CZ316299A3 - Způsob integrace genů do specifických míst genomu savčí buňky homologní rekombinací a příslušné vektorové systémy - Google Patents

Způsob integrace genů do specifických míst genomu savčí buňky homologní rekombinací a příslušné vektorové systémy Download PDF

Info

Publication number
CZ316299A3
CZ316299A3 CZ19993162A CZ316299A CZ316299A3 CZ 316299 A3 CZ316299 A3 CZ 316299A3 CZ 19993162 A CZ19993162 A CZ 19993162A CZ 316299 A CZ316299 A CZ 316299A CZ 316299 A3 CZ316299 A3 CZ 316299A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
dna
plasmid
marker
selectable marker
cells
Prior art date
Application number
CZ19993162A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ293355B6 (cs
Inventor
Mitchell E. Reff
Richard Spence Barnett
Karen Retta Mclachlan
Original Assignee
Idec Pharmaceuticals Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26697516&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ316299(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from US08/819,866 external-priority patent/US5830698A/en
Application filed by Idec Pharmaceuticals Corporation filed Critical Idec Pharmaceuticals Corporation
Publication of CZ316299A3 publication Critical patent/CZ316299A3/cs
Publication of CZ293355B6 publication Critical patent/CZ293355B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/42—Vector systems having a special element relevant for transcription being an intron or intervening sequence for splicing and/or stability of RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/44—Vectors comprising a special translation-regulating system being a specific part of the splice mechanism, e.g. donor, acceptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Způsob integrace genů do specifických míst genomu savčí buňky homologní rekombinací a příslušné.vektorové systémy
Oblast techniky
Předkládaný vynález' se týká způsobu cílené integrace požadované exogenní DNA do specifického místa v genomu savčí buňky. Konkrétně vynález popisuje nový způsob identif ikíice transkripčně aktivního cílového místa (žhavé místo) v genomu savčí buňky, a vložení požadované DNA do, tohoto místa prostřednictvím homologní rekombinace. Vynález také poskytuje možnost genové amplifikace požadované DNA v takovém místě, a to tím, že se současně v kombinaci s exogenní DNA integruje amplifikovatelný selekční markér, např'. DHFR. Vynález dále popisuje konstrukci nových vektorů vhodných k provádění výše uvedených způsobů, a dále poskytuje savčí buněčné linie připravené způsobem podle vynálezu, které obsahují požadovanou exogenní DNA integrovanou v cílovém žhavém místě ·
Dosavadnítstav techniky 'Technologie exprese rekombinantních proteinů jak v prokaryotických tak eukaryotických organismech jsou již dobře zavedeny. Savčí buňky ve srovnání s bakteriemi nebo kvasInkami nabízejí značné výhody pro produkci proteinu, neboť mají schopnost správně sestavit, glykosylovat, a také posttranslačně modifikovat rekombinantně exprimovaný protein. Po transfekci do hostitelské buňky se rekombinantní expresní konstrukt může udržovat jako extrachromozomální element, nebo • · » 9 ··· » · 9
9 9 9
999 999 .se může integrovat do genomu hostitelské buňky./ Vytvoření stabilně transfekované savčí buněčné linie obvykle zahrnuje následující:- konstrukt DNA kódující požadovaný gen . společně s genem rezistence k chemické látce, zpravidla léčivu (dominantní selekční markér) se vnese do hostitelské buňky, a poté následuje růst v přítomnosti léčiva, který umožní selekci buněk, které úspěšně integrovaly exogenní' DNA. V mnoha případech je požadovaný gen spojen se selektovatelným markérem rezistence k léčivu, který pak může být podroben amplifikaci. Pro tento účel se nejčastěji užívá gen kódující dihydrofolátreduktázu , (DHFR)
Růst buněk v přítomnosti úseky DNA amplifikace methotrexatu, který je kompetitivním inhibitorem DHFR, vede ke zvýšené produkci DHFR amplifikaci genu DHFR. Sousední se také amplifikují, a výsledná současná (koamplifikace) genu spojeného s DHFR v transfekované buněčné linií může vést ke zvýšené produkci proteinu, čili vede ke zvýšené expresi požadovaného genu.
Tento přístup se ukázal'být úspěšným, ale v systému je celá řada problémů, neboť integrační událost je náhodné povahy. Tyto problémy existují, neboť expresní hladiny jsou z velké míry ovlivněny působením lokálního genetického prostředí v genovém lokusu, což je jev dobře dokumentovaný' v odborné literauře a obecně označovaný jako poziční efekt (např. viz Al-Shawi et al. , Mol. Cell. Biol. 10: 1192-1198,
1990, Yoshimura et al . ,. Mol. Cell. Biol. 7: 1296-1299, 1987) .
Jelikož valná většina savčí DNA je v transkripčně .neaktivním stavu, způsoby náhodné integrace nenabízejí žádnou možnost kontroly transkripce integrované DNA.' Tudíž dochází ke značné variaci v hladině exprese integrovaných genů v závislosti na místu integrace. Tak např. výsledkem integrace exogenní DNA do inaktivního, transkripčně umlčeného úseku genomu, bude • · · ···· · · · · • · · · · · · · · · • · · · · ··· · ··· ··· • · · · · · · ··· ft ··. ftft ftft »· velmi nízká 'nebo nulová exprese. Naopak integrace do transkripčně aktivního místa povede k vysoké expresi.
Proto, pokud je cílem práce získat vysokou hladinu genové exprese, což je většinou typickým požadovaným výstupem metod genového inženýrství, je obecně třeba testovat velký počet transfekovaných buněk (transfektant) , aby byl nalezen klon s vysokou produktivitou.
Kromě toho náhodná integrace exogenní DNA do genomu muže v některých případech narušit důležité buněčné geny, což vede ke změněnému fenotypu.· Díky těmto faktorům může být příprava stabilní savčí linie s vysokou produktivitou značně složitým a pracným procesem.
Nedávno byly v naší laboratoři připraveny DNA vektory obsahující translačně oslabené , dominantní selektovatelné markéry, a byly použity k savčí genové expresi (v přihlášce vynálezu US 08/147696, podané 3. listopadu 1993) .
Tyto vektory obsahují translačně oslabený gen pro neomycinfosfotransferázu (neo) jako dominantní selektovatelný markér, uměle upravený tak, aby obsahoval intron, do· kterého je vložen gen DHFR společně s požadovaným genem/geny. Bylo zjištěno, že použití těchto vektorů jako expresních konstruktů významně snižuje celkový počet vzniklých kolonií rezistentních k léčivu, což usnadňuje proces testování a selekce vzhledem ke konvenčním savčím vektorům. Kromě toho významné procento klonů získaných pomocí tohoto systému patří ke klonům s vysokou expresí.· Tyto výsledky lze přičíst modifikacím, provedených na selektovateiném markéru neo. Díky translačnímu oslabení genu neo transfekované buňky nevytvářejí dostatek neo proteinu, aby přežily selekci na léčivu, a tím se snižuje celkový počet kolonií rezistentních k léčivu. A navíc, vysoké procento přežívajících klonů obsahuje expresní vektor integrovaný do místa genomu,, kde je • · ·····*··· • v ··· · · · · · • · · · · ··· · ······ • · · · · · . · • · · · · · · · ·· · · bazální hladina transkripce vysoká, což vede k nadprodukci neo, což umožňuje buňkám překonat translační oslabení genu neo. A jakožto průvodní jev i požadované geny spojené s neo mají stejně zvýšenou hladinu transkripce. A stejná výhoda je také důsledkem umělého intronu vytvořeného uvnitř :neo, přežívání je závislé na syntéze funkčního genu neo, což je zase závislé na správném ά účinném sestřihu intřonů neo. Avšak' tato kritéria jsou mnohem pravděpodobněji' splněna, jestliže se vektorová DNA integruje do úseku, který již má vysokou transkripční aktivitu. '
Po integraci vektoru do transkripčně aktivního úseku se provede amplifikace genu selekcí na gen DHFR. -Pomocí tohoto systému . lze získat klony - selektované použitím nízké koncentrace methotrexatu (50nM), které obsahují několik' (<10) kopií vektoru a které' vylučují .vysoké hladiny proteinu (>55 pg/buňka/den). Navíc toho lze dosáhnout v relativně krátké době. Avšak úspěch amplifikace j'e proměnlivý. Některá transkripčně aktivní místa nemohou být amplifikována a tudíž frekvence a rozsah amplifikace z určitého místa nelze předpovědět.
Celkově však představuje toto použití translačně oslabených vektorů výrazné zlepšení ve srovnání se způsobem náhodné integrace. Avšak stále zde zůstává' vážný problém chybějící kontroly integračního místa, jak jsme již diskutovali dříve.
Jednou možností, jak překonat problém náhodné integrace, je genové cílení (targeting), kdy je exogenní DNA nasměrována' do specifického lokusu v hostitelském genomu. Exogenní DNA -je vložena pomocí homologní rekombinace, ke které . dojde mezí sekvencí DNA expresního vektoru a odpovídající homologní sekvencí v genomu. Avšak zatímco k tomuto typu rekombinace dochází přirozeně a s vysokou • · 9
9 9 9 9 ”9 ·
9 frekvencí u kvasinek a jiných hub, u vyšších eukaryotických organismů' je to velmi vzácná událost. V savčích buňkách je poměr frekvence homologní rekombinace . k nehomologní (tj. náhodné integraci) v rozmezí 1/100 až 1/500 (např. Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989, Morrow and Kucherlapati, Cum
Op. Biotech. 4: 577-582, 1993).
Jedna z prvních zpráv popisující homologní rekombinaci u savčích buněk se týkala umělého systému vytvořeného v myších fibroblastech (Thomas et ·η1., Cell44: 419-428, 1986). Byla vytvořena buněčná linie, která obsahuje mutovanou nefunkční verzi genu neo integrovanou do hostitelského genomu, a potom byla zacílena druhou nefunkční kopií neo, která obsahuje odlišnou mutaci. Díky genovému cílení došlo k rekonstrukci funkčního genu neo. Homologní rekombinace byla identifikována pomocí selekce buněk na rezistenci k G418 a·byla potvrzena analýzou genomové DNA izolované z rezistentních klonů. Nedávno bylo popsáno užití homologní rekombinace těžkých a lehkých imunoglobulinových genů lokusu v buňkách secernujících protilátky
202 238, Fell et al., 1993). Ale tento konkrétní přístup není široce využitelný, neboť je omezen pouze na produkci imunoglobulinů v .buňkách, které endogenně exprimují imunoglobuliny, tj . B-buňky a myelomové buňky . Exprese je také omezena na úroveň jedné genové kopie, neboť koamplifikace pb genové integraci není součástí systému. Způsob je navíc komplikován skutečností, že jsou potřebné dvě samostatné integrační události, aby došlo k produkci funkčního imunoglobulinu: jedné pro gen lehkého řetězce a pak k jedné pro gen těžkého řetězce.
Další příklad takového systému byl popsán pro buňky NS/10, kde jsou exprimovány rekombinantní imunoglobuliny, k nahrazení v endogenním (US patent č, ·· · · ·· a' to homologní rekombinací do lokusir 2A imunoglobulinu gama (Hollis ' et al., Mezinárodní patentová přihláška PCT/IB9500014). Expresní hladiny získané z tohoto místa byly mimořádně vysoké - řádu 20 .pg/buňka/den- z integrace jediné kopie genu. Avšak, stejně jako ve výše uvedeném příkladu, exprese je omezena na tuto hladinu, neboť v systému není současně integrován žádný.amplifikovatelný gen. A také jinými vědci' byla popsána aberantní glykosylace rekombinantních proteinů exprimovaných v buňkách NS/0 (např. viz Flesher et al., Biotech. and Bioeng. 48: 399-407, 1995), což značně omezuje využitelnost tohoto systému.
Rekombinační systém cre-loxP bakteriofága Pl byl nedávno adaptován a použit jako nástroj genového cílení v eukaryotických' buňkách. Konkrétně byla provedena místně specifická integrace exogenní DNA do genomu buněk ovarií čínského křečka (CHO) použitím rekombinázy cre a série vektorů obsahujících lox (Fukushiga a Sauer, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7905-7909, 1992) . Tento systém je velmi atraktivní, neboť poskytuje reprodukovatelnou expresi v témže chromosomovém místě. Ale nebylo vyvinuto žádné úsilí k tomu, aby se stanovilo chromosomové místo, kde je exprese optimální a podobně jako ve výše uvedeném příkladu, exprese v tomto systému je omezena na úroveň jediné genové kopie. Systém je také komplikován skutečností, že je třeba dosáhnout exprese funkčního rekombinázového enzymu v savčí buňce.
Užití· homologní rekombinace mezi sekvencí vnesené DNA a jejím endogenním chromosomovým lokusem bylo také popsáno 1 jako systém, který poskytuje užitečný nástroj pro genové manipulace v savčích buňkách a také v kvasinkách (viz např. Bradley et al., Met. Enzymol. 223: 855-879, 1993, Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989, Rothstein et al., Met. Enzymol. 194: „281-301, 1991). Dodnes byla většina výzkumů cílení ·· · ···· 9 9 9·
9 9 9 9 9 9 9 9 9 • · · · · · · 9 · ··· · · ·
9 9 9 9 · · ··♦ · ·· ·· 99 99 v savčích genech zaměřena na narušení/vyřazení funkce genu (knock-out) nebo na místně-specifickou mutagenezí vybraných cílových genových lokusů v kmenových buňkách myších embryí (ES) . Vytvoření těchto myších knock-out modelů umožnilo zkoumat specifický vztah strukura-funkce a vyšetřit biologický význam mnoha myších genů. Toto pole výzkumu má také řadu potenciálních aplikací v oblasti genové terapie.
