CN1937914A - 离子通道 - Google Patents

Abstract

我们公开了具有功能性缺损的内源TrpM8基因的转基因非人类动物，其中TrpM8基因包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核酸序列，或与其有至少70％序列同一性的序列。

Description

离子通道

发明领域

本发明涉及新鉴定的核酸、由其编码的多肽、及其制备和用途。更具体地，本发明的核酸和多肽涉及在下文中被称为“TrpM8”或“TrpM8离子通道”的离子通道。本发明也涉及抑制或活化这种核酸和多肽的作用。

发明背景

哺乳动物神经系统持续地评估内部和环境的温度来保持内环境稳定和避免热极端。瞬时型感受器电位(TRP)通道形成由不同因子活化的阳离子通道，包括机械刺激、渗透性、pH和温度的变化，以及外源性的刺激物，辣椒辣素。这些特化的感觉感受器是在背侧根神经节(DRG)发现的。

离子通道的瞬时型感受器电位(TRP)家族的几个成员已经被认为是热刺激的传导器，包括热活化的TRPV1和TRPV2，和冷活化的TRPM8。

来自大鼠的冷-和薄荷醇-敏感型感受器(CMRI)最近已经被克隆[McKemy D.D.，Neuhausser W.M.，and Julius，D.：Identification of a coldreceptor reveals a general role for TRP channels in thermosensation.Nature 416：5258，2002]。此感受器是由三叉神经和背根神经节中的小直径神经元表达的兴奋性离子通道。此通道感受器被低温(8-28℃)和作为温度反应型感受器的化学激动剂引起与寒冷感觉相同感受的薄荷醇活化。CNIR1属于瞬时型感受器电位(TRP)通道亚家族的一员，与其他的温度感受器、-VR1和VRLI相似，对毒热有反应并将感受信息传导至脊髓和脑[Nagy L，Rang H..Noxious heat activates all capsaicin-sensitive and also a sub-population ofcapsaicin insensitive dorsal root ganglion neurons.Neuroscience 88：995-997，1999][Cesare P.，McNaughton P.：A novel heat-activated current innociceptive neurons and itssensitization by bradykinin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.93：1543 5-1543％1996]。

最近对培养的背根和三叉神经节神经元的电生理学研究已经表明，多离子机制以对低温的外周检测为基础。几个候选的“冷感受器”，其所有的离子通道蛋白，与这个过程有关。一个候选物是TRPM8，在由温度降低和冷却化合物薄荷醇活化的感觉神经元亚群中表达的非选择性阳离子通道。经培养的大鼠三叉神经元与单细胞RT-PCR的结合荧光钙成像，已经证实存在冷反应型神经元的独特亚群，并且TRPM8可能促进其中之一的冷传导。TRPM8优选在快速反应型、低阈值(低于30℃)、冷敏感型神经元的亚组中表达。

小鼠TRPM8的功能被表征为由冷刺激和薄荷醇门控的离子通道，并且其表达只限于感受疼痛和温度的DRG神经元亚群[Peiet A.M.，Moqrich A.，Hergarden A.C.，Reeve A.J.，Andersson D.A.，Story G.M.，Earley T.J.，DragoniI.，McIntyre P.，Bevan S.，Patapoutian A.：A TRPChannel that Senses ColdStimuli and Menthol.Cell 108：705-715，2002]。

我们已经发现小鼠TrpM8离子通道还由毒热(noxious heat)刺激引发，因此可能在疼痛中起作用。我们也证实TrpM8离子通道参与紧张和焦虑。

发明概述

根据本发明的第一个方面，我们提供具有功能性缺损的内源TrpM8基因的转基因非人类动物，其中TrpM8基因包含SEQ ID NO：1、SEQID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核酸序列，或与其有至少70％序列同一性的序列。

优选，转基因的非人动物在TrpM8基因或其部分有缺失。

优选，其显示下列表型中的任意一种或组合：与野生型动物相比(a)对疼痛的敏感性降低，优选如甩尾试验(tail-flick test)所测量；(b)紧张度下降，优选如开放区域试验(open field test)所测量；(c)血浆皮质酮水平降低。

我们进一步提供转基因的非人类动物，其中该动物的TrpM8基因的至少部分或全部被来自另一动物，优选另一物种，更优选人类的TrpM8基因的序列替代。

优选转基因的非人类动物是小鼠。

优选转基因的非人类动物包含功能性缺损的TrpM8基因，优选在TrpM8基因中有缺失，其中该TrpM8基因包含SEQ ID NO：4中所示的核酸序列或与其有70％序列同一性的序列。

根据本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的来自非人类转基因动物的分离的细胞或组织。

根据本发明的第三个方面，我们提供具有功能性缺损的内源TrpM8基因的细胞，其中该TrpM8基因包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4所示的核酸序列，或与其有至少70％序列同一性的序列。

作为本发明的第四个方面，提供如上文每项所述的转基因的非人类动物、细胞或组织、或细胞作为疼痛或紧张模型的用途。

根据本发明的第五个方面，我们提供如上文每项所述的转基因的非人类动物、细胞或组织、或细胞作为TrpM8相关疾病模型的用途。

在本发明的第七个方面，提供如每项所述的非人类的转基因动物、其分离细胞或组织、或细胞在鉴定TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的方法中的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或与其有至少70％序列同一性的序列。

根据本发明的第八个方面，我们提供鉴定TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或与其有至少70％序列同一性的序列，该方法包括：将候选化合物施用于动物，优选上面所述的野生型动物或如上所述的转基因非人类动物，并且测量下列任一表型的变化：(a)对疼痛的敏感性，优选以甩尾试验所测量；(b)紧张，优选如开放区域试验所测量；以及(c)血浆皮质酮水平。

优选，该方法通过鉴定能够使动物显示出表型(a)-(c)中的任何一种增强的候选化合物来鉴定TrpM8多肽的激动剂。

可选或另外地，该方法通过鉴定能够使动物显示出表型(a)-(c)中的任何一种或这种表型的减弱的候选化合物来鉴定TrpM8多肽的拮抗剂。

根据本发明的第九个方面，我们提供鉴定TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列，该方法包括将候选的化合物暴露于细胞或组织，优选野生型细胞或组织，或如上所述的细胞或组织或细胞，并且测量该细胞或该组织的细胞的电导(conductance)或胞内钙浓度的变化。

优选，该方法通过鉴定能够提高该细胞的电导或胞内钙浓度的候选化合物来鉴定TrpM8多肽的激动剂。

可选或另外地，该方法通过鉴定能够降低该细胞的电导或胞内钙浓度的候选化合物来鉴定TrpM8多肽的拮抗剂。

根据本发明的第十个方面，提供鉴定适于治疗或缓解疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的化合物的方法，该方法包括使包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或与其有至少70％序列同一性序列的TrpM8多肽接触候选化合物，并且确定该候选化合物是否是TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂。

作为本发明的第十一个方面，我们提供了TrpM8多肽用于鉴定治疗疼痛或紧张，优选治疗TrpM8相关疾病的TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示氨基酸序列或与其有至少70％序列同一性的序列。

根据本发明的第十二个方面，我们提供了TrpM8多肽用于鉴定治疗疼痛或紧张，优选治疗TrpM8相关疾病的TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其有至少70％序列同一性的序列。

根据本发明的第十三个方面，我们提供了具有SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：5所示氨基酸序列或与其有至少70％序列同一性的序列的TrpM8多肽的拮抗剂，该拮抗剂用于治疗个体的疼痛或紧张，优选治疗TrpM8相关疾病的方法。

根据本发明的第十四个方面，提供了TrpM8多肽的拮抗剂在制备用于治疗个体的疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的药物组合物中的用途，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其有至少70％序列同一性的序列。

根据本发明的第十五个方面，我们提供了治疗患有疼痛或紧张，优选患有TrpM8相关疾病的方法，该方法包括向个体施用TrpM8的拮抗剂。

根据本发明的第十六个方面，我们提供了诊断个体中疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的方法，该方法包括检测个体或其细胞或组织中TrpM8的表达、水平或活性的变化。

优选地，TrpM8相关疾病选自如下组成的组：疼痛、癌症、炎症、炎症性肠疾病、热性痛觉过敏、viseral疼痛、偏头痛、带状疱疹后神经痛(postherpatic neuralgia)、糖尿病神经痛、三叉神经痛、术后疼痛、骨性关节炎、类风湿性关节炎、急性疼痛、慢性疼痛、皮肤疼痛、躯体痛、内脏痛、牵涉痛，包括心肌缺血所致的牵涉痛、幻觉痛、神经病变痛(神经痛)，由损伤和疾病产生的疼痛、头痛、偏头疼、癌症疼痛、由神经疾病如帕金森病产生的疼痛、由脊椎和外周神经手术、脑肿瘤、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓创伤产生的疼痛、慢性疼痛综合症、慢性疲劳综合症、神经痛例如三叉神经痛、舌咽神经痛、带状疱疹后神经痛(postherpetic neuralgia)和灼性神经痛、由狼疮、结节病、蛛网膜炎、关节炎、风湿性疾病产生的疼痛、周期性疼痛、背痛、下背痛(lower back pain)、关节痛、腹痛、胸痛、分娩痛、肌肉骨骼和皮肤病、糖尿病、头外伤、和纤维肌痛、乳腺、前列腺、结肠、肺、卵巢、和骨的癌症、社交焦虑症、创伤后神经紧张性障碍(post-trauma stressdisorder)、恐惧症、社交恐惧症、特定恐惧症(special phobia)、惊恐症(panicdisorder)、强迫症、急性紧张(acute stress)、紊乱、离别性焦虑症(separationanxiety disorder)、广泛性焦虑症(generalised anxiety disorder)、重症抑郁(majordepression)、精神抑郁症(dysthymia)、双相性精神障碍(bipolar disorder)、季节性情感障碍(seasonal affective disorder)、产后抑郁症、躁狂忧郁症(manicdepression)、双相性抑郁症(bipolar depression)。

根据本发明的第十七个方面，我们提供了包含SEQ ID NO.3或SEQ IDNO：5所示氨基酸序列的TrpM8多肽，或与其有至少70％序列同一性的其同源物、变体或衍生物。

根据本发明的第十八个方面，我们提供了编码这种多肽的核酸。

优选这种核酸包含SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID NO：4所示的核酸序列，或与其有至少70％序列同一性的其同源物、变体或衍生物。

附图简述

图1是显示敲除载体的图。

图2显示来自RT-PCR试验的基因表达结果的图。

图2是显示与野生型小鼠(wt)相比较，敲除小鼠(突变型)的甩尾研究结果的图表。

图4A-C是显示与野生型小鼠(wt，+/+)相比较，敲除小鼠(突变型，-/-)的开放区域检测结果的图。

图4A显示中心区的持续时间(permenance time)。图4B显示中心区中的移动距离。图4C显示总的移动距离。

图5是显示3个月龄的雌性敲除小鼠(突变型，白色柱)与雌性野生型小鼠(黑色柱)相比的血浆皮质酮水平测试结果的图。

序列表

SEQ ID NO：1显示人TrpM8的cDNA序列。SEQ ID NO：2显示来自SEQ ID NO：1的可读框。SEQ ID NO：3显示人TrpM8的氨基酸序列。SEQID NO：4显示小鼠TrpM8的cDNA的可读框。SEQ ID NO：5显示小鼠TrpM8的氨基酸序列。SEQ ID No.6-18显示用于构建敲除质粒的基因型分型引物。SEQ ID No.19显示敲除质粒的序列。

发明详述

TRPM8离子通道

我们描述了离子通道，特别是TrpM8离子通道，及其同源物、变体或衍生物，还有它们在治疗和诊断疾病，包括TrpM8相关疾病中的用途。

如对编码人TrpM8的扩增cDNA产物的测序结果所显示，TrpM8与离子通道家族的其他蛋白在结构上相关。SEQ ID NO：1的cDNA序列含有编码SEQ ID NO：3所示1104个氨基酸的多肽的可读框(SEQ ID NO：2，核苷酸编号第41到3352位)。发现人TrpM8作图于人(Homo sapiens)染色体2q37。

除非另有注明，本发明的实施将使用本领域普通技术人员能力范围内的化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。这些技术描述在如下文献中。参见例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch，and T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.et al.(1995 and periodicsupplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，JohnWiley & Sons，New York，N.Y)；B.Roe，J.Crabtree，and A.Kahn，1996，DNAIsolation and Sequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；J.M.Polak and James O′D.McGee，1990，In Situ Hybridization：principles andpractice；Oxford Univers1ty Press；M.J.Gait(Editor)，1984，OligonucleotideSynthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg，1992，Methods of Erzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and PhysicalAnalysis of DNA Methods in Enzymology，Academic Press；Using Antibodies：ALaboratory Manual：Portable Protocol NO.I by Edward Harlow，DaVid Lane，EdHarloW(1999，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory  Manual by Ed Harlow(Editor)，David Lane(Editor)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN 0-87969-314-2)，1855，Lars-Inge Larsson″Immunocytochemistry：Theory anl Practice″，CRCPress inc.，Baca Raton，Florida，1988，ISBN0-8493-6078-1，John D.Pound(ed)；″Immunochemical Protocols vol 80″，in the series：″Methods in MolecularBiology″，Humana Press，Totowa，New Jersey，1998，ISBN 0-89603-493-3，Handbook of Drug Screening，edited by Ramakrishna Seethala，Prabhavathi B.Femandes (2001，New York，NY，Marcel Dekker，ISBN 0-8247-0562-9)；LabRef：A Handbook of Recipes，Reagents，and Other Reference Tools for Use atthe Bench，Edited Jane Roskams and Linda Rodgers，2002，Cold Spring HarborLaboratory，ISBN 0-87969-630-3；and The Merck Manual of Diagnosis andTherapy(17th Edition，Beers，M.H.，and Berkow，R，Eds，ISBN：0911910107，John Wiley & Sons)。这些普通教科书的每一本在此并入作为参考。

与TRPM8的同一性和相似性

使用pfma的HMM结构预测软件( http://www.sanger. ac.uk/Software/Pfam/search.shtml)对TrpM8多肽(SEQ ID NO：3)的分析证实TrpM8肽是离子通道。

人TrpM8离子通道的小鼠同源物已被克隆，其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。SEQ ID NO：4的小鼠TrpM8离子通道cDNA显示与人TrpM8离子通道(SEQ ID NO：2)序列有高度的同一性，而小鼠TrpM8离子通道的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)显示与人TrpM8离子通道(SEQ ID NO：3)有高度的同一性和相似性。因此人和小鼠的TrpM8离子通道是离子通道大家族的成员。

TrpM8的表达模式

TrpM8 cDNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增检测在前列腺(+++)、肝脏(+++)、肌肉(+)、睾丸(++)、和卵巢(+)中TrpM8表达的不同丰度。

利用SEQ ID NO：1的TrpM8 cDNA通过BLASTN检索人EST数据资源，在cDNA文库中发现一致性。这表明TrpM8在这些正常或异常组织中表达。

BE274448.1人皮肤

BE390627人子宫

AW295430人前列腺

BG567490人肝脏

BE791173人小细胞癌、肺、MGC3

BE408880人胎盘、绒毛膜癌

BF244389人脑、成胶质细胞瘤

BG565397人肝脏

BE207083人小细胞癌、肺、MGC3

BE274448人皮肤、黑色素性黑素瘤

BE390627人子宫、子宫内膜、腺癌细胞系。

因此，TrpM8多肽、核酸、探针、抗体、表达载体和配体可用于与TrpM8离子通道在这些和其他组织中的过度-、不足-和异常表达的相关疾病的检测、诊断、治疗和其他测试。这些疾病可包括下列提及的TrpM8相关疾病。

TrpM8离子通道相关疾病

根据这里描述的方法和组合物，TrpM8离子通道可用于治疗和诊断下列详述的系列疾病。为方便起见，这些疾病被称为TrpM8相关疾病。

这里我们证实人TrpM8作图于人染色体2q37。因此，在具体实施方案中，TrpM8离子通道可用于治疗或诊断作图于这个基因座、染色体条带、区域、臂或相同染色体中的疾病。已经确定和TrpM8离子通道的染色体位置(即，人染色体2q37)相同的基因座、染色体条带、区域、臂或染色体所连锁的已知疾病包括已经发现离子通道上调的前列腺癌。

TrpM8缺陷的敲除小鼠显示如实施例中所证实的一系列表型。

我们在下面的实施例4中具体公开了TrpM8缺陷小鼠是痛觉减退的，即对疼痛的敏感性降低。TrpM8和TrpM8活性的调节剂，特别包括TrpM8的拮抗剂，可用于治疗或缓解以疼痛为特征的疾病或综合征。具体地，TrpM8的活性或表达可在个体中下调，例如通过施用TrpM8的拮抗剂或阻断剂用于痛觉缺失/以减轻疼痛。因此我们公开了对用作镇痛药的TrpM8拮抗剂的鉴定。

因此，根据优选的实施方案，这里描述的方法和化合物，包括TrpM8离子通道及其调节剂和拮抗剂，通过本文中描述的任何方法，可用于诊断或治疗或减轻疼痛和癌症。具体地，疼痛包括神经病变、炎症、炎症性肠疾病、热痛觉过敏、viseral疼痛、偏头痛、带状疱疹后神经痛、糖尿病神经痛、三叉神经痛、术后疼痛、骨性关节炎、类风湿性关节炎。也包括急性疼痛、慢性疼痛、皮肤疼痛、躯体痛、内脏痛、牵涉痛、包括心肌缺血所致的牵涉痛、幻觉痛和神经病变痛(神经痛)。疼痛的定义包括但不限于由损伤、疾病引起的疼痛、头痛、偏头疼、癌症疼痛、由神经疾病例如帕金森症引起的疼痛、由中枢和外周神经手术、脑肿瘤、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓创伤引起的疼痛、慢性疼痛综合症、慢性疲劳综合症、神经痛例如三叉神经痛、带状疱疹后神经痛和灼性神经痛、由狼疮、结节病、蛛网膜炎、关节炎、风湿性疾病引起的疼痛、周期性疼痛、背痛、下背痛、关节痛、腹痛、胸痛、分娩痛、骨骼肌肉和皮肤疾病、糖尿病、头外伤和纤维肌痛。具体地，癌症包括乳腺、前列腺、结肠、肺、卵巢，和骨的癌症。

实施例5描述了开放区域试验，其中敲除TrpM8的小鼠比野生型的相应动物显示更少的焦虑。而且，皮质酮的血浆水平，紧张和焦虑的指示物，显示TrpM8敲除的小鼠比相应的野生型小鼠低(实施例6)。因此TrpM8活性的缺乏与紧张的下降有关。

因此我们公开了在个体中降低紧张或焦虑或两者都降低的方法，该方法包括降低该个体中TrpM8的水平或活性。正如在别处所注明的，这能通过下调TrpM8的表达，或使用TrpM8的拮抗剂来实现。

TrpM8和TrpM8活性的调节剂，特别包括TrpM8的拮抗剂，可用于治疗或缓解以紧张和焦虑为特征的疾病或综合征。这种疾病包括，社交焦虑症、创伤后精神紧张性障碍、恐惧症、社交恐惧症、特定恐惧症、惊恐症、强迫症、急性紧张、紊乱、离别性焦虑症、广泛性焦虑症、重症抑郁、精神抑郁症、双相性精神障碍、季节性情感障碍、产后抑郁症、躁狂忧郁症、双相性抑郁症。

在优选的实施方案中，TrpM8相关疾病包括以紧张或焦虑为症状的疾病。在更优选的实施方案中，TrpM8疾病包括焦虑和紧张相关疾病的上述列表。

如上面注明的，通过使用这里描述的任何方法和组合物，TrpM8离子通道可用于诊断和/或治疗这些具体疾病的任一种。

具体地，我们专门评估了核酸、包含TrpM8离子通道核酸的载体、多肽，包括其同源物、变体或衍生物、包含TrpM8离子通道核酸和/或多肽的药物组合物、宿主细胞、和转基因动物用于治疗或诊断上面所列的具体疾病的用途。而且，在上面提到的具体疾病的诊断或治疗中，我们评估能够与TrpM8离子通道相互作用或结合的化合物，优选TrpM8的拮抗剂，优选能够降低该通道的电导的化合物，TrpM8离子通道的抗体的用途，以及制备或鉴定这些的方法。具体地，我们包括这些化合物、组合物、分子等中的任一种在制备用于治疗或预防这些具体疾病的疫苗中的用途。我们也公开了用于检测个体中这些具体疾病的诊断试剂盒。

连锁作图来鉴定通过使用TrpM8离子通道能够治疗或能够诊断的这些或更多具体疾病的方法是本领域已知的，并在本文的其他部分也有描述。

焦虑和紧张

焦虑和紧张，以及有这些表现的紊乱，包括TrpM8相关疾病，是本领域技术人员已知的。概述如下：

焦虑和紧张也指，如感觉焦躁(uptight)、紧张(tension)、恐慌(jitter)，和恐惧(apprehension)。紧张可能来自任何使个体感觉挫折、愤怒、或焦虑的状况或想法。使一个人感觉紧张的并不一定使另一个人紧张。

焦虑是恐惧或害怕的感觉。此不安的来源并不总是被了解或意识到，这将增加个体感受到的痛苦(distress)。

紧张是生活的正常部分。少量的紧张可能是有益的，它能够激发个体并使他更加富有成效。但是，过度紧张或对于紧张的强烈反应是有害的。它可能使个体普遍健康不良并可能患具体的身体或心理疾病，例如感染、心脏病、或抑郁。持续且不间断的(relenting)紧张经常导致焦虑和不健康行为，例如饮食过量和酒精或药物的滥用。

情绪状态如悲痛或抑郁，以及健康状况如甲状腺亢进、低血糖，或心脏病发作，也会导致紧张。

焦虑经常伴随着身体症状，包括：颤搐或发抖、肌紧张、头痛、出汗、口干、吞咽困难、腹痛(这也可以是紧张的唯一症状，特别出现在儿童)。

有时伴随焦虑有其他症状：眩晕、快速或不规律的心率、快速呼吸、腹泻或频繁需要排尿、疲劳、易怒，包括发火、失眠和恶梦，注意力减退和性的问题。

TrpM8及其调节剂可用于治疗或缓解这些症状的任一种。

焦虑症是包括过度焦虑的一组精神病学状况。它们包括广泛性焦虑症、特定恐惧症、强迫症和社交恐惧症。也参见上述的TrpM8相关疾病。

某些娱乐性或药物性的药物，由于药物的副作用或停用可引起焦虑的症状。这种药物包括咖啡因、酒精、尼古丁、感冒药、解充血药(decongestant)、用于哮喘的支气管扩张剂、三环抗抑郁药(tricyclic antidepressant)、可卡因(cocaine)、安非他明(amphetamine)、减肥药、ADHD药物、和甲状腺药物。我们公开了将TrpM8及其调节剂与这些药物联用来缓解其诱导紧张和/或焦虑作用的用途。

饮食差(例如，低水平的维生素B12)也会促进紧张或焦虑。焦虑表现与具体状况有关，例如参加考试或公开演讲。创伤后精神紧张性障碍(PTSD)是在创伤事件，如战争、身体或性侵害、或自然灾难后发展的紧张紊乱。

在非常罕见的病例中，肾上腺的肿瘤(嗜铬细胞瘤)也可引起焦虑。它的出现是由于负责焦虑的感觉和症状的激素的过量产生造成的。

(摘自Medline Plus，

http://www.llm.nih.gov/nedlineplus/ency/article/003211.htm)。

疼痛

急性疼痛

急性疼痛定义为短期疼痛或具有容易确定病因的疼痛。急性疼痛是身体对组织的当前损伤或疾病的警告。它经常是快速和急剧的，继之以酸痛。急性疼痛在变得稍微扩散之前以一个区域为中心。

慢性疼痛

慢性疼痛在医学上定义为已经持续6个月或更长时间的疼痛。这种持续或间歇的疼痛经常比其目的更耐久，因为它不帮助身体预防损害。它经常比急性疼痛更难治愈。专门的护理对于治愈任何已经变为慢性的疼痛通常是必须的。当使用阿片样物质(opioid)延长药物耐受的时间(prolongedperiods drug tolerance)时，可能出现化学依赖性，甚至是心理成瘾。尽管药物耐受和化学依赖性在阿片样物质使用者中是普遍的，心理成瘾是少见的。

生理疼痛的感受按照来源及有关的伤害性感受器(痛觉检测神经)，可分为四类。

皮肤疼痛

皮肤疼痛是由皮肤或表层组织(superficial tissue)的损伤引起的。皮肤伤害性感受器刚好终止于皮肤下，并且由于高度集中的神经末稍，产生明确的、短持续时间的局部疼痛。产生皮肤疼痛的损伤实例包括纸割伤、次级(一级)烧伤和撕裂。

躯体痛

躯体痛源自于韧带、腱、骨、血管、甚至神经本身，并由躯体伤害性感受器检测。这些区域中疼痛感受器的缺乏产生迟钝的、局部化很弱的、比皮肤疼痛更持久的疼痛；实例包括扭伤脚踝和骨折。

内脏痛

产生于身体器官的内脏伤害性感受器的内脏痛位于身体器官内部和内腔。在这些区域中伤害性感受器更缺乏，会产生经常比躯体痛更疼且持续时间更长的疼痛。内脏痛非常难以定位，并且一些对内脏组织的损伤显示“牵涉”疼痛，其感觉定位于与损伤位置完全无关的区域。心肌缺血(流向部分心脏肌肉组织的血流损失)可能是牵涉痛最广为人知的例子；该感觉可能以受限的感觉出现于上胸部，或以疼痛出现于左肩、胳膊或手。

其他类型的疼痛

幻肢痛是来自不再存在或不再获得身体信号的肢体的痛觉感觉，一种几乎由截肢者和四肢瘫痪者普遍报告的经历。神经病变性疼痛(“神经痛”)可作为损伤或疾病作用于神经组织本身的结果出现。这会破坏感觉神经向丘脑传递正确信息的能力，因此尽管并没有引起该疼痛的明显或有记载的生理学原因，大脑还是解释为疼痛刺激。

三叉神经痛(“痛性痉挛”)是指由于对三叉神经的损伤或伤害引起的疼痛。三叉神经有3个分支：V1提供前额和眼睛区域的感觉，V2提供鼻子和脸的感觉，V3提供颌和颏区域的感觉。脸的每一侧都有提供感觉的三叉神经。一侧三叉神经的疼痛可沿脸颊、嘴、鼻和/或颌的肌肉扩展。三叉神经痛一般影响老人，尽管年轻人或患多发性硬化的人也可能感觉到三叉神经痛。

三叉神经痛的最初症状是前额、脸颊、颏或下颌(jawline)中的任一处疼痛。若干病例可能涉及全部三个区域或左右两侧。疼痛发作是剧烈的、痉挛的、且短期的，并且被描述为与电击的感觉相似。该疼痛可被普通的日常活动，例如刷牙、说话、咀嚼、饮水、刮脸或亲吻触发。疼痛发作的频率随时间增加，变得更具分裂性(disruptive)和伤残性(disabling)。

舌咽神经痛是以第九脑神经的感觉分布中的疼痛爆发为特征的临床实体(entity)。除了疼痛位置和疼痛刺激外，其发作与三叉神经痛是相同的。典型的疼痛是扁桃腺或舌头背面区域中一侧的撕裂性的(lancinating)、重复系列电流样刺痛。而且，疼痛可辐射到耳朵，或从耳朵产生。

诱导疼痛的感觉刺激是吞咽，在剧烈发作期间，患者可能坐着不动，头向前弯曲，使得唾液随意从口中流出。心脏停搏、晕厥、和癫痫发作已与舌咽神经痛发作联系起来。在多数病例中，舌咽神经痛的起因是未知的。但是，某些数量的病例已经被归因于肿瘤，第九神经被脊椎动脉压迫和血管畸形。

