Ａ－Ｅは、それぞれＤｏｗｅｘ５０ｘ８およびＺｉｐＴｉｐＣ１８により糖鎖部分を精製し、２、５－ジヒロド安息香酸（１０ｍｇ/ｍＬ）をマトリクスとして、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。Ｆは実験詳細１に記載の方法で糖鎖の分析を行った。得られたマススペクトルの結果を図１に示す。いずれも原料である糖ペプチドのシグナルが著しく低下し、新たに添加したピラゾロン誘導体によって標識されたペプチドおよび糖鎖のシグナルが出現した。想定される反応を図２に示した。
［実施例２］
　既存の様々な方法により、Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドから糖鎖を遊離したときに得られる糖鎖のプロファイルを比較した。得られたマススペクトルの結果を図３に示す。用いた糖ペプチドはシアリルＴと呼ばれる３糖構造（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）を主に持ち、微量のＴ抗原（Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）と呼ばれる２糖構造を含むことが分かっている。糖鎖の分解を防ぐために、還元剤（ＮａＢＨ４）存在下にβ脱離と同時に糖鎖の還元末端を糖アルコールに還元するＣａｒｌｓｏｎ法で得られた糖鎖プロファイルを図３Ａに示す。シアリルＴとＴ抗原のピークが認められ、分解物に相当するピークは微量しか存在しない。シグマ社から市販されているβエリミネーションキットを用い、推奨されている２種類の条件で糖鎖を遊離したときの結果を図３Ｂ，Ｃに示した。また、ジメチルアミンを用いる方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１０，８２，２４２１－２４２５）も２種類の条件で行った（図３Ｄ，Ｅ）。いずれの場合も、ピーリング反応により生じた分解物が非常に大きな割合を占め、還元を施さない場合は著しく糖鎖プロファイルが損なわれる結果が得られた。還元を施さない場合には、糖鎖プロファイルが損なわれる傾向にあることは、最近のヒトプロテオーム機構の論文においても指摘されている（Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、２０１０、９、７１９－７２７）。塩基性条件下にＰＭＰを加えた場合、シアリルＴがＰＭＰ標識体と微量のＴ抗原のＰＭＰ標識体のみが検出され、分解物のピークは全く検出されなかった（図３Ｆ）。
　これらの結果から、塩基性条件下にＯ－結合型糖鎖をβ脱離によって遊離しても、ピラゾロン誘導体が存在すれば、速やかに糖鎖と反応して安定な標識体を与え、分解産物をほとんど与えないことが示された。
［実施例３］
　実施例１で得られたＤＰ、ＰＭＰ、ＭＴＰによりそれぞれ標識されたペプチドのＴＯＦ／ＴＯＦスペクトルをそれぞれ図４、図５、図６に示した。いずれの場合も、良好にペプチド配列情報ならびに糖鎖の修飾位置情報を与えた。この結果から、β脱離反応にピラゾロン誘導体を添加することによって糖鎖、ペプチドともに構造、配列情報が良好に得られることが示された。
［実施例４］
　Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下にピラゾロン誘導体（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、70℃で１６時間加熱した。具体的には、Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に５μＬの０．６Ｍ　ＮａＯＨを添加した。さらに、１０μＬの０．５Ｍ　ＤＴＴまたは１０μＬの０．５Ｍ　ＤＰまたは５μＬの０．５Ｍ　ＤＴＴ＋５μＬの０．５ＭＤＰを加え、７０℃で１６時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。そのときのマススペクトルの結果を図７に示す。糖鎖はＤＰを加えたときのみ標識された（図７左上図）が、ＤＴＴを加えた場合には標識されなかった（図７左中図）。ＤＰとＤＴＴの両者を加えた場合には、ＤＰ標識体のみが検出された（図７左下図、図８）。ペプチドはＤＴＴを添加したときにはＤＴＴ誘導体が、ＤＰを添加したときにはＤＰ誘導体として検出された（図７右上図及び中図）。ＤＴＴとＤＰを添加した場合には、ＤＴＴのみがペプチドと反応したもののみが検出され、ＤＰが直接ペプチドに反応したものは検出されなかった（図７右下図、図８）。この結果から、糖鎖とペプチドはそれぞれ別々の試薬により選択的に標識することが可能であることが示された。
［実施例５］
