CN103502818A - 丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰解析用标记剂 - Google Patents

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Abstract

将作为被检测物质的糖蛋白和/或糖肽与吡唑啉酮衍生物、异噁唑酮衍生物、乙内酰脲衍生物、罗丹宁衍生物、马来酰亚胺衍生物等一起在碱性溶液条件下进行加热，将翻译后修饰基切断，并且标记、进行分析，由此解析丝氨酸残基和/或苏氨酸残基的翻译后修饰变得可能。

Description

丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰解析用标记剂
技术领域
本发明涉及生物化学、生物学、药学、药物研发、医学等领域中有用的丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰基的新型的解析方法。特别是，本发明涉及一种标记剂，其从接受了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽的丝氨酸、苏氨酸选择性切断翻译后修饰的O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等并对其进行标记。
背景技术
生物体内的蛋白质表现出各种各样的生理活性，可以认为是由基因翻译出的蛋白质发生了磷酸化、硫酸化或者糖链修饰等多样的翻译后修饰的结果。其中，磷酸化、硫酸化为一般的翻译后修饰，对于多数的蛋白质，通过该修饰具有生物学的活性、机能。其中，糖基化(Glycosylation)为最近开始被关注的领域，修饰后的糖链对蛋白质赋予各种各样的机能。例如：一些蛋白质最初不被糖基化就不能正确地折叠。另外，已知低聚糖通过结合于天冬酰胺而对蛋白质赋予稳定性、控制糖蛋白的体内动态的例子。进一步，糖基化承担着细胞间的粘附这样的作用。修饰蛋白质的糖链大体上分为N-聚糖、O-聚糖、糖胺聚糖(GAG)三类。另外，关于构成该糖链的单糖的种类，在高等生物的情况下，有：甘露糖(Man)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、葡萄糖醛酸(GlcA)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、岩藻糖(Fuc)、唾液酸(SA)。N-聚糖由糖链以N-连接型被转移至具有-天冬酰胺-X-苏氨酸或者-天冬酰胺-X-丝氨酸(X为除了脯氨酸(Pro)以外的氨基酸残基)序列的肽的天冬酰胺(Asn)上而成。O-聚糖由最初的糖以O-连接被转移至苏氨酸(Thr)或丝氨酸(Ser)残基上而成。O-聚糖的最初的糖为N-乙酰半乳糖胺的情况居多，其他的也有甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺等。在最初的糖的后面，屡屡有糖一个接一个地被转移而来，O-聚糖糖链不断延伸。蛋白多糖形成为在蛋白质上连接有多条极长的糖链的形状。将具有该氨基糖(N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺)的糖链部分称为糖胺聚糖(GAG)。糖胺聚糖的特征可列举出如下点：以二糖为1个单位，由该重复结构形成极长的糖链。
其中，丝氨酸和苏氨酸为接受了磷酸化或硫酸化、糖链修饰(O-GalNAc型、O-GlcNAc型、O-Fuc型、O-Man型、O-Xyl型、O-Gal型、O-Glc型)等多样的翻译后修饰的氨基酸残基，这些翻译后修饰在信号传导、分化控制等各种生命的高级机能调节中承担着重要的作用。例如：担负着特定的蛋白质的磷酸化的激酶，其抑制剂全部作为医药品上市，另外，O-连接型糖链的定性、定量的变动应用于各种疾病的诊断。已知，在丝氨酸和苏氨酸的翻译后修饰中，O-磷酸化、O-硫酸化、O-GlcNAc化分别为磷酸基、硫酸基、O-GlcNAc基单独地结合；通常，O-GalNAc化、O-Fuc化、O-Man化、O-Xyl化等O-连接型糖链修饰进一步延伸而成为多样的结构。
此处，作为磷酸化丝氨酸和磷酸化苏氨酸的磷酸化结合位点的切断、标记方法之一，可列举出β-消除·迈克尔加成(BEMA)法。该方法应用的是：在碱性条件下磷酸基β-消除、不饱和羰基生成而成为迈克尔反应受体(参照专利文献1、2，非专利文献1)。例如：通过使二硫苏糖醇之类具有硫醇基的化合物作用，磷酸化位点被标记，利用于肽的纯化和玻珠（on beads）、芯片（on-chip）上的荧光标记化等(参照专利文献3)。BEMA法对于涉及蛋白质的磷酸化的研究有贡献，而成为广泛使用的方法，然而包含O-GlcNAc化的其他的丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰基也通过BEMA而被切断，所以存在不能区分何种修饰基以何种状态存在的问题。另外，作为BEMA中的迈克尔供体，通常为具有硫醇基的化合物，其他的迈克尔供体的应用例几乎没有，应用范围狭窄。另外，作为接受O-GlcNAc化的蛋白质的解析方法，公开有通过2位上具有叠氮基的非天然型的GlcNAc衍生物进行代谢标记的方法(非专利文献2)。