JP2001516221A

JP2001516221A - 哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター

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Publication number: JP2001516221A
Application number: JP54053998A
Authority: JP
Inventors: レフ，ミッチェル・イー; バーネット，リチャード・スペンス; マクラクラン，カレン・レッタ
Original assignee: アイデック・ファーマシューティカルズ・コーポレイション
Priority date: 1997-03-14
Filing date: 1998-03-09
Publication date: 2001-09-25
Anticipated expiration: 2018-03-09
Also published as: CZ293355B6; CN1255166A; NO994397D0; IN189732B; ID24565A; BR9808584A; RU2004107694A; JP4128227B2; PT981637E; CA2283740C; PL335695A1; RO120148B1; TWI232239B; ATE296356T1; US20020192820A1; CN1175111C; EP0981637A1; PL191251B1; NO994397L; EP0981637B1

Abstract

(57)【要約】相同組換えにより哺乳類細胞の標的部位における所望のDNAの部位特異的組込みを達成する方法が記述されている。この方法では、マーカープラスミドで予め標識された所定の転写活性部位に所望のDNAが組み込まれた細胞株の再現性ある選択が可能である。本方法は高レベルの哺乳類タンパク質（具体的には免疫グロブリン）を分泌する哺乳類細胞株の作出にとりわけ適している。本クローニング法で使用されるベクターとベクターの組合せも提供される。

Description

【発明の詳細な説明】哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって遺伝子を組み込む方法とそれを実施するためのベクター発明の分野本発明は、所望の外因性DNAの組込みを哺乳類細胞のゲノム内の特定位置に向ける方法に関する。より具体的には、本発明は、哺乳類ゲノム中の転写活性な標的部位（「ホットスポット」）を同定し、所望のDNAをその部位に相同組換えによって挿入するための新しい方法を記述する。また本発明は、随意に、増幅可能な選択可能マーカー（例えばDHFR）を外因性DNAと組み合わせて同時に組み込むことにより、その位置における所望のDNAの遺伝子増幅を可能にする。更に本発明は、その実施に適した新規ベクターの構築を記述し、更に、その方法によって製造される、標的ホットスポットに組み込まれた所望の外因性DNAを含有する哺乳類細胞株を提供する。背景組換えタンパク質を原核生物と真核生物の両方で発現させる技術は十分に確立されている。哺乳類細胞はタンパク質生産に関して、しばしば、細菌や酵母との比較で、組換え発現されたタンパク質を正しく組み立て、グリコシル化し、翻訳後修飾するというそれらの能力から生じる際立った利点を提供する。組換え発現コンストラクトは、宿主細胞へのトランスフェクション後に、染色体外要素として維持されることができ、若しくは宿主細胞ゲノムに組み込まれうる。安定にトランスフェクトされた哺乳類細胞株の作出には、通常、後者が必要であり、目的の遺伝子をコードするDNAコンストラクトは薬物耐性遺伝子（優性選択可能マーカー）と共に宿主細胞に導入され、次いでその薬物の存在下での生育が、その外因性DNAをうまく組み込んでいる細胞の選択を可能にする。多くの場合、目的の遺伝子は、後に遺伝子増幅にかけることができる薬物耐性選択可能マーカーに連結される。この目的にはジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）をコードする遺伝子が最もよく使用される。DHFRの拮抗阻害剤メトトレキセートの存在下での細胞の生育は、DHFR遺伝子の増幅によるDHFR産生量の増加をもたらす。DNAの隣接領域も増幅されることになるので、結果として起こるトランスフェクト細胞株でのDH FR連結遺伝子の同時増幅がタンパク質産生量の増加につながり、その結果、目的遺伝子の高レベル発現が起こりうる。この方法はうまくいくことが証明されているが、組込み事象のランダム性ゆえに、この系には多くの課題がある。これらの課題は、発現レベルがその遺伝子座における局所的遺伝子環境の効果（これは文献に詳しく論じられている現象で、一般に「位置効果」と呼ばれる）による影響を著しく受けるために生じる（例えば、Al-Shawiら，Mol.Cell.Biol.,10:1192-1198(1990)やYoshimuraら,Mol.Cel.B iol.,7:1296-1299(1987)を参照されたい）。哺乳類DNAの大部分は転写的に不活性な状態にあるので、ランダム組込み法は組み込まれたDNAの転写的運命に何の制御も与えない。その結果、組込みの部位に依存して、組み込まれた遺伝子の発現レベルに幅広い変動が起こりうる。例えばゲノムの不活性な領域又は転写的に「サイレント」な領域への外因性DNAの組込みは、発現をほとんど又は全くもたらさないことになる。これに対し、転写活性部位への組込みは高発現をもたらしうる。したがって、その作業の目的が、遺伝子操作法の望ましい成果が一般にそうであるように、高レベルな遺伝子発現を得ることである場合は、そのような高産生クローンを見つけるために多数のトランスフェクタントをスクリーニングすることが一般に必要である。また、ゲノムへの外因性DNAのランダム組込みは、場合によっては、重要な細胞性遺伝子を分断し、その結果、表現型を変化させることもある。これらの要因は、高発現性の安定な哺乳類細胞株の作出を複雑で面倒な工程にしうる。最近、我々の研究室は、翻訳上欠陥を持つ優性選択可能マーカーを含有するDN Aベクターを哺乳類遺伝子発現に使用することを記述した。（これは1993年11月3 日に出願され最近特許された米国出願番号第08/147,696号に開示されている。）これらのベクターは、DHFR遺伝子が目的の１又は複数の遺伝子と共に挿入されるイントロンを含むように人工的に操作された、翻訳欠陥ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（neo）遺伝子を優性選択可能マーカーとして含有する。これらのベクターの発現コンストラクトとしての使用は、生成する薬物耐性コロニーの総数を有意に減少させ、その結果、従来の哺乳類発現ベクターと比較して、スクリーニング手続きを容易にすることが見出されている。更に、この系を使って得られるクローンはかなりの割合で高発現クローンである。これらの結果は、そのneo選択可能マーカーに施された修飾に起因するらしい。このneo遺伝子の翻訳上の欠陥ゆえに、トランスフェクト細胞は薬物選択を生き残るのに十分なneoタンパク質を産生せず、したがって薬物耐性コロニーの総数が減少する。そのうえ、生き残ったクローンは、より高い割合で、基礎転写レベルが高くてneoの過剰産生をもたらすゲノムの部位に組み込まれた発現ベクターを含有し、それによって、それらの細胞にそのneo遺伝子の欠陥を克服させる。同時に、neoに連結された目的遺伝子は、同様に上昇したレベルの転写を受けるだろう。この利点は、ne o内に作成した人工的イントロンの結果としても予想通りである。生残は機能的n eo遺伝子の合成に依存し、そしてその合成はneoイントロンの正しく効率的なスプラインシングに依存する。そのうえ、これらの規準は、ベクターDNAが既に転写的に著しく活性な領域に組み込まれているのであれば、より満たされやすい。転写活性領域へのベクターの組込みに続いて、DHFR遺伝子の選択によって遺伝子増幅が行なわれる。この系の使用により、高レベルのタンパク質（＞55pg/細胞/日）を分泌するわずかなコピー数（＜10）のベクターを含有するクローンを、低濃度のメトトレキセート（50nM）を使った選択で得ることが可能になった。更に、これは比較的短期間で達成できる。したし、増幅の成功は変動的である。転写活性部位のいくかは増幅することができないので、ある特定部位からの増幅の頻度と程度は予測不可能である。全体として、これら翻訳欠陥ベクターの使用は、他のランダム組込み法と比較してかなりの改善にはなる。しかし上述のように、組込み部位に対する制御を欠くという課題は、依然として重要な問題である。ランダム組込みの課題を克服する一つの方法は、外因性DNAが宿主ゲノム内の特定の遺伝子座に誘導される遺伝子ターゲティングを用いることである。外因性 DNAは、発現ベクター中のDNAの配列とゲノム中の対応する相同配列との間で起こる相同組換えを利用して挿入される。しかし、このタイプの組換えは酵母と他の真菌生物ではもともと高い頻度で起こるが、高等真核生物では極めてまれな事象である。