V současnosti byly také popsány vektory firmy Cell-tech (Kent, U.K.), které jsou zacíleny do transkripčně aktivních míst buněk NSO, a které nevyžadují genovou amplifikaci (Peakman ét al. , Hum. Antibody hybridomas 5: 65-74, 1994) .
Avšak hladina sekrece imunoglobulinů v těchto buňkách bez amplifikace nepřesahovala podle publikace 20 pg/buňka/den, zatímco u amplifikovaných buněk CHO je možné dosáhnou až 100 pg/buňka/den (Peakman et al, 1994) .
Je proto vysoce žádoucí vyvinout systém genového cílení, který umožní reprodukovatelně integrovat exogenní DNA do předem určeného místa genomu, o kterém se ví, že je transkripčně aktivní. Bylo by také žádoucí, aby takový systém dále umožňoval koamplifikaci vložené DNA po integraci. Takový systém by dovolil reprodukovatelnou expresi vysoké úrovně libovolného. požadovaného genu v savčí buňce, a nepochybně by byl předmětem zájmu mnoha výzkumných pracovníků.
Podstata vynálezu
V této přihlášce se popisuje nový expresní systém pro savčí buňky, založený na homologní rekombinaci, ke které dochází mezi dvěma umělými substráty obsaženými ve dvou různých vektorech. Konkrétně tento systém užívá kombinace • · ··· «
9 ·· 99 > 9 9 9 » 9 9 · ··9 999 dvou nových savčích expresních vektorů, pojmenovaných zde jako markerový (markerový) vektor a cílový vektor, markerový vektor genomu,
V podstatě označení místa v savčím.
umožni které identifikaci a je transkripčně aktivní, tj'. místo, kde je vysoká genová exprese. Toto místo (hot spot) genomu. Po expresní systém podle lze považovat za žhavé místo integraci markerového vektoru, předkládaného vynálezu umožní, aby se další DNA,, tj . cílový vektor, integrovala do tohoto místa, a sice prostřednictvím homologní rekombinace, ke které dojde mezi DNA sekvencemi společnými pro oba vektory. Tento systém přináší významné výhody ve srovnání s jinými systémy homologní rekombinace.
Na rozdíl ' od jiných systémů homologní rekombinace užitých u savčích buněk, systém podle předkládaného vynálezu nevykazuje žádné pozadí. Tudíž buňky, u kterých došlo jen k náhodné integraci vektoru, nepřežijí selekci. Takže jakýkoliv požadovaný gen klonovaný do cílového plazmidu je exprimován na vysoké hladině z označeného, žhavého, místa. Takže způsob genové exprese podle vynálezu podstatně nebo zcela odstraňuje problémy, které jsou vlastní systému náhodné integrace, které jsme diskutovali v předchozím textu. Navíc tento systém poskytuje pro' jakýkoliv rekombinantní protein reprodukovatelnou expresi vysoké úrovně ze stejného transkripčně aktivního místa savčího genomu. Navíc, genová ampli fikace transkripčně v tomto může být ovlivněna aktivním místě vložením amplifikovatelného dominantního selektovatelného markéru (např. DHFR) jakožto součásti markerového vektoru.
konkrétním
Předmětem předkládaného vynálezu je tedy zlepšený způsob cílení integrace požadované DNA do specifického místa v savčí buňce. — '
44 4 ·· ·· ·· ·· • 4 0 · 0 4 4 · · 4 · 4 4 4 · • · 404 4 ··· 444 ·«· · ·
44 04 ··
Konkrétním předmětem vynálezu je zlepšený způsob' cílené integrace požadované DNA do specifického .místa v , savčí buňce homologní rekombinací.
Dalším předmětem vynálezu jsou nové vektory k dosažení místně specifické integrace požadované DNA v savčí buňce.
Ještě dalším předmětem vynálezu jsou nové savčí buněčné linie, které obsahují požadovanou DNA integrovanou v předem určeném místě, které poskytuje vysokou expresi.
Vynález dále poskytuje nový způsob dosažení místně specifické integrace požadované DNA v buňkách ovarií čínského křečka (CHO).
Dalším specifickým předmětem vynálezu je , způsob integrace imunoglobulinových genů, nebo jakýchkoliv' jiných genů, do předem určeného chromosomového místa v savčí buňce, které poskytuje vysokou expresi.
Dalším specifickým předmětem vynálezu jsou nové vektory a kombinace vektorů, které jsou vhodné pro integraci imunoglobulinových genů do předem určeného chromosomového místa v savčí buňce, které poskytuje vysokou expresi.
Dalším předmětem vynálezu jsou savčí buněčné linie, které obsahují imunoglobulinové geny integrované v předem určeném místě, které poskytuje vysokou expresi.
Dalším specifickým předmětem vynálezu je nový způsob integrace imunoglobulinových genů do buněk' CHO, které poskytují vsokou expresi a také nové vektory a kombinace vektorů, které umožňují takovou integraci imunoglobulinových genů do buněk CHO.
Navíc jsou specifickým předmětem.předkládaného vynálezu nové linie buněk CHO, které obsahuj i imunoglobulinové geny integrované v předem určeném místě, které poskytuje vysokou expresi, a které byly amplifikovány selekcí na methotrexatu, aby vylučovaly ještě .větší množství funkčních imunoglobulinů.
0 0 0 • 0
0
· ·
00 ·· 0 0 0
Popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje mapu markerového. plazmidu podle předkládaného vynálezu označeného Desmúnd. Plazmid je znázorněn jak v kruhové forměí (la) tak i v linearizované verzi (lb) použité pro transfekci.
Obr.· 2(a) ukazuje mapu cílového plazmidu označeného Molly. Pl.azmid Molly zde kóduje imunoglobulinové geny antiCD20, jejichž exprese je popsána v příkladu 1.
Obr. 2 (b) ukazuje linearizovanou verzi Molly, tj . po štěpení enzymy Kpnl a Pacl. Tato linearizovaná forma byla užita pro transfekci.
Obr. 3 znázorňuje potenciální přiřazení (alignment) sekvencí plazmidu Desmond integrovaných do genomu CHO buňky a cílových sekvencí plazmidu Molly. Je' také uvedeno jedno možně uspořádání plazmidu Molly integrovaného do plazmidu Desmond po homologní rekombinaci.
Obr. 4 ukazuje analýzu Southernovým přenosem klonů s jedinou kopií plazmidu Desmond. Vzorky byly následující:
Dráha 1: velikostní standard XHindlII DNA, dráha 2: klon Desmond 10F3, dráha 3: klon Desmond 1002, dráha 4: klon Desmond 15C9, dráha' 5: kloň Desmond 14B5, dráha 6: klon Desmond 9B2.
Obr. 5 ukazuje analýzu northernovým přenosem klonů s jednou kopií Desmond. Panel A: northernový ' přenos se sondami CAD a DHFR, jak je popsáno na obrázku. Panel B: duplikátní northernový přenos se sondami CAD a HisD, jak je • ft ft · · · · * · ···· «··· • · ftftft ··· · ftftft ftftft • · · .· · · · • ftft · ftft ftft ftft ft* popsáno na obrázku. Vzorky RNA nanesené v panelech A a B byly následuj ící:
Dráha 1: klon 9B2, dráha 2: klon 10C12, dráha 3: klon 14B2, dráha 4: klon 15C9, dráha 5: kontrolní RNA z CHO transfekováných plazmidy obsahujícími HisD a DHFR, dráha 6 : netransfekované CHO.
Obr. 6 ukazuje analýzu Southernovým přenosem klonů, které vznikly po homologní integraci Molly do Desmond. Vzorky byly následující:
Dráha 1: velikostní standard XHindlII DNA, dráha 2: 20F4, dráha 3: 5F9, dráha 4: 21C7, dráha 5: 24G2, dráha 6: 25E1, dráha 7: 28C9, dráha 8: 29F9, dráha 9: 39G11, dráha 10: 42F9, dráha ll:50G10, dráha 12: DNA plazmidů Molly linearizovaného BglII (vrchní pás) a štěpeného BglII a KpnI (dolní pás), dráha 13: netransfekovaný Desmond.
Obr. 7A až 7G uvádí výpis sekvence Desmond.
Obr. 8A až 81 uvádí výpis sekvence MOlly obsahující anti-CD20.
Obr. 9 znázorňuje mapu cílového plazmidů Mandy, který zde kóduje geny anti-CD23, jejichž exprese je popsána v příkladu 5.
Obr. 10A až ION uvádí výpis sekvence Mandy obsahující geny anti-CD23, jak je popisuje příklad 5. ' • · · • · · • ··· · • ·
• · ··· · • · ···· ·· · · · · ·· ··
Předkládaný vynález poskytuje nový způsob integrace požadované exogenní DNA v cílovém místě uvnitř genomu savčí buňky prostřednictvím homologní rekombinace. Vynález také poskytuje nové vektory pro dosažení místně specifické integrace DNA v cílovém místě uvnitř genomu savčí .buňky..
Konkrétněji způsob klonování podle předkládaného vynálezu poskytuje místně specifickou integraci požadované DNA do savčí buňky transfekci této buňky markerovým plazmidem, který obsahuje jedinečnou sekvenci, která je cizorodá vzhledem k genomu savčí buňky a která poskytuje substrát pro homologní rekombinaci, která je pak následována transfekci cílovým plazmidem, obsahujícím sekvenci, která zajistí homologní rekombinaci s jedinečnou sekvencí obsaženou v markerovém plazmidu, a dále obsahujícím požadovanou DNA, která má být integrována do savčí buňky. Typicky integrovaná DNA kóduje požadovaný protein, jako je např. imunoglobulin nebo jiný vylučovaný savčí glykoprotein.
Systém .homologní rekombinace demonstrovaný v příkladech užívá genu neomycínfosfotransferázy jako dominantního selektovatelného markéru. Tento markér byl užit na základě dříve publikovaných zjištění, že
I) je schopen zacílit a obnovit funkci mutované verze genu neo (viz dříve uvedené citace), a
II) na základě našeho vývoje translačně oslabených expresních vektorů, ve kterých byl gen neo uměle vytvořen v podobě dvou exonů s požadovaným genem vloženým jako intron, kdy exony neo byly správně sestřiženy a translatovány in vivo, čímž vznikl funkční protein, který udělil vzniklé buněčné populaci rezistenci ke G418.
V této přihlášce je gen neo rozdělen do třech exonú. Třetí exon neo je umístěn na markerovém plazmidu a integruje se do hostitelského genomu po integraci markerového plazmidu ·*·· «· ·· ·· ·· ·· · · · · · · · · · • · · · · · ···« • · · · · ··· · ··· ··« • · ·· · · · ·»· · ·· ·· ·· ·· , . .
do savčí buňky. Exony 1 a 2 jsou přítomny v cílovém. plazmidu a jsou odděleny vmezeřeným intronem, do kterého je klonován alespoň jeden požadovaný gen. Homologní rekombinace cílového vektoru s integrovaným markerovým vektorem vede ke správnému sestřihu všech třech exonů genu neo a . tudíž k' expresi funkčního proteinu neo (jak bylo zjištěno selekcí kolonií rezistentních k G418). Před navržením současného expresního systému jsme testovali funkčnost takového konstruktu neo genu s trojím sestřihem v savčích buňkách. Výsledky tohoto kontrolního pokusu ukázaly,, že všechny tři exony neo genu bylý správně sestřiženy a tudíž je vhodný pro předkládaný vynález.
' Ačkoliv je vynález demonstrován pomocí genu neo, a konkrétně trojnásobně rozděleného genu neo, způsob .podle vynálezu je vhodný i pro jiné dominantní selektovatelné markéry.
Jak bylo již podrobně diskutováno výše, předkládaný vynález poskytuje mnohé výhody vzhledem ke konvenčním metodám exprese genů, včetně náhodné integrace a cílení- genů. Předkládaný vynález poskytuje způsob, který reprodukovatelně, umožňuje místně specifickou integraci požadované DNA do transkripčně aktivní domény savčí buňky. Kromě toho, jelikož způsob podle vynálezu vnáší do buňky umělý úsek homologie, který působí jako jedinečný substrát pro homologní rekombinaci a inzerci požadované DNA, účinnost způsobu podle vynálezu nevyžaduje, aby buňka endogenně obsahovala nebo exprimovala specifickou DNA. Takže způsob je použitelný obecně na všechny savčí buňky a lze ho užít k expresi jakéhokoliv typu rekombinantního proteinu.
