KR20060129411A - 이온 채널 - Google Patents

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KR20060129411A
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니콜라 브라이스
존 딕슨
소피 메사저
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패러다임 테라퓨틱스 리미티드
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Abstract

본 발명은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 기능적으로 분열된 내인성 TrpM8 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물을 개시한다.
Figure 112006061524918-PCT00003
TrpM8, 이온 채널, 핵산, 폴리펩타이드, 작용제, 길항제

Description

이온 채널{Ion channel}
본 발명은 신규하게 확인된 핵산, 그에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 및 그의 제조 및 이용에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명의 핵산 및 폴리펩타이드는 이하 "TrpM8" 또는 "TrpM8 채널"로 표기된 이온 채널에 관한 것이다. 또한 본 발명은 이러한 핵산 및 폴리펩타이드 작용의 억제 또는 활성화에 관한 것이다.
포유류 신경계는 항상성을 유지하고 극단적인 열을 방지하기 위해 내부 및 환경 온도를 지속적으로 검토한다. 일시적 수용체 전위(Transient receptor potential, TRP) 채널은 외인성 자극, 캅사이신(capsaicin)뿐만 아니라 기계적 자극, 삼투성, pH 및 온도의 변화을 포함한 다양한 인자에 의해 활성화된 양이온성 채널을 형성한다. 이들 특성화된 감각 수용체는 후근절(dorsal root ganglia, DRG)에서 발견된다.
이온 채널의 일시적 수용체 전위(TRP) 패밀리의 일부 멤버는 열에 의해 활성화되는 TRPV1 및 TRPV2 및 냉기에 의해 활성화되는 TRPM8을 포함한 열 자극의 변환기와 관련되었다.
래트 유래의 냉기- 및 멘톨-민감성 수용체(CMRI)가 최근 클론되었다(McKemy D.D., Neuhausser W.M., and Julius, D.: Identification of a cold receptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation. Nature 416:5258, 2002). 이러한 수용체는 삼차신경절 및 후근절 내의 작은-직경 뉴런에 의해 발현되는 흥분성 이온 채널이다. 이러한 채널 수용체는 동일한 감각의 냉기를 유도하는 냉기 온도(8∼28℃) 및 열 반응성 수용체의 화학 작용제로서 멘톨에 의해 활성화된다. CNIR1은 유독성 열에 반응하고 척수 및 뇌로 감각 정보를 전달하는 다른 온도수용체인 -VR1 및 VRL1과 유사한 일시적 수용체 전위(TRP) 채널 서브패밀리의 멤버에 속한다(brain [Nagy L, Rang H.. Noxious heat activates all capsaicin-sensitive and also a sub-population of capsaicin insensitive dorsal root ganglion neurons. Neuroscience 88:995-997, 1999; Cesare P., McNaughton P.: A novel heat-activated current in nociceptive neurons and its sensitization by bradykinin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:1543 5-1543% 1996).
최근 배양된 후근절 및 삼차신경절 뉴런의 전기생리학 연구는 다수의 이온 메커니즘이 한랭 온도의 말초적 감지의 기초가 됨을 제안하였다. 모두 이온 채널 단백질인 일부 후보 "한랭 수용체"는 이러한 과정에 관련되었다. 하나의 후보는 온도 감소 및 냉각 화합물 멘톨 모두에 의해 활성화되는 감각 뉴런의 부차 집단 내에서 발현되는 비선택성 양이온성 채널인 TRPM8이다. 단일-세포 RT-PCR과 결합된 배양 래트 삼차신경절 뉴런의 형광 칼슘 이미지화는 한랭 반응성 뉴런의 별개의 부차 집단이 존재하고 이들 중 하나에서 한랭 변환에 기여함이 증명되었다. TRPM8은 신속한 반응성, 저-역치(30℃ 이하), 한랭-민감성 뉴런의 서브세트 내에서 우선적으로 발현된다.
마우스 TRPM8의 기능은 한랭 자극 및 멘톨에 의해 경비화된 이온 채널로 특성화되었고, 그의 발현은 통증- 및 온도-감지 DRG 뉴런의 부차 집단에 한정되었다(Peiet A.M., Moqrich A., Hergarden A.C., Reeve A.J., Andersson D.A., Story G.M., Earley T.J., Dragoni I., McIntyre P., Bevan S., Patapoutian A.: A TRP Channel that Senses Cold Stimuli and Menthol. Cell 108:705-715, 2002).
본 발명자는 마우스 TrpM8 이온 채널이 유독성 열 자극에 의해 유발되고 다라서 통증에 효과를 지니는 것으로 발견하였다. 또한 본 발명자는 TrpM8 이온 채널의 스트레스 및 불안증에 대한 관련성을 증명한다.
요약
본 발명의 첫 번째 관점에 따라 본 발명자는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 기능적으로 분열된 내인성 TrpM8 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물을 제공한다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 TrpM8 유전자 또는 그의 일부가 결실되었다.
바람직하게는 이는 하기 표현형의 어느 하나 또는 그의 결합을 표시한다: 야생형 대비 (a) 바람직하게는 꼬리-튀기기(tail-flick) 시험으로 측정시 감소된 통증 민감성; (b) 바람직하게는 오픈 필드(open field) 시험으로 측정시 감소된 스트레스; (c) 감소된 혈장 코르티코스테론 수치.
또한 본 발명자는 상기 동물의 TrpM8 유전자의 일부 또는 전부가 또다른 동물, 바람직하게는 또다른 종, 더욱 바람직하게는 인간의 TrpM8 유전자로부터의 서열로 대치된 형질전환 비-인간 동물을 제공한다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 마우스이다.
바람직하게는 형질전환 비-인간 동물은 기능적으로 분열된 TrpM8 유전자, 바람직하게는 TrpM8 유전자의 결실을 포함하고, 상기 TrpM8 유전자는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한다.
본 발명의 두 번째 관점에 따라 본 발명의 첫 번째 관점에 따른 비-인간 형질전환 동물로부터 분리된 세포 또는 조직이 제공된다.
본 발명자는 본 발명의 세 번째 관점에 따라 기능적으로 분열된 내인성 TrpM8 유전자를 지닌 세포를 제공하고, 상기 TrpM8 유전자는 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한다.
본 발명의 네 번째 관점에 있어서, 통증 또는 스트레스에 대한 모델로서 형질전환 비-인간 동물, 세포 또는 조직 또는 상기에 기술된 바에 따른 세포의 이용이 제공된다.
본 발명자는 본 발명의 다섯 번째 관점에 따라 TrpM8 관련 질환에 대한 모델로서 형질전환 비-인간 동물, 세포 또는 조직 또는 상기 기술된 바에 따른 세포의 이용을 제공한다.
본 발명의 일곱 번째 관점에 따라 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에서 상기 기술된 바와 같은 비-인간 형질전환 동물, 그의 분리된 세포 또는 조직의 이용이 제공된다.
본 발명의 여덟 번째 관점에 따라 본 발명자는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 지닌 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법을 제공하고, 상기 방법은 후보 화합물을 동물, 바람직하게는 야생형 동물 또는 상기 기술된 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계 및 하기 표현형의 어느 하나의 변화를 측정하는 단계를 포함한다: (a) 바람직하게는 꼬리-튀기기 시험으로 측정시 통증 민감성; (b) 바람직하게는 오픈 필드 시험으로 측정시 스트레스; (c) 혈장 코르티코스테론 수치.
바람직하게는 본 방법은 상기 동물이 표현형 (a)-(c)의 어느 하나에서의 증가를 나타내게 하는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제를 확인시킨다.
대안으로, 또는 이에 더하여 본 방법은 상기 동물이 표현형 (a)-(c)의 어느 하나를 나타내게 하거나 이러한 표현형을 감소시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 TrpM8 폴리펩타이드의 길항제를 확인시킨다.
본 발명자는 본 발명의 아홉 번째 관점에 따라 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 지닌 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법을 제공하고, 상기 방법은 후보 화합물을 세포 또는 조직, 바람직하게는 야생형 세포 또는 조직 또는 상기 기술된 세포 또는 조직에 투여하는 단계 및 세포 또는 조직의 세포의 전도성 또는 세포내 칼슘 농도 상의 변화를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 본 방법은 세포의 전도성 또는 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제를 확이시킨다.
대안으로, 또는 이에 더하여 본 방법은 세포의 전도성 또는 세포내 칼슘 농도를 감소시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인함으로서 TrpM8 폴리펩타이드의 길항제를 확인시킨다.
본 발명의 열 번째 관점에 따라 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료 또는 완화에 적당한 화합물의 확인 방법이 제공되고, 상기 방법은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 지닌 TrpM8 폴리펩타이드를 후보 화합물에 노출시키는 단계 및 상기 후보 화합물이 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제인지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 열한 번째 관점에서 본 발명자는 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료를 위한 그의 작용제 또는 길항제의 확인시 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 이용을 제공한다.
본 발명자는 본 발명의 열두 번째 관점에서 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료를 위한 그의 작용제 또는 길항제의 확인시 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 이용을 제공한다.
본 발명의 열세 번째 관점에 따라 본 발명자는 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료 방법에서 이용하기 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 길항제를 제공한다.
본 발명의 열네 번째 관점에 따라 개체 내에서 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환에 대한 약제 조성물의 제조를 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 길항제의 이용이 제공된다.
본 발명자는 본 발명의 열다섯 번째 관점에 따라 통증 또는 스트레스에 시달리고, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환에 시달리는 개체의 치료 방법을 제공하고, 상기 방법은 TrpM8의 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명의 열여섯 번째 관점에 따라 본 발명자는 개체 내에서의 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 진단 방법을 제공하고, 상기 방법은 개체 또는 그의 세포 또는 조직 내 TrpM8의 발현, 농도 또는 활성 상의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
바람직하게는 TrpM8 관련 질환은: 통증, 암, 염증, 염증성 장질환, 열 통각과민증, 내장 통증, 편두통, 대상포진후 신경통, 당뇨병성 신경통, 삼차신경통, 수술후 신경통, 골관절염, 류머티즘성관절염, 급성 통증, 만성 통증, 피부 통증, 체성 통증, 내장 통증, 심근허혈을 포함한 연관 통증, 환상 통증, 신경병증성 통증(신경통), 상처, 질환, 두통, 편두통, 암 통증으로부터 유발된 통증, 파킨슨병과 같은 신경계 장애로부터 유발된 통증, 척추 및 말초신경 수술, 뇌종양, 외상성 뇌 손상(TBI), 척수 외상으로부터 유발된 통증, 만성통증증후군, 만성피로증후군, 삼차신경통, 설인신경통, 대상포진후신경통 및 작열통과 같은 신경통, 낭창, 유육종증, 지주막염, 관절염, 류마티즘성 관절염으로부터 유발된 통증, 주기성 통증, 배통, 요통, 관절통, 복통, 흉통, 분만 진통, 근골격 및 피부 질환, 당뇨병, 두부 외상 및 섬유근육통, 유방암, 전립선암, 결장암, 폐암, 난소암 및 골암, 사회불안장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 공포증, 특정 공포증, 공황장애, 강박반응성 장애, 급성 스트레스 장애, 분리불안장애, 범불안장애, 주요우울증, 기분저하증, 양극성 장애, 계절정동장애, 산후 우울증, 조울증, 양극성 우울증으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 열일곱 번째 관점에 따라 본 발명자는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 TrpM8 폴리펩타이드를 제공한다.
본 발명자는 본 발명의 열여덟 번째 관점에 따라 이러한 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산을 제공한다.
바람직하게는 이러한 핵산은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 이에 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한다.
TrpM8 이온 채널
본 발명자는 이온 채널, 특히 TrpM8 이온 채널뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 또는 유도체 및 TrpM8 관련 질환을 포함한 질환의 치료 및 진단시 그의 이용을 기술한다.
TrpM8은 인간 TrpM8를 인코드하는 증폭된 cDNA 생성물의 서열분석 결과에 나타난 바와 같이 이온 채널 패밀리의 다른 단백질에 구조적으로 관련되어 있다. 서열번호: 1의 cDNA 서열은 서열번호: 3에 나타난 1104개 아미노산 서열의 폴리펩타이드를 인코드하는 오픈 리딩 프레임(서열번호: 2, 뉴클레오타이드 수 41∼3352개). 인간 TrpM8는 호모 사피엔스(Homo sapiens) 염색체 2q37에 지도화된 것으로 나타났다.
본 발명의 실시는 특별히 나타내지 않는 한 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이며, 이는 당업자의 능력 내에 존재한다. 이러한 기술은 하기 문헌에 설명되어 있다. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James OD. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice; Oxford University Press; M. J. Gait (Editor), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Lars-Inge Larsson Immunocytochemistry: Theory and Practice, CRC Press inc., Baca Raton, Florida, 1988, ISBN 0-8493-6078-1, John D. Pound (ed); Immunochemical Protocols, vol 80, in the series: Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, New Jersey, 1998, ISBN 0-89603-493-3, Handbook of Drug Screening, edited by Ramakrishna Seethala, Prabhavathi B. Fernandes (2001, New York, NY, Marcel Dekker, ISBN 0-8247-0562-9); Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3; and The Merck Manual of Diagnosis and Therapy (17th Edition, Beers, M. H., and Berkow, R, Eds, ISBN: 0911910107, John Wiley & Sons). 이들 문헌은 참고문헌으로 포함되어 있다.
TrpM8의 확인 및 유사성
pfam(http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)의 HMM 구조 예측 소프트웨어를 이용한 TrpM8 폴리펩타이드(서열번호: 3)의 분석은 TrpM8 펩타이드가 이온 채널임을 확인시켰다.
인간 TrpM8 이온 채널의 마우스 상동체가 클론되었고 그의 핵산 서열 및 아미노산 서열이 각각 서열번호: 4 및 서열번호: 5에 나타나 있다. 서열번호: 4의 마우스 TrpM8 이온 채널 cDNA는 인간 TrpM8 이온 채널(서열번호: 2)과 높은 정도의 동일성을 나타내고, 마우스 TrpM8 이온 채널의 아미노산 서열(서열번호: 5)은 인간 TrpM8 이온 채널(서열번호: 3)과 높은 정도의 동일성 및 유사성을 나타낸다. 따라서 인간 및 마우스 TrpM8 이온 채널은 큰 이온 채널 패밀리의 멤버이다.
TrpM8의 발현 프로파일
TrpM8 cDNA의 중합효소 연쇄 반응(PCR)은 전립선(+++), 간(+++), 근육(+), 고환(++) 및 난소(+) 내에 다양한 정도로 TrpM8의 발현을 검출하였다.
BLASTN에 의한 인간 EST 데이터 출처 검색을 위한 서열번호: 1의 TrpM8 cDNA의 이용시 동일성이 cDNA 라이브러리 내에서 발견되었다. 이는 TrpM8이 이들 정상 또는 비정상 조직내에서 발현됨을 나타낸다.
BE274448.1 인간 피부
BE390627 인간 자궁
AW295430 인간 전립선
BG567490 인간 간
BE791173 인간 소세포암종, 폐, MGC3
BE408880 인간 태반, 융모막암종
BF244389 인간 뇌, 아교모세포종
BG565397 인간 간
BE207083 인간 소세포암종, 폐, MGC3
BE274448 인간 피부, 멜라닌 멜라닌종
BE390627 인간 자궁, 자궁내막, 샘암종 세포주
따라서 TrpM8 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드가 이들 또는 다른 조직 내 TrpM8 이온 채널의 과-, 저- 및 비정상 발현과 관련된 질환의 검출, 진단, 치료 및 분석에 유용하다. 이러한 질환은 하기에 기술된 TrpM8 관련 질환을 포함한다.
TrpM8 이온 채널 관련 질환
여기에 기술된 방법 및 조성물에 따라 TrpM8 이온 채널은 하기 상세하게 기술된 질환 범위를 치료하고 진단하는데 유용하다. 이들 질환은 편의상 TrpM8 관련 질환으로 표기된다.
본 발명자는 인간 TrpM8이 호모 사피엔스 염색체 2q37에 지도화됨을 증명하였다. 따라서 특정한 실시태양에서 TrpM8 이온 채널이 이러한 좌위, 염색체 밴드, 구역, 팔(arm) 또는 동일한 염색체에 지도화된 질환을 치료하고 진단하는데 사용된다. TrpM8 이온 채널의 염색체(즉, 호모 사피엔스 염색체 2q37) 위치와 동일한 좌위, 염색체 밴드, 구역, 팔 또는 염색체에 결합된 것으로 측정된 알려진 질환은 이온 채널이 상향 조절된 것으로 나타난 전립선암을 포함한다.
TrpM8 결함 넉아웃 마우스는 실시예에 증명된 바와 같이 광범위한 표현형을 나타낸다.
특히, 본 발명자는 하기 실시예 4에서 TrpM8 결함 마우스가 통각감퇴성 즉, 통증에 덜 민감함을 개시한다. TrpM8 및 TrpM8의 길항제를 포함한 TrpM8 활성 조절제는 통증이 특징적인 질환 또는 증후군을 치료하거나 완화하는데 사용된다. 특히, 예를 들어 무통/통증감소를 위해 TrpM8의 길항제 또는 차단제의 투여에 의해 TrpM8의 활성 또는 발현이 개체 내에서 하향-조절된다. 따라서 본 발명자는 진통제로 사용하기 위한 TrpM8 길항제의 확인을 개시한다.
따라서 바람직한 실시태양에 따라 TrpM8 이온 채널 및 그의 조절제 및 길항제를 포함한 여기에 기술된 방법 및 조성물은 본 출원서에 기술된 방법에 의해 통증 및 암을 진단하거나 치료하거나 경감시키는데 사용된다. 특히 통증은 신경병증성, 염증성, 염증성 장질환, 열 통각과민증, 내장 통증, 편두통, 대상포진후 신경통, 당뇨병성 신경통, 삼차신경통, 수술후 신경통, 골관절염, 류머티즘성 관절염을 포함한다. 또한 급성 통증, 만성 통증, 피부 통증, 체성 통증, 내장 통증, 심근허혈을 포함한 연관 통증, 환상 통증, 신경병증성 통증(신경통)을 포함한다. 통증의 정의는 상처, 질환, 두통, 편두통, 암 통증으로부터 유발된 통증, 파킨슨병과 같은 신경계 장애로부터 유발된 통증, 척추 및 말초신경 수술, 뇌종양, 외상성 뇌손상(TBI), 척수 외상으로부터 유발된 통증, 만성통증증후군, 만성피로증후군, 삼차신경통, 설인신경통, 대상포진후신경통 및 작열통과 같은 신경통, 낭창, 유육종증, 지주막염, 관절염, 류마티즘성 관절염으로부터 유발된 통증, 주기성 통증, 배통, 요통, 관절통, 복통, 흉통, 분만 진통, 근골격 및 피부 질환, 당뇨병, 두부 외상 및 섬유근육통을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 특히 암은 유방암, 전립선암, 결장암, 폐암, 난소암 및 골암을 포함한다.
실시예 5는 TrpM8 넉아웃 마우스가 야생형보다 덜 불안함을 나타내는 오픈 필드 시험을 기술한다. 더욱이 스트레스 및 불안의 지표인 코르티코스테론 혈장 수치가 야생형 마우스보다 TrpM8 넉아웃 마우스에서 더 낮은 것으로 나타났다(실시예 6). 따라서 TrpM8 활성의 결함이 스트레스 관련 질환과 상호관련된다.
따라서 본 발명자는 개체 내 스트레스 또는 불안 또는 이 둘 모두의 저하 방법을 개시하고, 상기 방법은 개체 내 TrpM8의 수치 및 활성을 감소시키는 단계를 포함한다. 주지된 바와 같이 이는 TrpM8의 발현을 하향-조절함으로서 또는 TrpM8의 길항제를 이용함으로서 달성될 수 있다.
TrpM8 및 TrpM8 길항제를 포함한 TrpM8 활성 조절제는 스트레스 및 불안이 특징인 질환 또는 증후군을 치료하거나 완화하는데 사용된다. 이러한 질환은 사회불안장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 공포증, 특정 공포증, 공황장애, 강박반응성 장애, 급성 스트레스 장애, 분리불안장애, 범불안장애, 주요우울증, 기분저하증, 양극성 장애, 계절정동장애, 산후 우울증, 조울증, 양극성 우울증을 포함한다.
바람직한 실시태양에서 TrpM8 관련 질환은 스트레스 및 불안이 증상인 질환을 포함한다. 더욱 바람직한 실시태양에서 TrpM8 질환은 상기 목록의 불안 및 스트레스 관련 질환을 포함한다.
주지된 바와 같이 TrpM8 이온 채널은 여기서 기술된 방법 및 조성물을 이용하여 이들 특정한 질환의 진단 및/또는 치료에 사용된다.
특히, 본 발명자는 상기 기입된 특정 질환의 치료 또는 진단을 위한 TrpM8 이온 채널 핵산, 폴리펩타이드 및 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 핵산, 벡터, TrpM8 이온 채널 핵산 및/또는 폴리펩타이드를 포함한 약제적 조성물, 숙주 세포 및 형질전환 동물의 이용을 조사하였다. 더욱이 본 발명자는 상기 기술된 특정 질환의 진단 및 치료시 TrpM8 이온 채널과 상호작용하거나 그에 결합하는 것이 가능한 화합물, 바람직하게는 본 채널의 전도성을 감소시키는 것이 가능한 화합물, TrpM8 이온 채널에 대한 항체의 이용뿐만 아니라 이들의 제조 또는 확인 방법을 조사하였다. 특히, 본 발명자는 특정 질환의 치료 또는 예방을 위한 백신 제조시 이들 화합물, 조성물, 분자 등의 이용을 포함하였다. 또한 본 발명자는 개체 내 특정 질환의 검출을 위한 진단 키트를 개시한다.
TrpM8 이온 채널의 이용에 의해 치료 가능하거나 진단 가능한 이러한 또는 또다른 특정 질환을 확인하기 위한 연관 지도화 방법은 당분야에 알려져 있고 본 출원서에 기술되어 있다.
불안 및 스트레스
불안 및 스트레스뿐만 아니라 TrpM8 관련 질환을 포함한 이들이 나타내는 장애는 당분야에 잘 알려져 있다. 요약 설명은 하기와 같다:
불안 및 스트레스는 근심, 긴장, 초조 및 염려와 같은 것으로도 표현된다. 스트레스는 개체가 좌절감, 분노 또는 근심을 느끼게 하는 상황 또는 생각으로부터 유래될 수 있다. 한 사람에게 스트레스가 많은 것이 다른 사람에게도 항상 그런 것은 아니다.
불안은 염려 또는 공포의 감정이다. 이러한 걱정의 근원은 항상 알려지거나 인식되는 것은 아니고, 이는 개인 감정을 고통스럽게 수 있다.
스트레스는 생활의 정상적인 부분이다. 적은 정도의 스트레스는 유익하다 - 이는 개인에게 동기부여를 할 수 있고 더욱 생산적이게 할 수 있다. 그러나 너무 많은 스트레스 또는 스트레스에 대한 강한 반응은 유해하다. 이는 일반적으로 건강을 해치게 할 뿐만 아니라 감염, 심장질환 또는 우울증과 같은 특정한 신체적 또는 정신적 질병을 유발할 수 있다. 지속적인 스트레스는 불안 및 과식과 같은 건강에 해로운 행동 및 알코올 또는 약물의 남용을 유발한다.
비통 또는 우울증과 같은 감정적인 스트레스 또는 과활성 갑상선, 낮은 혈당 또는 심장발작과 같은 건강 이상은 스트레스를 유발할 수 있다.
불안은 경련 또는 전율, 근육 긴장, 두통, 발한, 건조 구강, 삼키기 어려움, 복통(특히 유아의 경우 스트레스의 유일한 증후임)을 포함한 신체적 증후가 동반된다.
일부 다른 증후는 불안을 동반한다: 현기증, 빠르거나 불규칙한 심장박동수, 빠른 호흡, 설사 또는 빈뇨, 피로, 평정심 상실을 포함한 흥분성, 불면증 및 악몽, 집중력 감소 및 성적 문제.
TrpM8 및 그의 조절제는 이들 증후를 치료하거나 완화하는데 사용된다.
불안 장애는 과도한 불안을 포함한 정신의학적 이상의 그룹이다. 이들은 범불안장애, 특정 공포증, 강박반응성 장애 및 사회 공보증을 포함한다. TrpM8 관련 질환은 상기에 기술되어 있다.
기분적환용 및 의약용 모두를 포함한 특정한 약물은 약물의 부장용 또는 투여 중지에 의한 불안 증후를 유발할 수 있다. 이러한 약물은 카페인, 알코올, 니코틴, 감기약, 소염제, 천식용 기관지확장제, 삼환계 항우울제, 코카인, 암페타민, 체중 감량제, ADHD 약물 및 갑상선 약물을 포함한다. 본 발명자는 스트레스 및/또는 불안 유도 효과를 완화하기 위해 이러한 약물과 결합된 TrpM8 및 그의 조절제의 이용을 개시한다.
불충분한 식이는 스트레스 또는 불안을 유발할 수 있다 - 예를 들어 낮은 수치의 비타민 B12. 불안 이행은 시험 수행 또는 대중 앞에서의 발표와 같은 특정한 상황과 관련된다. 외상-후 스트레스 장애(PTSD)는 전쟁, 신체적 또는 성적 폭행 또는 자연 재해와 같은 외상 사고 후 발병된 스트레스 장애이다.
매우 드문 경우에 부신 종양(크롬친화세포종)은 불안의 원인이다. 이는 불안한 감정 또는 증후에 중요한 호르몬의 과생산 때문에 발생한다.
(Medline Plus로부터 변경됨,
http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/003211.htm)
통증
급성 통증
급성 통증은 단-기간 통증 또는 용이하게 확인 가능한 원인을 지닌 통증으로 정의된다. 급성 통증은 조직 또는 질환에 대한 현존하는 손상의 신체 경고이다. 이는 신속하고 날카로우며 쑤시는 통증이 동반된다. 급성 통증은 확장되기 전에 한 구역에 집중된다.
만성 통증
만성 통증은 6개월 이상 지속된 통증으로 의학적으로 정의된다. 이러한 일정하거나 간헐적인 통증은 신체가 손상을 방지하도록 돕지 않기 때문에 그의 목적을 오래 견디게 한다. 만성이 된 통증의 치료를 위해서는 일반적으로 전문적인 치료가 필요하다. 오피오이드가 장기간 약물 내성에 대해 사용되는 경우 화학적 의존 및 정신적 중독이 발생한다. 약물 내성 및 화학적 의존이 오피오이드 사용자들간에 일반적이나 정신적 중독은 드물다.
