CN116183323A - 试样的制备方法以及分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的技术问题在于迅速地使糖链中的内酯稳定化。一种试样的制备方法，是制备含有糖链的试样的制备方法，该制备方法包括以下步骤：进行内酯化反应，所述内酯化反应使糖链所含的唾液酸的至少一部分内酯化；和进行酰胺化反应，所述酰胺化反应将酰胺化反应溶液加入至试样中而使已内酯化的唾液酸的内酯酰胺化，所述酰胺化反应溶液含有从由与内酯化的唾液酸反应的氨、胺及它们的盐组成的组中选择的至少一种。

Description

试样的制备方法以及分析方法
本发明申请是基于株式会社岛津制作所的主题为“试样的制备方法以及分析方法”的中国发明申请递交的分案申请，中国发明申请的申请号为201910123558.1，申请日为2019年2月18日。
技术领域
本发明涉及试样的制备方法以及分析方法。
背景技术
唾液酸是在生物体内大量存在的糖。唾液酸在生物体内包含于与蛋白质结合的糖链中,较多地存在于糖链的末端(非还原末端)。因此,唾液酸在这样的糖蛋白分子中配置于分子的外侧,能够直接从其他分子识别,因此承担重要的作用。
存在唾液酸与相邻的糖之间的结合方式(linkagetype)不同的情况。例如,已知：在人的N型糖链中,主要为α2,3-以及α2,6-的结合方式，而在O型糖链或鞘糖脂中,除了这些以外,还存在α2、8-以及α2、9-的结合方式。根据这样的结合方式的不同,能够从不同的分子识别出唾液酸,从而可以具有不同的作用。此外,还已知所表达的糖蛋白中的唾液酸的结合方式随着癌变的进行而发生变化,从而也期待其作为癌症的生物标记物的利用。进而,已知糖链修饰对生物药品的效果的影响,在生物药品的质量管理中,唾液酸的结合方式的解析也是至关重要的。
但是,由于唾液酸具有负电荷,在正离子模式下难以离子化或者唾液酸容易分解,因此通过含有唾液酸的唾液酸糖链的质谱分析进行的解析并不容易。除此之外,分子量并不会根据唾液酸的结合方式而变化,因此区别并解析唾液酸的结合方式变得更加困难。
为了区别并解析唾液酸的结合方式,提出了进行结合方式特异性修饰的化学修饰法。在这样的化学修饰法中,利用α2,3-唾液酸与α2,6-唾液酸相比而容易因脱水缩合剂引起分子内脱水的性质,通过分子内脱水使α2,3-唾液酸内酯化，同时使α2,6-唾液酸与醇或胺等亲核剂反应。由此,根据唾液酸的结合方式而生成不同质量的分子,因此能够通过质谱分析来区别并解析唾液酸的结合方式。
然而,α2,3-唾液酸的内酯不稳定,只要溶解于水就会开始分解,在48小时左右也可能会分解相当多的比例。因此,为了避免因内酯的分解而引起的定量性的恶化,进行的是对内酯进行修饰而使其稳定化。
在专利文献1以及非专利文献1中,将含有异丙胺与脱水缩合剂的溶液加入至游离糖链中,使α2,3-唾液酸内酯化,使α2,6-唾液酸酰胺化。之后,为了使内酯水解并酰胺化,将含有甲胺盐酸盐的溶液以及含有脱水缩合剂的溶液依次加入至试样中,使其反应2小时。
在非专利文献2中,将含有二甲胺与脱水缩合剂的溶液加入至组织切片上的糖蛋白中，使α2,3-唾液酸内酯化,使α2,6-唾液酸酰胺化。之后,如非专利文献2的图1(B)所示,为了使内酯水解并酰胺化,加入氨水使其反应2小时。
在非专利文献3中,将含有乙醇与脱水缩合剂的溶液加入至与固相载体结合的糖蛋白中,使α2,3-唾液酸内酯化,使α2,6-唾液酸酯化。之后,如非专利文献3的图解(Scheme)1(b)所示,为了使内酯水解,将pH10的Tris缓冲液加入至试样中并使其反应1小时,然后将含有甲胺盐酸盐与脱水缩合剂的溶液加入至试样中并使其反应30分钟。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第6135710号公报
非专利文献1：西风隆司、津元裕树、关谷祯规、岩本慎一、三浦百合、田中耕一，《通过一锅法唾液酸衍生化区分唾液酸结合异构体从而用于基于质谱的糖链分析(DifferentiationofSialylLinkage IsomersbyOne-PotSialicAcidDerivatizationforMass Spectrometry-BasedGlycanProfiling)》，分析化学，(美国)，美国化学学会期刊(ASCPublications)，2017年2月21日，第89卷，第4期，第2353-2360页。
非专利文献2：HolstS,HeijsB,deHaanN,vanZeijlRJ,Briaire-deBruijnIH,vanPeltGW,MehtaAS,AngelPM,MeskerWE,TollenaarRA,DrakeRR,BoveeJV,McDonnellLA,WuhrerM.，《结合特异性原位唾液酸衍生化用于福尔马林固定石蜡包埋组织的N-聚糖质谱成像(Linkage-SpecificinSituSialicAcidDerivatizationfor N-GlycanMassSpectrometryImagingofFormalin-Fixed Paraffin-EmbeddedTissues)》，分析化学，(美国)，美国化学学会期刊，2016年6月7日，第88卷，第11期，第5904-5913页。
非专利文献3：李恒辉、高文杰、冯晓均、刘笔峰、刘欣《使用固相两步衍生方法对唾液酸化N-聚糖结合异构体进行MALDI-MS分析(MALDI-MSanalysisofsialylatedN-glycanlinkageisomersusing solid-phasetwostepderivatizationmethod)》，AnalyticaChimica Acta，(荷兰)，爱思维尔，2016年6月14日，第924卷，第77-85页。