带状疱疹后神经痛是指在感染带状疱疹病毒后持续慢性疼痛。带状疱疹，也称为shingle，是带状疱疹(水痘)病毒感染的反复感染。此病毒潜伏于神经内直到患者的免疫衰退。带状疱疹的急性损害引起通常会消退的疼痛。但是疼痛-带状疱疹后神经痛在大量患者中长期持续。

带状疱疹的症状包括刺撕裂样的、深层、持续的疼痛：该疼痛65％位于胸部，20％在脸部。当涉及脸部时，该病毒显示对三叉神经眼部分支的偏爱(脸的上部，眉毛以上)。该疼痛经常在2至4周内自然缓解。但是，一些患者将会有持久的疼痛。该疼痛位于前面的皮疹区域，轻柔地碰(stroke)感染的皮肤就会加剧，并且向该区域施压会缓解。衣服的摩擦经常是非常疼痛的。这种持续的疼痛被称作带状疱疹后神经痛。在涉及到脸部的带状疱疹病例中，带状疱疹后神经痛发生率更高。

灼性神经痛是局部外周神经损伤之后的罕见综合征。其特征是灼烧疼痛、自主性功能障碍和营养改变的三联征。严重的病例被称为主要的灼性神经痛。次要的灼性神经痛描述了较不严重的形式，类似于反射性交感神经营养不良(RSD)。RSD有显著的肌肉和关节症状，伴随x射线常见的骨质疏松症。

灼性神经痛由外周神经损伤引起，经常为臂丛损伤。去神经支配引起导致疼痛增加的超敏性，去甲肾上腺素释放的增加导致交感神经感觉。症状包括疼痛：通常为灼热，且主要位于手或足。多数情况下，发作是在损伤的24小时内。最通常涉及中间、尺骨和坐骨神经。几乎任何感觉刺激都加剧疼痛。血管变化：通过血管舒张(温暖且粉红)增加血液或通过血管收缩(冷的，斑纹蓝)减少血液。营养变化：干燥/鳞状皮肤、僵硬的关节、变尖的手指、嵴状未切的指甲、头发长/粗糙或脱发，出汗改变。

TRP M8离子通道多肽

这里所使用的术语“TrpM8离子通道多肽”是指包含SEQ ID No.3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的多肽，或其同源物、变体或衍生物。优选该多肽包含或就是SEQ ID NO：3所示序列的同源物、变体或衍生物。

“多肽”是指包括通过肽键或修饰的肽键相互连接的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白质，即肽同电子排列体。“多肽”既指短链，其通常是指肽、寡肽或寡聚体，也指较长的链，其通常指蛋白质。多肽可以包含20个基因编码的氨基酸以外的氨基酸。

“多肽”包括通过天然加工，例如翻译后加工，或通过本领域已知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。这种修饰在基础教科书中和更详细的专论，以及大部分的研究文献中都有详细描述。修饰可发生在多肽的任何部分，包括肽骨架，氨基酸侧链和氨基或羧基末端。应了解的是在给定的多肽中的几个位点，相同类型的修饰可以相同或不同的程度存在。给定的多肽也可以含有多种类型的修饰。

多肽可作为泛素化的结果而是分支的，它们可以是环状、具有或不具有分支的。环状的、分支的和分支环状的多肽可以是翻译后天然加工的结果，或可以通过合成方法制备。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂类衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键的形成、去甲基化、共价交联的形成、胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、gamma-羧化作用、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊酰化、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸盐化、转移RNA-介导的向蛋白质添加氨基酸，例如精氨酰化、和泛素化。参见，例如Proteins-Structure andMolecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993 and Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications：Perspectives and Prospects，pgs.  1-12 in Posttranslational CovalentModification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter et al.，″Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors”，Meth Enzymol(1990)182：626-646 and Rattan et aL，“Protein Synthesis：Posttranslational Modificatios and Aging”，Ann NY Acad Sci(1992)663：48-62。

如本文中所使用的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括对序列作一个(或多个)氨基酸的任意取代、变异、修饰、替代、缺失或添加。除非本文另有说明，对“TrpM8”和“TrpM8离子通道”的参考包括对TrpM8的这种变体、同源物、衍生物和片段的参考。

优选，如对于TrpM8，所得到的氨基酸序列具有离子通道活性，更优选，与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的TrpM8离子通道具有至少相同的活性。特别的，术语“同源物”涵盖了结构和/或功能上的同一性，只要所得氨基酸序列具有离子通道活性。关于序列同一性(即相似性)，优选有至少70％、更优选至少75％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％的序列同一性。更优选有至少95％，更优选至少98％的序列同一性。这些术语也包括衍生自TrpM8离子通道核酸序列等位变体的氨基酸的多肽。

当参考离子通道，例如TrpM8离子通道的“通道活性”或“生物活性”时，这些术语是指TrpM8离子通道的代谢或生理学功能，包括相似活性或改善活性或伴随不需要的副作用降低的这些活性。也包括TrpM8离子通道的抗原和免疫原活性。离子通道活性、和分析及定量这些活性的方法的实例是本领域已知的，并在本文中的其他部分详细描述。

本文使用的“缺失”定义为核苷酸或氨基酸序列中分别缺乏一个或多个核苷酸或氨基酸残基的变化。本文使用的“插入”或“添加”指已经分别相对于天然存在的物质添加一个或多个核苷酸或氨基酸残基的核苷酸或氨基酸序列的变化。本文使用的“取代”由用不同的核苷酸或氨基酸分别替代一个或多个核苷酸或氨基酸而导致。

在此描述的TrpM8多肽也可具有产生沉默变化和得到功能相当的氨基酸序列的氨基酸残基的缺失、插入、或取代。考虑的氨基酸取代也可基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性，亲水性、和/或两亲特性的相似性。例如，阴性电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；阳性电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有相似亲水性值的不带电荷的极性首基(polar headgroup)的氨基酸包括，亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

可例如根据下面的表格产生保守取代。在第二列中相同空格中，优选在第三列中相同行中的氨基酸可相互取代：

脂肪族	非极性	GAP
			ILV
		极性-不带电荷		CSTM

		NQ
			极性-带电荷	DE
	KR
		芳香族			HFWY

TrpM8多肽可一般在N末端或C末端，优选在N末端进一步包含异源的氨基酸序列。异源序列可包括影响胞内或胞外蛋白靶向(例如前导序列)的序列。异源序列也可包括增加多肽的免疫原性，和/或有助于多肽的鉴定、提取和/或纯化的序列。特别优选的另一个异源序列是多氨基酸序列，例如优选N末端的多组氨酸。特别优选至少10个氨基酸，优选至少17个氨基酸但少于50个氨基酸的多组氨酸序列。

TrpM8离子通道多肽可以是“成熟的”蛋白质的形式，或可以是更大蛋白质的一部分，例如融合蛋白。包括含有分泌或前导序列、原序列(pro-sequence)、有助于纯化的序列例如多组氨酸残基的附加氨基酸序列，或在重组制备中用于稳定的附加序列经常是有益的。

TrpM8多肽是利用已知技术通过重组方法有利制得的。但也可用本领域技术人员已知的技术，通过合成的方法例如固相合成来制备。这里描述的多肽也可作为融合蛋白，例如有助于提取和纯化来制备。融合蛋白配偶体的实例包括，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活区域)和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体和感兴趣的蛋白质序列之间包括蛋白酶切割位点，例如凝血酶切割位点以容许除去融合蛋白序列也可能是便利的。优选融合蛋白将不会阻碍有感兴趣序列的蛋白的功能。

TrpM8多肽可以是基本上分离的形式。这个术语用来指从天然状态通过人工的改变。如果“分离的”组合物或物质天然存在，它已经从其原始环境被改变或取出，或两者均有。例如，天然存在于活的动物中的多核苷酸、核酸或多肽不是“分离的”，但与其自然状态的共存材料分离的相同多核苷酸、核酸或多肽是“分离的”，正如该术语在本文所用。

但是可理解TrpM8离子通道蛋白可与不会干扰该蛋白预期目的的载体或稀释剂相混合，且仍然被认为是基本上分离的。TrpM8多肽也可以是基本上纯化的形式，在这个情况下它一般包含制品中的蛋白质，其中超过90％，例如95％、98％或99％的制品中的蛋白质是TrpM8多肽。

我们进一步描述包括部分TrpM8多肽的肽。因此，包括TrpM8离子通道的片段及其同源物、变体或衍生物。该肽可以是在2和200个氨基酸之间，优选在4和40个氨基酸长度之间。如本文公开，该肽可来自于TrpM8多肽，例如可用合适的酶，例如胰蛋白酶来消化。可选，该肽、片段等，可通过重组方法，或综合合成来制得。

术语“肽”包括本领域已知的多种合成肽的变体，例如retroinverso D肽。该肽可以是抗原决定簇和/或T-细胞表位。该肽在体内可以是免疫原性的。优选该肽能够在体内诱导中和抗体。

通过排列来自不同物种的TrpM8离子通道，有可能确定氨基酸序列的哪些区域在不同物种间是保守的(“同源区域”)，以及哪些区域在不同物种之间是变异的(“异源区域”)。

因此TrpM8多肽可包含与至少部分的同源区域对应的序列。同源区域在至少两个物种之间显示高度的同源性。例如，使用上面描述的测试，同源区域可显示至少为70％，优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％的氨基酸水平的同一性。包含与同源区域对应的序列的肽，可如下面更多细节所解释的那样用于治疗策略。可选，TrpM8离子通道可包含与至少部分异源区域对应的序列。异源区域在至少两个物种之间显示低度的同源性。

TrpM8离子通道的多核苷酸和核酸

如本文其他部分进一步详细描述，我们进一步公开了TrpM8多核苷酸、TrpM8核苷酸和TrpM8核酸、制备方法、这些的用途等。

术语“TrpM8多核苷酸”、“TrpM8核苷酸”和“TrpM8核酸”可相互替换使用，并且用于指包含如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示核酸序列的多核苷酸/核酸，或其同源物、变体、或衍生物。优选，该多核苷酸/核酸包含，或者是核酸序列SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2，最优选SEQ ID NO：2的同源物、变体或衍生物。

这些术语也指包括能够编码多肽和/或肽，即TrpM8多肽的核酸序列。因此，TrpM8离子通道多核苷酸和核酸包含能够编码包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列或其同源物、变体或衍生物的多肽的核苷酸序列。优选，TrpM8离子通道多核苷酸和核酸包含能够编码包含SEQ IDNO：3所示氨基酸序列或其同源物、变体或衍生物的多肽的核苷酸序列。

“多核苷酸”一般是指可能是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA的任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸。“多核苷酸”包括但不限于，单-和双-链的DNA、单-和双-链区域混合物的DNA、单-和双-链RNA、以及单-和双-链区域混合物的RNA，包含可以是单链、或更通常是双链、或单-和双-链区域混合物的DNA和RNA的杂合分子。另外，“多核苷酸”是指包含RNA或DNA或RNA和DNA都有的三链区域。术语多核苷酸也包括包含一个或多个修饰碱基的DNA或RNA，以及具有为了稳定或其他原因而修饰的骨架的DNA或RNA。“经修饰的”碱基包括，例如，三苯甲基化的碱基和不常见的碱基，例如次黄苷。已经对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多聚核苷酸”包括通常天然存在的化学、酶促、或代谢修饰的多核苷酸的形式，以及病毒和细胞特有的DNA和RNA的化学形式。“多核苷酸”也包括相对短的多核苷酸，经常被称为寡核苷酸。

技术人员会了解，由于遗传密码简并性的结果，许多核苷酸序列能够编码相同的多肽。

本文使用的术语“核苷酸序列”是指核苷酸序列、寡核苷酸序列、多核苷酸序列及其变体、同源物、片段和衍生物(例如其部分)。该核苷酸序列可以是基因组、或合成的或重组来源的的DNA或RNA，其可以是代表有义或反义链或其组合的双链或单链。术语核苷酸序列可通过使用重组DNA技术(例如，重组DNA)来制备。

优选，术语“核苷酸序列”是指DNA。

本文中使用的术语“变体”、“同源物”、“衍生物”或“片段”包括对TrpM8核苷酸序列的序列的一个(或多个)核酸的任意取代、变异、修饰、替代、缺失或添加。除非本文其他内容允许，否则对“TrpM8"和"TrpM8离子通道”的参考包括对TrpM8的这种变体、同源物、衍生物和片段的参考。

优选，所得到的核苷酸序列编码具有离子通道活性，优选与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的离子通道具有至少相同活性的多肽。优选，术语“同源物”是指包涵对于结构和/或功能的同一性，以使得所得到的核苷酸序列编码具有离子通道活性的多肽。关于序列的同一性(即相似性)，优选有至少70％、更优选至少75％、更优选至少85％、更优选至少90％的序列同一性。更优选有至少95％，更优选至少98％的序列同一性。这些术语也包括该序列的等位变体。

序列同源性的计算

关于这里出现的任何序列的序列同一性可通过任何一个或多个该序列与另一个序列的简单“眼球(eyeball)”(即，严格比较)比较来看另外的序列与该序列是否具有，例如，至少70％的序列同一性。

相对的序列同一性也可通过能够用确定同一性，例如使用缺省参数的任何合适算法来计算两个或多个序列之间的％同一性的可商购的计算机程序来确定。这种计算机程序的典型实例是CLUSTAL。用来确定两个序列之间的同一性和相似性的其他计算机程序方法包括但不限于，GCG程序包(Devereux et al 1984 Nucleic Acids Research 12：387)和FASTA(Ntschul et al1990 J Molec Biol 403-410)。

％同源性可通过毗邻序列来计算，即，将一个序列与另一个序列进行序列对比，并且一个序列中的每个氨基酸直接与另一个序列的相应氨基酸进行每次一个残基的比较。这被称为“无缺口的”序列对比。一般地，这种无缺口的序列对比只在相对少量的残基中进行。

尽管这是非常简单且一致的方法，但是它没有考虑到，例如，在序列的另外相同的配对中，一个插入或缺失将导致随后的氨基酸残基被逐出序列对比，因此当进行整体排列时，将潜在导致％同源性的大幅度下降。因此，多数序列比较方法被设计成考虑到可能的插入和缺失而不会对整体同源性积分不适当地罚分，从而产生最佳的序列对比。这通过在序列对比中插入“缺口”来试图最大化局部的同源性而实现。

但是，这些更复杂的方法对序列对比中出现的每个缺口指定了“缺口罚分”，这样，对于相同数量的等同氨基酸，带有尽可能少的缺口的序列对比——反应两个比较序列之间的更高相关性——将比有较多缺口的序列获得更高的积分。一般用“远交缺口计分(Affine gap costs)”来给缺口的存在扣(charge)较多的计分，给缺口中每个随后的残基扣较少罚分。这是最普遍使用的缺口积分系统。高缺口罚分当然将产生具有较少缺口的最优化的序列对比。多数序列对比程序允许修改缺口罚分。但是当使用这种软件作序列比较时，优选使用缺省值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分是缺口为-12每个延伸为-4。

因此，最大％同源性的计算首先需要产生考虑到缺口罚分的最佳序列对比。进行这种序列对比的适合计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit程序包(University of Wisconsin，美国；Devereux et al.，1984，Nucleic AcidsResearch 12：387)。能够进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于，BLAST程序包(Ausubel et al.，1999 ibid-Chapter 18)、FASTA(Atschul et al.，1990，J.Mol.Biol.，403-410)和比较工具的GENEWORKS套装(suite)。BLAST和FASTA提供离线和在线搜索(Ausubel et al.，1999 ibid，pages 7-58to 7-60)。

尽管最终的％同源性能够用同一性来测量，但序列对比过程本身通常并不是基于全或无的配对比较。事实上，通常使用量化的相似积分矩阵，其根据化学相似性或进化距离为每个配对比较指定积分。通常使用的这种矩阵的实例是BLAST程序套装的缺省矩阵一BLOSUM62矩阵。GCGWisconsin程序通常可使用公共缺省值，或者如果提供的话，可使用自定义符号比较表。优选使用GCG程序包中的公共缺省值，或在使用其他软件的情况下，使用缺省矩阵，例如BLOSUM62。

有利的是，使用参数设置为缺省值的BLAST算法。在http://www.ncbi.nih.gov/BLAST/blast help.html中详细描述了BLAST算法，其在此引入作为参考。可限定搜索参数并可有利地设置为确定的缺省参数。

有利的是，当通过BLAST评估时，“基本上等同”等同于匹配序列的期望值至少为大约7，优选至少为大约9，以及更优选10以上。BLAST搜索中，EXPECT的缺省阈值通常是10。

BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是通过程序blastp、blastn、blastx、tblastn，和tblastx使用的启发式搜索算法；这些程序的显著之处在于他们利用了有些改进的Karlin和Altschul(Karlin and Altschul 1990，Proc.Natl.Acad.Sci USA 87：2264-68；Karlin and Altschul，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-7；see http://www.nobi.nih.gov/BLAST/biast help.html)的统计方法的发现。BLAST程序适用于序列相似性搜索，例如鉴定查询序列的同源物。在序列数据库的相似性搜索中基本问题的讨论参见Altschul et al(1994)Nature Genetics 6：119-129。

5个BLAST程序可在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov获得，完成下列任务：blastp-将氨基酸查询序列与蛋白质序列数据库比较；blastn-将核苷酸查询序列与核苷酸序列数据库比较；blastx-将核苷酸查询序列(两条链)的6框概念的翻译产物与蛋白质序列数据库比较；tblastn-将蛋白质查询序列相对以全部6个阅读框(双链)动态翻译的核苷酸序列数据库比较；tblastx-将核苷酸查询序列的六框翻译物与核苷酸序列数据库的六框翻译物比较。

BLAST使用下列搜索参数：

HISTOGRAM-显示每次搜索的积分直方图；缺省为yes。(参见BLAST指南的参数H)。

DESCRIPTIONS-限制报告为特定数目的相配序列简短描述的数目；缺省限制是100个描述。(参见指南页中的参数V)。

EXPECT-报告与数据库序列的匹配的统计显著性阈值；缺省值是10，以使得根据Karlin和Altschul(1990)的随机模型，预期只能偶尔出现10个匹配。如果匹配的统计显著性大于EXPECT阈值，则这个匹配将不会被报告。越低的EXPECT阈值越严谨，导致报告的机会匹配更少。分数值是可接受的。(参见BLAST指南中的参数E)。

CUTOFF-报告高积分节段对(high-scoring segment pair)的截断值积分。缺省值从EXPECT值(见上)计算得出。仅当HSP的统计显著性至少与具有相等CUTOFF值的积分的单独HSP一样高时，才会对数据库序列报告HSP。CUTOFF值越高越严谨，导致报告的机会匹配更少。(参见BLAST指南的参数S)。通常，使用EXPECT可更直观地控制显著性阈值。

ALIGNMENTS-限制数据库序列为报告高积分节段对(HSPs)的特定数目；缺省限制为50。如果发生更多的数据库序列满足报告的统计显著性域值(见下面的预期值和截值)，那么只报告有最大统计显著性的匹配。(参见BLAST指南的参数B)。

MATRIX-为BLASTP、BLASTX、TBLASTN和TBLASTX指定任选积分矩阵。缺省矩阵是BLOSUM62(Henikoff & Henikoff，1992)。可用的备用选择包括：PAM40、PAM120、PAM250和IDENTITY。对于BLASTN没有任选积分矩阵；在BLASTN请求中指定MATRIX指令会反馈错误的应答。

STRAND-限制TBLASTN为刚好搜索数据库序列的顶端和底端链；或限制BLASTN、BLASTX或TBLASTX刚好搜索查询序列的顶端或末端链上的阅读框。

FILTER-掩盖如通过Wotton和Federhen(1993)Computers andChemistry 17：149-163)的SEG程序确定的具有低组合复杂性的查询序列节段，或由如通过Claverie和States(1993)Computers and Chemistry 17：191-201的XNU程序，或对于BLASTN，通过Tatusov和Lipman(见http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的DUST程序确定的短周期内部重复组成的节段。过滤可从blast输出结果(例如对于普通的酸-、碱-或脯氨酸-富集区的搜索命中)除去统计上显著但生物学上不感兴趣的报告，保留作数据库序列特异匹配可用的查询序列中在生物学上更感兴趣的区域。

通过过滤程序发现的低复杂度的序列，在核苷酸序列中用字母“N”代替(例如，“NNNNNNNNNNNNN”)，在蛋白质序列中用字母“X”代替(如，“XXXXXXXXX”)。

过滤仅应用于查询序列(或其翻译产物)，不适用于数据库序列。对BLASTN，缺省过滤是DUST，对于其他程序，则是SEG。

当在SWISS-PROT中用于序列时，通常通过SEG、XNU或两者皆是不能掩盖任何结果，因此不能预期过滤总能产生效果。而且，在某些情况下，序列可能完全被掩盖，表明针对未过滤的查询序列报告的任何匹配的统计显著性将受到怀疑。

NCBI-gi-产生显示在输出结果中的NCBI gi身份，同时还显示登录号和/或基因座的名称。

更优选地，利用在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST提供的简单BLAST搜索算法来进行序列比较。在一些实施方案中，当测定序列同一性时，不使用“缺口罚分”。

杂交

我们进一步公开能够与这里提供的序列杂交的核苷酸序列，或其任何片段或衍生物，或上述任何的互补物。

杂交意味着“核酸的一条链通过碱基配对与互补链相连接的过程”(Coombs J(1994)Dictionary of Biotechnology，Stockton Press，New YorkNY)，以及如Dieffenbach CW和GS Dveksler(1995，PCR Primer，aLaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plainview NY)所描述的，以聚合酶链式反应技术进行扩增的过程。

杂交条件是基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger和Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology，Vol 152，Academic Press，San Diego CA)所教导的，并且赋予了如下所解释的被限定的“严谨性”。

能够与本文出现的核苷酸序列或其互补体选择性杂交的核苷酸序列，与本文出现的相应核苷酸序列，在至少20个，优选至少25或30，例如至少40、60或100以上连续的核苷酸的区域上，一般是至少70％，优选至少75％，更优选至少85％或90％，以及更优选至少95％或98％同源的。优选的核苷酸序列将包含与SEQ ID NO：1、2或4同源的区域，优选与该序列之一是至少70％、80％或90％，以及更优选至少95％同源的。

术语“选择性杂交”是指用作探针的核苷酸序列在发现目标核苷酸序列以明显高于背景的水平与该探针杂交的条件下被使用。由于其他核苷酸序列的存在，例如，在被筛选的cDNA或基因组DNA文库中，可出现背景杂交。在这个情况下，背景隐含通过探针和文库中非特异性DNA成员的相互作用而产生的信号水平，其比用目标DNA所观察到的特异性相互作用在强度上低10倍，优选低100倍。相互作用的强度可例如通过用放射性标记，如用³²P探针来测量。

也包括能够在中等至最大严谨度的条件下，能够与本文出现的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。杂交条件是基于核酸结合复合物的解链温度(Tm)，如Berger and Kimmel(1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methodsin Enzymology，Vol 152，Academic Press，San Diego CA)所教导，并且赋予如下解释所限定的“严谨性”。

最大严谨性一般发生在大约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)；高严谨性在Tm以下大约5℃到10℃；中等严谨性在Tm以下大约10℃到20℃；以及低严谨性在Tm以下大约20℃到25℃。如本领域技术人员所理解，最大严谨性杂交可用于鉴定或检测相同的核苷酸序列，而中等(或低)严谨性杂交可用来鉴定或检测相似或相关的核苷酸序列。

在优选的实施方案中，我们公开了能够在严谨条件(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸三钠pH7.0}下与一个或多个TrpM8离子通道核苷酸序列杂交的核苷酸序列。当核苷酸序列是双链时，包括双链体的单独或组合的两条链。当核苷酸序列是单链时，可理解该核苷酸序列的互补序列也有用。

我们公开了能够与本文出现的序列，或其任何片段或衍生物互补的序列杂交的核苷酸序列。同样的，我们公开的内容包括与能够与该序列杂交的序列互补的核苷酸序列。这些核苷酸序列类型是核苷酸序列变体的实例。在这个方面，术语“变体”包括与能够与本文出现的核苷酸序列杂交的序列互补的序列。然而，优选术语“变体”包括与能够在严谨条件(例如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15 M NaCl，0.015柠檬酸三钠pH 7.0})下，与本文出现的核苷酸序列杂交的序列相互补的序列。

TrpM8离子通道和同源物的克隆

本文公开的内容包括与本文出现的序列，或其任何片段或衍生物相互补的核苷酸序列。如果该序列与其片段互补，则该序列可用作探针来鉴定和克隆其他生物等的相似离子通道序列。

这使得从人和其他物种，例如鼠、猪、羊等克隆TrpM8离子通道、其同源物和其他结构或功能上相关的基因得以实现。与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：4中包含的核苷酸序列或其片段等同或足够等同的多核苷酸，可用作cDNA和基因组DNA的杂交探针，来从适合的文库分离编码TrpM8离子通道的部分或全长cDNA和基因组克隆。这种探针也可用于分离与TrpM8离子通道基因具有序列相似性，优选具有高度序列相似性的其他基因的cDNA和基因组克隆(包括编码来自除人类以外的物种的同源物或直向同源物的基因)。杂交筛选、克隆和测序技术是本领域技术人员已知的，并且在例如Sambrook等(同上)中有描述。

一般适合用作探针的核苷酸序列与所指对象是70％等同、优选80％等同、更优选90％等同、甚至更优选95％等同。该探针一般包含至少15个核苷酸。优选这种探针具有至少30个核苷酸，并且可具有至少50个核苷酸。特别优选的探针在150到500个核苷酸范围之间，更特别的是大约300个核苷酸。

在一个实施方案中，为了获得编码TrpM8多肽的多核苷酸，包括来自除人类以外的物种的同源物和直向同源物，包括用具有SEQ ID NO：1，SEQID NO：2，SEQ ID NO：4或其片段的标记探针在严谨性杂交条件下筛选适当的文库，并且分离含有所述多核苷酸序列的部分或全长cDNA和基因组克隆的步骤。这种杂交技术是本领域技术人员已知的。严谨性杂交条件如上面所定义的，或任选的条件是于42℃，在包含如下的溶液中温育过夜：50％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖，和20微克/ml变性、剪切的鲑精DNA，之后在0.1×SSC中于大约65℃洗涤滤器。

TrpM8离子通道的功能性分析

克隆的推定TrpM8离子通道多核苷酸可通过序列分析或功能测试来确认。特别的，如上所述转染的爪蟾卵母细胞的电导可以测量和定量TrpM8活性的方式来检测，用于下述的筛选性分析。为便利称这种电导检测为“TrpM8的功能性分析(电导)”。

推定的TrpM8离子通道或同源物可如下述在“TrpM8功能性分析(传导性)”中检测活性。来自编码TrpM8离子通道cDNA的线性化质粒模板的戴帽RNA转录物，按照标准步骤，用RNA聚合酶体外合成。体外转录物以终浓度0.2mg/ml悬浮于水中。从成年雌性蟾蜍中取出卵巢叶，获得V阶段的除去滤泡膜的卵母细胞，用微注射装置以50nl推注RNA转录物(10ng/卵母细胞)。用双电极电压钳测量单独的非洲爪蟾卵母细胞在接触激动剂的刺激后的电流。在96mM NaCl，2mM KCl，1mM MgCl₂，0.1mM CaCl₂，5mMHepes，pH 7.4进行记录，并于室温补充200mM甘露醇。OSM是210mOsm。非洲爪蟾系统也可如下进一步详细描述的，用于筛选已知的配体和活化配体的组织/细胞提取物。