哺乳類細胞では、非相同組換え（ランダム組込み）に対して相同組換えの頻度は1/100から1/5000の範囲であると報告されている（例えば、Capecchi,Sc ience,244:1288-1292(1989);Morrow及びKucherlapati,Curr.Op.Biotech.,4:577- 582(1993)を参照されたい）。哺乳類細胞における相同組換えを記述した最も初期の報告の一つは、マウス線維芽細胞中に作成された人工系からなった（Thomasら,Cell,44:419-428(1986)）。突然変異させた非機能型のneo遺伝子が宿主ゲノムに組み込まれている細胞株が作成され、次いで異なる突然変異を含有するneoの第二の非機能的コピーによる標的とされた。機能的neo遺伝子の再構成は遺伝子ターゲティングによってのみ起こり得た。相同組換えはG418耐性細胞を選択することによって同定され、それら耐性クローンから単離されたゲノムDNAの分析によって確認された。最近、抗体分泌細胞の内在遺伝子座にある重鎖及び軽鎖免疫グロブリン遺伝子を置換するための相同組換えの使用が報告されている（Fellら、米国特許第5,20 2,238号（1993））。しかしこの方法は、免疫グロブリンを内因的に発現させる細胞（例えばB細胞や骨髄腫細胞）における免疫グロブリンの産生に限定されるので、これを広く応用することはできない。また、相同組換え後の同時増幅は含まれないので、発現は単コピー遺伝子レベルに限定される。この方法は、2つの独立した組込み事象（軽鎖遺伝子用の一事象と、それに続く重鎖遺伝子用の一事象）が機能的免疫グロブリンの産生に必要であるという事実により、さらに複雑なものになっている。このタイプの系のもうひとつの例は、免疫グロブリンが免疫グロブリンガンマ 2A遺伝子座への相同組換えによって発現されるNS/O細胞で報告されている（Holl isら、国際特許出願番号PCT/IB95（00014））。この部位から得られる発現レベルは極めて高く、単コピー成分からおよそ20pg/細胞/日だった。しかし、上述の例と同様に、この系では増幅可能遺伝子が同時に組み込まれないので、発現はこのレベルに制限される。また、他の研究者らによって、NS/O細胞で発現される組換えタンパク質の異常グリコシル化が報告されており（例えばFlesher ら,Biotech.and Bioeng.,48:399-407（1995）参照）、この方法の応用性はそれによって制限される。最近、バクテリオファージP1由来のcre-loxP組換え系が真核細胞における遺伝子ターゲティングの手段として改造され、使用されるようになった。具体的には、cre組換え酵素を用いたチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞ゲノムへの外因性DNAの部位特異的組込みと、一連のlox含有ベクターが記述されている（Fuku shige及びSauer,Proc.Natl.Acad Sci.USA,89:7905-7909（1992））。この系は、それが同じ染色体位置での再現性ある発現を与えるという点で興味深い。しかし、そこからの遺伝子発現が最適になる染色体部位を同定する努力はなされておらず、また上記の例と同様に、この系では発現が単コピーレベルに限定される。またこれは、哺乳類細胞中で機能的な組換え酵素を発現させる必要があるという事実によって複雑になる。また、導入されるDNA配列とその内因性染色体遺伝子座の間の相同組換えの使用は、酵母と同様に哺乳類細胞における遺伝子操作の有用な手段になるとも報告されている（例えば、Bradleyら,Meth.Enzymol.,223:855-879(1993)；Capecchi, Science,244:1288-1292(1989)；Rothsteinら,Meth.Enzymol.,194:281-301(1991) を参照されたい）。今までのところ、ほとんどの哺乳類遺伝子ターゲティングの研究は、マウス胚性幹（ES）細胞における遺伝子の破壊（「ノックアウト」）又は選択した標的遺伝子座の部位特異的突然変異誘発に向けられてきた。これら「ノックアウト」マウスモデルの作出は、科学者が特定の構造-機能問題を検討し、無数のマウス遺伝子の生物学的重要性を検討することを可能にしてきた。この研究分野は遺伝子治療への応用の可能性という点でも重要な意味を持っている。また最近、NSO細胞中の転写活性部位に向けられるとされ、遺伝子増幅を必要としないベクターが、Celltech（英国ケント）によって報告されている（Peakma nら,Hum.Antibod.Hybridomas,5:65-74（1994））。しかし、これら非増幅細胞における免疫グロブリン分泌のレベルが20pg/細胞/日を超えるという報告はなく、一方、増幅されたCHO細胞では100pg/細胞/日もの高レベルを達成できる（同上）。転写活性であることが知られているゲノム中の所定の部位への外因性DNAの組込みを再現性よく行ないうる遺伝子ターゲティング系を開発することは、極めて望ましいだろう。また、そのような遺伝子ターゲティング系が、組込み後に、挿入されたDNAの同時増幅も容易にするのであれば、好ましいだろう。そのような系の設計は、哺乳類細胞における任意の目的クローン化遺伝子の再現性ある高レベル発現を可能にし、多くの研究者にとって疑いもなく大いに興味あることだろう。本願において、我々は、2つの異なるベクターに含まれる2つの人工的基質間で起こる相同組換えに基づく新しい哺乳類発現系を提供する。具体的には、この系は、「マーキング（marking）」ベクター及び「ターゲティング（targeting）」ベクターと呼ばれる2つの新規哺乳類発現ベクターの組合せを使用する。本質的に、マーキングベクターは、哺乳類ゲノム中の転写活性である部位（すなわち、そこでの遺伝子発現レベルが高い部位）の同定と標識（マーキング）を可能にする。この部位はそのゲノム中の「ホットスポット」であるとみなしうる。マーキングベクターの組込み後、本発現系はもうひとつのDNA（すなわちターゲティングベクター）が、両ベクターに共通するDNA配列間で起こる相同組換えにより、その部位に組み込まれることを可能にする。この系は他の相同組換え系にまさる有意義な利点を提供する。哺乳類細胞で使用される他の相同系の大半とは異なり、この系はバックグラウンドを示さない。したがってベクターのランダム組込みを受けただけの細胞は選択に耐えない。それゆえ、ターゲティングプラスミドにクローニングされた任意の目的遺伝子は、標識されたホットスポットから高レベルで発現される。したがって本遺伝子発現法は、上に詳述したランダム組込みの系に内在する課題を実質上又は完全に排除する。さらにこの系は、哺乳類ゲノム中の同じ転写活性部位における任意の組換えタンパク質の再現性ある高レベル発現を提供する。また、増幅可能な優性選択可能マーカー（例えばDHFR）をマーキングベクターの一部として含めることにより、遺伝子増幅をその転写活性部位で達成することもできる。発明の目的したがって本発明の目的は、所望のDNAを哺乳類細胞内の特定部位に向かわせるための改良された方法を提供することである。より具体的な本発明の目的は、所望のDNAを哺乳類細胞内の特定部位に相同組換えによって向かわせるための新しい方法を提供することである。本発明のもう一つの具体的目的は、哺乳類細胞で所望のDNAの部位特異的組込みを達成するための新規ベクターを提供することである。本発明のさらなる目的は、高発現を与える所定の部位に組み込まれた所望のDN Aを含有する新規哺乳類細胞株を提供することである。より具体的な本発明の目的は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞で所望のDNAの部位特異的組込みを達成するための新しい方法を提供することである。本発明のもう一つの具体的目的は、哺乳類細胞で、免疫グロブリン遺伝子又は他の任意の遺伝子を、高発現を与える所定の染色体部位に組み込むための新しい方法を提供することである。本発明のもう一つの具体的目的は、哺乳類細胞中の高発現を与える所定の部位に免疫グロブリン遺伝子を組み込むのに適した新規ベクターとベクターの組合せを提供することである。本発明のもう一つの目的は、高発現を与える所定の部位に組み込まれた免疫グロブリン遺伝子を含有する哺乳類細胞株を提供することである。本発明のさらに具体的な目的は、高発現を与えるCHO細胞中に免疫グロブリン遺伝子を組み込むための新しい方法と、免疫グロブリン遺伝子のCHO細胞へのそのような組込みが可能な新規ベクター及びベクターの組合せを提供することである。加えて、高発現を与える所定の部位に組み込まれた免疫グロブリン遺伝子を含有し、メトトレキセート選択によってさらに大量の機能的免疫グロブリンを分泌するように増幅されている新規CHO細胞株を提供することが、本発明の具体的目的である。図面の簡単な説明図1は、デズモンド（Desmond）と呼ばれる本発明のマーキングプラスミドの地図である。プラスミドを環状（1a）と、トランスフェクションに使用される直鎖状（1b）で示す。図2（a）は「モーリー（Molly）」と呼ばれるターゲティングプラスミドの地図である。ここには抗CD20免疫グロブリン遺伝子をコードするモーリーを示し、その発現を実施例1で説明する。図2（b）は、制限酵素KpnIとPacIによる消化後の直鎖型モーリーを示す。トランスフェクションにはこの直鎖型を使用した。図3は、CHOゲノムに組み込まれたデズモンド配列と、入ってくるターゲティング・モーリー配列の考えうる整列を示す。