정신적 통증의 경험은 근원 및 관련 통각수용체(통증 감지 신경)에 따른 4가지 카테고리로 분류될 수 있다.
피부 통증
피부 통증은 피부 또는 표면 조직의 손상에 의해 유발된다. 피부 통각수용체는 피부 바로 아래에서 종결되고, 신경 말단의 높은 집중도에 기인하여 짧은 지속기간의 잘-정의되고 국부화된 통증을 생성한다. 피부 통증을 생성하는 손상의 예는 종이에 벰, 미약한(첫 번째 등급) 화상 및 열상을 포함한다.
체성 통증
체성 통증은 인대, 건, 뼈, 혈관 및 신경 자체로부터 유발되고 체성 통각수용체로 감지된다. 이들 구역 내 통증 수용체의 결핍은 피부 통증보다 더 긴 지속기간의 무디고 불충분하게-국부화된 통증을 생성하고; 예는 발목 염좌 및 탈골을 포함한다.
내장 통증
내장 통증은 신체 기관 내장 통각수용체로부터 유발되고 신체 기관 및 내부 공간 내에 위치한다. 이러한 구역 내 통각수용체의 훨씬 더 큰 결핍은 체성 통증보다 일반적으로 더 아프고 더 긴 지속기간의 통증을 생성시킨다. 내장 통증은 집중시키기 매우 어렵고 내장 조직의 일부 손상은 감각이 손상 위치와 완전하게 관련되지 않은 구역에 국부화되는 "연관통"을 나타낸다. 심근허혈(심근 조직 일부로의 혈류의 손실)은 연관통의 가장 잘 알려진 예이고; 감각은 한정된 지각으로서 또는 좌측 어깨, 팔 또는 손의 통증과 같은 흉부 위에서 발생할 수 있다.
다른 형태의 통증
환팔통은 더 이상 물리적인 신호를 받지 않는 사지로부터의 통증 감각이다 - 절단 수술 및 사지마비에 의해 거의 일반적으로 보고되는 경험. 신경병증성 통증("신경통")은 신경 조직 자체의 손상 또는 질환의 결과로서 발생할 수 있다. 이는 시상으로 정확한 정보를 전달하는 감각 신경의 능력을 분열시킬 수 있고, 따라서 통증에 대한 명확하거나 문서로 증명된 물리적 원인이 없더라도 뇌는 통증 자극을 판단한다.
삼차신경통("동통 티크")은 삼차신경의 손상 또는 상해에 의해 유발된 통증을 나타낸다. 삼차신경은 3가지 분류를 지닌다: V1은 이마 및 눈 지역에 감각을 제공하고 V2는 코 및 얼굴에 감각을 제공하고 V3은 아래턱 및 턱 지역에 감각을 제공한다. 얼굴의 각 면은 감각을 제공하는 삼차신경을 지닌다. 삼차신경통의 편측성 통증은 볼, 입, 코 및/또는 턱 근육을 통해 확장된다. 젊은 사람 또는 다발경화증 환자도 삼차신경통을 경험하나 일반적으로 삼차신경통은 노인에 영향을 미친다.
삼차신경통의 초기 증후는 이마, 볼, 턱 또는 아래턱 윤곽의 통증이다. 중증인 경우 3구역 모두 또는 좌측 및 우측 모두를 포함한다. 통증 에피소드는 중증이고 경련성이며 간결하고 전기 쇼크시 느끼는 것과 유사한 것으로 기술된다. 통증은 이를 닦고, 말하고, 씹고, 마시고, 면도하고 심지어 키스하는 등의 일반적인 일상 생활에 의해 유발될 수 있다. 통증 에피소드의 빈도는 시간에 따라 증가하고 더욱 파괴적이고 무능력하게 한다.
설인신경통은 아홉 번째 두개골 신경의 감각 분포 내 통증의 폭발이 특징적인 임상적 실체이다. 통증의 위치 및 통증에 대한 자극을 제외하고 공격은 삼차신경통과 동일하다. 일반적인 통증은 한 면에서 편도선 또는 혀 뒤 구역 내에서의 극심한 찌르는 듯하고 반복적인 전기-유사 동통(stab)이다. 더욱이 통증은 귀에서 방출되거나 유발된다.
통증을 유도하는 감각 자극은 삼키기이고 강한 공격 동안 환자는 움직이지 않고 앉아 있고 머리를 앞으로 구부리고 침이 입에서 자유롭게 흐르게 한다. 심장정지, 기절(졸도) 및 발작은 설인신경통의 공격과 관련되었다. 대부분의 경우 설인신경통의 원인은 알려져 있지 않다. 그러나 특정한 경우의 수는 종양, 척추 동맥에 의한 아홉 번째 신경의 압축 및 혈관성 기형에 의한 것이다.
대상포진후 신경통은 대상포진 바이러스 감염 후 지속되는 만성 통증을 나타낸다. 대상포진은 수두대상포진(수두) 바이러스 감염의 재발 감염이다. 바이러스는 환자의 면역력이 감퇴될 때까지 신경 내에 잠복상태로 존재한다. 대상포진의 급성 손상은 일반적으로 사라지는 통증을 유발할 수 있다. 그러나 많은 환자에서 통증은 만성적으로 지속된다 - 대상포진후 신경통.
대상포진의 증후는 찌르는 듯하고 깊고 지속적인 통증을 포함한다: 통증은 흉부 지역 65% 및 얼굴 20%에서 나타난다. 얼굴이 포함되는 경우 바이러스는 삼차신경의 안구 부분(눈썹 위 얼굴 상단)에 대한 편애를 나타낸다. 일반적으로 통증은 2∼4주간 자발적으로 사라진다. 그러나 일부 환자는 지속적인 통증을 지닐 것이다. 통증은 앞선 발진 구역 내에 나타나고 영향 받은 피부를 약하게 쓰다듬으면 악하되고 그 구역에 압력을 가함으로서 경감된다. 의류 마찰은 매우 고통스럽다. 이러한 지속적인 통증은 대상포진후 신경통이라고 명명된다. 얼굴을 포함한 대상포진의 경우 더 높은 발병률의 대상포진후 신경통이 존재한다.
작열통은 부분적 말초 신경 손상을 동반하는 드문 증후이다. 화상 통증, 자율신경계 기능장애 및 영양 변화의 삼징후가 특징적이다. 심한 경우는 대작열통이라고 명명한다. 소작열통은 반사교감신경(RSD)과 유사한 덜 심한 형태를 나타낸다. RSD는 x-선 상에 일반적인 골다공증을 지닌 우세한 근육 및 관절 증후이다.
작열통은 말초신경 손상, 일반적으로 상완신경총에 의해 유발된다. 신경제거는 증가된 통증을 유발하는 과민증을 유발하고 증가된 노르에피네프린 방출은 교감신경 발견을 유발한다. 증후는 통증: 일반적으로 화상을 포함하고 손과 발에 우세하다. 중추, 척골 및 좌골 신경이 가장 일반적으로 포함된다. 대부분의 감각 자극은 통증을 악화시킨다. 혈관 변화: 혈관확장에 의한 증가된 혈액(따뜻한 분홍색) 또는 혈관수축에 의한 감소된 혈액(차갑고 얼룩진 청색). 영양 변화: 건조/각질이 벗겨지는 피부, 경직된 관절, 가늘어지는 손가락, 융기된 자르지 않은 손톱, 길고/거친 머리카락 또는 탈모, 발한 변화.
TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드
여기에 사용된 "TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드"는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 나타낸다. 바람직하게는 폴리펩타이드는 서열번호: 3에 나타난 서열의 상동체, 변이체 또는 유도체이거나 이를 포함한다.
"폴리펩타이드"는 서로 펩타이드 결합 또는 변형 펩타이드 결합 즉, 펩타이드 동배체에 의해 서로 결합된 2 이상의 아미노산을 포함한 펩타이드 또는 단백질을 나타낸다. "폴리펩타이드"는 일반적으로 펩타이드, 올리고펩타이드 또는 올리고머로 표기되는 짧은 사슬 및 일반적으로 단백질로 표기되는 긴 사슬 모두를 나타낸다. 폴리펩타이드는 20개 이상의 유전자-인코드된 아미노산을 포함한다.
"폴리펩타이드"는 번역-후 과정과 같은 자연적 과정 또는 당분야에 잘 알려진 화학적 변형 기술에 의해 변형된 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 변형은 기본 교본에 잘 기술되어 있고 모노그래프뿐만 아니라 많은 연구 문헌에 더욱 상세히 기술되어 있다. 변형은 펩타이드 백본, 아미노산 측면-사슬 및 아미노 또는 카르복실 말단을 포함한 폴리펩타이드 내 어떠한 장소에서도 발생할 수 있다. 동일한 형태의 변형이 제공된 폴리펩타이드 내 일부 사이트에서 동일하거나 다른 정도로 존재함이 인식될 것이다. 또한 제공된 폴리펩타이드는 여러 형태의 변형을 포함한다.
폴리펩타이드는 편재화(ubiquitination) 결과로 분지되고 분지 없이 환형이 된다. 환형, 분지형 및 분지화 환형 폴리펩타이드는 번역후 자연적 과정으로부터 유발하거나 합성 방법에 의해 생성된다. 변형은 아세틸화, 아실화, ADP-라이보실화, 아미드화, 플라빈의 공유결합성 부착, 헴 모이어티의 공유결합성 부착, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유도체의 공유결합성 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유결합성 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유결합서 부착, 교차-결합, 고리화, 이황결합 형성, 탈메틸화, 공유결합성 교차-결합 형성, 시스테인 형성, 프로글루타메이트 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 당화, GPI 고정 형성, 수화, 요오드화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 과정, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 세레노일화, 황산화, 아르기닐화와 같은 아미노산의 단백질로의 전달-RNA 매개 첨가 및 편재화를 포함한다. Proteins - Structure and Molecular Properties, 2nd Ed., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993 and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs. 1-12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth Enzymol (1990) 182:626-646 and Rattan et al, Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci (1992) 663:48-62 참조.
본 출원서에서 사용된 "변이체", "상동체", "유도체" 또는 "단편"이라는 용어는 서열로부터 또는 이에 대한 하나(또는 그 이상의) 아미노산의 치환, 변이, 변형, 대치, 결실 또는 삽입을 포함한다. 다른 경우를 인정하지 않는 한 "TrpM8" 및 "TrpM8 이온 채널"에 대한 언급은 TrpM8의 변이체, 상동체, 유도체 및 단편의 언급을 포함한다.
바람직하게는 TrpM8에 적용시 수득된 아미노산 서열은 이온 채널 활성을 지니고, 바람직하게는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 TrpM8 이온 채널과 적어도 동일한 활성을 지닌다. 특히 "상동체"라는 용어는 수득된 아미노산 서열이 이온 채널 활성을 지니는 경우 구조 및/또는 기능에 대한 동일성을 포함한다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 적어도 95%, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 또한 이들 용어는 TrpM8 이온 채널 핵산 서열의 대립유전성 변이인 아미노산 유래의 폴리펩타이드를 포함한다.
TrpM8 이온 채널과 같은 이온 채널의 "채널 활성" 또는 "생물학적 활성"의 표현에 있어서 이들 용어는 유사한 활성 또는 개선된 활성 또는 바람직하지 않은 부작용이 감소된 활성을 포함한 TrpM8 이온 채널의 대사성 또는 생리적 기능을 나타낸다. 또한 TrpM8 이온 채널의 항원성 및 면역성 활성도 포함된다. 이온 채널 활성의 예 및 이들 활성을 분석하고 정량화하는 방법은 당분야에 잘 알려져 있고 본 출원서에 상세히 기술되어 있다.
여기서 사용된 "결실"는 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 부재하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내 변화로 한정된다. 여기서 사용된 "삽입" 또는 "첨가"는 자연 발생적 물질과 비교시 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 첨가를 유발하는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열 내 변화이다. 여기서 사용된 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산으로의 대치로부터 유발된다.
또한 여기서 한정된 TrpM8 폴리펩타이드는 무증후 변화를 생성하고 기능적으로 동일한 아미노산 서열을 유발하는 아미노산 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 지닌다. 인공 아미노사 치환은 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 상의 유사성에 기초하여 이루어진다. 예를 들어 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산, 글루탐산을 포함하고; 양으로 하전된 아미노산은 라이신, 아르기닌을 포함하고; 유사한 친수서을 지닌 하전되지 않은 극성 두부(polar head group)를 지닌 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글리신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다.
예를 들어 보존적 치환은 하기에 따라 이루어진다. 두 번째 컬럼 내의 동일한 블록, 바람직하게는 세 번째 컬럼 내 동일한 줄 내의 아미노산은 서로 치환된다:
Figure 112006061524918-PCT00001
TrpM8 폴리펩타이드는 일반적으로 N-말단 또는 C-말단, 바람직하게는 N-말단에서 이형성 아미노산 서열을 더욱 포함한다. 이형성 서열은 세포내 또는 세포외 단백질 타겟팅에 영향을 미치는 서열(리더 서열과 같은)을 포함한다. 또한 이형성 서열은 폴리펩타이드의 면역원성을 증가시키고/또는 폴리펩타이드의 식별, 추출 및/또는 정제를 촉진시키는 서열을 포함한다. 특히 바람직한 또다른 이형성 서열은 바람직하게는 N-말단인 폴리히스티딘과 같은 폴리아미노산 서열이다. 적어도 10개 이상, 바람직하게는 적어도 17개 이상의 아미노산이나 50개 이하의 아미노산의 폴리히스티딘 서열이 특히 바람직하다.
TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드는 "성숙" 단백질의 형태이거나 융합 단백질과 같은 더 큰 단백질의 일부이다. 분비 또는 리더 사열, 전(pro)-서열, 다중 히스티딘 잔기와 같은 정제 촉진 서열 또는 재조합 생성동안 안정성에 대한 추가 서열을 포함한 추가 아미노산 서열을 포함한다.
TrpM8 폴리펩타이드는 알려진 기술을 이용한 재조합 방법에 의해 유리하게 이루어진다. 그러나 또한 이는 고형상 합성과 같은 당업자에게 잘 알려진 기술을 이용한 합성 방법에 의해 이루어진다. 여기서 기술된 폴리펩타이드는 예를 들어 추출 및 정제를 촉진시키는 융합 단백질로서 제조되기도 한다. 융합 단백질 파트너의 예는 글루타티온-S-전이효소(GST), 6xHis, GAL4(DNA 결합 및/또는 전사 활성 도메인) 및 β-갈락토시다제를 포함한다. 또한 이는 트롬빈 분열 사이트와 같이 융합 단백질 파트너와 융합 단백질 서열의 제거를 가능하게 하는 목적 단백질 서열 사이의 단백질 분해성 분열 사이트를 포함하는 것이 편리하다. 바람직하게는 융합 단백질은 목적 서열의 단백질 기능을 저해하지 않을 것이다.
TrpM8 폴리펩타이드는 실질적으로 분리된 형태이다. 이러한 용어는 자연 상태로부터 인공적인 변화를 나타낸다. "분리된" 조성물 또는 물질이 자연적으로 발생하는 경우 그의 본래 환경으로부터 변화되거나 제거되었다. 예를 들어 생존 동물 내에 자연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 "분리된" 것이 아니나 그의 자연 상태의 동시 존재 물질로부터 분리된 동일한 폴리뉴클레오타이드, 핵산 또는 폴리펩타이드는 여기서 사용된 용어와 같이 "분리된" 것이다.
그러나 TrpM8 이온 채널 단백질이 단백질의 의도된 목적을 방해하지 않는 담체 또는 희석제와 혼합되고 실질적으로 분리되는 것으로 간주됨이 이해될 것이다. 또한 TrpM8 폴리펩타이드는 실질적으로 정제된 형태이고, 이러한 경우 일반적으로 90% 이상, 예를 들어 제제 내 단백질의 95%, 98% 또는 99%가 TrpM8 폴리펩타이드인 제제 내 단백질을 포함한다.
또한 본 발명자는 TrpM8 폴리펩타이드의 일부를 포함한 펩타이드를 기술한다. 따라서 TrpM8 이온 채널의 단편 및 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 포함된다. 펩타이드는 2∼200개 길이의 아미노산, 바람직하게는 4∼40개 길이의 아미노산이다. 펩타이드는 예를 들어 트립신과 같은 적당한 효소로의 분해에 의해 여기서 사용된 TrpM8 폴리펩타이드로부터 유래된다. 대안으로 펩타이드, 단편 등은 재조합 방법으로 제조되거나 합성적으로 합성된다.
"펩타이드"라는 용어는 레트로인벌소(retroinverso) D 펩타이드와 같은 당분야에 알려진 다양한 합성 펩타이드 변이를 포함한다. 펩타이드는 항원 결정소 및/또는 T-세포 에피토프이다. 펩타이드는 생체 내에서 면역원이다. 바람직하게는 펩타이드는 생체 내 중화 항체를 유도하는 것이 가능하다.
다른 종으로부터의 TrpM8 이온 채널 서열을 정렬시킴으로서 어떤 아미노산 서열 구역이 다른 종간에 보존되는지("상동성 구역") 및 어떤 구역이 다른 종간에 변화하는지("이형성 구역")를 측정하는 것이 가능하다.
따라서 TrpM8 폴리펩타이드는 상동성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 상동성 구역은 적어도 2종간의 높은 정도의 상동성을 나타낸다. 예를 들어 상동성 구역은 여기서 기술된 시험을 이용하여 아미노산 수치의 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성을 나타낸다. 상동성 구역에 상응하는 서열을 포함한 펩타이드는 하기 더욱 상세히 설명된 치료 전략 내에서 사용된다. 대안으로 TrpM8 이온 채널 펩타이드는 이형성 구역의 적어도 일부에 상응하는 서열을 포함한다. 이형성 구역은 적어도 2종간의 낮은 정도의 상동성을 나타낸다.
TrpM8 이온 채널 폴리뉴클레오타이드 및 핵산
또한 본 발명자는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 TrpM8 폴리뉴클레오타이드, TrpM8 뉴클레오타이드 및 TrpM8핵산, 그의 제조방법 및 이용이 개시한다.
"TrpM8 폴리뉴클레오타이드", "TrpM8 뉴클레오타이드" 및 "TrpM8 핵산"이라는 용어는 상호교환 가능하게 사용되고 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리뉴클레오타이드/핵산을 나타낸다. 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드/핵산은 서열번호: 1, 서열번호: 2, 가장 바람직하게는 서열번호: 2에 나타난 핵산 서열을 포함하거나 이의 상동체, 변이체 또는 유도체이다.
또한 이들 용어는 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드 즉, TrpM8 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 핵산 서열을 포함한다. 따라서 TrpM8 이온 채널 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는 TrpM8 이온 채널 폴리뉴클레오타이드 및 핵산은 서열번호: 3에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 폴리펩타이드를 인코드하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 변형되지 않은 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA인 폴리리보뉴클레오타이드 또는 폴리디옥시뉴클레오타이드를 나타낸다. "폴리뉴클레오타이드"는 제한 없이 단일- 및 이중-나선 DNA, 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA, 단일- 및 이중-나선 RNA 및 포함하나 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 RNA, 단일-나선 또는 더욱 일반적으로는 이중-나선 또는 단일- 및 이중-나선 구역의 혼합물인 DNA 및 RNA를 포함한 하이브리드 분자를 포함한다. 더욱이 "폴리뉴클레오타이드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA 모두를 포함한 삼중-나선 구역을 나타낸다. 또한 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 하나 이상의 변형된 염기를 포함한 DNA 또는 RNA 및 안정성 또는 다른 이유로 골격이 변형된 DNA 또는 RNA를 포함한다. "변형된" 염기는 예를 들어 트리틸레이트된(tritylated) 염기 및 이노신과 같은 특정 염기를 포함한다. 다양한 변형은 DNA 및 RNA에서 이루어지고, 따라서 "폴리뉴클레오타이드"는 자연 내에서 일반적으로 발견되는 폴리펩타이드의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사적으로 변형된 형태뿐만 아니라 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특성의 화학적 형태를 포함한다. 또한 "폴리뉴클레오타이드"는 올리고뉴클레오타이드로 표기되는 상대적으로 짧은 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
많은 뉴클레오타이드 서열은 유전자 코드의 퇴화 결과로 동일한 폴리펩타이드를 인코드할 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
여기에 나타난 "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 뉴클레오타이드 서열, 올리고뉴클레오타이드 서열, 폴리뉴클레오타이드 서열 및 그의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체(그의 일부분과 같은)를 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열은 센스 또는 안티센스 나선 또는 그의 결합에 관계없이 이중-나선 또는 단일-나선인 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원의 DNA 또는 RNA이다. 뉴클레오타이드 서열이라는 용어는 재조합 DNA 기술(예를 들어 재조합 DNA)의 이용에 의해 제조된다.
바람직하게는, "뉴클레오타이드 서열"이라는 용어는 DNA를 의미한다.
본 발명과 관련된 "변이체", "상동체", 유도체" 또는 단편"이라는 용어는 TrpM8 뉴클레오타이드 서열로부터 또는 그에 대한 하나의(또는 그 이상의) 핵산의 치환, 변이, 변형, 교체, 결실 또는 첨가를 포함한다. 문장이 다른 경우를 허용하지 않는 한 "TrpM8" 및 "TrpM8 이온 채널"에 대한 표기는 TrpM8의 이러한 변이체, 상동체, 유도체 및 단편을 포함한다.
바람직하게는 수득된 뉴클레오타이드 서열은 이온 채널 활성, 바람직하게는 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 이온 채널과 적어도 동일한 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드한다. 바람직하게는 "상동체"라는 용어는 구조 및/또는 기능에 대해 동일성을 포함하여 수득된 뉴클레오타이드 서열이 이온 채널 활성을 지닌 폴리펩타이드를 인코드하게 된다. 서열 동일성(즉, 유사성)에 있어서 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 서열 동일성이 존재한다. 또한 이들 용어는 서열의 대립유전자 변이를 포함한다.
서열 상동성의 계산
따라서 여기서 제공된 서열에 대한 서열 동일성은 다른 서열이 예를 들어 서열에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지니는지 여부를 관찰하기 위한 하나 이상의 서열을 또다른 서열과의 단순한 "안구" 비교(즉, 엄격 비교)에 의해 측정될 수 있다.
또한 상대 서열 동일성은 디폴트 파라미터를 이용하여 동일성을 측정하기 위한 적당한 알고리즘을 이용한 2 이상의 서열 사이의 % 동일성을 계산할 수 있는 통상적으로 구입 가능한 컴퓨터 프로그램에 의해 측정될 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 일반적인 예는 CLUSTAL이다. 2 서열 사이의 동일성 및 유사성을 측정하기 위한 다른 컴퓨터 프로그램 방법은 GCG 프로그램 팩키지(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12:387) 및 FASTA(Atschul et al 1990 J Molec Biol 403-410)을 포함하나 이에 한정적이지 않다.
% 상동체는 인접 서열에 대해 계산된다 즉, 하나의 서열이 다른 서열과 정렬되고 하나의 서열 내 각 아미노산은 다른 서열 내 상응하는 아미노산과 한번에 하나의 잔기씩 직접 비교된다. 이는 "언갭된(ungapped)" 정렬로 명명된다. 일반적으로 이러한 언갭된 정렬은 상대적으로 짧은 수의 잔기에서만 수행된다.
이는 매우 간단하고 일정한 방법이나 예를 들어 서열의 동일한 쌍이 아닌 경우 하나의 삽입 또는 결실이 하기 아미노산 잔기를 정렬에서 제거하게 하고 따라서 전제 정렬이 수행될 때 % 상동성 상의 큰 감소를 잠재적으로 유발한다는 점을 고려하지 못한다. 따라서 대부분의 서열 비교 방법은 전체 상동성 득점을 부당하게 패널티를 과하지 않기 위해 가능한 삽입 및 결실을 고려하는 최적 정렬을 생성하도록 고안된다. 이는 국부적 상동성을 최대화하기 위해 서열 정렬 내 "갭"을 삽입함으로서 달성된다.
그러나 이들 더욱 복잡한 방법은 정렬 내 발생하는 각 갭에 "갭 패널티"를 할당하여 가능한 적은 갭을 지닌 동일한 수의 동일한 아미노산의 경우 서열 정렬은 - 2개의 비교 서열 사이의 더 큰 관련성을 반영 - 많은 갭을 지닌 것보다 더 높은 득점을 달성할 것이다. 갭의 존재에 대해 매우 높은 비용을 부과하고 갭 내의 부차적 잔기에 대해 더 작은 패널티를 부가하는데 일반적으로 "아핀(affine) 갭 비용"이 이용된다. 이는 가장 일반적으로 사용되는 갭 득점 시스템이다. 물론 높은 갭 패널티는 적은 갭을 지닌 최적화된 정렬을 생성할 것이다. 대부분의 정렬 프로그램은 갭 패널티가 변형되는 것을 가능하게 한다. 그러나 서열 비교시 이러하 소프트웨으를 사용할 때 디폴트 수치를 이용하는 것이 바람직하다. 예를 들어 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지 사용시 아미노산 서열에 대한 디폴트 갭 패널티는 갭의 경우 -12 및 각 연장의 경우 -4이다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 패널티를 고려할 때 최적 정렬의 생성을 먼저 필요로 한다. 이러한 정렬을 수행하기 위한 적당한 컴퓨터 프로그램은 GCG Wisconsin Bestfit 팩키지이다(University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). 서열 비교를 수행할 수 있는 다른 소프트웨어의 예는 BLAST 팩키지(Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18), FASTA(Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) 및 GENEWORKS suite of comparision tool이나 이에 한정적인 것은 아니다. BLAST 및 FASTA 모두 오프라인 및 온라인 검색에 유용하다(Ausubel et al 1999, 7-58 내지 7-60 참조).
최종 % 상동성이 동일성의 측면에서 측정될 수 있더라도 정렬 과정 그 자체는 일반적으로 전부-또는-전부가 아닌(all-or-nothing) 쌍 비교에 기반하지 않는다. 대신에 일반적으로 눈금이 있는 유사성 득점 매트릭스가 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반하여 각각의 이원비교(pairwise comparison)에 득점을 할당하는데 이용된다. 일반적으로 이용되는 이러한 매트릭스의 예는 BLOSUM62 매트릭스이다 - 프로그램 BLAST 한 벌에 대한 디폴트 매트릭스. GCG Wisconsin 프로그램은 일반적으로 공개 디폴트 수치 또는 공급되는 경우 맞춤 기호 비교를 이용한다. 일부 적용을 위해 GCG 팩키지의 경우 공개 디폴트 수치를 이용하고, 다른 소프트웨어의 경우 BLOSUM62와 같은 디폴트 매트릭스를 이용하는 것이 바람직하다.