进一步，解析O-GalNAc型(粘蛋白型)的糖链部分的多样的结构时，由于尚未发现从蛋白质将糖链切出的有效的酶，因此为了切出糖链，强碱下的β-消除被广泛应用。该情况下，由于游离的糖链也能够从还原末端侧依次接受β-消除而引起分解(剥离反应（peeling reaction）)，因此加入高浓度的还原剂，与β-消除同时地，将还原末端还原为糖醇。该方法于1968年由Carlson公开，至今还是O-GalNAc型糖链的游离的标准的方法(非专利文献3)。然而，本法中存在以下问题点：(1)还原剂存在下的β-消除引起肽部分的分解，所以难以进行蛋白质部分的解析；(2)通过还原，糖链的还原末端丧失，所以用于糖链的分离和高灵敏度分析的衍生物化变困难，等。因此，一直以来强烈需要开发一种用于使O-连接型糖链不分解且以更高的收率从肽、蛋白质游离、分离、为高灵敏度化而衍生物化的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2007-515625号公报
专利文献2：美国专利第7803751号
专利文献3：日本特开2009-19002号公报
专利文献4：美国专利公开公报2006-0099604A1
专利文献5：美国专利公开公报2005-0176093A1
专利文献6：美国专利公开公报2005-0095725A1
专利文献7：美国专利公开公报2005-0014197A1
专利文献8：美国专利公开公报2004-0038306A1
专利文献9：美国专利公开公报2003-0219838A1
非专利文献
非专利文献1：Nature Biotechnology、19(4),379-382(2001)
非专利文献2：Proceedings of the National Academy of Sciences of theUnitedStates of America,100(16),9116-9121(2003)
非专利文献3：J.Biol.Chem.，243，616-626(1968)
发明内容
发明要解决的问题
蛋白质的结构解析技术进步，分析各种翻译后修饰基的机会增加，但现有技术中，只有丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰的O-磷酸基通过上述的BEMA法而被解析。其他的O-硫酸基、O-聚糖等翻译后修饰的解析即便能够用该BEMA法分别切断，也不能进行其后的标记化，例如：对于O-聚糖与何种位置的氨基酸残基结合、进一步该O-聚糖的结构均不能解析。本发明的目的在于解决这样的问题，提供利用能够将接受了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽的丝氨酸残基、苏氨酸残基的翻译后修饰的O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等共通地标记的标记剂，将上述翻译后修饰选择性切断，效率良好地进行解析的方法。进一步，本发明的目的在于，提供能够得到修饰的种类和肽上的修饰位置的相关信息的方法；提供将翻译后修饰位点化学地进行修饰的同时，游离的糖链也不发生剥离反应，作为对于分离、检测有利的任意的衍生物而回收的方法；以及提供新的化合物群，其用于通过BEMA法进行的肽部分的标记。
用于解决问题的方案
本发明人等，为了解决上述问题，在从各种角度讨论的基础上进行了研究开发。结果发现，对于在碱性条件下丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰的O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等，加入特定的标记剂进行加热，由此翻译后修饰基被选择性切断，能够效率良好地标记被切断的翻译后修饰基。本发明基于所述见解而完成。本发明的分析方法在简便性、选择性方面超过了现有方法；能够从各种接受了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基，将翻译后修饰基选择性由该氨基酸残基切断，而进行解析。进一步，本发明也能够进行作为切断源的糖蛋白和/或糖肽的解析。
即，本发明目的在于提供一种标记剂，其在碱性条件下，从接受了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基选择性切断翻译后修饰基，对丝氨酸残基、苏氨酸残基和该从氨基酸残基选择性切断的翻译后修饰基中的至少一种进行标记。另外，本发明目的在于提供一种翻译后修饰基的切断方法，使被检测物质的糖蛋白和/或糖肽与标记剂溶解或分散于溶剂中，在碱性条件下进行加热，由此从被检测物质的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基将翻译后修饰基选择性切断。进一步，本发明提供一种方法，其利用该翻译后修饰基切断方法，解析糖蛋白和/或糖肽的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基的翻译后修饰基。可以认为，本发明为：现有技术中困难的能够将丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰的O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等综合地进行解析的方法，是基于世界上独一无二的新想法的极其重要的发明。
