CN106536559A

CN106536559A - 定点诱变trem‑1抗体以降低黏度

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Publication number: CN106536559A
Application number: CN201580038005.6A
Authority: CN
Inventors: A.亨里克森; K.克耶加德; V.韦斯特法尔斯滕尼克; C.维贝里
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2015-07-17
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2035-07-17
Also published as: HK1232231A1; KR102641268B1; IL250082A0; US11072654B2; FI3172232T3; PH12017500054A1; MX2020013920A; MX2017000484A; CN113214397A; SG11201700250WA; US10179814B2; JP6738316B2; SG10201913702WA; EA201790104A1; CN106536559B; JP2017522325A; US20170298130A1; EP3172232A1; BR112016030947A2; IL250082B

Abstract

描述了能够特异性结合TREM‑1并阻止其活化的抗体，其具有良好的亲和力和在临床相关浓度下的低黏度，TREM‑1是一种在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞中表达的蛋白。此类抗体可用于治疗患有炎性疾病诸如类风湿性关节炎和炎症性肠病的个体。

Description

定点诱变TREM-1抗体以降低黏度

技术领域

本发明涉及TREM-1 mAb，并涉及参与TREM-1 mAb自身相互作用或TREM-1 mAb与TREM-1相互作用的特定的带负电和不带电氨基酸的突变，以降低mAb溶液黏度并维持靶标亲和力，并且本发明涉及此类抗体在治疗和药物使用中的用途。

本发明的序列表

SEQ ID NO:1 代表野生型（wt）人TREM-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO:2 代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（WO2013/120553中的mAb0170）。

SEQ ID NO:3 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（WO2013/120553中的mAb0170）。

SEQ ID NO:4 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0317，E27Q、E97S）。

SEQ ID NO:5 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0318，E27Q、E97Q）。

SEQ ID NO:6 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0319，E97S）。

SEQ ID NO:7 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0320，E97Q）。

SEQ ID NO:8 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0321，E27Q）。

SEQ ID NO:9 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0322，F32A）。

SEQ ID NO:10 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0323，F32S）。

SEQ ID NO:11 代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb 0324，A59Y）。

SEQ ID NO:12 代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb 0325，N57S）。

SEQ ID NO:13 代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb 0326，A59Y、N57S）。

SEQ ID NO:14 代表人源化TREM-1抗体的轻链的氨基酸序列（mAb 0330，F32A、E27Q、E97Q）。

SEQ ID NO:15 代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb 0332，A59Y；0332是由SEQ ID NO: 15作为HC和SEQ ID NO 5作为LC组合而成的mAb, 表1）。

SEQ ID NO:16 代表人源化TREM-1抗体的重链的氨基酸序列（mAb 0333，A59Y；0333是由SEQ ID NO: 16作为HC和SEQ ID NO 14作为LC组合而成的mAb, 表1）。

SEQ ID NO:17 代表全长cTREM-1的氨基酸序列。

SEQ ID NO 18代表mAb 0170的Fab区的重链。

SEQ ID NO 19代表mAb 0170的Fab区的轻链。

发明背景

TREM-1是在单核细胞、巨噬细胞和嗜中性粒细胞上表达的活化受体。这些细胞通过释放驱动炎症的细胞因子和其它介质而在慢性炎性疾病中起主要作用。TREM-1 mRNA和蛋白质表达在具有RA和IBD的患者中上调，且TREM-1阳性细胞在炎症部位积累，其与疾病严重程度相关。主要由活化的嗜中性粒细胞表达的肽聚糖识别蛋白1（PGLYRP1）是TREM-1的配体，并在结合后介导TREM-1信号传导。

在体外，TREM-1的参与触发促炎细胞因子（包括TNF、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1）的分泌。另外，TREM-1信号传导与多种Toll-样受体（TLR）协同作用以进一步强化促炎信号。继而，该TREM-1上调表达导致恶性循环从而扩大炎症。越来越多的证据表明TLR有助于慢性炎性疾病诸如RA和IBD的发展和进程。

WO 2013/120553公开了人源化抗-TREM-1 mAb，其抑制人和食蟹猴TREM-1两者的功能。但是，抗-TREM-1 mAb的黏度概况可阻碍以>50 mg/ml生产药物产品的制备过程，并且可限制临床中的最优剂量设置。通常需要高剂量的蛋白质治疗剂（若干 mg/kg）以实现适当的临床效果，并且由于这些治疗剂的绝大多数通过皮下递送施用，因此所述治疗剂的患者自我施用受限于< 1.5 mL的体积（Shire 等人, J. Pharm. Sci. 2004, 93, 1390-1402）。当蛋白制剂导致所得溶液的高黏度时，开发适合用于患者自我施用的高浓度蛋白制剂通常受阻于制备和递送。

已经针对在mAb溶液的黏度表现上的作用对mAb的电荷分布进行了研究（Ydav 等人, Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802）。同样，已经显示存在于稀释溶液中的弱的非荷质比相互作用影响浓缩的mAb溶液的黏度（Connolly 等人, Biophys. J., 2012,103, 69-78.）。减少mAb溶液黏度的补救方法是引入破坏直接的电荷-电荷分子间相互作用的定点电荷交换突变 (Ydav 等人, Mol. Pharmaceutics 2012, 9, 791-802)或添加盐或反离子（Liu 等人, J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1928-1940; Yadav 等人, J. Pharm.Sci. 2010, 99, 1152-1168; Yadav 等人, J. Pharm. Sci. 2012, 101, 998-1011;Kanai 等人, J. Pharm. Sci. 2008, 97, 4219-4227）。但是，盐和反离子的添加可以就所施用溶液的高渗性而导致对患者的副作用。

本文公开的是通过位点特异性突变在WO 2013/120553中公开的人源化抗-TREM-1mAb 0170的CDR而生成的TREM-1抗体。本公开的抗体不破坏直接的mAb 分子间电荷-电荷自我相互作用，但是具有有利的黏度概况和维持的靶标结合概况。有利的黏度概况允许以高浓度生产药物产品，其对于治疗和药物使用将是关键的。此类抗体可以对患有脓毒病或慢性炎症疾病诸如类风湿性关节炎、银屑病关节炎和炎症性肠病的个体的生活质量具有实质影响。

发明概述

本发明的主要方面涉及具有在单体mAb期望的范围内的黏度概况的抗-TREM-1 mAb，且所述抗-TREM-1 mAb如WO 2013/120553的mAb0170一样有力地阻断TREM-1功能。在本发明的变体mAb的有利黏度概况以外，所述变体对TREM-1受体不具有激动作用。

本发明的一个方面涉及能够结合并阻断TREM-1的抗体或其片段，其特征在于所述抗体或所述抗体的抗体片段在80 mg/mL的浓度下具有小于5 cP，优选小于4 cP的黏度。