대안으로, 디폴트 수치에 맞춰진 파라미터를 지닌 BLAST 알고리즘이 사용된다. BLAST 알고리즘은 http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 상세히 기술되어 있고 이는 참고문헌에 포함되어 있다. 검색 파라미터는 한정될 수 있고 한정된 디폴트 파라미터에 대해 유리하게 맞춰질 수 있다.
대안으로, BLAST에 의한 평가시 "실질적인 동일성"은 적어도 약 7 이상, 바람직하게는 적어도 약 9 이상, 가장 바람직하게는 적어도 10 이상의 EXPECT 수치로 매치된 서열과 동등하다.
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)은 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx에 의해 사용되는 발견적 검색 알고리즘이고; 이들 프로그램은 적은 증강으로 Karlin and Altschul(Karlin and Altschul 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68; Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-7; http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast_help.html 참조)의 통계법을 이용하여 그들의 발견에 대한 유의성을 유추한다. BLAST 프로그램은 예를 들어 의문의 서열에 대한 상동체를 확인하기 위해 서열 유사성 검색을 위해 주문 제작된다. 서열 데이터베이스의 유사성 검색 내 기본적인 이슈의 논의를 위해 Altschul et al (1994) Nature Genetics 6:119-129 참조.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov에서 구입가능한 5개 BLAST 프로그램은 하기 태스크를 수행한다: blastp - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 아미노선 사열 비교; blastn - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열을 비교; blastx - 단백질 서열 데이터베이스에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열(양쪽 나선 모두)의 6-프레임 개념 번역 생성물을 비교; tblastn - 모든 6개 리딩 프레임(양쪽 나선 모두) 내에서 역동적으로 번역된 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스에 대한 의문의 단백질 서열을 비교; tblastx - 뉴클레오타이드 서열 데이터베이스의 6-프레임 번역에 대한 의문의 뉴클레오타이드 서열의 6-프레임 번역을 비교.
BLAST는 하기 검색 파라미터를 이용한다:
HISTOGRAM(막대그래프) - 각각의 검색에 대한 득점의 히스토그램을 표시한다; 디폴트는 yes이다(BLAST 책자 내의 파라미터 H를 참조).
DESCRIPTIONS(설명) - 특성화된 숫자로 리포트되는 매치된 서열의 간단한 디스크립션(description)의 수를 제한한다; 디폴트 한계는 100 디스크립션이다(책자 페이지 내의 파라미터 V를 참조).
EXPECT(예상) - 리포트를 위한 통계적 유의성 역치는 데이터베이세스 서열에 대해 매치된다; 디폴트 값은 10이고, Karlin and Altschul(1990)의 추계학적 모델에 따라 10 매치는 단지 우연히 발견되는 것으로 기대된다. 매치의 통계적 유의성이 EXPECT 역치보다 클 경우 매치는 리포트되지 않을 것이다. 더 낮은 EXPECT 역치가 더 엄격하고, 리포트되는 매치 기회를 더 적게 한다. 분수 값이 수용될 수 있다(BLAST 책자내의 파라미터 E를 참조).
CUTOFF(컷오프) - 높은-득점 세그먼트(segment) 쌍을 리포팅하기 위한 득점을 차단함. 디폴트 값은 EXPECT 값(상기 참조)으로부터 산출된다. HSP는 통계적 유의성이 적어도 CUTOFF 값과 동일한 득점을 지닌 고립 HSP의 크기와 같을 때 데이터베이세스 서열에 대해 리포트된다. CUTOFF 값이 높을수록 더 엄격하여, 리포트되는 매치의 기회를 적게 한다(BLAST 책자 내의 파라미터 S를 참조). 일반적으로 유의성 역치는 EXPECT를 사용하여 더욱 강력하게 관리될 수 있다.
ALIGNMENTS(정렬) - 높은-득점 세그먼트(HSPs)가 보고되는 특정화된 숫자에 데이터베이세스 서열을 제한함; 디폴트 한계는 50이다. 이 보다 더 많은 데이터베이세스 서열이 리포팅을 위한 통계적 유의성 역치를 만족시키게 될 경우(하기의 EXPECT 및 CUTOFF를 참조) 가장 큰 통계적 유의성의 매치만이 리포트된다(BLAST 책자 내의 파라미터 B를 참조).
MATRIX(매트릭스) - BLASTP, BLASTX, TBLASTN 및 TBLASTX를 위한 다른 득점 매트릭스를 특성화함. 디폴트 매트릭스는 BLOSUM62(Henikoff & Henikoff, 1992)이다. 유효한 다른 선택은 PAM40, PAM120, PAM250 및 IDENTITY를 포함한다. BLASTN에 유용한 다른 득점 매트릭스는 없다; BLASTN 리퀘스트(request) 내에서 MATRIX 지시를 특성화시키는 것은 오류 반응으로 나타난다.
STRAND(스트랜드) - TBLASTN 검색을 데이터베이세스 서열의 상부 또는 하부로만 한정함; 또는 LASTP, BLASTX 또는 TBLASTX 검색을 질문 서열의 상부 또는 하부 상의 리딩 프레임에만 한정함.
FILTER(필터) - Wootton & Federhen(1993) Computers and Chemistry 17:149-163의 SEG 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 낮은 구성 복잡성을 지닌 질문 서열의 세그먼트 또는 Claverie & States(1993) Computers and Chemistry 17:191-201의 XNU 프로그램 또는 BLASTN의 경우 Tatusov and Lipman (http://www.ncbi.nih.gov.를 참조)의 DUST 프로그램에 의해 측정된 바와 같이 짧은-주기성 간격 반복으로 구성된 세그먼트를 마스크 오프(mask off)함. 필터링(filtering)은 blast 출력으로부터 통계적으로는 유의적이나 생물학적으로는 흥미없는 리포트를 제거하고(즉, 공통의 산성-, 염기성- 또는 프롤린-풍부 구역), 데이터베이세스 서열에 대한 특정 매칭에 유용한 질문 서열의 생물학적으로 흥미 있는 더 많은 구역을 남긴다.
필터 프로그램에 의해 발견된 낮은 복잡성 서열은 뉴클레오타이드 서열 내에서 문자 "N"을 사용하여(즉, "NNNNNNNNNNNNN"), 단백질 서열 내에서 문자 "X"를 사용하여(즉, "XXXXXXXXX") 대치된다.
필터링은 데이터베이세스 서열이 아니라 질문 서열(또는 그의 번역 생성물)에만 적용된다. 디폴트 필터링은 BLASTN의 경우 DUST, 다른 프로그램의 경우는 SEG이다.
SWISS-PROT 내의 서열에 적용될 경우 SEG 또는 XNU 또는 이 둘 모두에 의해마스크된 어떤 것에도 전혀 특별하지 않아서 필터링이 항상 효과를 나타내지 않는다. 더욱이 일부의 경우 서열이 완전히 마스크되어 여과되지 않은 질문 서열에 대해 리포트된 어떤 매치의 통계적 유의성이 의심받을 수 있다는 것을 나타낸다.
NCBI-gi NCBI-gi 확인자가 접근 및/또는 로커스(locus) 명칭에 부가하여 출력 내에 나타나도록 유발한다.
가장 바람직하게는 서열비교는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 제공된 간단한 BLAST 검색 알고리즘을 이용하여 수행된다. 일부 실시태양에서 서열 동일성 측정시 어떠한 갭 패널티도 사용되지 않는다.
하이브리디제이션
또한 본 발명자는 여기서 제공된 서열 또는 그의 단편 또는 유도체 또는 상기 서열의 상보체에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열을 개시한다.
하이브리디제이션은 "염기 짝짓기를 통해 핵산 나선이 상보적 나선과 결합하는 과정"(Coombs J (1994) Dictionary of Biotechnology, Stockton Press, New York NY) 뿐만 아니라 CW and GS Dveksler(1995, PCR Primer, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)에 개시된 중합효소 연쇄 반응 기술로 수행된 증폭 과정을 의미한다.
하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상보체에 선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 적어도 20개 이상, 바람직하게는 적어도 25개 또는 30개 이상, 예를 들어 적어도 40개, 60개, 또는 100개 이상의 인접 뉴클레오타이드 구역에 있어서 여기서 제공된 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 85% 또는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 95% 또는 98% 이상 상동성일 것이다. 바람직한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 1, 2 또는 4에 대해 상동적인, 바람직하게는 상기 서열 중의 하나에 대해 적어도 70%, 80% 또는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 상동적인 구역을 포함할 것이다.
"선택적으로 하이브리다이즈하는 것이 가능한"이라는 용어는 프로브로 사용된 뉴클레오타이드 서열이 타겟 뉴클레오타이드 서열이 배경 수준보다 유의적으로 상위의 수준에서 프로브에 하이브리다이즈하는 것으로 나타나는 조건 하에서 사용됨을 의미한다. 배경 하이브리디제이션은 예를 들어 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리 선별시 존재하는 다른 뉴클레오타이드 서열로 인해 발생한다. 이러한 경우 배경은 타겟 DNA에서 관찰되는 특이적 상호작용에 비해 10배 이하, 바람직하게는 100배 이하의 강도인 라이브러리의 비-특이적 DNA 멤버와 프로브 사이의 상호작용을 의미한다. 상호작용의 강도는 예를 들어 프로브 즉, 32P를 방사선표지함으로서 측정된다.
또한 중간 내지 최대 스트린전시 조건 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 뉴클레오타이드 서열이 포함된다. 하이브리디제이션 조건은 Berger and Kimmel(1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA)에 나타난 바와 같이 핵산 결합 복합체의 분해 온도(Tm)에 기반을 두고 있고, 하기 설명된 바와 같이 한정된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
최대 스트린전시는 일반적으로 약 Tm-5℃(프로브 Tm의 5℃ 이하)에서; 높은 스트린전시는 Tm의 5℃∼10℃ 이하에서; 중간 스트린전시는 Tm의 10℃∼20℃ 이하에서; 및 낮은 스트린전시는 Tm의 20℃∼25℃ 이하에서 발생한다. 당업자에 이해되는 바와 같이 최대 스트린전시 하이브리디제이션은 동일한 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있고 중간(또는 낮은) 스트린전시 하이브리디제이션은 유사하거나 관련된 뉴클레오타이드 서열을 확인하거나 검출하는데 이용될 수 있다.
바람직한 실시태양에서 본 발명자는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0) 하에서 하나 이상의 TrpM8 이온 채널 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 개시한다. 뉴클레오타이드 서열이 이중-나선인 경우 이중 나선의 두 스트랜드 모두, 개별적으로 또는 결합된 형태 모두 포함된다. 뉴클레오타이드 서열이 단일-나선인 경우 뉴클레오타이드 서열의 상보적 서열도 이용됨이 이해된다.
본 발명자는 여기서 제공된 서열에 상보적인 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 개시한다. 유사하게 본 발명은 상기 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이들 뉴클레오타이드 서열의 형태는 변이체 뉴클레오타이드 서열의 예이다. 이러한 관점에서 "변이체"라는 용어는 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다. 그러나 바람직하게는 "변이체"라는 용어는 스트린전트 조건(즉, 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3 구연산 pH 7.0) 하에서 여기서 제공된 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 서열에 상보적인 서열을 포함한다.
TrpM8 이온 채널 및 상동체의 클로닝
본 발명은 여기서 제공된 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편 또는 유도체를 포함한다. 상기 서열이 그의 단편에 상보적인 경우 상기 서열은 다른 생물체 내의 유사한 이온 채널 서열을 확인하고 클론하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다.
이는 인간 및 쥐, 돼지, 양 등의 다른 종으로부터의 TrpM8 이온 채널, 그의 상동체 및 다른 구조적으로 또는 기능적으로 관련된 유전자의 클로닝이 달성될 수 있게 한다. 적당한 라이브러리로부터 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하기 위해 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4에 포함된 뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 충분히 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편이 cDNA 및 게놈 DNA에 대한 하이브리디제이션 프로브로서 사용된다. 또한 이러한 프로브는 TrpM8 이온 채널 유전자에 대해 서열 유사성, 바람직하게는 높은 서열 유사성을 지닌 다른 유전자(인간 이외의 종으로부터의 상동체 및 오르쏠로그(orthologue)를 포함)의 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는데 사용된다. 하이브리다이즈 선별, 클로닝 및 서열분석 기술은 당업자에게 알려져 있고 예를 들어 Sambrook et al(상동)에 기술되어 있다.
일반적으로 프로브로 사용하기 적당한 뉴클레오타이드 서열은 대상 서열에 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 95% 이상 동일하다. 일반적으로 프로브는 적어도 15개 뉴클레오타이드를 포함할 것이다. 바람직하게는 이러한 프로브는 적어도 30개 뉴클레오타이드를 지닐 것이고 적어도 50개 뉴클레오타이드를 지닌다. 특히 바람직한 프로브는 150∼500개, 더욱 특별하게는 약 300개 뉴클레오타이드 범위일 것이다.
하나의 실시태양에서 인간 이외의 종으로부터 상동체 및 오르쏠로그를 포함한 TrpM8 폴리펩타이드를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 수득하기 위해 트린전트 조건 하에서 서열번호: 1, 서열번호: 2, 서열번호: 4 또는 그의 단편을 지닌 표지된 프로브로 적당한 라이브러리를 선별하는 단계 및 상기 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한 일부 또는 전체-길이 cDNA 및 게놈 클론을 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 하이브리디제이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 스트린전트 조건은 상기 한정된 바와 같거나 대안으로 50% 포름아마이드, 5XSSC(150 mM NaCl, 15 mM 구연산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5XDenhardt 용액, 10% 황산덱스트란 및 20 ㎍/ml 변성 절단 연어 정자 DNA를 포함한 용액 내에서 42℃에서의 밤새 인큐베이션한 후 약 65℃에서 0.1XSSC 내에서 필터를 세척하는 조건이다.
TrpM8 이온 채널의 기능적 분석
클론된 추정 TrpM8 이온 채널 폴리뉴클레오타이드는 서열 분석 또는 기능적 분석에 의해 증명된다. 특히 상기와 같이 트랜스펙트된 제노푸스(Xenopus) 난모세포의 전도성은 하기 기술된 선별 분석에 유용한 TrpM8 활성의 측정 및 정량화 방법으로 검출된다. 이러한 전도성 분석은 편의를 위해 "TrpM8(전도성)의 기능적 분석"으로 표기된다.
추정 TrpM8 이온 채널 또는 상동체는 하기 "TrpM8(전도성)의 기능적 분석"에서의 활성에 대해 분석된다. TrpM8 이온 채널 cDNA를 인코드하는 선형화 플라스미드 주형으로부터의 캡결합된(capped) RNA 전사체가 표준 절체에 따라 RNA 중합효소로 시험과 내에서 합성된다. 시험관 내에서 전사체는 0.2 mg/ml의 최종 농도로 물에 현탁된다. 난소엽은 성체 암컷 두꺼비로부터 제거되고, 단계 Ⅴ 탈난포화 난모세포가 수득되고 RNA 전사체(10 ng/난모세포)가 현미주사 기구를 이용하여 50 nl 환약으로 주입된다. 2개의 전극 전압 클램프가 작용제 노출에 대한 제노푸스 난모세포 개체로부터 전류를 측정하는데 사용된다. 기록은 96mM NaCl, 2mM KCl, 1mMMgCl2, 0.1mMCaCl2, 5mM Hepes, pH7.4에서 이루어지고 상온에서 200 mM 만니톨이 보충된다. OSM은 210m Osm이다. 또한 제노푸스 시스템은 하기에 더욱 상세히 기술된 바와 같이 알려진 리간드 및 리간드 활성화용 조직/세포 추출물을 선별하는데 사용된다.
대안적인 기능적 분석은 전체 세포 전기생리학, 형광 공명 에너지 전달(FRET) 분석 및 FLIPR 분석을 포함한다.
TrpM8 이온 채널에 대한 발현 분석
TrpM8 이온 채널 관련 질환을 치료하기에 유용한 치료제를 고안하기 위해 TrpM8(야생형 또는 특정 돌열변이)의 발현 프로파일을 측정하는 것이 유용하다. 따라서 당분야에 알려진 방법은 TrpM8이 발현되는 기관, 조직 및 세포 형태를 측정하는데 이용된다. 예를 들어 통상의 또는 "전자적" 노던(Northern)이 수행된다. 또한 역-전사효소 PCR(RT-PCR)는 TrpM8 유전자 또는 돌연변이체의 발현을 분석하는데 이용된다. TrpM8의 발현 프로파일의 더욱 민감한 측정 방법은 당분야에 알려진 바와 같이 RNAse 보호 분석을 포함한다.
노던 분석은 유전자의 전사체의 존재를 검출하는데 이용되는 실험 기술이고 특정 세포 형태 또는 조직으로부터의 RNA가 결합된 멤브레인으로의 표지된 뉴클레오타이드 서열의 하이브리디제이션을 포함한다(Sambrook, supra, ch. 7 and Ausubel, F. M. et al. supra, ch. 4 and 16). BLAST를 적용하는 유사한 컴퓨터 기술("전사적 노던")은 GenBank 또는 LIFESEQ 데이터베이스(Incyte Pharmaceuticals)와 같은 뉴클레오타이드 데이터베이스와 동일하거나 관련된 분자를 검색하는데 이용된다. 이러한 형태의 분석은 다수의 멤브레인-기반 하이브리디제이션보다 더 빠르다는 점에서 유리하다. 더욱이 컴퓨터 검색의 민감도는 어떠한 특정 매치가 정확하거나 상동성인 것으로 분류되는지 여부를 측정하도록 변형될 수 있다.
상기 기술된 프로브를 포함하여 여기서 기술된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 본 출원서에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 동물 및 인간 질환의 치료 및 진단의 발견을 위한 연구 시약 및 재료로서 이용된다.
TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드의 발현
또한 본 발명자는 TrpM8 폴리펩타이드의 제조 방법을 개시한다. 본 방법은 일반적으로 적당한 조건(즉, TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드가 발현되는 조건) 하에서 TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산, 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 숙주 세포를 배앙하는 단계를 포함한다.
생물학적으로 활성인 TrpM8 이온 채널을 발현하기 위해 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체가 적당한 발현 벡턱 즉, 삽입된 코딩 서열의 전사 또는 번역을 위해 필요한 요소를 포함한 벡터 내로 삽입된다.
당업자에게 잘 알려진 방법은 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열 및 적당한 전사 및 번역 조절 요소를 포함한 발현 벡터를 구축하는데 이용된다. 이들 방법은 시험관 내에서의 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체 내에서의 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 Sambrook, J. et al.(1989; Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ch. 4, 8, and 16-17, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y.) 및 Ausubel, F. M. et al.(1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N.Y.)에 기술되어 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템은 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열을 포함하고 발현시키는데 사용된다. 이들은 재조합 박테리오파지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 박테리아; 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(즉, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(즉, 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 또는 담배 모자이크 바이러스(TMV)) 또는 박테리아 발현 벡터(즉, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 사용되는 숙주 세포의 특성은 문제가 되지 않는다.
"조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 번역을 수행하기 위해 숙주 세포성 단백질과 상호작용하는 벡터의 비-번역되는 구역이다(즉, 인핸서, 프로모터 및 5' 및 3' 비번역 구역). 이러한 요소는 그의 강도 및 특이성이 다양하다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라 달리 구성적 및 유도성 프로모터를 포함한 적당한 전사 및 번역 요소가 사용된다. 예를 들어 박테리아 시스템 내에서 클로닝시 BLUESCRIPT 파지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(GIBCO/BRL)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등과 같은 유도성 프로모터가 사용된다. 바큘로바이러스 폴리헤드린(polyhedrin) 프로모터는 곤충 세포에 사용된다. 식물 세포의 게놈 유래(즉, 열충격, RUBISCO 및 저장 단백질 유전자) 또는 식물 바이러스 유래(즉, 바이러스 프로모터 또는 리더 서열) 프로모터 또는 인핸서가 벡터 내로 클론된다. 포유류 세포 시스템에서 포유류 유전자 유래 또는 포유류 바이러스 유래 프로모터가 바람직하다. TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열의 다수 카피를 포함한 세포주를 생성할 필요가 있는 경우 SV40 또는 EBV 기반 벡터가 적당한 선택성 마커와 함께 사용된다.
박테리아 시스템에서 많은 발현 벡터는 TrpM8 이온 채널에 대한 용도에 따라 다르게 선택된다. 예를 들어 많은 양의 TrpM8 이온 채널이 항체 유도를 위해 필요한 경우 용이하게 정제되는 융합 단백질의 높은 발현 수준을 지시하는 벡터가 사용된다. 이러한 벡터는 다기능성 E. coli 클로닝 및 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열이 β-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 하위 7개 잔기에 대한 서열에 인프레임으로 벡터 내로 라이게이트되어 하이브리드 단백질이 생성되는 BLUESCRIPT(Stratagene), pIN 벡터(Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509) 등과 같은 발현 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)는 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 외부 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용된다. 일반적으로 이러한 융합 단백질은 용해성이고 글루타티온-아가로스 비드에 대한 흡착 후 글루타티온 부재시 용출에 의해 용해된 세포로부터 용이하게 정제될 수 있다. 이러한 시스템 내에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 XA 프로테아제 분열 사이트를 포함하도록 고안되어 클론된 목적 폴리펩타이드는 GST 모이어티로부터 유리될 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레시비에(Saccharomyces cerevisiae)에서 알파 인자, 알코올 산화제 및 PGH와 같은 구성적 또는 유도성 프로모터를 포함한 많은 벡터가 사용된다. Ausubel (상동) 및 Grant et al.(1987; Methods Enzymol. 153:516-544) 참조.
식물 발현 벡터가 사용되는 경우 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열의 발현은 어떠한 수의 프로모터에 의해 작동된다. 예를 들어 CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터는 단독으로 또는 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 결합하여 사용된다(Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311). 대안으로 RUBISCO의 작은 서브유니트와 같은 식물 프로모터 또는 열충격 프로모터가 사용된다(Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; 및 Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105). 이들 컨스트럭트는 직접적인 DNA gudrainage asphalt 또는 병원균-매개 트랜스펙션에 의해 식물 세포 내로 도입될 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 많은 이용 가능한 문헌에 기술되어 있다(예를 들어 Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196 참조).
또한 곤충 시스템이 TrpM8 이온 채널을 발현시키는데 사용된다. 예를 들어 이러한 시스템 내에서 아우토그라파 칼리포르니카(Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스(polyhedrosis) 바이러스(AcNPV)는 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충 내 외부 유전자를 발현하는 벡터로서 사용된다. TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비-필수 구역 내로 클론되고 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓인다. TrpM8 이온 채널의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성이 되게 하고 외피 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성한다. 재조합 바이러스는 예를 들어 TrpM8 이온 채널이 발현되는 스포돕테라 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시키는데 사용된다(Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Nat. Acad. Sci. 91:3224-3227).
포유류 숙주 세포에서 많은 바이러스-기반 발현 시스템이 사용된다. 아데노바이러스가 발현 벡터로 사용되는 경우 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열은 후반 프로모터 3부 리더 서열로 구성된 아데노바이러스 전사/번역 복합체 내로 라이게이트된다. 감염딘 숙주 세포 내에서 TrpM8 이온 채널을 발현할 수 있는 생존 가능한 바이러스를 수득하기 위해 바이러스 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 구역 내로의 삽입이 이용된다(Logan, J. and T. Shenk (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659). 더욱이 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서와 같은 전사 인핸서는 포유류 숙주 세포 내 발현을 증가시키는데 사용된다.
따라서 예를 들어 TrpM8 이온 채널은 인간 진핵성 신장 293(HEK293) 세포 또는 점착성 CHO 세포에서 발현된다. 발현을 최대화하기 위해 일반적으로 모든 5' 및 3' 비번역 구역(UTR)이 pCDN 또는 pCDNA3 벡터 내로의 삽입 전에 TrpM8 cDNA로부터 제거된다. 세포는 리포펙션(lipofection)에 의해 개체 cDNA으로 트랜스펙트되고 400 mg/ml G418의 존재하에서 선택된다. 선택 3주 후 개체 클론이 채취되고 또다른 분석을 위해 확장된다. 벡터 단독으로 트랜스펙트된 HEK293 또는 CHO 세포는 음성 대조군으로 작용한다. 개체 이온 채널을 안정하게 발현하는 세포주를 분리하기 위해 일반적으로 약 24개 클론이 선택되고 노던 블럿 분석에 의해 분석된다. TrpM8 이온 채널 mRNA는 일반적으로 분석된 G4-18-저항성 클론의 약 50%로 검출 가능하다.
또한 인간 인공 염색체(HAC)는 플라스미드 내에서 포함되고 발현될 수 있는 것보다 더 큰 DNA 단편을 전달하는데 이용된다. 약 6∼10 kb의 HAC가 구축되고 치료를 목적으로 통상의 전달 방법(리포솜, 다양이온 아미노 폴리머 또는 소포)을 통해 전달된다.
또한 특이적 개시 신호는 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열의 더욱 효율적인 번역을 달성하는데 사용된다. 이러한 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열 및 그의 개시 코돈 및 업스트림 서열이 적당한 발현 벡터 내로 삽입되는 경우 추가적인 전사 또는 번역 조절 신호는 필요하지 않다. 그러나 코딩 서열 또는 그의 단편만이 삽입되는 경우 ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 번역 조절 신호가 제공되어야 한다. 더욱이 개시 코돈은 전체 삽입의 번역을 안전하게 하기 위해 정확한 리딩 프레임 내에 존재해야 한다. 외인성 번역 요소 및 개시 코돈은 다양한 기원이고 자연적 및 합성적인 것 모두가 된다. 발현의 효율은 문헌에서 기술된 바와 같이 사용된 특정 세포 시스템에 적당한 인핸서의 포함에 의해 증가된다(Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162).
더욱이 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 바람직한 형태로 발현된 단백질을 처리하는 그의 능력에 대해 선택된다. 이러한 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카르복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 단백질의 "프리프로(prepro)" 형태를 분열시키는 후-번역 처리도 정확한 삽입, 폴딩(folding) 및/또는 기능을 촉진시키는데 사용된다. 후-번역 활성에 대한 특이적 세포 가동기구 및 특성적 메커니즘을 지닌 다른 숙주 세포(즉, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38)는 American Type Culture Collection (ATCC, Bethesda, Md.)로부터 구입 가능하고 외부 단백질의 정확한 변형 및 처리를 안전하게 하도록 선택된다.