发明的效果
根据本发明的方法，能够通过简单的操作、在温和稳定的条件下，不使用有害的试剂而使O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖等从糖蛋白游离，同时将游离的糖链和肽两者分别用相同的或者不同的试剂进行标记。通过这样的标记，有助于其后分离的容易性和/或检测中的高灵敏度化等，能够将被标记的糖链和肽容易地纯化。另外，能够将被标记的糖链和肽通过液相色谱、质谱分析装置高灵敏度地进行结构解析、定量分析，能够将丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰综合地进行解析。
附图说明
图1为表示实施例1中将具有O-GalNAc型糖链的糖肽模型（glycopeptidemodel）在碱性条件下与PMP、DP、MTP分别加热时得到的MALDI-TOF谱的结果的图。
图2为表示实施例1中推定的反应路径的图。
图3为表示实施例2中从具有O-GalNAc型糖链的糖肽模型在各种条件下切出的O-连接型糖链的分布（profile）的图。A：还原性β-消除(Carlson法)、B：β-Elimination Kit(Sigma)，4℃、24小时，C：β-Elimination Kit(Sigma)，室温、24小时，D：二甲基胺、50℃、16小时，E：二甲基胺、70℃、16小时，F：碱性条件下PMP、70℃、16小时
图4为表示实施例3的、实施例1中得到的被DP分别标记的肽的TOF／TOF谱的图。
图5为表示实施例3的、实施例1中得到的被PMP分别标记的肽的TOF／TOF谱的图。
图6为表示实施例3的、实施例1中得到的被MTP分别标记的肽的TOF／TOF谱的图。
图7为表示实施例4的、将具有O-GalNAc型糖链的糖肽模型在碱性条件下与DTT、DP、DTT／DP一起加热时的生成物的MALDI-TOF谱的图。
图8为表示实施例4的、将具有O-GalNAc型糖链的糖肽模型在碱性条件下与DTT/DP一起加热时所推定的反应路径的图。
图9为表示实施例5的、将牛胎球蛋白、猪胃粘蛋白在碱性条件下与DP加热时得到的O-连接型糖链分布的图。图中的○标志表示半乳糖，浅色的□标志表示N-乙酰半乳糖胺，深色的□标志(涂黑的□标志)表示N-乙酰葡糖胺，△标志表示岩藻糖，◇标志表示N-乙酰基神经氨酸。
图10为表示实施例6的、将磷酸化模式肽(左图)和O-GlcNAc化模式肽(右图)在碱性条件下分别与PMP、DP加热时的生成物的MALDI-TOF谱的图(各图中，上图表示原料，下图表示生成物。)。
图11为表示实施例7的、将具有O-GalNAc型糖链的糖肽模型在碱性条件下与DTT、DP、DTT和DP分别加热时的反应生成物的MALDI-TOF谱的图。
图12为表示实施例7的、向具有O-GlcNAc型糖链的糖肽中在碱性条件下加入吡唑啉酮衍生物(DP)和二硫苏糖醇(DTT)，在70℃下加热16小时时的质谱的图。
图13为表示将牛胎球蛋白、猪颚下腺粘蛋白在碱性条件下与DP加热时得到的O-连接型糖链分布的图。图中的○标志表示半乳糖，浅色的□标志表示N-乙酰半乳糖胺，深色的□标志(涂黑的□标志)表示N-乙酰葡糖胺，△标志表示岩藻糖，◇标志表示N-乙酰基神经氨酸。
图14为表示通过新型吡唑啉酮试剂的糖链标记后的MALDI-TOF谱的图(上段用化合物5标记、中段用化合物10标记、下段用化合物14标记)。
图15为表示精氨酸附加吡唑啉酮（arginine-added pyrazolone）试剂的合成路径的反应概略图。
图16为表示精氨酸附加吡唑啉酮（arginine-added pyrazolone）试剂的合成路径的其他的反应方案图。
图17为表示生物素附加吡唑啉酮（biotin-added pyrazolone）试剂的合成路径的反应方案图。
具体实施方式
本发明涉及一种技术，用于对接受了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽中的、丝氨酸残基和/或苏氨酸残基的相关的翻译后修饰实施解析。对于作为其对象的糖蛋白和/或糖肽的来源，完全没有限制，可列举出例如：人、大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、猫、羊、猪、黑猩猩或它们的免疫缺陷动物等动物、或者植物；但将本发明的成果用于人类的治疗时，优选使用人、猪、黑猩猩来源的细胞。如上所述，本发明提供一种方法，用于解析作为接受了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽中的氨基酸中的、具有羟基的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基的被修饰的翻译后修饰基。对于这样的翻译后修饰基也没有特别的限定，可列举出例如：介由氨基酸侧的O原子连接的磷酸基、硫酸基、聚糖等，本发明中可以使用它们的任一种，也可以使用两种以上。尤其是，介由氨基酸侧的O原子结合的聚糖(以后，有时将介由氨基酸侧的O原子结合的聚糖称为O-聚糖。同样地，有时将介由氨基酸侧的O原子结合的磷酸基、硫酸基分别称为O-磷酸基、O-硫酸基。)可以为：由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、木糖、葡萄糖中的任一者作为与O原子结合的糖而起始的聚糖；以及由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖、木糖、葡萄糖中的任一者作为与O原子结合的糖而起始并进一步结合糖而延伸的聚糖。