所述抗体或其片段可包括SEQ ID NO: 3的变体，其中SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3区中的一个或多个带负电残基被不带电氨基酸残基取代，如本文所述。

所述抗体或其片段可包括SEQ ID NO: 3的变体，其中在SEQ ID NO: 3的位置32的苯丙氨酸被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸，优选地选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸缬氨酸和亮氨酸，更优选地其中SEQ ID NO: 3的F32被突变为丙氨酸或丝氨酸。

所述抗体或其片段可包括SEQ ID NO: 2的变体,其中SEQ ID NO: 2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ. ID NO 3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98中的任一个（“Fab-Fab相互作用”突变）被另一种氨基酸取代，所述另一种氨基酸是诸如天然氨基酸，优选地选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸。

本发明的另外的方面涉及抗体或其片段，其能够特异性地结合并阻断SEQ ID NO:1的TREM-1并且包括SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3或两者的变体，其中所述变体选自SEQID NO: 2或SEQ ID NO: 3的“Fab-Fab相互作用”突变、“Fab-TREM-1相互作用”突变和“电荷-补丁（charge-patch）”突变（表1）。

在本发明的抗体或其片段的一个实施方案中，SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3区中的一个或多个带负电残基被不带电氨基酸残基取代。在一个实施方案中， SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3区中的带负电残基被不带电氨基酸残基取代。

在一个实施方案中，本发明的抗体或其片段包括SEQ ID NO: 3的变体，其中SEQID NO: 3的“电荷补丁”残基D1、D30、D33、D74、D98、E27、E97中的任一个被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。在一个实施方案中，SEQ ID NO 3的“电荷补丁”残基D1、D30、D33、D74、D98、E27、E97中不止一个被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。

在一个实施方案中，SEQ ID NO 3的CDR1和CDR3区的E27和E97之一被不带电氨基酸残基取代，所述不带电氨基酸诸如选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。譬如，SEQ ID NO 3的E27可以保持未突变且E97可以被突变为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸，更优选突变为选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。可选地，SEQ ID NO 3的E97可以保持未突变且E27可以被选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。

在一个实施方案中，SEQ ID NO 3的CDR1和CDR3区的E27和E97两者均被不带电氨基酸残基取代，所述不带电氨基酸诸如选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。譬如，SEQ ID NO 3的E27可以被突变为谷氨酰胺且SEQ ID NO 3的E97可以被选自甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。

在本发明的另外的方面提供了抗体或其片段，其包括SEQ ID NO: 2的变体,其中SEQ ID NO: 2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ. ID NO 3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98中的任一个（“Fab-Fab相互作用”突变）被另一种氨基酸取代，所述另一种氨基酸是诸如天然氨基酸，优选地选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸。

在本发明的抗体或其片段的一个实施方案中，SEQ ID NO: 2的残基A59和N57中的至少一个被突变为氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。譬如，SEQ ID NO: 2的残基A59可以保持未突变且N57可以被突变为另一种氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。可选地，SEQ ID NO: 2的残基N57可以保持未突变且SEQ ID NO: 2的A59可以被突变为另一种氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。在另外的实施方案中，SEQ ID NO: 2的A59和N57两者均被突变为另一种氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。

本发明的另外的方面涉及改善的临床前评价值，其通过在SEQ ID NO: 3中的“Fab-TREM-1相互作用”氨基酸残基处引入定点突变以达到对食蟹猴TREM-1和对SEQ IDNO: 1的人TREM-1的相同的mAb亲和力而实现，诸如，其中SEQ ID NO: 3的Phe残基被Ala或Ser取代。

本发明因此提供了抗体或其片段，其中“Fab-TREM-1相互作用”氨基酸残基，SEQID NO: 3的F32，被选自以下的氨基酸残基取代：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸和半胱氨酸。

本发明的另外的方面涉及改善的黏度特性和改善的临床前评价值的组合效果，其通过在SEQ ID NO: 2的mAb-TREM-1交界面引入定点突变以实现对食蟹猴和对SEQ ID NO:1的人TREM-1的相同的mAb亲和力（例如上文所述）连同将SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3区中的带负电残基取代为不带电氨基酸残基（例如上文所述）而实现。

根据本发明的任意上述方面，在此提供了抗体或其片段，其中：

I) SEQ ID NO 3的CDR1和CDR3区的至少一个带负电残基被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。

ii) SEQ ID NO: 2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ. ID NO3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98中的至少一个（“Fab-Fab相互作用”突变）被突变为选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸、组氨酸和酪氨酸。

在一个实施方案中，在此提供了抗体或其片段其中：

i) SEQ ID NO 3的E27和E97之一或两者被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；且

ii) SEQ ID NO 2的A59h和N57之一或两者被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸；更优选丝氨酸或酪氨酸。

本发明还涉及包含SEQ ID NO 4至16中任一项的抗体或其片段。

附图简述

图1描述了抗-TREM-1 mAb变体的黏度概况及其指数曲线拟合。

图2描述了mAb 0170变体抑制由PGN和（A）重组PGLYRP1或（B）由活化的嗜中性粒细胞表达的PGLYRP1刺激的人TREM-1 受体细胞系(BWZ’36/hTREM-1)中人TREM-1信号传导的能力（N个供体的平均）。

图3描述了mAb 0170变体抑制由PGN和重组PGLYRP1刺激的食蟹猴TREM-1受体细胞系（TE426.27）中食蟹猴TREM-1信号传导的能力。

图4描述了mAb 0170变体抑制由PGN和重组PGLYRP1刺激的低氧M2巨噬细胞TNFa释放的能力。

图5描述了mAb 0170变体诱导从低氧M2巨噬细胞的TNF释放的平板结合激动潜力。MAb 1278 (R&D)被用作阳性对照。

图6描述了抗-TREM-1 mAb变体与mAb 0170相比的流体动力学半径。

发明详述

TREM-1是由234个氨基酸组成的跨膜蛋白，其包括单个胞外免疫球蛋白结构域和一个没有明显信号基序的短胞质尾区。当活化时，TREM-1与含有ITAM的信号衔接蛋白DAP12结合。下游信号传导可以包括NFAT转录因子的活化，其引起促炎细胞因子产量的上调。

本发明涉及能够特异性结合并阻断TREM-1功能的抗体。本发明的抗体可以通过减少/阻断TREM-1活化和下游信号传导来阻断TREM-1功能。

根据本发明的抗体可以通过直接或间接阻断TREM-1的一种机制或数种不同机制的组合来阻断TREM-1。例如，本发明的抗体可以防止TREM-1的天然配体，肽聚糖识别蛋白1（PGLYRP1）与TREM-1生成功能复合体和/或本发明的抗体可以通过防止单独的TREM-1分子形成二聚体或多聚体而阻断TREM-1。TREM-1二聚化或多聚化可以通过TREM-1抗体来减少或防止，所述TREM-1抗体能够结合TREM-1的部分，其将驻留于TREM-1二聚体接触面，因此防止了单独的TREM-1分子彼此结合。