재조합 단백질의 장기간의 높은 수율 제조를 위해 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어 TrpM8 이온 채널을 안정하게 발현하는 것이 가능한 세포주는 동일하거나 별개의 벡터 상에 복제의 바이러스 기원 및/또는 내인성 발현 요소 및 선택가능한 마커 유전자를 포함한 발현 벡터를 사용하여 형질전환될 수 있다. 벡터의 도입 후 세포는 선택성 배지로 교체되지 전 영양강화 배지 내에서 약 1∼2일간 생장된다. 선택 가능한 마커의 목적은 선택에 대한 저항성을 부여하는 것이고 그의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현시키는 세포의 생장 및 회수를 가능하게 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 저항성 클론은 세포 형태에 적당한 조직 배양 기술을 이용하여 증식된다.
어떠한 수의 선택 시스템도 형질전환 세포주를 회수하는데 사용된다. 이들은 각각 tk- 또는 arp- 세포에서 사용될 수 있는 단순포진바이러스 티미딘 키나제 유전자(Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 유전자(Lowy, I. et al. (1980) Cell 22:817-23)를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 항대사물질, 항생제 또는 제초제 저항성이 선택에 대한 근거로서 사용될 수 있다. 예를 들어 dhfr은 메토트렉세이트(methotrexate)(Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70)에 저항성을 부여하고; npt는 아미노글리코시드 네오마이신 및 G-418에 저항성을 부여하고(Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); als 또는 pat는 각각 클로르설푸론(chlorsulfuron) 및 포스피노스티신(phosphinotricin) 아세틸트랜스퍼라제에 대한 저항성을 부여한다(Murry, 상동). 예를 들어 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하게 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하게 하는 hisD와 같은 추가적인 선택 가능한 유전자가 기술되었다(Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51). 최근 안토시아닌, β-글루쿠로니다제 및 그의 기질 GUS 및 루시페라제 및 그의 기질 루시페린과 같은 시각적으로 표시되는 마커의 이용이 대중적이 되고 있다. 이들 마커는 형질전환체를 확인할 뿐만 아니라 특이적 벡터 시스템에 의한 일시적 또는 안정한 단백질 발현의 양을 정량화하는데 사용될 수 있다(Rhodes, C. A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131).
마커 유전자 발현의 존재/부재가 목적 유전자도 존재함을 나타내더라도 유전자의 존재 및 발현은 확인될 필요가 있다. 예를 들어 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열이 마커 유전자 서열 내에 삽입된 경우 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열을 포함한 형질전환 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 확인될 수 있다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절 하에 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열과 일렬로 놓일 수 있다. 유도 또는 선택에 반응하는 마커 유전자의 발현은 일반적으로 일렬 유전자의 발현을 나타낸다.
대안으로 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 핵산 서열을 포함하고 TrpM8 이온 채널을 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 알려진 다양한 처리에 의해 확인된다. 이들 처리는 핵산 또는 단백질 서열의 검출 및/또는 정량화에 대한 멤브레인, 용액 또는 칩 기반 기술을 포함한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 및 단백질 생물학적 검정 또는 면역측정 기술을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
TrpM8 이온 채널을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드 서열의 존재는 프로브 또는 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드의 단편 또는 단편들을 이용한 DNA--DNA 또는 DNA-RNA 하이브리디제이션 또는 증폭에 의해 검출될 수 있다. 핵산 증폭 기반 분석은 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 DNA 또는 RNA를 포함한 형질전환체를 검출하기 위한 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열을 기반으로 하는 올리고뉴클레오타이드 또는 올리고머의 이용을 포함한다.
단백질에 대해 특이적인 폴리클론 또는 단일클론 항체를 사용한 TrpM8 이온 채널의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당분야에 알려져 있다. 이러한 기술의 예는 효소면역측정법(ELISA), 방사면역측정법(RIA) 및 형광표지세포세포분리(FACS)를 포함한다. TrpM8 이온 채널 상에 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 단일클론 항체를 이용한 2-사이트 단일클론-기반 면역측정법이 바람직하나 경합성결합분석법도 이용된다. 이들 및 다른 분석은 예를 들어 Hampton, R. et al.(1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, Section IV, APS Press, St Paul, Minn.) 및 Maddox, D. E. et al.(1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)과 같이 당분야에 잘 알려져 있다.
다양한 표지 및 컨쥬게이션 기술은 당업자에게 잘 알려져 있고 다양한 핵산 및 아미노산 분석에 이용된다. TrpM8 이온 채널을 인코드하는 폴리뉴클레오타이드에 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리다이즈 또는 PCR 프로브의 제조 방법은 올리고표지, 틈(nick) 번역, 말단-표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 서열 또는 그의 단편은 mRNA 프로브의 제조용 벡터 내로 클론된다. 이러한 벡터는 당분야에 알려져 있고 통상적으로 구입 가능하고 T7, T3 또는 SP6와 같은 적당한 RNA 중합효소 및 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 시험관 내에서 RNA 프로브를 합성하는데 사용된다. 이들 처리는 Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo, Mich.), GE Healthcare(UK) 및 U.S. Biochemical Corp.(Cleveland, Ohio)에 의해 구입된 것과 같은 다양한 통상적으로 구입 가능한 키트를 사용하여 수행된다. 검출에 용이하게 이용되는 적당한 수용체 분자 또는 표지는 방사선핵종, 효소, 형광제, 화학발광제 또는 핵원체뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기 입자 등을 포함한다.
TrpM8 서브유니트를 인코드하는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양액으로부터의 단백질의 발현 및 회수에 적당한 조건 하에서 배양된다. 형질전환 세포에 의해 생성된 단백질은 세포막에 위치하고 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 다르게 세포내적으로 분비되거나 포함된다. 당업자에게 이해되는 바와 같이 TrpM8 서브유니트를 인코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한 발현 벡터는 원핵성 또는 진핵성 세포막을 통해 TrpM8 서브유니트의 분비를 지시하는 신호 서열을 포함하도록 고안된다. 다른 구성은 TrpM8 서브유니트를 인코드하는 서열을 용해성 단백질의 정제를 촉진시키는 폴리펩타이드 도메인을 인코드하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시키는데 이용된다. 이러한 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상의 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상의 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash)에 사용되는 도메인을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 정제 도메인과 TrpM8 서브유니트 인코딩 서열 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제(Invitrogen, San Diego, Calif.)에 특이적인 것과 같은 분열가능 링커 서열을 포함시키는 것은 정제를 촉진시키는데 이용된다. 이러한 발현 벡터는 타이오레독신 또는 엔테로키나제 분열 사이트 바로 앞에 TrpM8 서브유니트 및 6개 히스티딘 잔기를 인코드하는 핵산을 포함한 융합 단백질의 발현을 제공한다. 히스티딘 잔기는 고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피(IMIAC; described in Porath, J. et al. (1992) Prot. Exp. Purif. 3: 263-281) 상에서의 정제를 촉진시키고, 엔테로키나제 분열 사이트는 융합 단백질로부터 TrpM8 서브유니트의 정제 방법을 제공한다. 융합 단백질을 포함한 벡터의 논의는 Kroll, D. J. et al.(1993; DNA Cell Biol. 12:441-453)에 제공되어 있다.
TrpM8 서브유니트의 단편은 재조합 제조뿐만 아니라 고형상 기술을 이용한 직접적 펩타이드 합성에 의해 제조된다(Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154). 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행된다. 자동화된 합성은 예를 들어 Applied Biosystems 431A peptide synthesizer (Perkin Elmer)를 이용하여 달성된다. TrpM8 서브유니트의 다양한 단편은 개별적으로 합성된 후 결합되어 전체 길이 분자를 생성한다.
생체센서
TrpM8 폴리펩타이드, 핵산, 프로브, 항체, 발현 벡터 및 리간드는 생체센서로서(또는 그의 제조에) 유용하다.
Aizawa (1988), Anal. Chem. Symp. 17: 683에 따라 생체센서는 예를 들어 고정된 항체 또는 TrpM8과 같은 이온 채널을 지닌 선택층과 같은 분자 인식용 수용체 및 측정된 수치를 전송하기 위한 변환기의 특정한 결합으로 한정된다. 일군의 이러한 생체센서는 수용체의 주변 매체와의 상호작용에 의한 표면층의 광학적 성질에 기인한 변화를 감지할 것이다. 이러한 기술 중에서 특히 엘립소-메트리(ellipso-metry) 및 표면 플라스몬 공명이 논의된다. TrpM8를 도입시킨 생체센서는 TrpM8 리간드의 존재 또는 수치를 검출하는데 사용된다. 이러한 생체센서의 구축은 당분야에 잘 알려져 있다.
따라서 TrpM8 서브유니트를 발현하는 세포주는 [3H]이노시톨 포스페이트 또는 다른 2차 메신저의 수용체-촉진 형성을 통한 ATP와 같은 리간드의 검출을 위한 수용체 시스템으로서 사용된다(Watt et al., 1998, J Biol Chem May 29;273(22):14053-8). 또한 수용체-리간드 생체센서는 Hoffman et al., 2000, Proc Natl Acad Sci U S A Oct 10;97(21):11215-20에 기술되어 있다. 또한 TrpM8를 포함한 광학적 및 다른 생체센서는 예를 들어 Figler et al, 1997, Biochemistry Dec 23;36(51):16288-99 및 Sarrio et al., 2000, Mol Cell Biol 2000 Jul;20(14):5164-74)에 기술된 바와 같이 G-단백질 및 다른 단백질과의 상호작용의 수준 또는 존재를 검출하는데 사용된다. 생체센서용 센서 유니트는 예를 들어 미국특허 제5,492,840호에 기술되어 있다.
선별 분석
천연 또는 재조합에 관계없이 상동체, 변이체 및 유도체를 포함한 TrpM8 폴리펩타이드는 TrpM8 이온 채널에 결합하고 TrpM8의 활성화를 활성화시키거나(작용제) 억제하는(길항제 또는 차단제) 화합물의 선별 방법에 사용된다. 따라서 이러한 폴리펩타이드는 예를 들어 세포, 무-세포 제제, 화학적 라이브러리 및 천연 생성물 혼합물 내의 소분자 기질 및 리간드의 결합을 평가하는데 사용된다. 이들 기질 및 리간드는 천연 기질 또는 리간드이거나 구조적 또는 기능적 모방물질이다. Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Chapter 5 (1991) 참조.
TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드는 많은 병리학을 포함한 많은 생물학적 기능에 중요하다. 따라서 한편으로는 TrpM8 이온 채널을 자극하고 다른 한편으로는 TrpM8 이온 채널의 기능을 억제할 수 있는 화합물 및 약물을 발견하는 것이 바람직하다. 일반적으로 작용제 및 길항제는 불안, 스트레스, 우울증, 암 또는 통증과 같은 이상에 대한 치료 또는 예방 목적으로 사용된다.
TrpM8 이온 채널 단백질과 상호작용하는 것이 가능한 후보 화합물의 추론적 고안은 폴리펩타이드의 분자 형태의 구조적 연구에 기반한다. 어떤 사이트가 특이적인 다른 단백질과 상호작용하는 여부를 측정하는 한 가지 방법은 물리적 구조 측정 즉, X-선 결정학 또는 2차원 NMR 기술이다. 이들은 어떤 아미노산 잔기가 분자적 접촉 구역을 형성하는지에 대한 지침을 제공할 것이다. 단백질 구조적 측정의 상세한 설명을 위해 Blundell and Johnson (1976) Protein Crystallography, Academic Press, New York 참조.
추론적 고안의 대안으로 일반적으로 표면 상에 TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드를 발현하는 적당한 세포를 생성하는 단계를 포함한 선별 절차를 이용하는 것이다. 이러한 세포는 동물, 효모, 초파리(Drosophila) 또는 E. coli 유래의 세포를 포함한다. 이후 TrpM8를 발현하는 세포(또는 발현된 단백질을 함유하는 세포막)는 결합 또는 기능적 반응의 자극 또는 억제를 관찰하기 위해 시험 화합물에 접촉된다. 예를 들어 하기 상세히 설명된 바와 같이 제노푸스 난모세포는 TrpM8 mRNA 또는 폴리펩타이드이 주입되고 시험 화합물로의 노출에 의해 유도된 전류는 전압 클램프를 사용하여 측정된다.
TrpM8 이온 채널을 지닌 후보 화합물을 개별적으로 시험하는 대신 후보 리간드의 라이브러리 또는 뱅크가 유리하게 제조되고 선별된다. 따라서 예를 들어 200개 이상의 추정 리간드의 뱅크가 선별을 위해 수집되었다. 상기 뱅크는 이온 채널을 통해 작용하는 것으로 알려진 전달물, 호르몬 및 케모카인; 이온 채널에 대한 추정 작용제인 자연 발생적 화합물, 포유류 대응물이 아직 확인되지 않은 비-포유류 생물학적 활성 펩타이드; 및 자연상태에서 발견되지 않으나 알려지지 않은 천연 리간드로 이온 채널을 활성화시키는 화합물을 포함한다.
이러한 뱅크는 다른 문헌에 더욱 상세히 설명된 바와 같이 기능적 분석(즉, 칼슘, 마이크로피지오미터(microphysiometer), FLIPR 분석, 전체 세포 전기생리학, 난모세포 전기생리학 등) 뿐만 아니라 결합 분석을 이용하여 알려진 리간드에 대해 TrpM8 이온 채널을 선별하는데 사용된다. 그러나 아직 동족 활성화 리간드(작용제) 또는 불활성화 리간드(길항제)가 없는 것으로 남아 있는 많은 포유류 수용체가 존재한다. 따라서 이들 수용체에 대한 활성화 리간드는 현재 확인된 리간드 내에 포함되지 않는다. 따라서 TrpM8도 천연 리간드를 확인하기 위해 조직 추출물에 대해 기능적으로 선별된다(칼슘, 마이크로피지오미터, 난모세포 전기생리학 등을 이용, 기능적 선별). 양성 기능적 반응을 생성하는 추출물은 활성화 리간드가 분리되고 확인될 때까지 여기서 기술된 바와 같이 분석되는 분획으로 연속적으로 하위분획화될 수 있다.
HEK 293 세포에서 발현되는 이온 채널은 PLC의 활성화 및 칼슘 이동 및/또는 cAMP 자극 또는 억제에 기능적으로 결합됨을 나타내었다. 따라서 선별 기술의 하나는 채널 활성에 의해 유발된 세포외 pH 또는 세포내 칼슘 변화를 측정하는 시스템 내에서 TrpM8를 발현하는 세포(예를 들어 트랜스펙트된 제노푸스 난모세포, CHO 또는 HEK293 세포)의 이용을 포함한다. 이러한 기술에 있어서, 화합물은 TrpM8 폴리펩타이드를 발현하는 세포아 접촉된다. 이후 2차 메신저 반응 즉, 신호 변환, pH 변화 또는 바람직하게는 칼슘 수치 상의 변화가 측정되어 잠재적인 화합물이 채널을 활성화하거나 억제하는지 여부를 측정한다.
바람직하게는 반응은 칼슘 수치 상의 변화이고; 이러한 분석은 편의상 "TrpM8의 기능적 분석(칼슘 농도)"로 표기된다.
이러한 실험에서 트랜스펙트된 HEK 293 세포 또는 벡터 대조군 세포 내 기본 칼슘 수치가 100∼200 nM의 범위로 정상으로 관찰된다. 등가상가유전성 또는 이가상가유전성 TrpM8 이온 채널 또는 재조합 등가상가유전성 또는 이가상가유전성 TrpM8 이온 채널을 발현하는 HEK 293 세포는 fura 2로 로드되고 하루에 150개 이상의 선택된 리간드 또는 조직/세포 추출물이 작용제 유도성 칼슘 이동에 대해 평가된다. 유사하게는 TrpM8 이온 채널 또는 재조합 TrpM8 이온 채널을 발현하는 HEK 293 세포가 Ca2+ 유동의 증가 또는 감소에 대해 평가되었다. 칼슘 과도전류를 나타내는 작용제는 본 반응이 이온 채널을 발현하는 트랜스펙트된 세포에서 유일한 것인지 여부를 측정하기 위해 벡터 대조군 세포에서 시험된다.
또다른 방법은 TrpM8 이온 채널의 억제 또는 자극을 측정함으로서 이온 채널 억제제를 선별하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 세포 표면 상에 이온 채널을 발현하기 위해 등가상가유전성 채널을 형성하도록 TrpM8 서브유니트 단독으로 또는 이가상가유전성 채널을 형성하도록 다른 Trp 채널 서브유니트로 진핵세포를 트랜스펙트하는 단계를 포함한다. 이후 세포는 TrpM8 이온 채널의 존재 하에 잠재적인 길항제에 노출된다. 세포는 전도성 또는 전류의 동력학 상의 변화를 측정하기 위해 전체 세포 전기생리학을 이용하여 시험될 수 있다.
TrpM8의 작용제 또는 길항제를 검출하기 위한 또다른 방법은 참고문헌에 포함된 미국특허 제5,482,835호에 기술된 효모 기반 기술이다.
바람직한 실시태양에서 선별은 TrpM8의 작용제 및 길항제를 선별하기 위해 전도성의 변화의 검출을 이용한다. 특히 본 발명자는 TrpM8의 길항제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 전도성을 저하시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 전도성은 TrpM8의 길항제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 저하된다. 바람직하게는 전도성은 TrpM8의 길항제의 존재시 1 pS, 2 pS, 3 pS, 4pS, 5pS, 10pS, 15pS, 25pS, 35pS, 45pS, 60pS, 70pS 이상까지 저하된다.
또한 본 발명자는 TrpM8 작용제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 전도성을 증가시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 전도성은 TrpM8의 작용제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 증가된다. 바람직하게는 전도성은 TrpM8의 작용제의 존재시 1 pS, 2 pS, 3 pS, 4pS, 5pS, 10pS, 15pS, 25pS, 35pS, 45pS, 60pS, 70pS 이상까지 증가된다.
또다른 바람직한 실시태양에서 선별은 TrpM8의 작용제 및 길항제를 선별하기 위해 세포 내 칼슘 농도 변화의 검출을 이용한다. 바람직하게는 선별은 상기에 나타난 바와 같이 "TrpM8의 기능적 분석(칼슘 농도)"하에서 기능 분석을 이용한다.
특히 본 발명자는 TrpM8의 길항제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 칼슘 농도를 저하시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 칼슘 농도는 TrpM8의 길항제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 저하된다. 바람직하게는 칼슘 농도는 TrpM8의 길항제의 존재시 1 pS, 2 pS, 3 pS, 4pS, 5pS, 10pS, 15pS, 25pS, 35pS, 45pS, 60pS, 70pS 이상까지 저하된다.
또한 본 발명자는 TrpM8의 작용제가 적당하게 트랜스펙트된 세포의 칼슘 농도를 증가시키는 방법을 개시한다. 바람직하게는 칼슘 농도는 TrpM8의 작용제의 존재시 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 이상까지 증가된다. 바람직하게는 칼슘 농도는 TrpM8의 작용제의 존재시 1 pS, 2 pS, 3 pS, 4pS, 5pS, 10pS, 15pS, 25pS, 35pS, 45pS, 60pS, 70pS 이상까지 증가된다.
후보 화합물이 단백질, 특히 항체 또는 펩타이드인 경우 후보 화합물의 라이브러리는 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선별된다. 파지 디스플레이는 재조합 박테리오파지를 이용하는 분자적 선별 프로토콜이다. 본 기술은 후보 화합물의 라이브러리로부터의 하나의 화합물을 인코드하는 유전자로 박테리오파지를 형질전환시켜 각각의 파지 또는 파지미드가 특정 후보 화합물을 발현하게 하는 단계를 포함한다. 형질전환된 박테리오파지(바람직하게는 고형 지지대에 고정된)는 적당한 후보 화합물을 발현하고 그의 파지 외부 상에 이를 디스플레이한다. TrpM8 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 결합하는 것이 가능한 특정 후보 화합물은 친화성 상호작용에 기반한 선택 전략에 의해 강화된다. 이후 성공적인 후보 약제가 특성화된다. 파지 디스플레이는 표준 친화성 리간드 선별 기술보다 유리하다. 파지 표면은 그의 자연 발생적 입체형태와 더욱 밀접하게 유사한 3차원 입체형태로 후보 약제를 디스플레이한다. 이는 선별 목적에 있어서 더욱 특이적이고 더욱 높은 친화성 결합을 가능하게 한다.
화합물 라이브러리를 선별하는 또다른 방법은 화합물 라이브러리를 발현하는 재조합 DNA 분자로 안정하게 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포를 이용한다. 이러한 생존 가능하거나 고정된 형태의 세포는 표준 결합-파트너 분석에 사용될 수 있다. 세포 반응을 검출하는 민감성 반응을 기술한 Parce et al. (1989) Science 246:243-247; and Owicki et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sci. USA 87;4007-4011을 참조. 화합물 라이브러리를 발현하는 세포가 125I-항체와 같은 TrpM8 폴리펩타이드에 결합하는 것으로 알려진 표지된 항체 및 결합 조성물에 대한 결합 친화력이 측정된 후보 화합물과 같은 시험 표본과 접촉되거나 인큐베이트되는 경우 경합 분석은 특히 유용하다. 이후 상기 폴리펩타이드에 대해 결합되고 자유 표지된 결합 파트너가 분리되어 결합 정도를 평가한다. 결합된 시험 표본의 양은 폴리펩타이드에 결합한 표지된 항체의 양에 역비례한다.
많은 기술 중 어느 하나도 결합 정도를 평가하기 위해 자유 결합 파트너로부터 결합된 것을 분리시키는데 이용될 수 있다. 이러한 분리 단계는 일반적으로 필터로의 부착 후 세척, 플라스틱으로의 부착 후 세척 또는 세포막의 원심분리와 같은 처리를 포함한다.
도다른 접근은 예를 들어 형질전환된 진핵성 또는 원핵성 숙주 세포로부터 추출된 용해되고 정제되지 않거나 용해되고 정제된 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 사용하는 것이다. 이는 증가된 특이성, 자동화 능력 및 높은 약물 시험 작업 처리량의 이점으로 "분자적" 결합 분석을 가능하게 한다.
후보 화합물 선별을 위한 또다른 기술은 적당한 즉, TrpM8 폴리펩타이드에 대한 결합 친화성을 지닌 신규한 화합물에 대한 높은 처리 작업량의 선별을 제공하는 접근을 포함하고, 1984년 9월 13일 공보된 국제특허출원 WO 84/03564(Commonwealth Serum Labs.)에 상세히 기술되어 있다. 먼저, 많은 다른 작은 펩타이드 시험 화합물이 고형 기질 즉, 플라스틱 핀 또는 일부 다른 적당한 표면 상에서 합성된다; Fodor et al.(1991) 참조. 이후 모든 핀은 합성된 TrpM8 폴리펩타이드와 반응되고 세척된다. 다음 단계는 결합된 폴리펩타이드를 검출하는 것을 포함한다. 따라서 상기 폴리펩타이드와 특이적으로 상호작용하는 화합물이 확인될 것이다.
리간드 결합 분석은 약물학의 직접적인 확인 방법을 제공하고 높은 작업 처리량 포맷으로 개조 가능하다. 정제된 리간드는 결합 조사를 위해 높은 특이적 활성(50∼2000 Ci/mmol)으로 방사선표지된다. 이후 방사선표지 과정이 그의 타겟에 대한 리간드 활성을 감소시키지 않도록 측정이 이루어진다. 완충액, 이온, pH 및 뉴클레오타이드와 같은 다른 조절제에 대한 분석 조건은 멤브레인과 전체 세포 수용체 또는 이온 채널 근원에 대한 잡음 비율에 대한 작업 가능한 신호를 수립하도록 최적화된다. 이들 분석을 위해 특정한 결합은 총 결합 방사성에서 과도한 표지되지 않은 경합 리간드의 존재시 측정된 방사성을 감하는 것으로 한정된다. 가능한 경우 하나 이상의 경합 리간드가 잔여 비특이적 결합을 한정하는데 사용된다.
분석은 수용체 또는 이온 채널을 지닌 세포에 대한 부착이 후보 화합물과 직접적으로 또는 간접적으로 결합된 표지에 의해 검출되는 것을 특징으로 하는 후보 화합물의 간단한 결합 시험이거나 다른 분석의 경우 표지된 경쟁자와 경합시키는 단계를 포함한다. 또한 이들 분석은 그의 표면에서 타겟을 지닌 세포에 적당한 검출 시스템을 이용하여 후보 화합물이 타겟의 활성에 의해 생성된 신호를 유발하는지 여부를 시험한다. 활성화 억제제는 일반적으로 알려진 길항제의 존재시 분석되고 후보 화합물의 존재시 작용제에 의한 활성화의 효과가 관찰된다.
또한 분석은 후보 화합물을 TrpM8 폴리펩타이드를 포함한 용액과 혼합하여 혼합물을 형성시키는 단계, 혼합물 내의 TrpM8 이온 채널 활성을 측정하는 단계 및 혼합물의 TrpM8 이온 채널 활성을 표준물질과 비교하는 단계를 간단하게 포함한다.
또한 TrpM8 서브유니트 cDNA, 단백질, 단백질에 대한 항체는 세포 내 TrpM8 서브유니트 mRNA 및 단백질의 생성 상의 첨가된 화합물의 효과를 검출하는 방법을 형성하는데 사용된다. 예를 들어 당분야에 알려진 표분 방법에 의해 단일클론 및 폴리클론 항체를 이용하여 TrpM8 서브유니트 단백질의 분비 수치 또는 세포 결합 수치를 측정하기 위해 ELISA가 구축되고, 이는 적당하게 조작된 세포 또는 조직으로부터 TrpM8 서브유니트의 생성을 억제하거나 증가시키는 약제(또한 각각 길항제 또는 작용제로 명명됨)를 발견하는데 이용될 수 있다. 선별 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 당분야에서 잘 이해된다.
잠재적 TrpM8 이온 채널 길항제 및 차단제의 예는 항체 또는 일부의 경우 퓨린 및 퓨린 아날로그를 포함한 뉴클레오타이드 및 그의 아날로그, TrpM8 이온 채널의 리간드와 밀접하게 관련된 올리고뉴클레오타이드 또는 단백질 즉, 리간드의 단편 또는 이온 채널에 결합하나 반응을 유도하지 않아서 채널의 활성이 방지되는 소분자를 포함한다.