任选的功能性分析包括全细胞电生理、荧光共振能量转移(FRET)分析和FLIPR分析。

TRPM8离子通道的表达分析

为了设计治疗TrpM8离子通道相关疾病的有效治疗剂，确定Trp8M(无论野生型或具体突变体)的表达模式是有帮助的。因此，本领域已知的方法可用来确定表达Trp8M的器官、组织和细胞类型(以及发育阶段)。例如，可进行传统或“电子”的Northern。也可使用逆转录PCR(RT-PCR)来检测Trp8M基因或突变体的表达。用来确定Trp8M表达模式的更灵敏方法包括如本领域技术人员已知的RNAse保护分析。

Northern分析是用于检测基因转录物存在的实验室技术，并涉及标记的核苷序列与其上已经结合了来自特定细胞类型或组织的RNA的膜杂交。(Sambrook，如上所述，ch.7和Ausubel，F.M.et al.如上所述，ch.4 and 16.)。应用BLAST的类似物计算机技术(“电子Northern”)可用于在诸如GenBank或LIFESEQ数据库(Incyte Pharmaceuticals)的核苷数据库中搜索等同或相关的分子。这种分析类型的优点在于它们可能比基于多重膜的杂交更为快速。而且，可改进计算机搜索的灵敏性来确定任何具体匹配是否被分类为精确的或同源性的。

这里描述的多核苷酸和多肽，包括上述探针，可用作开发动物和人类疾病的治疗剂或诊断剂的研究试剂和材料，正如本文其他部分更多细节所解释。

TrpM8离子通道多肽的表达

我们进一步公开了制备TrpM8多肽的方法。该方法一般包括在适当的条件下(即，表达TrpM8离子通道多肽的条件)培养包含编码TrpM8离子通道多肽的核酸，或其同源物、变体或衍生物的宿主细胞。

为了表达有生物活性的TrpM8离子通道，编码TrpM8离子通道的核苷酸序列或其同源物、变体或衍生物被插入适当的表达载体，即，含有为插入的编码序列的转录和翻译所必需元件的载体。

本领域技术人员公知的方法被用来构建含有编码TrpM8离子通道和适当的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术、和体内基因重组。这些技术在Sambrook，J.et al.(1989；MolecularCloning，A Laboratory Manual，ch.4，8，and 16-17，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y)和Ausubel，F.M.et al.(1995 and periodic supplements；Current Protocols in Molecular Biology，ch.9，13，and 16，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)中有描述。

多种表达载体/宿主系统可用来包含和表达编码TrpM8离子通道的序列。这些包括但不限于，例如用重组噬菌体、质粒或粘端质粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒(CaMV)或烟草花叶病毒(TMV))，或用细菌表达载体(例如，Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。所用的宿主细胞性质并没有关系。

“控制元件”或“调控序列”是与宿主的细胞蛋白相互作用来进行转录和翻译的载体非翻译区(即增强子、启动子、和5’和3’的非翻译区)。这些元件的长度和特异性可有改变。依赖于使用的载体系统和宿主，任何数量的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型的启动子都可使用。例如当在细菌系统中克隆时，诱导型的启动子，例如BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1质粒(GIBCO/BRL)等的杂合LacZ启动子都可使用。杆状病毒多角体蛋白启动子可用于昆虫细胞中。来自植物细胞基因组(例如热休克、RUBISCO、和贮藏蛋白基因)或来自植物病毒的启动子或增强子(例如病毒启动子或前导序列)可被克隆到载体中。在哺乳动物细胞系统中，来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子是优选的。如果必须产生含有编码TrpM8离子通道序列的多个拷贝的细胞系，可使用带合适的选择性标记的基于SV40或EBV的载体。

在细菌系统中，许多表达载体可依赖TrpM8离子通道的预期用途而选择。例如，当需要大量的TrpM8离子通道来诱导抗体时，可使用指导高水平表达易被纯化的融合蛋白的载体。这种载体包括但不限于，多功能的大肠杆菌克隆和表达载体，例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码TrpM8离子通道的序列可连接到载体中，与氨基末端的Met和β-半乳糖苷酶的随后7个残基处于阅读框内，从而制备杂合蛋白，pIN载体(Van Heeke，G.andS.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)等。pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)也可用于通过谷胱甘肽S转移酶(GST)来表达作为融合蛋白的外源多肽。通常，这种融合蛋白是可溶的，它能够通过谷胱甘肽-琼脂糖珠的吸附，之后在存在游离谷胱甘肽时洗脱从而容易地从裂解细胞中纯化出来。这种系统中制备的蛋白可被设计成包括肝素、凝血酶、或因子XA蛋白酶切割位点，以使得感兴趣的克隆多肽能够任意地从GST部分释放出来。

在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可使用含有组成型或诱导型启动子的许多载体，例如α因子、醇氧化酶，和PGH。有关综述，参见Ausubel(同上)和Grant et al.(1987；Methods Enzymol.153：516-544)。

在使用植物表达载体的情况中，编码TrpM8离子通道的序列的表达，可被任何数量的启动子所驱动。例如，病毒启动子，例如CaMV的35S和19S启动子可单独使用，或可与来自TMV的omega前导序列组合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6：307-311.)。可，可使用植物启动子，例如RUBISCO的小亚基，或热休克启动子(Coruzzi，G.et al.(1984)EMBO J.3：1671-1680；Broglie，R.et al.(1984)Science 224：838-843；和Winter，J.et al.(1991)Results Probl.Cell Differ.17：85-105.)。这些构建体可通过直接的DNA转化或病原体介导的转染被导入植物细胞。这些技术在一般提供的综述中有描述(参见，例如，Hobbs，S.or Murry，L.E.in McGraw Hill Yearbook ofScience and Technology(1992)McGraw Hill，New York，N.Y.；pp.191-196.)。

昆虫系统也可用来表达TrpM8离子通道。例如，在这种系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)被用作载体，在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或粉纹夜蛾(Trichoplusia larvae)幼虫中表达外源基因。编码TrpM8离子通道的序列可被克隆进病毒的非必需区，例如多角体蛋白基因，并且受多角体蛋白启动子的控制。TrpM8离子通道的成功插入将使得多角体蛋白基因失活，并且产生缺乏衣壳蛋白的重组病毒。之后，该重组病毒可用于感染其中可表达TrpM8离子通道的，例如，草地夜蛾细胞或粉纹夜蛾幼虫(Engelhard，E.K.et al.(1994)Proc.Nat.Acad.Sci.91：3224-3227.)。

在哺乳动物宿主细胞中，可使用基于病毒的许多表达系统。在腺病毒用作表达载体的情况下，编码TrpM8离子通道的序列可连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒转录/翻译复合物中。插入病毒基因组的非必需E1或E3区，可获得能够在被感染宿主细胞中表达TrpM8离子通道的活病毒(Logan，J.and T.Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659.)。而且，转录增强子，例如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子，可用于在哺乳动物宿主细胞中增强表达。

因此，例如TrpM8离子通道可在人胚肾293(HEK293)细胞或贴壁的CHO细胞中表达。为了使表达最大化，在插入pCDN或pCDNA3载体之前，通常将全部的5’和3’未翻译区(UTR)从TrpM8 cRNA中移除。用单独的cDNA通过脂质体转染细胞，并在存在400mg/ml G418时进行选择。选择3周后，挑出单独的克隆并扩展用于进一步分析。用载体单独转染的HEK293或CHO细胞作为阴性对照。为了分离稳定表达单独的离子通道的细胞系，通常选取大约24个克隆，并用Northern印迹分析进行分析。TrpM8离子通道mRNA通常可在大约50％的被分析的G418-抗性克隆中检测到。

人类人工染色体(HAC)也可用来传递比能够在质粒中包含和表达的DNA片段更大的DNA片段。为治疗目的，构建大约6kb到10Mb的HAC，并通过传统的传递方法(脂质体、聚阳离子氨基聚合物或载体)传递。

也可用特异的起始信号来更高效地翻译编码TrpM8离子通道的序列。这种信号包括ATG起始密码子和邻近序列。在编码TrpM8离子通道的序列及其起始密码子和上游序列被插入合适的表达载体时，可不再需要附加的转录或翻译控制信号。但是，只有在插入编码序列或其片段的情况下，才应提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。而且，起始密码子应位于正确的阅读框中，来确保整个插入物的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以有天然和合成的多种来源。通过包括适于所用的具体细胞系统的增强子，例如文献中所描述的，可提高表达的效率(Scharf，D.et al.(1994)Results Probl.Cell Difrer.20：125-162.)。

而且，可根据调节插入序列表达，或以需要的方式加工被表达蛋白质的能力来选择宿主细胞株。这种多肽的修饰包括但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化、以及酰化。切割蛋白的“前原”形式的翻译后加工也可利于正确插入、折叠、和/或发挥功能。具有特殊胞内机制和翻译后活性的特征性机制的不同宿主细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、HEK293、和WI38)，可从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Bethesda，Md.)获得，并可加以选择以确保外源蛋白的正确修饰和加工。

对于重组蛋白的长期高产量生产，稳定的表达是优选的。例如，能够稳定表达TrpM8离子通道的细胞系可用含有病毒复制起点和/或内源性表达元件以及可选择标记基因(在相同或分别的载体上)的表达载体来转化。导入载体后，在转移到选择性培养基之前，可允许细胞在富集培养基中生长大约1到2天。选择性标记的目的是赋予对选择的抗性，并且其存在允许成功表达了导入序列的细胞的生长和恢复。稳定转化的细胞的抗性克隆可使用适合该细胞类型的组织培养技术来增殖。

任何数量的选择系统可用来恢复转化的细胞系。这些包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(Wigler，M.et al.(1977)Cell 11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因(Lowy，I.et al.(1980)Cell 22：817-23)，它们可分别用于tk^-或apr^-细胞。抗代谢物、抗生素、或除草剂抗性也能够用来作为选择的基础。例如，dhfr赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler，M.et al.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；npt赋予对氨基甙类新霉素和G-418的抗性(Colbere-Garapin，F.et al(1981)J.Mol.Biol.150：l-14)；以及als或pat分别赋予对氯磺隆(chlorsulfuron)和草铵膦(phosphinotricin)乙酰转移酶的抗性(Murry，同上)。附加的选择性基因已经有描述，例如trpB，其容许细胞利用吲哚代替色氨酸、或hisD，其容许细胞利用histinol代替组氨酸(Hartman，S.C.and R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：8047-51.)。最近，可见标记的使用已经开始流行，这些标记例如花色苷(anthocyanin)、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS，以及荧光素酶及其底物荧光素。这些标记不仅可用于鉴定转化体，还可用来定量具体载体系统所致(attributeable)的瞬时或稳定蛋白表达量(Rhodes，C.A.et al.(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131.)。

尽管标记基因表达的出现/缺乏暗示也存在感兴趣的基因，但该基因的存在和表达可能需要证实。例如，如果编码TrpM8离子通道的序列被插入标记基因序列中，含有编码TrpM8离子通道序列的转化细胞可通过标记基因功能的缺乏而被鉴定。可选，标记基因能够与编码TrpM8离子通道的序列串连排列受单个启动子的控制。标记基因应诱导或选择的表达经常也表明了串连基因的表达。

可选，含有编码TrpM8离子通道的核酸序列并且表达TrpM8离子通道的宿主细胞，可通过本领域技术人员已知的多种方法进行鉴定。这些方法包括但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA杂交，以及蛋白质生物检测或免疫检测技术，其包括用来检测和/或定量核酸或蛋白质序列的基于膜、溶液、或芯片的技术。

编码TrpM8离子通道的多核苷酸序列的存在能够通过利用探针或片段或编码TrpM8离子通道的多核苷酸片段的DNA-DNA或DNA-RNA杂交或扩增来检测。基于核酸扩增的检测涉及使用基于编码TrpM8离子通道的序列的寡核苷酸或寡聚体来检测含有编码TrpM8离子通道的DNA或RNA的转化体。

利用对该蛋白质特异的多克隆或单克隆抗体来检测和测量TrpM8离子通道表达的多种方法是本领域技术人员已知的。这种技术的实例包括酶联免疫吸附测定(ELISAs)、放射免疫测定(RIA)、和荧光激活细胞分选术(FACS)。利用与TrpM8离子通道上的两个非干扰表位起反应的单克隆抗体进行的双位点、基于单克隆的免疫测定是优选，但也可使用竞争性结合测定。这些和其他测定在本领域中已有详细描述，例如Hampton，R.et al(1990；Serological Methods，a Laboratory Manual，Section IV，APS Press，StPaul，Minn.)和Maddox，D.E.et al.(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)。

多种标签和连接的技术是本领域技术人员已知的，并且可用于多种核酸和氨基酸分析。制备杂交或PCR的标记探针来检测与编码TrpM8离子通道的多核苷酸相关的序列的方法包括，oligolabeling、缺口平移、末端标记、或使用标记的核苷酸的PCR扩增。可选，编码TrpM8离子通道的序列，或其任何片段，可被克隆进用于制备mRNA探针的载体。这种载体是本领域已知的，是商业化提供的，并且通过加入合适的RNA聚合酶，例如T7、T3、或SP6和标记的核苷酸，来在体外合成RNA探针。这些方法可用多种商业化提供的试剂盒来进行，例如由Pharmacia & Upjohn(Kalamazoo，Mich.)，GE Healthcare(UK)和U.S.Biochemical Corp.(Cleveland，Ohio)提供的试剂盒。为了检测方便的合适报告分子或标签包括放射性核素、酶、荧光、化学发光、或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。

用编码TrpM8亚基的核苷酸序列转化的宿主细胞可在适于蛋白质表达并从细胞培养物回收的条件下培养。由转化细胞制备的蛋白质可根据使用的序列和/或载体而位于细胞膜上、分泌或包含在细胞内。如本领域技术人员所理解，含有编码TrpM8亚基的多核苷酸的表达载体可被设计成包含指导TrpM8亚基通过原核或真核的细胞膜分泌的信号序列。其他构建体可用来将编码TrpM8亚基的序列和编码利于可溶性蛋白纯化的多肽结构域的核苷酸序列连接。这种促进纯化的结构域包括但不限于，金属鳌合肽，例如容许在固定的金属上进行纯化的组氨酸-色氨酸模块，容许在固定的免疫球蛋白上纯化的蛋白质A结构域，以及用于FLAGS延伸/亲合纯化系统的结构域(Immunex Corp.，Seattle，Wash.)。在纯化结构域和TrpM8亚基编码序列之间包括可切除的连接序列，例如对因子XA或肠激酶(Invitrogen，SanDiego，Caiif.)特异的序列，可以利于纯化。一个这样的表达载体可使含有TrpM8亚基和在硫氧还蛋白或肠激酶切割位点前编码6个组氨酸残基的核酸的融合蛋白表达。组氨酸残基利于在固定的金属离子亲合层析上的纯化(IMIAC；在Porath，J.et a1.(1992)Prot.Exp.Purif.3：263-281中有描述)，而肠激酶切割位点提供了从融合蛋白纯化TrpM8亚基的方法。对含融合蛋白的载体的论述见Kroll，D.J.et al.(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)。

TrpM8亚基的片段不仅可通过重组制备，而且可通过直接肽合成利用固相技术(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154.)来制备。蛋白质合成可通过手动技术或自动进行。自动合成可通过，例如使用AppliedBiosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)来实现。TrpM8亚基的多种片段可分别合成，之后组合制备全长的分子。

生物传感器

TrpM8多肽、核酸、探针、抗体、表达载体和配体可用作(并可用于生产)生物传感器。

按照Aizawa(1988)，AnaL Chem.Symp.17：683，生物传感器被定义为，用于识别分子的受体的独特组合，例如，具有固定抗体或离子通道(例如TrpM8)的选择性层，和用于传递测量值的传导器。一组这样的生物传感器将检测由于该受体与周围介质的相互作用而在表面层的光学特性上引起的变化。在这些技术中，可特别提及椭圆偏振术和表面等离子共振术。结合有TrpM8的生物传感器可用于检测TrpM8配体的存在或水平。这种生物传感器的构建是本领域公知的。

因此表达TrpM8亚基的细胞系可用作检测配体(例如ATP)的报告系统，其借助于受体促进的[3H]磷酸肌醇或其他第二信使的形成(Watt et al.，1998，J Biol Chem May 29；273 (22)：14053-8)。受体-配体生物传感器也在Hoffinan et al.，2000，Proc Natl Acad Sci USA Oct 10；97(21)：11215-20中有描述。包含TrpM8的光学和其他生物传感器也可用来检测与G蛋白和其他蛋白的相互作用的水平或存在，如例如Figler et al，1997，Biochefsaistfy Dec 23；36(51)：16288-99和Sarrio et al.，2000，Mol Cell Biol 2000 Jul；20(14)：5164-74)所述。生物传感器的感受器单位见例如US 5,492,840中所述。

筛选分析

TrpM8多肽，包括同源物、变体、和衍生物，无论是天然的还是重组的，都可在结合TrpM8离子通道的化合物，和活化(激动剂)或抑制(抑制剂)TrpM8活化的化合物的筛选方法中应用。因此，这种多肽也可用于评估小分子底物和配体在例如，细胞、不含细胞的制品、化学文库、和天然产物混合物中的结合。这些底物和配体可以是天然的底物和配体，或可以是结构性或功能性的部分。参见Coligan et al.，Current Protocols in Immunology1(2)：Chapter 5(1991)。

TrpM8离子通道多肽决定很多生物功能，包括很多病理症状。因此，希望发现一方面刺激TrpM8离子通道且另一方面抑制TrpM8离子通道功能的化合物和药物。通常，激动剂和拮抗剂在例如焦虑、紧张、抑郁、癌症或疼痛的状况时用于治疗和预防的目的。

对可能与TrpM8离子通道蛋白相互作用的候选化合物的合理设计可基于多肽的分子形状的结构研究。一种确定哪些位点与特异的其他蛋白质相互作用的方法是确定物理结构，例如，X-射线晶体学或二维NMR技术。这会提供对于哪些氨基酸残基形成分子接触区域的指导。关于确定蛋白结构的详细描述，参见例如Blundell and Johnson(1976)Protein Crystallography，Academic Press，New York。

合理设计的任选使用涉及通常制备在细胞表面上表达TrpM8离子通道多肽的合适细胞的筛选程序。这种细胞包括来自动物、酵母、果蝇或大肠杆菌的细胞。之后将表达TrpM8的细胞(或含有表达蛋白的细胞膜)与被试化合物接触以观察功能性反应的结合、刺激或抑制。例如，可将TrpM8 mRNA或多肽注射给爪蟾卵母细胞，并且利用电压钳测量通过接触被试化合物而诱导的电流，见其他部分更详细的描述。

并非用TrpM8离子通道分别测试每种候选化合物，候选配体的文库或库可有利地被制备和筛选。因此例如，已组装了超过200个推定配体的库用于筛选。该库包括：已知借助离子通道起作用的递质、激素和趋化因子；可被推定为其哺乳动物对应物尚未被鉴定的离子通道、非哺乳动物、生物活性肽激动剂的天然存在的化合物；以及非天然存在、但用未知的天然配体活化的离子通道的化合物。

这个库可用来为已知配体筛选TrpM8离子通道，其中如其他部分更多细节所述的，使用功能性分析(即，钙、微生理计(microphysiometer)、FLIPR分析、全细胞电生理法、卵母细胞电生理法等，见其他部分)以及结合分析。但是，仍然存在大量的哺乳动物受体，但至今它们没有同源的活化配体(激动剂)或钝化配体(拮抗剂)。因此这些受体的活化配体可能没有包括在迄今为止已鉴定的配体库中。因此，TrpM8也可对组织提取物进行功能性筛选(使用钙、微生理计、卵母细胞电生理法等，功能性筛选)来鉴定天然的配体。产生阳性功能性反应的提取物可继续被亚分级，其片段如本文所述进行分析，直到分离和鉴定出活化配体。

在HEK 293细胞中表达的离子通道已经显示与PLC的活化和钙迁移和/或cAMP刺激或抑制在功能上偶联。因此，筛选技术包括在测量由通道活性引起的胞外pH或胞内钙变化的系统中表使用达TrpM8的细胞(例如，转染的爪蟾卵母细胞、CHO或HEK293细胞)。在这个技术中，化合物可与表达TrpM8多肽的细胞接触。之后测量第二信使反应，例如，信号转导、pH变化、或优选钙水平的改变，来确定潜在的化合物是否活化或抑制该通道。

优选该反应是钙水平的变化；为方便称这种分析为“TrpM8的功能性检测(钙浓度)”。

在这种实验中，观察转染或载体对照细胞中的HEK 293细胞的基础钙水平处于正常的100nM到200nM范围之内。表达同聚(monomeric)或异聚(heteromeric)TrpM8离子通道或重组的同聚或异聚的TrpM8离子通道的HEK293细胞用fura2上样，并且在一天中，对超过150个的被选配体或组织/细胞提取物评估激动剂诱导的钙迁移。类似的，评估表达TrpM8离子通道或重组的TrpM8离子通道的HEK 293细胞的Ca²⁺流增加或减少。在载体对照细胞中检测出现钙瞬时现象的激动剂，来确定这个反应是否是表达离子通道的转染细胞所独有的。

另一种方法涉及通过确定对TrpM8离子通道的抑制或刺激来筛选离子通道的抑制剂。这种方法包括，或者单独用TrpM8亚基转染真核细胞来形成同聚通道或者与其他Trp通道亚基一起转染真核细胞来形成异聚通道，以在细胞表面上表达离子通道。之后该细胞在存在TrpM8离子通道时接触潜在的拮抗剂。该细胞可用全细胞电生理学作试验来确定电导或电流动力学的变化。

检测TrpM8的激动剂或拮抗剂的另一种方法是美国专利号 5,482,835描述的基于酵母的技术，其在此引入作为参考。

在优选的实施方案中，该筛选使用对电导变化的检测来筛选TrpM8的激动剂和拮抗剂。具体的说，我们公开了其中TrpM8的拮抗剂降低了适当转染的细胞的电导的方法。优选，该电导在存在TrpM8的拮抗剂时，降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％以上。优选，在存在TrpM8的拮抗剂时，电导降低了1pS、2pS、3pS、4pS、5pS、10pS、15pS、25pS、35pS、45pS、60pS、70pS以上。

我们进一步公开了其中TrpM8的激动剂增加提高了适当转染的细胞的电导的方法。优选，在存在TrpM8激动剂时，电导提高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％以上。优选，在存在TrpM8激动剂时，电导提高了1pS、2pS、3pS、4pS、5pS、10pS、15pS、25pS、35pS、45pS、60pS、70pS以上。

在进一步优选的实施方案中，筛选使用对胞内钙浓度变化的检测，来筛选TrpM8的激动剂和拮抗剂。优选地，该筛选使用如上所述的功能性分析“TrpM8的功能性分析(钙浓度)”。

具体地，我们公开了其中TrpM8的拮抗剂降低了适当转染的细胞的钙浓度的方法。优选，在存在TrpM8拮抗剂时，钙浓度降低了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％以上。优选，在存在TrpM8拮抗剂时，钙浓度降低了1pS、2pS、3pS、4pS、5pS、10pS、15pS、25pS、35pS、45pS、60pS、70pS以上。

我们进一步公开了其中TrpM8的激动剂提高适当转染的细胞的钙浓度的方法。优选，在存在TrpM8激动剂时，钙浓度提高了10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％以上。优选，在存在TrpM8激动剂时，钙浓度提高了1pS、2pS、3pS、4pS、5pS、10pS、15pS、25pS、35pS、45pS、60pS、70pS以上。

当候选化合物是蛋白质，特别是抗体或肽时，可利用噬菌体展示技术来筛选候选化合物的文库。噬菌体展示是利用重组噬菌体的分子筛选方案。该技术涉及用来自候选化合物文库的化合物的编码基因转化噬菌体，以使得每个噬菌体或噬菌粒表达一种特定的候选化合物。经转化的噬菌体(优选被连接到固相支持物上)表达合适的候选化合物，并将其展示在噬菌体衣壳上。能够结合TrpM8多肽或肽的特定候选化合物通过基于亲合相互作用的选择策略而被富集。之后表征成功的候选试剂。噬菌体展示比标准的亲合配体筛选技术更具有优势。噬菌体表面以三维构型展示候选试剂，更紧密地反映了其天然存在的构象。这提供了为筛选目的更特异并具有更高亲和力的结合。

筛选化合物文库的另一种方法利用用表达化合物文库的重组DNA分子稳定转化的真核或原核宿主细胞。这种细胞，不论是存活还是固定的形式，能够用于标准的结合-配对物分析。也参见Parce et al.(1989)Science 246：243-247，和Owicki et al.(1990)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 87；4007-4011，其描述了检测细胞反应的灵敏方法。竞争性测定特别有用，其中表达化合物文库的细胞与已知结合TrpM8多肽的标记抗体，例如¹²⁵I-抗体相接触或温育，并且测量被试样品，例如候选化合物与结合组合物的结合亲和力。之后将多肽的结合或游离的标记结合配偶体分离，来评估结合程度。被试样品的结合量与结合多肽的标记抗体的量成反比。

多种技术中的任何一种都能够用于将结合的与游离的结合配偶体分离来评估结合的程度。这个分离步骤通常包括，例如，附着于滤器，然后洗涤，附着于塑料，之后洗涤，或离心细胞膜的操作步骤。

还有另一种方法是利用可溶的、未纯化或可溶的纯化多肽或肽，例如从转化的真核或原核宿主细胞提取的。这产生了优点在于提高的特异性、自动化能力、和药物检测高通量的“分子”结合分析。

候选化合物筛选的另一个技术涉及为具有合适的结合亲合力的新化合物，例如对TrpM8多肽提供高通量筛选的方法，并且在1984年9月13日公开的国际专利申请号WO 84/03564(Commonwealth Serum Labs.)中有详细描述。首先，大量不同的小肽被试化合物在固相物质，例如，塑料针(pin)或一些其他适宜的表面上合成；参见Fodor et al.(1991)。之后，全部的针与可溶性TrpM8多肽反应并洗涤。下一个步骤包括检测结合的多肽。如此鉴定出与多肽特异性相互作用的化合物。

配体结合分析提供了确定药理学的直接方式并且适用于高通量形式。纯化的配体可被放射性标记为高特异活性(50-2000Ci/mmol)来用于结合研究。之后确定放射性标记的过程不会减少配体对其靶标的活性。优化分析条件的缓冲液、离子、pH和其他调节剂，例如核苷酸，来建立膜和整个细胞的受体或离子通道的来源的可用信噪比。对于这些分析，特异性结合被定义为总的相关放射性减去在存在过量未标记的竞争性配体时测定的放射性。可能的话，使用一个以上的竞争性配体来限定剩余的非特异性结合。

该分析可简单地测试候选化合物的结合，其中与携受体或离子通道的细胞的附着借助于与该候选化合物直接或间接相关的标记或在涉及与标记的竞争剂竞争的分析中检测。进一步地，利用对在其表面携靶标的细胞适合的检测系统，这些分析可测试该候选化合物是否导致由靶标活化所产生的信号。通常在存在已知激动剂时测定活化的抑制剂，并且观察存在候选化合物时激动剂对活化的作用。

进一步地，该分析可简单地包括下列步骤：混合候选化合物与包含TrpM8多肽的溶液以形成混合物，测量混合物中TrpM8离子通道的活性，并且将混合物的TrpM8离子通道活性与标准物比较。

TrpM8亚基cDNA、蛋白质和抗该蛋白质的抗体也可用于配置检测增加的化合物对细胞中TrpM8亚基mRNA和蛋白质的制备的作用的分析。例如，利用单克隆和多克隆抗体，通过本领域已知的标准方法可构建测量TrpM8亚基蛋白质的分泌或细胞缔合水平的ELISA，这可用于发现可抑制或增强从适当操作的细胞或组织制备TrpM8亚基的试剂(也分别称为拮抗剂或激动剂)。用于进行筛选分析的标准方法是本领域清楚了解的。