　Ｏ－結合型糖鎖を持つことで知られるウシフェチュイン、ブタ胃ムチン及びヒトＩｇＡに対し本発明で示すところの技術を用いて、Ｏ－結合型糖鎖のプロファイリングを行った。結果を図９に示す。ウシフェチュインまたはブタ胃ムチンまたはヒトＩｇＡをそれぞれ５０μｇとり、５０μＬの水、１００μＬの０．５Ｍ　ＤＰ溶液、５０μＬの０．６Ｍ　ＮａＯＨを添加し、７０℃で１６時間静置した。反応後に中和し、反応液の１/４量（５０μＬ）をＤｏｗｅｘ５０ｘ８およびＺｉｐＴｉｐＣ１８により糖鎖部分を精製し、一旦乾固した後にＤＨＢに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。いずれの結果も過去に報告されている結果と定性、定量的に同等な結果であった。このことから、本発明が糖タンパク質のＯ－結合型糖鎖の解析に有用であることが示された。また、ウシフェチュインはＯ－結合型糖鎖とＮ－結合型糖鎖の両者を有することが知られているが、本法ではＯ－結合型糖鎖のみが検出され、Ｎ－結合型糖鎖は全く検出されなかった。この結果から、本発明技術はＮ－結合型糖鎖には作用せず、Ｏ－結合型糖鎖に高選択的に作用することが示された。
［実施例６］
　リン酸化修飾、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖修飾のそれぞれ有する２種類のペプチドに本発明技術を利用したときの結果のマススペクトルである（図１０）。　具体的にはウシβ－カゼインの由来のリン酸化糖ペプチド（ＦＱｐＳＥＥＱＱＱＴＥＤＥＬＱＤＫ）はＡＮＡＳＰＥＣ社から購入した。Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド（ＴＡＰＴ（Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ）ＳＴＩＡＰＧ）はＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ社から購入した。リン酸化糖ペプチド５０μｇ（５μＬ）に１０μＬの０．５Ｍ　ＰＭＰ、５μＬの０．６Ｍ　ＮａＯＨを加え、７０℃で１６時間静置した。Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ化ペプチド５．６μｇ（１０μＬ）に２０μＬの０．５Ｍ　ＤＰ、１０μＬの０．６Ｍ　ＮａＯＨを加え、７０℃で１６時間静置した。反応液を直接ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより解析した。その結果、いずれも原料の修飾ペプチドが反応後に著しく低下し、ペプチドはそれぞれ添加したピラゾロン誘導体に高収率で変換された。この結果から、本法がＯ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖同様に、セリンやスレオニンのリン酸化、Ｏ－ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖修飾に対しても同様に作用することが示された。
［実施例７］
　Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、５μＬ）に５μＬの０．６Ｍ　ＮａＯＨを添加した。さらに、１０μＬの０．５Ｍ　ＤＴＴまたは１０μＬの０．５Ｍ　ＤＰまたは５μＬの０．５Ｍ　ＤＴＴ＋５μＬの０．５ＭＤＰを加え、７０℃で１６時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。
　Ｏ－ＧａｌＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドの水溶液（４μｇ/ｍＬ、１０μＬ）に２０μＬの０．４５Ｍ　ＮａＯＨを添加した。さらに、２０μＬの０．５Ｍ　ＰＭＰまたは２０μＬの０．５Ｍ　ＤＴＴまたは１０μＬの１．０Ｍ　ＤＴＴ＋１０μＬの１．０ＭＤＰＰＭＰを加え、８５℃で１６時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。結果を図１１及び図１２に示す。
　図１２はＯ－ＧｌｃＮＡｃ型糖鎖を有する糖ペプチドに、塩基性条件下にピラゾロン誘導体（ＤＰ）とジチオトレイトール（ＤＴＴ）を加え、70℃で１６時間加熱したときのマススペクトルである。糖鎖はＤＰを加えたときのみ標識されたが、ＤＴＴを加えた場合には標識されなかった。ＤＰとＤＴＴの両者を加えた場合には、ＤＰ標識体のみが検出された。ペプチドはＤＴＴを添加したときにはＤＴＴ誘導体が、ＤＰを添加したときにはＤＰ誘導体として検出された（図１１、上段および中段）。ＤＴＴとＤＰを添加した場合には、ＤＴＴのみがペプチドと反応したもののみが検出され、ＤＰが直接ペプチドに反応したものは検出されなかった（図１１、下段）。この結果から、糖鎖とペプチドはそれぞれ別々の試薬により選択的に標識することが可能であることが示された。
［実施例８］