따라서 본 발명자는 TrpM8 폴리펩타이드 및/또는 펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물을 제공한다.
"화합물"이라는 용어는 생물학적 대분자(즉, 핵산, 단백질, 비-펩타이드 또는 유기 분자)와 같은 화학적 화합물(자연 발생적 또는 합성) 또는 박테리아, 식물, 진균 또는 동물(특히 포유류)의 세포 또는 조직과 같은 생물학적 물질로부터 제조된 추출물 또는 무기 원소 또는 분자를 나타낸다. 바람직하게는 화합물은 항체이다.
이러한 선별이 수행되는데 필요한 물질은 선별 키트로 포장된다. 이러한 선별 키트는 TrpM8 폴리펩타이드 또는 TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드의 생성을 감소시키거나 증가시키는 화합물에 대한 작용제, 길항제, 리간드, 수용체, 기질, 효소 등을 확인하는데 유용하다. 선별 키트는: (a) TrpM8 폴리펩타이드; (b) TrpM8 폴리펩타이드를 발현하는 재조합 세포; (c) TrpM8 폴리펩타이드를 발현하는 세포막; 또는 (d) TrpM8 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다. 선별 키트는 선택적으로는 사용 지침을 포함한다.
형질전환 동물
또한 본 발명자는 정상적인 발현 수준과 비교시 정상적이거나 증가되거나 감소된 수준으로 천연 또는 재조합 TrpM8 이온 채널 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 발현하는 것이 가능한 형질전환 동물을 개시한다. 바람직하게는 이러한 형질전환 동물은 돼지, 양 또는 설치류와 같은 비-인간 포유류이다. 가장 바람직하게는 형질전환 동물은 마우스 또는 래트이다.
본 발명자는 고유의 TrpM8 유전자의 전부 또는 일부가 또다른 생물체로부터의 TrpM8 서열로 대치된 형질전환 동물을 개시한다. 바람직하게는 이러한 생물체는 또다른 종, 가장 바람직하게는 인간이다. 바람직한 실시태양에서 본 발명자는 전체 TrpM8 유전자가 인간 TrpM8 유전자로 실질적으로 대치된 마우스를 개시한다. 이러한 형질전환 동물뿐만 아니라 TrpM8에 대한 야생형 동물이 TrpM8 작용제 및/또는 길항제를 선별하는데 이용된다.
예를 들어 이러한 분석은 야생형 또는 형질전환 동물 또는 그의 일부, 바람직하게는 형질전환 동물의 세포, 조직 또는 기관을 후보 물질에 노출시키는 단계 및 통증 및 스트레스와 같은 TrpM8 관련 표현형을 분석하는 단계를 포함한다. 또한 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 전도성 또는 세포내 칼슘 농도 상의 효과를 분석하는 세포-기반 선별이 수행된다.
또한 본 발명자는 본 출원서에 개시된 TrpM8의 하나 이상의 기능이 부분적으로 또는 전체적으로 제거된, 기능적으로 분열된 TrpM8 유전자를 포함한 형질전환 동물을 개시한다. TrpM8 유전자의 결실을 포함한 하나 이상의 돌연변이 기능 손실의 결과로 기능적 TrpM8 이온 채널을 발현하지 않는 형질전환 동물("TrpM8 넉아웃")이 포함된다.
또한 예를 들어 TrpM8 유전자의 선택된 부분이 결실된 일부 기능-손실 돌연변이체 즉, 불완전 넉아웃이 포함된다. 이러한 동물은 예를 들어 기능적으로 중요한 단백질 도메인과 같은 TrpM8 서열의 관련 부분을 선택적으로 대치하거나 결실함으로서 생성된다.
이러한 기능의 완전 또는 일부 손실 돌연변이체는 TrpM8 관련 질환, 특히 통증 또는 스트레스 관련 질환을 위한 모델로서 유용하다. 일부-기능-손실을 나타내는 동물은 후보 물질에 노출되어 표현형을 증가시키는 즉, 통각감퇴 또는 관찰되는 스트레스 수준 표현형의 감소를 증가시키는(TrpM8의 경우) 물질을 확인한다. 또한 전도성 감소 또는 세포내 칼슘 수준의 감소와 같은 다른 파라미터는 본 출원서에서 확인된 방법을 이용하여 검출된다.
또한 일부 및 완전 넉아웃은 TrpM8의 선택적 작용제 및/또는 길항제를 확인하는데 이용된다. 예를 들어 작용제 및/또는 길항제는 야생형 및 TrpM8 결함 동물(넉아웃)에 투여된다. TrpM8의 선택적 작용제 및/또는 길항제는 야생형 동물에는 효과적이나 TrpM8 결함 동물에는 그렇지 않은지에 대해 관찰될 것이다. 더욱 상세하게는 TrpM8 이온 채널의 부재시 생리적 반응을 생성하는지 여부를 측정하기 위해 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)을 평가하도록 특정 분석이 고안된다. 이는 상기 기술된 바와 같이 형질전환 동물에 약물을 투여한 후 특정 반응에 대해 동물을 분석함으로서 달성된다. 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 전도성 또는 세포내 칼슘 농도 상의 효과를 분석하는 유사한 세포-기반 방법도 수행된다. 또한 이러한 동물은 본 출원서에 기술된 선별에 의해 확인된 약물의 효능을 시험하는데 이용된다.
또다른 실시태양에서 일부 기능-손실 표현형을 지닌 형질전환 동물이 선별을 위해 이용된다. 이러한 실시태양에서 선별은 야생형 표현형으로의 일부 또는 완전 복구 또는 복귀에 대해 분석하는 단계를 포함한다. 또한 관련 동물 유래의 세포를 이용하고 전도성 또는 세포내 칼슘 농도 상의 효과를 분석하는 세포-기반 선별이 수행된다. 이와 같이 가능한 것으로 판별된 후보 화합물은 TrpM8 작용제 또는 아날로그로 간주될 수 있다. 이러한 작용제는 예를 들어 통증과 같은 자극에 대한 민감도를 복구시키거나 증가시키고 또는 개체 내 스트레스를 증가시키는데 사용된다.
바람직한 실시태양에서 형질전환 TrpM8 동물, 특히 TrpM8 넉아웃(완전 기능 손실)은 실시예에 나타난, 바람직하게는 여기에 나타난 시험에 의해 측정된 표현형을 나타낸다. 따라서 TrpM8 동물, 특히 TrpM8 넉아웃은 바람직하게는 하나 이상의 하기를 나타낸다: 감소된 움켜쥠 강도, 야생형 마우스보다 더 많이 마시는 경향, 통증에 대한 저하된 민감도(통각감퇴), 저하된 스트레스, 감소된 혈장 코르티코스테론 수치.
매우 바람직한 실시태양에서 형질전환 TrpM8 동물, 특히 TrpM8 넉아웃은 상응하는 야생형 마우스와 비교시 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 이상 더 높거나 더 낮은 측정된 파라미터를 나타낸다. 따라서 예를 들어 TrpM8 넉아웃은 야생형 마우스와 비교시 1초, 2초, 5초, 10초, 30초 이상 또는 5%, 10%, 20%, 50% 이상으로 실시예에 나타난 꼬리 튀기기(Tail Flick) 시험에 반응한 증가된 통증 역치를 지닌다. 실시예에 나타난 오픈 필드 분석으로 측정시 TrpM8 결함 마우스는 바람직하게는 야생형 마우스와 비교시 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20초 이상의 중식구역에 대한 증가된 성능 시간 또는 15, 20, 25, 30, 50 cm 이상의 증가된 중심구역으로의 이동 거리를 지닌다.
TrpM8의 기능-손실에 대한 유사한 효과를 유발하는 화합물을 검출하기 위해 TrpM8 결함 형질전환 동물에 대해 현재 개시된 표현형이 야생형 동물을 이용한 선별에 유용하게 이용됨이 명백해질 것이다. 즉, TrpM8 기능의 조절제 특히 길항제를 확인하기 위해 야생형 동물이 후보 화합물에 노출되고 통감감퇴, 통증에 대한 민감도 감소, 스트레스 수준의 감소, 코르티코스테론 수치의 감소 등과 같은 관련된 TrpM8 표현형이 관찰된다. 또한 전도성의 감소 또는 세포 내 칼슘 수치의 감소와 같은 세포성 표현형이 본 출원서 내에서 확인된 방법을 이용하여 검출된다.
이러한 선별에 의해 확인된 화합물은 특히 TrpM8 관련 질환의 치료 또는 경감을 위해 TrpM8의 길항제 즉, 진통제 또는 스트레스 경감제로서 사용될 수 있다.
상기 기술된 선별은 행동적, 생리적 또는 생화학적 반응과 같은 적당한 파라미터의 관찰을 포함한다. 바람직한 반응은 생리적 반응을 포함하고 하나 이상의 하기를 포함한다: 질병 저항성 변화; 변화된 염증성 반응; 변화된 종양 감수성; 혈압 변화; 신혈관생성; 식이 행동 변화; 체중 변화; 골밀도 변화; 체온 변화; 인슐린 분비; 식샘자극호르몬 분비; 비강 및 기관지 분비; 혈관수축; 기억 상실; 불안; 변화된 불안 상태; 반사감퇴 또는 반사이상항진; 통증 또는 스트레스 반응.
또한 전도성 또는 세포 내 칼슘 농도의 변화와 같은 생화학적 파라미터가 이용된다. 바람직하게는 전도성은 "TrpM8(전도성)의 기능적 분석"을 이용하여 측정되고 세포 내 칼슘 농도는 "TrpM8(칼슘 농도)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다. 이는 세포-기반 선별에 특히 유용하다.
바람직한 실시태양에서 TrpM8 작용제에 노출된 세포의 전도성(예를 들어 야생형 또는 일부 기능-상실 세포)은 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 +30% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상까지 증가된다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "TrpM8(전도성)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 TrpM8 작용제에 노출된 세포의 세포 내 칼슘 농도(예를 들어 야생형 또는 일부 기능-상실 세포)은 적어도 10% 이상, 바람직하게는 적어도 20% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 +30% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 40% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 50% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 60% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 70% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상까지 증가된다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "TrpM8(세포 내 칼슘 농도)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 TrpM8의 길항제는 이러한 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-상실 동물이 적어도 부분적으로 TrpM8 일부 또는 완전 기능-상실 돌연변이체와 적어도 일부 표현형 동일성을 나타내게 한다. 즉, 바람직한 길항제는 통각감퇴 또는 스트레스의 감소 또는 혈청 코르티코스테론 수치의 감소 또는 전도성의 감소 또는 세포 내 칼슘 수치의 감소 또는 상기의 결합을 유발하는 것이다. 바람직하게는 관련된 표현형은 TrpM8 넉-아웃 동물과 동일한 정도로 발현된다.
바람직한 실시태양에서 TrpM8 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-손실 세포의 전도성은 TrpM8 결함 세포의 전도성의 +80% 이내, 바람직하게는 +70% 이내, 더욱 바람직하게는 +60% 이내, 더욱 바람직하게는 +50% 이내, 더욱 바람직하게는 +40% 이내, 더욱 바람직하게는 +30% 이내, 더욱 바람직하게는 +20% 이내, 더욱 바람직하게는 +10% 이내, 더욱 바람직하게는 +5% 이내이다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "TrpM8(전도성)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 TrpM8 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-손실 세포의 세포 내 칼슘 농도는 TrpM8 결함 세포의 세포 내 칼슘 농도의 +80% 이내, 바람직하게는 +70% 이내, 더욱 바람직하게는 +60% 이내, 더욱 바람직하게는 +50% 이내, 더욱 바람직하게는 +40% 이내, 더욱 바람직하게는 +30% 이내, 더욱 바람직하게는 +20% 이내, 더욱 바람직하게는 +10% 이내, 더욱 바람직하게는 +5% 이내이다. 바람직한 실시태양에서 이는 본 출원서에 기술된 "TrpM8(세포 내 칼슘 농도)의 기능적 분석"을 이용하여 측정된다.
바람직한 실시태양에서 TrpM8 길항제에 노출된 야생형 또는 일부 기능-손실 세포의 코르티코스테론 수치는 TrpM8 결함 형질전환 동물의 코르티코스테론 수치의 +80% 이내, 바람직하게는 +70% 이내, 더욱 바람직하게는 +60% 이내, 더욱 바람직하게는 +50% 이내, 더욱 바람직하게는 +40% 이내, 더욱 바람직하게는 +30% 이내, 더욱 바람직하게는 +20% 이내, 더욱 바람직하게는 +10% 이내, 더욱 바람직하게는 +5% 이내이다.
TrpM8 넉아웃 동물 유래의 조직은 잠재적 약물(후보 리간드 또는 화합물)이 TrpM8에 결합하는지 여부를 측정하기 위한 결합 분석에 사용된다. 이러한 분석은 TrpM8 이온 채널 제조시 결함이 있도록 설계된 형질전환 동물로부터 첫 번재 이온 채널 제제를 수득하고 어떠한 확인된 TrpM8 리간드 또는 화합물에 결합하는 것으로 알려진 원료로부터 두 번째 이온 채널 제제를 수득함으로서 수행될 수 있다. 일반적으로 첫 번째 및 두 번째 이온 채널 제제는 수득되는 원료를 제외하고 모든 면에서 유사할 것이다. 예를 들어 형질전환 동물롤부터의 뇌 조직(상기 및 하기 기술된 바와 같은)이 분석에 사용되는 경우 정상(야생형) 동물로부터의 비교 가능한 뇌 조직은 두 번째 이온 채널 제제의 원료로서 사용된다. 각각의 이온 채널 제제는 단독 및 후보 리간드 또는 화합물의 존재시 모두에 대해 TrpM8 이온 채널에 결합하는 것으로 알려진 리간드와 인큐베이트된다. 바람직하게는 후보 리간드 또는 화합물은 일부 다른 농도에서 조사될 것이다.
알려진 리간드에 의한 결합이 시험 화합물에 의해 표시되는 정도는 첫 번째 및 두 번째 이온 채널 제제 모두에 대해 측정된다. 형질전환 동물 유래의 조직은 분석에 직접 사용되거나 조직은 그 자체로 분석에 사용되는 멤브레인 또는 멤브레인 단백질을 분리하도록 처리된다. 바람직한 형질전환 동물은 마우스이다. 리간드는 결합 분석에 적합한 방법을 이용하여 표지된다. 이는 방사선, 효소, 형광 또는 화학발광 표지(뿐만 아니라 상기 더욱 상세히 설명된 다른 표지 기술)를 포함하나 한정적인 것은 아니다.
더욱이 TrpM8 이온 채널의 길항제는 후보 화합물 등을 기능적 TrpM8을 발현하는 동물 및 TrpM8 기능의 감소되거나 제거된 발현과 관련된 표현형적 특성을 나타내는 것으로 확인된 동물에 투여함으로서 확인된다.
비-인간 형질전환 동물을 생성하는 상세한 방법은 하기에 더욱 상세히 설명되어 있다. 형질전환 유저자 컨스트럭트는 동물의 생식계 내로 도입되어 형질전환 포유류를 생성할 수 있다. 예를 들어 하나 또는 일부의 컨스트럭트 카피가 표준 형질전환 기술에 의해 포유류 배아의 게놈 내로 도입된다.
예시적 실시태양에서 형질전환 비-인간 동물은 비-인간 동물의 생식계 내로 트랜스유전자를 도입시킴으로서 생성된다. 다양한 발달 단계의 배아성 타겟 세포는 트랜스유전자를 도입하는데 사용될 수 있다. 배아성 타겟 세포의 발달 단계에 따라 다른 방법이 이용된다. 동물의 특정 계통(들)이 일반적인 우수한 건강, 우수한 배아 산출량, 우수한 배아내 전핵 가시도 및 우수한 재생 적합성에 대해 선택된다. 더욱이 일배체형은 유의적인 인자이다.
트랜스유전자의 배아 내로의 도입은 예를 들어 현미주사, 일렉트로포레이션 또는 리포펙션과 같은 당분야에 알려진 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 하나 이상의 컨스트럭트 카피가 발달 포유류(들)의 세포 내에서 유지되게 하기 위해 포유류 수정란의 전핵 내로 컨스트럭트의 현미주사에 의해 TrpM8 트랜스유전자가 포유류 내로 도입될 수 있다. 수정란 내로 트랜스유전자 컨스트럭트의 도입 후 수정란은 다양한 시간 동안 시험관 내에서 인큐베이트되거나 대리 숙주 내로 재이식되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 시험관 내의 성숙을 위한 인큐베이션도 수행된다. 일반적인 하나의 방법에서 종에 따라 다르게 약 1∼7일간 시험관 내에서 배아를 인큐베이트한 후 대리 숙주 내로 이를 재이식한다.
형질전환적으로 조작된 배아의 자손은 조직 세그먼트의 서던 블럿 분석에 의해 컨스트럭트의 존재에 대해 시험되었다. 하나 이상의 외인성 클론된 컨스트럭트 카피가 이러한 형질전환 배아의 게놈 내로 안정하게 도입되어 유지되는 경우 형질전환적으로 첨가된 컨스트럭트를 지닌 영구적 형질전환 포유류 계통을 수립하는 것이 가능하다.
형질전환적으로 변화된 포유류 자손은 자손의 게놈 내로의 컨스트럭트 도입에 대해 출생 후 분석되었다. 바람직하게는 이러한 분석은 자손으로부터의 염색체 물질 상에 원하는 재조합 단백질 생성물 또는 그의 세그먼트를 코드하는 DNA 서열에 상응하는 프로브를 하이브리다이즈함으로서 달성된다. 그의 게놈 내에 적어도 하나 이상의 컨스트럭트 카피를 포함한 것으로 나타난 이들 포유류 자손은 생장하여 성숙된다.
본 출원서의 목적으로, 접합자는 완전한 생물체 내로 발달하는 것이 가능한 이배체 세포의 형태이다. 일반적으로 접합자는 생식세포 또는 생식세포들로부터의 2개의 반수체 핵의 융합에 의해 자연적으로 또는 인공적으로 형성된 핵을 포함한 난으로 구성될 것이다. 따라서 생식세포 핵은 자연적으로 적합한 것 즉, 분화를 착수하고 기능적 생물체로 발달하는 것이 가능한 생존 가능한 접합자를 유발하는 것이어야 한다. 일반적으로 정배수체 접합자가 바람직하다. 이수배수체 접합자가 수득되는 경우 염색체 수는 기원된 생식세포 생물체의 정배수체 수에 있어서 하나 이상까지 차이가 나지 않아야 한다.
유사한 생물학적 고찰에 더하여 물리적인 고찰도 접합자의 핵 또는 접합자 핵의 일부를 형성하는 유전 물질에 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양(즉, 부피)을 제어한다. 어떠한 유전 물질도 제거되지 않은 경우 첨가될 수 있는 외인성 유전 물질의 양은 물리적으로 분열되지 않고 흡수되는 양으로 제한된다. 일반적으로 삽입되는 외인성 유전 물질의 부피는 약 10 피코리터를 초과하지 않을 것이다. 첨가의 물리적 효과는 접합자의 생존율을 물리적으로 분열시키는 정도로 크지 않아야 한다. 수득되는 접합자의 외인성 유전 물질을 포함한 유전 물질은 접합자의 기능적 생물체로의 분화 및 발달을 생물학적으로 개시하고 유지시키는 것이 가능하여야 하기 때문에 DNA 서열의 수 및 종류의 생물학적 제한 특정한 접합자 및 외인성 유전 물질의 기능에 따라 달라질 것이고 당업자에게 용이하게 명백화될 것이다.
접합자에 첨가되는 트랜스유전자 컨스트럭트의 카피 수는 첨가되는 외인성 유전 물질의 총량에 따라 달라지고 유전적 형질전환을 발생하게 할 수 있는 양이 될 것이다. 이론적으로는 하나의 카피만이 필요하다; 그러나 일반적으로 하나의 카피가 기능적임을 보증하기 위해 예를 들어 트랜스유전자 컨스트럭트의 1,000∼20,000개 카피와 같은 많은 카피가 사용된다. 외인성 DNA 서열의 표현형적 발현을 증가시키기 위해 삽입된 외인성 DNA 서열 각각의 하나 이상의 기능성 카피를 지니는 것이 종종 유리하다.
세포, 핵막 또는 다른 존재하는 세포성 또는 유전성 구조물을 파괴하지 않는 한 외인성 유전 물질의 핵 유전 물질 내로의 첨가를 가능하게 하는 어떠한 기술도 이용될 수 있다. 외인성 유전 물질은 현미주사에 의해 핵 유전 물질 내로 우선적으로 삽입된다. 세포 및 세포 구조물의 현미주사는 알려져 있고 당분야에 이용된다.
재이식은 표준 방법을 이용하여 달성된다. 일반적으로 대리 숙주가 마취되고 배아가 난관 내로 삽입된다. 특정 숙주 내로 이식된 배아의 수는 종에 따라 달라질 것이나 일반적으로 종이 자연적으로 생산하는 자손의 수에 비교 가능할 것이다.
대리 숙주의 형질전환 자손은 적당한 방법에 의해 트랜스유전자의 존재 및/또는 발현에 대해 선별된다. 선별은 종종 적어도 일부의 트랜스유전자에 상보적인 프로브를 이용한 서던 블럿 또는 노던 블럿 분석에 의해 달성된다. 트랜스유전자에 의해 인코드되는 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 분석이 트랜스유전자 생성물의 존재에 대한 대안적 또는 추가적 선별 방법으로 이용된다. 일반적으로 DNA는 꼬리 조직으로부터 준비되고 트랜스유전자에 대한 서던 블럿 분석 또는 PCR에 의해 분석된다. 대안으로 어떠한 조직 또는 세포 형태도 본 분석에 사용되나 최대 수준으로 트랜스유전자를 발현하는 것으로 판단되는 조직 또는 세포가 서던 분석 또는 PCR을 이용하여 트랜스유전자의 존재 및 발현에 대해 시험된다.
트랜스유전자의 존재를 평가하는 대안적 또는 추가적 방법은 효소 및/또는 면역 분석과 같은 적당한 생화학적 분석, 특정 마커 또는 효소 활성에 대한 조직학적 염색, 유속 세포분석 등을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 또한 혈액 분석이 혈액 내 트랜스유전자 생성물의 존재를 검출할 뿐만 아니라 다양한 형태의 혈액 세포의 수준 및 다른 혈액 구성물 상의 트랜스유전자의 효과를 조사하는데 유용하다.
형질전환 동물의 자손은 적당한 파트너와의 형질전환 동물의 교미 또는 형질전환 동물로부터 수득된 난자 및/또는 정자의 시험관 내 수정에 의해 수득된다. 파트너와의 교미가 수행되는 경우 파트너는 형질전환 및/또는 넉아웃이거나 그렇지않고; 형질전환인 경우 동일하거나 다른 트랜스유전자 또는 이 둘 모두를 포함한다. 대안으로 파트너는 모계이다. 시험관 내 수정이 이용되는 경우 수정된 배아는 대리 숙주 내로 이식되거나 시험관 내에서 인큐베이트되거나 또는 이 둘 모두가 수행된다. 이들 방법을 이용하여 자손은 상기 기술된 방법 또는 다른 적당한 방법을 이용하여 트랜스유전자의 존재에 대해 조사된다.
여기서 기술된 방법에 따라 생성된 형질전환 동물은 외인성 유전 물질을 포함할 것이다. 상기 나타난 바와 같이 외인성 유전 물질은 특정한 실시태양에서 TrpM8 이온 채널의 생성을 유발하는 DNA 서열이다. 또한 이러한 실시태양에서 서열은 바람직하게는 특정한 형태의 세포 내에서 트랜스유전자 생성물의 발현을 가능하게 하는 전사 조절 요소 즉, 프로모터에 부착될 것이다.
또한 레트로바이러스 감염이 비-인간 동물 내로 트랜스유전자를 도입시키는데 이용될 수 있다. 발달하는 비-인간 배아는 시험관 내에서 배반포 단계로 배양될 수 있다. 이러한 기간 동안 할구는 레트로바이러스 감염에 대한 타겟이 될 수 있다(Jaenich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). 할구의 유효 감염은 투명대를 제거하는 효소 처리에 의해 수득된다(Manipulating the Mouse Embryo, Hogan eds. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986)). 트랜스유전자를 도입시키는데 사용되는 바이러스 벡터 시스템은 일반적으로 트랜스유전자를 운반하는 복제-결함 레트로바이러스이다(Jahner et al. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten et al. (1985) PNAS 82:6148-6152). 트랜스펙션은 바이러스-생산 세포의 단일층 상에 할구를 배양함으로서 용이하고 효과적으로 수득된다((Van der Putten, supra; Stewart et al. (1987) EMBO J. 6:383-388). 대안으로, 감염은 후기 단계에서 수행될 수 있다. 바이러스 또는 바이러스-생산 세포가 포배강 내로 주입될 수 있다(Jahner et al. (1982) Nature 298:623-628). 도입이 형질전환 비-인간 동물을 형성하는 세포의 서브세트에서만 발생하기 때문에 대부분의 시조물질은 트랜스유전자의 모자이크가 될 것이다. 또한 시조물질은 일반적으로 자손에서 격리되는 게놈 내 다른 위치에서 트랜스유전자의 다양한 레트로바이러스성 삽입을 포함한다. 더욱이 미드게스테이션(midgestation) 배아의 자궁내 레트로바이러스 감염에 의해 생식 계열 내로 트랜스유전자를 도입시키는 것이 가능하다(Jahner et al. (1982) 상동).
트랜스유전자 도입을 위한 타겟 세포의 세 번째 형태는 배아줄기세포(ES)이다. ES 세포는 시험관 내에서 배양되고 배아와 융합된 이식-전 배아로부터 수득된다(Evans et al. (1981) Nature 292:154-156; Bradley et al. (1984) Nature 309:255-258; Gossler et al. (1986) PNAS 83: 9065-9069; and Robertson et al. (1986) Nature 322:445-448). 트랜스유전자는 DNA 트랜스펙션 또는 레트로바이러스-매개 형질도입에 의해 ES 세포 내로 유효하게 도입될 수 있다. 이렇게 형질전환된 ES 세포는 이후 비-인간 동물로부터의 배반포와 결합될 수 있다. 이후 ES 세포는 배아를 집락화하고 키메라 동물의 생식 계열에 기여한다. Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474 참조.