Použití trojitě sestřiženého selektovatelného markéru, v příkladném provedení trojitě sestřiženého konstruktu neo, je zárukou toho, že všechny vzniklé kolonie rezistentní ···· ·· ·· ·· »· • ·· · · * · · • · · · · ·· · • · · ··· · ··· ··· • · · · · ·· ·· ·· ·· k G418 jsou důsledkem homologní rekombinace (náhodné integrace nevede k produkci funkčního neo genu. u tudíž neumožní přežití na G418). Takže vynález usnadňuje testování' a selekci požadované homologní rekombinace. A kromě toho je frekvence náhodné integrace v buňce, ve které dochází k homologní rekombinaci, velmi nízká.
Vzhledem k tomu, co bylo již dříve uvedeno, je zřejmé,že významnou výhodou vynálezu je to, že podstatně snižuje počet kolonií,které je třeba testovat pro identifikaci vysoce produktivních klonů, tj . buněčných linií obsahujících požadovanou DNA, které secernují požadovanýprotein ve vysoké hladině. V průměru je možné identifikovat klony obsahující .integrovanou požadovanou DNA pomocí screeningu az kolonií (ve srovnání s několika tisíci, které je třeba testovat při použití standardní náhodné integrace, nebo několika sty při užití dříve popsaných vektorů pro intronovou .inzerci). Navíc, jelikož bylo místo integrace předem vybráno a obsahuje transkripčně aktivní doménu, každá endogenní DNAexprimovaná v tomto ' místě bude poskytovat srovnatelnou, tj. vysokou hladinu požadovaného proteinu.
Navíc je předkládaný vynález výhodný tím, že umožňuje vložení amplifikovatelného genu integrací markerového vektoru. Takže' když je požadovaný gen zacílen do takového místa pomocí homologní rekombinace, vynález umožňuje, aby se exprese ještě zvýšila genovou amplifikaci. Co se tohoto týče, v odborné literatuře bylo publikováno, že různá genomová místa mají různou kapacitu pro amplifikaci genu (Meinkotů et al., Mol. Cell. Biol. 7: 1415-1424, 1987). Proto je tento způsob dále výhodný tím, že umožňuje umístění požadovaného genu do specifického místa, které je jak transkripčně aktivní tak i snadno amplifikovatelné. To významně snižuje čas potřebný k izolaci takových vysoce produktivních buněk.
• · • · „
Konkrétně, jestliže konvenční způsoby konstrukce vysoce produktivních savčích buněčných linií mohou zabrat čas 6 až 9 měsíců, předkládaný vynález umožňuje izolaci takových klonů v průměru v čase 3 až 6 měsíců·. To je dáno tím, že konvenčně izolované klony se musí podrobit přinejmenším třem 'běhům genové amplifikace pomocí chemické/lékové rezistence, aby bylo dosaženo uspokojivé výše genové exprese. Jelikož homologně produkované klony jsou vytvářeny z předem vybraného místa, které je místem vysoké exprese, je potřeba menšího počtu amplifikací pro uspokojivou produkci. ..
Navíc předkládaný vynález umožňuje reprodukovatelnou selekci vysoce.produktivních klonů, kde je vektor integrovaný v malém počtu kopií, typicky v jediné kopii. To je výhodné, neboť to zvyšuje stabilitu klonů a zabraňuje případným škodlivým vedlejším účinkům, které může mít velký počet kopií.
Jak již bylo uvedeno výše, systém homologní rekombinace podle vynálezu užívá kombinace markerového plazmidu a cílového plazmidu, které jdou dále podrobně popsáriy.
Markerový plazmid, který je užit k označení a identifikaci traskripčního žhavého místa obsahuje alespoň následující sekvence:
I)Úsek DNA, která je heterologní nebo jedinečná vzhledem ke genomu savčí buňky, což slouží jako zdroj homologie a umožňuje homologní rekombinaci (s DNA obsaženou v druhém, cílovém plazmidu). Konkrétně úsek jedinečné DNA (I) obecně obsahuje bakteriální, virovou, kvasinkovou, syntetickou nebo jinou DNA, 'která normálně není přítomna v genomu savčí buňky a která neobsahuje významnou homologii nebo sekvenční identitu k DNA obsažené v genomu savčí buňky. Tato sekvence musí být nezbytně dostatečně odlišná od savčí DNA, takže nedochází k rekombinaci s hostitelským genomem • · φ φ · φ φφφφ • · « φ φ · · · · · · · φφφ • · · · · · φ ··· φ ·· φφ Φ· ·· prostřednictvím homologní rekombinace. Velikost takové jedinečné DNA je obecně alespoň 2 až 10 kilobasí, nebo více, výhodněji nejméně 10 kb, neboť některé jiné výzkumy uvádějí zvýšenou' frekvenci cílené rekombinace, když je zvětšena velikost homologního úseku (Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989).
Horní limit velikosti „jedinečné DNA, která slouží jako místo pro homologní rekombinací se sekvencí v druhém cílovém vektoru, je dána z velké míry omezeními plynoucími ze stability (jestliže je DNA příliš- velká, nesnadno se integruje do chromosomu, a navíc s příliš velkou DNA se obtížně pracuje).
II) DNA obsahující fragment DNA selektovatelného markéru, typicky exon dominantního selektovatelného . markerového genu. Jedinou nezbytnou vlastností takové DNA je to, že nekóduje funkční selektovatelný markerový protein, dokud není exprimována ve spojení se sekvencí obsahující cílový plazmid. Typicky cílový plazmid obsahuje zbývající exony dominantního selektovatelného markerového genu (ty, které nejsou obsaženy v cílovém plazmidu). Funkční selektovatelný markér je nezbytně produkován pouze, pokud dojde k homologní rekombinací (která vede k asociaci a expresi markerové sekvence DNA (Ij společně s částí fragmentu DNA selektovatelného markéru, která je obsažena' v cílovém plazmidu.
Jak bylo již uvedeno, předkládaný vynález užívá jako příklad dominantního . selektovatelného markéru, který je rozdělen do dvou vektorů, gen neomycinfosfotransferázy. Ale i jiné selektovatelné markéry jsou vhodné, např. gen pro histidinoldehydrogenázu, gen hygromycinfosfotransfer-ázy ze salmonely, gen thymidinkinázy z viru Herpes simplex, gen • ·
• · adenosindeaminázy, gen glutaminsyntetázy gen hypoxantinguaninfosforibosyltransferázy.
III) DNA, která kóduje protein funkčního selektovatelného markéru, kterýžto selektovatelný markér je odlišný od selektovatelné markerové DNA· (II). Tento markér umožňuje úspěšnou selekci savčích buněk, ve kterých je markerový plazmid úspěšně -integrovaný v buněčné DNA. Výhodněji je žádoucí, aby markerový plazmid obsahoval dvě DNA dominantního selektovatelného markéru, které jsou umístěny na opačných koncích vektoru. To je výhodné proto, že to umožňuje selekci integrantů pomocí různých selekčních činidel a dále to umožňuje selekci buněk, které obsahují celý -vektor. Navíc jeden z markérů' může být amplifikovatelný markér, který podporuje amplifikací genu, jak bylo popsáno v předchozím textu. Kterýkoliv z dominantních selektovatelných -markérů uvedených v (II) může být' užit stejně dobře jako další odborníkovi známé markéry.
Navíc markerový plazmid může ještě volitelně obsahovat vzácná místa pro restrikční endonukleázy. To je případně potřebné pro usnadnění štěpení. Pokud jsou taková místa přítomna, měla by být v blízkosti středu jedinečného úseku, který působí jako substrát pro homologní.rekombinaci. Výhodně je taková sekvence dlouhá alespoň 12 nukleotidů. Bylo popsáno, že vnesení dvouřetězcového zlomu podobným způsobem zvyšuje frekvenci homologní rekombinace (Choulika et al. , Mol. Cell. Biol. 15; 1968-1973, 1995). -Avšak přítomnost takové sekvence není nezbytná.
Cílový plazmid obsahuje alespoň následující sekvence:
1)Stejný jediněčný úsek DNA, který je obsažen také v markerovém plazmidu nebo takový úsek DNA, který má dostatečnou homologii nebo sekvenční identitu, tak aby uvedená DNA byla schopna homologní rekombinace s jedinečným φ φ φ φ φ φφφφ φ φ φ φ φ φ φ φ »φ φφφ úsekem (I) ve markerovým plazmidu. Vhodné typy DNA již byly popsány výše v popisu jedinečného úseku DNA (1) markerového plazmidu.
2) Zbývající exony dominantního selektovatelného markéru, z nichž jeden exon je obsažen jako (II) v markerovém plazmidu popsaném výše. Nezbytnou vlastností tohoto fragmentu DNA je to, že poskytuje funkční (selektovatelný) .markerový protein pouze v případě, jestliže se cílový, plazmid integruje homologní rekombinací (kde taková rekombinace; vede k asociaci této DNA s jiným fragmentem DNA selektovatelného markéru obsaženým ve markerovým plazmidu), a dále to, .že umožňuje inzerci požadované exogenní DNA. Typicky tato DNA obsahuje zbývající exony DNA selektovatelného markéru, které jsou odděleny intronem. Např.. tato DNA obsahuje první dva exony genu neo a markerový plazmid obs'ahuje třetí 'exon (zadní třetinu genu neo) .
3) Cílový plazmid také obsahuje požadovanou DNA, např. DNA kódující požadovaný polypeptid, výhodně vloženou do fragmentu DNA selektovatelného markéru, obsaženého v plazmidu. Typicky je DNA vložena' do intronu, který leží mezi exony DNA selektovatelného markéru. To. zaručuje, že požadovaná DNA se také integruje, jestliže dojde k homologní rekombinací cílového plazmidu a markerového plazmidu. Tento intron buď může být přirozeně se vyskytující intron nebo může · být uměle· vytvořen ve fragmentu DNA dominantního selektovatelného markéru.
Tato DNA kóduje požadovaný protein, .výhodně takový protein, který má požadované farmaceutické nebo jiné vlastnosti. Typicky kóduje DNA savčí protein., např.. to je imunogiobulin nebo imunoadhesin, jak je dále uvedeno v příkladech. Avšak vynález se v žádném případě neomezuje pouze na produkci imunoglobulinů.
·· · ···«·'·· • · · · · · » · · 1 11 1 · » 111 · 111 111 • ι 11 1 11 ··· · ·♦ ·· ·· 9·
Jak bylo již uvedeno dříve, způsob klonování podle předkládaného vynálezu je vhodný pro jakoukoliv savčí buňku, neboť pro svou účinnost nevyžaduje přítomnost'· žádné specifické sekvence nebo sekvencí.' Obecně k takovým savčím buňkám patří buňky, které se typicky užívají k expresi proteinů jako jsou např. buňky CHO, myelomové buňky, buňky COS, BHK, Sp2/0, NIH. 3T3 a HeLa. V následujících příkladech byly užity buňky CHO. K jejich výhodám patří to, že jsou schopné dobře růst v kultuře až do vysoké hustoty, a že jsou schopné exprimovat savčí proteiny jako jsou např. imunoglobuliny v biologicky aktivní formě.
Buňky CHO byly kromě toho z větší části vybrány i proto, že byly již předtím použity původci pro expresi imunoglobulinů (pomocí vektorů ‘ obsahujících translačně oslabený dominantní seléktovatelný markér, -popsaných dříve). tudíž v laboratoři původce měli značnou zkušenost s použitím těchto buněk pro expresi. Ale na základě uvedených příkladů lze rozumně očekávat podobné výsledky i při použití jiných savčích buněk.
Obecně transformace nebo transfekce savčích buněk podle předkládaného vynálezu se provádí obvyklým způsobem odborníkovi známým. Aby byl vynález podrobněji a srozumitelněji vysvětlen, uvádíme následující příklady konstrukce vektorů a jejich použití.
* ·· 9
• · · · » · · · » · · · » ♦ ··· » · 9
9 9 9
Příklady, provedení vynálezu
Příklad 1
Návrh a příprava markerových a cílových plazmidových vektorů
Markerový plazmid nazvaný Desmond byl sestaven z následujících prvků:
a) Gen dihydrofolátreduktázv (DHFR) z myši, vložený do transkripční kazety, obsahující betaglobinový promotor myši na 5-konci před počátečním místem DHFR a polyadenylační signál bovinního růstového hormonu na 3'konci od stop-kodonu. Transkripční kazeta DHFR byla izolována z TCAE6, expresního vektoru vytvořeného dříve v naší laboratoři (Newman et al. , 1992, Bidtechnology 10: 1455-1460).
b) Gen β-galaktoosidázy z E. coli - komerčně dostupný, získaný od firmy Promega jako kontrolní vektor ppSV-βgalaktosidáza, katalog, č. E1081.
c) DNA bakuloviru, komerčně dostupná, získaná· od firmy Clontech jako pBAKPAKS, katalog, č. 6145-1.
d) Kazeta obsahující promotorový a zesilovací prvek z cytomegaloviru a viru SV40. Tato kazeta byla vytvořena pomocí PCR z derivátu expresního vektoru TCAE8 (Reff et al., Blood 83:' 435-445, 1994. zesilovací kazeta byla vložena do bakulovirové sekvence, která byla předtím modifikována vložením vícenásobného klonovacího místa.
e) Gen GUS (glukuronidáza) z E. coli, komerčně dostupný·, získaný od firmy Clontech jako pBlOl, katalog, č. E1541.
f) Gen luciferázy světlušky, komerčně dostupný, získaný od firmy Promega jako pGem-luc, katalog, č. E1541.
g) Gen histidinoldehydrogenázy (HisD) ze S. typhímurium.