本发明中，需要将这样的对丝氨酸残基和/或苏氨酸残基进行修饰的翻译后修饰基从丝氨酸残基和/或苏氨酸残基切断。该切断反应可以根据常规方法进行β-消除反应，对于其条件，没有特别的限定，可以列举出例如：将发生了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽溶解或分散于溶剂中，在碱性条件下进行加热的方法。作为β-消除条件，例如：在10mM～1M的氢氧化锂或氢氧化钠或氢氧化钡中，以4℃～60℃左右静置10分钟～24小时左右。
本发明对于将该丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰用β-消除进行游离时生成的双键通过迈克尔加成进行标记。本迈克尔加成通常一锅(one-pot)进行，β-消除时例如通过添加20mM～1M左右的吡唑啉酮衍生物等迈克尔加成反应供体而进行。另外，可以对游离的翻译后修饰基侧也进行标记。本发明中，可以只标记丝氨酸残基和/或苏氨酸残基侧，也可以标记两者，进一步也可以将丝氨酸残基和/或苏氨酸残基侧和翻译后修饰基侧用不同的试剂进行标记。对于这样的迈克尔加成反应时使用的试剂，没有特别的限定，可列举出例如：硫醇化合物、吡唑啉酮衍生物、异噁唑酮衍生物、乙内酰脲衍生物、罗丹宁衍生物、马来酰亚胺衍生物等；本发明中可以使用它们的任一种也可以组合使用两种以上。其中，对于吡唑啉酮衍生物、异噁唑酮衍生物、乙内酰脲衍生物、罗丹宁衍生物、马来酰亚胺衍生物等，由于能够在迈克尔加成反应的同时进行标记化，所以是本发明中优选的。本发明的标记剂是指包含这样的试剂的制剂。本发明中，进一步吡唑啉酮衍生物作为本发明的标记剂是有用的，它们只要是具有吡唑啉酮基的化合物就没有特别的限制，可以列举出例如：3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)、1,3-二甲基-吡唑啉酮(DP)、3-甲基-1-对甲苯基-5-吡唑啉酮(MTP)、3-甲基-1-(喹啉-8-基)-1H-吡唑-5(4H)-酮等。作为异噁唑酮衍生物，可以列举出例如：3(2H)-异噁唑酮、5-甲基-3(2H)-异噁唑酮、2,5-二甲基3(2H)-异噁唑酮等。作为乙内酰脲衍生物，可以列举出例如：2,4-咪唑啉二酮、3-甲基-2,4-咪唑啉二酮、3-(2-丙炔-1-基)-2,4-咪唑啉二酮等。作为罗丹宁衍生物，可列举出：2-硫代-4-噻唑啉二酮、3-甲基-2-硫代-4-噻唑啉二酮等。
本发明中，可以与上述的标记剂一起组合使用硫醇化合物。此时使用的硫醇化合物只要是具有硫醇基的化合物就没有特别的限制，可以列举出例如：二硫苏糖醇(DTT)、2-氨基乙烷硫醇、硫代胆碱、2-(吡啶-4-基)乙烷硫醇等。通过该组合，产生如上所述的只标记丝氨酸残基和/或苏氨酸残基侧的情况、标记两者的情况，可以结合目的而适宜选择。作为标记剂，可以以上述的1，3-二甲基-吡唑啉酮(DP)和二硫苏糖醇(DTT)为例，对此进行具体的说明。翻译后修饰基为糖链时，加入DP时被标记而加入DTT时没有被标记；加入DP和DTT两者的情况下，只有DP标记体被检测出。另外，蛋白质或者肽的情况下，添加DTT时DTT标记体被检测出，添加DP时作为DP标记体被检测出。根据经验可知，将DTT与DP组合使用时，只有DTT标记体与肽反应，DP不与蛋白质或者肽反应。
对于从本发明中的被检测物质的糖蛋白和/或糖肽将翻译后修饰基切断时的反应液的状态，没有特别的限制，可以为溶解于溶剂中的状态，也可以为使之分散的状态。在本发明中，使糖蛋白和/或糖肽与标记剂在水中溶解的条件下进行的方法，能效率良好地进行反应而优选。另外，为了进一步效率良好地进行反应，也可以搅拌反应液。
本发明中，对于从这样得到的被检测物质的丝氨酸残基、苏氨酸残基将翻译后修饰基切断并标记的该翻译后修饰基或者从被检测物质的丝氨酸残基、苏氨酸残基将翻译后修饰基切断并标记的被检测物质中的任一者或者两者，可以使用液相色谱、高效液相色谱进行分析。进一步，可以根据目标分子的种类使用适宜的方法，可以使用例如：质谱分析(MS)、核磁共振(NMR)，除此以外，还可以使用紫外分光光度计(UV)、蒸发光散射检测器(ELS)、电化学检测器等。本发明中，可以使用它们中的任一种方法进行分析，也可以组合两种以上的方法进行分析。
根据本发明，能够对被检测物质的糖蛋白和/或糖肽的翻译后修饰基进行高灵敏度结构解析、定量分析，能够对丝氨酸和苏氨酸的翻译后修饰综合地进行解析。
实施例
以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。
[实施例1]
(实验详细内容1)