发明内容
发明要解决的技术问题
在上述现有技术文献的方法中,由于试图通过水解使内酯开环,之后在脱水缩合剂的存在下使因开环产生的羧基与胺反应,因此用于反应的时间较长,操作繁杂。
用于解决上述技术问题的方案
本发明的优选实施方式的试样的制备方法是制备含有糖链的试样的制备方法，包括以下步骤：进行内酯化反应，所述内酯化反应使所述糖链所含的唾液酸的至少一部分内酯化；和进行酰胺化反应，所述酰胺化反应将酰胺化反应溶液加入至所述试样中而使所述已内酯化的所述唾液酸的内酯酰胺化，所述酰胺化反应溶液含有从由与内酯化的所述唾液酸反应的氨、胺以及它们的盐组成的组中选择的至少一种。
在进一步优选的实施方式中,还包括以下步骤：在所述内酯化反应之后,进行从所述试样去除用于所述内酯化反应的内酯化反应溶液的操作。
在进一步优选的实施方式中,所述酰胺化反应仅通过使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触来进行。
在进一步优选的实施方式中,所述酰胺化反应溶液不含有与所述内酯反应的脱水缩合剂。
在进一步优选的实施方式中,在所述试样中加入所述酰胺化反应溶液后,不进行使所述试样与脱水缩合剂反应的操作。
在进一步优选的实施方式中,为了进行所述酰胺化反应而使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触的时间短于30分钟。
在进一步优选的实施方式中,所述胺为伯胺。
在进一步优选的实施方式中,所述胺包含烷基。
在进一步优选的实施方式中,所述烷基不具有支链。
在进一步优选的实施方式中,所述胺包含烯丙基及羟基中的至少一种。
在进一步优选的实施方式中,所述酰胺化反应溶液的pH为8.0以上。
在进一步优选的实施方式中,在进行所述内酯化反应时,将内酯化反应溶液加入至所述试样中,使所述唾液酸的至少一部分内酯化，所述内酯化反应溶液含有与所述糖链所含的所述唾液酸反应的脱水缩合剂。
在进一步优选的实施方式中,所述内酯化反应溶液还含有与所述糖链所含的所述唾液酸反应的亲核剂,所述亲核剂的质量与用于所述酰胺化反应的所述氨以及所述胺的质量不同,在所述试样中加入所述内酯化反应溶液，基于所述唾液酸的结合方式，使所述唾液酸的一部分内酯化,使所述亲核剂的至少一部分与所述唾液酸的另一部分结合。
在进一步优选的实施方式中,在所述内酯化反应中,从由α2，3-唾液酸、α2,8-唾液酸以及α2,9-唾液酸组成的组中选择的至少一种所述唾液酸被内酯化。
在进一步优选的实施方式中,将所述内酯化反应溶液加入至所述试样中,使α2,3-唾液酸内酯化,使所述亲核剂的一部分与α2,6-唾液酸结合。
在进一步优选的实施方式中,所述试样与所述酰胺化反应溶液的接触是在所述试样结合或吸附于固相载体的状态下进行的。
在进一步优选的实施方式中,所述酰胺化反应溶液的溶剂包含有机溶剂。
本发明的优选实施方式的分析方法包括以下步骤：通过上述试样的制备方法来制备试样；和对制备成的所述试样进行分析。
在进一步优选的实施方式中,通过质谱分析以及色谱法中的至少一种对制备成的所述试样进行分析。
发明效果
根据本发明,能够更迅速地使糖链中的内酯化后的分子稳定化。
附图说明
图1是表示一个实施方式的分析方法的流程的流程图。
图2是将从α2,3-唾液酸糖肽游离的糖链供于内酯化反应以及酰胺化反应后,对反应生成物以负离子模式进行质谱分析而得到的质谱,图2a为酰胺化反应时的甲胺浓度为1％时的质谱，图2b为酰胺化反应时的甲胺浓度为10％时的质谱。
图3是表示酰胺化反应时的甲胺水溶液的浓度与被酰胺化的效率的关系的图表。
图4是表示酰胺化反应时的胺的种类与各反应生成物的生成比的图表。
图5是表示酰胺化反应时的胺的种类以及溶剂与各反应生成物的生成比的图表。
图6是表示酰胺化反应时的pH与各反应生成物的生成比的图表。
图7是将从作为糖蛋白的胎球蛋白游离的糖链供于内酯化反应以及酰胺化反应后,对反应生成物进行质谱分析而得到的质谱。
图8是将含有从鞘糖脂双唾液酸神经节苷酯GD1a(上段)以及GD1b(下段)游离的α2,8-唾液酸的糖链供于内酯化反应及酰胺化反应后,对反应生成物进行质谱分析而得到的质谱。
图9是表示将从α2,3-唾液酸糖肽游离的糖链供于内酯化反应后,与HILIC载体结合,在洗脱的前后供于酰胺化反应时的各反应生成物的生成比的图表。
具体实施方式
以下,参照附图对本发明的具体实施方式进行说明。发明人等发现：通过对唾液酸被内酯化的试样加入酰胺化反应溶液，能够引起迅速的酰胺化，所述酰胺化反应溶液包含从与被内酯化的唾液酸反应的氨、胺以及它们的盐组成的组中选择的至少一种化合物。
图1是表示本实施方式的试样的制备方法的分析方法的流程的流程图。在步骤S1001中,准备含有糖链的试样。
含有糖链的试样没有特别限定,可以包含从由游离糖链、糖肽、糖蛋白、以及糖脂组成的组中选择的至少一种分子。本实施方式的试样的制备方法用于在糖链上所形成的内酯的修饰,特别适合用于唾液酸的结合方式的解析,因此,试样中的糖链优选含有N-结合型糖链、O-结合型糖链、糖脂型糖链等在末端可能具有唾液酸的糖链。试样中的糖链优选含有α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸以及α2,9-唾液酸中的至少一种。