Tento gen nám byl původně darován (Donahue et al, Gene 18: 47-59, 1982) a byl vložen do transkripční kazety obsahující • · » · • · · • · · • ··· • * » · · • · · · » · · · » · · · ·· · ··· • · • · · · myší β-globinový promotor na' 5'-konci genu a polyadenylační signál SV40 na 3:-konci genu.
Prvky DNA popsané v odstavcích a) až g) byly vloženy do plazmidové kostry odvozené z plazmidu pBR a vytvořili souvislý úsek DNA velikosti 7,7 kb, který je nazván na přiložených obrázcích „homologie . Termín homologie se v tomto smyslu týká sekvencí DNA, které nejsou součástí savčího genomu a jsou užity k tomu, aby podpořily homologní rekombinaci mezi trensfekovanými plazmidy, které sdílejí stejné homologní sekvence DNA.
h)Gen neomycinfosfotransferázy z TN5 (Davis a Smith, Ann. Rev. Micro 32: 469-518, 1978). Úplný gen neo byl subklonován do plazmidu pBluescriptSK-(Stratgene., katalog, č. 212205) pro usnadnění genové manipulace. Pak. byl syntetický linker (spojovací prvek) vložen do jedinečného místa Pstl vyskytujícího se v kodonech pro aminokyseliny 51 až 52 genu neo. Linker kódoval nezbytné DNA prvky pro vytvoření umělého donorového setřihového místa („splice donor), vmezeřeného intronu a akceptorového sestřihového místa (splice acceptor) v genu neo, čímž se vytvořily dva oddělené exony, které jsou označeny jako exony neol a neo2. Kodon neol kóduje prvních 51 aminokyselin neo a exon neo2 kóduje zbývajících 203 aminokyselina stop-kodon proteinu A. V intronu bylo také vytvořeno klonovací místo Notl.
Exon neo2 byl dále rozdělen tak, že vytvořil exony neo2 a neo3. Toho bylo dosaženo takto: Byla navržena sada primerů PCR pro amplifikaci úseku DNA kódujícího exon neol, intron a prvních 111 2/3 aminokyselin exonu neo2. PCR primer na 3'konci vedl k vložení nového 5'sestřihového místa ležícího bezprostředně za druhým nukleotidem kodonu pro 111 aminokyselinu v exonu ,neo2, tudíž k vytvoření nového menšího exonu 2. Fragment DNA kódující původní exon 1, intron a nový ····
• · · · · ··· · ··· ··· • · · · · · · ··· · ·· ·· ·· ··
2 exon 2 byl pak subklonován a pomnožen ve vektoru odvozeném z pBR. Zbytek původního exonu 2 byl užit jako templát pro jiný cyklus PCR, kdy se vytvořil exon 3. 5'primer pro tuto PCR vnesl nové akceptorové sestřihové místo na 5'konci nově vytvořeného exonu 3, tj. před posledním nukleotidem kodonu pro 111. aminokyselinu.. Výsledné 3 exony genu neo kódují následující informaci: exon 1 - prvních 51 aminokyselin neo, exon 2 - dalšícj 111 2/3 a exon 3 - konečných 91 1/3 aminokyselin a translační stop-kodon genu neo.
Exon neo3 byl vložen společně s výše uvedenými DNA prvky do markerového plazmidu „Desmond. Exony neol a neo2 byly vloženy do cílového plazmidu „Molly. Klonovací místo Notl vytvořené v intronu mezi exony 1 a 2 bylo užito v následujících klonovacích krocích pro vložení požadovaných genů do cílového plazmidu.
Byl také vytvořen druhý cílový plazmid „Mandy. Tento plazmid je téměř shodný s plazmidem „Molly (některá restrikční místa ve vektoru byla změněna), až na to, že původní geny HisD a DHER byly inaktivovány. Tyto změny byly do plazmidu vneseny proto, že buněčná linie Desmond již nebyla dále kultivována za přítomnosti histidinolu, proto nebyla nutná přítomnost druhé kopie genu HisD. Navíc byl inaktivován gen DHFR, aby bylo jisté, že pouze jediný gen DHFR, a sice ten, který je přítomen v markerovém místě plazmidu Desmond, bude amplifikovatelný ve vzniklé buněčné linii. Plazmid „Mandy byl tedy z plazmidu „Molly odvozen pomocí následujících modifikací:
I) Do středu kódujícího úseku DHFR byl vložen syntetický linker. Tento linker vytvořil stop-kodon a posunul zbývající úsek kódující DHFR mimo čtecí rámec, čímž se tento gen stal nefunkčním.
999 ·
• · · · · · · « · · • · · · · · ··· • · · · · ··· · ··· ·· • · · · · · ··· · · · 9 9 9 9 9 9
23
II)Část genu HisD byla odstraněna a nahrazena fragmentem ;
HisD, který byl vytvořen pomocí' PCR a postrádal promotor
a počáteční kodon genu
Obrázek 1 ukazuje uspořádání těchto DNA prvků
v markerovém plazmidu „Desmond. Obrázek 2 . znázorňuje uspořádání těchto DNA prvků v prvním cílovém plazmidu „Molly. Obrázek 3 ukazuje možné uspořádání různých prvků DNA v .genomu CHO, jes-tliže došlo k integraci DNA plazmidu Molly do CHO buněk označených pomocí plazmidu Desmond. Obrázek 9 znázorňuje cílový plazmid Mandy.
Konstrukce markerového i cílového plazmidu z výše uvedených prvků DNA byla provedena pomocí standardních způsobů odborníkovi známých (viz např. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, J. Sambrook et al., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory Press,- Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Asubel et al., eds., 1987, John Wiley and Sons). Všechny plazmidy byly množeny a udržovány pomocí E. coli XLI blue (Stratagene, katalog.' č. 2Ό0236). Příprava plazmidů ve velkém měřítku byla provedena pomocí soupravy Wizard Maxiprep DNA Purífication System© (Promega) podle pokynů výrobce.
Příklad 2 /
Příprava označené linie buněk CHO
1. Buněčná kultura a transfekce buněk pro přípravu označené linie CHO
DNA markerového plazmidu byla línearizována štěpením BstllO7I přes noc při 37°C. Linearizovaný vektor se precipitoval etanolem a resuspendoval ve sterilním TE na • ·· · • · · · · ··· · ··· ··· • · · · · · · ··· · ·· ·· ·· ·· koncentraci l· mg/ml. Linearizovaný vektor byl vnesen do buněk ovarií čínského křečka (CHO buněk) DG44 (Urlaub et al., Som, Cell and Mol. Gen. 12:· 555-566, 1986) elektroporací podle následujícího postupu:
Exponenciálně rostoucí buňky byly sklizeny centrifugaci, jedenkrát promyty v ledovém SBS (pufrovaný roztok sacharózy: 272mM sacharóza, 7mM fosforečnan sodný, pH 7,4, lmM chlorid hořečnatý) a pak resuspendovány v SBS na' koncentraci 10' buněk/ml. Po 15minutové inkubaci na ledu bylo 0,4 ml buněčné suspenze smícháno se 40 pg linearizované DNA v elektroporačníkyvetě na jedno použití. Buňky byly podrobeny- elektrickému „šoku pomocí zařízení Electrocell manipulátor, BTX (San Diego, CA) s nastavením napětí na 230 V, kapacitance 400 pF a odporu 13 Ω. Buňky byly po šoku smíchány s 20 ml předehřátého kultivačního média pro CHO buňky (CHO-S-SEMIL, Bibco/BRL, katalog. č. 31033-012) a vysety na 96jamkové destičky pro tkáňové kultury. 48 hodin po elektroporací byly destičky naplněny selekčním médiem (v případě kotransfekce s plazmidem Desmond bylo selekčním médiem médium CHO-S-SFMII bez hypoxantinu nebo thymidinu, doplněné 2mM histidinolem (Sigma, katalog. ’č. H6647). Destičky byly udržovány v selekčním médiu po 30 dnů, nebo až dc doby, kdy byl patrný růst buněk v některých jamkách. Tyto buňky pak byly přeneseny z jamky v destičce a dále kultivovány ve 120 ml kultivační rotační, láhvi, kde byly pak udržovány v selekčním médiu po celou dobu.
·· · · ·· tt* ·· tt· • tt · ···· ···· • · tt·· · ···· tttt · tt tt tt·· tt ··· ··« • · · · · tttt ··· · ·· ·· ·· ··
5
Příklad 3
Charakterizace označených linií CHO
a) Analýza Southernovým přenosem
Genomová DNA byla izolována ze všech trvale rostoucích označených buněk CHO. DNA byla izolována pomocí soupravy Easy®DNA kit firmy Invitrogen podle pokynů výrobce. Genomová DNA byla naštěpena enzymem HindlII přes noc při 37 °C . a pak analyzována Southernovým přenosem .se sondami specifickými pro gen DHFR, které byly připraveny a označeny dioxygeninem pomocí PCR. Hybridizace a promývání byly provedeny pomocí zařízení DIG Easy Hyb (Boehringer
Mannheim, katalogu č. 1603 558) a soupravy DIG Wash and Block Buffer Set (Boehringer Mannheim, katalog, č. 1585 7.62) podle pokynů výrobce. Vzorky DNA obsahující jediný pás hybridizující se sondou DHFR představovaly klony Desmond vzniklé z jediné buňky, ve které se integrovala jediná kopie plazmidu. Tyto klony byly ponechány pro další analýzu. Ze 45 celkem izolovaných rezistentních buněčných linií bylo pouze 5 linií, kde se integrovala jediná kopie. Obr. - 4 ukazuje Southernův přenos všech 5 klonů obsahujících jedinou kopii plazmidu Desmond. Jména klonů jsou uvedena-v popisu obrázku.
b) Analýza northernovým přenosem
Celková RNA byla izolována ze všech klonů obsahujících jedinou kopii Desmond pomocí činidla TRIzol (Gibco/BRL, katalog, č. 15596-026) podle pokynů výrobce. .10 až 20 pg RNA bylo analyzováno ve dvou opakováních na formaldehydovém gelu. Výsledné membrány s přenesenou RNA byly testovány sondami označenými dioxygeninem pomocí PCR, a sice .pro I) messenger (tj., messengerová RNA) DHFR, II) messenger HisD
• · a III) messenger CAD. CAD je trifunkční protein' účastnící se biosyntézy uridinu (Wahl et al., J. Biol. Chem. 254, 17: 8679-8689, 1979), který je exprimován shodně ve všech buněčných typech. Zde byl použit jako vnitřní kontrola a pro pomoc při kvantifikaci nanesené RNA. Hybridizace a promývání byly provedeny pomocí výše zmíněných činidel a zařízení firmy Boehringer Mannheim. Výsledky analýzy northernovým přenosem jsou uvedeny na obr. 5. Klon s jedinou kopií plazmídu Desmond, který má nejvyšší intenzitu signálu jak pro messenger HisD tak pro messenger DHFR je klon 15C9, analyzovaný v dráze 4 v obou panelech na zmíněném obrázku. Tento klon byl nazván označená buněčná linie a použit v dalších cílových experimentech, které jsou uvedeny v následujících příkladech.
Příklad 4
Exprese protilátek anti-CD20 v buňkách - CHO označených plazmidem Desmond
C2B8, chimérická protilátka rozpoznávající povrchový antigen B-buněk CD20, byla klonována a exprimována již dříve v naší laboratoři (Reff et al. , Blood 83: 434-45, 1994). Fragment DNA velikosti 4,1 kb obsahující geny pro lehký a těžký řetězec, společně s nezbytnými regulačními prvky (eukaryotický promotor a polyadenylační signály) byl vložen do umělého intronu vytvořeného mezi exonem 1 -a exonem 2 genu neo obsaženého, v klonovacím vektoru odvozeném z plazmídu pBR. Tento nově vytvořený fragment DNA o velikosti 5 kb (obsahující exon neol, C2B8 a exon neo2) ' byl vystřižen a použít k sestavení cílového plazmídu Molly. Ostatní prvky DNA použité v konstrukci „plazmídu Molly byly shodné s prvky • tr# • t ·· • · · 4 • · · 4 • · · ··· · ·· ·· • · · « • · · · ·· · ··· • · ·· ·« užitými při konstrukci markerového plazmidu Desmond, jak byly popsány dříve. Úplná mapa plazmidu Molly je uvedena na obrázku 2.
Cílový vektor Molly byl před transfekcí linearizován štěpením KpnI a PacI, precipitován etanolem a resuspendován ve sterilním TE na · koncentraci 1,5 mg/ml. Linearizovaný plazmid byl vnesen do exponenciálně rostoucích buněk v podstatě způsobem, který byl popsán, v předchozím textu, s výjimkou toho, že v každé elektroporaci bylo užito 80 gg DNA. 48. hodin po elektroporaci bylo . do 96jamkových destiček přidáno selekční médium CHO-SSFMII se 400 gg/ml geneticinu (G418, Gibco/BRL, katalog.č. 10131-019). Destičky byly udržovány v selekčním médiu po 30 dnů nebo až do doby, kdy se· projevil' růst v některých jamkách. Tento růst’ byl považován expanzí jediné buňky rezistentní k G418.
za klonální Supernatanty ze všech jamek rezistetních , k G418 byly testovány na tvorbu C2B8 standardním testem ELISA a všechny produktivní klony byl rozmnoženy ve 120 ml rotačních kultivačních lahvích a podrobeny další analýze.