按照已有的报道合成具有O-GalNAc型糖链的糖肽。向糖肽的水溶液(4μg/mL、5μL)中加入45μL的水、50μL的0.6M NaOH、100μL的0.5M3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)的甲醇溶液或0.5M1,3-二甲基5-吡唑啉酮(DP)的水溶液或0.5M3-甲基-1-对甲苯基-5-吡唑啉酮(MTP)的甲醇溶液，70℃下静置16小时。反应后，用0.3M盐酸中和，将反应液直接与2,5-二氢苯甲酸(10mg/mL)混合，通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、Bruker Corporation)进行解析。
(实验详细内容2)
接着，向该具有O-GalNAc型糖链的糖肽中，在碱性条件下加入3种不同的吡唑啉酮衍生物，70℃下加热16小时，进行分解。具体而言，向具有O-GalNAc型糖链的糖肽的水溶液(4μg/mL、5μL)中添加10μL的1MNaBH4(100mM NaOH溶液)、水5μL，50℃下静置15小时(A)。向糖肽的水溶液(4μg/mL、5μL)中加入12μL的水和3.4μL的β―消除试剂混合物(β―elimination reagent mix)(Sigma-Aldrich Japan K.K.)，4℃或室温下静置24小时(B、C)。在糖肽的水溶液(4μg/mL、5μL)中，加入18μL的二甲基胺，50℃或70℃下静置16小时(D、E)。向糖肽的水溶液(4μg/mL、5μL)中加入45μL的水、50μL的0.6M NaOH、100μL的0.5M3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮(PMP)的甲醇溶液，70℃下静置16小时(F)。分别在反应后进行中和，A中重复加入1%醋酸甲醇溶液，干固。A-E分别通过Dowex50x8和ZipTipC18将糖链部分纯化，将2,5-二氢苯甲酸(10mg/mL)作为基质通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、BrukerCorporation)进行解析。F采用实验详细内容1中所述的方法进行糖链的分析。将得到的质谱的结果示于图1。作为原料的糖肽的信号均显著降低，出现了被新添加的吡唑啉酮衍生物标记的肽和糖链的信号。将推定的反应示于图2。
[实施例2]
对通过现有的各种方法使糖链从具有O-GalNAc型糖链的糖肽游离而得到的糖链的分布进行比较。将得到的质谱的结果示于图3。可知使用的糖肽主要具有被称为唾液酸化T（siaryl-T）的三糖结构(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc)，包含微量的被称为T抗原(Galβ1-3GalNAc)的二糖结构。将通过为了防止糖链的分解而在还原剂(NaBH4)存在下、在β-消除的同时将糖链的还原末端还原为糖醇的Carlson法而得到的糖链分布示于图3的A。确认有唾液酸化T和T抗原的峰，与分解物相当的峰仅微量存在。将使用Sigma-Aldrich Japan K.K.市售的β消除试剂盒(elimination kit)在推荐的两种条件下使糖链游离时的结果示于图3的B、C。另外，使用二甲基胺的方法(Anal.Chem.，2010，82，2421-2425)也在两种条件下进行(图3的D、E)。在任一情况下，通过剥离反应生成的分解物占有非常大的比例，不实施还原的情况下，得到糖链分布显著受损的结果。最近的人类蛋白质组机构的论文中也指出(Mol.Cel.Proteomics、2010、9、719-727)不实施还原的情况下，存在糖链分布受损的倾向。碱性条件下加入PMP时，唾液酸化T只有PMP标记体被检测出以及仅微量的T抗原的PMP标记体被检测出，分解物的峰完全没有检测出(图3的F)。
由这些结果可知，即便在碱性条件下将O-连接型糖链通过β-消除而游离，只要存在吡唑啉酮衍生物，就能快速地与糖链反应而得到稳定的标记体，几乎不会得到分解产物。
[实施例3]
将实施例1中得到的被DP、PMP、MTP分别标记的肽的TOF／TOF谱分别示于图4、图5、图6。所有的情况下，均良好地得到肽序列信息以及糖链的修饰位置信息。由这些结果可知，通过向β-消除反应中添加吡唑啉酮衍生物，能够很好地得到糖链、肽以及结构、序列信息。
[实施例4]
向具有O-GalNAc型糖链的糖肽中，在碱性条件下加入吡唑啉酮衍生物(DP)和二硫苏糖醇(DTT)，70℃下加热16小时。具体而言，向具有O-GalNAc型糖链的糖肽的水溶液(4μg/mL、5μL)中添加5μL的0.6M NaOH。进一步，加入10μL的0.5M DTT或10μL的0.5M DP或5μL的0.5M DTT＋5μL的0.5M DP，70℃下静置16小时。反应后，分别稀释反应液，与DHB混合，通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、Bruker Corporation)进行解析。将此时的质谱的结果示于图7。关于糖链，只在加入了DP时被标记(图7左中图)，在加入了DTT时没有被标记(图7左上图)。加入DP和DTT两者时，只有DP标记体被检测出(图7左下图、图8)。关于肽，在添加了DTT时DTT衍生物被检测出，在添加了DP时作为DP衍生物而被检测出(图7右上图和中图)。添加了DTT和DP时，只有DTT与肽反应的物质被检测出；DP直接与肽反应的物质没有被检测出(图7右下图、图8)。该结果显示，糖链和肽能够分别被不同的试剂选择性进行标记。
[实施例5]