在试样含有游离糖链的情况下,能够使用从糖蛋白、糖肽、糖脂中游离的糖链。作为使糖链从糖蛋白、糖肽、糖脂中游离的方法,能够使用采用N-糖苷酶、O-糖苷酶、鞘糖脂内切糖苷酶(endoglycoceramidase)等的酶处理、肼(hydrazine)分解、基于碱处理的β脱离等方法。在使N-结合型糖链从糖肽以及糖蛋白的肽链游离的情况下,适合使用基于肽-N-糖苷酶F(PNGaseF)、肽-N-糖苷酶A(PNGaseA)、内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EndoM)等的酶处理。此外，能够适当进行糖链的还原末端的吡啶氨基化(PA化)等的修饰。也可以在酶处理之前进行后述的糖肽或糖蛋白的肽链的切断。
在试样含有糖肽和/或糖蛋白的情况下,如后述的“关于抑制糖肽以及糖蛋白的副反应”的部分所述,能够适当进行用于抑制肽部分的副反应的处理。此外,对于糖肽或者糖蛋白的肽链的氨基酸的残基数较多的试样,优选通过酶的切断等切断肽链再使用。例如,在制备质谱分析用的试样的情况下,肽链的氨基酸残基数优选为30以下,更优选为20以下,进一步优选为15以下。另一方面,在要求明确糖链所结合的肽的来源的情况下,肽链的氨基酸残基数优选为2以上,更优选为3以上。
作为切断糖肽或糖蛋白的肽链时的消化酶,可使用胰蛋白酶、赖氨酸C端内切酶(Lys-C)、精氨酸肽链内切酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、蛋白酶K、蛋白酶E等。这些消化酶也可以组合使用两种以上。切断肽链时的条件没有特别地限定,能够根据使用的消化酶采用适当的实验方案。也可以在该切断之前进行试样中的蛋白质以及肽的变性处理或烷基化处理。变性处理或烷基化处理的条件没有特别限定。
另外,上述肽链的切断处理也可以在通过本实施方式的试样的制备方法将糖链所含的内酯酰胺化后进行。此外,也可以不通过酶的切断而是通过化学性切断等切断肽链。
如果步骤S1001结束,则进入步骤S1003。
(内酯化反应)
在步骤S1003中,使试样与用于内酯化的反应溶液(以下,称为内酯化反应溶液)接触,进行使糖链所含的唾液酸的至少一部分内酯化的内酯化反应(以下,在记载为内酯化反应的情况下，只要没有特别说明,则是指步骤S1003的内酯化反应)。在内酯化反应中,α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸以及α2,9-唾液酸适合被内酯化。内酯化反应溶液包含脱水缩合剂。
在以下的说明中,以区别唾液酸的结合方式进行解析的情况为例来进行说明。在这种情况下,内酯化反应溶液除了脱水缩合剂以外还含有亲核剂，所述亲核剂含有从由醇、胺及它们的盐组成的组中选择的至少一种。
调整脱水缩合剂以及亲核剂的种类和浓度,以基于唾液酸的结合方式而选择性地发生脱水反应或亲核反应。由α2,3-唾液酸的羧基的分子内脱水产生的内酯为六元环,通过α2,6-唾液酸的羧基的分子内脱水而能够产生的内酯为七元环。因此,相比于α2,6-唾液酸，产生比七元环更稳定的六元环的α2,3-唾液酸更容易内酯化。此外,与α2,6-唾液酸的羧基相比，α2,3-唾液酸的羧基位于位阻较大的位置,因此,如果与α2,6-唾液酸相比,则大的分子难以与α2,3-唾液酸反应。基于这样的因唾液酸的结合方式所致的分子结构的不同,能够调整脱水缩合剂以及亲核剂的种类和浓度,以根据唾液酸的结合方式进行不同的修饰。
(内酯化反应中的脱水缩合剂)
脱水缩合剂优选含有碳二亚胺。这是因为：如果使用碳二亚胺,则与使用鏻系脱水缩合剂(所谓的BOP试剂)或脲鎓系脱水缩合剂作为脱水缩合剂的情况相比,存在于位阻较大的部位的羧基难以被酰胺化。作为碳二亚胺的例子，可列举出:N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺(EDC)、N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)、1-叔丁基-3-乙基碳二亚胺(BEC)、N,N'-二-叔丁基碳二亚胺、1,3-二-对甲苯基碳二亚胺、双(2,6-二异丙基异丙基苯基)碳二亚胺、双(三甲基硅基)碳二亚胺、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基甲基)碳二亚胺(BDDC)、或它们的盐。
(内酯化反应中的添加剂)
为了促进由脱水缩合剂引起的脱水缩合,并且抑制副反应,优选除了碳二亚胺以外还使用亲核性高的添加剂。作为亲核性高的添加剂,优选使用1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-苯并三唑(HOAt)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、2-氰基-2-(羟基亚氨基)乙酸乙酯(CHA)、N-羟基琥珀酰亚胺(Hosu)、6-氯-1-羟基-苯并三唑(Cl-HoBt)、N-羟基-3,4-二氢-4-氧代-1,2,3-苯并三嗪(HOOBt)等。
(内酯化反应中的亲核剂)
作为亲核剂使用的胺优选包含含有2个以上碳原子的烷基伯胺和/或烷基仲胺。烷基伯胺优选为乙胺、丙胺、异丙胺、丁胺、仲丁胺、叔丁胺等。烷基仲胺优选为二甲胺、乙基甲胺、二乙胺、丙基甲胺、异丙基甲胺等。从如α2,3-唾液酸的羧基那样存在于位阻较大的部位的羧基不易被酰胺化的观点来看,优选使用如异丙胺那样的具有支链烷基的胺。在内酯化反应溶液的亲核剂中使用胺的情况下,基于唾液酸的结合方式,α2,6-唾液酸等的一部分的唾液酸的羧基被酰胺化。
作为亲核剂使用的醇没有特别限定,例如可以使用甲醇以及乙醇等。在内酯化反应溶液的亲核剂中使用醇的情况下,基于唾液酸的结合方式,α2,6-唾液酸等的一部分的唾液酸的羧基被酯化。
另外,亲核剂也可以包括上述亲核剂的盐。
(进行内酯化反应的相)