　ウシフェチュインまたはブタ顎下腺ムチンをそれぞれ５０μｇとり、５０μＬの水、１００μＬの０．５Ｍ　ＤＰ溶液、５０μＬの０．６Ｍ　ＮａＯＨを添加し、７０℃で１６時間静置した。反応後に中和し、反応液の１/４量（５０μＬ）をＤｏｗｅｘ５０ｘ８およびＺｉｐＴｉｐＣ１８により糖鎖部分を精製し、一旦乾固した後にＤＨＢに溶解し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。結果を図１３に示す。
　図１３は、Ｏ－結合型糖鎖を有することが知られているウシフェチュイン及びブタ顎下腺ムチンについて、本法を用いて、Ｏ－結合型糖鎖のプロファイリングを行った結果である。いずれも過去に文献等で報告されている結果と定性、定量的に同等な結果が得られたことから、本法が糖タンパク質のＯ－結合型糖鎖の解析に有用であることが示された。また、ウシフェチュインはＯ－結合型糖鎖とＮ－結合型糖鎖の両者を有することが知られているが、本法ではＯ－結合型糖鎖のみが検出され、Ｎ－結合型糖鎖は全く検出されなかった。この結果から、本法はＮ－結合型糖鎖には作用せず、Ｏ－結合型糖鎖に高選択的に作用することが示された。
［合成例］
　図１４は、新規ピラゾロン試薬により標識された糖鎖のマススペクトルである。ピラゾロン骨格を有する試薬を用いた場合、monoもしくはbis誘導体化される事が確認された。図１５、図１６および図１７は新規ピラゾロン試薬の合成スキームである。
（合成例１）
　１ｍＭのグルコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルラクトサミンおよびキトテトラオースの混合物１０μＬに２０μＬの０．４５Ｍ　ＮａＯＨを添加した。さらに、２０μＬの０．５Ｍ　合成ピラゾロン試薬（化合物５もしくは１０もしくは１４）を加え、８５℃で２時間静置した。反応後、反応液をそれぞれ希釈し、ＤＨＢと混合し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ（/ＴＯＦ）（ＵｌｔｒａＦｌｅｘ　ＩＩ、ブルカー社）により解析を行った。
（合成例２）
　３－ヒドラジノ安息香酸（５９２ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）をジメチルフォルムアミド１０ｍＬに溶解し、二炭酸ジ－ｔ－ブチル（８５４ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）加え室温で１６時間反応した。反応液を酢酸エチルで抽出し、１０ｍＭ塩酸および水で洗浄した。抽出液を濃縮し、目的物であるＢｏｃ－３－ヒドラジノ安息香酸（９８０ｍｇ、１００％）を得た。
　Ｂｏｃ－３－ヒドラジノ安息香酸（４９１ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍＬに溶解し、ＷＳＣ（５６０ｍｇ、２．９３ｍｍｏｌ）を加えた（溶液１）。溶液２）メチルアルギニン２塩酸塩（５０９ｍｇ、１．９５ｍｍｏｌ）を水２ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（３９５ｍｇ、３．９ｍｍｏｌ）を加えた溶液を溶液１に加え、室温で１６時間反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、目的物であるＢｏｃ－３－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（４０６ｍｇ、４９％）を得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：４２３．４に観測した。
　Ｂｏｃ－３－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（３８６ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸４ｍＬ加え、室温で１時間反応した後溶媒を濃縮し目的物である３－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステルを定量的に得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３２３．２に観測した。
　３－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（２９ｍｇ、０．０９ｍｍｏｌ）をエタノール１ｍＬに溶解し、１Ｍアセト酢酸エチルのエタノール溶液（８０μＬ、０．０８ｍｍｏｌ）さらに酢酸２００μＬ加え６５℃で３０分反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、最終目的物である３－アルギニン付加ピラゾロン（２１．７ｍｇ、７０％）を得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３８９．２に観測した。
（合成例３）