对于已知具有O-连接型糖链的牛胎球蛋白、猪胃粘蛋白和人类IgA，使用本发明所示的技术，进行O-连接型糖链的分布分析。将结果示于图9。将牛胎球蛋白或猪胃粘蛋白或人类IgA分别秤取50μg，添加50μL的水、100μL的0.5M DP溶液、50μL的0.6M NaOH，70℃下静置16小时。反应后进行中和，将反应液的1/4量(50μL)通过Dowex50x8和ZipTipC18而将糖链部分纯化，暂时干固后，溶解于DHB中，通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、BrukerCorporation)进行解析。所有的结果均为与过去所报告的结果定性、定量地相同的结果。由此可知，本发明对于糖蛋白的O-连接型糖链的解析是有用的。另外，已知牛胎球蛋白具有O-连接型糖链和N-连接型糖链两者，但本法中只检测出O-连接型糖链，N-连接型糖链完全没有检测出。由该结果可知，本发明技术对于N-连接型糖链没有作用，高选择性作用于O-连接型糖链。
[实施例6]
示出对于分别具有磷酸化修饰、O-GlcNAc型糖链修饰的两种肽利用本发明技术时的结果的质谱(图10)。具体而言，来源于牛β-酪蛋白的磷酸化糖肽(FQpSEEQQQTEDELQDK)从ANASPEC Inc.购得。O-GlcNAc化肽(TAPT(O-GlcNAc)STIAPG)从INVITROGEN公司购得。向磷酸化糖肽50μg(5μL)中加入10μL的0.5M PMP、5μL的0.6M NaOH，70℃下静置16小时。向O-GlcNAc化肽5.6μg(10μL)中加入20μL的0.5M DP、10μL的0.6M NaOH，70℃下静置16小时。将反应液直接与DHB混合，通过MALDI-TOF进行解析。结果，原料的修饰肽均在反应后显著地降低，肽分别以高收率转化为所添加的吡唑啉酮衍生物。由该结果可知，与O-GalNAc型糖链同样地，本法对于丝氨酸、苏氨酸的磷酸化、O-GlcNAc型糖链修饰也同样地起作用。
[实施例7]
向具有O-GalNAc型糖链的糖肽的水溶液(4μg/mL、5μL)中添加5μL的0.6M NaOH。进一步，加入10μL的0.5M DTT或10μL的0.5M DP或5μL的0.5MDTT＋5μL的0.5M DP，70℃下静置16小时。反应后，分别稀释反应液，与DHB混合，通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、Bruker Corporation)进行解析。
向具有O-GalNAc型糖链的糖肽的水溶液(4μg/mL、10μL)中添加20μL的0.45M NaOH。进一步，加入20μL的0.5M PMP或20μL的0.5M DTT或10μL的1.0M DTT+10μL的1.0M DPPMP，85℃下静置16小时。反应后，分别稀释反应液，与DHB混合，通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、Bruker Corporation)进行解析。将结果示于图11和图12。
图12为向具有O-GlcNAc型糖链的糖肽中在碱性条件下加入吡唑啉酮衍生物(DP)和二硫苏糖醇(DTT)且70℃下加热16小时时的质谱。糖链只在加入了DP时被标记，在加入了DTT时没有被标记。加入DP和DTT两者时，只有DP标记体被检测出。肽在添加了DTT时DTT衍生物被检测出，在添加了DP时作为DP衍生物而被检测出(图11，上段和中段)。添加了DTT和DP时，只有DTT与肽反应的物质被检测出；DP直接与肽反应的物质没有被检测出(图11，下段)。该结果显示，糖链和肽能够分别被不同的试剂选择性标记。
[实施例8]
将牛胎球蛋白或猪颚下腺粘蛋白分别秤取50μg，添加50μL的水、100μL的0.5M DP溶液、50μL的0.6M NaOH，70℃下静置16小时。反应后进行中和，将反应液的1/4量(50μL)通过Dowex50x8和ZipTipC18而将糖链部分纯化，暂时干固后，溶解于DHB中，通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、BrukerCorporation)进行解析。将结果示于图13。
图13为对于已知具有O-连接型糖链的牛胎球蛋白和猪颚下腺粘蛋白，使用本法进行O-连接型糖链的分布分析的结果。均能够得到与过去文献等报告的结果定性、定量地相同的结果，所以可知本法对于糖蛋白的O-连接型糖链的解析是有用的。另外，已知牛胎球蛋白具有O-连接型糖链和N-连接型糖链两者，但本法中只检测出O-连接型糖链，N-连接型糖链完全没有检测出。由该结果可知，本法对于N-连接型糖链没有作用，高选择性作用于O-连接型糖链。
[合成例]
图14为被新型吡唑啉酮试剂标记的糖链的质谱。可以确认，使用具有吡唑啉酮骨架的试剂时，被单衍生物化或者双衍生物化。图15、图16和图17为新型吡唑啉酮试剂的合成方案图。
(合成例1)
向1mM的葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰乳糖胺和壳四糖(Chitotetraose)的混合物10μL中添加20μL的0.45M NaOH。进一步，加入20μL的0.5M合成吡唑啉酮试剂(化合物5或10或14)，85℃下静置2小时。反应后，分别稀释反应液，与DHB混合，通过MALDI-TOF(/TOF)(UltraFlex II、Bruker Corporation)进行解析。