相同組換え後にデズモンド中に組み込まれるモーリーの考えうる配置の一つも表す。図4は、単コピーデズモンドクローンのサザン分析を示す。試料は次の通りである。レーン1：λHindIII DNAサイズマーカーレーン2：デズモンドクローン10F3 レーン3：デズモンドクローン10C12 レーン4：デズモンドクローン15C9 レーン5：デズモンドクローン14B5 レーン6：デズモンドクローン9B2 図5は単コピーデズモンドクローンのノーザン分析を示す。試料は次の通りである。パネルA：図に示すようにCADプローブとDHFRプローブでプローブしたノーザン。パネルB：表示のようにCADプローブとHisDプローブでプローブした複製ノーザン。パネルAとBに負荷したRNA試料は次の通りである。レーン1：クローン9B2、レーン2：クローン10C12、レーン3：クローン14B5、レーン4：クローン15C9、レーン5：HisD及びDHFR含有プラスミドをトランスフェクトしたCHOから得た対照RNA、レーン6：非トランスフェクトCHO。図6は、デズモンドへのモーリーの相同組込みによってもたらされるクローンのサザン分析を示す。試料は次の通りである。レーン1：λHindIII DNAサイズマーカー、レーン2：20F4、レーン3：5F9、レーン4：21C7、レーン5：24G2、レーン6：25E1、レーン7、28C9、レーン8：29F9、レーン9：39G11、レーン10：42F9、レーン11：50G10、レーン12：モーリープラスミドDNA［BglIIで直鎖状にしたもの（上側のバンド）及びBglIIとKpnIで切断したもの（下側のバンド）］、レーン13：非トランスフェクトデズモンド図7A〜7Gにはデズモンドの配列表を示す。図8A〜81には抗CD20を含有するモーリーの配列表を示す。図9はターゲティングプラスミド「マンディー（Mandy）」の地図で、ここには抗CD23遺伝子をコードするものを示し、その発現については実施例5に開示する。図10A〜10Nには、実施例5に開示するように抗CD23遺伝子を含有する「マンディー」の配列表を示す。発明の詳細な説明本発明は、所望の外因性DNAを哺乳類細胞のゲノム内の標的部位に相同組換えによって組み込むための新しい方法を提供する。また本発明は、哺乳類細胞のゲノム内の標的部位でのDNAの部位特異的組込みを達成するための新規ベクターを提供する。より具体的には、本クローニング法は、哺乳類細胞を、その哺乳類細胞ゲノムにとって外来性であるユニーク配列を含有し相同組換えの基質となる「マーカープラスミド」でトランスフェクションし、次に、そのマーカープラスミドに含まれる前記ユニーク配列との相同組換えに備えた配列を含有し更にその哺乳類細胞中に組み込もうとする所望のDNAをも含んでなる「ターゲットプラスミド」でトランスフェクションすることにより、その哺乳類細胞における所望のDNAの部位特異的組込みを可能にするものである。通例、組み込まれるDNAは、免疫グロブリンや他の分泌哺乳類糖タンパク質などの興味あるタンパク質をコードする。例示する本相同組換え系では、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を優性選択可能マーカーとして使用する。このマーカーは既に公表された次の知見に基づいて使用された：（i）突然変異型neo遺伝子の標的及び機能修復能が証明されていること（上述）、及び（ii）介在イントロン中に挿入された目的遺伝子を持つ2つのエクソンとしてn eo遺伝子が人工的に作成されている翻訳欠陥発現ベクターが我々によって開発されたこと（ここに、neoエクソンは生体内で正しくスプライシングざれ翻訳されて機能的タンパク質を産生することにより、結果として生じる細胞集団にG418 耐性を付与する）。本願では、neo遺伝子が3つのエクソンに分割される。neoの第三エクソンは「マーカー」プラスミド上にあり、マーカープラスミドが哺乳類細胞中に組み込まれるとその宿主細胞ゲノムに組み込まれた状態になる。エクソン1とエクソン2はターゲティングプラスミド上にあり、少なくとも一つの目的遺伝子がそこにクローニングされる介在イントロンによって分離される。ターゲティングベクターの、組み込まれたマーキングベクターとの相同組換えは、そのne o遺伝子の3つのエクソン全ての正しいスプライシングと、それによる機能的なne oタンパク質の発現（G418耐性コロニーの選択によって決定）とをもたらす。この発現系を設計する前に、我々はこのような三分割neoコンストラクトの哺乳類細胞における機能性を実験的に調べてあった。その対照実験の結果は3つのneoエクソンすべてが適切にスプライスされることを示したことから、本発明の実施可能性が示唆された。ただし、本発明はneo遺伝子（より具体的には三分割neo遺伝子）を用いて例証されるが、その一般的方法論は他の優性選択可能マーカーでも有効なはずである。以下に詳述するように、本発明は、ランダム組込み法と遺伝子ターゲティング法の両者を含む従来の遺伝子発現法に数多くの利点を提供する。具体的には、本発明は、哺乳類細胞の転写活性ドメインへの所望のDNAの部位特異的組込みを再現性よく可能にする方法を提供する。更に、本方法は相同組換えと所望のDNAの挿入のためのユニーク基質として作用する人工的な「相同」領域を導入するので、本発明の有効性は、その細胞が特定のDNAを内因的に含有する又は発現させることを必要としない。したがって本方法は全ての哺乳類細胞に包括的に適用可能であり、どのタイプの組換えタンパク質を発現させるためにも使用できる。三分割された選択可能マーカー（例えば例示する三分割neoコンストラクト）の使用は、生成する全てのG418耐性コロニーが相同組換え事象から生じることを保証する（ランダム組込み体は機能的neo遺伝子を生成せず、したがってG418選択に耐えないだろう）。したがって本発明は所望の相同事象のスクリーニングを容易にする。さらに、相同組換え事象を経た細胞における追加のランダム組込みの頻度は低いようである。上の記述に基づけば、高産生クローン（すなわち、対応するタンパク質を高レベルに分泌する所望のDNAを含有する細胞株）を同定するためにスクリーニングする必要のあるコロニーの数をかなり減少させることが、本発明の有意義な利点であることは明らかである。平均すると、組み込まれた所望のDNAを含有するクローンは、約5〜20コロニーをスクリーニングすることによって同定できる（これに対し、標準的なランダム組込み技術を使用した場合は数千、また先に記述したイントロン挿入ベクター（intronic insertion vector）を使用した場合は数百のコロニーをスクリーニングしなければならない）。また、組込み部位は前もって選択されたものであり転写活性ドメインを含むので、この部位で発現される全ての外因性DNAはそれに匹敵するもの（すなわち、高レベルの目的タンパク質）を産生するはずである。さらに本発明は、マーキングベクターの組込み時に、増幅遺伝子を挿入することが可能であるという点でも有利である。したがって本発明は、所望の遺伝子を相同組換えによってこの部位に向かわせた場合、その遺伝子の発現を遺伝子増幅によってさらに増進させることができる。この点に関して、ゲノム部位が異なると遺伝子増幅能が異なることが文献に報告されている（Meinkothら,Mol.Cell Bi ol.,7:1415-1424（1987））。したがってこの技術は、目的とする所望の遺伝子を、転写活性でかつ容易に増幅される特定部位に配置することを可能にするので、更に有利である。したがって、これはそのような高産生体を単離するのに必要な時間をかなり短縮するはずである。具体的に述べると、高発現哺乳類細胞株を構築するための従来の方法は6〜9ヶ月を要する場合があるが、本発明はそのようなクローンを平均してわずか約3〜6 ヶ月で単離することを可能にする。これは、満足できる遺伝子発現レベルに到達するには、従来法で単離されるクローンを通例少なくとも3ラウンドの薬物耐性遺伝子増幅にかけなければならないという事実による。相同法で作成される本クローンは高発現部位である前もって選択された部位から生成するので、満足できるレベルの産生量に達するまでに必要な増幅のラウンド数は少なくなるはずである。さらにまた、本発明は、ベクターが低コピー数（典型的には単コピー）で組み込まれた高産生クローンの再現性ある選択を可能にする。これは、そのクローンの安定性が向上し、高コピー数に伴う可能性がある他の有害な副次的効果が回避されるので、有利である。上述のように、本相同組換え系では、以下に詳述する「マーカープラスミド」と「ターゲティングプラスミド」を併用する。転写的ホットスポットを標識し同定するために使用される「マーカープラスミド」は少なくとも次の配列を含む。（i）哺乳類細胞のゲノムに対して非相同又はユニークなDNAの領域であって、相同性の源泉として機能し、（第二のターゲットプラスミドに含まれるDNAとの）相同組換えを可能にするもの。より具体的に述べると、DNA（i）のユニーク領域は、一般に、その哺乳類細胞ゲノムには通常存在せず、その哺乳類細胞のゲノムに含まれるDNAに対して有意な相同性又は配列同一性を含まない細菌、ウイルス、酵母、合成又は他のDNAを含むだろう。基本的にこの配列は、相同組換えによる宿主細胞ゲノムとの組換えを有意に起こさないように、哺乳類DNAとは十分に異なるべきである。