Charakterizace zaměřených buněk vylučujících protilátku
V tomto experimentu bylo celkem provedeno 50 elektroporaci s cílovým plazmidem Molly, .přičemž každá byla vyseta na samostatné 96 jamkové destičce. Souhrnně bylo získáno 10 životaschopných klonů .vylučujících protilátku antí-CD20 a pomnoženo ve 120 ml kultivačních lahvích. Ze všech klonů byla izolována genomová DNA, která pak byla analyzována Southernovým přenosem, -aby se určilo, zda' klony představují výsledek jediné homologní rekombinace nebo zda. došlo k další náhodné integraci v téže buňce. Způsob izolace DNA a Southernova analýza byly již popsány v předchozích kapitolách. Genomová DNA byla štěpena EcoRI a testována sondou, kterou, byl fragment konstantního úseku těžkého řetězce CD20 označený pomocí PCR dioxygeninem. Výsledky této Southernovy analýzy jsou uvedeny ,na obr. 6. Jak je na tomto obrázku vidět, 8 z 10 analyzovaných klonů vykazovalo jediný hybridizační pás se sondou CD20, což ukazuje, .že v těchto buňkách došlo k jediné homologní rekombinací. U 2 z 10 klonů, a sice 24G2 a 28C9, se ukázala ještě další pásy, svědčící o tom, že došlo ještě navíc- k náhodné integraci na jiném místě genomu.
U všech 10 klonů byla analyzována hladina protilátek anti-CD20, výsledky této analýzy ukazuje následující tab. 1.
Tabulka 1
Hladina exprese anti-CD20 klonů po homologní.integraci
Klon ‘Anti-CD20 (pg/buňka/den)
20F4. 3,5
25E1 2,4
42F9 1,8
39G11 1,5
21C7 1,3
50G10 0,9
29F9 0, 8
5F-9 0, 3
28C9* 4,5
24G2* 2,1
*Tyto klony obsahovaly ještě další náhodně integrované kopie antiCD20. Hladiny exprese v těchto klonech proto odrážejí příspěvek jako homologní integrace tak i integrace do náhodného místa.
Hladiny exprese jsou uvedeny v hodnotách sekrece jednotlivých klonů v pg na jednu buňku na den (pg/b.uňk'a/den) a představují • ·· · ·· · · • ···· · · · · • · 9 9 9 9 9 9 9 • » · 9 99 9 9 999 999 • 9 9 9 * · ·· 9 9 9 9 9 9 průměrnou hodnotu ze 3 nezávislých testů ELISA na vzorcích odebranýchze 120ml kultivačních lahví.
Jak lze vidět . na údajích v tabulce 1, existuje variabilita ve vylučování protilátky, která představuje až lOnásobek mezi klonem s největší a nejmenší sekrecí. To bylo poněkud nečekané zjištění, neboť jsme očekávali podobné hladiny exprese u všech klonů, neboť gen anti-CD20 se integroval do stejného místa označeného plazmidem ' Desmond. Avšak i tato variabilita je extrémně nízká ve srovnání s tím, co lze získat užitím tradičního způsobu náhodné integrace nebo pomocí našeho dříve popsaného systému s translačně oslabeným vektorem.
Klon 20F4, tj.
klon s nejvyšší produkcí, která je výsledkem jediné integrace, byl vybrán pro další zkoumání.
Následující tabulka 2 ukazuje údaje buněčné kultuře •a testech ELISA ze 7denní produkční kultivace tohoto klonů.
Tabulka 2
Výsledky 7denní produkční kultivace klonu 20F4
Den š životaschopných životaschopné počet/ml (χ 105) Tx2 (hodiny) mg/1 pg/bunka/den
1 96 3,4 31 1,3 4, 9
2 94 6 29 2,5 3, 4
3 94 9,9 33 4,7 3,2
4 90 17,4 30 6, 8 3
5 73 14 8,3
6 17 3, 5 9,5
Klon 20F4 byl na počátku, tj. 0. den, naočkován do 120 ml kultivační láhve v hustotě 2 χ 105 buněk/ml. Po následujících 6 dnů • · · · ♦ · · · • · · · · · ···· • ft ftftft ftftft ft ftftft ftftft • · ftft · « · ··· fi ftft · · ft · ft*
0 se provádělo počítání buněk, stanovila se doba zdvojení kultury a odebral se 1 ml vzorek z kultivační lahve a ten byl analyzován na vylučovanou protilátku anti-CD20 testem ELISA.
Tento klon dosáhl průměrně hodnoty vylučování protilátky 3 až 5 pg/buka/den, jak ukázaly výsledky ELISA testů. Tato Hodnota se.shoduje s hodnotami, které jsme získali již dříve v naší laboratoři také u jiných vysoce exprimujících klonů s jednou kopii genu, které byly připraveny pomocí náhodně se integrujících vektorů s oslabenou translací. Výsledky ukázaly následující fakta:
1) Místo označené v genomu CHO buněk markerovým plazmidem Desmond je transkripčně vysoce aktivní a proto představuje vynikající místo pro expresi rekombinantních proteinů, a
2) Cílení pomocí homologní rekombinace může být provedeno uvedenými vektory a dochází k němu s frekvencí, která je dostatečná k tomu, aby tento systém byl vhodnou a žádoucí alternativou k dosavadnímu způsobu náhodné integrace.
Pro další demonstraci účinnosti tohoto systému bylo ukázáno, že místo je také amplif ikovatelné, což vede ještě k vyšším úrovním exprese a vyššímu ' vylučování proteinu. Amplifikace bylo dosaženo tak, že se na 96jamkovou kultivační misku vyselo sériové ředění buněk 20F4, s počáteční hustotou 2,5 χ 104 buněk/ml, a tyto buňky se potom kultivovaly v médiu CHO-SSFMII, kam se přidal 5, 10, 15 nebo 20nM methotrexat. Klony vylučující anti-CD20 se testovaly ELISA a klony s nejvyšší sekrecí byly dále analyzovány. Souhrn výsledků z tohoto amplifikačního pokusu je uveden v následující tabulce 3.
• · · • •0
Tabulka 3
Souhrnné údaje o amplifikaci 20F4
nM MTX počet testovaných jamek exprese mg/1, 96 jamek počet jamek dále pěstovaných exprese pg/buňka/den kultivační láhev
10 56 3-13 4 10-15
15 27 2-14 3 15-18
20 17 4-11 1 nestanoveno
Amplifikace 20F4 byla provedena jak je popsáno v textu, použitím koncentrací methotrexatu uvedených v tabulce. Supernatanty ze všech přežívajících kolonií na 96 jamkové destičce byly restovány ELISA, rozsah exprese anti-CD20 je uveden ve 3. sloupci tabulky. NA základě těchto výsledků byly vybrány klony s nejvyšší produkcí a dále namnoženy ve 120ml kultivačních lahvích, na vzorcích supernatantu z těchto lahví pak byly provedyn testy ELISA pro stanovení expresní hladiny vyjádřené v 5. sloupci v pg/buňka/den.
Tyto údaje jasně ukazují, že místo může být amplifikováno v přítomnosti methotrexatu.. Klony z amplifikaci s 10 a 15 nM methotrexatem produkovaly v rozsahu 15 až 20 pg/buňka/den.
Klon z 15nm methotrexatu označený 20F4-15A5 byl vybrán jako buněčná linie s nej.vyšší produkcí. Tento klon byl vybrán z 96jamkové destičky, kde rostlo pouze 22 jamek, a proto lze předpokládat, že pochází z jediné buňky. Tento klon byl podroben ještě další amplifikaci s methotrexatem. Jak již bylo popsáno dříve, sériové ředění bylo vyseto na 96jamkové kultivační misky a kultivovalo se v médiu CHO-SSFMII s přídavkem 200, 300 a 400nM methotrexatu. Přeživší klony byly analyzovány ELISA a několik -klonů s vysokou produkcí β · · · bylo namnoženo ve 120 ml k-ultivačních lahvích . a dále analyzováno. ' Přehled výsledků ze druhého amplifikačního experimentu je uveden v následující tabulce 4.
Tabulka 4
Výsledky amplifikace 20F4-15A5
nM MTX počet testovaných jamek exprese mg/1, 96 jamek počet jamek dále pěstovaných exprese pg/buňka/den kultivační láhev
200 67 23-70 1 50-60
300 86 21-70 4 55-60
400 81 15-75. 3 40-50
Amplifikace 20F4-15A5 pomocí methotrexatu byla provedena jak je popsáno v textu. jamky s nejvyšší produkcí, jejichž čísla jsou uvedeny ve 4. sloupci, byly namnoženy ve 120 ml kultivačních lahvích. Exprese buněčných linií odvozených z těchto buněk ke uvedena v 5. sloupci v pg/buňka/den.
Klon s nejvyšší produkcí pochází z amplifikace s 250nM methotrexatem. Tento klon 20F4-15A5-250A6 byl vybrán z 96jamkové destičky, kde rostlo pouze několik málo jamek, proto lze předpokládat, že pochází z jediné buňky. Souhrnně lze uvést, že údaje v tabulkách 3 a 4 přesvědčivě ukazují, že dvojitý proces amplifikace s methotrexatem: je dostatečný pro dosažení hladiny exprese 60 pg/buňka/den, která se blíží kapacitě imunoglobuinů v savčí buňce maximální expresní (Reff, M. E . , Curr.
Opinion.
Biotech.
573-576, 1993)
Schopnost dosáhnou maximální expresní kapacity již po dvou opakováních methotrexatové amplifikace dále zvyšuj e užitečnost systému homologní rekombinace podle předkládaného «· -► · · ·
Β · · ·
I · ··· » β · • · · * ř · · · • · · ·· · · · · vynálezu. Systém náhodné integrace typicky vyžaduje více než dva kroky amplifikace s methotrexatem k dosažení takové hladiny exprese' a je podstatně méně spolehlivý z hlediska snadnosti amplifikace. Takže systém homologní rekombinace podle , vynálezu nabízí účinnější a rychlejší způsob, jak dosáhnout vysoké exprese u savčích buněk.
Příklad 5
Exprese protilátky proti lidskému CD23 v CHO buňkách označených plazmidem Desmond
CD23 je receptor IgE s nízkou afinitou, který zprostředkovává, vazbu IgE na B- a T-lymfocyty (Sutton, B.J. a Gould, H.J., Nátuře 366: . 421-428, 199.3). Monoklonální protilátka 5E8 proti lidskému CD23 je lidská monoklonální protilátka gamma-1, , která byla v současnosti klonována a exprimována v naší laboratoři. Tato protilátka je popsána v současně podané patentové ·ρτίΗ1έέθθ č. 08/803 085 (podané
20. února 1997).
Geny pro lehký ' a těžký řetězec 5E8 byly klonovány do savčího expresního vektoru N5KG1, který je derivátem' vektoru
NEOSPLA (Barnett et al., in Antibody Epression and Engineering, H.Y. Yang and T.Imanaka, eds., pp. 27-40, 1995) a přitom byly do genů vneseny dvě modifikace. Nedávno jsme v naší laboratoři pozorovali poněkud vyšší sekreci lehkých imunoglobulinových řetězců ve srovnání s těžkými řetězci· v jiných expresních (Barnett et al., in Antibody Epression and Engineering, H.Y. Yang and T.Imanaka, eds., pp. 27-40,
1995) konstruktech (Reff et al., 1997, nepublikováno).
Abychom odstranili tento nedostatek,- změnili jsme gen pro těžký řetězec
5E8 tím, ze dodali silný φφφφ • Φ «φ ·· ·· • φ φ φ · « · φ · φ φ φφφφ φφφ· φ · φφφ φ·φ φ φφφ φφφ «φφφ · φ * φφφφ φ · φφ φφ φ'· '
promotorový/zesilovací prvek bezprostředně před počáteční místo genu. V následujících krocích byl z vektoru N5KG1 izolován fragment DNA velikosti 2,9 kb obsahující modifikované geny pro lehký a'těžký řetězec 5E8, a byl vložen do cílového vektoru Mandy. Příprava vektoru Molly obsahujícího 5E8 a elektroporace do CHO buněk 15C9 označených plazmidem Desmond byly provedeny v podstatě postupem popsaným v předchozím textu.