TREM-1二聚化或多聚化可以通过TREM-1抗体来减少或防止，所述TREM-1抗体干扰TREM-1与其配体的相互作用。根据本发明的抗体可以阻断TREM-1的PGLYRP1-诱导的活化。PGLYRP1，一种高度保守的、长196个氨基酸的蛋白质，由信号肽和肽聚糖结合结构域组成，其在嗜中性粒细胞中表达并在其活化后释放。根据本发明的抗体可以下调从骨髓瘤细胞释放促炎细胞因子。根据本发明的抗体可以阻断从巨噬细胞、嗜中性粒细胞、滑膜组织细胞和/或报道细胞释放TNF、MIP-1β、MCP-1、IL-1β、GM.CSF、IL-6和/或IL-8，如本文所公开。

本发明的抗体可能能够结合人TREM-1和来自不同于人的其它物种的TREM-1。如本文所用的术语“TREM-1”因此涵盖了TREM-1的任何天然存在的形式，其可以来源于任何合适的生物体。例如，如本文所述使用的TREM-1可以是脊椎动物的TREM-1，诸如哺乳动物TREM-1，诸如来自灵长类动物的TREM-1（诸如人、黑猩猩、食蟹猴或食蟹猴）；啮齿类（诸如小鼠或大鼠）、兔类（诸如兔）或偶蹄类（诸如牛、绵阳、猪或骆驼）。优选地，TREM-1是SEQ ID NO: 1（人TREM-1）。TREM-1可以是TREM-1的成熟形式诸如已经在合适的细胞中经历了翻译后加工的TREM-1蛋白。此类成熟TREM-1蛋白可以是例如，被糖基化的。TREM-1可以是全长TREM-1蛋白。

本发明的抗体可以是单克隆抗体，在这个意义上而言它们直接或间接地来源于B淋巴细胞的单个克隆。TREM-1抗体可以使用例如WO2013/120553的实施例中描述的方法产生、筛选和纯化。简而言之，可以使用TREM-1、表达TREM-1的细胞或两者的组合对合适的小鼠诸如TREM-1或TREM-1/TREM-3敲除(KO)小鼠进行免疫。

本发明的抗体可以是多克隆的，在这个意义上而言其是根据本发明的单克隆抗体的混合物。

杂交瘤上清液的初步筛选可以使用直接ELISA或FMAT进行，且二次筛选可以使用流式细胞术进行。阳性杂交瘤上清液可以随后在报道基因测定中筛选。

抗体可以在原核或真核细胞中重组表达。所述原核细胞可以是大肠杆菌（E. coli）。所述真核细胞可以是酵母、昆虫或哺乳动物细胞，诸如来源于灵长类（诸如人、黑猩猩、食蟹猴或食蟹猴）、啮齿类（诸如小鼠或大鼠）、兔类（诸如兔）或偶蹄类（诸如牛、绵阳、猪或骆驼）的生物体的细胞。合适的哺乳动物细胞系包括，但不限于HEK293细胞、CHO 细胞和HELA细胞。TREM-1抗体还可以通过本领域技术人员已知的其他方法产生，诸如噬菌体展示或酵母展示。

一旦产生，抗体可以被筛选用于结合例如全长TREM-1或其突变体,其使用WO2013/120553的实施例中描述的方法。

本发明的功能TREM-1抗体是能够特异性结合TREM-1并且通过阻断或刺激TREM-1而对TREM-1活化和下游信号传导产生影响的抗体，并且它们在本文中被称为“功能性TREM-1抗体”。鉴定功能性TREM-1抗体的方法包括（a）培养表达TREM-1的第一细胞、信号蛋白和报道构建体；（b）当所述第一细胞与TREM-1改性剂温育时测量所述细胞的活性；（c）将（b）共培养物与TREM-1接触；和（d）测量所述第一细胞的活性小于或大于（b）中测量的活性。

（a）的所述“第一细胞”可以是造血起源的细胞，诸如骨髓细胞，诸如T-细胞。（a）的信号蛋白可以是能够与TREM-1形成复合体的任何信号蛋白。合适的信号蛋白包括DAP10、DAP12、TCRζ、Fcγ RIII和Fc受体或其部分。（a）的受体构建体可以是能够经由信号蛋白活化的任何构建体，并生成可识别的信号。合适的报道构建体包含转录因子和报道基因。所述信号蛋白可以经由选自NFAT和NFkB的转录因子传导信号。所述报道基因不是在所述第一细胞中天然表达的基因，并且可以是但不限于是编码β-半乳糖苷酶、萤光素酶、绿色荧光蛋白（GFP）或氯霉素转移酶的基因。所述第一细胞可以使用本领域熟知的方法用转录因子和报道基因转染。

实施例中描述的“BWZ/hTREM-1报道细胞”和“TE426.27报道细胞”是“第一细胞”的一个实例。

（b）的改性剂可以是TREM-1配体或活化的嗜中性粒细胞。（c）的“TREM-1抗体”可以是TREM-1特异性杂交瘤上清液或纯化的抗体。（d）中测量的活性是由报道构建体产生的信号。此类信号传导的实例是由NFAY驱动的LacZ (β-内酰胺酶萤光素酶)产生引起的发光。

可以调整所述方法以鉴定阻断TREM-1的抗体。鉴定阻断TREM-1的抗体的方法包括（a）培养表达TREM-1的第一细胞、信号蛋白和报道构建体；（b）当所述第一细胞与活化的嗜中性粒细胞温育时测量所述细胞的活性；（c）将所述第一细胞和活化的嗜中性粒细胞的共培养物与TREM-1抗体接触；和（d）测量所述第一细胞的活性小于（b）中测量的活性。

可以调整所述方法以鉴定刺激TREM-1的抗体。鉴定刺激TREM-1的抗体的方法包括（a）培养表达TREM-1的第一细胞、信号蛋白和报道构建体；（b）测量所述第一细胞的活性；（c）将所述细胞与TREM-1抗体接触/温育；和（d）测量所述第一细胞的活性大于（b）中测量的活性。