또한 본 발명자는 바람직하게는 상기 기술된 바와 같이 TrpM8 이온 채널 기능에 대한 모델로서 변화된 TrpM8 유전자를 지님으로서 특성화된 비-인간 형질전환 동물 제공한다. 유전자의 변화는 결실 또는 기능 손실 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이화된 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 도입, 다른 종으로부터의 외인성 유전자의 도입 또는 그의 결합을 포함한다. 형질전환 동물은 변이에 대해 동형접합성이거나 이형접합성이다. 이로부터 유래된 동물 및 세포는 TrpM8 이온 채널 기능을 조절하는 생물학적으로 활성인 약제를 선별하는데 유용하다. 선별 방법은 통증 및 암, 특히 전립선암의 잠재적 치료제의 특이성 및 작용을 측정하는데 특히 유용하다. 동물은 뇌, 심장, 비장 및 간과 같은 정상 조직 및 기관 내에서의 TrpM8 이온 채널의 역할 및 그의 기능 상의 효과를 조사하는 모델로서 유용하다.
또다른 관점은 기능적으로 분열된 내인성 TrpM8 유전자를 지니고 그의 게놈 내에서 운반되고 이형성 TrpM8 단백질(즉, 또다른 종으로부터의 TrpM8)를 인코드하는 트랜스유전자를 발현하는 형질전환 비-인간 동물에 관한 것이다. 바람직하게는 동물은 마우스이고 이형성 TrpM8은 인간 TrpM8이다. 인간 TrpM8로 재구성된 동물 또는 이러한 동물 유래의 세포주는 생체 내 및 시험관 내에서 인간 TrpM8을 억제하는 약제를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를 들어 인간 TrpM8을 통해 신호전달을 유도하는 자극은 시험되는 약제의 존재 및 부재시 동물 또는 세포주에 투여될 수 있고, 동물 또는 세포주의 반응이 측정될 수 있다. 생체 내 및 시험관 내에서 인간 TrpM8를 억제하는 약제는 약제의 부재시 반응 대비 약제의 존재시 반응을 감소시키는지에 따라 확인될 수 있다.
또한 본 발명자는 TrpM8 결함 형질전환 비-인간 동물("TrpM8 서브유니트 넉-아웃")을 제공한다. 이러한 동물은 바람직하게는 내인성 TrpM8 이온 채널 게놈 서열이 분열되거나 결실됨으로서 저하되거나 전혀 없는 TrpM8 이온 채널 활성을 발현하는 것이다. 바람직하게는 이러한 동물은 이온 채널 활성을 발현하지 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 동물은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 TrpM8 이온 채널의 활성을 발현하지 않는다. TrpM8 이온 채널 넉-아웃은 하기 더욱 상세히 기술된 바와 같이 당분야에 알려진 다양한 방법으로 생성된다.
또한 본 발명은 숙주 세포 내에서 TrpM8 유전자를 기능적으로 분열시키기 위한 핵산 컨스트럭트에 관한 것이다. 핵산 컨스트럭트는: a) 비-상동성 대치 부분; b) 첫 번째 TrpM8 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지닌, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 c) 두 번째 TrpM8 유전자 서열에 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연 발생적 내인성 TrpM8 유전자 내의 첫 번째 TrpM8 유전자의 다운스트림 위치를 지닌, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역. 더욱이 핵산 분자가 숙주 세포 내로 도입시 첫 번째 및 두 번째 상동성 구역은 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포 내 내인성 TrpM8 유전자 사이의 상동적 재조합에 충분한 길이다. 바람직한 실시태양에서 비-상동성 대치 부분은 바람직하게는 lacZ 및 양성 선택 발현 카세트를 포함하고, 바람직하게는 조절 요소(들)에 실시 가능하게 결합되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자를 포함한 발현 수용체를 포함한다.
바람직하게는 첫 번째 및 두 번째 TrpM8 유전자 서열은 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체로부터 유래한다.
또다른 관점은 상기 기술된 핵산 컨스트럭트가 도입되는 재조합 벡터에 관한 것이다. 또다른 관점은 핵산 컨스트럭트가 도입되어 핵산 컨스트럭트와 숙주 세포의 내인성 TrpM8 유전자 사이의 상동적 재조합을 가능하게 하여 내인성 TrpM8 유전자의 기능적 분열을 유발하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 간, 뇌, 비장 또는 심장 또는 마우스 배아줄기세포와 같은 다기능성 세포로부터의 TrpM8를 정상적으로 발현하는 포유류 세포가 될 수 있다. 또한 핵산 컨스트럭트가 도입되고 내인성 TrpM8 유전자로 상동적으로 재조합된 배아줄기세포의 발달은 배아줄기세포로부터 유전되고 따라서 그의 게놈 내에 TrpM8 유전자를 운반하는 세포를 지닌 형질전환 비인간 동물을 생성한다. 이후 그의 생식 계열 내에 TrpM8 유전자 분열을 운반하는 동물이 선택되고 모든 체세포 또는 생식 세포 내 TrpM8 유전자 분열을 지닌 동물이 번식될 수 있다. 이후 이러한 마우스가 TrpM8 유전자 분열에 대한 동형접합성으로 번식될 수 있다.
항체
본 출원서의 목적에 있어서, "항체"라는 용어는 상세한 기술이 없는 한 폴리클론, 단일클론, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성된 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 이러한 단편은 타겟 물질에 대한 결합 활성을 보유한 전체 항체의 단편, Fv, F(ab'), F(ab')2 단편뿐만 아니라 단일 사슬 항체(scFv), 융합 단백질 및 항체의 항원-결합 사이트를 포함한 다른 합성 단백질을 포함한다. 항체 및 그의 단편은 예를 들어 EP-A-23900에 기술된 바와 같은 인간화 항체이다. 더욱이 예를 들어 미국특허 제5,545,807호 및 6,075,181호에 기술된 바와 같이 전체 인간 변이가능 구역(또는 그의 단편)을 지니 항체도 이용된다. 중화 항체 즉, 아미노산 서열 물질의 생물학적 활성을 억제하는 것이 진단제 및 치료제로서 특히 바람직하다.
항체는 면역법 또는 파지 디스플레이 라이브러리의 이용과 같은 표준 기술에 의해 생성된다.
폴리펩타이드 또는 펩타이드는 알려진 기술에 의해 항체를 발달시키는데 사용된다. 이러한 항체는 TrpM8 이온 채널 단백질 또는 상동체, 단편 등에 특이적으로 결합하는 것이 가능하다.
폴리클론 항체가 바람직한 경우 선택된 포유류(즉, 마우스, 토끼, 염소, 말 등)는 관련 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 포함한 면역원성 조성물로 면역된다. 숙주 종에 따라 다르게 다양한 보조제가 면역 반응을 증가시키기 위해 사용된다. 이러한 보조제는 수산화알루미늄과 같은 Freund 미네랄 겔 및 리소레시틴과 같은 표면 활성 물질, 플루론산 폴리올, 다음이온, 펩타이드, 오일 에멀젼, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌 및 디니트로페놀을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. BCG(Bacillus Calmette-Guerin) 및 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum)이 전신 방어를 자극하는 목적으로 면역학적으로 절충된 개체에 투여되는 아미노산 서열 물질을 정제시 이용되는 잠재적으로 유용한 인간 보조제이다.
면역된 동물로부터의 혈청이 수집되고 알려진 절차에 따라 처리된다. TrpM8 폴리펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 폴리클론 항체를 포함한 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 포함하는 경우 폴리클론 항체는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 폴리클론 항혈청을 생성하고 처리하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이러한 항체가 제조되기 위해서는 본 발명자는 동물 또는 인간에서 면역원으로 사용하기 위한 또다른 아미노산 서열로 합텐화된(haptenised) TrpM8의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 제공한다.
또한 TrpM8 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대해 지시된 단일클론 항체가 당업자에 의해 용이하게 생성될 수 있다. 하이브리도마에 의해 단일클론 항체를 제조하는 일반적인 방법론이 잘 알려져 있다. 영구적 항체-생성 세포주는 세포 융합 및 발암성 DNA로의 B 림프구의 직접적인 형질전환 또는 에브스타인-바 바이러스로의 트랜스펙션과 같은 다른 기술에 의해 생성될 수 있다. 궤도 에피토프에 대해 생성된 단일클론 항체의 패널은 다양한 특성 즉, 동형 및 에피토프 친화성에 대해 선별될 수 있다.
단일클론 항체는 배양액 내 지속적인 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 어떠한 기술도 이용하여 제조된다. 이는 Koehler and Milstein (1975 Nature 256:495-497)에 의해 처음으로 기술된 하이브리도마 기술, 트리오마(trioma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술(Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030) 및 EBV-하이브리도마 기술(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc., 1985)을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
더욱이 적당한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 지닌 분자를 수득하기 위해 "키메라 항체"의 생성을 위해 개발된 기술, 마우스 항체 유전자의 인간 항체 유전자로의 스플라이싱(splicing)이 이용될 수 있다(Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604-608; Takeda et al (1985) Nature 314:452-454). 대안으로 단일 사슬 항체의 생성을 위해 설명된 기술(미국특허 제4,946,779호)이 특정 단일 사슬 항체 물질을 생성하도록 개조될 수 있다.
TrpM8 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 수득 가능한 에피토프에 대한 단일클론 항체 및 폴리클론 항체 모두 진단에 특히 유용하고, 중화된 것은 수동 면역화에 유용하다. 특히 단일클론 항체는 항-유전형 항체를 유발하는데 사용된다. 항-유전형 항체는 보호가 바람직한 물질 및/또는 약제의 "내부 이미지"를 운반하는 면역글로불린이다. 항-유전형 항체를 유발하는 기술은 당분야에 알려져 있다. 이들 항-유전형 항체는 치료에도 유용하다.
또한 항체는 림프구 집단 내에서 생체 내 생성을 유도하거나 Orlandi et al (1989, Proc Natl Acad Sci 86: 3833-3837) 및 Winter G and Milstein C(1991; Nature 349:293-299)에 개시된 매우 특이적 결합 시약의 재조합 면역글로불린 라이브러리 또는 패널을 선별함으로서 생성된다.
또한 폴리펩타이드 또는 펩타이드에 대한 특이적 결합 사이트를 포함한 항체 단편이 생성된다. 예를 들어 이러한 단편은 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편 및 F(ab')2 단편의 이황 결합을 환원시킴으로서 생성될 수 있는 Fab 단편을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 대안으로, Fab 발현 라이브러리가 구축되어 원하는 특이성을 지닌 단일클론 Fab 단편의 신속하고 용이한 확인을 가능하게 한다(Huse WD et al (1989) Science 256:1275-1281).
또한 단일 사슬 항체의 생성 기술(미국특허 제4,946,778호)이 TrpM8 폴리펩타이드에 대한 단일 사슬 항체를 생성하도록 개조될 수 있다. 또한 형질전환 마우스 또는 다른 포유류를 포함한 다른 생물체가 인간화 항체를 발현시키는데 사용된다.
상기-기술된 항체는 폴리펩타이드를 발현하는 클론을 분리하거나 확인하기 위해 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 폴리펩타이드를 정제하기 위해 사용된다.
또한 TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드에 대한 항체는 통증 및 암, 특히 신경성 통증 및 전립선암을 치료하는데 이용될 수 있다.
진단 분석
또한 본 발명은 진단 시약으로서의 진단 또는 유전자 분석에 이용하기 위한 TrpM8 이온 채널 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드(뿐만 아니라 그의 상동체, 변이체 및 유도체)의 이용에 관한 것이다. 또한 TrpM8 이온 채널 핵산에 상보적이거나 이에 하이브리다이즈하는 것이 가능한 핵산(상동체, 변이체 및 유도체 포함)뿐만 아니라 TrpM8 폴리펩타이드에 대한 항체가 이러한 분석에 유용하다.
기능장애와 관련된 TrpM8 이온 채널 유전자의 돌연변이화된 형태의 검출은 TrpM8 이온 채널의 저-발현, 과-발현 또는 변화된 발현으로부터 유발된 질병의 진단 또는 감수성의 진단에 첨가되거나 이를 한정할 수 있는 진단 도구를 제공할 것이다. TrpM8 이온 채널 유전자(대조군 서열을 포함) 내 돌연변이를 지닌 개체는 다양한 기술에 의해 DNA 수준에서 검출된다.
예를 들어 DNA는 환자로부터 분리되고 TrpM8의 DNA 다형성 패턴이 측정된다. 확인된 패턴은 TrpM8의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 대조군과 비교된다. 이후 TrpM8 관련 질환과 관련된 유전자 다형성 패턴을 발현하는 환자가 확인된다. TrpM8 이온 채널의 유전자 분석은 당분야에 알려진 기술에 의해 수행된다. 예를 들어 개체는 RFLP 또는 SNP 분석 등에 의해 TrpM8 대립유전자의 DNA 서열을 측정함으로서 선별된다. 환자는 TrpM8에 대한 유전자 서열 또는 그의 발현을 조절하는 어떠한 서열 내 DNA 다형성의 존재를 검출함으로서 TrpM8의 과-, 저- 또는 비정상 발현과 관련된 질환에 대한 유전자 소인을 지닌 것으로 확인된다.
이후 이렇게 확인된 환자는 TrpM8 관련 질환의 발생을 예방하도록 또는 더욱 적극적으로는 TrpM8 관련 질환의 초기 단계에서 질환의 발생 또는 발달을 예방하도록 치료될 수 있다. TrpM8 관련 질환은 스트레스, 불안, 우울증, 통증 및 암, 특히 신경성 통증 및 전립선암을 포함한다.
또한 본 발명자는 TrpM8 관련 질환과 관련된 환자의 유전자 다형성 패턴의 확인용 키트를 개시한다. 상기 키트는 DNA 표본 수집기 및 환자의 TrpM8 관련 질환에 대한 감수성을 측정하기 위해 대조군 표본에 비교되는 유전자 다형성 패턴을 측정하는 기구를 포함한다. 또한 TrpM8 폴리펩타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드(또는 그의 단편)에 대한 항체를 포함한 TrpM8 관련 질환의 진단용 키트가 제공된다.
진단용 핵산은 혈액, 소변, 타액, 생검 또는 부검 조직 물질과 같은 피험자의 세포로부터 수득된다. 바람직한 실시태양에서 DNA는 환자의 손가락을 찔러 흡수지 상에서 수집된 혈액으로부터 수집된 혈액 세포로부터 수집된다. 또다른 바람직한 실시태양에서 혈액은 AmpliCard.TM.(University of Sheffield, Department of Medicine and Pharmacology, Royal Hallamshire Hospital, Sheffield, England S10 2JF) 상에서 수집될 것이다.
DNA는 검출을 위해 직접적으로 이용되거나 분석 전 PCR 또는 다른 증폭 기술을 이용함으로서 효소적으로 증폭된다. 목적 유전자 내 특정 다형성 DNA 구역을 타겟하는 올리고뉴클레오타이드 DNA 프라이머가 제조되어 타겟 서열의 PCR 반응 증폭이 달성되게 된다. 또한 RNA 또는 cDNA는 유사한 형태로 주형으로 사용된다. 이후 주형 DNA으로부터 증폭된 DNA서열이 제한효소를 이용하여 분석되어 증폭된 서열 내에 존재하는 유전자 다형성을 측정하여 환자의 유전자 다형성 프로파일을 제공한다. 제한 단편 길이는 겔 분석에 의해 확인된다. 대안으로 또는 그와 결합하여 SNP(단일 뉴클레오타이드 다형성) 분석과 같은 기술이 이용된다.
결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교시 증폭된 생성물 크기 상의 변화에 의해 검출될 수 있다. 점돌연변이는 증폭된 DNA를 표지된 TrpM8 이온 채널 뉴클레오타이드 서열에 하이브리다이즈시킴으로서 확인될 수 있다. 완벽하게 매치된 서열은 RNase 분해 또는 분해 온도 상의 차이에 의해 미스매치된 이중나선과 구별될 수 있다. 또한 DNA 서열 차이는 변성제와 함께 또는 변성제 없이 겔 내에서의 DNA 단편의 전기영동 이동 상의 변화 또는 직접적인 DNA 서열분석에 의해 검출된다. Myers et al, Science (1985)230:1242 참조. 특정 위치에서의 서열 변화는 RNAse 및 S1 보호와 같은 뉴클레아제 보호 분석 또는 화학적 분열방법에 의해 판명된다. Proc Natl Acad Sci USA (1985) 85: 4397-4401 참조. 또다른 실시태양에서 TrpM8 이온 채널 뉴클레오타이드 서열 또는 그의 단편을 포함한 올리고뉴클레오타이드 프로브의 어레이가 구축되어 유전자 돌연변이의 유효한 선별을 수행할 수 있게 한다. 어레이 기술 방법은 잘 알려져 있고 일반적인 적용 가능성을 지니고 유전자 발현, 유전자 결합 및 유전자 변이성을 포함한 다양한 분자유전학 상의 의문을 설명하는데 사용될 수 있다(예를 들어 M.Chee et al., Science, Vol 274, pp 610-613 (1996) 참조).
단일 나선 구조 다형성(SSCP)은 돌연변이와 야생형 핵산 사이의 전기영동 이동 상의 차이를 검출하는데 이용된다(Orita et al. (1989) Proc Natl. Acad. Sci USA: 86:2766, see also Cotton (1993) Mutat Res 285:125-144; and Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9:73-79). 표본 및 대조군 TrpM8 핵산의 단일-나선 DNA 단편은 변성되고 복원을 가능하게 한다. 단일-나선 핵산의 2차 구조는 서열에 따라 다르고 결과적인 전기영동 이동 상의 차이는 단일 염기 변화의 검출을 가능하게 한다. DNA 단편은 표지되거나, 표지된 프로브로 검출된다. 분석 민감도는 RNA(DNA 보다는)를 이용하여 증가되고, 2차 구조는 서열 변화에 더욱 민감하다. 바람직한 실시태양에서 주된 방법은 전기영동 이동 상의 변화를 기반으로 이중 나선 이질이중나선 분자를 분리하는 이질이중나선 분석을 이용한다(Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).
진단 분석은 기술된 방법에 의한 TrpM8 유전자 돌연변이의 검출을 통해 이러한 통증 및 암, 특히 신경성 통증 및 전립선암과 같은 감염에 대한 감수성을 진단하거나 측정하는 방법을 제공한다.
TrpM8 폴리펩타이드 및 핵산의 존재는 표본 내에서 검출된다. 따라서 상기 기입된 감염 및 질병은 피험자 유래의 표본으로부터 비정상적으로 감소되거나 증가된 수준의 TrpM8 폴리펩타이드 또는 TrpM8 이온 채널 mRNA를 측정하는 단계를 포함한 방법에 의해 진단될 수 있다. 표본은 증가되거나 감소되거나 비정상적인 TrpM8 발현과 관련된 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체로부터의 세포 또는 조직 표본을 포함한다. 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 생물체의 TrpM8 발현 수준 또는 패턴은 질환의 진단에 의해 정상 생물체 내 발현 수준 또는 패턴과 유용하게 비교된다.
따라서 일반적으로 본 발명자는 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 표본을 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한 표본 내 TrpM8 핵산을 포함한 핵산 존재의 검출 방법을 개시한다. 예를 들어 핵산 프로브는 TrpM8 서브유니트 핵산 또는 그의 일부에 특이적으로 결합하고 그 둘 사이의 결합이 검출되고; 복합체 자체의 존재도 검출된다. 더욱이 본 발명자는 TrpM8 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 항체에 세포 표본을 접촉시키고 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터함으로서 TrpM8 폴리펩타이드의 존재를 검출하는 방법을 포함한다. 이는 항체와 폴리펩타이드 사이에 형성된 복합체의 존재를 모니터하거나 폴리펩타이드와 항체 사이의 결합을 모니터함으로서 편리하게 달성된다. 두 실체 사이의 결합의 검출 방법은 당분야에 알려져 있고 FRET(형광 공명 에너지 전달), 표면 플라스몬 공명 등을 포함한다.
감소되거나 증가된 발현은 예를 들어 PCR, RT-PCR, RNAse 보호, 노던 블럿팅 및 다른 하이브리디제이션 방법과 같은 폴리뉴클레오타이드의 정량화를 위한 당분야에 잘 알려진 어떠한 방법을 이용하여도 RNA 수준에서 측정될 수 있다. 숙주 유래의 표본 내 TrpM8와 같은 단백질 수준을 측정하는데 이용되는 분석 기술은 당업자에게 잘 알려져 있다. 이러한 분석 방법은 방사면역측정법, 경합-반응분석, 웨스턴 블럿 분석 및 ELISA 분석을 포함한다.
또한 본 발명자는 예를 들어 통증 및 암, 특히 신경성 통증 및 전립선암과 같은 질병(감염을 포함) 또는 이러한 질병에 대한 감수성용 진단 키트를 개시한다. 진단 키트는 TrpM8 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편; 상보성 뉴클레오타이드 서열; TrpM8 폴리펩타이드 또는 그의 단편 또는 TrpM8 폴리펩타이드에 대한 항체를 포함한다.
염색체 분석
또한 여기서 기술된 뉴클레오타이드 서열은 염색체 확인에 유용하다. 상기 서열은 인간 개체 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 타겟되고 이와 하이브리다이즈할 수 있다. 상기 기술된 바와 같이 인간 TrpM8 이온 채널은 호모 사피엔스 염색체 2q37에 지도화된 것으로 나타났다.
염색체로의 관련 서열의 지도화는 이들 서열을 유전자 관련 질환과 연관시키는 중요한 첫 번째 단계이다. 서열이 정확한 염색체 위치로 지도화되면 염색체 상의 서열의 물리적 위치는 유전자 지도 데이터와 상호관련될 수 있다. 이러한 데이터는 예를 들어 V. McKusick, Mendelian heritance in Man(온라인 상의 Johns Hopkins University Welch Medical Library에서 이용 가능)에 나타나 있다. 이후 동일한 염색체 구역으로 지도화된 유전자와 질병 사이의 관계는 계통 분석(물리적으로 인접한 유전자의 공동상속)을 통해 확인된다.
또한 영향 받은 개체와 영향 받지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열 상의 차이가 측정될 수 있다. 돌연변이가 영향 받은 개체의 일부 또는 전부에서 관찰되나 정상 개체에서는 관찰되지 않는 경우 돌연변이는 질병의 유발 요인으로 간주된다.
예방 및 치료 방법
또한 본 발명자는 과도하고 불충분한 양의 TrpM8 이온 채널 활성 모두에 관련한 비정상적 이상의 치료 방법을 제공한다.
TrpM8 이온 채널 활성이 과도한 경우 일부 접근이 이용 가능하다. 하나의 접근은 상기 기술된 억제제 화합물(길항제)을 TrpM8 이온채널에 대한 리간드의 결합을 차단하거나 두 번째 신호를 억제하여 비정상적 이상을 완화시킴으로서 활성화를 억제하는데 효과적인 양으로 약제적으로 수용 가능한 담체와 함께 피험체에 투여하는 것을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 TrpM8 이온 채널과 경합하는 리간드에 결합하는 것이 가능한 용해성 형태의 TrpM8 폴리펩타이드가 투여된다. 이러한 경합제의 일반적인 실시태양은 TrpM8 폴리펩타이드의 단편을 포함한다.
또다른 접근에서 내인성 TrpM8 이온 채널을 인코드하는 유전자의 발현이 발현 차단 기술을 이용하여 억제될 수 있다. 이러한 알려진 기술은 내부적으로 생성되거나 별도로 투여되는 안티센스 서열의 이용을 포함한다. 예를 들어 OConnor, J Neurochem (1991) 56:560 in Oligodeoxvnucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, Fla. (1988) 참조. 대안으로 유전자와 함께 삼중 헬릭스를 형성하는 올리고뉴클레오타이드가 보충될 수 있다. Lee et al., Nucleic Acids Res (1979) 6:3073; Cooney et al., Science (1988) 241:456; Dervan et al., Science (1991) 251:1360 참조. 이들 올리고머는 그 자체로 투여될 수 있거나 관련 올리고머가 생체 내에서 발현될 수 있다.
TrpM8 이온 채널의 저-발현 및 그의 활성과 관련한 비정상적 이상을 치료하기 위해 일부 접근이 유용하다. 하나의 접근은 TrpM8 이온 채널을 활성화시키는 화합물 즉, 상기 기술된 작용제를 약제적으로 수용 가능한 담체와 결합하여 피험체에 투여하여 비정상적 이상을 완화시키는 것을 포함한다. 대안으로, 피험체 내의 관련 세포에 의한 TrpM8 이온 채널의 내인성 생성에 효과를 나타내지 위해 유전자 치료가 이용된다. 예를 들어 TrpM8 폴리뉴클레오타이드는 상기 기술된 바와 같이 복제 결함 레트로바이러스 벡터 내 발현을 위해 설계된다. 이후 레트로바이러스 발현 컨스트럭트가 분리되고 TrpM8 폴리펩타이드를 인코드하는 RNA를 포함한 레트로바이러스 플라스미드 벡터로 형질도입된 팩키징 세포 내로 도입되어 팩키징 세포가 목적 유전자를 포함한 감염성 바이러스 입자를 생성하게 된다. 이들 생산자 세포는 생체 내 세포의 설계 및 생체 내 폴리펩타이드의 발현을 위해 피험체에 투여된다. 유전자 치료의 개요를 위해 Chapter 20, Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches,(및 참고문헌) in Human Molecular Genetics, T Strachan and A P Read, BIOS Scientific Publishers Ltd (1996) 참조.
포뮬레이션 및 투여
용해성 형태의 TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드와 같은 펩타이드 및 작용제 및 길항제 펩타이드 또는 소분자가 적당한 약제적 담체와 결합하여 포뮬레이트된다. 이러한 포뮬레이션은 치료적으로 효과적인 양의 폴리펩타이드 또는 화합물 및 약제적으로 수용 가능한 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 포뮬레이션은 투여 형태를 만족시켜야 하고 당업자에게 잘 알려져 있다. 또한 본 발명은 하나 이상의 상기 기술된 조성물 성분으로 충진된 하나 이상의 용기를 포함한 약제적 팩 및 키트에 관한 것이다.
TrpM8 폴리펩타이드 및 다른 화합물은 단독으로 또는 치료 화합물과 같은 다른 화합물과 결합하여 이용된다.
약제적 조성물의 전신 투여의 바람직한 형태는 일반적으로 정맥주사에 의한 주사를 포함한다. 피하, 근육내 또는 복막내와 같은 다른 경로 주사도 이용될 수 있다. 전신 투여의 대안적 수단은 담즙산염 또는 푸시딘산 또는 다른 세정제를 포함한다. 더욱이 창자용 또는 캡슐화된 포뮬레이션으로 적당히 포뮬레이트되는 경우 구강 투여도 가능하다. 이들 화합물의 투여는 연고, 페이스트, 겔 등의 형태로 국부적이 되고/또는 집중화된다.