内酯化反应可以在液相中实施，也可以在固相中实施。在液相中进行反应的情况下,优选在二甲基亚砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)等非水系溶剂中进行反应。通过在非水溶剂中进行反应,具有抑制副反应的倾向,适合于将糖肽或糖蛋白作为试样的情况。液相反应中的各成分的浓度没有特别限定,能够根据脱水缩合剂或胺的种类等适当决定。内酯化反应溶液的脱水缩合剂的浓度例如优选为1mM～5M,更优选为10mM～3M。在并用碳二亚胺和HOAt或HOBt等亲核性高的添加剂时,各自的浓度优选为上述范围。内酯化反应溶液的胺的浓度优选为0.01M～20M,更优选为0.1M～10M。内酯化反应时的反应温度优选为-20℃～100℃左右,更优选为-10℃～50℃。
在固相中进行内酯化反应的情况下,固相载体只要能够固定糖链、糖肽、糖蛋白等,就没有特别限定。例如,为了固定糖肽或糖蛋白,能够使用具有环氧基、甲苯磺酰基、羧基、氨基等作为配体的固相载体。此外,为了固定糖链,能够使用具有酰肼基或氨基氧基等作为配体的固相载体。通过在将试样固定于固相载体的状态下进行反应,从而使内酯化反应后的内酯化反应溶液的除去等变得更容易。
如果步骤S1003结束,则进入步骤S1005。
另外,优选进行用于从内酯化反应后的试样中除去内酯化反应溶液的操作。关于用于除去内酯化反应溶液的操作,只要能够使内酯化反应所需的成分的浓度充分降低,就没有特别限定，例如通过离心等从与固相载体结合的糖链分离反应溶液,使用清洗溶液进行清洗；或通过离心浓缩使试样干燥固化等。
(酰胺化反应)
在步骤S1005中,进行如下的酰胺化反应：使试样与用于使内酯酰胺化的反应溶液(以下,称为酰胺化反应溶液)接触,使被内酯化的唾液酸的内酯酰胺化的酰胺化反应(以下,在记载为酰胺化反应的情况下,只要没有特别说明,则是指步骤S1005的酰胺化反应)。发明人等发现了使内酯迅速地直接酰胺化的方法，其与以往进行的通过水解使内酯开环后再使羧基酰胺化的技术常识完全不同。该反应如后述那样即使在无水条件下也适合进行,因此被认为是与水解不同的反应,其是基于氨基与内酯的相互作用的氨解。以下,将即使在无水条件下也能进行的、基于氨、胺或它们的盐的内酯的开环以及酰胺化称为氨解。
酰胺化反应溶液包含从由氨、胺及它们的盐组成的组中选择的至少一种。在使用胺的情况下,使用与内酯化反应溶液所使用的胺不同的胺,或利用基于稳定性同位素的修饰等使质量不同。在酰胺化反应中并不需要脱水缩合剂,可以不含有脱水缩合剂。优选的是：酰胺化反应仅通过使试样与酰胺化反应溶液接触来进行。
另外,虽然在酰胺化反应中并不需要脱水缩合剂,但也可以在酰胺化反应溶液中含有脱水缩合剂。例如,也可以不除去在步骤S1003中添加到试样中的内酯化反应溶液,而加入氨、胺或它们的盐,由此制备酰胺化反应溶液。像这样地,在酰胺化反应中,可通过简便的操作使内酯稳定化。
(酰胺化反应中的胺)
酰胺化反应溶液所含的胺优选为伯胺,更优选具有直链烃基的伯胺,进一步优选具有直链烷基的伯胺。在酰胺化反应溶液所含的胺中,作为具有直链烷基的伯胺,优选碳原子数为10以下的伯胺,更优选碳原子数为7以下的伯胺,进一步优选甲胺、乙胺、丙胺、丁胺、戊胺,最优选甲胺。酰胺化反应溶液所含的胺具有没有支链(以下,“支链”表示烃链的支链)的直链状的结构或碳原子数较少时，能够更有效地被酰胺化,因此优选。
在酰胺化反应溶液所含的胺为具有不饱和链式烃基的伯胺的情况下,该不饱和链式烃基优选含有双键,该不饱和链式烃基更优选含有烯丙(Allyl)基,该胺最优选为烯丙基胺(Allylamine)。酰胺化反应溶液所含的胺可以是含有羟基的伯胺,在该情况下,优选乙醇胺。虽然在后述的实施例中示出了酰胺化反应溶液所含的胺含有烯丙基或羟基时的例子,但不特别限于该例子,酰胺化反应溶液所含的胺也可以含有除烷基以外的各种各样的官能团。糖链酰胺化反应的结果是被修饰为含有这样的官能团,从而不仅通过质谱分析更容易分离受到该修饰的糖链,而且通过色谱法等也更容易分离受到该修饰的糖链。
另外,酰胺化反应溶液也可以含有上述的胺的盐。
(酰胺化反应溶液的浓度)
酰胺化反应溶液中的氨、胺及它们的盐的浓度优选为0.1M(M为mol/l)以上,更优选为0.3M以上,进一步优选为0.5M以上,进而优选为1.0M以上，最优选为3.0M以上。作为适合的例子,酰胺化反应溶液含有氨或伯胺、尤其是甲胺,该氨或甲胺等伯胺的浓度优选为0.1M以上,更优选为0.3M以上,进一步优选为0.5M以上,进而优选为1.0M以上，最优选为3.0M以上。酰胺化反应溶液的浓度越高,越能够更可靠地进行内酯的酰胺化。
(酰胺化反应溶液的溶剂)
酰胺化反应溶液的溶剂可以是水系溶剂,也可以是有机溶剂,但从防止内酯的水解并可靠地引起迅速的酰胺化的观点来看,优选含水量少的溶剂。酰胺化反应溶液的溶剂优选为增加了抑制含水量的脱水操作的脱水溶剂,进一步优选为无水溶剂。酰胺化反应溶液的溶剂优选含有甲醇以及乙腈中的至少一种。
另外,酰胺化反应溶液可以含有适当量的水,酰胺化反应溶液的溶剂也可以是水。
(酰胺化反应溶液的pH)
酰胺化反应溶液的pH优选为7.7以上,更优选为8.0以上,进一步优选为8.8以上,最优选为10.3以上。若酰胺化反应溶液的pH变高,则内酯更可靠地被酰胺化,因此优选。
(用于引起酰胺化反应的时间)
酰胺化反应在数秒～数分钟以内完成。因此,为了通过酰胺化反应使内酯酰胺化,使试样与酰胺化反应溶液接触的时间(以下称为反应时间)优选小于1小时,更优选小于30分钟,进一步优选小于15分钟,进而优选小于5分钟,最优选小于1分钟。也适合仅用酰胺化反应溶液清洗试样、或对保持于载体等的试样暂时通液。此外,在试样与内酯化反应溶液的接触结束后,直至试样与酰胺化反应溶液的接触结束为止的时间优选小于1个半小时,更优选小于1小时,进一步优选小于30分钟。像这样,酰胺化反应在短时间内完成,因此能够防止不稳定的内酯分解而损害糖链解析的定量性。此外,通过将酰胺化反应的反应时间设定得较短,能够更有效地进行试样的解析。