潜在TrpM8离子通道拮抗剂和阻断剂的实例包括抗体或，有时候包括核苷酸及其类似物，包括嘌呤和嘌呤类似物、寡核苷酸或蛋白质，它们与TrpM8离子通道的配体，例如，配体片段、或结合离子通道但不激发应答的小分子紧密相关，以阻止该通道的活性。

我们因此也提供能够特异结合TrpM8多肽和/或肽的化合物。

术语“化合物”指(天然存在的或合成的)化学化合物，例如生物学大分子(例如，核酸、蛋白质、非肽、或有机分子)，或从例如细菌、植物、真菌、或动物(特别是哺乳动物)细胞或组织的生物材料制备的提取物，以及无机的元素或分子。优选该化合物是抗体。

为进行这种筛选必需的材料可被包装在筛选试剂盒中。这种筛选试剂盒用于鉴定TrpM8多肽的激动剂、拮抗剂、配体、受体、底物、酶等，或降低或提高TrpM8离子通道多肽制备的化合物。该筛选试剂盒包含：(a)TrpM8多肽；(b)表达TrpM8多肽的重组细胞；(c)表达TrpM8多肽的细胞膜；或(d)抗TrpM8多肽的抗体。该筛选试剂盒可以可选包括使用说明书。

转基因动物

我们进一步公开与正常的表达水平相比能够在正常、提高或降低的水平表达天然或重组的TrpM8离子通道、或同源物、变体或衍生物的转基因动物。优选，这种转基因动物是非人类哺乳动物，例如猪、绵羊或啮齿类动物。最优选该转基因动物是小鼠或大鼠。

我们公开其中天然TrpM8基因的全部或部分被来自另一个生物体的TrpM8序列替代的转基因动物。优选这个生物体是另一个物种，最优选是人类。在非常优选的实施方案中，我们公开了其全部TrpM8基因基本上被人TrpM8基因替换的小鼠。这种转基因动物，以及TrpM8野生型的动物，可用来筛选TrpM8的激动剂和/或拮抗剂。

例如，这种分析可包括将野生型或转基因动物，或其部分，优选该转基因动物的细胞、组织或器官接触候选物质，并且分析TrpM8相关的表型，例如疼痛或紧张。也可进行使用来源于相关动物的细胞的基于细胞的筛选，并且分析对电导或胞内钙浓度的影响。

我们进一步公开包含功能性缺损的TrpM8基因的转基因动物，其中在本文中公开的TrpM8的任何一项或多项功能被部分或完全地去除。其中包括由于损失TrpM8基因的一个或多个功能突变，包括缺失而不表达功能性TrpM8离子通道的转基因动物(“TrpM8敲除”)。

也包括部分损失功能的突变株，例如不完全的敲除，其可例如在TrpM8基因的被选部分具有缺失。这种动物可通过选择性替换或缺失TrpM8序列相关部分，例如功能上重要的蛋白质结构域而制备。

这种完全或部分损失功能的突变株用作TrpM8相关疾病，特别是疼痛或紧张相关疾病的模型。显示部分损失功能的动物可接触候选物质来鉴定出增强表型，即提高(对TrpM8而言)观察到的表型如痛觉减退或紧张水平下降的物质。利用在本文中其它部分鉴定的方法，也可检测其他参数，例如电导的降低或胞内钙水平的降低。

部分和完全的敲除也可用于鉴定TrpM8的选择性激动剂和/或拮抗剂。例如，可将激动剂和/或拮抗剂施用于野生型和TrpM8缺陷的动物(敲除)。将看到TrpM8的选择性激动剂或拮抗剂对野生型动物而不是TrpM8缺陷的动物有影响。具体地，设计特异的测定来评估潜在的药物(候选配体或化合物)以确定其是否在缺少TrpM8离子通道时产生生理反应。这可通过将该药物施用于如上所讨论的转基因动物来完成，然后分析该动物的特定应答。也可进行使用来源于相关动物的细胞的类似的基于细胞的方法，并且分析对电导或胞内钙浓度的影响。这种动物也可用于测试通过在本文中描述的筛选所鉴定出来的药物的效力。

在另一个实施方案中，具有部分损失功能表型的转基因动物被用于筛选。在这种实施方案中，该筛选可包括分析部分或完全的恢复或回复至野生型表型。也可进行使用来源于有关动物的细胞的基于细胞的筛选，并且测定对电导或胞内钙浓度的作用。被发现能够有作用的候选化合物可被认为是TrpM8激动剂或类似物。这种激动剂例如可用来恢复或增加个体对刺激，例如疼痛的敏感性，或提高其紧张水平。

在优选的实施方案中，转基因TrpM8动物，特别是TrpM8敲除动物(功能完全损失)，显示在实施例中陈述的表型，优选如通过在其中陈述的测试所测量的。因此，TrpM8动物，特别是TrpM8敲除动物，优选显示下列的任何一或多项：降低握力、倾向于比野生型鼠饮水更多、对疼痛的敏感性降低(痛觉减退)、紧张降低、血浆皮质酮水平降低。

在非常优选的实施方案，转基因的TrpM8动物，特别是TrpM8敲除动物，显示与相应的野生型小鼠相比测量参数高或低(视情况而定)至少10％，优选至少20％，更优选至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、或100％。因此例如，在TrpM8敲除动物，对实施例中所陈述的甩尾试验应答的痛觉阈值比野生型小鼠增加长1秒、2秒、5秒、10秒、30秒以上，或增加5％、10％、20％、50％以上。当在实施例所陈述的开放区域分析中测量时，TrpM8缺陷的小鼠优选比野生型小鼠的中心区域的持续时间长3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20秒以上，或在中心区域的移动距离增加15、20、25、30、50cm以上。

显然对于TrpM8缺陷的转基因动物现在公开的表型可效用于使用野生型动物的筛选中，来检测引起类似的TrpM8功能损失作用的化合物。换言之，野生型动物可接触候选化合物，并观察到相关的TrpM8表型的变化，例如痛觉减退、对疼痛的敏感性降低、紧张水平下降、皮质酮水平降低等，以鉴定TrpM8功能的调节剂，特别是拮抗剂。也可利用在本文中其他部分确定的方法来检测细胞的表型，例如电导的下降或胞内钙水平的下降。

通过这种筛选鉴定的化合物能被用作TrpM8的拮抗剂，例如用作止痛剂或紧张缓和剂，特别用于治疗或减轻TrpM8相关的疾病。

如上所述的筛选可包括观察任何适当的参数，例如行为的、生理的或生化的反应。优选的反应包括生理的反应并且可包括下列的一或多项：抗病力的变化；改变的炎性症反应；改变的肿瘤易感性：血压的变化；新血管形成；饮食行为的变化；体重的变化；骨密度的变化；体温的变化；胰岛素分泌；促性腺激素分泌；鼻和支气管的分泌物；血管收缩；记忆丧失；焦虑；改变的焦虑状态；反射减退或反射亢进；疼痛或紧张反应。

也可使用生化参数，例如电导或胞内钙浓度的变化。优选，利用“TrpM8的功能性测定(电导)”测量电导，利用“TrpM8的功能性测定(钙浓度)”测量胞内的钙浓度。这对基于细胞的筛选特别有用。

在优选的实施方案中，接触TrpM8激动剂的细胞(例如野生型或功能部分损失的细胞)的电导增加至少10％，优选至少20％，更优选至少+30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％。在优选的实施方案中，这利用在本文其他部分描述的“TrpM8的功能性测定(电导)”来测量。

在优选的实施方案中，接触TrpM8激动剂的细胞(例如野生型或功能部分损失的细胞)的胞内钙浓度增加至少10％，优选至少20％，更优选至少+30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％。在优选的实施方案中，这利用在本文其他部分描述的“TrpM8的功能性测定(胞内的钙浓度)”来测量。

在优选的实施方案中，接触TrpM8激动剂的野生型或TrpM8部分敲除动物的皮质酮水平增加至少10％，优选至少20％，更优选至少+30％，更优选至少40％，更优选至少50％，更优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％。

在优选的实施方案中，TrpM8的拮抗剂使得接触这种拮抗剂的野生型或功能部分损失的动物显示出与TrpM8的功能部分或完全损失的突变株在至少部分程度上的表型的至少部分同一性。也就是说，优选的拮抗剂是导致痛觉减退、或紧张下降、血清皮质酮水平降低、或电导下降、或胞内钙水平下降、或上述任何组合的拮抗剂。优选，相关表型以与TrpM8敲除动物相同的程度来表达。

在优选的实施方案中，接触TrpM8拮抗剂的野生型或功能部分损失的细胞的电导是在TrpM8缺陷细胞的电导的+80％范围内，优选在+70％内，更优选在+60％内，更优选在+50％内，更优选在+40％内，更优选在+30％内，更优选在+20％内，更优选在+10％内，更优选在+5％内。在优选的实施方案中，这利用在本文其他部分描述的“TrpM8的功能性测定(电导)”来测量。

在优选的实施方案中，接触TrpM8拮抗剂的野生型或功能部分损失的细胞的胞内钙浓度是在TrpM8缺陷细胞的胞内钙浓度的+80％范围内，优选在+70％内，更优选在+60％内，更优选在+50％内，更优选在+40％内，更优选在+30％内，更优选在+20％内，更优选在+10％内，更优选在+5％内。在优选的实施方案中，这利用在本文其他部分描述的“TrpM8的功能性测定(胞内的钙浓度)”来测量。

在优选的实施方案中，接触TrpM8拮抗剂的野生型或部分TrpM8敲除的动物的皮质酮水平是在TrpM8缺陷的转基因动物的皮质酮水平的+80％范围内，优选在+70％内，更优选在+60％内，更优选在+50％内，更优选在+40％内，更优选在+30％内，更优选在+20％内，更优选在+10％内，更优选在+5％内。

来源于TrpM8敲除动物的组织可用于结合测定，来确定潜在的药物(候选配体或化合物)是否结合TrpM8。这种测定可通过从改造成为TrpM8离子通道制备缺陷的转基因动物获得第一离子通道的制品，和从已知结合任何鉴定的TrpM8配体或化合物的来源获得第二离子通道制品来进行。通常，第一和第二离子通道制品除其获得来源外，在所有方面都是相似的。例如，如果在测定中使用来自转基因动物的脑组织(例如如上下文所述)，那么来自正常(野生型)动物的可比较脑组织被用作第二离子通道制品的来源。每份离子通道制品与已知结合TrpM8离子通道的配体一起，在单独和在存在候选配体或化合物时温育。优选，该候选配体或化合物在若干不同浓度检验。

对于第一和第二离子通道制品测定对由被试化合物替代已知配体的结合的程度。来源于转基因动物的组织可直接用于测定，或该组织可被加工以分离其本身用于测定的膜或膜蛋白。优选的转基因动物是小鼠。配体可利用与结合测定相适合的任何方法来标记。这包括但不限于，放射性的、酶促的、荧光的或化学发光的标记(以及如上更详细描述的其他标记技术)。

此外，对TrpM8离子通道的拮抗剂的鉴定可通过将候选化合物等施用于表达功能性TrpM8的野生型动物，和经鉴定显示与TrpM8功能表达减少或消除相关的任何表型特征的动物。

用于制备非人类转基因动物的详细方法在下文中更详细地描述。转基因的基因构建体可被导入动物的生殖系以产生转基因的哺乳动物。例如，一个或几个拷贝的构建体可通过标准的转基因方法被整合进入哺乳动物胚胎的基因组。

在例证性的实施方案中，转基因的非人类动物通过将转基因导入非人类动物的生殖系而产生。在不同发育阶段的胚胎靶细胞可用于导入转基因。根据胚胎靶细胞的发育阶段使用不同的方法。选择任何动物的特定系需要全身健康良好、好的胚胎产率、好的胚胎中前核(pronuclear)可见度、和好的繁殖适合度。另外，单体型是重要的因素。

转基因导入胚胎可通过本领域已知的任何方法来实现，例如，显微注射、电穿孔、或脂质转染。例如，可通过将构建体显微注射到哺乳动物受精卵的前核中而将TrpM8转基因导入哺乳动物，从而导致一个或多个拷贝的构建体保持在发育中的哺乳动物的细胞中。将转基因构建体导入受精卵后，该卵可在体外培养不同长度的时间，或再植入代孕宿主，或两者皆进行。也可进行体外培养至成熟。通常方法是根据物种在体外培养胚胎大约1-7天，然后将其再植入代孕宿主。

可通过Southern印迹分析组织片段来测试转基因操作的胚胎后代中该构建体的存在。如果一个或多个拷贝的外源克隆构建体保持稳定地整合到这种转基因胚胎的基因组中，则有可能建立携带转基因加入的构建体的持久的转基因哺乳动物系。

可在转基因改变的哺乳动物的窝崽出生后分析测定该构建体向后代基因组中的掺入。优选，这个测定通过使对应于编码所需重组蛋白质产品的DNA序列或其节段的探针杂交到来自后代的染色体物质上来实现。被发现在其基因组中包含构建体的至少一个拷贝的那些哺乳动物的后代逐渐生长成熟。

为了本文的目的，受精卵基本上是形成的能够发育成为完全生物体的二倍体细胞。通常，受精卵由包含天然或人工成形的核，通过来自一或多个配子的两个单倍体的核的融合而组成。因此，配子的核必须是天然相容的，即产生能够经历分化和发育成为游功能生物体的有存活力的受精卵。通常，整倍体的受精卵是优选的。如果获得非整倍体的受精卵，则就两个配子所来源的生物体的整倍体数目而论，染色体的数目将不会变化超过1个。

除相似的生物学因素之外，物理因素也控制可加入受精卵的核或组成受精卵核的部分的遗传物质的外源遗传物质的数量(例如，体积)。如果不移出遗传物质，则可加入的外源遗传物质的数量受到如果不被物理破坏也会被吸收的数量的限制。通常，插入的外源遗传物质的体积不会超过大约10皮升。加入的物理效应不必太大以物理破坏该受精卵的存活力。DNA序列的数目和种类的生物学限制将根据特定的受精卵和外源遗传物质的功能而变化，并且对本领域技术人员是显而易见的，因为所得到的受精卵的遗传物质，包括外源遗传物质，必须在生物学上能够起始并维持该受精卵分化发育成为有功能的生物体。

加入受精卵的转基因构建体的拷贝数目取决于加入的外源遗传物质的总数，并且将是能够使遗传转化发生的数量。理论上只有一个拷贝是必要的；然而，通常使用许多拷贝，例如1,000-20,000个拷贝的转基因构建体，以确保一个拷贝是有功能的。经常有利的是每一插入的外源DNA序列具有一个以上功能拷贝来增强外源DNA序列的表型表达。

可利用容许外源遗传物质加入核遗传物质的任何方法，只要其对细胞、核膜或其他存在的细胞或遗传结构不是有害的。外源的遗传物质优选通过显微注射插入核遗传物质。细胞和细胞结构的显微注射是本领域已知和常用的。

再植入术利用标准的方法完成。通常，麻醉代孕宿主，并将胚胎置于输卵管。植入特定宿主的胚胎的数目将根据物种而变化，但通常比得上该物种天然产生后代的数目。

可通过任何合适的方法筛选代孕宿主的转基因后代中该转基因的存在和/或表达。筛选经常通过Southern印迹或Northern印迹分析，利用与转基因的至少部分互补的探针来完成。利用抗由转基因编码的蛋白质的抗体的Western印迹分析可用作筛选该转基因产物存在的任选或附加方法。通常地，DNA从尾部组织制备并通过Southern分析或转基因的PCR来分析。可选，利用Southern分析或PCR来测试被认为以最高水平表达该转基因的组织或细胞中该转基因的存在和表达，尽管任何组织或细胞类型可用于此分析。

用于评估转基因存在的任选或附加的方法包括但不限于，合适的生物化学测定，例如酶和/或免疫学测定、特定标记物或酶活性的组织染色、流式细胞分析等。血液的分析也可用于检测血液中转基因产物的存在，以及用于评估该转基因对各种类型的血细胞及其他血液成分的水平的影响。

转基因动物的后代可通过使转基因动物与合适的配偶交配，或通过从转基因动物获得的卵子和/或精子的体外受精来获得。在要与伴侣进行交配时，该伴侣可能或可能不是转基因的和/或敲除的动物；当其是转基因的动物，可包含相同或不同的转基因，或两者皆有。可选，伴侣可以是亲本品系。当使用体外受精时，受精的胚胎可被植入代孕宿主或体外培养，或两者皆有。使用任何方法，可使用如上所述的方法，或其他适当的方法来评估后代中转基因的存在。

根据这里描述的方法产生的转基因动物将包括外源的遗传物质。如上所述，在某些实施方案中，外源的遗传物质是会制备出TrpM8离子通道的DNA序列。进一步地，在这种实施方案中，该序列将附着于转录控制元件，例如优选容许该转基因产物在特定的细胞类型中表达的启动子。

逆转录病毒感染也可用于将转基因导入非人类动物。发育中的非人类胚胎可体外培养至胚泡阶段。在这个时候，卵裂球可以是逆转录病毒感染的靶标(Jaenich，R.(1976)PNAS 73：1260-1264)。对卵裂球的有效感染可通过酶促处理以除去透明带而获得(Manipulating the Mouse Embryo，Hogan eds.(Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，1986)。用于导入转基因的病毒载体系统通常是携带转基因的复制缺陷的逆转录病毒(Jahner etal.(1985)PNAS82：6927-6931；Van der Putten et al.(1985)PNAS82：6148-6152)。转染通过在产生病毒的单层细胞上培养卵裂球而容易且有效地实现(Van der Putten，supra；Stewart et al.(1987)EMBO J.6：383-388)。可选，感染可在稍后的阶段进行。病毒或产生病毒的细胞可被注射进入囊胚腔(Jahner et al.(1982)Nature 298：623-628)。大部分建立物(founder)将是转基因的嵌合体，因为掺入只在形成转基因非人类动物的细胞亚组(subset)中发生。进一步地，该建立物可在通常于后代中分离的基因组的不同位置包含转基因的若干逆转录病毒插入物。另外，也可能将转基因通过怀孕中(midgestation)胚胎的子宫内逆转录感染而导入生殖系(Jahner et al.(1982)同上)。

用于转基因导入的第三类靶细胞是胚胎的干细胞(ES)。ES细胞是从体外培养并与胚胎混合的预先植入的胚胎获得的(Evans et al.(1981)Nature292：154-156；Bradley et al.(1984)Nature 309：255-258；Gossler et al.(1986)PNAS83：9065-9069；and Robertson et al.(1986)Nature 322：445-448)。转基因可通过DNA转染或通过逆转录病毒-介导的转导而被有效地导入ES细胞。这样转化的ES细胞之后可与来自非人类动物的胚泡结合。之后该ES细胞定位于胚胎并影响(contribute)所得嵌合动物的生殖系。综述参见Jaenisch，R.(1988)Science 240：1468-1474。

我们也提供非人类的转基因动物，其中该转基因动物的特点在于具有改变的TrpM8基因，优选如上所述，作为TrpM8离子通道功能的模型。对该基因的改变包括缺失或其他的功能突变损失，导入具有靶向或随机突变的核苷酸序列的外源基因，导入来自另一物种的外源基因，或其组合。该转基因动物对于该变化可以是纯合的或杂合的。由此衍生的动物和细胞对筛选可调节TrpM8离子通道功能的生物活性剂是有用的。该筛选法特别用于测定疼痛和癌症，特别是前列腺癌的潜在疗法的特异性和作用。该动物用作研究TrpM8离子通道在正常组织和器官，例如脑、心脏、脾和肝中的作用，及对其功能的影响的模型。

另一个方面为具有功能性破损的内源TrpM8基因，但也在其基因组中携带，并且表达编码异源TrpM8蛋白质的转基因(即，来自另一个物种的TrpM8)的转基因非人类动物。优选，该动物是小鼠，异源的TrpM8是人TrpM8。可用已经用人TrpM8重建的动物、或来源于这种动物的细胞系来鉴定体内和体外抑制人TrpM8的试剂。例如，可在被试试剂存在和缺乏时，将通过人TrpM8诱导信号传导的刺激施用于动物或细胞系，并且可测量动物或细胞系中的反应。体内或体外抑制人TrpM8的试剂可根据在存在该试剂时，与缺乏该试剂时的反应相比，反应降低而被鉴定出来。

我们也提供TrpM8缺陷的转基因非人类动物(“TrpM8亚基敲除动物”)。这种动物是TrpM8离子通道活性表达降低或没有的的动物，优选是内源TrpM8离子通道基因组序列被破坏或缺失的结果。优选，这种动物没有表达离子通道活性。更优选，该动物没有表达如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示的TrpM8离子通道的活性。TrpM8离子通道敲除动物可通过本领域已知的各种方法来制备，如下文更多细节所述。

本公开的内容也包括功能性破坏宿主细胞中TrpM8基因的核酸构建体。该核酸构建体包含：a)非同源的置换部分；b)位于非同源置换部分上游的第一同源区，该第一同源区具有与第一TrpM8基因序列基本同一的核苷酸序列，和c)位于非同源置换部分下游的第二同源区，该第二同源区具有与第二TrpM8基因序列基本同一的核苷酸序列，该第二TrpM8基因序列具有位于天然存在的内源TrpM8基因中第一TrpM8基因序列下游的位置。另外，当该核酸分子被导入宿主细胞时，第一和第二同源区具有在宿主细胞中于核酸构建体和内源TrpM8基因之间进行同源重组的足够长度。在优选的实施方案中，非同源的置换部分包含表达报告子，优选包括lacZ和阳性选择表达盒，优选包括与调节元件可操作连接的新霉素磷酸转移酶基因。

优选，所述第一和第二TrpM8基因序列来源于SEQ ID No.1、SEQ ID No.2或SEQ ID NO：4、或其同源物、变体或衍生物。

另一个方面包括已经掺入如上所述的核酸构建体的重组载体。另一方面包括已经被导入核酸构建体的宿主细胞，从而在该核酸构建体和宿主细胞的内源TrpM8基因之间容许同源重组，导致内源TrpM8基因的功能破损。该宿主细胞可以是正常表达来自肝、脑、脾或心脏、或多能细胞，例如小鼠胚胎干细胞的TrpM8的哺乳动物细胞。已经导入核酸构建体并与内源TrpM8基因的同源重组的胚胎干细胞的进一步发育，产生了具有从胚胎干细胞传代并因此在其基因组中携带TrpM8基因的破损的细胞的转基因非人类动物。因此可选择在其生殖系中携带TrpM8基因破损的动物，并且使其繁殖以制备在全部体细胞和生殖细胞中具有TrpM8基因破损的动物。这种小鼠因此可被繁殖成TrpM8基因破损的纯合体。

抗体

为了本文的目的，除非特别说明，术语“抗体”包括但不限于，通过多克隆、单克隆、嵌合、单链、Fab片段和由Fab表达文库制备的片段。这些片段包括保持对靶物质的结合活性的完整抗体的片段、Fv、F(ab′)和F(ab′)₂片段，以及单链抗体(scFv)、融合蛋白质及其他包括该抗体的抗原结合位点的合成蛋白。抗体及其片段可以是人源化抗体，例如如EP-A-239400所述。此外，也可使用具有完全人可变区(或其片段)的抗体，如美国专利号5,545,807和6,075,181所述。中和抗体，即抑制所述物质氨基酸序列的生物活性的抗体，特别优选用于诊断和治疗。

抗体可通过标准技术，如通过免疫接种或使用噬菌体展示文库来制备。

可通过已知技术用多肽或肽来开发抗体。这种抗体能够特异结合TrpM8离子通道蛋白质或同源物、片段等。

如果需要多克隆的抗体，选择的哺乳动物(例如，小鼠、兔、山羊、马等)可用包含相关多肽或肽的免疫原组合物免疫接种。根据宿主物种，各种佐剂可用来提高免疫反应。这种佐剂包括但不限于，弗氏的、矿物盐凝胶例如氢氧化铝、和表面活性物质例如溶血卵磷脂、聚醚多羟基化合物(pluronic polyol)，聚阴离子，肽，油乳液，匙孔血蓝蛋白(keyhole limpethemocyanin)和二硝基酚。BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum)是可能有用的人类佐剂，如果将所述物质氨基酸序列施用到免疫受损(compromised)的个体以刺激系统防御时可使用所述佐剂。

收集来自免疫接种动物的血清并根据已知的方法处理。如果包含抗得自TrpM8多肽的表位的多克隆抗体的血清包含抗其他抗原的抗体，则该多克隆的抗体可通过免疫亲合层析来纯化。用于制备和加工多克隆抗血清的技术是本领域已知的。为了可以制备这种抗体，我们也提供TrpM8的氨基酸序列或其片段，其对用作动物或人的免疫原的其它氨基酸序列是半抗原化的(haptenised)。

直接抗得自TrpM8多肽或肽的表位的单克隆抗体也可由本领域技术人员轻易制备。通过杂交瘤来制备单克隆抗体的常用方法是众所周知的。产生抗体的无限增殖细胞系可通过细胞融合建立，也通过其他方法，例如用致癌DNA直接转化B淋巴细胞，或用Epstein-Barr病毒转染来建立。可筛选针对眼眶(orbit)表位制备的单克隆抗体组的各种性质；即同种型和表位的亲合力。

单克隆抗体可通过任何可通过连续细胞系培养制备抗体分子的技术来制备。这些包括但不限于，最初由Koehler和Milstein(1975 Nature 256：495-497)描述的杂交瘤技术、trioma技术、人B细胞杂交瘤技术(Kosbor etal(1983)Immunol Today 4：72；Cote et al(1983)Proc Natl Acad Sci 80：2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole et al.，Monoclonal Sntibodies and CancerTherapy，pp.77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。

此外，可使用为制备“嵌合抗体”发展的技术，如将小鼠抗体基因与人抗体基因进行拼接以获得具有适宜抗原特异性和生物活性的分子的技术(Morrison et al(1984)Proc Natl Acad Sci 81：6851-6855；Neuberger et al(1984)Nature 312：604-608；Takeda et al(1985)Nature 314：452-454)。可选，为制备单链抗体(美国专利号4,946,779)所描述的技术可适合于制备物质特异性的单链抗体。

针对获自TrpM8多肽或肽表位的单克隆和多克隆抗体，对于诊断是特别有用的，而中和抗体对被动免疫疗法有用。单克隆抗体，特别可用来激发抗独特型抗体。抗独特型抗体是携带物质的“内部图像”和/或需要防止其攻击的试剂的免疫球蛋白。用于激发抗独特型抗体的技术是本领域已知的。这些抗独特型抗体也可用于治疗。

抗体也可通过在淋巴细胞群中诱导体内产生或通过筛选重组免疫球蛋白文库或全部高度特异的结合试剂来制备，如Orlandi et al(1989，Proc NatlAcad Sci 86：3833-3837)，和Winter G and Milstein C(1991；Nature 349：293-299)所述。

也可制备包含多肽或肽的特异结合部位的抗体片段。例如，这种片段包括但不限于，能通过胃蛋白酶消化抗体分子而制备的F(ab′)₂片段，和能通过还原F(ab′)₂片段的二硫键而制备的Fab片段。可选，可构建Fab表达文库来容许快速和容易地鉴定具有所需要特异性的单克隆Fab片段(HuseWD et a1(1989)Science 256：1275-1281)。

用于生产单链抗体(美国专利号4,946,778)的技术还可适合于制备TrpM8多肽的单链抗体。转基因的小鼠、或其他生物体包括其他哺乳动物也可用来表达人源化的抗体。

上述抗体可用来分离或鉴定表达该多肽的克隆或通过亲合层析纯化该多肽。

针对TrpM8离子通道多肽的抗体也可用来治疗疼痛和癌症，特别是神经性疼痛和前列腺癌。

诊断分析

本公开的内容也涉及利用TrpM8离子通道多核苷酸和多肽(以及其同源物、变体和衍生物)作为诊断剂用于诊断或遗传分析。与TrpM8离子通道核酸(包括同源物、变体和衍生物)互补或能够与其杂交的核酸，以及抗TrpM8多肽的抗体也对这种测定有用。