(合成例2)
将3-肼基苯甲酸(592mg、3.9mmol)溶解于二甲基甲酰胺10mL中，加入二碳酸二叔丁酯(854mg、3.9mmol)，室温下反应16小时。将反应液用乙酸乙酯提取，用10mM盐酸和水进行洗涤。将提取液浓缩，得到作为目标产物的Boc-3-肼基苯甲酸(980mg、100%)。
将Boc-3-肼基苯甲酸(491mg、1.95mmol)溶解于甲醇5mL中，加入WSC(560mg、2.93mmol)(溶液1)。在溶液1中加入溶液2)、即将精氨酸甲酯二盐酸盐(509mg、1.95mmol)溶解于水2mL中并加入了三乙基胺(395mg、3.9mmol)而成的溶液，室温下反应16小时。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇、9：1→5：1)进行分离，得到作为目标产物的Boc-3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(406mg、49%)。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：423.4处观测到目标产物的[M＋H]+离子。
向Boc-3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(386mg、0.91mmol)中加入三氟乙酸4mL，室温下反应1小时后，将溶剂浓缩，定量地得到作为目标产物的3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：323.2处观测到目标产物的[M＋H]+离子。
将3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(29mg、0.09mmol)溶解于乙醇1mL，加入1M乙酰乙酸乙酯的乙醇溶液(80μL、0.08mmol)，再加入醋酸200μL，65℃下反应30分钟。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇、9：1→5：1)进行分离，得到作为最终目标产物的3-精氨酸附加吡唑啉酮(21.7mg、70%)。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：389.2处观测到目标产物的[M＋H]+离子。
(合成例3)
将4-肼基苯甲酸(1.52g、10mmol)溶解于二甲基甲酰胺10mL中，加入二碳酸二叔丁酯(2.18g、10mmol)，65℃下反应1小时。将反应液用乙酸乙酯提取，用10mM盐酸和水进行洗涤。将提取液浓缩，得到作为目标产物的Boc-4-肼基苯甲酸。
将Boc-4-肼基苯甲酸(252mg、1.00mmol)溶解于甲醇10mL中，加入4-(4，6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(295mg、1.00mmol)(溶液1)。在溶液1中加入溶液2)、即将精氨酸甲酯二盐酸盐(261mg、1.00mmol)溶解于水2mL中并加入了三乙基胺(100μL、1.00mmol)而成的溶液，室温下反应2小时。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇、9：1→5：1)进行分离，得到作为目标产物的Boc-3-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(417mg、99%)。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：423.3处观测到目标产物的[M＋H]+离子。
向Boc-4-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(417mg、0.99mmol)中加入三氟乙酸4mL，室温下反应30分钟后，将溶剂浓缩，定量地得到作为目标产物的4-肼基苯甲酰精氨酸甲酯。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：323.2处观测到目标产物的[M＋H]+离子。
将4-肼基苯甲酰精氨酸甲酯(159mg、0.49mmol)溶解于乙醇5mL中，加入1M乙酰乙酸乙酯的乙醇溶液(450μL、0.45mmol)，再加入醋酸1000μL，65℃下反应30分钟。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇、9：1→5：1)进行分离，得到作为最终目标产物的4-精氨酸附加吡唑啉酮(175mg、92%)。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：389.2处观测到目标产物的[M＋H]+离子。
(合成例4)