(关于酰胺化反应中的试样的状态)
酰胺化反应能够在液相中进行，也能够在固相中进行。只要能够使试样与酰胺化反应溶液接触,则引起酰胺化反应时的试样的状态就没有特别地限定,但优选使试样中所含的糖链在结合或吸附于固相载体的状态下与酰胺化反应溶液接触。
与内酯化反应的情况同样地,在以固相进行反应的情况下,作为固相载体,只要是能够固定糖链、糖肽、糖蛋白等的载体,就可以没有特别限制地使用。例如,为了固定糖肽或糖蛋白,能够使用具有环氧基、甲苯磺酰基、羧基、氨基等作为配体的固相载体。此外,为了固定糖链,能够使用具有酰肼基或氨基氧基等作为配体的固相载体。此外,从酰胺化后的离子化效率等观点来看,还优选使糖链吸附于亲水性相互作用色谱(以下称为HILIC)用的载体、即固定相,该HILIC用的载体进一步优选含有酰胺基。
使酰胺化反应溶液作用于固定在固相载体上的试样而进行酰胺化之后，只要通过化学方法或酶反应等使试样从载体游离并回收即可。例如,可以通过PNGaseF等糖苷酶或胰蛋白酶等消化酶对固定于载体的糖蛋白或糖肽进行酶切断并回收,也可以通过弱酸性溶液使与具有酰肼基的固相载体结合的糖链游离并回收。在HILIC中,可以利用以乙腈等为溶剂的酰胺化反应溶液进行酰胺化反应,并且可以利用水等水系溶液洗脱试样。
在将试样固定于固相载体的状态下进行反应,由此反应溶液的除去或脱盐纯化变得更容易,能够简化试样的制备。此外,在使用固相载体的情况下,在糖蛋白或糖肽的状态下固定试样,在酰胺化反应后,如果通过PNGaseF等糖苷酶等进行切断,则也可以将酰胺化反应后的试样作为游离糖链进行回收。
另外,也可以在利用HILIC对内酯化后的试样进行纯化并洗脱之后供于酰胺化反应。为了不容易引起水解,优选适当调整清洗HILIC用的载体的溶剂。
作为本实施方式的试样的制备方法的适合的一例,如实施例所示,本发明人等发现了吸附在固相载体上的糖链发生氨解。
通过上述的制备方法,在试样中的糖链含有α2,3-、α2,8-以及α2,9-唾液酸的情况下,在步骤S1003的内酯化反应中,各自的唾液酸被内酯化,被内酯化的唾液酸通过步骤S1005的酰胺化反应被酰胺化从而稳定化。
如果步骤S1005结束,则进入步骤S1007。
在步骤S1007中,通过质谱分析和/或色谱法对试样进行分析。通过上述的内酯化反应及酰胺化反应,像α2,6-唾液酸那样难以内酯化的糖链的质量与α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸、α2,9-唾液酸等可内酯化的糖链的质量不同。因此,通过质谱分析,能够基于唾液酸的结合方式分离这些糖链。
质谱分析中的离子化的方法没有特别限定,可以使用基质辅助激光解吸离子化(MALDI)法、电喷雾(ESI)法、纳米电喷雾离子化(nano-LSI)法等。离子化的方法特别优选MALDI法。在质谱分析中的离子化中,可以使用正离子模式以及负离子模式中的任一种。质谱分析可以以多阶段进行,由此能够解析唾液酸的结合方式以外的糖链的结构、肽链的结构。
此外,也可以基于内酯化反应以及酰胺化反应的结果产生的修饰体的特性而利用色谱法等除质谱分析以外的分析方法等进行分析。用于液相色谱法的色谱柱没有特别限定,能够适当使用C30、C18、C8、C4等疏水性反相色谱柱、碳色谱柱、HILIC用的正相色谱柱等。在进行液相色谱分析后,为了更精密地进行试样中的成分的分析,优选通过质谱分析进行测定。在该情况下,更优选通过在线控制将来自液相色谱仪的洗脱液在质谱分析计中直接离子化。
如果步骤S1007结束,则结束处理。
(关于抑制糖肽以及糖蛋白的副反应)
在糖肽或者糖蛋白中加入内酯化反应溶液以及酰胺化反应溶液,如上述那样地修饰了唾液酸的情况下,有时会在糖肽或者糖蛋白所含的氨基酸的侧链、或与位于主链的末端的氨基或羧基之间引起分子内脱水缩合等副反应。在这种情况下,存在与分析对象的糖链对应的质谱的峰被分开而使解析变得困难的问题。
发明人等明确了肽部分的副反应主要来源于氨基的存在,并且明确了通过在唾液酸修饰前预先通过化学修饰等使氨基封端,能够抑制在唾液酸修饰时肽部分的副反应。详细内容参照以下的文献：西风隆司、关谷祯规、岩本慎一、田中耕一，“关于糖肽上的唾液酸的结合特异性衍生化的通用方法(AUniversalApproachtolinkage-SpecificDerivatizationforSialic AcidsonGlycopeptides)”，美国质谱学会志，2017年6月，第28卷，第1期增印，海报编号MP091。本实施方式的基于酰胺化反应的修饰也能够与此同样地用于糖肽以及糖蛋白。即,对糖肽或者糖蛋白进行二甲酰胺化或胍基化等使氨基封端的反应,接着进行内酯化反应,接着进行基于酰胺化反应的迅速酰胺化。此时,如果使用根据唾液酸的结合方式形成内酯的方法,则也能够识别唾液酸的结合方式。
另外,在糖肽中有在基于氨基酸序列的特性上而难以产生副反应的糖肽。例如,通过利用胰蛋白酶等消化酶消化IgG的Fc区域而生成的糖肽不具有赖氨酸,N末端的氨基也在脱水缩合剂的存在下迅速地环化脱水而焦谷氨酰基(pyroglutamyl)化。其结果是,由于不存在氨基,因此不需要二甲酰胺化或胍基化等事先的氨基的封端。关于这样的糖肽,不进行氨基的封端而进行内酯化反应,通过酰胺化反应使产生的内酯酰胺化,可以得到足以用于解析的质谱。
[实施例]
以下,示出本实施方式的实施例,但本发明并不限定于下述的实施例。另外,在以下内容中,只要没有特别说明,则％的记载表示重量％。
<酰胺化反应中的胺的浓度的研究>