与机能障碍相关的突变形式的TrpM8离子通道基因的检测，将提供能够加入或限定对由于TrpM8离子通道表达不足、表达过度或表达改变所引起的疾病或疾病易感性的诊断的诊断工具。携带TrpM8离子通道基因(包括控制序列)突变的个体可通过多种技术在DNA水平予以检测。

例如，可从患者分离DNA并确定TrpM8的DNA多态性模式。将鉴定的模式与已知患有TrpM8过度、不足或异常表达相关疾病的患者对照作比较。然后可鉴定表达与TrpM8相关疾病相关的遗传多态性模式的患者。TrpM8离子通道基因的遗传分析可通过本领域已知的任何技术进行。例如，可通过RFLP或SNP分析等，测定TrpM8等位基因的DNA序列来筛选个体。可通过检测TrpM8的基因序列或控制其表达的任何序列中DNA多态性的存在，来鉴定患者具有与TrpM8过度、不足或异常表达相关的疾病的遗传易感性。

因此可治疗如此鉴定的患者以预防TrpM8相关疾病的发生，或在TrpM8相关疾病的早期更积极地阻止该疾病的进一步发生或发展。TrpM8相关疾病包括紧张、焦虑、抑郁、疼痛和癌症，特别是神经病变疼痛和前列腺癌。

我们进一步公开用于鉴定患者与TrpM8相关疾病相关的遗传多态性模式的试剂盒。该试剂盒包括DNA取样工具和测定遗传多态性模式的工具，然后将其与对照样品相比较以测定患者对TrpM8相关疾病的易感性。也提供用于诊断TrpM8相关疾病、包含TrpM8多肽和/或抗此种多肽的抗体(或其片段)的试剂盒。

用于诊断的核酸可从受试者的细胞，例如从血液、尿、唾液、组织活检或尸检材料获得。在优选的实施方案中，该DNA从扎患者的手指并用吸水纸收集的血液的血细胞获得。在进一步优选的实施方案中，血液将在AmpliCard.TM.(University of Sheffield，Department of Medicine andPharmacology，Royal Hallamshire Hospital，Sheffield，England S10 2JF)上收集。

DNA可直接用于检测或可在分析前利用PCR或其他扩增技术来酶促扩增。可制备靶向感兴趣基因内特异多态性DNA区域的寡核苷酸DNA引物，以使得在PCR反应中实现靶序列的扩增。RNA或cDNA也可以相似的方式用作模板。然后扩增自模板DNA的DNA序列可利用限制酶分析，以测定存在于扩增序列中的遗传多态性，由此提供该患者的遗传多态性模式。限制片段长度可通过凝胶分析鉴定。可选或联合，可使用例如SNP(单核苷酸多态性)分析的技术。

缺失和插入可通过扩增产物相对于正常基因型的大小变化而被检测。点突变可通过将扩增的DNA与标记的TrpM8离子通道核苷酸序列杂交而被鉴定出来。完全匹配的序列可通过RNase消化或解链温度差异而不同于错配的双链体。DNA序列差异也可通过DNA片段在凝胶中的电泳迁移率变化、有或没有变性剂、或通过直接的DNA测序而检测。参见例如，Myers etal，Science(1985)230：1242。在特定位置的序列变化也可通过核酸酶保护测定，例如RNAse和S1保护或化学切割法来显示。参见Cotton et a1.，Proc NatlAcad Sci USA (1985)85：4397-4401。在另一个实施方案中，可构建包含TrpM8离子通道核苷酸序列或其片段的寡核苷酸探针阵列来进行例如，遗传突变的有效筛选。阵列技术方法是已知的，具有广泛的适用性，并且可针对分子遗传学，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异中的多种问题。(参见例如：M.Chee et a1.，Science，Vol 274，pp610-613(1996))。

单链构象多态性(SSCP)可用于检测突变体和野生型核酸之间电泳迁移率的差异(Orita et al.(1989)Proc Natl.Acad. Sci USA：86：2766，也参见Cotton(1993)Mutat Res 285：125-144；and Hayashi(1992)Genet Anal Tech Appl9：73-79)。样品的单链DNA片段和对照的TrpM8核酸可被变性并使其复性。单链核酸的二级结构根据序列而变化，所得到的电泳迁移率变化可检测甚至单个碱基的变化。DNA片段可被标记或用标记探针检测。分析的灵敏度可通过使用RNA(而不是DNA)来提高，其中二级结构对序列的变化更灵敏。在优选的实施方案中，目标方法使用异源双链分析来根据电泳迁移率的变化分离双链的异源双链分子(Keen et al.(1991)Trends Genet 7：5)。

诊断分析提供了通过所述方法检测TrpM8基因的突变来诊断或测定对感染，例如疼痛和癌症，特别是神经病变疼痛和前列腺癌的易感性的方法。

TrpM8多肽和核酸的存在可在样品中被检测到。因此，如上列出的感染和疾病可通过如下方法来诊断，该方法包括在来源于受试者的样品中确定TrpM8多肽或TrpM8离子通道mRNA的异常下降或上升的水平。该样品可包含细胞或组织样品，其来自患有或疑似患有与TrpM8表达增加、减少或其他异常(包括表达水平或模式在空间或时间上的改变)相关的疾病的生物体。作为诊断疾病的方法，患有或疑似患有此疾病的生物体中TrpM8表达的水平或模式可以有效地与正常生物体中表达的水平或模式进行比较。

因此通常，我们公开了检测样品中包含TrpM8核酸的核酸存在的方法，该方法是通过将样品接触对所述核酸特异的至少一种核酸探针，并且监测所述样品中该核酸的存在。例如，该核酸探针可特异结合TrpM8亚基核酸，或其部分，并且检测两个之间的结合，也可检测该复合物自身的存在。此外，我们包括了检测TrpM8多肽存在的方法，该方法是通过将细胞样品接触能够结合该多肽的抗体，并且监测所述样品中该多肽的存在。这可通过监测在抗体和多肽之间形成的复合物的存在，或监测多肽和抗体之间的结合而便利地实现。检测两个实体之间结合的方法是本领域已知的，它包括FRET(荧光共振能量转移)，表面等离振子共振等。

减少或增加的表达可利用本领域公知用于定量多核苷酸的任何方法，例如PCR、RT-PCR、RNAse保护、Northern印迹及其他杂交方法在RNA水平被试量出来。可用于测定在来源于宿主的样品中的蛋白质，例如TrpM8的水平的分析技术是本领域技术人员公知的。这种测定法包括放射免疫测定、竞争性结合测定、Western印迹分析和ELISA测定。

我们进一步公开了针对疾病或对疾病(包括感染)，例如疼痛和癌症，特别是神经病变疼痛和前列腺癌的易感性的诊断试剂盒。该诊断试剂盒包含TrpM8多核苷酸或其片段；互补的核苷酸序列；TrpM8多肽或其片段、或TrpM8多肽的抗体。

染色体测定

这里描述的核苷酸序列也对染色体鉴定很有价值。该序列特异地靶向单独的人染色体上的特定位置并且可与其杂交。如上所述，人TrpM8离子通道被作图发现存在于人染色体2q37。

将相关序列在染色体上作图是使那些序列与疾病相关基因相关联的重要的第一步。一旦序列已经被作图至精确的染色体位置，该序列在染色体上的物理位置就与遗传图谱数据相关联了。这种数据例如发现在V.McKusick，Mendelian heritance in Man(通过Johns Hopkins University WelchMedical Library在线获得)中。然后已经被作图至相同染色体区域的基因和疾病之间的关系通过连锁分析(共同继承的物理上的邻近基因)来鉴定。

也可测定受影响的和未受影响的个体之间cDNA或基因组序列的差异。如果在一些或全部受影响的个体，而不是在任何正常的个体中观察到突变，则该突变可能是疾病的致病因素。

预防性和治疗性方法

我们进一步提供治疗与离子通道活性过量和不足量相关的异常状况的方法。

如果TrpM8离子通道的活性过量，可利用几种方法。一种方法包括给受试者以有效抑制活化的量与药物学上可接受的载体一起施用如上文描述的抑制剂化合物(拮抗剂)，它抑制活化是通过阻断配体与TrpM8离子通道的结合，或通过抑制第二信号，由此减轻异常状况。

在另一种方法中，可施用仍然能够与内源TrpM8离子通道竞争结合配体的可溶形式的TrpM8多肽。这种竞争剂的典型实施方案包含TrpM8多肽的片段。

在另一种方法中，该编码内源TrpM8离子通道的基因的表达可用表达阻断技术来抑制。已知这种技术包括以内部产生或分开给药的方式使用反义序列。参见例如，O′Connor，JNeurochem(1991)56：560 inOligodeoxvnucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，Fla.(1988)。可选，可提供与基因形成三链螺旋的寡核苷酸。参见例如，Lee et al.，Nucleic Acids Res(1979)6：3073；Cooney et al.，Science(1988)241：456；Dervan et al.，Science(1991)251：1360。这些寡聚体可按原样给药或相关寡聚物可在体内表达。

为了治疗与TrpM8离子通道表达不足及其活性相关的异常状况，也可使用几种方法。一种方法包括对受试者施用与药物学上可接受的载体联用的活化TrpM8离子通道的治疗有效量的化合物，即如上所述的激动剂，由此减轻该异常状况。可选，可用基因治疗来通过受试者中的相关细胞影响TrpM8离子通道的内源产生。例如，可改造TrpM8多核苷酸来如上所讨论，在复制缺陷的逆转录病毒载体中进行表达。该逆转录病毒表达构建体可被分离并且被导入用包含编码TrpM8多肽的RNA的逆转录病毒质粒载体转导的包装细胞，以使得该包装细胞现在能制备包含感兴趣基因的感染性病毒颗粒。可将这些制备细胞施用于受试者用于体内改造细胞并在体内表达多肽。基因治疗的综述参见Chapter 20，Gene Therapy and other MolecularGenetic-based Therapeutic Approaches，(和其中引用的参考文献)in HumanMolecular Genetics，T Strachan and A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)。

配制剂和施用

肽，例如可溶形式的TrpM8离子通道多肽，和激动剂和拮抗剂肽或小分子，可与合适的药物载体组合配制。这种配制剂包含治疗有效量的多肽或化合物，和可药用的载体或赋形剂。这种载体包括但不限于，盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。配制剂应适合施用的方式，并且是本领域技术人员已知的。本公开的内容进一步涉及包含充满上述组合物的一或多种成分的一或多个容器的药物包装和试剂盒。

TrpM8多肽及其他化合物可单独使用或与其他化合物，例如治疗性化合物联用。

全身施用药物组合物的优选形式包括注射，通常通过静脉内注射。也可使用其他注射途径，例如皮下、肌内、或腹膜内。用于全身施用的可选方式包括利用渗透剂，例如胆盐或梭霉孢酸或其他去污剂的转化粘液质的和经皮的施用。另外，如果适当配制为肠溶或包囊化的配制剂，口服也可以。这些化合物也可经局部(topical)和/或局部化(localize)，以药膏(salve)，膏剂(paste)，凝胶等形式来施用。

所需剂量范围取决于所选的肽，施用途径，配制剂性质，以及受试者疾病的性质，以及主治医师判断。适宜的剂量为0.1-100ug/kg受试者。预期所需剂量范围可变化较大，这是由于可获得各种化合物并且各种施用途径的效率不同。例如预期口服给药需要的剂量高于静脉内注射。这些剂量水平的差异可利用优化的标准经验途径来调节，这也是本领域已知的。

用于治疗的多肽还可在受试者中，以经常被称为如上所述的“基因治疗”的治疗形态来内源产生。因此例如，来自受试者的细胞可用多核苷酸，例如DNA或RNA进行改造，以及例如利用逆转录病毒质粒载体，来在离体条件下编码多肽。然后该细胞被导入受试者。

药物组合物

我们进一步公开药物组合物，包括施用治疗有效量的TrpM8多肽、多核苷酸、肽、载体或其抗体，以及可选的可药用的载体、稀释剂或赋形剂(包括其组合)。

药物组合物可以在人类医学和兽医学中用于人或动物，其通常包含任何一或多种可药用的稀释剂、载体、或赋形剂。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂是药物领域公知的，在例如Remington′s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)中有描述。可选的药物载体、赋形剂或稀释剂可考虑施用途径和标准药物实践来选择。该药物组合物可包含-或除载体、赋形剂或稀释剂之外，任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包被剂(coating agent)、增溶剂。

可在药物组合物中提供防腐剂、稳定剂、染料以及甚至调味剂。防腐剂的实例包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟苯甲酸的酯。也可使用抗氧化剂和悬浮剂。

根据不同的递送系统可能有不同的组合物/配制剂需求。举例来说，这里描述的药物组合物可被配制为利用微型泵(mini-pump)或通过粘膜途径递送，例如作为喷鼻剂或吸入气雾剂或可摄取的溶液、或肠胃外地递送，其中该组合物配制为可注射的形式，通过例如静脉内的、肌内的或皮下的途径来递送。可选，该配制剂可设计成通过两个途径进行递送。

当该试剂通过胃肠粘膜经粘膜递送时，它将能在通过胃肠道期间保持稳定；例如，它将能抵抗蛋白水解的降解作用，在酸性pH稳定，并且抵抗胆汁的清洁作用。

适当时，该药物组合物可通过如下方式施用：经吸入，以栓剂或阴道栓剂(pessary)的形式，以洗液、溶液、乳膏、油膏或细粉(dusting powder)的形式，通过利用贴皮剂(skin patch)，以含有赋形剂诸如淀粉或乳糖的片剂形式口服，或在胶囊或卵形囊(ovule)中单独或与赋形剂一起，或以含有调味或着色剂的的酏剂、溶液或混悬液的形式，或经胃肠外诸如，例如经静脉内，肌肉内或皮下注射。对于肠胃外给药，该组合物最好用于无菌水溶液的形式，其可包含其他的物质，例如足够的盐或单糖以使得该溶液与血液等渗。对于颊部或舌下的施用，该组合物可以用传统方式配制的片剂或锭剂的形式施用。

疫苗

另一个实施方案涉及在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包括用足够产生抗体和/或T细胞免疫反应的TrpM8离子通道多肽或其片段接种哺乳动物，以保护所述的动物免于焦虑、紧张、抑郁、疼痛和癌症，特别是前列腺癌。

另一实施方案涉及在哺乳动物中诱导免疫反应的方法，其包括借助于指导TrpM8多核苷酸体内表达的载体来递送TrpM8多肽，从而诱导免疫反应来产生保护所述动物免于疾病的抗体。

进一步的实施方案涉及免疫/疫苗配制剂(组合物)，当被导入哺乳动物宿主时，在该哺乳动物中诱导针对TrpM8多肽的免疫反应，其中该组合物包含TrpM8多肽或TrpM8基因。该疫苗配制剂可进一步包含合适的载体。

既然TrpM8多肽可在胃中分解，优选通过肠胃外(包括皮下的，肌内的、静脉内的、皮内等注射)施用该TrpM8多肽。适于肠胃外给药的配制剂包括含水和无水的无菌注射液，其可包含抗-氧化剂、缓冲液、抑菌药和使得该配制剂与接受者的血液等渗的溶解物；以及可包括悬浮剂或增稠剂的含水和无水的无菌悬浮液。该配制剂可存在于单位剂量或多剂量容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可保存在冻干的条件下，只需要在使用前立即加入无菌的液体载体。疫苗配制剂也可包括用于增强该配制剂免疫原性的佐剂系统，例如水包油系统及本领域已知的其他系统。剂量将取决于疫苗的特异活性，并且可通过常规实验轻易地测定。

疫苗可从一个或多个TrpM8多肽或肽制备。

包含免疫原性多肽或肽作为活性成分的疫苗的制备是本领域技术人员已知的。通常，这种疫苗制备为可注射的液体溶液或悬浮液；也可制备适于在注射前溶解或悬浮在液体中的固体形式。该制剂也可被乳化，或者蛋白质被包裹在脂质体中。活性的免疫原性成分经常与可药用的并与该活性成分相适合的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如，水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、及其组合。

此外，如果需要，该疫苗可包含较少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、和/或增强疫苗有效性的佐剂。可能有效的佐剂的实例包括但不限于：氢氧化铝、N-乙酰基胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-去甲基-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11637，称为去甲基-MDP)、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)，和RIBI，其在2％角鲨烯/Tween 80乳液中包含自细菌提取的3个成分，单磷酸类脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨骼(MPL+TDM+CWS)。

佐剂及其他试剂的进一步实例包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、硫酸铍、硅石、高岭土、碳、油包水乳化液、水包油乳化剂、胞壁酰二肽、细菌内毒素、脂类X、粉刺丙酸杆菌(Propionobacterium acnes)、百日咳杆菌、多核糖核苷酸、海藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂苷、脂质体、左旋咪唑、DEAE-右旋糖酐、嵌段共聚物或其他的合成佐剂。这种佐剂可从各种来源商业获得，例如，Merck Adjuvant 65(Merck andCompany，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐剂和完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，Michigan)。

通常，使用例如Amphigen(水包油)、Alhydrogel(氢氧化铝)、或Amphigen和Alhydrogel的混合物的佐剂。只有氢氧化铝被批准用于人类。

免疫原和佐剂的比例可以在广泛的范围内变化，只要两者都以有效量存在。例如，氢氧化铝可占疫苗混合物(Al2O3基底)的大约0.5％的量。便利地，配制的疫苗包含终浓度为0.2至200μg/ml的范围，优选5至50μg/ml，最优选15μg/ml的免疫原。

配制后，该疫苗可被掺入随后被密封的无菌容器，并且于低温，例如4℃保存，或可冻干。冻干法容许以稳定的形式长期储存。

该疫苗便利地肠胃外施用，通过注射，例如皮下或肌内注射。适于其他施用方式的附加制剂包括栓剂，以及在一些情况下为口服制剂。对于栓剂，可包括传统的粘合剂和载体，例如，聚二醇或三酸甘油酯；这种栓剂可从含有0.5％至10％，优选1％至2％范围的活性成分的混合物形成。口服制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放的配制剂，或粉剂的形式，且包含10％至95％，优选25％至70％的活性成分。当疫苗组合物是冷冻干燥的，该冷冻干燥的材料可在施用前重建，例如为悬浮液。重新构成优选在缓冲液中起作用。

用于患者口服的胶囊剂、片剂和丸剂可有肠溶包衣，包括例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、醋酸纤维素酯、苯二甲酸醋酸纤维素酯或羟丙甲基纤维素酯。

TrpM8多肽可配制成为中性或盐形式的疫苗。可药用的盐包括酸加成的盐(与肽的游离氨基形成)和其与无机酸例如盐酸或磷酸、或有机酸例如乙酸、草酸、酒石酸和马来酸形成的盐。与游离羧基形成的盐也可来源于无机碱，例如氢氧化钠、钾、铵、钙、或铁，以及有机碱。例如异丙胺、三甲胺、2-乙胺基乙醇、组氨酸和普鲁卡因。

施用

一般地，医师会确定最适于个体受试者的实际剂量，其将随着具体患者的年龄、体重和反应而变化。下列剂量是平均情况的示例。当然存在其中较高或较低的剂量范围都是有益的个别情况。

这里描述的药物和疫苗组合物可通过直接注射来施用。所述组合物可配制用于肠胃外的、粘膜的、肌内的、静脉内的、皮下的、眼内的或经皮的施用。通常，每种蛋白质都可以0.01至30mg/kg体重，优选0.1至10mg/kg，更优选0.1至1mg/kg体重的剂量施用。

术语“施用”包括通过病毒或非病毒的技术递送。病毒的递送机制包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、和杆状病毒载体。非病毒的递送机制包括脂类介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染试剂(lipofectin)、阳离子表面的两性分子(CFAs)及其组合。这种递送机制所用的途径包括但不限于粘膜的、鼻的、口腔的、肠胃外的、胃肠的、局部的、或舌下的途径。

术语“施用”包括但是不限于通过粘膜的途径递送，例如作为喷鼻剂或气溶胶以便吸入)或可摄取的溶液；肠胃外的途径，其中通过可注射的形式(例如静脉内的、肌内的或皮下的途径)来递送。

术语“共同施用”是指施用例如TrpM8多肽和附加实体，例如佐剂中每一个的部位和时间使得可以实现对免疫系统的必要调节。因此，尽管多肽和佐剂可在相同时间及时地并在相同部位施用，以与佐剂不同的时间和不同的部位施用多肽可能是有利的。该多肽和佐剂甚至可以在相同的递送载体中递送，并且该多肽和抗原可偶联和/或未偶联和/或在遗传上偶联和/或未偶联。

TrpM8多肽、多核苷酸、肽；核苷酸、其抗体并可选佐剂，可以单剂量或以多剂量分别施用或共同施用到宿主受试者。

疫苗组合物和药物组合物可通过许多不同的途径施用，例如注射(其包括肠胃外的、皮下的和肌肉注射)鼻内的、粘膜的、口腔的、阴道内的、尿道的或眼部的施用。

这里描述的疫苗和药物组合物可按照常用方法，通过注射，皮下或肌内注射进行肠胃外施用。适合于其他施用方式的附加制剂包括栓剂，以及有时候的口服配制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；这种栓剂可由包含0.5％至10％，或可能是1％至2％范围的活性成分的混合物形成。口服配制剂包括通常使用的赋形剂，例如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采取液剂、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、持续释放的配制剂或粉剂的形式，并且包含10％至95％，优选25％至70％的活性成分。当疫苗组合物是冷冻干燥的，该冷冻干燥的材料可在施用前重建，例如作为悬浮液施用。重建优选受缓冲液的影响。

更多的方面

现在本发明的更多方面和实施方案在下文编号的段落中陈述；可理解本发明包括这些方面：

段落1.TrpM8多肽，其包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列，或其同源物、变体或衍生物。

段落2.编码段落1所述多肽的核酸。

段落3.段落2所述的核酸，包含SEQ ID NO.1、SEQ ID NO：2或SEQ IDNO：4所示的核酸序列，或其同源物、变体或衍生物。

段落4.包含段落1所述多肽的片段的多肽。

段落5.段落3所述的多肽，其包含在SEQ ID No.3和SEQ ID No.5之间同源的一个或多个区域，或包含在SEQ ID No.3和SEQ ID No.5之间异源的一个或多个区域。

段落6.编码段落4或5所述多肽的核酸。

段落7.载体，其包含段落2、3、或6所述的核酸。

段落8.宿主细胞，其包含段落2、3、或6所述的核酸、或段落7所述的载体。

段落9.转基因非人类动物，其包含段落2、3或6所述的核酸、或段落7所述的载体。

段落10.段落9所述的转基因非人类动物，其为小鼠。

段落11.段落1、4或5所述多肽在鉴定能够与离子通道特异性相互作用的化合物的方法中的用途。

段落12.段落9或10所述的转基因非人类动物在鉴定能够与离子通道特异性相互作用的化合物的方法中的用途。

段落13.鉴定TrpM8的拮抗剂的方法，该方法包括将表达TrpM8受体的细胞接触候选化合物，并且测定细胞中环化AMP(cAMP)的水平是否由于所述的接触而降低。

段落14.鉴定能够降低细胞中环化AMP内源水平的化合物的方法，该方法包括将表达TrpM8的细胞接触候选化合物，并且测定细胞中环化AMP(cAMP)的水平是否由于所述的接触而降低。

段落15.鉴定能够结合TrpM8多肽的化合物的方法，该方法包括将TrpM8多肽接触候选化合物并且测定该候选化合物是否结合TrpM8离子通道多肽。

段落16.通过段落11至15任一所述的方法鉴定的化合物。

段落17.化合物，其能够特异性结合段落1、4或5所述的多肽。

段落18.段落1、4或5所述多肽或其部分、或段落2、3或6所述核酸在抗体的制备方法中的用途。

段落19.抗体，其能够特异性结合段落1、4或5所述多肽或其部分、或由段落2、3或6所述核苷酸编码的多肽或其部分。

段落20.药物组合物，其包含下列任何一个或多个：段落1、4或5所述的多肽或其部分；段落2、3或6所述的核酸或其部分；段落7所述的载体；段落8所述的细胞；段落16或17所述的化合物；以及段落19所述的抗体，和可药用的载体或稀释剂。

段落21.疫苗组合物，其包含下列任何一个或多个：段落1、4或5所述的多肽或其部分；段落2、3或6所述的核酸或其部分；段落7所述的载体；段落8所述的细胞；段落16或17所述的化合物；以及段落19所述的抗体。

段落22.针对疾病或对疾病易感性的诊断试剂盒，其包含下列任何一个或多个：段落1、4或5所述的多肽或其部分；段落2、3或6所述的核酸或其部分；段落7所述的载体；段落8所述的细胞；段落16或17所述的化合物；以及段落19所述的抗体。

段落23.治疗患有与TrpM8活性增强相关的疾病的患者的方法，该方法包括对病人施用TrpM8离子通道的拮抗剂。

段落24.治疗患有与TrpM8活性降低相关的疾病的患者的方法，该方法包括对病人施用TrpM8离子通道的激动剂。

段落25.段落23或24所述的方法，其中该TrpM8离子通道包含具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示序列的多肽。

段落26.用于治疗和/或预防患者的疾病的方法，其包括给该患者施用下列任何一个或多个的步骤：段落1、4或5所述的多肽或其部分；段落2、3或6所述的核酸或其部分；段落7所述的载体；段落8所述的细胞；段落16或17所述的化合物；段落19所述的抗体；段落20所述的药物组合物；以及段落20所述的疫苗。

段落27.试剂，其包含段落1、4或5所述的多肽或其部分；段落2、3或6所述的核酸或其部分；段落7所述的载体；段落8所述的细胞；段落16或17所述的化合物；和/或段落19所述的抗体，所述试剂用于治疗或预防疾病的方法。

段落28.段落1、4或5所述的多肽或其部分；段落2、3或6所述的核酸或其部分；段落7所述的载体；段落8所述的细胞；段落16或17所述的化合物；以及段落19所述的抗体，用于制备治疗或预防疾病的药物组合物的用途。

段落29.非人类的转基因动物，其特征在于该转基因动物包含改变的TrpM8基因。

段落30.段落29所述的非人类的转基因动物，其中该变化选自如下组成的组：TrpM8的缺失、导致功能损失的TrpM8突变、将具有靶向或随机突变的核苷酸序列的外源基因导入TrpM8，将来自另一个物种的外源基因导入TrpM8，以及任何这些的组合。

段落31.具有功能性缺损的内源TrpM8基因的非人类转基因动物，其中该转基因动物在其基因组内包含并表达编码异源TrpM8蛋白质的转基因。

段落32.用于功能性破损宿主细胞中的TrpM8基因的核酸构建体，该核酸构建体包含：(a)非同源的置换部分；(b)位于非同源置换部分上游的第一同源区，该第一同源区具有与第一TrpM8基因序列基本同一的核苷酸序列，以及(c)位于非同源置换部分下游的第二同源区，该第二同源区具有与第二TrpM8基因序列基本同一的核苷酸序列，该第二TrpM8基因序列具有在天然存在的内源TrpM8基因中第一个TrpM8基因序列下游的位置。

段落33.用于制备TrpM8多肽的方法，该方法包括在表达编码TrpM8多肽的核酸的条件下培养段落8所述的宿主细胞。

段落34.检测样品中段落2、3或6所述核酸的存在的方法，该方法包括将样品接触对所述核酸特异的至少一种核酸探针，并且监测所述样品中该核酸的存在。

段落35.检测样品中段落1、4或5所述多肽的存在的方法，该方法包括将样品接触段落19所述的多肽，并且监测所述样品中该多肽的存在。

段落36.诊断由TrpM8表达增加、降低或异常引起的或与其相关的疾病或综合征的方法，该方法包括如下步骤：(a)检测患有或疑似患有这种疾病的动物中TrpM8表达的水平或模式；和(b)将该表达的水平或模式与正常动物的作比较。