本发明涉及阻断TREM-1的抗体，其可以通过本文公开的鉴定阻断抗体的方法来鉴定。当使用上文所述的方法和在实施例中测试时，根据本发明的抗体可以在小于50 µg/ml、诸如小于40 µg/ml、诸如小于30 µg/ml、诸如小于20 µg/ml、诸如小于10 µg/ml、诸如小于5µg/ml、诸如小于1 µg/ml的浓度 – 能够减少所述第一细胞50%、诸如60%、诸如70%、诸如80%、诸如90%、诸如95%、诸如100%的活性。根据本发明的抗体可能够完全消除所述第一细胞的活性。当使用上文所述的方法和在实施例中测试时，根据本发明的抗体可以在小于1 µg/ml - 诸如小于0.9 µg/ml、诸如小于0.8 µg/ml、诸如小于0.7 µg/ml、诸如小于0.6 µg/ml、诸如小于0.5 µg/ml、诸如小于0.4 µg/ml、诸如小于0.3 µg/ml、诸如小于0.2 µg/ml的浓度- 能够消除所述第一细胞的活性。

本发明还涉及阻断TREM-1的抗体，其可以通过本文公开方法以外的其它方式来鉴定。

本文的术语“抗体”指的是一种蛋白，其衍生自种系免疫球蛋白序列，其能够特异性地结合抗原（TREM-1）或其部分。术语包括任何类或同种型（即，IgA、IgE、IgG、IgM和/或IgY）的全长抗体或其任何单链或片段。特异性结合至抗原或其部分的抗体可以专一地结合至所述抗原或其部分，或其可以结合治有限数量的同源抗原或其部分。全长抗体通常包括至少四条多肽链：两条重（H）链和两条轻（L）链，其通过二硫键相互连接。具有特别药物兴趣的一种免疫球蛋白亚类是IgG家族。在人中，所述IgG类可以被细分为4个亚类：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，基于它们的重链恒定区的序列。轻链可以被分为两类，κ和λ，基于它们的序列组成的差异。IgG分子有两条重链（通过两个或更多个二硫键相互连接）和两条轻链构成（各自通过二硫键与一条重链连接）。重链可以包括重链可变区（VH）和多达三个重链恒定（CH）区：CH1、CH2和CH3。轻链可以包括轻链可变区（VL）和轻链恒定区（CL）。VH和VL区可以进一步细分为高变区，被称为互补决定区（CDR），其散布在更保守的区间，所述更保守的区被称为框架区（FR）。VH和VL区通常由三个CDR和四个FR构成，以以下顺序从氨基端至羧基端排列：FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.重链和轻链的高变区形成能够与抗原相互作用的[结合]结构域，同时抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，其包括但不限于免疫系统的各种细胞（效应器细胞）、Fc受体和经典补体系统的第一组分（Clq）。

本发明的抗体可以是经分离的。术语“经分离的抗体”指的是已经从产生其的环境中与其它组分相分离和/或回收的抗体，和/或已经从产生其的环境存在的组分的混合物中纯化的抗体。

抗体的某些抗原结合片段可能适合本发明的背景，因为已经证明，抗体的结合功能可以通过全长抗体的片段执行。术语抗体的“抗原结合片段”指的是抗体的一个或多个片段，其保留了特异结合至抗原诸如TREM-1的能力，如本文描述的。抗原结合片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)S、Fv（通常为抗体单臂的VL和VH域）、单链Fv（scFv；参见，例如Bird 等人, Science 1988; 242:42S-426; and Huston 等人 PNAS 1988; 85:5879-5883）、dsFv、Fd (通常为VH和CHI域)和dAb (通常为VH域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR域；包含单独VH和单独VL链的单价分子；微抗体、双体、三体、四体和κ体（参见，例如Ill 等人,Protein Eng 1997;10:949-57）；骆驼IgG；IgNAR；以及一种或多种经分离的CDR或功能互补位，其中经分离的CDR或抗原结合残基或多肽可以结合或一同连接，从而形成功能性抗体片段。抗体片段的各种类型已经在例如Holliger和Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136；WO2005040219和公开的美国专利申请20050238646和20020161201中描述或综述。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以筛选片段用于在如完整抗体的相同方式中使用。

本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。如本文所用的，术语“人抗体”意图包括具有可变区中框架区的至少部分和/或CDR区的至少部分衍生自人种系免疫球蛋白序列的抗体。（例如，人抗议可以具有框架和CDR区两者均衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区。）此外，如果抗体含有恒定区，所述恒定区还衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或位点特异诱变或通过体内体细胞突变引入的突变）。

此类人抗体可以是人单克隆抗体。此类人单克隆抗体可以通过杂交瘤产生，所述杂交瘤包括得自转基因非人动物（例如，转基因小鼠）的B细胞，其具有融合至永生化细胞的包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。

人抗体可以分离自基于人种系序列的选择建立的序列文库，其进一步使用天然和合成序列多样性进行多样化。

人抗体可以通过人淋巴细胞的体外免疫随后使用埃巴病毒转化来制备。

术语“人抗体衍生物”指的是人抗体的任何修饰形式，诸如抗体或其它剂或抗体的缀合物。

如本文使用的术语“人源化抗体”指的是人/非人嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的一种或多种序列（CDR区或其部分）。因此，人源化抗体是人免疫球蛋白（受体抗体），其中来自受体的高变区的至少数个残基被来自非人物种的抗体（供体抗体，诸如来自小鼠、大鼠、兔或非人哺乳动物）的高变区的数个残基取代，所述人源化抗体具有期望的特异性、亲和力、序列组成和功能性。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基取代。此类修饰的一个实例是引入一种或多种所谓的回复突变，其中氨基酸通常来源于供体抗体。抗体的人源化可以使用本领域技术人员已知的重组技术实施（参见，例如Antibody Engineering, Methods in Molecular Biology, vol. 248, edited by BennyK. C. Lo）。轻链和重链可变域的合适的人受体框架可以通过例如测序或结构同源性鉴定。可选地，可以基于例如结构、生物物理学和生物化学特性的认知而使用固定的受体框架。受体框架可以是衍生自种系或衍生自成熟抗体序列。来自供体抗体的CDR区可以通过CDR移植进行转移。CDR移植的人源化抗体可以进一步通过鉴定关键框架位置对例如亲和力、功能性和生物物理特性进行优化，其中在所述位置的来自供体抗体的氨基酸残基的再引入（回复突变）对人源化抗体的特性具有有利影响。除了供体抗体衍生的回复突变，人源化抗体可以通过在CDR或框架区引入种系系残基、消除免疫原性表位、定点诱变、亲和力成熟等进行工程改造。

此外，人源化抗体可以包含受体抗体或供体抗体中不存在的残基。可以进行这些修饰以进一步改善抗体表现。通常，人源化抗体将包含至少一个，通常两个可变结构域，其中CDR区的全部或基本全部对应于非人免疫球蛋白的那些，并且其中FR残基的全部或基本全部是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可以，任选地，还包含免疫球蛋白（通常是人免疫球蛋白的）恒定区（Fc）的至少部分。