作为试样,使用通过PNGaseF从结合有α2,3-唾液酸的唾液酸糖肽(α2,3-SGP；伏见制药所)切出糖链而使其游离的物质。唾液酸糖肽是将糖链结合至多个残基的肽而得到的。试样结合至由具有酰肼基作为配体的磁珠构成的固相载体(BlotGlyco；住友电木株式会社)。糖链与固相载体的结合按照糖链纯化试剂盒BlotGlyco的标准实验方案进行。
使用200μL的DMSO将结合糖链后的载体清洗3次。然后,加入含有异丙胺的100μL的内酯化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、500mMEDC-HCl、500mMHOBt),一边以800rpm轻轻搅拌一边使其反应1小时。(由此,α2,6-唾液酸被转化为异丙酰胺,α2,3-唾液酸被转化为内酯体。)通过离心除去反应溶液后,使用200μL的甲醇进行1次清洗。然后,使用200μL的甲胺水溶液(浓度0.1％～10％)清洗3次,由此进行内酯的酰胺化反应。接着,使用200μL的甲醇清洗2次,再使用200μL的水清洗3次。然后,利用按照标准实验方案的方法使反应后的糖链试样从载体游离,使用StageTipCarbon进行脱盐纯化,利用离心浓缩(SpeedVac(赛默飞世尔科技))使其干燥固化。StageTipCarbon是将EmporeDiskCarbon(3M制)切下直径约1mm、填塞到200μL的尖端中的碳柱。使干燥固化后的试样再溶解于10μL的水中,向聚焦板滴下1μL，作为基质,加入溶解于50％乙腈(ACN)的100mM3AQ/CA、2mM硫酸铵0.5μL后,使其在75℃的微量恒温仪(HeatBlock)上反应1.5小时,进行基于3AQ的糖链的还原末端的标签化。反应结束后,将板冷却至室温,通过MALDI-QIT-TOF-MS(AXIMA-Resonance,岛津/克雷托斯(Shimadzu/Kratos)),在负离子模式下进行飞行时间型的质谱分析。
图2是表示将1％(a)以及10％(b)的甲胺水溶液作为酰胺化反应溶液而引起氨解时的质谱的图。从作为试样的α2,3-SGP游离的α2,3-A2-聚糖(glycan),通过上述的内酯化反应溶液进行分子内脱水缩合而转化为内酯体。在此,之后不使用脱水缩合剂而仅用甲胺溶液清洗酰肼磁珠,但可知原本为内酯的结构发生了甲酰胺化(相当于m/z2471.9的峰)。在m/z2360.9观测到的峰是一处未结合甲胺而成为羧基的峰。推测该峰与发生水解而并非发生内酯的氨解的糖链相对应。在使用了10％甲胺水溶液的酰胺化反应中,来自该水解的峰进一步变小,几乎完全仅发生氨解。
图3是表示相对于酰胺化反应溶液中的甲胺的浓度的、根据质谱上的峰的信号强度计算出的发生了水解的唾液酸与发生了氨解的唾液酸的比例(氨解效率)的图表。可知即使在甲胺溶液的浓度为1％的情况下也引起了充分的氨解,但通过使用含有更高浓度的甲胺的酰胺化反应溶液,能够更高效地引起氨解。
<酰胺化反应中的胺的种类的研究>
图4是表示在与关于胺浓度的上述研究大致相同的条件下分别使用3M的氨水或者烷基胺水溶液(在甲胺的情况下,相当于10％浓度)作为酰胺化反应溶液而进行酰胺化反应时的生成比的图表。
若观察图4的结果,则在不具有氨以及支链的烷基伯胺的情况下,虽然高效地引起氨解,但异丙胺、叔丁胺等具有支链的烷基胺的氨解效率较低,水解(生成-COOH)占优势。此外,在酰胺化反应溶液中使用叔胺的情况下,即便在脱水缩合剂下也不反应,因此仅发生水解,而在使用仲胺的情况也几乎不反应,水解占优势地位。此外,对于烯丙基胺与乙醇胺,氨解占优势地位。因此可知：只要是至少在烃链部分不具有支链的伯胺就可以含有其他的官能团，也可以含有双键或羟基。根据以上内容可知：为了引起氨解,特别适合的是在碳链上不具有支链的伯胺。
<酰胺化反应中的溶剂的研究>
图5是表示在与上述研究大致相同的条件下使用溶解于90％ACN的1.2M甲胺、溶解于甲醇中的3M甲胺、或者溶解于ACN的3M乙醇胺等作为酰胺化反应溶液时的生成比的图表。
若观察图5的结果,则能够观测到在所有情况下都以较高比例引起了氨解,与被酰胺化的糖链对应的峰占优势地位。即使是溶解于实质上不含水的状态下的甲醇或ACN的胺中也没有问题地引起了酰胺化,因此,强烈暗示着内酯并非暂时水解后再酰胺化,而是胺直接作用于内酯而引起酰胺化的氨解。在实质上不含水的条件下,水解被进一步抑制,即使在将在水溶剂中以5％左右的唾液酸发生水解的乙醇胺用于酰胺化反应溶液的情况下,也几乎完全被酰胺化。
<酰胺化反应中的pH的研究>
图6是表示在与上述研究大致相同的条件下使用以任意的比例混合了3M甲胺水溶液与3M甲胺盐酸盐水溶液的溶液作为酰胺化反应溶液时的生成比的图表。图6的“MA”表示甲胺水溶液,“MA-HCl”表示甲胺盐酸盐水溶液。
在本研究中,假设即使将酰胺化反应溶液加入至试样后,在一部分的条件下,α2，3-唾液酸仍以具有内酯的状态残留。因此,为了进一步定量地评价不稳定的内酯,将酰胺化反应溶液加入至试样进行酰胺化反应后,用200μL的H2O清洗2次,并以200μL的ACN清洗2次，然后利用含有溶解于ACN中的3M乙醇胺的酰胺化反应溶液再一次进行酰胺化反应。在这两阶段进行的酰胺化反应的条件下,可以明确地区别在第一阶段的酰胺化反应中酰胺化后的物质(以甲酰胺化体进行检测)、水解后的物质(以-COOH进行检测)、以及以内酯的状态残留的物质(以与乙醇胺的酰胺化体进行检测)。另外,本研究中的酰胺化反应并非如迄今为止那样地利用200μL的酰胺化反应溶液清洗3次,而是加入100μL的酰胺化反应溶液并以700rpm搅拌2分钟来进行。