他の複数の研究者により、相同領域のサイズが増大するにつれて標的組換えの頻度が増加することが認められているので（Capecchi,Scien ci,244：1288-1292（1989））、このようなユニークDNAのサイズは一般的には少なくとも2〜10キロ塩基又はそれ以上、より好ましくは少なくとも約10kbになるだろう。第二のターゲットベクター中の配列との相同組換え用の部位として作用するユニークDNAのサイズの上限は、主として、潜在的な安定性の制約によって決まる（DNAが大きすぎると、容易には染色体に組み込まれなくなり、また極めて大きいDNAでは作業が困難である）。（ii）選択可能マーカーDNAの断片（通例、優性選択可能マーカー遺伝子の１つのエクソン）を含むDNA。このDNAの唯一不可欠な特徴は、それがターゲットプラスミドに含まれる配列と共同して発現されない限り、それが機能的な選択可能マーカータンパク質をコードしないことである。通例、ターゲットプラスミドは優性選択可能マーカー遺伝子の残りのエクソン（「ターゲティング」プラスミドに含まれないもの）を含むことになる。基本的に、機能的な選択可能マーカーは、（このマーカーDNA（i）配列とターゲットプラスミドに含まれる選択可能マーカーDNA断片部分との結合と発現をもたらす）相同組換えが起こる場合にのみ生成すべきである。上述のように、本発明は、2つのベクターに「分割」されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の優性選択可能マーカーとしての使用を例示する。しかし、例えばサルモネラヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子、グルタミンシンテターセ遺伝子及びヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子などの他の選択可能マーカーも好適なはずである。（iii）選択可能マーカーDNA（ii）とは異なる機能的な選択可能マーカータンパク質をコードするDNA。この選択可能マーカーは、本マーカープラスミドが細胞性DNAにうまく組み込まれている哺乳類細胞の選択を成功させるものである。より好ましくは、本マーカープラスミドは、本ベクターの両端に位置する2つのそのような優性選択可能マーカーDNAを含むことが望ましい。これは、異なる選択剤を使用して組込み体を選択することを可能にし、さらにまた、ベクター全体を含有する細胞の選択を可能にするので、有利である。さらに、先に論じたように、遺伝子増幅を容易にするために、一つのマーカーを増幅可能マーカーにすることができる。（ii）に挙げた優先選択可能マーカーはいずれも、当技術分野で一般に知られている他のマーカーと同様に使用できる。また、本マーカープラスミドは珍しいエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに含んでもよい。これは、それが切断を容易にしうる点で望ましい可能性がある。そのような珍しい制限部位が存在する場合、それは相同組換えの基質として作用するユニーク領域の中央近くに位置すべきである。好ましくは、そのような配列は少なくとも約12ヌクレオチドになるだろう。同様の方法論による二本鎖切断の導入は、相同組換えの頻度を向上させると報告されている（Choulikaら,Mol.Cell. Biol.,15:1968-1973（1995））。しかし、そのような配列の存在は必須ではない。「ターゲティングプラスミド」は少なくとも次の配列を含む。（1）マーカープラスミドに含まれているものと同じDNAのユニーク領域、又はそのDNAがマーカープラスミド中のユニーク領域（i）と相同組換えによる組換えを起こしうるように十分な相同性又は配列同一性を持つもの。好適なDNAのタイプは、マーカープラスミド中のDNAのユニーク領域（1）の説明で上述したものである。（2）一つのエクソンが上記マーカープラスミドに（ii）として含まれる優性選択可能マーカーの残りのエクソン。このDNA断片の必須の特徴は、そのターゲットプラスミドが相同組換えによって組込みを起こした場合（そのような組込みはこのDNAとマーカープラスミドに含まれるその選択可能マーカーDNAの他の断片との結合をもたらす）にのみ、それが機能的な（選択可能）マーカータンパク質をもたらすということと、さらに、所望の外因性DNAの挿入が可能であることである。通例、このDNAは、イントロンによって分離された選択可能マーカーDNAの残りのエクソンを含むだろう。例えば、このDNAはneo遺伝子の最初の2つのエクソンを含み、マーカープラスミドは第三のエクソン（neoの後ろの三分の一）を含みうる。（3）ターゲットプラスミドは所望のDNA（たとえば所望のポリペプチドをコードするもので、好ましくはそのプラスミドに含まれる選択可能マーカーDNA断片内に挿入されたもの）も含むだろう。通例、このDNAは、選択可能マーカーDNAのエクソン間に含まれるイントロンに挿入されるだろう。これにより、ターゲットプラスミドとマーカープラスミドの相同組換えが起こったときに所望のDNAも組み込まれることが保証される。このイントロンは自然界に存在するものでもよいし、若しくはそれを優先選択可能マーカーDNA断片中に工作してもよい。このDNAは任意の所望のタンパク質（好ましくは薬学的な又は他の望ましい特性を持つもの）をコードするだろう。最も一般的には、本DNAは哺乳類タンパク質（ここに記載する実施例では、免疫グロブリン又はイムノアドヘシン）をコードするだろう。ただし本発明は、決して免疫グロブリンの生産に限定されない。既に述べたように、本クローニング法は、それが有効であるために1又は複数の特定の哺乳類配列が存在することを必要としないことから、任意の哺乳類細胞に適している。一般に、そのような哺乳類細胞は、タンパク質発現に通例使用されるもの（例えば、CHO細胞、骨髄主細胞、COS細胞、BHK細胞、Sp2/O細胞、NIH3 T3細胞、HeLa細胞）からなるだろう。後述する実施例では、CHO細胞を使用した。その利点としては、好適な成長培地を入手できること、それらが培養中で効率良く高密度まで生育できること、及びそれらが免疫グロブリンなどの哺乳類タンパク質を生物学的に活性な形で発現させうることが挙げられる。また、CHO細胞を選択した大きな理由の一つは、過去に本発明者らが（既に記述した翻訳欠陥優性選択可能マーカー含有ベクターを使用して）免疫グロブリンを発現させるのに、その細胞を使用したことがあるからだった。したがって本研究室は、発現にこの細胞を使用した経験をかなりもっている。しかし下記の実施例に基づいて、他の哺乳類細胞でも同様の結果が得られると予測することは妥当である。一般に、本発明による哺乳類細胞の形質転換又はトランスフェクションは、従来の方法によって達成されるだろう。本発明をより良く理解できるように、模範的ベクターの構築と、組込み体の作成におけるそれらの使用法を、下記の実施例で説明する。実施例1 マーカー及びターゲティングプラスミドDNAベクターの設計と調製ここで「デズモンド」と呼ぶマーカープラスミドは次のDNA配列から組み立てられた。（a）ネズミジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（DHFR） DHFR開始部位の5'側のマウスベータグロビンプロモーターと、停止コドンの3'側のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルとからなる転写カセットに組み込まれたもの。このDHFR 転写カセットは、本研究室で以前に作成した発現ベクターTCAE6から単離された（Newmanら,1992,Biotechnology,10：1455-1460）。（b）大腸菌β-ガラクトシダーゼ遺伝子 Promega社からpSV-β-ガラクトシダーゼコントロールベクター（カタログ番号E1081）として入手した市販品。（c）バキュロウイルスDNA Clontech社からpBAKPAK8（カタログ番号6145-1）として購入した市販品。（d）サイトメガロウイルスとSV40ウイルスに由来するプロモーター及びエンハンサー配列からなるカセットこのカセットは、発現ベクターTCAE8（Reffら, Blood,83:435-445（1994））の誘導体を用いてPCRにより作成した。このエンハンサーカセットを、多重クローニング部位の挿入によってまず修飾したバキュロウイルス配列内に挿入した。（e）大腸菌GUS（グルクロニダーゼ）遺伝子 Clontech社からpB101（カタログ番号6017-1）として購入した市販品。（f）ホタルルシフェラーゼ遺伝子 Promega社からpGEM-Luc（カタログ番号E1 54）として入手した市販品。（g）ネズミチフス菌ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ遺伝子（HisD）この遺伝子はもともとDonahueら（Gene,18:47-59（1982））から提供されたもので、その後、その遺伝子の5'側のマウスベータグロビン主要プロモーターとその遺伝子の3'側のSV40ポリアデニル化シグナルとからなる転写カセットに組み込まれた。（a）〜（g）に記載のDNA配列をpBR由来のプラスミド主鎖に組み込んで、7.7k bの連続したDNA区間（添付の図面で「相同」と呼ぶ区間）を作成した。