术语“人源化抗体衍生物”指的是人源化抗体的任何修饰形式，诸如抗体或其它试剂或抗体的缀合物。

如本文使用的术语“嵌合抗体”指的是其轻链和重链基因已经被来自不同物种起源的免疫球蛋白可变和恒定区基因构建（通常通过基因工程改造）的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段可以连接至人恒定区段。

抗体的片段可结晶区（“Fc区”/”Fc结构域”）是抗体的N-端区，其包括恒定CH2和CH3结构域。所述Fc结构域可以与称为Fc受体的细胞表面受体，以及补体系统的一些蛋白相互作用。所述Fc区使得抗体能够与免疫系统相互作用。在本发明的一个方面中，抗体可以经工程改造以包括Fc区内的修饰，这通常改变其一项或多项功能特性，诸如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、蛋白稳定性和/或抗原依赖性细胞毒性，或尤其是其缺乏。此外，本发明的抗体可以经化学修饰（例如，可以将一个或多个化学部分连接至抗体），或所述抗体可以经修饰以改变其糖基化，再次改变所述抗体的一项或多项功能特性。IgG抗体可以携带包括以下一个或多个，且也许全部突变的经修饰的Fc结构域，所述突变将分别导致对某些Fc受体（L234A、L235E和G237A）的亲和力降低和减少C1q介导的补体结合（A330S和P331S）（残基编号根据EU索引）。

本发明的抗体的同种型可以是IgG，诸如IgG1、诸如IgG2、诸如IgG4。如果期望，抗体的类型可以通过已知技术“转换”。例如，原本作用IgM分子产生的抗体可以类别转换为IgG抗体。类别转换技术还可以用于将一种IgG亚类转换为另一种,例如:从IgG1至IgG2或IgG4;从IgG至IgG1或IgG4；或从IgG4至IgG或IgG。也可以通过将来自不同IgG亚类的区组合来执行抗体的工程改造，以生成恒定区嵌合分子。

在一个实施方案中，CH1的铰链区被修饰，使得铰链区中半胱氨酸残基的数量变化，例如，增加或减少。该方法进一步描述于例如由Bodmer等人的美国专利号5,677,425中。

该恒定区可以经修饰以稳定抗体，例如，以降低二价抗体分离为两个单价VH-Vl片段的风险。例如，在IgG4恒定区中，残基S228（残基编号根据EU索引）可以被突变为脯氨酸(P)残基以稳定在所述铰链形成的重链间二硫桥键（参见，例如Angal 等人, Mol Immunol.1995; 30: 105-8）。

抗体或其片段还可以根据它们的互补决定区（CDR）进行限定。当在本文中使用时，术语“互补决定区”或“高变区”指的是其中参与抗原结合的氨基酸残基所在的抗体区。高变区或CDR可以被鉴定为在抗体可变区的氨基酸排列中具有最高可变性的区。数据库可以用于CDR鉴定，诸如Kabat数据库，CDR例如被限定为包括轻链可变域的氨基酸残基24-34(L1)、50-59 (L2)和89-97 (L3)和重链可变域中的31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102(H3)；（Kabat 等人 1991; Sequences of Proteins of Immunological Interest, FifthEdition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242）。可选地，CDR可以被定义为来自“高变环”的那些残基（轻链可变域中的残基26-33(L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)和重链可变域中的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101(H3)）；Chothia and Lesk, J. Mol. Biol 1987; 196: 901-917）。通常，在该区中的氨基酸残基的编号通过Kabat等人，同上中描述的方法执行，。术语诸如“Kabat位置”、“Kabat残基”和“根据Kabat”在本文中指的是该编号系统的重链可变域或轻链可变域。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可以含有更少的或另外的氨基酸，其对应于可变域的框架（FR）或CDR的缩短、插入。例如，重链可变域可以包括在CDR H2的残基52之后的氨基酸插入（根据Kabat的52a、52b和52c），和在重链FR残基82后插入的残基（根据Kabat例如82a、82b和82c等）。可以通过在抗体序列的序列的同源区与“标准”Kabat编号对比，对给出的抗体确定残基的Kabat编号。

如本文所定义的，术语“框架区”或“FR”残基指的是那些不在CDR中的VH或VL氨基酸残基。

mAb 0170抗体具有如SEQ ID NO: 2所示的可变重链序列和如SEQ ID NO: 3所示的可变轻链序列。本发明的抗体可以包括该可变重链序列和/或该可变轻链序列。mAb 0170抗体具有SEQ ID NO: 2的氨基酸31至35、50至68和101至110以及SEQ ID NO: 3的氨基酸24至38、54至60和93至101所示的CDR序列。

根据本发明的重链可包含具有SEQ ID NO: 2的氨基酸31至35（TYAMH）的CDR1序列，其中这些氨基酸之一可以被不同的氨基酸取代。

根据本发明的重链可包含具有SEQ ID NO: 2的氨基酸50至68（RIRTKSSNYATYYADSVKD）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。

根据本发明的重链可包含具有SEQ ID NO: 2的氨基酸101至110（DMGQRRQFAY）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。

根据本发明的轻链可包含具有SEQ ID NO: 3的氨基酸24至38（RASESVDTFDYSFLH）的CDR1序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。

根据本发明的轻链可包含具有SEQ ID NO: 3的氨基酸54至60（RASNLES）的CDR2序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以被不同的氨基酸取代。

根据本发明的轻链可包含具有SEQ ID NO: 3的氨基酸93至101（QQSNEDPYT）的CDR3序列，其中这些氨基酸中的一个或两个可以被不同的氨基酸取代。

mAb 0170抗体具有如SEQ ID NO: 2所示的重链序列和如SEQ ID NO: 3所示的轻链序列。本发明的抗体可包含该重链序列和/或该轻链序列。本发明的抗体的重链或轻链或两者可以是mAb 0170的变体。mAb 0170抗体具有SEQ ID NO: 2的氨基酸31至35、50至68和101至110以及SEQ ID NO: 3的氨基酸24至38、54至60和93至101所示的CDR序列。本发明的抗体可包含这些CDR序列中的1、2、3、4、5或全部6个。

根据本发明的重链可包含具有SEQ ID NO: 2的氨基酸101至110（DMGIRRQFAY）的CDRH3序列，其中这些氨基酸中的一个、两个或三个可以被不同的氨基酸取代。

术语“抗原”（Ag）指的是用于对免疫活性脊椎动物免疫以产生识别所述Ag的抗体的分子实体。本文中，Ag更广泛地表示且通常意图包括由Ab特异性识别的靶标分子，因此其包括用于免疫过程中，或其它过程例如噬菌体展示中的分子的片段或模拟物，用于生成所述Ab。