段落37.段落22至28任一所述的试剂盒、方法、试剂或用途，或段落36所述的方法，其中该疾病选自如下组成的组：社交焦虑症、创伤后神经紧张性障碍、恐惧症、社交恐惧症、特定恐惧症、惊恐症、强迫症、急性紧张、离别性焦虑症、广泛性焦虑症、重症抑郁、精神抑郁症、双相性精神障碍、季节性情感障碍或产后抑郁症。

实旋例

实施例1.转基因的TrpM8敲除小鼠：TrpM8基因靶向载体的构建

利用基因组数据库的同源性搜索用生物信息方法鉴定TrpM8基因。从若干数据库中装配87kb缺口的基因组毗连序列。这个毗连序列提供足够的侧翼序列信息以使得将同源性臂的设计克隆进入靶向载体。

鼠的TrpM8基因有23个编码外显子。靶向策略是设计为了移出第15个编码外显子的部分。通过PCR扩增在待缺失区域两侧的4.0kb的5′同源臂和1.6kb的3′同源臂，将所述片段克隆到靶向载体中。合成用于扩增所述臂的各个寡核苷酸引物的5′末端为包含与载体多接头的克隆位点相适合、但所述臂自身缺乏的切点罕见限制酶的不同识别位点。就TrpM8来说，设计如下列引物表所列出的引物为具有AgeI/NotI的5′臂克隆位点和AscI/FseI的3′臂克隆位点(所使用的靶向载体的结构，包括相关的限制酶切位点，显示在图X中)。

除了臂的引物对(5′armF/5′armR)和(3′armF/3′armR)之外，为了下列目的设计对TrpM8基因座特异的更多引物：5′和3′探针引物对(5′prF/5′prR和3′prF/3′prR)，它可扩增在各个臂外并且延伸超过各个臂的非重复基因组DNA的2个短的150-300bp片段，从而在分离的推定靶向克隆中进行该靶向基因座的Southern分析；小鼠基因分型的引物对(hetF和hetR)，当它在载体特异性引物(在本发明为Asc306)的多重PCR中使用时，可区分野生型、杂合体和纯合型小鼠；最后为靶标筛选引物(3′scr)，它在3′臂区域末端的上游退火，当它与对载体(TK5IBLMNL)3′末端特异的引物(在本发明为Asc146)配对时，可产生对靶向活动(target event)特异的1.7kb扩增物。这个扩增物只能源自已经出现了所需基因组变化的细胞的模板DNA，并可从包含随机整合的载体拷贝的克隆背景鉴定出正确靶向的细胞。显示用于靶向策略的这些引物和TrpM8基因座区域的基因组结构的定位。

表1.TrpM8引物序列

musTrpM8 5′prF    GGCTGTGTCCCTGTTTGCATGTACTTG-Seq ID No.6

musTrpM8 5′prR    GTGCTAGGGATCAAACCTAAGACCTTG-Seq ID No.7

musTrpM8 5′armF Age tttaccggtGAATCTATGGATACCTGTGCTTCTGTC-Seq ID No.8

musTrpM8 5′armR Not aaagcggccgcGGGAAATCTCTCCATACCATTGCTTAG-Seq ID No.9

musTrpM8 3′armF Asc aaaggcgcgccGTAGGGTTTCAAGCAGGTGGTACTGAG-Seq ID

No.10

musTrpM8 3′armRFse tttggccggCCCCTGAGCCTTGTACTTTGTAATCTG-Seq ID No.11

musTrpM8 3′scr     AGGCAGTATGTTTCCCCTTCAAATCTC-Seq ID No.12

musTrpM8 3′prF     TGGTAGATTTTTATGTGCAGTCTCCAG-Seq ID No.13

musTrpM8 3′prR     CCACCATCTTCCACACCACTTACCTAC-Seq ID No.14

musTrpM8 hetF       GACACGAAGAACTGGAAGATTATCCTG-Seq ID No.15

musTrpM8 hetR       ACAACCTCAGTACCACCTGCTTGAAAC-Seq ID No.16

Asc146              CGCATCGCCTTCTATCGCCTTClTGAC-Seq ID No.17

Asc306              AATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGAC-Seq ID No.18

选择同源臂的位置以功能性破损TrpM8基因。制备靶向载体，其中待缺失的TrpM8区域被由选择盒上游的内源基因表达报告子(独立于框的lacZ基因)组成的非同源序列替代，该选择盒由以与TrpM8基因相同方向排列的促进新霉素磷酸转移酶(neo)的基因组成。

一旦5′和3′同源臂已经被克隆到靶向载体TK5IBLMNL(参见图5)，就可利用标准分子生物学方法制备极高纯度的DNA制品。将20μg新鲜制备的无内毒素的DNA用另一个稀有切割的限制酶SwaI切割，此酶存在于载体骨架中氨苄青霉素抗性基因和细菌复制起点之间的独特位点。然后沉淀线性化的DNA并在100μl磷酸盐缓冲盐水中再悬浮，准备作电穿孔。

电穿孔后24小时，在含有200μg/ml新霉素的培养基中培养转染的细胞9天。在通过PCR筛选(如上所述使用引物3′scr和Asc146)鉴定其中已经在内源TrpM8基因和靶向构建体之间发生同源重组的克隆前，将克隆挑入96孔板，复制并扩增。阳性克隆可以1至5％的比率鉴定。扩增这些克隆并将复制物冷冻，制备足够高质量的DNA来使用如上所述制备的外部5′和3′探针进行Southem印迹从而证实靶向活动，这些全部使用标准方法(Russ et al，Nature 2000 Mar 2；404(6773)：95-99)。当用将用诊断性限制酶消化的DNA的Southern印迹与外部的探针杂交时，通过突变条带和未改变的野生型条带的存在来确认同源靶向的ES细胞克隆。例如，当与外部的探针杂交时，用BstEII消化的野生型基因组DNA会产生8.0kb的条带，而类似消化包含靶向等位基因的DNA将另外产生～13kb的敲除特异条带。

实施例2.转基因的TrpM8敲除小鼠：制备TrpM8离子通道缺陷小鼠

C57BL/6雌性和雄性小鼠进行交配，在妊娠的第3.5天分离囊泡。向每个囊胚泡注射来自所选克隆的10-12个细胞，并将7-8个囊泡植入假孕F1雌性的子宫。出生1窝包含若干高水平(达100％)鼠灰色(agouti)雄性(鼠灰毛色表明从靶向克隆传代的细胞影响)的嵌合幼崽。这些雄性嵌合体与雌性MF1和129小鼠进行交配，分别通过鼠灰毛色和通过PCR基因分型来确定生殖系传递。

PCR基因分型在裂解的尾部夹片上，利用引物hetF和hetR与第3种载体特异的引物(Asc306)一起进行。这个多重PCR可通过引物hetF和hetR从野生型基因座(如果存在)进行扩增产生230bp条带的。hetF的位点在敲除小鼠中缺失，所以这个扩增对于靶向等位基因将是失败的。然而，Asc306引物将与仅在3′臂内侧的区域退火的hetR引物联合，从靶向基因座扩增338bp的条带。因此，这个多重PCR如下显示了幼崽的基因型：野生型样品显示单个230bp的条带；杂合的DNA样品在230bp和338bp产生2条带；而纯合型样品将只显示靶标特异性的338bp条带。

实施例3.生物学数据：基因表达模式

1)RT-PCR

利用RT-PCR，基因的表达显示在前列腺、肝和睾丸中(图2)。

2)LacZ染色结构的列举

LacZ染色

以下面的方式进行解剖组织的Xgal染色。

典型的组织切片由大的器官制成。切开完整的小器官和管道，因此固定剂和染色剂便会渗入。在PBS(磷酸盐缓冲盐水)中彻底漂洗组织以除去血液或管道内容物。将组织置于固定剂(包含2％甲醛、0.2％戊二醛、0.02％NP40、1mM MgCl₂、脱氧胆酸钠0.23mM的PBS)中30-45分钟。在PBS中洗涤3个5分钟后，将组织于30℃置于Xgal染色溶液(4mM K亚铁氰化物、4mM K铁氰化物、2mM MgCl2、1mg/ml X-gal的PBS溶液)中18个小时。用PBS洗涤组织3次，在4％甲醛中后固定24小时，在储存在70％乙醇中之前再次用PBS洗涤。

利用LacZ染色，发现TrpM8在DRG，特别是在神经元中表达。

实施例4.生物学数据：行为：甩尾试验

利用甩尾痛觉丧失仪表进行甩尾痛觉丧失检验。这个设备提供在啮齿动物中精确地和可再现地测定疼痛敏感性的易用方法(D′Amour，F.E.andD.L.Smith，1941，Expt.Clin.Pharmacol.，16：179-184)。该仪器具有挡板控制的灯作为热源。该灯位于动物下面以提供较少界限的环境。通过让使用者可空出手来处置动物的自动检测电路来检测甩尾。该动物被限制在通风管中，其尾部置于设备顶端的感觉凹槽上。

通过打开挡板用强烈光束活化尾部，会在动物将其尾部甩出光束时的一些时间点使其感觉不适。光探测器以自动化模式检测使计时器停止和挡板关闭的尾部动作。记录挡板打开和动物的反应之间总的时间推移。

将突变型的转基因小鼠与年龄和性别匹配的野生型小鼠的反应相比较。可以让单个动物接触不同的加热设置以产生尾部温度不超过55℃的升高。

此试验被用作敲除小鼠对伤害性疼痛起反应的指标。

可以观察到突变型对由热诱导的疼痛不太敏感，显示出痛觉减退。观察到突变型与年龄和性别匹配的野生型小鼠相比具有将其尾部甩离热源的比较久的等待时间(latency)(图3)。因此，这证明TrpM8涉及痛觉。

实施例5.生物学数据：行为：开放区域试验

在开放区域试验中测试敲除的和野生型的对照小鼠。本领域的技术人员熟悉这种试验并知道它是如何进行的。简要地，小鼠被置于具有透明侧面的有机玻璃箱(Perspex box)的中心，并且用视频记录该小鼠在一段时间内的运动。分析小鼠的行动距离以及该小鼠在任何时间的位置。对照动物通常花大部分时间在场地外围移动。记录这个正常模式的变化，特别是在场地的中心区所花费时间的数值，其增加意味着该动物较不焦虑。

结果显示敲除的小鼠与野生型对照的移动量相同(图4A)。然而，这个数据的分裂(breakdown)显示，相对于边缘带，敲除的小鼠总体花费了更多时间在开放区域场地的中心区移动(图4B)。这是通过敲除动物在中心区域的移动距离远超过野生型来反映的(图4C)。

实施例6.生物学数据：生理学：血中的血浆皮质酮

皮质酮是应紧张和焦虑而释放的激素。皮质酮水平越低，该动物可能经受的焦虑和紧张的水平越低。

利用ELISA测定分析来自TrpM8-/-和年龄匹配的+/+小鼠的血中的血浆皮质酮。发现在突变型动物中的皮质酮水平比在野生型中低(图5)，这表明TrpM8小鼠比它们的野生型对照较少焦虑和紧张。

本文中提到的每一件申请和专利，和上述每一件申请和专利所引用或参考的各份文件，包括在每件申请和专利(“申请引用的文件”)的诉讼期间，和在每件申请和专利中以及在申请引用的任何文件中引用或提及的任何产品的任何制造商的说明或目录，都引入本文作为参考。此外，本文中引用的全部文件，和本文中引用的文件中引用或参考的全部文件，以及本文中引用或提及的任何产品的任何制造商的说明书或目录，都引入本文作为参考。

本发明所描述的方法和系统的不同改进和变化对于本领域的技术人员来说是显而易见的，并不背离本发明的范围和精神。虽然本发明已经连同特定的优选实施方案进行描述，应理解如所要求保护的本发明将不应被不当限定为这种特定的实施方案，可在本发明的范围内对其作许多改进和补充。实际上，对于分子生物学或相关领域技术人员明显的、对于实施本发明所述方式的不同改进应包括在权利要求的范围之内。此外，可根据独立权利要求的特征对其后的从属权利要求的特征的作多种组合，而不背离本