若观察图6的结果,则在不加入酰胺化反应溶液的情况下(“withoutaminolysis”)或将3M甲胺盐酸盐溶液(pH4.7)作为酰胺化反应溶液的情况下,几乎不引起氨解,唾液酸实质上全处于内酯的状态。如果增加制备酰胺化反应溶液时的甲胺溶液的比例来提高pH,则唾液酸缓缓地发生水解与氨解,在pH为8.8时，90％左右的唾液酸被酰胺化,在pH为10.3以上的酰胺化反应溶液中唾液酸实质上全部被酰胺化。
<将从胎球蛋白(fetuin)游离的糖链作为试样的酰胺化反应的研究>
将作为糖蛋白的胎球蛋白溶解于20mM碳酸氢铵、10mMDTT、0.02％SDS中,在100℃下处理3分钟,使其变性/还原。然后,冷却至室温,加入PNGaseF,在37℃下培养过夜,使糖链游离。次日,在100℃下进行3分钟热处理,使PNGaseF失活,由此使酶反应停止。
游离的糖链与上述研究同样地进行在酰肼磁珠上的结合和使用了含有异丙胺的内酯化反应溶液的结合方式特异性修饰,接着进行基于10％甲胺水溶液的酰胺化反应。利用与上述研究同样的方法进行从磁珠的洗脱或利用质谱分析的检测。
图7是从胎球蛋白游离的糖链的质谱。与各峰相对应地表示的数字中，左侧的数字表示与峰对应的分子包含的α2,3-唾液酸的数量,右侧的数字表示该分子包含的α2,6-唾液酸的数量。可知：未检测到由水解产生的生成物或未反应体,经内酯化的唾液酸被高效地甲酰胺化。如果将该质谱与在专利文献1或非专利文献1中报告的质谱进行比较,则可知即使不进行使用了脱水缩合剂的酰胺化反应,通过氨解,内酯也被高效地直接甲酰胺化。
<将糖脂型糖链作为试样的酰胺化反应的研究>
作为试样,使用作为鞘糖脂的HumanDisialoganglioside(双唾液酸神经节苷酯)GD1a以及GD1b(HyTest)。将上述糖脂溶解于45μL的含有0.2％Tritonx100的50mM乙酸钠缓冲液(pH5.5)中,在60℃下放置20分钟后,加入EndoglycoceramidaseI(参考以下文献而从放线菌纯化得到的物质；IshibashiY，NakasoneT，KiyoharaM，HoribataY，Sakaguchi K，HijikataA，IchinoseS，OmoriA，YasuiY，ImamuraA，Ishida H，KisoM，OkinoN以及ItoM.，《一种新型的神经节苷酯内切糖苷酶水解寡聚半乳糖神经酰胺以生产低聚半乳糖和神经酰胺(Anovel endoglycoceramidasehydrolyzesoligogalactosylceramidesto producegalactooligosaccharidesandceramides)》，生物化学杂质(JournalofBiologicalChemistry)，2007年，第282卷，第11386-11396页),在37℃下进行16小时的糖链消去反应。
游离的糖脂型糖链与上述研究同样地按照BlotGlyco标准实验方案进行在酰肼载体上的结合、剩余酰肼基的封端(capping),接着进行使用异丙胺的唾液酸的结合方式特异性修饰。接着,通过使用200μL的1％甲胺水溶液清洗3次,进行酰胺化反应后,将酰肼载体使用200μL的DMSO清洗3次,使用200μL的甲醇清洗3次,再使用200μL的水清洗3次。然后,在从载体游离的同时使用高灵敏度化试剂aoWR对糖链的还原末端进行标记。然后,利用HILIC载体去除多余试剂,将2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)作为基质,通过MALDI法对试样进行离子化,在正离子模式下通过飞行时间型质谱分析(MALDI-TOFMS)取得质谱。
图8是表示得到的糖脂型糖链的质谱的图。上段为从鞘糖脂双唾液酸神经节苷酯GD1a游离的糖链的质谱,下段为从双唾液酸神经节苷酯GD1b游离的糖链的质谱。在两处具有α2,3-唾液酸的GD1a糖链的情况下,在m/z1746能观测到信号。这相当于两处的α2,3-唾液酸均被甲酰胺化的质量。由此可知：通过氨解,糖脂型糖链也经由内酯而同样地进行甲酰胺化。此外,在GD1b型的情况下,也与GD1a型同样地能在m/z1746观测到信号,两处的唾液酸均被甲酰胺化。GD1b型具有直线型多唾液酸(polysialicacid)结构,该结构具有α2,3-唾液酸和与该α2,3-唾液酸结合的α2,8-唾液酸，但由于两者的唾液酸被甲酰胺化,因此暗示着：即便是由α2,8-唾液酸生成的内酯，本发明的氨解也可以没有问题地进行。
<HILIC载体上的酰胺化反应的研究>
将α2,3-SGP溶解于20mM碳酸氢铵,加入PNGaseF,在37℃下培养过夜,由此使糖链游离。次日,在100℃下进行3分钟热处理,使PNGaseF失活,由此使酶反应停止。然后,利用StageTipCarbon进行脱盐处理,利用SpeedVac使其在Eppendorf离心管内干燥固化。
然后,加入含有20μL的异丙胺的内酯化反应溶液(2M异丙胺盐酸盐、500mMEDC-HCl、500mMHOBt),一边以2000rpm搅拌一边使其反应1小时。(由此,α2,6-唾液酸被转化为异丙酰胺,α2,3-唾液酸被转化为内酯体。)之后,使用120μLACN进行稀释,加入至GLTipAmide(GLscience)中,以4000xg进行离心,由此进行通液，使糖链吸附于含有酰胺基的HILIC用的载体。然后,将20～200μL的90％ACN4％甲胺溶液作为酰胺化反应溶液而进行通液,从而进行了酰胺化反应。进而,通过使100μL的90％ACN0.1％TFA通液2次来进行清洗,最后将20μLH2O通液2次而使糖链洗脱,用SpeedVac将洗脱液干燥固化。然后,进一步利用StageTipCarbon进行脱盐操作,如上述研究那样进行靶上3AQ化(ontarget3AQ化),进行质谱分析。