この意味での相同とは、哺乳類ゲノムの一部ではなく、同じ相同DNA配列を持つトランスフェクトされたプラスミド間の相同組換えを促進するために使用されるDNA配列を指す。（h）ＴＮ５由来のネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Davis及び Smith,Ann.Rev.Micro.,32:469-518（1978））遺伝子操作を容易にするために、完全なneo遺伝子をpBluescript SK-（Stratagene社カタログ番号212205)にサブクローニングした。次に、neoのアミノ酸51と52に対応するコドンを横切って存在するユニークPstI部位に、合成リンカーを挿入した。このリンカーは人工的スプライス供与部位、介在イントロン及びスプライス受容部位をneo遺伝子内に作出することによって、２つの独立したエクソン（ここではそれらをneoエクソン1 及び2と呼ぶ）を作出するのに必要なDNA配列をコードした。neoエクソン1はneo の最初の51アミノ酸をコードし、エクソン2は残りの203アミノ酸とそのタンパク質の停止コドンをコードする。そのイントロン内には1つのNotIクローニング部位も作られた。 neoエクソン2をさらに細分してneoエクソン2及び3を作った。これは次のように行なった：neoエクソン1をコードするDNAの領域、イントロン及びエクソン2の最初の111と2/3アミノ酸を増幅するために、一組のPCRプライマーを設計した。その3'PCRプライマーは、エクソン2中のアミノ酸111に対応するコドンの第二ヌクレオチドの直後に新しい5'スプライス部位の導入をもたらし、その結果、より小さな新しいエクソン2が生成した。次に、元のエクソン1、イントロン及び新しいエクソン2をコードするようになったそのDNA断片を、pBR系ベクターにサブクローニングして、増殖した。元のエクソン2の残りの部分を、「エクソン3」を生成するもう一つのPCR増幅工程にテンプレートとして使用した。この増幅工程のための5'プライマーは、新たに作出されるエクソン3の5'側（すなわちアミノ酸1 11に対応するコドンの最後のヌクレオチドの前）に新しいスプライス受容部位を導入した。その結果生じた3つのneoエクソンは次の情報をコードする：エクソン 1-neoの最初の51アミノ酸；エクソン2-次の111と2/3アミノ酸；エクソン3-最後の91と1/3アミノ酸＋neo遺伝子の翻訳停止コドン。 neoエクソン3を、上記のDNA配列と共に、マーキングプラスミド「デズモンド」に組み込んだ。neoエクソン1及び2はターゲティングプラスミド「モーリー」に組み込んだ。エクソン1とエクソン2の間に作つたNotIクローニング部位は、目的遺伝子をそのターゲティングプラスミドに挿入するために、後のクローニング段階で使用した。もう一つのターゲティングプラスミド「マンディー」も作成した。このプラスミドは、「モーリー」に含まれる元のHisD遺伝子とDHFR遺伝子が不活化されている点以外は、「モーリー」とほとんど同一である（ベクター上のいくつかの制限部位が変えられている）。これらの変化は、デズモンド細胞系がもはやヒスチジノールの存在下で培養されず、したがってHisD遺伝子の第二のコピーを含む必要はないと思われたために組み込まれた。また、DHFR遺伝子は、一つのDHFR遺伝子（すなわち、デズモンド標識部位に存在する一つ）のみが、結果として生じる細胞株中で増幅可能になることを保証するために不活化された。「マンディー」は次の修飾によって「モーリー」から誘導された。（i）合成リンカーをDHFRコード領域の中央に挿入した。このリンカーは停止コドンを生み出し、DHFRコード領域の残りの部分を枠外にシフトさせたので、この遺伝子は非機能的になった。（ii）HisD遺伝子の一部を欠失させ、その遺伝子のプロモーターと開始コドンを欠くHisD断片（PCRで作成）と置換した。図1はマーカープラスミド「デズモンド」におけるこれらDNA配列の配置を表す。図2は第一のターゲティングプラスミド「モーリー」におけるこれら配列の配置を示す。図3は、デズモンド標識CHO細胞へのモーリーDNAのターゲティングと組込み後の様々なDNA配列のCHOゲノムにおける起こりうる配置を図解したものである。図9はターゲティングプラスミド「マンディー」を表す。上記DNA配列からのマーキングプラスミドとターゲティングプラスミドの構築は従来のクローニング技術に従って行なった（例えばMolecular Cloning,A Labo ratory Manual,J.Sambrookら,1987,Cold Spring Harbor Laboratory Pressや、C urrent Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausubelら編,1987,John Wiley an d Sons社を参照されたい）。すべてのプラスミドは大腸菌XL1 blue（Stratagene 社、カタログ番号200236）中で増殖し、維持した。大量プラスミド製造者の指示に従って調製した。実施例2 標識CHO細胞株の構築１．標識CHO細胞株を作成するための細胞培養とトランスフェクション法マーカープラ不ミドDNAを、Bst1107Iを用いて37℃で終夜消化することによって直鎖状にした。直鎖型ベクターをエタノール沈殿し、滅菌TEに再懸濁して濃度を1mg/mlとした。直鎖型ベクターを、次のようにエレクトロポレーションによって、DHFR-チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO細胞）DG44細胞（Urlaubら,Som .Cell and Mol.Gen.，12:555-566(1986)）に導入した。指数増殖期の細胞を遠心分離によって収集し、氷冷SBS（ショ糖緩衝溶液、272 mMショ糖、7mMリン酸ナトリウム、pH7.4、1mM塩化マグネシウム）で1回洗浄した後、SBSに再懸濁して濃度を10⁷細胞/mlとした。氷上で15分インキュベートした後、その細胞懸濁液0.4mlを使い捨てのエレクトロポレーションキュベットで40 μgの直鎖型DNAと混合した。230ボルト、静電容量400マイクロファラデー、抵抗 13オームに設定したBTXエレクトロセルマニピュレーター（カリフォルニア州サンディエゴ）を使って、細胞にショックを与えた。次に、ショック処理した細胞を前もって温めておいた20mlのCHO成長培地（CHO-S-SFMII、Gibco/BRL社、カタログ番号31033-012）と混合し、96ウェル組織培養プレートで培養した。エレクトロポレーションの48時間後に、プレートに選択培地（デズモンドによるトランスフェクションの場合、選択培地はヒポキサンチン又はチミジンを含まず2m Mヒスチジノール（Sigma社カタログ番号H6647）を添加したCHO-S-SFMIIである）を供給した。プレートを最長30日まで又はウェルの一部が細胞成長を示すまで選択培地中に維持した。次に、それらの細胞を96ウェルプレートから取り出し、最終的に120mlスピナーフラスコに拡大し、そこでは細胞を常に選択培地中に維持した。実施例3 標識CHO細胞株の特徴づけ（a）サザン分析ゲノムDNAを安定に成長する全てのデズモンド標識CHO細胞から単離した。DNA 次にゲノムDNAをHindIIIにより37℃で終夜消化し、DHFR遺伝子に特異的なジゴキシゲニン標識プローブ（PCRで作成）を用いるサザン分析にかけた。ハイブリダイゼーションと洗浄は、Boehringer Mannheim社のDIG easy hyb（カタログ番号1 603 558）とDIG Wash and Block Buffer Set（カタログ番号1585 762）を使用し、製造者の指示に従って行なった。DHFRプローブにハイブリダイズする単一バンドを含有するDNA試料は、単コピーのプラスミドを組み込んでいる単一細胞から生じたデズモンドクローンであると推定された。これらのクローンをさらなる分析のために確保しておいた。単離された合計45のHisD耐性細胞株のうち、５つだけが単コピー組込み体だった。図4は、それら単コピーデズモンドクローンの5つすべてを含むサザンブロットを示す。クローン名は図面の説明に記載する。（b）ノーザン分析全RNAを全ての単コピーデズモンドクローンから、TRIzol試薬（Gibco/BRLカタログ番号15596-026）を使用し、その製造者の指示に従って単離した。各クローンから得た10〜20μgのRNAを複製ホルムアルデヒドゲルで分析した。得られたブロットを（i）DHFRメッセージ、（ii）HisDメッセージ及び（iii）CADメッセージに対するジゴキシゲニン標識DNAプローブ（PCRで作成）でプローブした。CAD はウリジン生合成に関与する三機能性タンパク質であり（Wahlら,J.Biol.Chem., 254,17：8679-8689（1979））、あらゆる細胞タイプで等しく発現される。ここではこれをRNA負荷量の定量を助けるための内部対照として使用する。ハイブリダイゼーションと洗浄は上述したBoehringer Mannheim社の試薬を用いて行なった。そのノーザン分析の結果を図5に示す。HisDメッセージとDHFRメッセージがどちらも最も高いレベルを示す単コピーデズモンドクローンは、どちらのパネルでもレーン４に示すクローン15C9である。