４－ヒドラジノ安息香酸（１．５２ｇ、１０ｍｍｏｌ）をジメチルフォルムアミド１０ｍＬに溶解し、二炭酸ジ－ｔ－ブチル（２．１８ｇ、１０ｍｍｏｌ）加え６５℃で１時間反応した。反応液を酢酸エチルで抽出し、１０ｍＭ塩酸および水で洗浄した。抽出液を濃縮し、目的物であるＢｏｃ－４－ヒドラジノ安息香酸を得た。
　Ｂｏｃ－４－ヒドラジノ安息香酸（２５２ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）をメタノール１０ｍＬに溶解し、４－(４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル)－４－メチルモルホリニウムクロリド（２９５ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を加えた（溶液１）。溶液２）メチルアルギニン２塩酸塩（２６１ｍｇ、１．００ｍｍｏｌ）を水２ｍＬに溶解し、トリエチルアミン（１００μＬ、１．００ｍｍｏｌ）を加えた溶液を溶液１に加え、室温で２時間反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、目的物であるＢｏｃ－３－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（４１７ｍｇ、９９％）を得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：４２３．３に観測した。
　Ｂｏｃ－４－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（４１７ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸４ｍＬ加え、室温で３０分反応した後溶媒を濃縮し目的物である４－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステルを定量的に得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３２３．２に観測した。
　４－ヒドラジノベンゾイルアルギニンメチルエステル（１５９ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）をエタノール５ｍＬに溶解し、１Ｍアセト酢酸エチルのエタノール溶液（４５０μＬ、０．４５ｍｍｏｌ）さらに酢酸１０００μＬ加え６５℃で３０分反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、最終目的物である４－アルギニン付加ピラゾロン（１７５ｍｇ、９２％）を得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：３８９．２に観測した。
（合成例４）
　Ｂｏｃ－４－ヒドラジノ安息香酸（１１７ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をメタノール５ｍＬに溶解し、４－(４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル)－４－メチルモルホリニウムクロリド（１３７ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を加えた。ジメチルスルフォキシド５ｍＬに溶解したビオチンヒドラジド（１）（１００ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）を加えた室温で１６時間反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、目的物であるＮ－（Ｂｏｃ－４－ヒドラジノベンゾイル）－ビオチンヒドラジド（２）（１２０ｍｇ、６３％）を得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｎａ］+イオンをｍ/ｚ：５１５．４に観測した。
　Ｎ－（Ｂｏｃ－４－ヒドラジノベンゾイル）－ビオチンヒドラジド（２）（１２０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ）にトリフルオロ酢酸４ｍＬ加え、室温で３０分反応した後溶媒を濃縮し目的物であるＮ－（４－ヒドラジノベンゾイル）－ビオチンヒドラジド（３）を定量的に得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｎａ］+イオンをｍ/ｚ：４１５．２に観測した。