如本文使用的术语“表位”，在本文背景下定义为“抗原结合多肽”（诸如抗体（Ab））及其对应的抗原（Ag）之间相互作用的分子。一般地，“表位”指的是Ag上的范围或区，其是Ab特异性结合的，即所述范围或区与所述Ab物理接触。对于Ab和Ag分子中的原子，物理接触可以通过多个标准限定（例如，截止距离为2-6Å、诸如3Å、诸如4 Å、诸如5Å；或溶液可及性）。蛋白表位可以包括直接参与结合至Ab的Ag中的氨基酸残基(也被称为表位的免疫显性组分)和不直接参与结合的其它氨基酸残基，诸如由Ab有效阻断的Ag的氨基酸残基，即在Ab的“溶剂排除面”和/或“足迹”中的氨基酸残基。

本文的术语表位包括特异性结合至TREM-1抗体的TREM-1的任何特定区中的结合区的类型。TREM-1可以包括多种不同表位，其可以包括但不限于，由位于成熟TREM-1构象中的彼此临近的一个或多个非连续氨基酸组成的构象表位和由共价结合至TREM-1的分子结构，诸如碳水化合物基团中全部或部分组成的翻译后表位。

给定抗体（Ab）/抗原（Ag）对的表位可以使用实验性和计算机的表位作图方法在不同细节水平描述和表征。实验性方法包括诱变、X-射线、晶体学、核磁共振（NMR）光谱学、氢-氘交换质谱法（HX-MS）和本领域已知的各种竞争结合方法。由于每种方法依赖于其独特的原理，因此表位的描述与用于确定其的方法密切相关。因此，取决于采用的表位作图方法，可以区别地描述给定的抗体（Ab）/抗原（Ag）对的表位。

在最详细的水平，Ag和Ab之间相互作用的表位可以通过定义Ag-Ab相互作用中存在的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学的相对作用的信息进行描述。在较不详细的水平，表位可以通过定义在Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标进行表征。在甚至更不详细的水平，表位可以通过含有通过具体标准定义的氨基酸残基进行表征，所述具体标准诸如Ab:Ag复合体中原子间距离或溶剂可及性。在进一步更不详细的水平看，表位可以通过功能，例如与其它Ab的竞争结合进行表征。表位还可以更一般地定义为包含这样的氨基酸残基，其被另一种氨基酸所取代将改变Ab和Ag之间相互作用的特征。

在通过Ab（例如Fab片段）和其Ag之间的复合物的空间定位定义X-射线衍生的晶体结构的背景下，除非另有明确说明或与上下文矛盾，本文中的术语表位具体地定义为这样的TREM-1残基，其特征在于具有与Ab中重原子距离为例如4 Å以内的重原子（即非氢原子）。

取决于使用的表位作图方法，所获得的表位的描述和定义事实上具有不同的详细水平，相似地，可以在不同的详细水平比较同一Ag上针对不同Ab的表位。

如果表位含有相同的氨基酸残基布置，则在氨基酸水平描述的（例如通过X-射线结构确定）表位被认为是相同的。如果表位共享至少一个氨基酸，则表位被认为是重叠的。如果表位没有共享的氨基酸，则表位被认为分别的（独特的）。

表位还可以通过比较抗体对野生型人TREM-1和那些人TREM-1变体（其在预期的表位具有丙氨酸突变）的结合动力学的方式间接定义。抗体对一个氨基酸残基已经被一个丙氨酸残基替换的人TREM-1变体的亲和力降低或结合消除指示突变的氨基酸有助于所述抗体和野生型人TREM-1之间的相互作用。该方法提供了对表位的否定识别。由于蛋白质错误折叠或未折叠将给出类似于消除相互作用的结果，所述方法削弱了对表位的有效定义。如果存在交叉反应抗体，分析可以通过直系同源靶蛋白（例如食蟹猴TREM-1）的功能突变分析的比较增益进行补充。所述比较将定义不与例如，食蟹猴TREM-1交叉反应的抗体和交叉反应的抗体之间的表位差异。

还可以通过测量结合至野生型抗原（TREM-1）的变体的抗体（或其片段）提供表位的间接鉴定。如果抗体或其片段结合例如人TREM-1，但不结合食蟹猴TREM-1，并且如果所述抗体或其片段能够结合食蟹猴TREM-1的部分人源化变体，则该恢复的结合指示所取代的氨基酸残基对于抗体与抗原相互作用是重要的。同样地，抗人TREM-1抗体（或其片段）对食蟹猴TREM-1的人源化变体增加的亲和力对食蟹猴TREM-1具有相比人TREM-1更弱的结合，这可以提供构成结合表位的残基的身份信息。

相同突变在任何给出的交叉反应抗体上的效果使得有可能区分可能的蛋白错误折叠（消除了对两种抗体的结合）和人TREM-1相互作用的丧失（结合抗体之一并消除了对另一抗体的结合），同时清楚地提供了表位在不发生交叉反应的抗体和交叉反应的抗体之间在氨基酸水平上的差异。

本发明的抗体可以如使用例如表面等离子体共振确定的，能够结合人TREM-1的变体。

本发明的抗体可以如使用例如表面等离子体共振确定的，能够结合食蟹猴TREM-1的变体。

本发明的抗体可能够特异性结合TREM-1，其中所述抗体能够特异性结合人TREM-1的（i）选自以下的至少一种氨基酸残基：A21、T22、K23、L24、T25、E26，和（ii）选自以下的至少一种氨基酸残基A49、S50、S51、Q52、K53、A54、W55、Q56、I57、I58、R59、D60、G61、E62、M63、P64、K65、T66、L67、A68、C69、T70、E71、R72、P73、S74、K75、N76、S77、H78、P79、V80、Q81、V82、G83、R84、I85，和（iii）选自以下的至少一种氨基酸残基C113、V114、、I115、Y116、Q117、P118和P119。

本发明的抗体可能够特异性结合包含SEQ ID NO: 1（人TREM-1）的氨基酸D38至F48的多肽，如使用例如，HX-MS或X-衍射确定的。

本发明的抗体可以具有这样的表位，其包含SEQ ID NO: 1（人TREM-1）的氨基酸残基D38, V39、K40、C41、D42、Y43、T44和L45中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部以及选自SEQ ID NO: 1（人TREM-1）的氨基酸残基E46、K47和F48中的一个、两个或全部，如使用例如，HX-MS或X-衍射确定的。

本发明的抗体可以具有这样的表位，其包含选自SEQ ID NO: 1（人TREM-1）的氨基酸残基D42、E46、D92和H93中的一个、两个、三个或全部，如使用TREM-1的变体和表面等离子体共振确定的。

本发明的抗体可以具有这样的表位，其包含至少SEQ ID NO: 1（人TREM-1）的氨基酸残基E46和/或D92，如使用TREM-1的变体和表面等离子体共振确定的。