Jednou modifikací proti dříve popsaným postupům bylo použití jiného kultivačního ' média. CHO buňky označené plazmidem Desmond byly kultivovány v médiu CD-CHO bez proteinů (Gibco/BRL, katalog, č. AS21206) s přídavkem 3 mg/1 rekombinantního insulinu (zásobní roztok 3 mg/ml, Gibco/BRL, katalog, č. AS22057) a 8mM glutaminu (zásobní roztok 200nM,Gibco/BRL, katalog, č. AS25030-081). Poté následovala selekce transformovaných buněk ve výše uvedeném médiu doplněném 400mg/ml geneticinu. V tomto experimentu bylo provedeno 20 elektroporací a vyseto na 96 jamkové kultivační misky. Buňky rostly a vylučovaly anti-CD23 celkem v 68 jamkách, které všechny pocházely z jedné G418rezistentní buňky. 12 z těchto jamek bylo namnoženo ve 120ml kultivačních lahvích a dále analyzováno. Máme za to, že zvýšený' počet klonů izolovaných v tomto pokusu. (68 ve srovnání, s 10 pro CD20, jak bylo posáno v příkladu 4) je způsobeno- vyšší klonovací účinností a mírou přežívání v médiu CD-CHO ve srovnání s médiem CHO-SS-FMII. Expresní hladiny těchto klonů analyzované v kultivačních lahvích byly v rozmezí od 0,5 do 3,0 pg/buňka/den, což je v dobré shodě s hladinami pozorovanými pro klony anti-CD20. Klon CD23 s nejvyšší expresí, označený 4H12, byl podroben methotrexatové amplifikaci, aby se zvýšila hladina exprese. Tato amplifikace byla provedena způsobem podobným způsobu, . který byl popsán pro anti-CD20 v příkladu 4. Sériové ředění
0 0 0 • 0 0 0 00 0 * · 0 · 0 φ «000 0000
000 000 · 000 «00 0 0 0 0 · * · «00 0 «0 00 00 ·· exponenciálně rostoucích buněk 4H12 bylo vyseto na 96jamkové kultivační misky a kultivováno v médiu CD-CHO s přídavkem 3 mg/1 insulinu, 8mM glutaminu a 30, 35 a 40nM methotrexatu..
Přehled výsledků tohoto amplifikačního pokusu je .uveden v následující tabulce 5.
Tabulka 5
Souhrn výsledků 'z amplifikace 4H12 ,
nM MTX počet testovaných j amek exprese mg/1, 96 jamek počet jamek dále pěstovaných exprese pg/buňka/den kultivační láhev
30 100 6-24 8 10-25
35 64 4-27 2 10-15
40 ' 96 4-20 1 nestanoveno.
Klon s nejvyšší expresí byl získán z 30nM koncentrace z destičky, na které rostlo jen 22 jamek. Tento klon, označený 4H12-30G5, reprodukovatelně vylučoval protilátku v množství 18 až 22 pg/buňka/den. To je stejná úroveň exprese, jaká byla pozorována po první amplifikaci klonu 20F4 produkujícího anti-CD20 (klon 20F415A5, produkující 15 až 18 pg/buňka/den, popsaný v příkladu. 4). Tyto údaje dále podporují pozorování, že amplifikace v takto označeném místě v CHO buňkách je reprodukovatelná a účinná. V současné době probíhá druhá amplifikace této buněčné linie vybrané ze 30nM koncentrace. Očekáváme, že saturační úrovně exprese lze s protilátkou CD23 dosáhnout po 2 amplifikacích, stejně jako tomu bylo u anti-CD20.
···* «« · · to » to · ·· · ·»·· ···· • · » ··· «·»· to · ··· ··· * ··· ··· • « < · · toto «•to · ·· ·· ·· ··
Příklad 6
Exprese imunoadhesinu v buňkách CHO označených plazmidem Desmond
CTLA-4, člen superrodiny lg, se vyskytuje na povrchu T-lymfocytů a má se za to, že hraje důležitou roli v antigenně-specifické aktivaci T-buněk (Dariavach et al. , Eur. J. Immunol. 18: 1901-1905, 1988, Linsley et al., J. Exp. Med. 174: 561-569, 1991. Aby bylo možné podrobněji zkoumat úlohu molekul CTLA-4 v aktivační dráze, byl připraven rozpustný fúzní protein obsahující extracelulární doménu CTLA-4 spojenou se zkrácenou formou konstantního úseku lidského IgGl (Linsley et al., viz výše). My jsme exprimovali tento fúzní protein v savčím expresním vektoru BLECH1, který je derivátem plazmidu NEOSPLA ( (Barnett et al., in Antibody Epression and Engineering, H.Y. Yang and T.Imanaka, eds., pp. 27-40, .1995) . Fragment velikosti 800 bp kódující CTLA-4· lg byl izolován z- tohoto vektoru a vložen mezi místa Seal a BglII v plazmidu Molly.
Příprava CTLA-4Ig-Molly a elektroporace do klonu 15C9 buněk CHO označených plazmidem Desmond byly provedeny v podstatě stejně jako v případě anti-CD20 popsaném v předchozím příkladu. Z 96jamkových kultivačních misek bylo izolováno 18 jamek exprimujících CTLA-4 a dále kultivováno ve 120 ml kultivačních lahvích. Byla provedena Southernova analýza DNA z každého z těchto klonů, aby se určilo, kolik homologních klonů obsahuje další náhodné integranty. Genomová DNA byla štěpena BglII a testována sondou, kterou byl konstantní úsek lidského IgGl označený dioxygeninem pomocí PCR. Výsledky této analýzy ukázaly, že 85. % klonů CTLA-4 byly pouze homologní integranty, zbývajících 15 %' obsahovalo jeden další náhodný integrant. Tyto výsledky podporují údaje • · · · • ·
···* «··· » « · ·♦· ♦ ··· ··· • · · · · • · ·· «· «· o expresí anti-CD20 diskutované dříve, kde 80 i klonu bylo výsledkem jedné homologní integrace. Proto je možně na závěr shrnout, že tento expresní systém reprodukovatelně vede k cílené homologní integraci alespoň v 80 % vzniklých klonů.
Expresní hladiny u homologních klonů CTLA4-Ig byly v rozmezí 8 až 12 pg/buňka/den. To je rozmezí poněkud vyšší, než jaké bylo zjištěno pro klony produkující protilátky antiCD20 a anti-CD23, jak bylo již diskutováno výše. Avšak, my jsme již dříve pozorovali, že vektorový systém s inzercí do intronu vede k významně vyšším hladinám exprese, než jsou obvykle uváděné hodnoty pro imunoglobuliny. V současnosti nejsme schopni poskytnout vysvětlení tohoto jevu.
Příklad 7
Zacílení anti-CD20 do jiné buněčné linie CHO označené plazmidem Desmond
Jak jsem uvedli již v předchozích příkladech, získali jsme 5 buněčných linií CHO označených jedinou kopiíi plazmidu Desmond (viz obr. 4 a 5) . Abychom demonstrovali, že úspěch uvedené strategie cílení a integrace není důsledkem nějaké jedinbečné vlastnosti klonu Desmond 15C9 a že je tudíž omezen pouze na tento klon, zavedli jsme anti-CD20 Molly do klonu Desmond 9B2 (dráha 6 na obr. 4, dráha 1 na- obr. 5) . Příprava DNA z Molly a elektroporace do Desmond 9B2 byly provedeny přesně jak bylo popsáno v předchozím příkladu pro anti-CD20.
Z tohoto pokusu byl získán homologní integrant. Tento klon byl namnožen ve 120ml kultivační lahvi, kde produkoval protilátku anti-CD20 v průměru v množství 1,2 pg/buňka/den. To je podstatně nižší exprese, než jaká byla pozorována, když Molly byl zacílen a integrován do Desmond 15C9. Avšak tento ···
• 9
9· » 9 9 · » 9 9 9
999 999 výsledek se dal očekávat na základě výsledků northernové analýzy klonů Desmond. Jak je vidět na obr. 5, hladina mRNA klonu 9B2 je podstatně nižší než u klonu 15C9, což ukazuje, že místo v tomto klonu není tolik transkripčně aktivní jako v klonu 15C9. Takže tento experiment neukazuje jen reprodukovatelnost systému - pravděpodobně jakékoliv místo označené plazmidem Desmond může být zacíleno plazmidem Molly - ale potvrzuje také údaje z northernové. analýzy, že Desmond 15C9 vykazuje nejvyšší transkripční aktivitu.
Z výše- uvedené je zřejmé, že ačkoliv , pro lepší vysvětlení. a ilustraci vynálezu byla popsána specifická provedení vynálezu, je možné provést různé modifikace vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky. Tudíž vynález zahrnuje i takovéto modifikace.

Claims (36)

  1. 4 4 · ·
    PATENTOVÉ · NÁROKY
    44 ·· ·· ·· • 444« 4444 • · 44 4 4 44 4 « 444 444 4 ··» 444
    4 4 · » · *
    4 4 44 44 44. 44 ?/·
    WM?
    Cm
    1.Způsob vložení požadované DNA do cílového místa v genomu savčí ' buňky vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
    I) transfekci nebo transformaci savčích buněk prvním plazmidem („markerovým plazmidem), který obsahuje následující sekvence:
    a) úsek DNA, který je heterologní vzhledem ke genomu savčí buňky, a který po integraci do genomu savčí buňky poskytuje jedinečné místo pro homologní rekombinací,
    b) fragment DNA kódující část prvního selektovateíného markerového proteinu, , a
    c) DNA alespoň jednoho dalšího selektovateíného markéru, který umožňuje selekci savčích buněk,' kde byl úspěšně integrován markerový plazmid, .II) selekci buněk, které obsahují markerový plazmid integrovaný v genomu,
    III) transfekci nebo transformaci, vybraných buněk druhým plazmidem („cílovým plazmidem), který obsahuje následující sekvence: ,
    a) úsek DNA, který je identický nebo dostatečně homologní s jedinečným úsekem · v markerovém plazmídu, takže tento úsek DNA může rekombinovat s uvedenou DNA prostřednictvím homologní rekombinace,
    b) fragment DNA kódující část stejného selektovateíného markéru ' obsaženého v markerovém plazmídu, přičemž aktivní selektovatelný markér kódovaný uvedenou DNA je tvořen pouze v případě, že uvedený fragment je exprimován společně s fragmentem « ·· ·
    40 • ···· ·· ·· ·» ·· »· · » · · » »»· • · ···· ··· * · « · * «·« « ··« ·· « · · · · · »·· · »· «· <♦ ·· selektovatelného plazmidu, a markéru obsaženým v markerovém IV) selekci buněk, které obsahují cílový plazmid integrovaný do cílového místa, tím, že se provede test na
    expresi proteinu prvního selektovatelného markéru.
  2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že fragment DNA kódující první selektovatelný markér je exon dominantního selektovatelného markéru.
  3. 3. Způsob, podle nároku 2 vyznačující se tím. že druhý ' plazmid obsahuje zbývající exony prvního selektovatelného markéru.
  4. 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že alespoň jedna DNA kódující požadovaný protein je vložena mezi exony prvního selektovatelného markéru obsaženého v cílovém plazmidu.
  5. 5. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že DNA kódující dominantní selektovatelný markér je dále vložena' mezi exony prvního selektovatelného markéru obsaženého v cílovém plazmidu, ' aby umožnila současnou amplifikaci DNA kódující požadovaný protein.
  6. 6.Způsob podle nároku 3 vyznačujíc íse tím, že první dominantní selektovatelný markér je vybrán ze skupiny obsahující neomycinfosfotransferázu, histidinoldehydrogenázu, dihydrofolátdreduktázu, hygromycinfosfotransferázu, thymidinkinázu z viru Herpes, simplex, adenosindeaminázu, glutaminsyntetázu a hypoxantinguaninfosforibosyltransferázu.
    • 9 9 ·
    9 9 9 9 9 9 9
    9 9 9 9 9 9 9
    99999 999 999
    9 9 9 9 • 9
    9 9
  7. 7. Způsob podle nároku 4 vyznačující se tím, že požadovaný protein je savčí protein.
  8. 8. Způsob podle nároku 8v yznačující se tím, že protein je imunoglobulin.
  9. 9. Způsob podle nároku lvyz.načující se tím, že dále obsahuje stanovení hladiny RNA selektovatelného markéru (c) obsaženého v markerovém plazmidu před integrací cílového vektoru.
  10. 10. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že další selektovatelný markér obsažený v marke-rovém plazmidu je dominantní selektovatelný markér vybraný ze skupiny obsahující histidinoldehydrogenázu, thymidínkinázu viru Herpes simplex, hygromycinfosfotransferázu, adenosindeaminázu.a glutaminsyntetázu.
  11. 11. Způsob podle nároku, lvyznačující se tím, že savčí buňka je vybrána ze skupiny obsahující buňky ovarií čínského křečka (CHO), myelomové buňky, buňky ledvin křeččích mláďat, buňky COS, buňky NOS, buňky HeLa a buňky NIH3T3.
  12. 12. Způsob podle nároku 11 v y z n a č u j í c í se tím, že buňka je buňka CHO.
  13. 13. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že markerový plazmid obsahuje třetí exon genu ' neomycinfosfotransferázy a cílový plazmid obsahuje první 'dva exony genu neomycinfosfotransferázy. •·♦· ·· ·· ·* ·· φ φ φ φ φ · ·· · • φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ · φφφ φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φφ φφ
  14. 14.Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že markerový plazmid dále obsahuje sekvenci pro vzácně štěpící endonukleázu, která je vložena do úseku homologie.
  15. 15.Způsob podle nároku lvyzn.ačující se tím, že jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinací je bakteriální DNA, virová DNA nebo syntetická DNA.
  16. 16. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinací je dlouhý alespoň 300 nukleotidů.