图9的(a)～(d)是表示各酰胺化反应溶液的量与生成比的图表。在所有(a)～(d)的情况下,能够确认到几乎完全地进行了氨解。在将酰胺化反应溶液减少至20μL的状态下,认为载体与酰胺化反应溶液接触的时间长达数十秒左右,暗示着氨解的反应极其迅速地发生。
<使用HILIC的纯化后的酰胺化反应的研究>
通过与上述研究同样的操作,从α2,3-SGP切出糖链并使其游离,将含有异丙胺的内酯化反应溶液添加至该糖链并使其反应,加入ACN进行稀释,使其吸附在HILIC载体上。然后,通过将100μL的90％ACN0.1％TFA溶液通液2次来清洗,最后将20μL的H2O通液2次来使糖链洗脱。向其中加入40％甲胺水溶液6.7μL,制成最终浓度为10％的甲胺的酰胺化反应溶液,轻轻搅拌后在室温下静置2分钟,进行酰胺化反应。然后,利用SpeedVac除去溶剂,进一步用StageTipCarbon进行脱盐操作,如上述研究那样使用靶上3AQ化来进行质谱分析。
结果示于图9(e)。试样中的内酯大致被甲酰胺化,但也检测出了由水解产生的生成物。其原因可以解释为：在通过HILIC载体除去含有异丙胺的内酯化反应溶液后,在清洗载体的过程中内酯的一部分水解。因此,也可以在从HILIC载体洗脱的试样中加入酰胺化反应溶液,但从实质上使全部的内酯发生氨解、并使反应效率最大化的观点来看,优选在使试样吸附于HILIC载体的状态下加入酰胺化反应溶液。
本发明并不限定于上述实施方式的内容。在本发明的技术思想的范围内想到的其他方式也包含在本发明的范围内。

Claims (19)

1.一种试样的制备方法，是制备含有糖链的试样的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
进行内酯化反应，所述内酯化反应使所述糖链所含的唾液酸的至少一部分内酯化；和
进行酰胺化反应，所述酰胺化反应将酰胺化反应溶液加入至所述试样中而使所述已内酯化的所述唾液酸的内酯酰胺化，所述酰胺化反应溶液含有从由与内酯化的所述唾液酸反应的氨、胺及它们的盐组成的组中选择的至少一种。
2.如权利要求1所述的试样的制备方法，其特征在于，还包括以下步骤：
在所述内酯化反应之后,进行从所述试样去除用于所述内酯化反应的内酯化反应溶液的操作。
3.如权利要求1所述的试样的制备方法，其特征在于，
所述酰胺化反应仅通过使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触来进行。
4.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，所述酰胺化反应溶液不含有与所述内酯反应的脱水缩合剂。
5.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，在所述试样中加入所述酰胺化反应溶液后,不进行使所述试样与脱水缩合剂反应的操作。
6.如权利要求1所述的试样的制备方法，其特征在于，
为了进行所述酰胺化反应而使所述试样与所述酰胺化反应溶液接触的时间短于30分钟。
7.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，所述胺为伯胺。
8.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，所述胺包含烷基。
9.如权利要求8所述的试样的制备方法，其特征在于，
所述烷基不具有支链。
10.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，
所述胺包含烯丙基以及羟基中的至少一种。
11.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，
所述酰胺化反应溶液的pH为8.0以上。
12.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，
在进行所述内酯化反应时,将内酯化反应溶液加入至所述试样中，使所述唾液酸的至少一部分内酯化，所述内酯化反应溶液含有与所述糖链所含的所述唾液酸反应的脱水缩合剂。
13.如权利要求12所述的试样的制备方法，其特征在于，
所述内酯化反应溶液还含有与所述糖链所含的所述唾液酸反应的亲核剂，
所述亲核剂的质量与所述酰胺化反应中使用的所述氨以及所述胺的质量不同，
在所述试样中加入所述内酯化反应溶液,基于所述唾液酸的结合方式,使所述唾液酸的一部分内酯化,使所述亲核剂的至少一部分与所述唾液酸的另一部分结合。
14.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，
在所述内酯化反应中,从由α2,3-唾液酸、α2,8-唾液酸以及2,9-唾液酸组成的组中选择的至少一种所述唾液酸被内酯化。
15.如权利要求13所述的试样的制备方法，其特征在于，
将所述内酯化反应溶液加入至所述试样中,使α2,3-唾液酸内酯化,使所述亲核剂的一部分与α2,6-唾液酸结合。
16.如权利要求1所述的试样的制备方法,其特征在于，
所述试样与所述酰胺化反应溶液的接触是在所述试样结合或吸附于固相载体的状态下进行的。
17.如权利要求1～16中任一项所述的试样的制备方法，其特征在于，
所述酰胺化反应溶液的溶剂含有有机溶剂。
18.一种分析方法,其特征在于,包括以下步骤：通过如权利要求1～17中任一项所述的试样的制备方法来制备试样；和对制备成的所述试样进行分析。
19.如权利要求18所述的分析方法，其特征在于,通过质谱分析以及色谱法中的至少一种对制备成的所述试样进行分析。
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