　Ｎ－（４－ヒドラジノベンゾイル）－ビオチンヒドラジド（３）（３９ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）をエタノール１ｍＬに溶解し、１Ｍアセト酢酸エチルのエタノール溶液（９０μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）さらに酢酸２００μＬ加え６５℃で３０分反応した。反応液を濃縮し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ（クロロフォルム：メタノール、９：１→５：１）で分離し、最終目的物であるビオチン付加ピラゾロン（４）（３８ｍｇ、９２％）を得た。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳによる解析により、目的物の［Ｍ＋Ｈ］+イオンをｍ/ｚ：４５９．４に観測した。
　本発明は、これまで長く方法論の開発が望まれていたＯ－結合型糖鎖の解析に極めて有効な方法となる。また、従来、リン酸修飾の解析に用いられてきたＢＥＭＡ法に対しても新たな選択肢をもたらすこととなる。本発明により、セリン、スレオニンの翻訳後修飾の総合的な解析が可能となり、生化学、生物学、薬学、創薬、医学等の領域への多大なる貢献が期待される。

Claims (16)

  1. 　塩基性条件下で、翻訳後修飾を受けた糖タンパク質及び／又は糖ペプチドのセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を選択的に切断し、セリン残基、スレオニン残基、および当該アミノ酸残基より切断された翻訳後修飾基のうち少なくとも１つを標識する標識剤。
  2. 　標識剤が、ピラゾロン誘導体、イソキサゾロン誘導体、ヒダントイン誘導体、ローダニン誘導体、マレイミド誘導体のうち少なくとも１つを有効成分として含む、請求項１記載の標識剤。
  3. 　ピラゾロン誘導体が、３－メチル－１－フェニル－５－ピラゾロン、１，３－ジメチル－ピラゾロン、３－メチル－１－ｐ－トリル－５－ピラゾロンのいずれか１種、もしくは２種以上を組み合わせたものである、請求項１、２のいずれか１項記載の標識剤。
  4. 　翻訳後修飾基がＯ－リン酸基、Ｏ－硫酸基、Ｏ－グリカンのいずれか、もしくは２種以上のものである、請求項１～３のいずれか１項記載の標識剤。
  5. 　Ｏ－グリカンが、Ｏ原子と結合する糖として、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、Ｎ－アセチルグルコサミン、キシロース、グルコースのいずれかから始まるものである、請求項１～４のいずれか１項記載の標識剤。
  6. 　Ｏ－グリカンが、Ｏ原子と結合する糖として、Ｎ－アセチルガラクトサミン、マンノース、フコース、キシロース、グルコースのいずれかから始まり、さらに糖が結合して伸長したものである、請求項１～５のいずれか１項記載の標識剤。
  7. 　被検物質の糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと請求項１～６のいずれか１項記載の標識剤を溶媒中に溶解、若しくは分散させ、塩基性条件下で加熱することで、被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から選択的に翻訳後修飾基を切断し、標識させる、翻訳後修飾基の切断方法。
  8. 　切断と同時に翻訳後修飾基が標識される、請求項７記載の翻訳後修飾基の切断方法。
  9. 　分離と同時にセリン残基及び／又はスレオニン残基が標識される、請求項７、８のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
  10. 　糖タンパク質及び／又は糖ペプチドと標識剤を水中で溶解させた条件下で行う、請求項７～９のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
  11. 　標識剤と共にチオール化合物を利用する、請求項７～１０のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
  12. 　チオール化合物がジチオトレイトールである、請求項１１記載の翻訳後修飾基の切断方法。
  13. 　標識剤がピラゾロン誘導体である、請求項７～１２のいずれか１項記載の翻訳後修飾基の切断方法。
  14. 　請求項７～１３のいずれか１項記載の方法で被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた当該翻訳後修飾基に対して、液体クロマトグラフィー分析及び／又は質量分析を行うことを特徴とする、翻訳後修飾基の解析方法。
  15. 　請求項７～１３のいずれか１項記載の方法で被検物質のセリン残基及び／又はスレオニン残基から翻訳後修飾基を切断し、標識させた被検物質に対して、液体クロマトグラフィー分析及び／又は質量分析を行うことを特徴とする、翻訳後修飾基の解析方法。
  16. 　請求項１４、１５の解析を同時に行うことを特徴とする、翻訳後修飾基の解析方法。
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