  17. 17. Způsob podle nároku' 16 v y z n a č u j í c í se tím, že jedinečný úsek DNA má velikost v rozmezí od 300 nukleotidů do 20 kilobazí. . .
    18. Způsob podle nároku 17 vyznač u j í c í s e t· í m, že jedinečný úsek DNA. má velíko-st výhodně v rozmezí od 2 do 10 kilobazí. 19.Způsob podle nároku 1 vyznač u j í c í s e t í m, že DNA prvního selektovatelného markéru je rozdělena alespoň do třech exonů. 20. Způsob podle nároku 1 vyznač u j í c ' í s e t í m,
    že jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinací je bakteriální DNA, DNA hmyzu, virová DNA nebo syntetická DNA.
  18. 21. Způsob podle nároku 20 vyznačuj ící se tím, že jedinečný úsek DNA neobsahuje žádné funkční geny.
    ····
    9 9 · ·* ft • · · • ft ·· • ft ··
  19. 22.Vektorový systém pro vkládání požadované DNA do' cílového místa v genomu savčí buňky, který obsahuje přinejmenším následuj ící: '
    I) první plazmid (markerový plazmid), který obsahuje alespoň následující sekvence:
    a) úsek DNA, který je heterologní vzhledem ke genomu savčí buňky, a který po integraci do genomu savčí buňky poskytuje jedinečné místo pro homologní rekombinaci,
    b) fragment DNA kódující část prvního selektovatelného markerového proteinu, a
    c) DNA alespoň jednoho dalšího selektovatelného markéru, který umožňuje selekci savčích buněk,· kde byl úspěšně integrován markerový plazmid,
    II) druhý plazmid („cílový plazmid), který obsahuje přinejmenším následující sekvence:
    a) úsek DNA, který je identický nebo dostatečně homologní s jedinečným úsekem v markerovém plazmidu, takže tento úsek DNA může rekombinovat s uvedenou DNA prostřednictvím homologní rekombinace,
    b) fragment selektovatelného .DNA kódující. část stejného markéru obsaženého v markerovém plazmidu, přičemž aktivní selektovatelný markér kódovaný uvedenou DNA je tvořen pouze v případě, fragment je selektovatelného plazmidu.
    že uvedený s fragmentem v markerovém exprimován společně markéru obsaženým
  20. 23.Vektorový systém podle nároku 22, kde fragment DNA kódující fragment prvního selektovatelného markéru je exon dominantního selektovatelného markéru.
    ··« · • 4 ·· ·· ·· • · ·· · · ·· · • · · · · · · · · • * « · 09 9 9 999 999
    9 9 9 9 9 9
    9 99 99 99 00
    Vektorový systém podle nároku 23, kde druhý plazmid obsahuje zbývající exony prvního selektovatelného markéru.
  21. 25. Vektorový systém podlé nároku 24, kde alespoň jedna DNA kódující požadovaný protein je vložena mezi exony prvního selektovatelného markéru obsaženého v cílovým plazmidu.
  22. 26. Vektorový systém podle nároku 24, kde DNA ' kódující dominantní selektovatelný markér je dále vložena mezi exony prvního . selektovatelného markéru obsaženého v cílovém plazmidu, aby se zajistila současná amplifikace DNA kódující požadovaný protein.
  23. 27. Vektorový systém podle nároku 24, kde první dominantní selektovatelný markér je vybrán ze skupiny obsahující neomycinfosfotransferázu, histidinoldehydrogenázu, dihydrofolátdreduktázu, . hygromycinfosfotransferázu, thymidinkinázu z viru Herpes simplex, adenosindeaminázu, glutaminsyntetázu a hypoxantinguaninfosforibosyltrans ferázu.
  24. 28. Vektorový systém podle nároku 25, kde požadovaný protein je savčí protein.
  25. 29. Vektorový systém podle nároku 28, kde protein je imunoglobulin.
  26. 30. Vektorový systém podle nároku 22, kde další selektovatelný markér obsažený v markerovém' plazmidu je dominantní selektovatelný markér vybraný ze skupiny obsahující histidinoldehydrogenázu, thymidinkinázu viru Herpes • tttt · • tt ·· ·· ·· • · · · · · · · • · · · · · · · • · ·*· · ··· ··· tt' · · tt · • tt ·· ·· ·· simplex, 'hygromycinfosfotransfeřázu, adenosindeamonázu a glutaminsyntetázu.
  27. 31. Vektorový . systém podle nároku 22, který zajistí vložení požadované DNA do cílového místa v genomu savčí buňky, která je vybrána ze skupiny obsahující buňky ovarií čínského křečka (CHO), myelomové buňky, buňky ledvin křeččích mláďat, buňky COS, buňky NOS, buňky HeLa a buňky NIH3T3.
  28. 32. Vektorový systém podle nároku 31, kde savčí buňka je buňka CHO.
  29. 33. Vektorový systém podle nároku 31, kde markerový plazmid obsahuje třetí exon genu neomycinfosfotransferázy a cílový plazmid obsahuje první dva exony genu neomycinfosfotransferázy.
  30. 34. Vektorový systém podle nároku 22, kde markerový plazmid dále obsahuje sekvenci pro vzácně štěpící endonukleázu, která je vložena do úseku homologie. /
  31. 35. Vektorový systém podle nároku 22, kde jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinaci je bakteriální DNA, virová DNA nebo syntetická DNA.
  32. 36. Vektorový systém podle nároku 22, kde jedinečný úsek DNA (a) obsažený v markerovém plazmidu, který zajišťuje homologní rekombinaci, je dlouhý alespoň 300 nukleotidů.
  33. 37. Vektorový systém podle nároku 36, kde jedinečný úsek DNA má velikost v rozmezí od 300 nukleotidů do 20 kilobazí.
    ··♦· ftft ·· ftft ftft ·· · · · · · ftftftft • · ft··· ftft· · • · ftftft ftftft · ftftft ftftft • · ftftft ftft • ftft ft ft· ·· ftft ··
  34. 38. Vektorový systém podle nároku 37, kde jedinečný úsek DNA má velikost výhodně v rozmezí od 2 do 10 kilobazí.
  35. 39. Vektorový systém podle nároku 22, kde DNAz prvního selektovatelného markéru je rozdělena alespoň do třech exonů.
  36. 40. Vektorový systém podle nároku 22, kde jedinečný úsek DNA zajišťující homologní rekombinací je bakteriální DNA, DNA hmyzu, virová DNA nebo syntetická DNA.
    .41.Vektorový systém podle nároku 40, kde jedinečný úsek DNA neobsahuje žádné funkční geny.
    « ·
CZ19993162A 1997-03-14 1998-03-09 Způsob integrace genů do specifických míst genomu savčí buňky homologní rekombinací a příslušné vektorové systémy CZ293355B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/819,866 US5830698A (en) 1997-03-14 1997-03-14 Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
US09/023,715 US5998144A (en) 1997-03-14 1998-02-13 Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ316299A3 true CZ316299A3 (cs) 2000-02-16
CZ293355B6 CZ293355B6 (cs) 2004-04-14

Family

ID=26697516

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19993162A CZ293355B6 (cs) 1997-03-14 1998-03-09 Způsob integrace genů do specifických míst genomu savčí buňky homologní rekombinací a příslušné vektorové systémy

Country Status (21)

Country Link
US (3) US6413777B1 (cs)
EP (1) EP0981637B1 (cs)
JP (1) JP4128227B2 (cs)
CN (1) CN1175111C (cs)
AT (1) ATE296356T1 (cs)
AU (1) AU737155B2 (cs)
BR (1) BR9808584A (cs)
CA (1) CA2283740C (cs)
CZ (1) CZ293355B6 (cs)
DE (1) DE69830312T2 (cs)
ES (1) ES2242997T3 (cs)
ID (1) ID24565A (cs)
IL (1) IL131746A0 (cs)
IN (1) IN189732B (cs)
NO (1) NO994397L (cs)
PL (1) PL191251B1 (cs)
PT (1) PT981637E (cs)
RO (1) RO120148B1 (cs)
RU (1) RU2004107694A (cs)
TW (1) TWI232239B (cs)
WO (1) WO1998041645A1 (cs)

Families Citing this family (97)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830698A (en) * 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
PT981637E (pt) * 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
DK1036198T3 (da) 1997-12-08 2013-01-02 California Inst Of Techn Fremgangsmåde til fremstilling af polynukleotid- og polypeptidsekvenser
WO2000039304A2 (en) 1998-12-31 2000-07-06 Chiron Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
GB9912965D0 (en) * 1999-06-03 1999-08-04 Oxford Biomedica Ltd In vivo selection method
AU2400500A (en) * 1999-11-01 2001-05-14 Chiron Corporation Expression vectors, transfection systems, and method of use thereof
DK1297170T3 (en) * 2000-06-23 2016-03-14 Novozymes As A process for stable chromosomal integration of multiple copies of the genes
AU2002320314A1 (en) 2001-07-05 2003-01-21 Chiron, Corporation Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof
JP2005535282A (ja) 2001-11-16 2005-11-24 アイデック ファーマシューティカルズ コーポレイション 抗体のポリシストロニック発現
US7164056B2 (en) * 2002-05-03 2007-01-16 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Gene targeting using replicating DNA molecules
CN101537180B (zh) 2002-07-18 2016-02-10 莫鲁斯有限公司 抗体混合物的重组生产
USRE47770E1 (en) 2002-07-18 2019-12-17 Merus N.V. Recombinant production of mixtures of antibodies
AU2003286684A1 (en) * 2002-10-30 2004-06-07 Gail Bishop Somatic cell gene targeting vectors and methods of use thereof
DE602004002275T2 (de) 2003-01-07 2007-09-06 Symphogen A/S Verfahren zur herstellung rekombinanterpolyklonaler proteine
DE10303937A1 (de) * 2003-01-31 2004-08-12 Icon Genetics Ag Pflanzentransformation mit Assemblierung einer gewünschten Sequenz in Vivo
AU2004207177B2 (en) * 2003-01-31 2008-02-07 Bayer Cropscience N.V. Plant transformation with in vivo assembly of a trait
PL378582A1 (pl) 2003-03-19 2006-05-02 Biogen Idec Ma Inc. Białko wiążące receptor Nogo
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
EP1626993B1 (en) * 2003-05-09 2015-03-11 Duke University Cd20-specific antibodies and methods of employing same
US20100069614A1 (en) 2008-06-27 2010-03-18 Merus B.V. Antibody producing non-human mammals
ES2408582T3 (es) 2003-05-30 2013-06-21 Merus B.V. Biblioteca de Fab para la preparación de una mezcla de anticuerpos
EP1641826A2 (en) * 2003-06-27 2006-04-05 Biogen Idec MA Inc. Use of hydrophobic-interaction-chromatography or hinge-region modifications for the production of homogeneous antibody-solutions
CA2536807C (en) 2003-09-04 2010-07-13 Medarex, Inc. Expression vector
US7344753B2 (en) * 2003-09-19 2008-03-18 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Nanostructures including a metal
US8030833B2 (en) * 2003-09-19 2011-10-04 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Electron emission device incorporating free standing monocrystalline nanowires
US7935862B2 (en) * 2003-12-02 2011-05-03 Syngenta Participations Ag Targeted integration and stacking of DNA through homologous recombination
DK1737971T3 (da) 2004-01-20 2017-11-13 Merus Nv Blandinger af bindingsproteiner
AU2005258335B2 (en) 2004-06-24 2011-03-17 Biogen Ma Inc. Treatment of conditions involving demyelination
DK2053408T3 (da) 2004-07-20 2012-06-04 Symphogen As Fremgangsmåde til strukturel karakterisering af et rekombinant polyklonalt protein eller en polyklonal cellelinje
US7846438B2 (en) 2004-08-03 2010-12-07 Biogen Idec Ma Inc. Methods of promoting neurite outgrowth with soluble TAJ polypeptides
FR2879204B1 (fr) * 2004-12-15 2007-02-16 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps cytotoxique dirige contre les proliferations hematopoietiques lymphoides de type b.
EP2311880A3 (en) 2005-01-05 2011-07-27 Biogen Idec MA Inc. Cripto binding molecules
CN100381573C (zh) * 2005-04-14 2008-04-16 北京天广实生物技术有限公司 快速构建目标基因高表达的哺乳动物细胞株的体系和方法
MX2008000253A (es) 2005-07-08 2008-04-02 Biogen Idec Inc Anticuerpos de sp35 y usos de los mismos.