このクローンを「標識細胞株」と名づけて、CHOにおけるその後のターゲティング実験に使用した。そのような実験の例を下記の項に挙げる。実施例4 デズモンド標識CHO細胞における抗CD20抗体の発現 B細胞表面抗原CD20を認識するキメラ抗体C2B8は、既に我々の研究室でクローニングされ、発現されている（Reffら,Blood,83:434-45（1994））。C2B8軽鎖及び重鎖遺伝子と必要な調節配列（真核プロモーターとポリアデニル化シグナル）とからなる4.1kbのDNA断片を、pBR系クローニングベクターに含まれるneo遺伝子のエクソン1とエクソン2の間に作成した人工イントロン中に挿入した。この新たに生成した5kbのDNA断片（neoエクソン1、C2B8及びneoエクソン2を含む）を切り出し、それを使ってターゲティングプラスミド「モーリー」を組み立てた。モーリーの構築に使用した他のDNA配列は、先に示したマーキングプラスミド「デズモンド」を構築するために使用したものと同じである。モーチーの完全な地図を図2に示す。トランスフェクションに先立って、ターゲティングベクター「モーリー」をKp nIとPacIによる消化で直鎖化し、エタノール沈殿し、滅菌TEに再懸濁して濃度を 1.5mg/mLとした。直鎖型プラスミドを、各エレクトロポレーションで80μgのDNA を使用した点以外は本質的に上記と同様にして、指数増殖期のデズモンド標識細胞に導入した。エレクトロポレーションの48時間後に、96ウェルプレートに選択培地（400μg/mlジェネティシン（G418；Gibco/BRLカタログ番号10131-019）を添加したCHO-SSFMII）を添加した。プレートを最長30日まで又は細胞成長がウェルの一部で起こるまで維持した。そのような成長は、単一G418耐性細胞のクローン増殖の結果であると推定された。全てのG418耐性ウェルから得た上清をC2B8産生について標準的ELISA法によってアッセイし、全ての産生クローンを最終的に1 20mLスピナーフラスコに拡大し、さらに分析した。抗体分泌標的細胞の特徴づけこの実験では「モーリー」ターゲティングプラスミドを使って合計50回のエレクトロポレーションを行ない、そのそれぞれを別個の96ウェルプレートに播種した。合計10の生育可能な抗CD20抗体分泌クローンが得られ、それらを120mlスピナーフラスコに拡大した。すべてのクローンからゲノムDNAを単離し、そのクローンが単一の相同組換え事象を表すか、それとも同じ細胞内で追加のランダム組込みが起こっているかを決定するために、続いてサザン分析を行なった。DNA単離とサザンハイブリダイゼーションの方法は上述の通りとした。ゲノムDNAをEco RIで消化し、CD20重鎖定常領域の一区間に対するジゴキシゲニン標識プローブ（ PCRで作成）でプローブした。そのサザン分析の結果を図6に示す。この図からわかるように、10クローンのうち8つがそのCD20プローブにハイブリダイズする単一バンドを示すことから、これらの細胞では単一の相同組換え事象が起こっていることが示される。これら10クローンのうちの2つ、クローン24G2と28C9は、追加のバンドの存在を示し、これはゲノムのどこか他の位置での追加のランダム組込みを表す。我々は、これら10個のクローン全てにおける抗CD20抗体の発現レベルを調べた。そのデータを下記表1に示す。表１抗CD-20分泌相同組込み体の発現レベル ^*これらのクローンはランダム組込みされた追加の抗CD20コピーを含有した。したがってこれらクローンの発現レベルは相同部位とランダム部位の両方からの寄与を反映する。発現レベルは、個々のクローンによって分泌されるピコグラム/細胞/日（pg/c/d ）として報告し、120mLスピナーフラスコから採取した試料に対する３回の独立したELISAで得られた平均レベルを表す。このデータからわかるように、最も高いクローンと最も低いクローンの間に約 10倍の抗体分泌量の変動がある。我々は、抗CD20遺伝子がすべて同じデズモンド標識部位に組み込まれるという事実ゆえに、全てのクローンから類似する発現レベルを予期していたので、この結果は多少予想外だった。それでもなお、観察されたこの発現量の範囲は、従来のランダム組込み法や我々の翻訳欠陥ベクター系を使った場合に見られるものと比較して、極めて小さい。最も産生量の高い単コピー組込み体であるクローン20F4をさらなる研究のために選択した。表2（下記）は、このクローンの7日生産実験で得られたELISA及び細胞培養データを表す。表２ 20F4に関する７日生産実験データクローン20F4を第0日に120mlスピナーフラスコに2×10⁵/mlの密度で接種した。それ以降の6日間、細胞数を数え、倍加時間を計算し、フラスコから上清の試料1mlを採取して、分泌された抗CD20についてELISAで分析した。このELISAデータによれば、このクローンは平均で1日あたり1細胞あたり3〜5pg の抗体を分泌している。これは先に開発された翻訳欠陥ランダム組込みベクターを使って我々の研究室で得られた他の高発現単コピークローンから得られるものと同じレベルである。この結果は次の事柄を示す：（1）デズモンドマーキングベクターによって標識されたCHOゲノム中の部位は高度に転写活性であり、それゆえ、そこから組換えタンパク質を発現させる部分として優れた部位に相当すること、及び（2）相同組換えによるターゲティングは本ベクターを用いて達成でき、それはこの系をランダム組込み法に代わる実施可能で望ましい方法にするのに十分なほど高い頻度で起こること。この系の有効性をさらに証明するために、我々は、この部位が増幅可能であって、さらに高いレベルの遺伝子発現とタンパク質分泌をもたらすことも証明した。増幅は、2.5×10⁴細胞/mlの密度から始まる20F4細胞の連続希釈物を96ウェル組織培養プレートに播種し、5、10、15又は20nMメトトレキセートを添加した培地（CHO-SSFMII）でそれらの細胞を培養することによって達成した。抗体分泌クローンを標準的ELISA法を使ってスクリーニングし、最も産生量の高いクローンを増殖し、さらに分析した。この増幅実験の要約を下記表３に示す。表３ 20F4増幅の要約 20F4のメトトレキセート増幅は、上の表に示すメトトレキセート濃度を使用して、本文に記述するように設定した。すべての生存96ウェルコロニーから得た上清をELISAによってアッセイし、それらのクローンによって発現される抗CD2 0の範囲を第3列に示す。これらの結果に基づき、最も産生量の高いクローンを 120mlスピナーに拡大し、そのスピナー上清に対して数回のELISAを行なって、第5列に示すpg/細胞/日-発現レベルを決定した。ここに示したデータは、メトトレキセートの存在下でこの部位を増幅させうることを明瞭に示している。10及び15nM増幅で得られるクローンは、15〜20pg/細胞/ 日程度を産生することがわかった。 20F4-15A5と名づけた15nMクローンを最も産生量の高い細胞株として選択した。このクローンは22ウェルしか生育しなかった96ウェルプレートから生じたものであることから、単一細胞から生成したと推定された。20F4-15A5と名づけた15n Mクローンを最も産生量の高い細胞株として選択した。このクローンは22ウェルしか生育しなかった96ウェルプレートから生じたものであることから、単一細胞から生成したと推定された。次にそのクローンをさらなるメトトレキセート増幅にかけた。上述のように、その培養の連続希釈物を96ウェル培養皿に播種し、20 0、300又は400nMメトトレキセートを添加したCHO-SS-FMII培地で培養した。生き残ったクローンをELISAでスクリーニングし、いくつかの高産生クローンをスピナー培養に拡大し、さらに分析した。この二回目の増幅実験の要約を表４に示す。表４ 20F4-15A5増幅の要約 20F4-15Aのメトトレキセート増幅は本文に記述するように設定し、アッセイした。最も産生量の高いウェル（その数を第4列に示す）を120mlスピナーフラスコに拡大した。それらのウェルに由来する細胞株の発現レベルをpg/c/dとして第5列に記録する。最も産生量の高いクローンは250nMメトトレキセート増幅によってもたらされた。その250nMクローン、20F4-15A5-250A6はウェルしか生育しなかった96ウェルプレートから生じたものであることから、単一細胞から生成したと推定される。総合すると、表3及び4のデータは、哺乳類細胞における免疫グロブリンの最大分泌能力に近い60pg/細胞/日の発現レベルに到達するのに、2ラウンドのメトトレキセート増幅で十分であることをはっきり示している（Reff,M.E., Curr.Opin.Biotech.,4:573-576（1993））。たった2回の増幅段階でこの分泌能力に到達できることは、この相同組換え系の有用性をさらに高める。通例、ランダム組込み法はこの発現レベルに到達するのに2回を超える増幅段階を必要とし、増幅の容易さという点で一般に信頼性が低い。したがって本相同系は、哺乳類細胞における高レベル遺伝子発現を達成する、より効率的で時間を節約できる方法を提供する。実施例5 デズモンド標識CHO細胞における抗ヒトCD23抗体の発現 CD23はB及びTリンパ球に対するIgEの結合を媒介する低親和性IgEレセプターである（Sutton,B.J.及びGould,H.J.,Nature,366:421-428（1993））。