将Boc-4-肼基苯甲酸(117mg、0.46mmol)溶解于甲醇5mL中，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(137mg、0.47mmol)。加入溶解于二甲基亚砜5mL中的生物素酰肼(1)(100mg、0.39mmol)，室温下反应16小时。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇、9：1→5：1)进行分离，得到作为目标产物的N-(Boc-4-肼基苯甲酰基)-生物素酰肼(2)(120mg、63%)。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：515.4处观测到目标产物的[M＋Na]+离子。
向N-(Boc-4-肼基苯甲酰基)-生物素酰肼(2)(120mg、0.24mmol)中加入三氟乙酸4mL，室温下反应30分钟后，将溶剂浓缩，定量地得到作为目标产物的N-(4-肼基苯甲酰基)-生物素酰肼(3)。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：415.2处观测到目标产物的[M＋Na]+离子。
将N-(4-肼基苯甲酰基)-生物素酰肼(3)(39mg、0.1mmol)溶解于乙醇1mL中，加入1M乙酰乙酸乙酯的乙醇溶液(90μL、0.09mmol)，再加入醋酸200μL，65℃下反应30分钟。将反应液浓缩，用硅胶柱色谱(氯仿：甲醇、9：1→5：1)分离，得到作为最终目标产物的生物素附加吡唑啉酮(4)(38mg、92%)。通过MALDI-TOF-MS进行解析，在m/z：459.4处观测到目标产物的[M＋H]+离子。
产业上的可利用性
本发明成为方法论方面长期以来期望开发的、对于O-连接型糖链的解析极为有效的方法。另外，对于现有的、磷酸修饰的解析中一直应用的BEMA法，也带来新的选项。通过本发明，丝氨酸、苏氨酸的翻译后修饰的综合的解析变得可能，期待对于生物化学、生物学、药学、药物研发、医学等领域做出更大的贡献。

Claims (16)

1.一种标记剂，其在碱性条件下，从接受了翻译后修饰的糖蛋白和/或糖肽的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基选择性切断翻译后修饰基，对丝氨酸残基、苏氨酸残基和该从氨基酸残基切断的翻译后修饰基中的至少一种进行标记。
2.根据权利要求1所述的标记剂，其中，标记剂包含吡唑啉酮衍生物、异噁唑酮衍生物、乙内酰脲衍生物、罗丹宁衍生物、马来酰亚胺衍生物中的至少一种作为有效成分。
3.根据权利要求1、2的任一项所述的标记剂，其中，吡唑啉酮衍生物为3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮、1,3-二甲基-吡唑啉酮、3-甲基-1-对甲苯基-5-吡唑啉酮中的任一种或两种以上的组合。
4.根据权利要求1～3的任一项所述的标记剂，其中，翻译后修饰基为O-磷酸基、O-硫酸基、O-聚糖的任一种或两种以上的修饰基。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的标记剂，其中，O-聚糖是由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡糖胺、木糖、葡萄糖中的任一者作为与O原子结合的糖而起始的聚糖。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的标记剂，其中，O-聚糖是由N-乙酰半乳糖胺、甘露糖、岩藻糖、木糖、葡萄糖中的任一者作为与O原子结合的糖而起始并进一步结合糖而延伸的聚糖。
7.一种翻译后修饰基的切断方法，其中，将被检测物质的糖蛋白和/或糖肽与权利要求1～6的任一项所述的标记剂溶解或分散于溶剂中，在碱性条件下进行加热，由此从被检测物质的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基选择性切断翻译后修饰基并将其标记。
8.根据权利要求7所述的翻译后修饰基的切断方法，其中，在切断的同时，翻译后修饰基被标记。
9.根据权利要求7、8的任一项所述的翻译后修饰基的切断方法，其中，在分离的同时，丝氨酸残基和/或苏氨酸残基被标记。
10.根据权利要求7～9的任一项所述的翻译后修饰基的切断方法，其中，在使糖蛋白和/或糖肽与标记剂溶解在水中的条件下进行。
11.根据权利要求7～10的任一项所述的翻译后修饰基的切断方法，其中，与标记剂一起利用硫醇化合物。
12.根据权利要求11所述的翻译后修饰基的切断方法，其中，硫醇化合物为二硫苏糖醇。
13.根据权利要求7～12的任一项所述的翻译后修饰基的切断方法，其中，标记剂为吡唑啉酮衍生物。
14.一种翻译后修饰基的解析方法，其特征在于，对于用权利要求7～13的任一项所述的方法从被检测物质的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基将翻译后修饰基切断并标记的该翻译后修饰基，进行液相色谱分析和/或质谱分析。
15.一种翻译后修饰基的解析方法，其特征在于，对于用权利要求7～13的任一项所述的方法从被检测物质的丝氨酸残基和/或苏氨酸残基将翻译后修饰基切断并标记的被检测物质，进行液相色谱分析和/或质谱分析。
16.一种翻译后修饰基的解析方法，其特征在于，同时进行权利要求14、15的解析。
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