필요한 투여량 범위는 펩타이드의 선택, 투여 경로, 포뮬레이션 성질, 피험체 조건의 특성 및 주치의의 판단에 따라 달라진다. 그러나 적당한 투여량은 피험체의 0.1∼100 ㎍/kg의 범위이다. 그러나 유용한 화합물의 다양성 및 다양한 투여 경로의 다른 효율의 견지에서 필요한 투여량 내의 광범위한 변화가 예측된다. 예를 들어 구강 투여는 정맥주사에 의한 투여보다 더 높은 투여량을 요구한다. 이들 투여량 수준 상의 차이는 당분야에 잘 이해되는 바와 같이 최적조건을 위한 표준 경험상 관례를 이용하여 조정될 수 있다.
또한 치료에 사용되는 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이 "유전자 치료"로 표기되는 치료 양상으로 피험체 내에서 내인적으로 생성될 수 있다. 따라서 예를 들어 피험체 유래의 세포는 예를 들어 레트로바이러스 플라스미드 벡터의 이용에 의해 생체 외에서 폴리펩타이드를 인코드하기 위해 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오타이드로 설계된다. 이후 세포는 피험체 내로 도입된다.
약제적 조성물
또한 본 발명자는 약제적으로 효과적인 양의 TrpM8 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 벡터 또는 그의 항체 및 선택적으로는 약제적으로 수용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제(그의 결합을 포함)를 투여하는 것을 포함한 약제적 조성물을 개시한다.
약제적 조성물은 인간 및 가축 약물에서 인간 또는 동물 용도가 되고 일반적으로 하나 이상의 약제적으로 수용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함한다. 치료제로서 수용 가능한 담체 또는 희석제는 약제학 분야에 잘 알려져 있고 예를 들어 Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A. R. Gennaro edit. 1985)에 기술되어 있다. 약제적 담체, 부형제 또는 희석제의 선택은 투여의 의도된 경로 및 표준 약제적 실습에 따라 선택될 수 있다. 약제적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제, 어떠한 적당한 바인더(들), 윤활제(들), 현탁제(들), 코팅제(들), 용해제(들)를 포함한다.
방부제, 안정화제, 염료 및 향미제가 약제적 조성물에 제공된다. 방부제의 예는 벤조산나트륨, 소르빈산, p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 항산화제 및 현탁제도 사용된다.
다른 전달 시스템에 따라 다른 조성물/포뮬레이션 필요조건이 존재한다. 예로서 여기서 기술된 약제적 조성물은 조성물이 미니-펌프를 이용하거나 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취가능 용액에 의해 또는 조성물이 전달을 위해 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주사형태로 포뮬레이트된 비경구적으로 전달되도록 포뮬레이트된다. 대안으로 포뮬레이션은 두 경로 모두에 의해 전달되도록 고안된다.
약제가 위장 점막을 통해 점막으로 전달되는 경우 위장관을 통과하는 동안 안정하게 유지될 수 있어야 한다; 예를 들어 단백질 분해성 분해에 저항적이고 산 pH에 안정적이고 담즙의 세정 효과에 저항적이어야 한다.
적당한 경우 약제적 조성물은 좌약 또는 페서리 형태로 흡입에 의해, 로션, 용액, 크림, 연고 또는 살포 분말 형태 및 피부 패취의 이용에 의해 국부적으로, 전분 또는 락토오스와 같은 부형제를 포함한 정제 형태 또는 캡슐 또는 오불(ovule) 단독 또는 부형제와 결합된 형태 또는 향미제 또는 착색제를 함유한 엘릭서(elixir), 용액 또는 현탁액 형태로 투여될 수 있거나, 예를 들어 정맥내, 근육내 또는 피하와 같은 비경구적으로 주입될 수 있다. 비경구적 투여의 경우 조성물은 예를 들어 혈액과 등장액을 생성기에 충분한 염 또는 모노사카라이드와 같은 다른 물질을 함유한 멸균 수용액 형태로 사용되는 것이 최상이다. 구강 또는 설하 투여의 경우 조성물은 편리한 형태로 포뮬레이트될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge) 형태로 투여된다.
백신
또다른 실시태양은 불안, 스트레스, 우울증, 통증 및 암, 특히 전립선암으로부터 동물을 보호하기 위해 항체 및/또는 T 세포 면역 반응을 생성하기에 충분한 TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드 또는 그의 단편으로 포유류를 접종시키는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 질병으로부터 상기 동물을 보호하도록 이러한 면역 반응을 유도하기 위해 생체 내에서 TrpM8 폴리뉴클레오타이드의 발현을 지시하는 벡터를 통해 TrpM8 폴리펩타이드를 전달하는 단계를 포함한 포유류 내 면역 반응의 유도 방법에 관한 것이다.
또다른 실시태양은 TrpM8 폴리펩타이드 또는 TrpM8 유전자를 포함한 조성물이 포유류 숙주 내로 도입시 TrpM8 폴리펩타이드에 대해 포유류 내에서 면역 반응을 유도하는 면역적/백신 포뮬레이션(조성물)에 관한 것이다. 백신 포뮬레이션은 적당한 담체를 더욱 포함한다.
TrpM8 폴리펩타이드가 위에서 분해되기 때문에 바람직하게는 비경구적으로(피하, 근육내, 정맥내, 피내 등의 주사를 포함) 투여된다. 비경구적 투여에 적당한 포뮬레이션은 항산화제, 완충액, 세균발육저지제 및 포뮬레이션이 수용체의 혈액과 등장성을 이루게 하는 용질을 함유한 수성 및 비-수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 또는 농화제를 포함한 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 포뮬레이션은 밀봉된 앰플 및 바이알과 같은 단위-투여 또는 다중-투여 용기로 제공되고, 사용하기 바로 전에 멸균 액체 담체의 첨가가 필요한 동결-건조 조건으로 보관된다. 또한 백신 포뮬레이션은 오일-인 워터 시스템 및 당분야에 알려진 다른 시스템과 같은 포뮬레이션의 면역원성을 증가시키기 위한 보강 시스템을 포함한다. 투여량은 백신의 특이적 활성에 따라 달라질 것이고 일반 실험에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
백신은 하나 이상의 TrpM8 폴리펩타이드 또는 펩타이드로부터 제조된다.
활성 성분(들)로서 면역원성 폴리펩타이드(들) 또는 펩타이드(들)을 포함한 백신의 제조는 당업자에게 알려져 있다. 일반적으로 이러한 백신은 액체 용액 똔느 현탁액과 같은 주사제로서 제조되고; 주사 전 액체 내 용액 또는 현탁액에 적당한 고형 형태로도 제조된다. 또한 제제는 에멀젼화되거나 리포솜 내에 캡슐화된 단백질이다. 활성 면역원성 성분은 약제적으로 수용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적당한 부형제는 예를 들어 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 및 그의 결합이다.
더욱이 바람직한 경우 백신은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 및/또는 백신의 유효성을 증가시키는 보조제와 같은 최소량의 보조 물질을 포함한다. 효과적인 보조제의 예는 하기를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다: 수산화알루미늄, N-아세틸-무라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민(thr-MDP), N-아세틸-노르-무라밀-L-알라닐-D-이소글루타민(CGP 11637, nor-MDP로 표기), N-아세틸무라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1-2-디팔미토일-sn-글리세로-3-하이드록시포스포릴록시)-에틸아민(CGP 19835A, MTP-PE로 표기), 및 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀젼 내에 박테리아로부터 추출된 3가지 성분인 모노포스포릴 지질 A, 트레할로스 디마이콜레이트 및 세포벽 골격(MPL+TDM+CWS)을 포함한 RIBI.
보조제 및 다른 약제의 또다른 예는 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 황산칼륨알루미늄(백반), 황산베릴리움, 실리카, 카올린, 탄소, 워터-인-오일 에멀젼, 오일-인-워터 에멀젼, 무라밀 디펩타이드, 박테리아 내독소, 지질 X, 코리네박테리움 파르붐(프로피오노박테리움 아크네스(Propionobacterium acnes)), 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 폴리리보뉴클레오타이드, 알긴산나트륨, 라놀린, 리소레시틴, 비타민 A, 사포닌, 리포솜, 레바미솔, DEAE-덱스트란, 차단된 코폴리머 또는 다른 합성 보조제를 포함한다. 이러한 보조제는 예를 들어 Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.) 또는 Freund's Incomplete Adjuvant and Complete Adjuvant(Difco Laboratories, Detroit, Michigan)와 같은 다양한 원료로부터 상업적으로 구입 가능하다.
일반적으로 Amphigen(오일-인-워터), Alhydrogel(수산화알루미늄) 또는 Amphigen과 Alhydrogel의 혼합물과 같은 보조제가 사용된다. 수산화알루미늄만이 인간 용도로 승인된다.
면역원 및 보조제의 비율은 효과적인 양으로 존재하는 한 광범위한 범위로 변화될 수 있다. 예를 들어 수산화알루미늄은 백신 혼합물의 약 0.5%의 양으로 존재할 수 있다(Al2O3 기초). 편리하게는 백신은 0.2∼200 ㎍/ml, 바람직하게는 5∼50 ㎍/ml, 가장 바람직하게는 15 ㎍/ml 범위의 최종농도의 면역원을 포함하도록 포뮬레이트된다.
포뮬레이션 후 백신은 멸균 용기에 포함된 후 밀봉되고 예를 들어 4℃와 같은 저온에서 보관되거나 동결-건조된다. 동결건조는 안정한 형태로 장기간 보관을 가능하게 한다.
백신은 통상적으로 피하로 또는 근육내로 같은 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약을 포함하고, 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
환자로의 구강 투여를 위한 캡슐, 정제 및 환약은 예를 들어 Eudragit "S", Eudragit "L", 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함한 장 코팅제와 함께 제공된다.
TrpM8 폴리펩타이드는 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 포뮬레이트된다. 약제적으로 수용 가능한 염은 산 첨가 염(펩타이드의 자유 아미노기로 형성된)을 포함하고 염산 또는 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 수산, 주석산 및 말레산과 같은 유기산으로 형성된다. 또한 자유 카르복실기로 형성된 염은 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘 또는 수산화제2철과 같은 무기 염기 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘 및 프로카인과 같은 유기 염기로부터 유래된다.
투여
일반적으로 의사는 피험 개체에 가장 적당한 실질적인 투여량을 결정할 것이고, 이는 특정 환자의 연령, 체중 및 반응에 따라 달라질 것이다. 하기 투여량은 평균 사례의 예이다. 물론 더 높거나 더 낮은 투여량 범위가 적당한 개인적 경우도 존재한다.
여기서 기술된 약제적 및 백신 조성물은 직접 주입에 의해 투여된다. 조성물은 비경구적, 점막, 근육내, 정맥내, 피하, 안구내 또는 경피성 투여를 위해 포뮬레이트된다. 일반적으로 각각의 단백질은 체중의 0.01∼30 mg/kg, 바람직하게는 0.1∼10 mg/kg, 더욱 바람직하게는 0.1∼1 mg/kg의 투여량을 투여된다.
"투여된"이라는 용어는 바이러스성 또는 비-바이러스성 기술에 의한 전달을 포함한다. 바이러스 전달 메커니즘은 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 바큘로바이러스 벡터를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다. 비-바이러스성 전달 메커니즘은 지질 매개 트랜스펙션, 리포솜, 면역리포솜 리포펙틴, 양이온 안면 양친매성물질(CFA) 및 이들의 결합을 포함한다. 이러한 전달 메커니즘의 경로는 점막, 비강, 구강, 비경구, 위장, 국부 또는 설하 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"투여된"이라는 용어는 흡입용 비강 스프레이 또는 에어로졸 또는 섭취 용액과 같은 점막 경로; 정맥내, 근육내 또는 피하 경로와 같은 주입 가능 형태에 의해 전달되는 비경구 경로를 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
"동시-투여된"이라는 용어는 예를 들어 TrpM8 및 보조제와 같은 추가 실체 각각의 투여 사이트 및 시간이 면역체계의 필요한 조절이 달성되게 하는 것을 의미한다. 따라서 폴리펩타이드 및 보조제가 동일한 순간 및 동일한 사이트에 투여되는 경우 폴리펩타이드를 보조제와 다른 시간 및 다른 사이트에 투여하는 것보다 이점이 있다. 폴리펩타이드 및 보조제는 동일한 전달 운반체 내에서 전달되고 - 폴리펩타이드 및 항원은 결합되고/또는 결합되지 않고/또는 유전적으로 결합되고/또는 결합되지 않는다.
TrpM8 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드, 그의 항체 및 선택적으로는 보조제는 단일 투여 또는 다수 투여로 숙주 피험체에 개별적으로 투여되거나 동시-투여된다.
백신 조성물 및 약제적 조성물은 주입(비경구, 피하 및 근육내 주입), 비강내, 점막, 구강, 질내, 요도 또는 안구 투여와 같은 많은 다른 경로에 의해 투여된다.
여기서 기술된 백신 및 약제적 조성물은 통상적으로 예를 들어 피하 또는 근육내 주사에 의해 비경구적으로 투여된다. 다른 형태의 투여에 적당한 추가 포뮬레이션은 좌약 및 일부의 경우 구강 포뮬레이션을 포함한다. 좌약의 경우 통상의 바인더 및 담체는 예를 들어 폴리알킬렌 글리콜 또는 트리글리세라이드를 포함하고; 이러한 좌약은 0.5∼10%, 바람직하게는 1∼2% 범위로 활성 성분을 함유한 혼합물로부터 형성된다. 구강 포뮬레이션은 약제 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등과 같은 일반적으로 사용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환약, 캡슐, 지효성 포뮬레이션 또는 분말의 형태를 취하고 10∼95%, 바람직하게는 25∼70%의 활성 성분을 포함한다. 백신 조성물이 동결건조되는 경우 동결건조된 물질은 투여 전 현택액으로 재구성된다. 재구성은 바람직하게는 완충액 내에서 효과적이다.
또다른 관점
본 발명의 또다른 관점 및 실시태양은 하기 항에 나타나 있고; 본 발명이 이들 관점을 포함함이 이해되어야 한다.
1항. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 TrpM8 폴리펩타이드
2항. 1항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
3항. 2항에 있어서, 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함함을 특징으로 하는 핵산
4항. 1항에 따른 폴리펩타이드의 단편을 포함한 폴리펩타이드
5항. 3항에 있어서, 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 상동적인 하나 이상의 구역을 포함하거나 서열번호: 3과 서열번호: 5 사이에서 이형적인 하나 이상의 구역을 포함함을 특징으로 하는 폴리펩타이드
6항. 4항 또는 5항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
7항. 2, 3 또는 6항에 따른 핵산을 포함한 벡터
8항. 2항, 3항 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 숙주 세포
9항. 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 또는 7항에 따른 벡터를 포함한 형질전환 비-인간 동물
10항. 9항에 있어서, 마우스임을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
11항. 이온 채널과 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드의 이용
12항. 이온 채널과 특이적으로 상호작용하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법에서의 9 또는 10항에 따른 형질전환 비-인간 동물의 이용
13항. 후보 화합물에 TrpM8 수용체를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계 및 세포 내 환식 AMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과로 저하되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 TrpM8 길항제의 확인 방법
14항. 후보 화합물에 TrpM8를 발현하는 세포를 접촉시키는 단계 및 세포 내 환식 AMP(cAMP)의 수치가 상기 접촉 결과로 저하되는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 세포 내 환식 AMP의 내인성 수치를 저하시키는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
15항. 후보 화합물에 TrpM8 폴리펩타이드를 접촉시키는 단계 및 후보 화합물이 TrpM8 이온 채널 폴리펩타이드에 결합하는지 여부를 측정하는 단계를 포함한 TrpM8 폴리펩타이드에 결합하는 것이 가능한 화합물의 확인 방법
16항. 11항 내지 15항의 어느 한 항에 따른 방법에 의해 확인된 화합물
17항. 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 화합물
18항. 항체의 제조 방법에서의 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부 또는 2, 3 또는 6항에 따른 핵산의 이용
19항. 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 것이 가능한 항체 또는 그의 일부 또는 2, 3 또는 6항에 따른 뉴클레오타이드에 의해 인코드되는 폴리펩타이드 또는 그의 일부
20항. 약제적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 하나 이상의 하기를 포함한 약제적 조성물: 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
21항. 하나 이상의 하기를 포함한 백신 조성물: 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
22항. 하나 이상의 하기를 포함한 질병 또는 질병 감수성에 대한 진단 키트: 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체
23항. 환자에게 TrpM8 이온 채널의 길항제를 투여하는 단계를 포함한 증가된 TrpM8 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
24항. 환자에게 TrpM8 이온 채널의 길항제를 투여하는 단계를 포함한 감소된 TrpM8 활성과 관련된 질환 증세를 나타내는 환자의 치료 방법
25항. 23항 또는 24항에 있어서, 상기 TrpM8 이온 채널은 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 서열을 지닌 폴리펩타이드를 포함함을 특징으로 하는 방법
26항. 하나 이상의 하기를 환자에게 투요하는 단계를 포함한 환자의 질병을 치료하고/또는 예방하는 방법: 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체; 20항에 따른 약제적 조성물 및 20항에 따른 백신
27항. 질병의 치료 또는 예방 방법에서 이용하기 위한 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체를 포함한 약제
28항. 질병의 치료 또는 예방용 약제적 조성물의 제조시 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 또는 그의 일부; 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 또는 그의 일부; 7항에 따른 벡터; 8항에 따른 세포; 16 또는 17항에 따른 화합물; 및 19항에 따른 항체의 이용
29항. 형질전환 동물이 변화된 TrpM8 유전자를 포함함을 특징으로 하는 비-형질전환 동물
30항. 29항에 있어서, 상기 변화는 TrpM8의 결실, 기능 손실을 유발하는 TrpM8의 돌연변이, 타겟되거나 무작위 돌연변이를 포함한 뉴클레오타이드 서열을 지닌 외인성 유전자의 TrpM8 내로의 도입, 또다른 종으로부터의 외인성 유전자의 TrpM8 내로의 도입 및 이들의 결합으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 비-인간 형질전환 동물
31항. 형질전환 동물이 그의 게놈 내에서 이형성 TrpM8 단백질을 인코드하는 트랜스유전자를 포함하고 발현하는, 기능적으로 분열된 내인성 TrpM8 유전자를 지닌 비-인간 형질전환 동물
32항. (a) 비-상동성 대치 부분; (b) 첫 번째 TrpM8 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 업스트림에 위치한 첫 번째 상동성 구역; 및 (c) 두 번째 TrpM8 유전자 서열에 대해 실질적인 동일성을 지닌 뉴클레오타이드 서열을 지니고 자연발생적 내인성 TrpM8 유전자 내에서 첫 번째 TrpM8 유전자 서열의 다운스트림 위치를 지님을 특징으로 하는, 비-상동성 대치 부분의 다운스트림에 위치한 두 번째 상동성 구역을 포함한, 숙주 세포 내 TrpM8 유전자를 기능적으로 분열시키는 핵산 컨스트럭트
33항. TrpM8 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산이 발현되는 조건 하에서 8항에 따른 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 제조 방법
34항. 표본을 핵산에 특이적인 적어도 하나 이상의 핵산 프로브에 접촉시키는 단계 및 핵산의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 2, 3 또는 6항에 따른 핵산 존재의 검출 방법
35항. 표본을 19항에 따른 항체에 접촉시키는 단계 및 폴리펩타이드의 존재에 대해 상기 표본을 모니터하는 단계를 포함한, 1, 4 또는 5항에 따른 폴리펩타이드 존재의 검출 방법
36항. TrpM8의 증가되거나 감소되거나 비정상적인 발현에 의해 유발되거나 이에 관련된 질환의 진단 방법에 있어서, 상기 방법은 (a) 이러한 질환 증세를 나타내거나 나타낼 것으로 의심되는 동물 내에서의 TrpM8 발혀 수준 또는 패턴을 검출하는 단계; 및 (b) 발현 수준 또는 패턴을 정상 동물과 비교하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
37항. 22항 내지 28항의 어느 한 항에 따른 키트, 방법, 약제 또는 이용에 있어서, 상기 질환은 사회불안장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 공포증, 특정 공포증, 공황장애, 강박반응성 장애, 급성 스트레스 장애, 분리불안장애, 범불안장애, 주요우울증, 기분저하증, 양극성 장애, 계절정동장애 또는 산후 우울증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 키트, 방법, 약제 또는 이용
도 1은 넉아웃 벡터를 나타낸 도표이다.
도 2는 RT-PCR 시험로부터의 유전자 발현 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 야생형 마우스(wt)와 비교된 넉아웃 마우스(돌연변이)의 테일-플릭시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4A-C는 야생형 마우스(wt, +/+)와 비교된 넉아웃 마우스(돌연변이, +/+)의 오픈 필드 시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4A는 중심 구역 내 영구 시간을 나타낸다. 도 4B는 중식 구역 내 이동 거리를 나타낸다. 도 4C는 이동 총 거리를 나타낸다.
도 5는 3개월째에 암컷 야생형 마우스(흑색 막대)와 비교시 암컷 넉아웃 마우스(돌연변이, 백색 막대)의 혈장 코르티코스테론 수치에 대한 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
서열목록
서열번호: 1은 인간 TrpM8의 cDNA 서열을 나타낸다. 서열번호: 2는 서열번호: 1 유래의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 3은 인간 TrpM8의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 4는 마우스 TrpM8의 cDNA의 오픈 리딩 프레임을 나타낸다. 서열번호: 5는 마우스 TrpM8의 아미노산 서열을 나타낸다. 서열번호: 6-18은 넉아웃 플라스미드 구축시 사용된 유전형 프라이머를 나타낸다. 서열번호: 19는 넉아웃 플라스미드 서열을 나타낸다.
(실시예 1) 형질전환 TrpM8 넉-아웃 마우스: TrpM8 유전자 타겟 벡터의 구축
TrpM8 유전자는 게놈 데이터베이스의 상동성 검색을 이용하여 생물-정보학적으로 확인된다. 87 kb 갭된 게놈 인접은 다양한 데이터베이스로부터 집합되었다. 이러한 인접은 상동성 팔의 고안이 타겟 벡터 내로 클론될 수 있게 하는 충분한 측 면 서열 정보를 제공하였다.
쥐과 TrpM8 유전자는 23개 인접 엑손을 지닌다. 타겟 전략은 15번째 코딩 엑손을 제거하도록 고안된다. 구역의 측면에 위치한 4.0 kb 5'상동성 팔 및 1.6 kb 3' 상동성 팔은 PCR에 의해 증폭되고 단편은 타겟 벡터 내로 클론된다. 팔을 증폭시키는데 사용되는 각 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 5' 말단은 절단이 드문 제한 효소에 대한 다른 인식 사이트를 포함하고 벡터 폴리링커의 클로닝 사이트와 양립 가능하고 팔 자체가 결손되도록 합성된다. TrpM8의 경우 프라이머는 AgeI/NotI의 5' 팔 클로닝 사이트 및 AscI/FseI의 3' 팔 클로닝 사이트(관련 제한 효소를 포함한 사용된 타겟 벡터의 구조가 도 X에 나타나 있다)를 지니고 하기 프라이머 표에 기입된 바와 같이 고안된다.
팔 프라이머쌍(5'armF/5'armR) 및 (3'armF/3'armR)에 더하여 TrpM8 좌위에 대해 특이적인 또다른 프라이머가 하기 목적으로 고안된다: 분리된 추정 타겟 클론 내에서 타겟된 좌위의 서던 분석을 가능하게 하기 위해 각 팔 외부 및 그 이상으로 연장된 비-반복 게놈 DNA의 2개의 짧은 150∼300 bp 단편을 증폭시키는 5' 및 3' 프로브 프라이머쌍(5'prF/5'prR 및 3'prF/3'prR); 벡터 특이적 프라이머, 이러한 경우에는 Asc306과 함께 다중 PCR에 사용시 야생형, 이형접합성 및 동형접합성 마우스 사이의 구별을 가능하게 마우스 유전형 프라이머쌍(hetF 및 hetR); 및 마지막으로 벡터(TK5IBLMNL)의 3' 말단에 특이적인 프라이머, 이러한 경우 Asc146과 쌍을 이룰 때 3' 팔 구역 말단의 업스트림을 어닐하고(anneal) 타겟 이벤트 특이적 1.7 kb 증폭기를 생성하는 타겟 선별 프라이머(3'scr). 바람직한 게놈 변화가 발생하고 무작위로 통합된 벡터 카피를 포함한 클론 배경으로부터 정확히 타겟된 세포의 확인을 가능하게 하는 경우 이러한 증폭기는 세포 유래의 주형 DNA로부터 유래될 수 있다. 타겟 전략에 사용된 이들 프라이머의 위치 및 TrpM8 좌위 구역의 게놈 구조가 나타나 있다.
Figure 112006061524918-PCT00002
상동성 팔의 위치는 TrpM8 유전자를 기능적으로 분열시키도록 선택된다. 타겟 벡터는 결실되는 TrpM8 구역이 TrpM8 유전자와 동일한 방향으로 배열된 촉진된 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(neo) 유전자로 구성된 선택 카세트의 업스트림의 내인성 유전자 발현 수용체(프레임 독립적 lacZ 유전자)로 구성된 비-상동성 서열로 대치되도록 제조된다.
5' 및 3' 상동성 팔이 타겟 벡터 TK5IBLMNL 내로 클론되면(도 5 참조) 표준 분자생물학 기술을 이용하여 크고 매우 순수한 DNA 제제가 제조된다. 신선하게 준비된 무-내독소 DNA 20 ㎍이 암피실린 저항성 유전자와 박테리아의 복제 기원 사이의 벡터 백본 내에 특정 사이트에 존재하는 또다른 절단이 드문 제한효소 SwaI로 제한된다. 이후 선형화된 DNA가 침전되고 일렉트로포레이션을 위해 100 ㎕의 인산 완충 식염수 내에 재현탁된다.