抗ヒトCD23 モノクローナル抗体5E8は、最近我々の研究室でクローニングされ発現されたヒトγ-1モノクローナル抗体である。この抗体は、1997年2月20日に出願された譲受人同一の出願第08/803,085号に開示されている。 5E8の重鎖及び軽鎖遺伝子を、ベクターNEOSPLA（Barnettら,Antibody Express ion and Engineering（H.Y Yang及びT.Imanaka編）の27〜40頁（1995））の誘導体である哺乳類発現ベクターN5KG1にクローニングした後、2つの修飾をその遺伝子に施した。最近、我々は、本研究室の他の発現コンストラクトにおいて免疫グロブリン軽鎖の分泌量が重鎖と比較していくらか高いことを観察した（Reffら,1 997,未公表の観察）。我々は、その不足を補償する試みとして、より強力なプロモーター/エンハンサー配列を開始部位の直ぐ上流に付加することにより、5E8重鎖遺伝子を改変した。次の段階として、5E8修飾軽鎖及び重鎖遺伝子を含む2.9kb のDNA断片をN5KG1ベクターから単離し、ターゲティングベクター「マンディー」に挿入した。5E8含有モーリーの調製とデズモンド15C9 CHO細胞へのエレクトロポレーションは基本的に上の項で記述した通りとした。上述のプロトコルに施した一つの変更は、使用した培養培地のタイプである。 3mg/L組換えインシュリン（3mg/mL保存液、Gibco-BRL、カタログ番号AS22057）と8mM L-グルタミン（200mM保存液、Gibco-BRL、カタログ番号25030-081）を添加した無タンパク質CD-HO培地（Gibco-BRL、カタログ番号AS21206）で、デズモンド標識CHO細胞を培養した。次に、400μg/mLジェネティシンを添加した上記の培地でトランスフェクト細胞を選択した。この実験では、20回のエレクトロポレーションを行ない、96ウェル組織培養皿に播種した。合計68ウェルで細胞が成長して抗CD23を分泌し、それらは全て、単一のG418細胞から派生したクローンであると推定された。これらのうち12ウェルをさらなる分析のために120mlスピナーフラスコに拡大した。この実験で分離されたクローン数が多かったのは（実施例 4に記述したように抗CD20の10クローンに対して68クローン）、CHO-SS-FMII培地よりCD-CHO培地で成長する細胞の方が高いクローニング効率と生存率を持つからだと、我々は考える。スピナー培養で分析したこれらクローンの発現レベルは0. 5〜3pg/c/dの範囲にあり、抗CD20クローンで見られたレベルとよく一致した。4H 12と名づけた最も産生量の高い抗CD23クローンを、その発現レベルを増加させるために、メトトレキセート増幅にかけた。この増幅は抗CD20クローンについて実施例4に記述したものと同様に設定した。指数増殖期の4H12細胞の連続希釈物を9 6ウェル組織培養皿に播種し、3mg/Lインシュリン、8mMグルタミン及び30、35又は40nMメトトレキセートを添加したCD-CHO培地で生育した。この増幅実験の要約を表5に示す。表５ 2H12増幅の要約得られたクローンで最も発現量の高いものは、22ウェルが成長したプレートから単離された30nMクローンだった。4H12-30G5と名づけられたこのクローンは1 日あたり1細胞あたり18〜22pgの抗体を再現性よく分泌した。これは抗CD20クローン20F4の一回目の増幅でみられた発現量（実施例4に記述したように15〜 18pg/c/dを産生するクローン20F4-15A5）と同じ範囲である。このデータから、CHO中のこの標識部位での増幅には再現性があり高効率であるという観察がさらに裏付けられる。この30nM細胞株の二回目の増幅は現在進行中である。抗 CD20の場合のように、CD23についても、たった2回の増幅段階で飽和発現レベルを達成できると予期される。実施例6 デズモンド標識CHO細胞におけるイムノアドヘシンの発現 Igスーパーファミリーの一要素であるCTLA-4はTリンパ球の表面に見出され、抗原特異的T細胞活性化に、ある役割を果たしていると思われる（Dariavachら,E ur.J.Immunol.,18:1901-1905（1988）及びLinsleyら,J.Exp.Med,174:561-569（1 991））。この活性化経路におけるCTLA-4の正確な役割をさらに研究するために、短縮型のヒトIgG1定常領域に連結されたCTLA-4の細胞外ドメインからなる可溶性融合タンパク質が作成された（Linsleyら，同上）。最近、我々は、このCTLA- 4 Ig融合タンパク質を、NEOSPLA（Barnettら,Antibody Expression and Enginee ring（H.Y Yang及びT.Imanaka編）の27〜40頁（1995））の誘導体である哺乳類発現ベクターBLECH1で発現させた。CTLA-4 Igをコードする800bpの断片をこのベクターから単離し、モーリーのSacII部位とBglII部位の間に挿入した。 CTLA-4Ig-モーリーの調製とデズモンドクローン15C9 CHO細胞へのエレクトロポレーションは、抗CD20に関して先の実施例に記述したように行なった。上述のように20回のエレクトロポレーションを行ない、96ウェル培養皿に播種した。18 個のCTLA-4発現ウェルを96ウェルプレートから分離し、120mlスピナー段階に移した。次に、これら相同クローンのうちのいくつが追加のランダム組込み体を含有するかを決定するために、それらクローンのそれぞれから単離したゲノムDNA のサザン分析を行なった。ゲノムDNAをBglIIで消化し、ヒトIgG1定常領域に対するジゴキシゲニン標識プローブ（PCRで作成）でプローブした。この分析の結果は、これらCTLA-4クローンの85%が相同組込み体のみであり、残りの15%の追加のランダム組込み体を１つ含有することを示した。この結果は、上述した抗CD20の発現から得られた知見（クローンの80%が単一相同組込み体）を確証するものである。したがって、この発現系は生成する全クローンの少なくとも80%に単一標的相同組込み体をもたらすと結論できる。相同CTLA4-Igクローンに関する発現レベルは8〜12pg/細胞/日の範囲だった。これは上述の抗CD20抗体クローンと抗CD23抗体クローンについて報告した範囲よりいくらか高い。しかし我々は、イントロン挿入ベクター系によるこの分子の発現も、免疫グロブリンで得られるものよりも有意に高い発現レベルをもたらすことを以前に観察している。我々は現時点ではこの観察に説明を与えることができない。実施例7 代替デズモンド標識CHO細胞株への抗CD20のターゲティング上述のように、我々は5つの単一コピーデズモンド標識CHO細胞株を得た（図4 及び5参照）。我々のターゲティング法の成功がデズモンドクローン15C9の何かユニークな特徴によるのではなく、またこのクローンだけに限定されないことを証明するために、デズモンドクローン9B2（図4のレーン6、図5のレーン1）に抗C D20モーリーを導入した。モーリーDNAの調製とデズモンド9B2へのエレクトロポレーションは抗CD20に関する上記実施例に記述したものと全く同様にした。我々はこの実験から一つの相同組込み体を得た。このクローンを120mlスピナーフラスコに拡大したところ、これは平均で1日あたり1細胞あたり1.2pgの抗CD20を産生した。これは、デズモンド15C9にターゲティングされたモーリーで我々が観察したものよりかなり低い発現量である。しかしこれは、我々が行なった各種デズモンドクローンのノーザン分析に基づいて予期される結果だった。図5からわかるように、クローン9B2からのmRNAレベルは15C9からのmRNAレベルよりかなり低く、このクローン中の部位が15C9中のものほど転写活性でないことを示している。したがってこの実験はこの系の再現性−おそらくモーリーを使って任意の標識デズモンド部位を標的にすることができる−を示すばかりでなく、デズモンド15 C9中の部位が最も転写活性であるというノーザンデータを確認するものでもある。ここでは例示を目的として本発明の特定の態様を説明したが、本発明の範囲から逸脱することなく様々な変更を施しうることは、上の記述から理解されるだろう。したがって本発明は添付の請求の範囲によって制限されない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マクラクラン，カレン・レッタアメリカ合衆国92075カリフォルニア州ソラナ・ビーチ、サウス・ナード766番、アパートメント・ビー６

Claims