本发明的抗体还可以包含选自SEQ ID NO: 1（人TREM-1）的氨基酸残基L31、I86和V101中的一个、两个或全部。

本发明的抗体可能够特异性结合包含食蟹猴TREM-1(SEQ ID NO: 17)的氨基酸残基E19至L26的多肽，如使用例如，HX-MS或X-衍射确定的。

本发明的抗体可能够特异性结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含选自SEQ IDNO: 1的氨基酸残基V39、K40、C41、D42、Y43、L45、E46、K47、F48和A49中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或全部。

本发明的抗体可能够特异性结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含SEQ ID NO:1的D42。本发明的抗体可能够特异性结合人TREM-1，其中所述抗体的表位包含SEQ ID NO:1的E46。所述抗体的表位可以包含EQ ID NO: 1的V39、C41、D42、Y43、L45。所述抗体的表位可以包含EQ ID NO: 1的E46、K47和A49。所述抗体的表位还可以包含EQ ID NO: 1的F48。

术语“配位”的定义通过翻转视角而衍生自“表位”的定义。因此，术语“配位”指的是抗体上抗原特异性结合的范围或区，即所述范围或区与抗原物理接触。

在通过抗体（诸如Fab片段）和其抗原之间的复合物的空间定位定义X-射线衍生的晶体结构的背景下，除非另有明确说明或与上下文矛盾，本文中的术语配位具体地定义为这样的抗原残基，其特征在于具有与TREM-1中重原子距离为例如4 Å以内的重原子（即非氢原子）。

给定抗体（Ab）/抗原（Ag）对的表位和配位可以通过常规方法鉴定。例如，表位的一般位置可以通过评价抗体结合至TREM-1多肽的不同片段或变体的能力来确定。TREM-1内与抗体接触的特定氨基酸（表位）和抗体中与TREM-1接触的特定氨基酸（配位）还可以使用常规方法确定。例如，抗体和靶分子可以结合，且Ab：Ag复合物可以结晶化。可以确定所述复合物的结晶结构并且所述晶体结构可以用于鉴定抗体和其靶标之间相互作用的特定位点。

结合至相同抗原的抗体可以对它们同时结合至它们的共同抗原的能力进行表征，并且可以经历“竞争结合”/“建箱（binning）”。在本发明背景下。术语“建箱”指的是将结合相同抗原的抗体分组的方法。抗体的“建箱”可以基于在测定中两种抗体对它们的共同抗原的竞争结合，所述测定基于标准技术诸如表面等离子体共振（SPR）、ELISA或流式细胞术。

一个抗体的“箱”使用参考抗体进行定义。如果第二抗体不能与参考抗体同时结合一种抗原，则所述第二抗体被认为属于参考抗体的相同“箱”。在该情况中，参考抗体和第二抗体竞争结合抗原的相同部分，且造成“竞争抗体”。如果第二抗体能够与参考抗体同时结合一种抗原，则所述第二抗体被认为属于分别的“箱”。在该情况中，参考抗体和第二抗体不竞争结合抗原的相同部分，且造成“非竞争抗体”。

抗体“建箱”不提供关于表位的直接信息。竞争抗体，即属于相同“箱”的抗体可以具有相同表位、重叠表位或甚至分别的表位。后者的情况是如果结合至其抗原表位的参考抗体占据了所述第二抗体与其在抗原上的表位接触所需的空间（“空间位阻”）。非竞争抗体通常具有分别的表位。

本发明的抗体可以与mAb 0170竞争结合人TREM-1。本发明的抗体可以与mAb 0170竞争结合食蟹猴TREM-1。换而言之，本发明的抗体可能与mAb 0170属于同一“箱”。

本文的术语“结合亲和力”指的是两分子（例如抗体或其片段与抗原）之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”被用于描述单价相互作用（固有活性）。

两分子（例如抗体或其片段和抗原）之间通过单价相互作用的结合亲和力可以通过平衡解离常数(K_D)的测定来定量。继而，K_D可以通过复合物形成和解离的动力学的度量来确定，例如通过SPR方法。对应于单价复合物的结合和解离的速率常数分别指的是结合速率常数k_a(或k_on)和解离速率常数k_d(或k_off)。K_D通过方程式K_D = k_d / k_a涉及k_a和k_d。

根据上文定义，与不同分子相互作用有关的结合亲和力，诸如不同抗体对给定抗原的结合亲和力的比较，可以通过比较各自的抗体/抗原复合物的K_D值进行比较。

本发明的抗体可以1 x 10^-7M或更小、1 x 10^-8M或更小、或1 x 10^-9M或更小、或1x 10^-10M或更小、1 x 10^-11M或更小、1 x 10^-12M或更小、或1 x 10^-13M或更小的亲和力(K_D)与人TREM-1结合，如使用表面等离子体共振确定的。本发明的抗体可以1 x 10^-7M或更小、1 x10^-8M或更小、或1 x 10^-9M或更小、或1 x 10^-10M或更小、1 x 10^-11M或更小、1 x 10^-12M或更小、或1 x 10^-13M或更小的亲和力(K_D)与食蟹猴TREM-1结合，如使用表面等离子体共振确定的。

本文的术语“结合特异性”指的是分子诸如抗体或其片段，与单独的专一抗原或具有优先数量的高度同源抗原（或表位）的相互作用。与之相反，能够特异性结合TREM-1的抗体不能结合不相似的分子。根据本发明的抗体可能不能够结合Nkp44，自然杀伤细胞p44-相关蛋白。

相互作用的特异性和平衡结合常数的值可以通过熟知的方法直接确定。评估配体（诸如抗体）结合其靶标的能力的标准测定是本领域已知的，且包括例如，ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学和结合亲和力还可以通过本领域已知的标准测定进行评价，诸如SPR。

可以进行竞争性结合测定，其中比较抗体与靶标的结合和所述靶标与另一靶标的配体（诸如另一抗体）的结合。

在另一个方面中，本发明提供了组合物和制剂，其包含本发明的分子诸如本文描述的TREM-1抗体、多核苷酸、载体和细胞。例如，本发明提供了包含本发明的一种或多种TREM-1抗体的药物组合物，其与药学上可接受的载体一同配制。

因此，本发明的一个目标是提供药物制剂，其包含以0.25 mg/ml至250 mg/ml，的浓度，诸如10至200 mg/ml的浓度存在的TREM-1抗体，且其中所述制剂具有2.0至10.0的pH，诸如4.0至8.0的pH。制剂还可以包含一种或多种缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和/或表面活性剂，以及其各种组合。防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂在药物组合物中的使用是技术人员熟知的。可以参考Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 第19版, 1995。

在一个实施方案中，所述药物制剂是含水制剂。此类制剂通常是溶液或悬浮液，但也可以包括胶体、分散液、乳液和多相材料。术语“含水制剂”被定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样地，术语“含水制剂”被定义为包含至少50% w/w水的溶液，且术语“含水悬浮液”被定义为包含至少50% w/w水的悬浮液。