일렉트로포리에션 24시간 후 트랜스펙트된 세포는 200 ㎍/ml 네오마이신을 함유한 배지 내에서 9일간 배양된다. 상동성 재조합이 내인성 TrpM8 유전자와 타겟 컨스트럭트 사이에서 발생한 클론을 확인하기 위해 클론은 96웰 플레이트 내로 수집되고 PCR(상기 기술된 프라이머 3'scr 및 Asc146을 사용하여)에 의해 선별되기 전에 복제되고 팽창된다. 양성 클론은 1∼5%의 비율로 확인될 수 있다. 이들 클론은 팽창되어 상기 기술된 바와 같이 표준 절차를 이용하여(Russ et al, Nature 2000 Mar 2;404(6773):95-99) 제조된 외부 5' 및 3' 프로브를 이용한 타겟 이벤트의 서던 블럿 확인을 위해 복사체가 동결되고 충분히 우수한 질의 DNA게 제조될 수 있게 한다. 진단 제한효소로 분해된 DNA의 서던 블럿이 외부 프로브와 하이브리다이즈되면 상동적으로 타겟된 ES 세포 클론은 돌연변이 밴드뿐만 아니라 변화되지 않은 야생형 밴드의 존재에 의해 증명된다. 예를 들어 BstEII로 분해된 야생형 게놈 DNA는 외부 프로브와 하이브리다이즈시 8.0 kb의 밴드를 산출할 것이고, 유사하게 분해된 타겟된 대립유전자를 포함한 게놈 유전자는 이 더하여 ∼13 kb 넉아웃 특이적 밴드를 산출할 것이다.
(실시예 2) 형질전환 TrpM8 넉-아웃 마우스: TrpM8 이온 채널 결함 마우스의 생성
C57BL/6 암컷 및 수컷 마우스가 교미되고 배반포가 임신 3.5일에 분리된다. 선택된 클론으로부터의 10∼12개 세포가 배반포 당 주입되고 7∼8개 배반포가 가임신된 F1 암컷의 자궁 내로 이식된다. 키메라 새끼의 새끼는 일부 높은 수준(100%까지)의 아구티 수컷(아구티 외피색은 타렛된 클론으로부터 유전된 세포의 분포를 나타냄)을 포함하여 태어난다. 이들 수컷 키메라는 암컷 MF1 및 129 마우스와 교미되고 생식계열 전달은 각각 아구티 외피색 및 PCR 유전형에 의해 측정된다.
PCR 유전형분석은 세 번째 벡터 특이적 프라이머(Asc306)와 함께 프라이머 hetF 및 hetR을 이용하여 용해된 꼬리 클립 상에서 수행된다. 이러한 다중 PCR은 230 bp 밴드를 제공하는 프라이머 hetF 및 hetR로부터 야생형 좌위(존재하는 경우)로부터의 증폭을 가능하게 한다. hetF에 대한 사이트는 넉아웃 마우스 내에서 결실되고, 따라서 이러한 증폭은 타겟된 대립유전자로부터 실패될 것이다. 그러나 Asc306 프라이머는 3' 팔의 바로 내부의 구역을 어닐하는 hetR 프라이머와 결합하여 타겟된 좌위로부터 338 bp 밴드를 증폭시킬 것이다. 따라서 이러한 다중 PCR은 하기와 같은 새끼의 유전형을 나타낸다: 야생형 표본은 단일 230 bp 밴드를 나타내고; 이형접합성 DNA 표본은 230 bp 및 338 bp의 2개 밴드를 산출하고; 동형접합성 표본은 타겟 특이적 338 bp 밴드만을 나타낼 것이다.
(실시예 3) 생물학적 데이터: 유전자 발현 패턴
1) RT-PCR
RT-PCR을 이용하여 유전자 발현이 전립선, 간 및 고환 내에 나타나 있다(도 2).
2) LacZ 염색된 구조의 목록
LacZ 염색
해부된 조직의 X gal 염색이 하기 방식으로 수행된다.
대표 조직 조각은 큰 기관으로 이루어진다. 전체 소기관 및 관은 잘려서 개방되어 고정제 및 착색제가 침투될 것이다. 혈액 또는 내장 내용물을 제거하기 위해 조직은 PBS(인산 완충 식염수)로 세척된다. 조직은 고정제(2% 포름알데하이드, 0.2% 글루타르알데하이드, 0.02% NP40, 1 mM MgCl2, 데옥시콜산나트륨 0.23 mM을 함유한 PBS) 내에 30∼45분간 놓인다. PBS로 5분간 3회 세척 후 조직은 Xgal 염색 용액(PBS 내 4 mM K 페로시아니드, 4 mM K페로시아니드, 2 mM MgCl2, 1 mg/mlX-gal) 내에 30℃에서 18시간 동안 놓인다. 조직은 PBS로 3회 세척되고 4% 포름알데하이드 내에서 24시간 동안 후고정되고 70% 에탄올에 보관되기 전에 다시 PBS로 세척된다.
LacZ 염색을 이용하여 TrpM8는 DRG, 특히 뉴런 내에서 발현되는 것으로 판명되었다.
(실시예 4) 생물학적 데이터: 행동: 꼬리 튀기기 시험
꼬리 튀기기 무통 시험은 꼬리-튀기기 무통 측정기를 이용하여 수행된다. 이러한 장치는 설치류에서 통증 민감도를 정확하고 재현가능하게 측정하는 방법에 이용 용이성을 제공한다(D'Amour, F.E. and D.L. Smith, 1941, Expt. Clin. Pharmacol., 16: 179-184). 이러한 기구는 열원으로서 셔터-제어되는 램프를 지닌다. 램프는 덜 제한적인 환경을 제공하기 위해 동물 아래에 위치한다. 꼬리 튀기기는 자동 검출 회로에 의해 검출되고 이는 동물을 손으로 조종하지 않게 한다. 동물은 환기되는 튜브 내에 감금되고 그의 꼬리는 장치의 상부 상의 검출 홈에 위치한다.
셔터의 개방을 통한 꼬리로의 강한 광의 활성화는 동물이 광선 외부로 꼬리를 튀기는 경우 일부 지점에서 불쾌감을 유발한다. 자동화 방식에서 광-감지기는 시계가 정지되게 하고 셔터가 폐쇄되게 하는 꼬리 움직임을 감지한다. 셔터의 개방과 동물의 반응 사이에 경과된 총 시간이 기록된다.
돌연변이 형질전환 마우스의 반응은 연령 및 성 매치된 야생형 마우스와 비교된다. 단일 동물은 55℃ 이하의 꼬리 온도내 증가를 생성하기 위해 다른 열로 셋팅된다.
이러한 시험은 침해성 통증에 대한 넉아웃 마우스 반응의 지표로서 사용된다.
돌연변이는 열 유도성 통증에 덜 민감하여 통각감퇴를 나타냄이 관찰되었다. 돌연변이는 연령 및 성 매치된 야생형 마우스와 비교시 열원으로부터 멀리 그의 꼬리를 튀기는 더 긴 잠재성을 지닌 것으로 관찰되었다(도 3). 따라서 이는 TrpM8이 통증의 지각과 관련됨을 증명하였다.
(실시예 5) 생물학적 데이터: 행동: 오픈 필드 시험
넉아웃 및 야생형 대조군 마우스는 오픈 필드 시험으로 시험된다. 당업자는 이러한 시험 및 어떻게 수행되는지에 대해 익숙할 것이다. 간단하게는 마우스는 투명한 측면을 지닌 Perspex 상자 중앙에 놓이고 시간 경과에 따른 마우스의 이동이 비디오 상에 기록된다. 대조군 동물은 일반적으로 대부분의 시간을 활동무대 변두리 주변을 움직이는데 보낸다. 이러한 정상 패턴으로부터의 변화, 특히 대부분의 시간을 활동무대 중앙에서 보내는 변화가 기록되고, 이의 증가는 동물이 덜 불안함을 의미할 수 있다.
결과는 넉아웃 마우스가 야생형 대조군과 동일한 양으로 움직이는 것으로 나타났다(도 4A). 그러나 이러한 데이터의 분석은 넉아웃 마우스가 주변부 구역과 비교시 오픈 필드 활동무대의 중앙 구역에서 더 많은 시간을 소비하였음을 나타내었다(도 4B). 이는 야생형과 비교시 넉아웃 동물의 경우 더 큰 중심 구역 내로의 이동 거리를 나타낸다(도 4C).
(실시예 6) 생물학적 데이터: 생리학: 혈장 코르티코스테론
코르티코스테론은 스트레스 및 불안에 반응하여 방출되는 호르몬이다. 코르티코스테론의 수치가 낮을수록 동물이 겪게 되는 불안 및 스트레스 수치가 더 낮다.
혈장 코르티코스테론은 ELISA 분석을 이용하여 TrpM8 -/- 및 연령 매치된 +/+ 마우스로부터 분석된다. 코르티코스테론 수치는 야생형보다 돌연변이 동물에서 더 낮은 것으로 나타났고(도 5), 이는 야생형 대조군보다 TrpM8 마우스가 더 불안하고 스트레스를 받는 것을 나타낸다.
심사중인 출원 및 특허를 포함하여 본 출원서에 기술된 출원 및 특허 및 상기 출원 및 특허에 인용된 문헌 및 출원 및 특허에 인용되거나 기술된 제품의 제조사 지침서 또는 카탈로그는 참고문헌에 포함된다. 더욱이 본 명세서에 인용된 모든 문헌 및 본 명세서에 인용된 문헌에 인용되거나 참조된 모든 문헌 및 본 명세서 내에 인용되거나 기술된 모든 제품의 제조사 지침서가 참고문헌에 포함된다.
본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변화는 본 발명의 범위 및 정신에 위배됨이 없이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 결합하여 기술되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정한 실시태양에 부당하게 한정되지 않고 이에 대한 많은 변형 및 추가가 본 발명의 범위 내에서 이루어짐이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야의 숙련자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 방법의 다양한 변형은 청구범위 내에 존재한다. 더욱이 하기 종속의 특징의 다양한 결합은 본 발명의 범위에서 벗어나지 않고 독립항의 특징으로 이루어질 수 있다.
<110> Paradigm Therapeutics Limited <120> Ion channel <150> GB 0407175.9 <151> 2004-03-30 <150> US 60/561,123 <151> 2004-04-08 <160> 19 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 3355 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 aagaaaatcc tgcttgacaa aaaccgtcac ttaggaaaag atgtcctttc gggcagccag 60 gctcagcatg aggaacagaa ggaatgacac tctggacagc acccggaccc tgtactccag 120 cgcgtctcgg agcacagact tgtcttacag tgaaagcgac ttggtgaatt ttattcaagc 180 aaattttaag aaacgagaat gtgtcttctt taccaaagat tccaaggcca cggagaatgt 240 gtgcaagtgt ggctatgccc agagccagca catggaaggc acccagatca accaaagtga 300 gaaatggaac tacaagaaac acaccaagga atttcctacc gacgcctttg gggatattca 360 gtttgagaca ctggggaaga aagggaagta tatacgtctg tcctgcgaca cggacgcgga 420 aatcctttac gagctgctga cccagcactg gcacctgaaa acacccaacc tggtcatttc 480 tgtgaccggg ggcgccaaga acttcgccct gaagccgcgc atgcgcaaga tcttcagccg 540 gctcatctac atcgcgcagt ccaaaggtgc ttggattctc acgggaggca cccattatgg 600 cctgatgaag tacatcgggg aggtggtgag agataacacc atcagcagga gttcagagga 660 gaatattgtg 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caatgatgaa gacttggcag aacagctact ggtctactcc tgcgaagcct 5460 ggggtgggag caactgtctg gagctggcag tggaggctac agatcagcat ttcatcgctc 5520 agcctggggt ccagaatttc ctttctaagc aatggtatgg agagatttcc cgagacacga 5580 agaactggaa gattatcctg tgtctattca tcatcccctt agtgggctgt ggcctcgtat 5640 catttaggaa gaaacccatt gacaagcaca agaagctgct gtggtactat gtggccttct 5700 tcacgtcgcc cttcgtggtc ttctcctgga acgtggtctt ctacatcgcc ttcctcctgc 5760 tgtttgccta tgtgctgctc atggacttcc actcagtgcc acacaccccc gagctgatcc 5820 tctacgccct ggtcttcgtc ctcttctgtg atgaagtgag gcagtggtac atgaacggag 5880 tgaattattt caccgaccta tggaacgtta tggacaccct gggactcttc tacttcatag 5940 cgggtattgt attccggctc cactcttcta ataaaagctc gttgtactct gggcgcgtca 6000 ttttctgtct ggattacatt atattcacgc taaggctcat ccacattttc accgtcagca 6060 ggaacttggg acccaagatt ataatgctgc agcggatgct gatcgacgtt ttcttcttcc 6120 tgttcctctt tgctgtgtgg atggtggcct ttggcgtggc cagacagggg atcctaaggc 6180 aaaatgaaca gcgctggaga tggatcttcc gctctgtcat ctatgagccc tacctggcca 6240 tgtttggcca ggttcccagt gacgtggata gtaccacata tgacttctcc cactgtacct 6300 tctcgggaaa tgagtccaag ccactgtgtg tggagctgga tgagcacaac ctgccccgct 6360 tccctgagtg gatcaccatt ccgctggtgt gcatctacat gctctccacc aatatccttc 6420 tggtcaacct cctggtcgcc atgtttggct acacggtagg cattgtacag gagaacaacg 6480 accaggtctg gaaattccag cggtacttcc tggtgcagga gtactgcaac cgcctaaaca 6540 tccccttccc cttcgttgtc ttcgcttatt tctacatggt ggtgaagaag tgtttcaaat 6600 gctgctgtaa agagaagaat atggagtcta atgcctgctg tttcagaaat gaggacaatg 6660 agactttggc gtgggagggt gtcatgaagg agaattacct tgtcaagatc aacacgaaag 6720 ccaacgacaa ctcagaggag atgaggcatc ggtttagaca actggactca aagcttaacg 6780 acctcaaaag tcttctgaaa gagattgcta ataacatcaa gtaa 6824 <210> 5 <211> 1101 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Ser Phe Glu Gly Ala Arg Leu Ser Met Arg Ser Arg Arg Asn Gly 1 5 10 15 Thr Met Gly Ser Thr Arg Thr Leu Tyr Ser Ser Val Ser Arg Ser Thr 20 25 30 Asp Val Ser Tyr Ser Asp Ser Asp Leu Val Asn Phe Ile Gln Ala Asn 35 40 45 Phe Lys Lys Arg Glu Cys Val Phe Phe Thr 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acccaaagtc ccttcaatga tgttaccctc aatggtctaa 1860 aatctttccc ctagacttca acatcttaaa gactgcacta ccttccaaag tgtcatactg 1920 gaaactatgt ctttcgggta tggaccttcg aaaaatattt aagacacaaa ccacagtgtg 1980 atgcctagct ttaattgtaa acttaataga ttatagaatc acctaggaag agtctcaggg 2040 aagggttgcc tagttcagtg tctgtgggca gtttaactgc cttgtggttg ccttgatcag 2100 cttcgttggt gtgggaagaa gactcagcct actatgggtg gcactatttc ctagatttgg 2160 accctggact gtataagagt agagaaagct agctgaacac aaagcatgga atcacttctc 2220 tgcttttgat tgaggatatg acatgactcg ctgcctcaag ttcctgcctt gatttccccg 2280 ctgtgatgga ccataaggtg gagctgagag ataagataac cctcatctcc ccaaagatgc 2340 tttttgtcag gatattttat cacagtgaca gaaatgaaac caagacacat ggcaaggaga 2400 aagaattgtt cggtcttcca caaagcaaat agtacattat aatgctgggt atcctgcctg 2460 ggtcttagtc tactgaagta gatgtgagat gatgaacctc agtttctcat ctgtgaagtg 2520 ggcatagttg tctatactag ttctctttct gtttatatta gttatcttaa gttacctgac 2580 agaggcaaca taagggaaga tagatgtagt tgggctcaca gtgttagccc aacatggtag 2640 agttcatggt ggttacattt ctcactcctg gtggatgatg agaaagcaga aaatgggact 2700 agaaactggg ttaggctatt actttaaggg gctcaccctc agtgtgccca cctccactgt 2760 ctagactgga gaatctcccc aaaacagcac caccagttag ggatgaggtg ttcacaccca 2820 ggagcctgtt caagcagaaa taacaggggt tgtcagagag ttgccatggc gatgccatga 2880 cattctataa gaaaggggag gtcagcagag tcagctgctt ccaccacagc cattatgagt 2940 gatggagaaa tcttgagatg ggtgaagctc ttcctgaggc aagtttagca agcagcagcg 3000 tataaccatg ttcacagttg cactgggatg tttgtctaac caggtagcga tgcagacgag 3060 ccatgccggt tatgtgtttt atctgcaccg tgtgtgtgga aatgggcatc attcatttta 3120 tatcgaggac tccgtgttca gagacgtgct agaatatttt ccatgcttgc ttgctaggaa 3180 gttggagcac tgggatttaa tcctccatgg attgcctcct gcttcaaact ttgtactcgg 3240 tggccagtaa agagacctca gatgaggagg cggtgctgta agcagtttgc tctagagctg 3300 agctggaggt gattagtggg cagtgagctg tgggaggaag gagaagacat gctgtgatga 3360 gaggggtggt gtccctggga gttcttggca gcctccaggt cccctgtaga gtgtgcccca 3420 agccccaggg tcatcatgct acttactggg tgctctttcc ggggtccagc ttgcccctcc 3480 ttggtcaagc acgcacctgt 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ggacttccac tcagtgccac acacccccga gctgatcctc 5220 tacgccctgg tcttcgtcct cttctgtgat gaagtgaggc aggtaggcaa gtgcagcgtc 5280 gctctttcca gggagatgtg gatacatgtc tgctcatccc agacggacat gattccacac 5340 aaggctggtc tatggagctg gtgagtttac tggggtaaat gtcaagagag catctgcatc 5400 atcaaaagcc cacccaaacg actcatgaaa gctgcgtcac gggagctcaa agtccaatct 5460 gtgagcaaat ttctccactg aagaagcctg tccccagcaa tggttgatca tcagtttcct 5520 gggatgtgca tattttagga tctttgcttc accattgaat ccaaactcta ccccagccct 5580 catagagcag gtgcatctta gtttgggttt tactgctgtg aacagacacc atgaccaagg 5640 caacttttat aaatgacatc atttaacggg ctggcttaca ggtttagagg ttcagtccat 5700 tatcgccaag gtgggaaatg gcagcaacta ggcatggtgc aggaggatct gagagttcta 5760 cgtcttcata tgaaggctgc tagtggaagg ctgactccca agcagctaga gcaagggtat 5820 taaagcccac acccaccagg ccacacctac tccaataaga ccatacctcc caacagtgct 5880 actccctggg ccaagcatta caaaccatca cactgaggta gcagatgttg aagaaatgtt 5940 tgttgttggt gaaggaggtg ctgtcctgac tcatggtgga aaatgtctca gcaagtccta 6000 tcagatttat ctgtcactct cttgtctctt ctggacccga accttaaaat atacccattt 6060 agcaagtatt tgttaggtat acaactcatg gagtatttac agattacaaa gtacaaggct 6120 caggggtgga agagatttga aggggaaaca tactgccttt gccctgacta gtctaagaac 6180 actgagttgg cttatgttgt catgccaact ctctctggta gatttttatg tgcagtctcc 6240 aggactcctg gattgcgagg gattctgggg ccctctgtca attcttagta tgtcttaatc 6300 aattaatgat gtctgctatg gaagtgaggg ctgggggggg ggggttgggt acctgtgccc 6360 tatatgcctg tctttatgat tagtaggtaa gtggtgtgga agatggtgga acgtcagcag 6420 aggtggagga agaaaacaca caggatggcc ggagtaccag tgtactgact atagttctgg 6480 aaggcagaag tccaacgtga 6500

Claims (28)

  1. 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 기능적으로 분열된 내인성 TrpM8 유전자를 지닌 형질전환 비-인간 동물
  2. 제 1항에 있어서, TrpM8 유전자 또는 그의 일부의 결실을 지님을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 야생형 동물과 비교시 하나 이상의 하기 표현형을 표시함을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물:
    (a) 바람직하게는 꼬리-튀기기 시험으로 측정시 감소된 통증 민감도;
    (b) 바람직하게는 오픈 필드 시험으로 측정시 감소된 스트레스;
    (c) 감소된 혈장 코르티코스테론 수치;
  4. 동물의 TrpM8 유전자의 적어도 일부 또는 전부가 또다른 동물, 바람직하게는 또다른 종, 더욱 바람직하게는 인간의 TrpM8 유전자로부터의 서열로 대치된 형질전 환 비-인간 동물
  5. 상기 어느 한 항에 있어서, 마우스임을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
  6. 제 5항에 있어서, 기능적으로 분열된 TrpM8 유전자, 바람직하게는 TrpM8 유전자의 결실을 포함하고, 상기 TrpM8 유전자는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함함을 특징으로 하는 형질전환 비-인간 동물
  7. 상기 어느 한 항에 따른 비-인간 형질전환 동물로부터 분리된 세포 또는 조직
  8. 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 기능적으로 분열된 내인성 TrpM8 유전자를 지닌 세포
  9. 통증 또는 스트레스에 대한 모델로서 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 형질전환 비-인간 동물, 제 7항에 따른 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포의 이용
  10. TrpM8 관련 질환에 대한 모델로서 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 형질전환 비-인간 동물, 제 7항에 따른 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포의 이용
  11. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제의 확인 방법에서의 제 1항 내지 제 6항의 어느 한 항에 따른 형질전환 비-인간 동물, 제 7항에 따른 그의 분리된 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포의 이용
  12. 후보 화합물을 동물, 바람직하게는 야생형 동물 또는 제 1항 내지 제 6항에 따른 형질전환 비-인간 동물에 투여하는 단계 및 하기 표현형의 어느 하나 상의 변화를 측정하는 단계를 포함한, 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드 작용제 또는 길항제의 확인 방법:(a) 바람직하게는 꼬리-튀기기 시험으로 측정된 통증 민감도; (b) 바람직하게는 오픈 필드 시험으로 측정된 스트레스; 및 (c) 혈장 코르티코스테론 수치
  13. 제 12항에 있어서, 상기 동물이 표현형 (a)∼(c)의 어느 하나의 증가를 나타내게 하는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 TrpM8 폴리펩타이드 작용제의 확인 방법
  14. 제 12항에 있어서, 상기 동물이 표현형 (a)∼(c)의 어느 하나를 나타내게 하거나 이러한 표현형의 감소를 나타내게 하는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 TrpM8 폴리펩타이드 길항제의 확인 방법
  15. 후보 화합물을 세포 또는 조직, 바람직하게는 야생형 세포 또는 조직 또는 제 7항에 따른 세포 또는 조직 또는 제 8항에 따른 세포에 노출시키는 단계 및 세 포 또는 조직의 세포의 전도성 또는 세포내 칼슘 농도 상의 변화를 측정하는 단계를 포함한, 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드 작용제 또는 길항제의 확인 방법
  16. 제 15항에 있어서, 상기 세포의 전도성 또는 세포내 칼슘 농도를 증가시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 TrpM8 폴리펩타이드 작용제의 확인 방법
  17. 제 15항에 있어서, 상기 세포의 전도성 또는 세포내 칼슘 농도를 감소시키는 것이 가능한 후보 화합물을 확인하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 TrpM8 폴리펩타이드 길항제의 확인 방법
  18. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드를 후보 화합물에 노출시키는 단계 및 상기 후보 화합물이 TrpM8 폴리펩타이드의 작용제 또는 길항제인지 여부를 측정하는 단계를 포함한, 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료 또는 완화에 적당한 화합물의 확인 방법
  19. 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료를 위해 그의 작용제 또는 길항제의 확인을 위한 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리뉴클레오타이드의 이용
  20. 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료를 위해 그의 작용제 또는 길항제의 확인을 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 이용
  21. 개체 내 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료 방법에서의 이용을 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 길항제
  22. 개체 내 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 치료용 약제 조성물의 제조를 위한 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 서열을 포함한 TrpM8 폴리펩타이드의 길항제의 이용
  23. TrpM8의 길항제를 개체에 투여하는 단계를 포함한, 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환 증세를 나타내는 개체의 치료 방법
  24. 개체 또는 그의 세포 또는 조직 내 TrpM8의 발현, 수준 또는 활성 상의 변화를 감지하는 단계를 포함한, 통증 또는 스트레스, 바람직하게는 TrpM8 관련 질환의 진단 방법
  25. 제 10항, 제 19항, 제 20항 또는 제 22항에 따른 이용, 제 18항, 제 23항 또는 제 24항에 따른 방법 또는 제 21항에 따른 길항제에 있어서, 상기 TrpM8 관련 질환은: 통증, 암, 염증, 염증성 장질환, 열 통각과민증, 내장 통증, 편두통, 대상포진후 신경통, 당뇨병성 신경통, 삼차신경통, 수술후 통증, 골관절염, 류머티즘성 관절염, 급성 통증, 만성 통증, 피부 통증, 체성 통증, 내장 통증, 심근허혈을 포함한 연관 통증, 환상 통증, 신경병증성 통증(신경통), 상처, 질환, 두통, 편두통, 암 통증으로부터 유발된 통증, 파킨슨병과 같은 신경계 장애로부터 유발된 통증, 척추 및 말초신경 수술, 뇌종양, 외상성 뇌손상(TBI), 척수 외상으로부터 유발된 통증, 만성통증증후군, 만성피로증후군, 삼차신경통, 설인신경통, 대상포진후신경통 및 작열통과 같은 신경통, 낭창, 유육종증, 지주막염, 관절염, 류마티즘성 관절염으로부터 유발된 통증, 주기성 통증, 배통, 요통, 관절통, 복통, 흉통, 분만 진통, 근골격 및 피부 질환, 당뇨병, 두부 외상 및 섬유근육통, 유방암, 전립선암, 결장암, 폐암, 난소암 및 골암, 사회불안장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 공포증, 특정 공포증, 공황장애, 강박반응성 장애, 급성 스트레스 장애, 분리불안장애, 범불안장애, 주요우울증, 기분저하증, 양극성 장애, 계절정동장애, 산후 우울증, 조울증, 양극성 우울증으로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 제 10항, 제 19항, 제 20항 또는 제 22항에 따른 이용, 제 18항, 제 23항 또는 제 24항에 따른 방법 또는 제 21항에 따른 길항제
  26. 서열번호: 3 또는 서열번호: 5에 나타난 아미노산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 그의 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함한 TrpM8 폴리펩타이드
  27. 제 26항에 따른 폴리펩타이드를 인코드하는 핵산
  28. 제 27항에 있어서, 서열번호: 1, 서열번호: 2 또는 서열번호: 4에 나타난 핵산 서열 또는 그에 대해 적어도 70% 이상의 서열 동일성을 지닌 상동체, 변이체 또는 유도체를 포함함을 특징으로 하는 핵산
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