【特許請求の範囲】１．哺乳類細胞のゲノム中の標的部位に所望のDNAを挿入する方法であって、次の各段階を含む方法：（i）哺乳類細胞を次の各配列を含む第一プラスミド（「マーカープラスミド」）でトランスフェクション又は形質転換し：（a）哺乳類細胞ゲノムに組み込まれた時に相同組換え用のユニーク部位を提供する、哺乳類細胞ゲノムに対して非相同的なDNAの領域；（b）第一選択可能マーカータンパク質の一部をコードするDNA断片；及び（c）マーカープラスミドがうまく組み込まれている哺乳類細胞の選択に備えた少なくとも一つの他の選択可能マーカーDNA；（ii）そのゲノムに組込まれたマーカープラスミドを含有する細胞を選択し；（iii）選択したその細胞を次の各配列を含む第二プラスミド（「ターゲットプラスミド」）でトランスフェクション又は形質転換し：（a）マーカープラスミド中のユニーク領域と同一であるか、若しくはそのDNA の領域が相同組換えにより該DNAと組換えを起こしうるほど十分に相同であるDNA の領域；（b）マーカープラスミドに含まれるものと同じ選択可能マーカーの一部をコードするDNA断片（ここに、該DNAによってコードされる活性な選択可能マーカータンパク質は、該断片がマーカープラスミドに含まれる該選択可能マーカーDNA の断片と共同して発現される場合にのみ産生される）；（iv）第一選択可能マーカータンパク質の発現についてスクリーニングすることにより、標的部位に組み込まれたターゲットプラスミドを含有する細胞を選択する。２．第一選択可能マーカーの断片をコードするDNA断片が優性選択可能マーカーの1つのエクソンである請求の範囲1に記載の方法。３．第二プラスミドが該第一選択可能マーカーの残りのエクソンを含有する請求の範囲2に記載の方法。４．所望のタンパク質をコードする少なくとも一つのDNAが、ターゲットプラスミドに含まれる該第一選択可能マーカーの該エクソン間に挿入される請求の範囲3に記載の方法。５．所望のタンパク質をコードするDNAの同時増幅に備えるために、優性選択可能マーカーをコードするDNAが、更に、ターゲットプラスミドに含まれる該第一選択可能マーカーのエクソン間に挿入される請求の範囲4に記載の方法。６．第一優性選択可能マーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンテターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼからなる群より選択される請求の範囲3に記載の方法。７．所望のタンパク質が哺乳類タンパク質である請求の範囲4に記載の方法。８．そのタンパク質が免疫グロブリンである請求の範囲7に記載の方法。９．マーカープラスミドに含まれる選択マーカー（c）のRNAレベルを、ターゲットベクターの組込みに先立って決定する段階を更に含む請求の範囲1に記載の方法。 10．マーカープラスミドに含まれる当該他の選択可能マーカーがヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、ハイドロマイシンホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びグルタミンシンテターゼからなる群より選択される請求の範囲9に記載の方法。 11．哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、骨髄腫細胞、ベビーハムスター腎細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞及びNIH 3T3細胞からなる群より選択される請求の範囲1に記載の方法。 12．その細胞がCHO細胞である請求の範囲11に記載の方法。 13．マーカープラスミドがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の第三エクソンを含有し、ターゲットプラスミドがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の最初の2つのエクソンを含有する請求の範囲1に記載の方法。 14．マーカープラスミドが更に、相同領域内に挿入された珍しい制限エンドヌクレアーゼ配列を含有する請求の範囲1に記載の方法。 15．相同組換えに備えたDNAのユニーク領域が細菌DNA、ウイルスDNA又は合成D NAである請求の範囲1に記載の方法。 16．相同組換えに備えたDNAのユニーク領域が少なくとも300ヌクレオチドである請求の範囲1に記載の方法。 17．DNAのユニーク領域のサイズが約300ヌクレオチドから20キロ塩基までの範囲にある請求の範囲16に記載の方法。 18．DNAのユニーク領域のサイズが2〜10キロ塩基の範囲にある請求の範囲17に記載の方法。 19．第一選択可能マーカーDNAが少なくとも3つのエクソンに分割される請求の範囲1に記載の方法。 20．相同組換えに備えたDNAのユニーク領域が細菌DNA、昆虫DNA、ウイルスDNA 又は合成DNAである請求の範囲1に記載の方法。 21．DNAのユニーク領域が機能的な遺伝子を含有しない請求の範囲20に記載の方法。 22．哺乳類細胞のゲノム中の標的部位に所望のDNAを挿入するためのベクター系であって、少なくとも下記を含んでなるもの：（i）少なくとも次の各配列を含む第一プラスミド（「マーカープラスミド」）：（ａ）哺乳類細胞ゲノムに組み込まれた時に相同組換え用のユニーク部位を提供する、哺乳類細胞ゲノムに対して非相同的なDNAの領域；（b）第一選択可能マーカータンパク質の一部をコードするDNA断片；及び（c）マーカープラスミドがうまく組み込まれている哺乳類細胞の選択に備えた少なくとも一つの他の選択可能マーカーDNA；（ii）少なくとも次の各配列を含む第二プラスミド（「ターゲットプラスミド」）：（a）マーカープラスミド中のユニーク領域と同一であるか、若しくはそのDNA の領域が相同組換えにより該DNAと組換えを起こしうるほど十分に相同であるDNA の領域；（b）マーカープラスミドに含まれるものと同じ選択可能マーカーの一部をコードするDNA断片（ここに、該DNAによってコードされる活性な選択可能マーカータンパク質は、該断片がマーカープラスミドに含まれる該選択可能マーカーDNA の断片と共同して発現される場合にのみ産生される）。 23．第一選択可能マーカーの断片をコードするDNA断片が優性選択可能マーカーの1つのエクソンである請求の範囲22に記載のベクター系。 24．第二プラスミドが該第一選択可能マーカーの残りのエクソンを含有する請求の範囲23に記載のベクター系。 25．所望のタンパク質をコードする少なくとも一つのDNAが、ターゲットプラスミドに含まれる該第一選択可能マーカーの該エクソン間に挿入される請求の範囲24に記載のベクター系。 26．所望のタンパク質をコードするDNAの同時増幅に備えるために、優性選択可能マーカーをコードするDNAが、更に、ターゲットプラスミドに含まれる該第一選択可能マーカーのエクソン問に挿入される請求の範囲24に記載のベクター系。 27．第一優性選択可能マーカーがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、グルタミンシンテターゼ及びヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼからなる群より選択される請求の範囲24に記載のベクター系。 28．所望のタンパク質が哺乳類タンパク質である請求の範囲25に記載のベクター系。 29．そのタンパク質が免疫グロブリンである請求の範囲28に記載のベクター系。 30．マーカープラスミドに含まれる当該他の選択可能マーカーがヒスチジノールデヒドロゲナーゼ、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、ハイドロマイシンホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ及びグルタミンシンテターゼからなる群より選択される請求の範囲22に記載のベクター系。 31．チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、骨髄腫細胞、ベビーハムスター腎細胞、COS細胞、NSO細胞、HeLa細胞及びNH 3T3細胞からなる群より選択される哺乳類細胞のゲノム中の標的部位に所望のDNAを導入するための請求の範囲 22に記載のベクター系。 32．その哺乳類細胞がCHO細胞である請求の範囲31に記載のベクター系。 33．マーカープラスミドがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の第三エクソンを含有し、ターゲットプラスミドがネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の最初の2つのエクソンを含有する請求の範囲22に記載のベクター系。 34．マーカープラスミドが更に、相同領域内に挿入された珍しい制限エンドヌクレアーゼ配列を含有する請求の範囲22に記載のベクター系。 35．相同組換えに備えたDNAのユニーク領域が細菌DNA、ウイルスDNA又は合成D NAである請求の範囲22に記載のベクター系。 36．相同組換えに備えたマーカープラスミドベクター系に含まれるDNA（a）のユニーク領域が少なくとも300ヌクレオチドである請求の範囲22に記載のベクター系。 37．DNAのユニーク領域のサイズが約300ヌクレオチドから20キロ塩基までの範囲にある請求の範囲36に記載のベクター系。 38．DNAのユニーク領域のサイズが2〜10キロ塩基の範囲にある請求の範囲37に記載のベクター系。 39．第一選択可能マーカーDNAが少なくとも3つのエクソンに分割される請求の範囲22に記載のベクター系。 40．相同組換えに備えたDNAのユニーク領域が細菌DNA、昆虫DNA、ウイルスDNA 又は合成DNAである請求の範囲22に記載のベクター系。 41．DNAのユニーク領域が機能的な遺伝子を含有しない請求の範囲40に記載のベクター系。