发明的范围。

                          序列表

序列

SEQ ID No.1

AAGAAAATCCTGCTTGACAAAAACCGTCACTTAGGAAAAGATGTCCTTTCGGGCAGCCAGGCTCAGCATGAGGAACA

GAAGGAATGACACTCTGGACAGCACCCGGACCCTGTACTCCAGCGCGTCTCGGAGCACAGACTTGTCTTACAGTGAA

AGCGACTTGGTGAATTTTATTCAAGCAAATTTTAAGAAACGAGAATGTGTCTTCTTTACCAAAGATTCCAAGGCCAC

GGAGAATGTGTGCAAGTGTGGCTATGCCCAGAGCCAGCACATGGAAGGCACCCAGATCAACCAAAGTGAGAAATGGA

ACTACAAGAAACACACCAAGGAATTTCCTACCGACGCCTTTGGGGATATTCAGTTTGAGACACTGGGGAAGAAAGGG

AAGTATATACGTCTGTCCTGCGACACGGACGCGGAAATCCTTTACGAGCTGCTGACCCAGCACTGGCACCTGAAAAC

ACCCAACCTGGTCATTTCTGTGACCGGGGGCGCCAAGAACTTCGCCCTGAAGCCGCGCATGCGCAAGATCTTCAGCC

GGCTCATCTACATCGCGCAGTCCAAAGGTGCTTGGATTCTCACGGGAGGCACCCATTATGGCCTGATGAAGTACATC

GGGGAGGTGGTGAGAGATAACACCATCAGCAGGAGTTCAGAGGAGAATATTGTGGCCATTGGCATAGCAGCTTGGGG

CATGGTCTCCAACCGGGACACCCTCATCAGGAATTGCGATGCTGAGGGCTATTTTTTAGCCCAGTACCTTATGGATG

ACTTCACAAGAGATCCACTGTATATCCTGGACAACAACCACACACATTTGCTGCTCGTGGACAATGGCTGTCATGGA

CATCCCACTGTCGAAGCAAAGCTCCGGAATCAGCTAGAGAAGTATATCTCTGAGCGCACTATTCAAGATTCCAACTA

TGGTGGCAAGATCCCCATTGTGTGTTTTGCCCAAGGAGGTGGAAAAGAGACTTTGAAAGCCATCAATACCTCCATCA

AAAATAAAATTCCTTGTGTGGTGGTGGAAGGCTCGGGCCAGATCGCTGATGTGATCGCTAGCCTGGTGGAGGTGGAG

GATGCCCTGACATCTTCTGCCGTCAAGGAGAAGCTGGTGCGCTTTTTACCCCGCACGGTGTCCCGGCTGCCTGAGGA

GGAGACTGAGAGTTGGATCAAATGGCTCAAAGAAATTCTCGAATGTTCTCACCTATTAACAGTTATTAAAATGGAAG

AAGCTGGGGATGAAATTGTGAGCAATGCCATCTCCTACGCTCTATACAAAGCCTTCAGCACCAGTGAGCAAGACAAG

GATAACTGGAATGGGCAGCTGAAGCTTCTGCTGGAGTGGAACCAGCTGGACTTAGCCAATGATGAGATTTTCACCAA

TGACCGCCGATGGGAGTCTGCTGACCTTCAAGAAGTCATGTTTACGGCTCTCATAAAGGACAGACCCAAGTTTGTCC

GCCTCTTTCTGGAGAATGGCTTGAACCTACGGAAGTTTCTCACCCATGATGTCCTCACTGAACTCTTCTCCAACCAC

TTCAGCACGCTTGTGTACCGGAATCTGCAGATCGCCAAGAATTCCTATAATGATGCCCTCCTCACGTTTGTCTGGAA

ACTGGTTGCGAACTTCCGAAGAGGCTTCCGGAAGGAAGACAGAAATGGCCGGGACGAGATGGACATAGAACTCCACG

ACGTGTCTCCTATTACTCGGCACCCCCTGCAAGCTCTCTTCATCTGGGCCATTCTTCAGAATAAGAAGGAACTCTCC

AAAGTCATTTGGGAGCAGACCAGGGGCTGCACTCTGGCAGCCCTGGGAGCCAGCAAGCTTCTGAAGACTCTGGCCAA

AGTGAAGAACGACATCAATGCTGCTGGGGAGTCCGAGGAGCTGGCTAATGAGTACGAGACCCGGGCTGTTGAGCTGT

TCACTGAGTGTTACAGCAGCGATGAAGACTTGGCAGAACAGCTGCTGGTCTATTCCTGTGAAGCTTGGGGTGGAAGC

AACTGTCTGGAGCTGGCGGTGGAGGCCACAGACCAGCATTTCATCGCCCAGCCTGGGGTCCAGAATTTTCTTTCTAA

GCAATGGTATGGAGAGATTTCCCGAGACACCAAGAACTGGAAGATTATCCTGTGTCTGTTTATTATACCCTTGGTGG

GCTGTGGCTTTGTATCATTTAGGAAGAAACCTGTCGACAAGCACAAGAAGCTGCTTTGGTACTATGTGGCGTTCTTC

ACCTCCCCCTTCGTGGTCTTCTCCTGGAATGTGGTCTTCTACATCGCCTTCCTCCTGCTGTTTGCCTACGTGCTGCT

CATGGATTTCCATTCGGTGCCACACCCCCCCGAGCTGGTCCTGTACTCGCTGGTCTTTGTCCTCTTCTGTGATGAAG

TGAGACAGTGGTACGTAAATGGGGTGAATTATTTTACTGACCTGTGGAATGTGATGGACACGCTGGGGCTTTTTTAC

TTCATAGCAGGAATTGTATTTCGGCTCCACTCTTCTAATAAAAGCTCTTTGTATTCTGGACGAGTCATTTTCTGTCT

GGACTACATTATTTTCACTCTAAGATTGATCCACATTTTTACTGTAAGCAGAAACTTAGGACCCAAGATTATAATGC

TGCAGAGGATGCTGATCGATGTGTTCTTCTTCCTGTTCCTCTTTGCGGTGTGGATGGTGGCCTTTGGCGTGGCCAGG

CAAGGGATCCTTAGGCAGAATGAGCAGCGCTGGAGGTGGATATTCCGTTCGGTCATCTACGAGCCCTACCTGGCCAT

GTTCGGCCAGGTGCCCAGTGACGTGGATGGTACCACGTATGACTTTGCCCACTGCACCTTCACTGGGAATGAGTCCA

AGCCACTGTGTGTGGAGCTGGATGAGCACAACCTGCCCCGGTTCCCCGAGTGGATCACCATCCCCCTGGTGTGCATC

TACATGTTATCCACCAACATCCTGCTGGTCAACCTGCTGGTCGCCATGTTTGGCTACACGGTGGGCACCGTCCAGGA

GAACAATGACCAGGTCTGGAAGTTCCAGAGGTACTTCCTGGTGCAGGAGTACTGCAGCCGCCTCAATATCCCCTTCC

CCTTCATCGTCTTCGCTTACTTCTACATGGTGGTGAAGAAGTGCTTCAAGTGTTGCTGCAAGGAGAAAAACATGGAG

TCTTCTGTCTGCTGTTTCAAAAATGAAGACAATGAGACTCTGGCATGGGAGGGTGTCATGAAGGAAAACTACCTTGT

CAAGATCAACACAAAAGCCAACGACACCTCAGAGGAAATGAGGCATCGATTTAGACAACTGGATACAAAGCTTAATG

ATCTCAAGGGTCTTCTGAAAGAGATTGCTAATAAAATCAAATAA

SEQ ID No.2

ATGTCCTTTCGGGCAGCCAGGCTCAGCATGAGGAACAGAAGGAATGACACTCTGGACAGCACCCGGACCCTGTACTC

CAGCGCGTCTCGGAGCACAGACTTGTCTTACAGTGAAAGCGACTTGGTGAATTTTATTCAAGCAAATTTTAAGAAAC

GAGAATGTGTCTTCTTTACCAAAGATTCCAAGGCCACGGAGAATGTGTGCAAGTGTGGCTATGCCCAGAGCCAGCAC

ATGGAAGGCACCCAGATCAACCAAAGTGAGAAATGGAACTACAAGAAACACACCAAGGAATTTCCTACCGACGCCTT

TGGGGATATTCAGTTTGAGACACTGGGGAAGAAAGGGAAGTATATACGTCTGTCCTGCGACACGGACGCGGAAATCC

TTTACGAGCTGCTGACCCAGCACTGGCACCTGAAAACACCCAACCTGGTCATTTCTGTGACCGGGGGCGCCAAGAAC

TTCGCCCTGAAGCCGCGCATGCGCAAGATCTTCAGCCGGCTCATCTACATCGCGCAGTCCAAAGGTGCTTGGATTCT

CACGGGAGGCACCCATTATGGCCTGATGAAGTACATCGGGGAGGTGGTGAGAGATAACACCATCAGCAGGAGTTCAG

AGGAGAATATTGTGGCCATTGGCATAGCAGCTTGGGGCATGGTCTCCAACCGGGACACCCTCATCAGGAATTGCGAT

GCTGAGGGCTATTTTTTAGCCCAGTACCTTATGGATGACTTCACAAGAGATCCACTGTATATCCTGGACAACAACCA

CACACATTTGCTGCTCGTGGACAATGGCTGTCATGGACATCCCACTGTCGAAGCAAAGCTCCGGAATCAGCTAGAGA

AGTATATCTCTGAGCGCACTATTCAAGATTCCAACTATGGTGGCAAGATCCCCATTGTGTGTTTTGCCCAAGGAGGT

GGAAAAGAGACTTTGAAAGCCATCAATACCTCCATCAAAAATAAAATTCCTTGTGTGGTGGTGGAAGGCTCGGGCCA

GATCGCTGATGTGATCGCTAGCCTGGTGGAGGTGGAGGATGCCCTGACATCTTCTGCCGTCAAGGAGAAGCTGGTGC

GCTTTTTACCCCGCACGGTGTCCCGGCTGCCTGAGGAGGAGACTGAGAGTTGGATCAAATGGCTCAAAGAAATTCTC

GAATGTTCTCACCTATTAACAGTTATTAAAATGGAAGAAGCTGGGGATGAAATTGTGAGCAATGCCATCTCCTACGC

TCTATACAAAGCCTTCAGCACCAGTGAGCAAGACAAGGATAACTGGAATGGGCAGCTGAAGCTTCTGCTGGAGTGGA

ACCAGCTGGACTTAGCCAATGATGAGATTTTCACCAATGACCGCCGATGGGAGTCTGCTGACCTTCAAGAAGTCATG

TTTACGGCTCTCATAAAGGACAGACCCAAGTTTGTCCGCCTCTTTCTGGAGAATGGCTTGAACCTACGGAAGTTTCT

CACCCATGATGTCCTCACTGAACTCTTCTCCAACCACTTCAGCACGCTTGTGTACCGGAATCTGCAGATCGCCAAGA

ATTCCTATAATGATGCCCTCCTCACGTTTGTCTGGAAACTGGTTGCGAACTTCCGAAGAGGCTTCCGGAAGGAAGAC

AGAAATGGCCGGGACGAGATGGACATAGAACTCCACGACGTGTCTCCTATTACTCGGCACCCCCTGCAAGCTCTCTT

CATCTGGGCCATTCTTCAGAATAAGAAGGAACTCTCCAAAGTCATTTGGGAGCAGACCAGGGGCTGCACTCTGGCAG

CCCTGGGAGCCAGCAAGCTTCTGAAGACTCTGGCCAAAGTGAAGAACGACATCAATGCTGCTGGGGAGTCCGAGGAG

CTGGCTAATGAGTACGAGACCCGGGCTGTTGAGCTGTTCACTGAGTGTTACAGCAGCGATGAAGACTTGGCAGAACA

GCTGCTGGTCTATTCCTGTGAAGCTTGGGGTGGAAGCAACTGTCTGGAGCTGGCGGTGGAGGCCACAGACCAGCATT

TCATCGCCCAGCCTGGGGTCCAGAATTTTCTTTCTAAGCAATGGTATGGAGAGATTTCCCGAGACACCAAGAACTGG

AAGATTATCCTGTGTCTGTTTATTATACCCTTGGTGGGCTGTGGCTTTGTATCATTTAGGAAGAAACCTGTCGACAA

GCACAAGAAGCTGCTTTGGTACTATGTGGCGTTCTTCACCTCCCCCTTCGTGGTCTTCTCCTGGAATGTGGTCTTCT

ACATCGCCTTCCTCCTGCTGTTTGCCTACGTGCTGCTCATGGATTTCCATTCGGTGCCACACCCCCCCGAGCTGGTC

CTGTACTCGCTGGTCTTTGTCCTCTTCTGTGATGAAGTGAGACAGTGGTACGTAAATGGGGTGAATTATTTTACTGA

CCTGTGGAATGTGATGGACACGCTGGGGCTTTTTTACTTCATAGCAGGAATTGTATTTCGGCTCCACTCTTCTAATA

AAAGCTCTTTGTATTCTGGACGAGTCATTTTCTGTCTGGACTACATTATTTTCACTCTAAGATTGATCCACATTTTT

ACTGTAAGCAGAAACTTAGGACCCAAGATTATAATGCTGCAGAGGATGCTGATCGATGTGTTCTTCTTCCTGTTCCT

CTTTGCGGTGTGGATGGTGGCCTTTGGCGTGGCCAGGCAAGGGATCCTTAGGCAGAATGAGCAGCGCTGGAGGTGGA

TATTCCGTTCGGTCATCTACGAGCCCTACCTGGCCATGTTCGGCCAGGTGCCCAGTGACGTGGATGGTACCACGTAT

GACTTTGCCCACTGCACCTTCACTGGGAATGAGTCCAAGCCACTGTGTGTGGAGCTGGATGAGCACAACCTGCCCCG

GTTCCCCGAGTGGATCACCATCCCCCTGGTGTGCATCTACATGTTATCCACCAACATCCTGCTGGTCAACCTGCTGG

TCGCCATGTTTGGCTACACGGTGGGCACCGTCCAGGAGAACAATGACCAGGTCTGGAAGTTCCAGAGGTACTTCCTG

GTGCAGGAGTACTGCAGCCGCCTCAATATCCCCTTCCCCTTCATCGTCTTCGCTTACTTCTACATGGTGGTGAAGAA

GTGCTTCAAGTGTTGCTGCAAGGAGAAAAACATGGAGTCTTCTGTCTGCTGTTTCAAAAATGAAGACAATGAGACTC

TGGCATGGGAGGGTGTCATGAAGGAAAACTACCTTGTCAAGATCAACACAAAAGCCAACGACACCTCAGAGGAAATG

AGGCATCGATTTAGACAACTGGATACAAAGCTTAATGATCTCAAGGGTCTTCTGAAAGAGATTGCTAATAAAATCAA

ATAA

SEQ ID No.3

MSFRAARLSMRNRRNDTLDSTRTLYSSASRSTDLSYSESDLVNFTQANFKKRECVFFTKDSKATENVCKCGYAQSQH

MEGTQTNQSEKWNYKKHTKEFPTDAFGDIQFETLGKKGKYIRLSCDTDAEILYELLTQHWHLKTPNLVISVTGGAKN

FALKPRMRKIFSRLIYIAQSKGAWILTGGTHYGLMKYIGEVVRDNTISRSSEENIVAIGIAAWGMVSNRDTLIRNCD

AEGYFLAQYLMDDFTRDPLYILDNNHTHLLLVDNGCHGHPTVEAKLRNQLEKYISERTIQDSNYGGKIPIVCFAQGG

GKETLKAINTSIKNKIPCVVVEGSGQIADVIASLVEVEDALTSSAVKEKLVRFLPRTVSRLPEEETESWIKWLKEIL

ECSHLLTVIKMEEAGDEIVSNAISYALYKAFSTSEQDKDNWNGQLKLLLEWNQLDLANDEIFTNDRRWESADLQEVM

FTALIKDRPKFVRLFLENGLNLRKFLTHDVLTELFSNHFSTLVYRNLQIAKNSYNDALLTFVWKLVANFRRGFRKED

RNGRDEMDIELHDVSPITRHPLQALFIWAILQNKKELSKVIWEQTRGCTLAALGASKLLKTLAKVKNDINAAGESEE

LANEYETRAVELFTECYSSDEDLAEQLLVYSCEAWGGSNCLELAVEATDQHFIAQPGVQNFLSKQWYGEISRDTKNW

KIILCLFIIPLVGCGFVSFRKKPVDKHKKLLWYYVAFFTSPFVVFSWNVVFYIAFLLLFAYVLLMDFHSVPHPPELV

LYSLVFVLFCDEVRQWYVNGVNYFTDLWNVMDTLGLFYFIAGIVFRLHSSNKSSLYSGRVIFCLDYIIFTLRLIHIF

TVSPNLGPKIIMLQRMLIDVFFFLFLFAVWMVAFGVARQGILRQNEQRWRWIFRSVIYEPYLAMFGQVPSDVDGTTY

DFAHCTFTGNESKPLCVELDEHNLPRFPEWITIPIVCIYMLSTNILLVNLLVAMFGYTVGTVQENNDQVWKFQRYFL

VQEYCSRLNIPFPFIVFAYFYMVVKKCFKCCCKEKNMESSVCCFKNEDNETLAWEGVMKENYLVKINTKANDTSEEM

RHRFRQLDTKLNDLKGLLKEIANKIK

SEQ ID No.4

CCTGGCTGTCCCGGAGCTTGATACATAGAAAAGACTGACCTCAGATACACAGAGATCCTTCTGCTTCTGTCTCCCAA

GTGCTGGGATCACAGGCAAGATGTCCTTCGAGGGAGCCAGGCTCAGCATGAGGAGCCGCAGAAATGGTACTATGGGC

AGCACCCGGACCCTGTACTCCAGTGTATCTCGGAGCACAGACGTGTCCTACAGTGACAGTGATTTGGTGAATTTTAT

TCAGGCAAATTTTAAAAAACGAGAATGTGTCTTCTTTACCAGAGACTCCAAGGCCATGGAGAACATATGCAAGTGTG

GTTATGCCCAGAGCCAGCACATCGAAGGCACCCAGATCAACCAAAATGAGAAGTGGAACTACAAAAAACATACCAAG

GAGTTTCCAACAGACGCCTTCGGGGACATTCAGTTTGAGACTCTGGGGAAGAAAGGCAAGTACTTACGCTTGTCCTG

TGACACCGACTCTGAAACTCTCTACGAACTGCTGACCCAGCACTGGCACCTCAAAACACCCAACCTGGTCATTTCAG

TGACGGGTGGAGCCAAAAACTTTGCTTTGAAGCCACGCATGCGCAAGATCTTCAGCAGGCTGATTTACATCGCACAG

TCTAAAGGTGCGTGGATTCTCACTGGAGGCACTCACTACGGCCTGATGAAGTACATAGGCGAGGTGGTGAGAGACAA

CACCATCAGCAGGAACTCAGAAGAGAACATCGTGGCCATTGGCATCGCAGCATGGGGCATGGTCTCCAACAGGGACA

CCCTCATCAGGAGCTGTGATGATGAGGGACATTTTTCAGCTCAATACATCATGGATGACTTTACCAGAGACCCTCTA

TACATCCTGGACAACAACCATACCCACCTGCTGCTTGTGGACAACGGTTGTCATGGACACCCCACAGTGGAAGCCAA

GCTCCGGAATCAGCTGGAAAAGTACATCTCTGAGCGCACCAGTCAAGATTCCAACTATGGTGGTAAGATCCCCATCG

TGTGTTTTGCCCAAGGAGGTGGAAGAGAGACTCTAAAAGCCATCAACACCTCTGTCAAAAGCAAGATCCCTTGTGTG

GTGGTGGAAGGCTCGGGGCAGATTGCTGATGTGATCGCCAGCCTGGTGGAGGTGGAGGATGTTTTAACCTCTTCCAT

GGTCAAAGAGAAGCTGGTACGCTTTTTACCACGCACTGTGTCCCGGCTGCCTGAAGAGGAAATTGAGAGCTGGATCA

AATGGCTCAAAGAAATTCTTGAGAGTTCTCACCTACTCACAGTAATTAAGATGGAAGAGGCTGGAGATGAGATTGTG

AGCAACGCCATTTCCTATGCGCTGTACAAAGCCTTCAGCACTAATGAGCAAGACAAGGACAACTGGAATGGACAGCT

GAAGCTTCTGCTGGAGTGGAACCAGTTGGACCTTGCCAGTGATGAGATCTTCACCAATGATCGCCGCTGGGAGTCTG

CCGACCTTCAGGAGGTCATGTTCACGGCTCTCATAAAGGACAGACCCAAGTTTGTCCGCCTCTTTCTGGAGAATGGC

CTGAATCTGCAGAAGTTTCTCACCAATGAAGTCCTCACAGAGCTCTTCTCCACCCACTTCAGCACCCTAGTGTACCG

GAATCTGCAGATCGCCAAGAACTCCTACAATGACGCACTCCTCACCTTTGTCTGGAAGTTGGTGGCAAACTTCCGTC

GAAGCTTCTGGAAAGAGGACAGAAGCAGCAGGGAGGACTTGGATGTGGAACTCCATGATGCATCTCTCACCACCCGG

CACCCGCTGCAAGCTCTCTTCATCTGGGCCATTCTTCAGAACAAGAAGGAACTCTCCAAGGTCATTTGGGAGCAGAC

CAAAGGCTGTACTCTGGCAGCCTTGGGGGCCAGCAAGCTTCTGAAGACCCTGGCCAAAGTTAAGAATGATATCAACG

CTGCTGGGGAATCGGAGGAACTGGCCAATGAATATGAGACCCGAGCAGTGGAGTTGTTCACCGAGTGTTACAGCAAT

GATGAAGACTTGGCAGAACAGCTACTGGTCTACTCCTGCGAAGCCTGGGGTGGGAGCAACTGTCTGGAGCTGGCAGT

GGAGGCTACAGATCAGCATTTCATCGCTCAGCCTGGGGTCCAGAATTTCCTTTCTAAGCAATGGTATGGAGAGATTT

CCCGAGACACGAAGAACTGGAAGATTATCCTGTGTCTATTCATCATCCCCTTAGTGGGCTGTGGCCTCGTATCATTT

AGGAAGAAACCCATTGACAAGCACAAGAAGCTGCTGTGGTACTATGTGGCCTTCTTCACGTCGCCCTTCGTGGTCTT

CTCCTGGAACGTGGTCTTCTACATCGCCTTCCTCCTGCTGTTTGCCTATGTGCTGCTCATGGACTTCCACTCAGTGC

CACACACCCCCGAGCTGATCCTCTACGCCCTGGTCTTCGTCCTCTTCTGTGATGAAGTGAGGCAGTGGTACATGAAC

GGAGTGAATTATTTCACCGACCTATGGAACGTTATGGACACCCTGGGACTCTTCTACTTCATAGCGGGTATTGTATT

CCGGCTCCACTCTTCTAATAAAAGCTCGTTGTACTCTGGGCGCGTCATTTTCTGTCTGGATTACATTATATTCACGC

TAAGGCTCATCCACATTTTCACCGTCAGCAGGAACTTGGGACCCAAGATTATAATGCTGCAGCGGATGCTGATCGAC

GTTTTCTTCTTCCTGTTCCTCTTTGCTGTGTGGATGGTGGCCTTTGGCGTGGCCAGACAGGGGATCCTAAGGCAAAA

TGAACAGCGCTGGAGATGGATCTTCCGCTCTGTCATCTATGAGCCCTACCTGGCCATGTTTGGCCAGGTTCCCAGTG

ACGTGGATAGTACCACATATGACTTCTCCCACTGTACCTTCTCGGGAAATGAGTCCAAGCCACTGTGTGTGGAGCTG

GATGAGCACAACCTGCCCCGCTTCCCTGAGTGGATCACCATTCCGCTGGTGTGCATCTACATGCTCTCCACCAATAT

CCFTCTGGTCAACCTCCTGGTCGCCATGTTTGGCTACACGGTAGGCATTGTACAGGAGAACAACGACCAGGTCTGGA

AATTCCAGCGGTACTTCCTGGTGCAGGAGTACTGCAACCGCCTAAACATCCCCTTCCCCTTCGTYGTCTTCGCTTAT

TTCTACATGGTGGTGAAGAAGTGTTTCAAATGCTGCTGTAAAGAGAAGAATATGGAGTCTAATGCCTGCTGTTTCAG

AAATGAGGACAATGAGACTTTGGCGTGGGAGGGTGTCATGAAGGAGAATTACCTTGTCAAGATCAACACGAAAGCCA

ACGACAACTCAGAGGAGATGAGGCATCGGTTTAGACAACTGGACTCAAAGCTTAACGACCTCAAAAGTCTTCTGAAA

GAGATTGCTAATAACATCAAGTAACCTGGCTGTCCCGGAGCTTGATACATAGAAAAGACTGACCTCAGATACACAGA

GATCCTTCTGCTTCTGTCTCCCAAGTGCTGGGATCACAGGCAAGATGTCCTTCGAGGGAGCCAGGCTCAGCATGAGG

AGCCGCAGAAATGGTACTATGGGCAGCACCCGGACCCTGTACTCCAGTGTATCTCGGAGCACAGACGTGTCCTACAG

TGACAGTGATTTGGTGAATTTTATTCAGGCAAATTTTAAAAAACGAGAATGTGTCTTCTTTACCAGAGACTCCAAGG

CCATGGAGAACATATGCAAGTGTGGTTATGCCCAGAGCCAGCACATCGAAGGCACCCAGATCAACCAAAATGAGAAG

TGGAACTACAAAAAACATACCAAGGAGTTTCCAACAGACGCCTTCGGGGACATTCAGTTTGAGACTCTGGGGAAGAA

AGGCAAGTACTTACGCTTGTCCTGTGACACCGACTCTGAAACTCTCTACGAACTGCTGACCCAGCACTGGCACCTCA

AAACACCCAACCTGGTCATTTCAGTGACGGGTGGAGCCAAAAACTTTGCTTTGAAGCCACGCATGCGCAAGATCTTC

AGCAGGCTGATTTACATCGCACAGTCTAAAGGTGCGTGGATTCTCACTGGAGGCACTCACTACGGCCTGATGAAGTA

CATAGGCGAGGTGGTGAGAGACAACACCATCAGCAGGAACTCAGAAGAGAACATCGTGGCCATTGGCATCGCAGCAT

GGGGCATGGTCTCCAACAGGGACACCCTCATCAGGAGCTGTGATGATGAGGGACATTTTTCAGCTCAATACATCATG

GATGACTTTACCAGAGACCCTCTATACATCCTGGACAACAACCATACCCACCTGCTGCTTGTGGACAACGGTTGTCA

TGGACACCCCACAGTGGAAGCCAAGCTCCGGAATCAGCTGGAAAAGTACATCTCTGAGCGCACCAGTCAAGATTCCA

ACTATGGTGGTAAGATCCCCATCGTGTGTTTTGCCCAAGGAGGTGGAAGAGAGACTCTAAAAGCCATCAACACCTCT

GTCAAAAGCAAGATCCCTTGTGTGGTGGTGGAAGGCTCGGGGCAGATTGCTGATGTGATCGCCAGCCTGGTGGAGGT

GGAGGATGTTTTAACCTCTTCCATGGTCAAAGAGAAGCTGGTACGCTTTTTACCACGCACTGTGTCCCGGCTGCCTG

AAGAGGAAATTGAGAGCTGGATCAAATGGCTCAAAGAAATTCTTGAGAGTTCTCACCTACTCACAGTAATTAAGATG

GAAGAGGCTGGAGATGAGATTGTGAGCAACGCCATTTCCTATGCGCTGTACAAAGCCTTCAGCACTAATGAGCAAGA

CAAGGACAACTGGAATGGACAGCTGAAGCTTCTGCTGGAGTGGAACCAGTTGGACCTTGCCAGTGATGAGATCTTCA

CCAATGATCGCCGCTGGGAGTCTGCCGACCTTCAGGAGGTCATGTTCACGGCTCTCATAAAGGACAGACCCAAGTTT

GTCCGCCTCTTTCTGGAGAATGGCCTGAATCTGCAGAAGTTTCTCACCAATGAAGTCCTCACAGAGCTCTTCTCCAC

CCACTTCAGCACCCTAGTGTACCGGAATCTGCAGATCGCCAAGAACTCCTACAATGACGCACTCCTCACCTTTGTCT

GGAAGTTGGTGGCAAACTTCCGTCGAAGCTTCTGGAAAGAGGACAGAAGCAGCAGGGAGGACTTGGATGTGGAACTC

CATGATGCATCTCTCACCACCCGGCACCCGCTGCAAGCTCTCTTCATCTGGGCCATTCTTCAGAACAAGAAGGAACT

CTCCAAGGTCATTTGGGAGCAGACCAAAGGCTGTACTCTGGCAGCCTTGGGGGCCAGCAAGCTTCTGAAGACCCTGG

CCAAAGTTAAGAATGATATCAACGCTGCTGGGGAATCGGAGGAACTGGCCAATGAATATGAGACCCGAGCAGTGGAG

TTGTTCACCGAGTGTTACAGCAATGATGAAGACTTGGCAGAACAGCTACTGGTCTACTCCTGCGAAGCCTGGGGTGG

GAGCAACTGTCTGGAGCTGGCAGTGGAGGCTACAGATCAGCATTTCATCGCTCAGCCTGGGGTCCAGAATTTCCTTT

CTAAGCAATGGTATGGAGAGATTTCCCGAGACACGAAGAACTGGAAGATTATCCTGTGTCTATTCATCATCCCCTTA

GTGGGCTGTGGCCTCGTATCATTTAGGAAGAAACCCATTGACAAGCACAAGAAGCTGCTGTGGTACTATGTGGCCTT

CTTCACGTCGCCCTTCGTGGTCTTCTCCTGGAACGTGGTCTTCTACATCGCCTTCCTCCTGCTGTTTGCCTATGTGC

TGCTCATGGACTTCCACTCAGTGCCACACACCCCCGAGCTGATCCTCTACGCCCTGGTCTTCGTCCTCTTCTGTGAT

GAAGTGAGGCAGTGGTACATGAACGGAGTGAATTATTTCACCGACCTATGGAACGTTATGGACACCCTGGGACTCTT

CTACTTCATAGCGGGTATTGTATTCCGGCTCCACTCTTCTAATAAAAGCTCGTTGTACTCTGGGCGCGTCATTTTCT

GTCTGGATTACATTATATTCACGCTAAGGCTCATCCACATTTTCACCGTCAGCAGGAACTTGGGACCCAAGATTATA

ATGCTGCAGCGGATGCTGATCGACGTTTTCTTCTTCCTGTTCCTCTTTGCTGTGTGGATGGTGGCCTTTGGCGTGGC

CAGACAGGGGATCCTAAGGCAAAATGAACAGCGCTGGAGATGGATCTTCCGCTCTGTCATCTATGAGCCCTACCTGG

CCATGTTTGGCCAGGTTCCCAGTGACGTGGATAGTACCACATATGACTTCTCCCACTGTACCTTCTCGGGAAATGAG

TCCAAGCCACTGTGTGTGGAGCTGGATGAGCACAACCTGCCCCGCTTCCCTGAGTGGATCACCATTCCGCTGGTGTG

CATCTACATGCTCTCCACCAATATCCTTCTGGTCAACCTCCTGGTCGCCATGTTTGGCTACACGGTAGGCATTGTAC

AGGAGAACAACGACCAGGTCTGGAAATTCCAGCGGTACTTCCTGGTGCAGGAGTACTGCAACCGCCTAAACATCCCC

TTCCCCTTCGTTGTCTTCGCTTATTTCTACATGGTGGTGAAGAAGTGTTTCAAATGCTGCTGTAAAGAGAAGAATAT

GGAGTCTAATGCCTGCTGTTTCAGAAATGAGGACAATGAGACTTTGGCGTGGGAGGGTGTCATGAAGGAGAATTACC

TTGTCAAGATCAACACGAAAGCCAACGACAACTCAGAGGAGATGAGGCATCGGTTTAGACAACTGGACTCAAAGCTT

AACGACCTCAAAAGTCTTCTGAAAGAGATTGCTAATAACATCAAGTAA

SEQ ID No.5

MSFEGARLSMRSRRNGTMGSTRTLYSSVSRSTDVSYSDSDLVNFIQANFKKRECVFFTRDSKAMENICKCGYAQSQH

IEGTQINQNEKWNYKKHTKEFPTDAFGDIQFETLGKKGKYLRLSCDTDSETLYELLTQHWHLKTPNLVISVTGGAKN

FALKpRMRKIFSRLIYIAQSKGAWILTGGTHYGLMKYIGEVVRDNTISRNSEENIVAIGIAAWGMVSNRDTLIRSCD

DEGHFSAQYIMDDFTRDpLYILDNNHTHLLLVDNGCHGHpTVEAKLRNQLEKYISERTSQDSNYGGKIPIVCFAQGG

GRETLKAINTSVKSKIpCVVVEGSGQIADVIASLVEVEDVLTSSMVKEKLVRFLpRTVSRLPEEEIESWIKWLKEIL

ESSHLLTVIKMEEAGDEIVSNAISYALYKAFSTNEQDKDNWNGQLKLLLEWNQLDLASDEIFTNDRRWESADLQEVM

FTALIKDRpKFVRLFLENGLNLQKFLTNEVLTELFSTHFSTLVYRNLQIAKNSYNDALLTFVWKLVANFRRSFWKED

RSSREDLDVELHDASLTTRHpLQALFIWAILQNKKELSKVIWEQTKGCTLAALGASKLLKTLAKVKNDINAAGESEE

LANEYETRAVELFTECYSNDEDLAEQLLVYSCEAWGGSNCLELAVEATDQHFIAQPGVQNFLSKQWYGEISRDTKNW

KIILCLFIIPLVGCGLVSFRKKPIDKHKKLLWYYVAFFTSpFVVFSWNVVFYIAFLLLFAYVLLMDFHSVPHTpELI

LYALVFVLFCDEVRQWYMNGVNYFTDLWNVMDTLGLFYFIAGIVFRLHSSNKSSLYSGRVIFCLDYIIFTLRLIHIF

TVsRNLGPKIIMLQRMLIDVFFFLFLFAVWMVAFGVARQGILRQNEQRWRWIFRSVIYEpYLANFGQVpSDVDSTTY

DFSHCTFSGNESKpLCVELDEHNLPRFPEWITIpLVCIYMLSTNILLVNLLVAMFGYTVGIVQENNDQVWKFQRYFL

VQEYCNRLNIpFpFVVFAYFYMVVKKCFKCCCKEKNMESNACCFRNEDNETLAWEGVMKENYLVKINTKANDNSEEM

RHRFRQLDSKLNDLKSLLKEIAN

SEQID NO：19

从5′prF到3′prR的基因座

序列范围：67902至7440O

>5′prF

 ｜

 ｜                                                                                            68000