EP3138403A1 (en) 2005-08-09 2017-03-08 Revivicor, Inc. Transgenic ungulates expressing ctla4-ig and uses thereof
EP2510934A1 (en) 2005-11-04 2012-10-17 Biogen Idec MA Inc. Methods for promoting neurite outgrowth and survival of dopaminergic neurons
US20090175872A1 (en) 2005-12-02 2009-07-09 Biogen Idec Ma Inc. Treatment of Conditions Involving Demyelination
US20070136826A1 (en) * 2005-12-02 2007-06-14 Biogen Idec Inc. Anti-mouse CD20 antibodies and uses thereof
ES2550099T3 (es) 2006-01-27 2015-11-04 Biogen Ma Inc. Antagonistas del receptor Nogo
DK2426143T3 (en) 2007-01-05 2017-09-11 Univ Zuerich Process for providing disease-specific binding molecules and targets
US8128926B2 (en) 2007-01-09 2012-03-06 Biogen Idec Ma Inc. Sp35 antibodies and uses thereof
PT2740744T (pt) 2007-01-09 2018-06-06 Biogen Ma Inc Anticorpos sp35 e suas utilizações
EP2114433B1 (en) 2007-02-02 2014-04-09 Biogen Idec MA Inc. Use of semaphorin 6a for promoting myelination and oligodendrocyte differentiation
WO2009048605A1 (en) * 2007-10-11 2009-04-16 Biogen Idec Ma Inc. Methods for treating pressure induced optic neuropathy, preventing neuronal degeneration and promoting neuronal cell, survival via administration of lingo-1 antagonists and trkb agonists
EP2217697B1 (en) * 2007-11-08 2015-06-10 Biogen MA Inc. Use of lingo-4 antagonists in the treatment of conditions involving demyelination
US20110119779A1 (en) * 2007-12-10 2011-05-19 Aliva Biopharmaceuticals, Inc. Methods for sequential replacement of targeted region by homologous recombination
EP2315779A2 (en) * 2008-07-09 2011-05-04 Biogen Idec MA Inc. Compositions comprising antibodies to lingo or fragments thereof
US9346873B2 (en) 2008-09-30 2016-05-24 Ablexis, Llc Non-human mammals for the production of chimeric antibodies
ES2544569T3 (es) 2008-12-19 2015-09-01 Biogen International Neuroscience Gmbh Autoanticuerpos humanos anti alfa-sinucleina
EP2382238A1 (en) 2008-12-31 2011-11-02 Biogen Idec MA Inc. Anti-lymphotoxin antibodies
RU2542394C2 (ru) 2009-03-24 2015-02-20 ТЕВА БИОФАРМАСЬЮТИКАЛЗ ЮЭсЭй, ИНК. Гуманизированные антитела против light и их применение
WO2011040285A1 (ja) 2009-10-01 2011-04-07 Toto株式会社 Ｄｎａ構築物およびそれを用いた組み換えｃｈｏ細胞の製造方法
EP4345163A2 (en) 2010-03-31 2024-04-03 Ablexis, LLC Genetic engineering of non-human animals for the production of chimeric antibodies
SG184903A1 (en) * 2010-04-30 2012-11-29 Temasek Life Sciences Lab Ltd Fragment switch: a reverse genetic approach
EP2591099B1 (en) 2010-07-09 2020-11-18 Bioverativ Therapeutics Inc. Chimeric clotting factors
PL2627672T3 (pl) 2010-10-11 2018-11-30 Biogen International Neuroscience Gmbh Ludzkie przeciwciała anty-tau
DK2640743T3 (en) 2010-11-16 2017-01-23 Excelimmune Inc PROCEDURES FOR THE PREPARATION OF RECOMBINANT PROTEINS
JP5209693B2 (ja) * 2010-12-10 2013-06-12 ロンザ・バイオロジクス・ピーエルシー Ｃｈｏ細胞において組換えタンパク質を発現する方法
US9283271B2 (en) 2010-12-17 2016-03-15 Neurimmune Holding Ag Human anti-SOD1 antibodies
DK2723379T3 (en) 2011-06-23 2018-10-15 Biogen Int Neuroscience Gmbh ANTI-ALPHA SYNUCLEIN BINDING MOLECULES
US9738707B2 (en) 2011-07-15 2017-08-22 Biogen Ma Inc. Heterodimeric Fc regions, binding molecules comprising same, and methods relating thereto
US10233424B2 (en) 2011-12-22 2019-03-19 Elwha Llc Compositions and methods including cytotoxic B lymphocyte cell line expressing exogenous membrane immunoglobulin different from secreted immunoglobulin
US10745468B2 (en) 2011-12-22 2020-08-18 Kota Biotherapeutics, Llc Compositions and methods for modified B cells expressing reassigned biological agents
US9175072B2 (en) 2011-12-22 2015-11-03 Elwha Llc Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including an exogenously incorporated nucleic acid expressing an exogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including an endogenous gene expressing an endogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen
US8962315B2 (en) 2011-12-22 2015-02-24 Elwha Llc Compositions and methods including recombinant B lymphocyte cell line including at least one endogenous gene expressing at least one endogenous membrane immunoglobulin reactive to a first antigen and including at least one exogenously incorporated nucleic acid expressing at least one exogenous secreted immunoglobulin reactive to a second antigen
PT2838918T (pt) 2012-04-20 2019-08-23 Merus Nv Métodos e meios para a produção de moléculas heterrodiméricas do tipo ig
SG11201406547YA (en) 2012-04-25 2014-11-27 Regeneron Pharma Nuclease-mediated targeting with large targeting vectors
JP6559063B2 (ja) 2012-05-07 2019-08-14 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド 導入遺伝子のヌクレアーゼ媒介標的化組み込みのための方法および組成物
CN104470541A (zh) 2012-05-14 2015-03-25 比奥根艾迪克Ma公司 用于治疗涉及运动神经元的疾患的lingo-2拮抗剂
EP2863940A4 (en) 2012-06-08 2016-08-10 Biogen Ma Inc CHIMERIC COAGULATION FACTORS
EP2906240A2 (en) 2012-10-09 2015-08-19 Biogen MA Inc. Combination therapies and uses for treatment of demyelinating disorders
ES2816700T3 (es) 2012-12-21 2021-04-05 Biogen Ma Inc Anticuerpos anti-tau humanos
WO2014102399A1 (en) 2012-12-31 2014-07-03 Neurimmune Holding Ag Recombinant human antibodies for therapy and prevention of polyomavirus-related diseases
HRP20231183T1 (hr) 2013-02-15 2024-01-05 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimizirani gen faktora viii
SG10201707600XA (en) 2013-03-15 2017-11-29 Biogen Ma Inc Factor ix polypeptide formulations
EP3160478A4 (en) 2014-06-30 2018-05-16 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimized factor ix gene
EP3201228A2 (en) 2014-09-30 2017-08-09 Neurimmune Holding AG Human-derived anti-dipeptide repeats (dprs) antibody
MA40835A (fr) 2014-10-23 2017-08-29 Biogen Ma Inc Anticorps anti-gpiib/iiia et leurs utilisations
MA40861A (fr) 2014-10-31 2017-09-05 Biogen Ma Inc Anticorps anti-glycoprotéines iib/iiia
JP2018504400A (ja) 2015-01-08 2018-02-15 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． Ｌｉｎｇｏ‐１拮抗薬及び脱髄障害の治療のための使用
CN106191040B (zh) * 2015-04-30 2021-09-14 杭州菁因康生物科技有限公司 基因打靶方法
MX2018001497A (es) 2015-08-03 2018-05-15 Bioverativ Therapeutics Inc Proteinas de fusion de factor ix y metodos para producirlas y usarlas.
SI3411478T1 (sl) 2016-02-01 2022-10-28 Bioverativ Therapeutics Inc. Optimirani geni dejavnika VIII
WO2017214376A1 (en) 2016-06-10 2017-12-14 Elwha Llc Compositions and methods including b lymphocyte cell line expressing membrane immunoglobulin different from secreted immunoglobulin and cytolytic function
JP2018035137A (ja) 2016-07-13 2018-03-08 マブイミューン ダイアグノスティックス エイジーＭａｂｉｍｍｕｎｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ａｇ 新規な抗線維芽細胞活性化タンパク質（ｆａｐ）結合薬剤およびその使用
AU2017297404A1 (en) 2016-07-13 2019-01-24 Biogen Ma Inc. Dosage regimens of LINGO-1 antagonists and uses for treatment of demyelinating disorders
BR112019011198A2 (pt) 2016-12-02 2019-12-17 Bioverativ Therapeutics Inc métodos de indução de tolerância imune a fatores de coagulação
MX2019006444A (es) 2016-12-02 2019-10-30 Bioverativ Therapeutics Inc Métodos de tratamiento de artropatía hemofílica utilizando factores de coagulación quiméricos.
TW201831521A (zh) 2017-01-31 2018-09-01 美商生物化學醫療公司 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備方法及使用方法
MX2020009975A (es) 2018-03-28 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion interleucina-2/receptor alfa de interleucina-2 y metodos de uso.
US20210238289A1 (en) 2018-06-04 2021-08-05 Biogen Ma Inc. Anti-vla-4 antibodies having reduced effector function
CN110607326B (zh) * 2018-06-15 2022-11-29 江苏省农业科学院 非强启动式的外源基因表达法及其在具有毒性的目标蛋白表达中的应用
SG11202103111TA (en) * 2018-10-01 2021-04-29 Lonza Ag Ssi cells with predictable and stable transgene expression and methods of formation
KR20210126078A (ko) 2019-02-13 2021-10-19 더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크. 항-말초 림프절 어드레신 항체 및 그의 용도
WO2023028455A1 (en) 2021-08-23 2023-03-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Closed-end dna production with inverted terminal repeat sequences
IL310997A (en) 2021-08-23 2024-04-01 Bioverativ Therapeutics Inc Factor VIII gene optimization
IL311725A (en) 2021-09-30 2024-05-01 Bioverativ Therapeutics Inc Nucleic acids encoding factor VIII polypeptides with reduced immunogenicity

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5202238A (en) 1987-10-27 1993-04-13 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
FR2646438B1 (fr) 1989-03-20 2007-11-02 Pasteur Institut Procede de remplacement specifique d'une copie d'un gene present dans le genome receveur par l'integration d'un gene different de celui ou se fait l'integration
US5464764A (en) * 1989-08-22 1995-11-07 University Of Utah Research Foundation Positive-negative selection methods and vectors
WO1991006666A1 (en) 1989-11-06 1991-05-16 Cell Genesys, Inc. Production of proteins using homologous recombination
PT101031B (pt) 1991-11-05 2002-07-31 Transkaryotic Therapies Inc Processo para o fornecimento de proteinas por terapia genetica
AU4401993A (en) * 1992-06-04 1993-12-30 Exemplar Corporation Insertion of heterologous dna outside of known chromosomal genes
MX9305183A (es) * 1992-08-27 1994-05-31 Us Agriculture Intron portatil, molecula de adn genomico viral, virus vivo y vacuna que los contiene y metodo para su obtencion.
US5648267A (en) * 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
PT981637E (pt) 1997-03-14 2005-09-30 Biogen Idec Inc Metodo para integrar genes em sitios especificos em celulas de mamifero atraves de recombinacao homologa e vectores para a realizacao do mesmo
US5830698A (en) * 1997-03-14 1998-11-03 Idec Pharmaceuticals Corporation Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same

Also Published As

Publication number Publication date
CZ293355B6 (cs) 2004-04-14
CN1255166A (zh) 2000-05-31
NO994397D0 (no) 1999-09-10
IN189732B (cs) 2003-04-19
ID24565A (id) 2000-07-27
BR9808584A (pt) 2000-05-23
RU2004107694A (ru) 2005-08-27
JP4128227B2 (ja) 2008-07-30
PT981637E (pt) 2005-09-30
CA2283740C (en) 2006-06-27
PL335695A1 (en) 2000-05-08
RO120148B1 (ro) 2005-09-30
TWI232239B (en) 2005-05-11
ATE296356T1 (de) 2005-06-15
US20020192820A1 (en) 2002-12-19
CN1175111C (zh) 2004-11-10
EP0981637A1 (en) 2000-03-01
PL191251B1 (pl) 2006-04-28
NO994397L (no) 1999-11-09
EP0981637B1 (en) 2005-05-25
JP2001516221A (ja) 2001-09-25
US7235360B2 (en) 2007-06-26
CA2283740A1 (en) 1998-09-24
DE69830312T2 (de) 2006-02-02
US20040166528A1 (en) 2004-08-26
WO1998041645A1 (en) 1998-09-24
US6413777B1 (en) 2002-07-02
ES2242997T3 (es) 2005-11-16
IL131746A0 (en) 2001-03-19
US6841383B2 (en) 2005-01-11
DE69830312D1 (de) 2005-06-30
AU6443598A (en) 1998-10-12
AU737155B2 (en) 2001-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ316299A3 (cs) Způsob integrace genů do specifických míst genomu savčí buňky homologní rekombinací a příslušné vektorové systémy
US5830698A (en) Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
WO1998041645A9 (en) Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
KR100479146B1 (ko) 큰게놈dna결실유발법
US20170306352A1 (en) Transgenic mammals and methods of use thereof
US10793829B2 (en) Transgenic mammals and methods of use thereof
US20220369609A1 (en) Transgenic mammals and methods of use thereof
US20210000087A1 (en) Transgenic mammals and methods of use thereof
JP2003510072A (ja) 遺伝子発現を改変するための組成物および方法
JP2009538144A (ja) 真核細胞株を用いたタンパク質産生
CA3235395A1 (en) Transgenic mammals and methods of use thereof
MXPA99008363A (en) Method for integrating genes at specific sites in mammalian cells via homologous recombination and vectors for accomplishing the same
CN117440753A (zh) 表达嵌合马科动物-啮齿动物抗体的转基因啮齿动物及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20090309