GCATGTACTTGGGGATGTACATAGGATGGGTGGTCCCCAGAAAGGAGTCACATAGGGGTCCTCCAGCGTACTCCTGCTCCCCAGGTGTCTGTGCATAACT

CGTACATGAACCCCTACATGTATCCTACCCACCAGGGGTCTTTCCTCAGTGTATCCCCAGGAGGTCGCATGAGGACGAGGGGTCACCAGACACGTATTGA

                                                                                           <5′ pTR

                                                                                              ｜

                                                                                               68100

TTCTCCCAAGTATAAGAAATATATTGAAATTTAATTTAAGACGATTTCTAAGCTGTTATCTCACTTGCACAAGGTCTTAGGTTTGATCCCTAGCACTGAA

AAGAGGGTTCATATTCTTTATATAACTTTAAATTAAATTTCTGCTAAAGATTCGACAATAGAGTGAACGTGTTCCAGAATCAAACTAGGGATCGTGACTT

                                                                                               68200

TTATAAGATTAAGATAAAAATAATAATTTCTAGCTTTATTCTGTTATAGACCAGGAGGTGGGGGGGGGAGGTCCTGTAAAAATTCTGCTTTGAAATCTTT

AATATTCTAATTCTATTTTTATTTATTAAAGATCGAAATAAGACAATATCTGGTCCTCCACCCCCCCCCTCCAGGACATTTTAAGACGAAACTTTAGAAA

                                           >5 ′ armF

                                              ｜

                                              ｜                                               68300

ATTGAGAATTTTCTTGGTGGTTTACTATGTCACTATTTCTTTAAATGAATCTATGGATACCTGTGCTTCTGTCTCCACTTCAGCCCTTGGCTGCTGGATT

TAACTCTTAAAAGAACCACCAAATGATACAGTGATAAAGAAATTTACTTAGATACCTATGGACACGAAGACAGAGGTGAAGTCGGGAACCGACGACCTAA

                                                                                               68400

CACACAGCCTTAGTTAGATGTCTCAGGCCTTCCGGTGTTCTCATTCTCTTTATCCCTGTATCCTGGATGCTACTGTGTGATAATATTGAGATAGTGGGTC

GTGTGTCGGAATCAATCTACAGAGTCCGGAAGGCCACAAGAGTAAGAGAAATAGGGACATAGGACCTACGATGACACACTATTATAACTCTATCACCCAG

                                                                                               68500

AGCCAGGCCCCTGCTGTTAGAAGCTTAATACTTTGTAAFTATTTATCCAACTATTTTCTTTTTATATGCTGATTCTACATACAACACCATTGAATGGTTA

TCGGTCCGGAGGACGACAATCTTCCGATTATGAAACATTATAAATAGGTTCATAAAACAAAAATATACGACTAAGATGTATGTTCTGGTAACTTACCAAT

                                                                                               68600

GTTTATTGAAGTCCGAGCTCTGCTCCAAGCTCATTACAGACTTGACATDCACCAATGGATGGTAGACTTTGCCATCTCCTGCTTGTCTACACTTTTCAGA

CAAATAACTTCAGGCRCAGACGAGGTTCGAGTAATGTCTGAACTGACTTACTGGTACCTACCATCTGAAACGGTAGAGGACGAACAGATGTGAAAAGTCT

                                                                                               68780

AGTTAACGTTGATGTTAGCACCTCAACAGATTACGAATTAACCAACATCTTCCCACCCTGCCCCCCAAAGACCAAAGGCTGTACTCTGGCAGCCTTGGGG

TCAATTGCAACTACAATCGTGGAGTTGTCTAATGCTTAATTGGTTGTAGAAGGGTGGGACGGGGGGTTTCTGCTTTCCGACATGAGACCGTCGGAACCCC

                                                                                               68800

GCCAGCAAGCTTCTGAAGACCCTTTAAGAACCAAAGTAAGAAGATATCAACGCTGCTGGGAATCGGAGGAACTGGCATGAATATGAGACCCGAGCAGTGG

CGGTCGTTCGAAGACTTCTGGGACCGGTTTCAATTCTTACTATAGTTGCGACGACCCCTTAGCCTCCTTGACCGGTTACTTATACTCTGGGCTCGTCACC

                                                                                               68900

GTGAGCGCACTGTAGTGTATGCCAATCTATCGCACCTAGAAGGCTTGCGGTGGGGGAGGGTAGAAGGAGCTGTTTTAGATAAGGAGAGGTAGAGAGAGGA

CACTCGCGTGACATCACATACGGTTAGATAGCGTGGATCTTCCGAACGCCACCCCCTCCCATCTTCCTCGACAAAATCTATTCCTCTCCATCTCTCTCCT

                                                                                               69000

TCAGAGAGGGAAGGGGCCGTGCCAGGTGTTGAAGGCAGATGAATTCCATAAGCATTTATCAACACCCTCTGCATTAAAGGGCCCCACTGACTATGTGTGT

AGTCTCTCCCTTCCCCGGCACGGTCCACAACTTCCGTCTACTTAAGGTATTCGTAAATAGTTGTGGGAGACGTAATTTCCCGGGTGACTGCATACACACA

                                                                                               69100

CTAAAGAAACACCCATGTAGTGAGGCTTATATTTGGACAGCTTTCTCTATGCTTCTGTCTGCCTGGATCCTCGTGCCCAATCTGTTCAGTTTTTGACTGG

GATTTCTTTGTGGGTACATCACTCCGAATATAAACCTGTCGAAAGAGATACGAAGACAGACGGACCTAGGADGCACGGGATTAGACAAGTCAAAAAGACC

                                                                                               69200

GGCTAGGCAGGCCACATCTCATGTCTGCCAGCTGAGCCCAGCTCTCCCTACCCTGATGATACAGAGTTGTTACCGAGTCTTTACAGCAATGATGAACACT

CCGATCCCTCCGGTGTAGAGTACAGACGGTCGACTCGGGTCGAGAGGGATGGGACTACTATGTCTCAACAAGTGGCTCACAATGTCGTTACTACTTCTCA

                                                                                               69300

TGGCAGAACAGCTACTGGGTCTACTCCTGCGAAGCTGGGGTGGGAGCAACTGTCTGGAGCTGGCAGTGGAGGCTACAGATCAGCATTTCATCGCTCAGCC

ACCGTCTTGTCGATGACCAGATGAGGACGCTTCGGACCCCACCCTCGTTGACAGACCTCGACCGTCACCTCCGATGTTAGTCGTAAAAGTAGCGAGTCGG

                                                                                               69400

TGGGGTCCAGGTAAGAAAAAGCCAGCACCTGAAAAATGTACCCAGGAATGGGCTATCAGTAGCATTAAGAAAATGACATTAAAAGTCCGCATTTCCCAAC

ACCCCAGGTCCATTCTTTTTCGGTCCTGGACTTTTACATGGGTCCTTTACCCGATAGTCATCGTAATTCTTTTACTGTAATTTTCAGGCGTAAAGCGTTG

                                                                                               69500

CCGTTGTAAAAAACATTGAGGGAGTACCTCGGTGAAAGGTGAAAGACGGTGACACATTAAGCTTTTGTGAAAAGTCTTACCTTAAGAGATGGCAAAGGAA

GGCACATTTTTTGTAACTCCCTCATGGACCCACTTTCACACTTTCTGCCACTGTGTAATTCGAAAACACTTTTCAGAATGGATTCTCATACCGTTTCCTT

                                                                                               69600

TGCATCAGTTAGCTTTTCCATGACTGTAGTAAAATGCCTGAGGTGGTCAACATAAAAAGAGGAAAGGTTTATTTGACAAACAGTGTTTGGAGTTTTAGTT

ACGTAGTCAATCGAAAGGTACTGACATCATTTTACGGACTCCACCAGTTGTATTTTCTCCTTTCCAAATAAAACTGTTTGTCACAAACCTCAAAATCAAA

                                                                                               69700

TATGGTAGGTTGTGCTCATTGCTTCTGGGTTCATGATGAAGCAGACATTACGGCCAGAGCATGGTAGAGGTAGACATTTACCTCATGACAGCCAGGAAGC

ATACCATCCAACACGAGTAAACGAAGACCCAAGTACTACTTCGTCTCTAATGCGGTCTCGTACCATCTCCATCTGTAAATGGAGTACTCTCGGTCCTTCG

                                                                                               69800

AAATGATGAGAAAGAGGAGGACCCAAAGTCCCTTCAATGATGTTACCTCAATGGTCTAAAATCTTTCCCCTAGACTTCAACATCTTAAAGACATGCACTA

TTTTACTACTCTTTCTCCTCCTGGGTTTCAGGGAAGTTACTACAATGGAGTTACCAGATTTTAGAAAGGGGATCTGAAGTTGTAGAATTTCTGACGTGAT

                                                                                               69900

CCTTCCAAAGTGTCATAACTGGAAACTATGTCTTTTCGGGTATGGACTCGAAAAATATTTAAGACACAAACCACAGTGTGATGCCTAGCTTTAATTGTAA

GGAAGGGTTTCACAGTATGACCTTTGATACAGAAAGCCCATACCTGGGAAGCTTTTATAAATTCTGTGTTTGGTGTCACACTACGATCGAAATTAACATT

                                                                                               70000

ACTTAATGATTTATAGAATCACCTAGGGAAGAGTCTCAGGGAAGGGTTGCCTAGTTCAGTGCTGTGGGCAGTTTAACTGCCTTGTGGTTGCCTTGATCAG

TGAATTATCTAATATCTTAGTGGATCCTTCTCAGAGTCCCTTCCCAACGGATCAAGTCACAGACACCCGTCAAATTGACGGAACACCAACGGAACTAGTC

                                                                                                70100

CTTCGTTGGTGTGGGAAGAAGACTCAGCCTACTATGGGTGGCACTATTTCCTAGATTTGGACCCTGGACTGTATAAGAGTAGAAGAAAGCTAGCTGAACAC

GAAGCAACCACACCCTTCTTCTGAGTCGGATGATACCCACCGTGATAAAGGATCTAAACCTGGGACC1GACATATTCTCATCTCTTTTCGATCGACTTGTG

                                                                                                78200

AAAGCATGGAATCACTTCTCTGCTTTTGATTGAGGATATGACATGACTCGCTGCCTCAAGTTCCTGCCTTGATTTTCCCCGCTGTGATGGACCATAAGGTG

TTTCGTACCTTAGTGAAGAGACGAAAACTAACTCCCTATACTGTACTGAGCGACGGAGTTCAAGGACGGAACTAAAGGGGCGACACTACCTGGTATTCCAC

                                                                                                70300

GAGCTGAGAGATAAGATAACCCTCATCTCCCCAAAGATGCTTTTTGTCAGGATATTTTTATCACAGTGACAGAAATGAAACCAAGACACATGGCAAGGAGA

CTCCGACTCTCTATTCTATTGGGAGTAGAGGGGTTTCTACGAAAAACAGTCCTATAAAATAGTGTCACTGTCTTTACTTTGGTTCTGTGTACCGTTCCTCT

                                                                                                70400

AAGAATTTGTTCGGTCTTCCACAAAGCAAATAGTACATTATAACGTTGGGTATCCTGCCTGGGTCTTAGTCTACTGAAGTAGATGTGAGATGATGAACCTC

TTCTTAACAAGCCAGAAGGTGTTTCGTTTATCATGTAATATTACGACCCATAGGACGGACCCAGAATCAGATGACTTCATCTACACTCTACTACCTTGGAG

                                                                                                70500

AGTTTCTCATCTGTGAAGTGGGGCATAGTTGTCTATACTAGTTCTCTTTCTGTTTATATTAGTTATCTTAAGTTACCTGACAGAGGCAACATAAGGGAAGA

TCAAAGAGTAGACACTTCACCCGTATCAACAGATATGATCAAGAGAAAGACAAATATAATCAATAGAATTCAATGGACTCTCATCCGTTGTATTCCCTTCT

                                                                                                70600

TAGATGTAGTTGGGCTCACAGTGTTAGCCCAACATGGTAGAGTTCATGGTGGTTACATTTCTCACTCCTGGTGGATGATGACGAAAGCAGAAAATGGGACT

ATCTACATCAACCCGAGTGTCACAATCGGGTGTACCATCTCAAGTACCACCAATGTAAAGAGTGAGGACCACCTACTACTCTCTTCGTCTTTTACCCTGAA

                                                                                                70700

AGAAACTGGGTTAGGCTATTACTTTAAGGGGCTCACCCTCAGTGTGCCCACCTCCACTTGTCTAGACTGGAGAATCTCCCCAAAACAGCACCACCAGTTAG

TCTTTGACCCAATCCGATAATGAAATTCCCCGAGTGGGAGTCACACGGGTGGAGGTGACAGATCATGACCTCTTAGAGGGGTTTTGTCGTGGTGGTCAAAC

                                                                                                70800

GGATGAGGTGTTCACACCCAGGAGCCTGTTCAAGCAGAAATAACAGGGGTTGTCAGAAGAGTTGCCATGGCGATGCCATGACATTCTATAAGAAAGGGGAG

CCTACTCCACAAGTGTGGGTCCTCGCGACAAGTTCGTCTTTATTGTCCCCAACAGTCTCTCAACGGTACCGCCGGACGGTAGTAAGATATTCTTTCCCCTC

                                                                                                70900

GTCAGCAGAGTCAGCTG CTTCCACCACAGCCATTATGAGTGATGGAGAAATCTTGAGATGGGTGAAGCTCTTCCTGAGGCAAGTTTAGCAAGCAGCAGCG

CAGTCGTCTCAGTCGACCCAAGGTGGTGTCGGTAATACTCACTACCTCTTTAGAACTCTACCCACTTCGAGAAGGACTCCGTTCAAATCGTTCGTCHTCGC

                                                                                                71000

TATAACCATGTTCACAGTTGCACTGGGATGTTTGTCTAACCAGGTAGCGATGCAGACGAGCCATGCCGGTTATGTGTTTTATCTGCAACCGTGTGTGTGGA

ATATTGGTACAAGTGTCAACGTGACCCTACAAACAGATTGGTCCATCGCTACGTCTGCTCGGTACGGCCAATACACAAAATAGFAAACGTGGCACACACCT

                                                                                                71100

AATGGGCATCATTCATTTTATATCGAGGACTCCGTGTTCAGAGACGTGCTAGAATATTTTCCATGCTTGCTTGCTAGGAAGTTGGAGCAACTGGGATTTAA

TTACCCGTAGTAAGTAAAATATAGCTCCTGAGGCACAAGTCTCTGCACGATCTTATAAAAGGTACGAACGAACGATCCTTCAACCTCCCGGACCCTAAATT

                                                                                                71200

TCCTCCATGGATTGCCTCCTGCTTCAAACTTTYGTACTCGGTGGCCACTAAAGAGACCTCAGATGAGGAGGCGGTGCTGTAAGCAGTTTGCTCTAGAGCTG

AGGAGGGTACCTAACGGAGGACGAAGTTTGAAACATGAGCCACCGGTCATTTCTCTGGAGTCTACTCCTCCGCCACGACATTCGTCAAACGAGATCTCGAC

                                                                                                71300

AGCTGGAGGTGATTAGTGGGCAGTGAGCTGTGGGAGGAAGGAGAAGACATGCTGTGATGAGAGGGGTGGTGTCCCTGGGAGTTCTTGGGCAGCCTCCAGGT

TCGACCTCCACTAATCACCCGTCACTCGACACCCTCCTTCCTCTTCCTACGACACTACTCTCCCCACCACAGGGACCCTCAAGAAAACCGTCGGAGGTCCA

                                                                                                71400

CCCCTGTAGAGTGTGCCCCAAGCCCCAGGGTCATCATGCTACTTACTGGGTGCTCTTTCCGGGGTCCAGCTTGCCCCTCCTTGGTCAAAGCACGCACCTGT

GGGGACATCTCACACGGGGGTTCGGGGTCCCAGTAGTACGATGAATGACCCACGAGAAAGGCCCCAGGTCGAACGGGGAGGAACCAGTTCGTGCGTGGACA

                                                                                                71500

GGAGCATCCCCAAGAGGATATAGCAGGACGAGCACACAGGAGAAGCACGTGGCGCTTGCCATCTTTCTAATAGAAGAGGAGATGCAGCCTCTGTGGGCATA

CCTCGTAGGGGTTCTCCTATATCGTCCTGCTCGTGTGTCCTCTTCGTGCACCGCGAACGGTAGAAAGATTATCTTCTCCTCTACGTCCAAGACACCCGTAT

                                                                                                71600

GCACACCAGTCTCAGTCTCTTCATGGACCTCAGCTTTCCCTTACTCTGCCTTCTTCATGCCAACCCCACTTTGGCTGGTGTTTTCCCCAGCCCCTGTGAGG

CGTGTGGTCAGAGAGTCAGAGAAGTACCTGGAGTCGAAAGGGAATGAGACGGAAGAAGTACGGTTGGGGTGAAACCGHACCACAAAAGGGGTCGACACTCC

                                                                                                71700

TTTATTATTTTGTTTGTTTGCTTTGGTATAGTCATCTATCTTTTGGTAGCAATGTGATGTTTCACATCTCTGCCATCAATGGAAACCCTTTTCTGCCCCCA

AAATAATAAAACAAACAAAC1AAACCATATCAGAGATAGAAAACCATCGTTACACTACAAAGTGTAGAGACGGTAGTTTACCTTTGGGAAAAGACGGGGGT

                                                                                                71800

CCTTTTGGGGGCTGGTAAGGAGAGTCAGCAGTTGTCTTTGTGCACTCCATCTTGGTTTTACTTCGGCCCTTTTTCTTCTCGACTTCCTTTTAGCTTCCAAA

GGAAAACCCCCGACCATTCCTCTCAGTCGTCAACAGAAACACGTGAGGTAGAACCAAAATGAAGCCGGGAAAAAGAAGACAAGAAGGAAAATCGAAGGTTT

                                                                                                71900

TAAAAGCACCCCATCTGCCTCCAGCTAGGAGCCCTGGAGACTCAGCAGACTGCACTGGGGGCCCTGTCTTTAAAAACTTAGTGCTCCCCAAAGAGAGGGGG

ATTTTCGTGGGGTAGACGGAGGTCGATCCTCGGGACCTCTGAGTCGTCTGACGTGACCGGGACAGAAATTTGAATCACAGGGGAATTCTCCTCCCCCGAAC

                                                                                                72000

AAACATGCTTGTTTAAACTAAGCTTACACAGATAAAAACTATAGTGGTTAAAAATTCATAGGTTTGGTGAATTTTCACTCACATAA0CCAGCTCTTTTAAA

TTTGTACGAACAAATTTGATTCGAATGTGTCTATTTTTGATATCACCAATTTTTAAGTATCCAAACCACTTAAAAGTGAGTGTATTGTGTCGAGAAAATTT

                                                                                                72100

GCACATAGAACTGAACTTAGGGGAAAAAATACTTAAAAATCAAACAGAATTTTAAGTTGTTTCTTCATGCATTAAGATCCAGACAATATTCTAAAAGATTG

CGTGTATCTTGACTTGAATCCCCTTTTTATGAATTTTTTACTTTGTCTTAAAATTCAACAAAGAAGTACGTAATTCTAGGTCTGTTATAAGATTTTCTAAC

                                                                                                72200

AAGACGTGGATGTGGGGGTGGGGGTTACATATTTTGGGAGTGGGCAGCGCTGAGGAGAAGGGCCTGTCCTGTCCATGTACTTACATCAATAAAGACTGTGT

TTCTGCACCTACACCCCCAATCTATAAAACCCTCACCCGTCCCGACTCCTCTTCCCGGGACAGGACAGGGGGTACATGAATGTAGTTATTTCTGAAACACA

                                                             shecF

                                                               |

                                                        <5′armR    >TM

                                                            |  |    |

                                                            |  |    |                           72300

TCCCTGTCTCTGTTTCCTCCTAGAATTTCCTTTTCTAAGCAATGGTATGGAGAGATTTCCCGAGACACGAAGAACTGGAACATTATCCTGTGTCTATTCAT

AGGGACAGAGACAAAGGAGGATCTTAAAGGAAAGATTCGTTACCATACCTCTCTAAAGGGCTCTGTGCTTCTTGACCTTCTAATAGGACACAGATAAGTA

                        N  F  L  S  K  Q  W  Y  G  E  I  S  R  G  T  K  N  W  K  I I   L  C  L  F  I>

                          __________________________________________________________________________>

                                                                                               72400

CATCCCCTTAGTGGGCTGTGGCCTCGTATCATTTAGGTGTGGACTGGGGCATCTAATCTTGTGTGTGAGCATCTTTGAGTATTTTTGAGCAATTGTGTAA

GTAGGGCAATCACCCGACACCGGAGCATAGTAAATCCACACCTGACCCCGTAGATTAGAACACACACTCCTAGAAACTCATAAAAACTCGTAAACACATT

  I  P  L  V  G  C  G  L  V  S  F  X>

___________________________>

                                                        >3′armF                         <hetR

                                                            |                              |

                                                            |                              |  72500

ATGGAGTGTTCACTGTGGCATCTGTGTGCTCAGCCCAGCATCTTTCCTGGCTTTTCCTAGGTAGGGTTTCAAGCAGGTGGTACTGAGGTTGTCTTCAGTA

TACCTCACAAGTGACACCGTAGACACACGAGTCGGGTCGTAGAAAGGACCGAAAAGGATCCATCCCAAAG1TCGTCCACCATGACTCCAACAGAAGTCAT

                                                                                               72600

TATGAGGCTGAATTTGGATTCTCCGATCAGAAAGGGGGAGGGGGGGCTGAGTGTTGGCTAGGTCAGCCTTTGGGGATCCAGTTTTTGTCCTCTGTTCCTT

AATACTCCGACTTAAACCTAAGAGGCTAGTCTTTCCCCCTCCCCCCCGACTCACAACCGATCCAGTCGGAACCCTAGCTCAAAACAGGACAGACAAGGAA

                                                                                               72700

GTCTATGGTAGGAAGCAAGCCATGGTTCCCCCCACCCCTCCTTTCTCACTCTTTCTGTGTTCTCTCTGTGTCTGCATGTACAAGTGCCCCATGTGAGTGT

CAGATACCATCCTTCGTTCGGTACCAAGGGGGGTGGGGAGGAAAGAGTGAGAAAGACACACAGAGACACACACACGTACATGTTCACCTACACACTCACA

                                                                                               72800

GTGAATACAAGTGTGAGTGACTGTGTGTGTGCACATGTATAGTATGTGTGTCTGTGAGTACATATGTCTGTGGTGGAGTAGGCATGCATGATGTGTAAGT

CACTTATGTCACACTCACTGACACACACACGTGTACATAATCATACACACAGACACTCATGTATAACAGACACACTCATCCGTACGTACATACACATTCA

                                                                                               72900

ATACAAGTATGTGTGTTTGTGATGTGTAATTTGTGACCGTGTCAGTGTGTATAAATGTACCTGAGTATGTGAAAGGTATATGTGTGTGCCAGTGTGTGCG

TATGTTCATACACACAAACACTACACATAAACACTGGCACAGTCACACATATTTACATGGACTCATACACTTTCTCATATACACACACGGTCACACACGC

                                                                                               73000

AGTGAATGTGACTGGTGACACTCCCCTGCCTCTGACTCTGTCTAGGAAGAACCCATTGACAAGCACAAGAAGCTGCTGTGGTACTATTGTGGCCTTCTTC

TCACTTACACTGACCACTCTGAGGGGACGGAGACTGAGACAGATCCTTCTTTGGGTAACTGTTCGTGTTCTTCGACGACACCATGATACACCGGAAGAAG

                                                                                               73100

ACGTCGCCCTTCGTGGTCTTCTCCTGGAACGTGGTCTTCTACATCGCCTTCCTCCTGCTGTTTGCCTATGTGCTGCTCATGGACTTCCACTCAGTGCCAC

TGCAGCGCGAAGCACCAGAAGAGCACCTTGCACCAGAAGATGTAGCGGAAGGAGGACGACAAACGGATACACGACGAGTACCTTAGGGTGAGTCACGGTG

                                                                                               73200

ACACCCCCGAGCTGATCCTCTACGCCCTGGTCTTCGTCCTCTTCTGTGATGAAGTGAGGCAGGTAGGCAAGTGCAGCGTCGCTCTTTCCAGGGAGATCTG

TGTGGGGGCTCCACTAGGAGATGCGCGACCAGAAGCAGGAGAAGACACTACTTCACTCCGTCCATCCGTTCACGTCGCAGCGAGAAAGGTCCCTCTACAC

                                                                                               73300

GATACATGTCTGCTCATCCCAGACGGACATGATTCCACACAAGGCTGGTCTATGGAGCTGGTGAGTTTACTGGGGTAAATGTCAAGAGAGAATCTGCATC

CTATGTACAGACGAGTAGGGTCTGCCTCTACTAAGGTGTGTTCCGACCAGATACCTCGACCACTCAAATGACCCCATTTACAGTTCTCTCGTAGACGTAG

                                                                                               73400

ATCAAAAGCCCACCCAAACGACTCATCAAAGCTGCGTCACGGGAGCTCAAAGTCCAATCTGTGAGCAAATTTCTCCACTGAAGAAGCCTGTCCCCAGCAA

TAGTTTTC GGGTGGGGTTTGCTGAGTACTTTCGACGCAGTGCCCTCGAGTTTCAGGTTAGACACTVGTTTAAAGAGGTGACTTCTGGACAGGGGTCGTT

                                                                                               73500

TGGTTGATCATCAGTTTCCTGGGATGTGCATATTTTAGGATCTTTGCTTCACCATTGAATCCAAACTCTACCCCAGCCCTCATAGAGCAGGTGCATCTTA

ACCAACTAGTAGTCAAAGGACCCTACACGTATAAAATCCTAGAAACGAAGTGGTAACTTAGGTTTGAGATGGGGTCGGGAGTATCTCGTCCACGTAGAAT

                                                                                               73600

GTTTGGGTTTTACTGCTGTGAACAGACACCATGACCAAGGCAACTTTTATAAATGACATCATTTAACGGGCTGGCTTACAGGTTTAGAGGTTCAGTCCAT

CAAACCCAAAATGACGACACTTGTCTGTGGTACTGGTTCCGTTGAAAATATTTACTGTAGTAAATTGCCCGACCGAATGTCCAAATCTCCAAGTCAGGTA

                                                                                               73700

TATCGCCAAGGTGGGAAATGGCAGCAACTAGGCATGCTGCAGGAGGATCTGAGAGTTCTACCTCTTCATATGAAGGCTGCTAGTGGAAGGCTGACTCCCA

ATAGCGGTTCCACCCTTTACCGTCGTTGATCCGTACCACGTCCTCCTAGACTCTCAAGATGCAGAAGTATACTTCCGACGATCACCTTCCGACTGAGGGT

                                                                                               73800

AGCAGCTAGAGCAAGGGTATTAAAGCCCACACCCACCAGGCCACACCTACTCCAATAAGACCATACCTCCCAACAGTGCTACTCCCTGGGCCAAGCATTA

TCGTCGATCTCGTTCCCATAATTTCGGGTGTGGGTGGTCCGGTGTGGATGAGGTTATTCTGGTATGGAGGGTTGTCACGATGAGGGACCCGGTTCGTAAT

                                                                                               73900

CAAACCATCACACTGAGGTAGCAGATGTTGAAGAAATGTTTGTTGTTGGTGAAGGAGGTGCTGTCCTGACTCATGGTGGAAAATGTCTCAGCAAGTCCTA

GTTTGGTAGTGGTGACTCCATCGTCTACAACTTCTTTACAAACAACAACCACTTCCTCCACGACAGGACTGAGTACCACCTTTACAGAGTCGTTCAGGAT

                                                                                               74000

TCAGATTTATCTGTCACTCTCTTTGTCTCTTCTGGGACCCGAACCTTAAAATATACCCATTTAGCAAGTATTTGTTAGGATCAACTCATGGAGTATTTAC

AGTCTAAATAGACAGTGAGAGAACAGAGAAGACCTGGGCTTGGAATTTTATATGGGTAAATCGTTCATAAACAATCCATATGTTGAGTACCTCATAAATG

                     <3′armR                          <3′scr

                         |                               |

                         |                               |                                     74100

AGATTACAAAGTACAAGGCTCAGGGGTGGAAGAGATTTGAAGGGGAAACATACTGCCTTTGCCCTGACTAGCTAAGAACACTAGAGTTGGCTTATGTTGT

TCTAATGTTTCATGTTCCGAGTCCCCACCTTCTCTAAACTTCCCCTTTGTATGACGGAAACGGGACTGATCAGATTCTTGTGACTCAACCCAATACAACA

             >3′pTF

               |

               |                                                                               74200

CATCCCAACTCTCTCTGGTAGATTTTTTATGTGCAGTCTCCAGGACTCCTGGATTGCGAGGGATTCTGGGGCCCTCTGTCAATCTTAGTATGTCTTAATC

GTACGGTTGAGAGAGACCATCTAAAAATACACGTCAGAGGTCCTGAGGACCTAACGCTCCCTAAGACCCCGGGAGACAGTTAAGAATCATACAGAATTAG

                                                                                               74300

AATTAATGATGTCTGCTATGGAAGTGAGGGCTGGGGGGGGGGGGTTGGGTACCTGTGCCCTATATGCCTGTCTTTATGATTAGTAGGTAAGTGGTGTGGA

TTAATACTACAGACGATACCTTCACTCCCGACCCCCCCCCCCCAACCCATGGACACGGGATATACGGACAGAAATACTAATCATCCATTACACCACACCT

      <3′prR

        |

        |                                                                                      74000

AGATGGTGGAACGTCAGCAGAGGTGGAGGAAGAAACACACAGGATGGCCGGAGTACCAGTGTACTGACTATAGTTCTGGAAGGCAGAAGTACCAACGTGA

TCTACCACCTTGCAGTCGTCTCCAC CTCCTTCTTTTGTGTGTCCTACCGGCCTCATGGTCACATGACTGATATCAAGACCTTCCGTCTTCAGAGTTGCA

Claims (28)

1.具有功能性缺损的内源TrpM8基因的转基因非人类动物，其中该TrpM8基因包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。

2.权利要求1所述的转基因非人类动物，其在TrpM8基因或其部分中具有缺失。

3.权利要求1或2所述的转基因非人动物，其显示下列表型中的任何一种或组合：

与野生型动物相比

(a)对疼痛的敏感性降低，优选如甩尾试验所测量；

(b)紧张度下降，优选如开放区域试验所测量；

(c)血浆皮质酮水平降低。

4.转基因的非人类动物，其中该动物TrpM8基因的至少部分或全部被来自另一动物，优选另一物种，更优选人类的TrpM8基因的序列替代。

5.前述任何权利要求所述的转基因非人类动物，其为鼠类。

6.权利要求5所述的转基因非人类动物，其包含功能性缺损的TrpM8基因，优选在TrpM8基因中有缺失，其中该TrpM8基因包含SEQ ID NO：4所示的核酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。

7.分离的细胞或组织，其来自任何前述权利要求所述的非人类转基因动物。

8.具有功能性缺损的内源TrpM8基因的细胞，其中该TrpM8基因包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。

9.权利要求1至6中任一项所述的转基因非人类动物、权利要求7所述的细胞或组织或权利要求8所述的细胞作为疼痛或紧张模型的用途。

10.权利要求1至6中任一项所述的转基因非人类动物、权利要求7所述的细胞或组织或权利要求8所述的细胞作为TrpM8相关疾病的模型的用途。

11.权利要求1至6中任一项所述的非人类转基因动物、权利要求7所述的分离的细胞或组织、或权利要求8所述的细胞在鉴定TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的方法中的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO：3或SEQID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。

12.鉴定TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列，该方法包括将候选化合物施用于动物，优选野生型动物或权利要求1至6中任一项所述的转基因非人类动物，并且测量下列任一表型的变化：(a)对疼痛的敏感性，优选如甩尾试验所测量；(b)紧张，优选如开放区域试验所测量；和(c)血浆皮质酮水平。

13.鉴定权利要求12所述的TrpM8多肽激动剂的方法，包括鉴定能够使动物显示出表型(a)-(c)中的任何一种增强的候选化合物。

14.鉴定权利要求12所述的TrpM8多肽拮抗剂的方法，包括鉴定能够使动物显示出表型(a)-(c)中的任何一种或这种表型的减弱的候选化合物。

15.鉴定TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的方法，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列，该方法包括将候选化合物暴露于细胞或组织，优选野生型细胞或组织、或权利要求7所述的细胞或组织、或权利要求8所述的细胞，并且测量所述细胞或所述组织的细胞的电导或胞内钙浓度的变化。

16.鉴定权利要求15所述的TrpM8多肽激动剂的方法，包括鉴定能够提高细胞的电导或胞内钙浓度的候选化合物。

17.鉴定权利要求15所述的TrpM8多肽拮抗剂的方法，包括鉴定能够降低细胞的电导或胞内钙浓度的候选化合物。

18.鉴定适于治疗或缓解疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的化合物的方法，该方法包括将包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列的TrpM8多肽暴露于候选化合物，并且确定该候选化合物是否是TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂。

19.TrpM8多核苷酸用于鉴定治疗疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的TrpM8多核苷酸的激动剂或拮抗剂的用途，所述TrpM8多核苷酸包含SEQID NO：1、SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示核酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。

20.TrpM8多肽用于鉴定治疗疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的TrpM8多肽的激动剂或拮抗剂的用途，所述TrpM8多肽包含SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。

21.具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列的TrpM8多肽的拮抗剂，该拮抗剂用于治疗个体中疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的方法中。

22.TrpM8多肽的拮抗剂在制备用于治疗个体中疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的药物组合物中的用途，所述TrpM8多肽具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列或与其具有至少70％序列同一性的序列。

23.治疗患有疼痛或紧张，优选患有TrpM8相关疾病的个体的方法，该方法包括将TrpM8的拮抗剂施用于该个体。

24.诊断个体中疼痛或紧张，优选TrpM8相关疾病的方法，该方法包括检测个体或其组织或细胞中TrpM8的表达、水平或活性的变化。

25.权利要求10、19、20或22所述的用途、权利要求18、23或24所述的方法、或权利要求21所述的拮抗剂，其中该TrpM8相关疾病选自：疼痛、癌症、炎症、炎症性肠疾病、热痛觉过敏、viseral疼痛、偏头痛、带状疱疹后神经痛(post herpatic neuralgia)、糖尿病神经痛、三叉神经痛、术后疼痛、骨性关节炎、类风湿性关节炎、急性疼痛、慢性疼痛、皮肤疼痛、躯体痛、内脏痛、牵涉痛，包括心肌缺血所致的牵涉痛、幻觉痛、神经病变痛(神经痛)，由损伤、疾病产生的疼痛、头疼、偏头疼、癌症疼痛、由神经疾病如帕金森病产生的疼痛、由脊椎和外周神经手术、脑肿瘤、创伤性脑损伤(TBI)、脊髓创伤产生的疼痛、慢性疼痛综合症、慢性疲劳综合症、神经痛例如三叉神经痛、舌咽神经痛、带状疱疹后神经痛(postherpeticneuralgia)和灼痛、由狼疮、结节病、蛛网膜炎、关节炎、风湿性疾病产生的疼痛、周期性疼痛、背痛、下背痛、关节痛、腹痛、胸痛、分娩痛、肌肉骨骼和皮肤病、糖尿病、头外伤、和纤维肌痛、乳腺、前列腺、结肠、肺、卵巢、和骨的癌症、社交焦虑症、创伤后神经紧张性障碍、恐惧症、社交恐惧症、特定恐惧症、惊恐症、强迫症、急性紧张、紊乱、离别性焦虑症、广泛性焦虑症、重症抑郁、精神抑郁症、双相性精神障碍、季节性情感障碍、产后抑郁症、躁狂忧郁症、双相性抑郁症。

26.包含SEQ ID NO.3或SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的TrpM8多肽，或与其具有至少70％序列同一性的同源物、变体或衍生物。

27.编码权利要求26所述多肽的核酸。

28.权利要求27所述的核酸，其包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所示的核酸序列，或与其具有至少70％序列同一性的同源物同源物、变体或衍生物。

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