在另一个实施方案中，所述药物制剂是冻干制剂，在使用前医师或患者向其中添加溶剂和/或稀释剂。

在另外的方面中，所述药物制剂包含此类抗体的含水溶液和缓冲剂，其中所述抗体以1 mg/ml或以上的浓度存在，且其中所述制剂具有约2.0至约10.0的pH，诸如4.0至8.0的pH。

本发明的TREM-1抗体和药物组合物包含这样的抗体，其可以用于治疗诸如以下的炎性疾病：炎症性肠病（IBD）、克罗恩病（CD）、溃疡性结肠炎（UC）、肠易激综合症、类风湿性关节炎（RA）、银屑病、银屑病性关节炎、全身性红斑狼疮（SLE）、狼疮性肾炎、一型糖尿病、格雷夫斯病、多发性硬化（MS）、自身免疫性心肌炎、川崎病、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病、间质性肺病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病、系统性硬化症、骨关节炎、异位性皮炎、白癜风、移植物抗宿主病、干燥综合征、自身免疫性肾炎、古德帕斯丘综合征、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、过敏症、哮喘和其它导致急性或慢性炎症的自身免疫疾病。

本发明的TREM-1抗体可适用于治疗患有炎症性肠病的个体。炎症性肠病（IBD）是可以影响嘴至肛门的胃肠道的任何部分的疾病，其导致广泛的各种症状。IBD主要导致腹痛、腹泻（其可以是带血的）、呕吐或体重减少，但也可以导致胃肠道以外的并发症诸如皮疹、关节炎、眼部炎症、疲劳和缺乏注意力。患有IBD的患者可以被分为两个主要类别，患有溃疡性结肠炎（UC）的那些和患有克罗恩病（CD）的那些。CD一般涉及回肠和结肠，其可以影响肠的任何区但是通常是不连续的（疾病的集中区域分布在肠中）。UC通常涉及直肠（结肠的）且更连续。在CD中炎症是透壁的，导致脓肿、瘘管和狭窄，而在UC中炎症通常局限于粘膜。没有已知的用于克罗恩病的药物或手术疗法，而通过手术切除结肠可以治愈一些患有UC的患者。治疗选项受限于控制症状、维持缓解和预防复发。炎症性肠病在临床中的效力可以如用于CD的克罗恩病活性指数（CDAI）分数的减少进行测量，其是基于实验室测试和生活质量调查问卷的得分量表。在动物模型中，功效大多通过体重测量，并且还通过疾病活性指数（DAI）测量，其为粪便硬度、体重和便血的组合。

本发明的TREM-1抗体可适用于治疗患有类风湿性关节炎的个体。类风湿性关节炎（RA）是全身性疾病，其影响几乎整个（如果不是全部）身体，且是关节炎最常见的形式。其特征在于关节的炎症，其导致疼痛、僵硬、温热、发红和肿胀。该炎症是炎性细胞入侵关节的结果，并且这些炎性细胞释放可以消化骨和软骨的酶。结果，该炎症可以导致严重的骨和软骨损伤，并且导致关节恶化和严重疼痛，除了其它生理效果之外。波及的关节会失去其形状和排列，导致疼痛和无法运动。

本领域已知数种类风湿性关节炎的动物模型。例如，在胶原诱导性关节炎（CIA）模型中，小鼠发展出类似人类风湿性关节炎的炎性关节炎。因为CIA与RA具有相似的免疫学和病理学特征，这使得其成为筛选潜在的人抗炎性化合物的合适的模型。该模型中的功效通过关节肿胀的减少来测量。RA在临床中的功效通过在患者中减少症状的能力来测量，其测量的是关节肿胀、红细胞沉降率、C-反应性蛋白水平和血清因子（诸如抗瓜氨酸化蛋白）水平的组合。

本发明的TREM-1抗体可适用于治疗患有银屑病的个体。银屑病是T细胞介导的皮肤的炎性病症，其可以导致相当大的不适。这是一种目前无法治愈且影响全部年龄的人的疾病。虽然具有轻微银屑病的个体通常可以使用局部药剂控制他们的疾病，但是全世界超过一百万患者需要紫外线治疗或全身免疫抑制疗法。不幸的是，紫外辐射的不便和风险以及很多疗法的毒性限制了它们的长期使用。此外，银屑病患者通常会复发，且在一些情况下在停止免疫抑制疗法后立即出现反弹。近期开发的基于CD4+ T细胞转移的银屑病模型模拟了人银屑病的很多方面且因此可以用于鉴定适合用于治疗银屑病的化合物（Davenport 等人, Internat. Immunopharmacol 2:653-672, 2002）。通过皮肤病理学的减少使用评分系统来测量在该模型中的功效。相似地，通过皮肤病理学的减少测量在患者中的功效。

本发明的TREM-1抗体可适用于治疗患有银屑病关节炎的个体。银屑病关节炎（PA）是发生在一部分银屑病患者中的一类炎性关节炎。在这些患者中，皮肤病理学/症状伴随着与类风湿性关节炎中观察到的类似的关节肿胀。其特征在于伴随剥落的具有破损的、凸起的、发红的区域的皮肤炎症。银屑病通常影响肘和膝盖尖、头皮、肚脐和生殖器区或肛门周围。大约10%的银屑病患者也发展出其关节的相关炎症。

如本文使用的术语“治疗”指的是任何人或其它动物个体所需的医学疗法。预计所述个体已经经历通过医师或兽医师进行的身体检查，其已经得到了初步诊断或最终诊断，所述诊断指示使用所述治疗有益于所述人或其它动物个体的健康。所述治疗的时间安排和目的可以在个体之间彼此不同，其取决于多种因素，诸如该个体的健康现状。因此，所述治疗可以是预防性的、缓解性的、针对症状的和/或治疗性的。

根据本发明，预防性的、缓解性的、针对症状的和/或治疗性的治疗可以代表本发明的不同方面。

本发明的抗体可以肠胃外地,诸如静脉内地、诸如肌内地、诸如皮下地施用。可选地，本发明的抗体可以经由非肠胃外途径施用，诸如经口地或局部地。本发明的抗体可以预防性地施用。本发明的抗体可以治疗性地施用（按要求）。

在本发明的第一个方面，观察到SEQ ID NO: 3（mAb 0170的可变轻链）的CDR1和CDR3区的带负电残基的取代影响mAb的黏度。在本发明的这第一个方面，本发明的mAb是具有重链和轻链的mAb 0170的变体，其中mAb 0170的轻链，即SEQ ID NO: 3，包含这样的突变，其中SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3的带负电残基被取代为不带电残基。因此，本发明的方面涉及mAb 0170的变体，其包含使用选自以下的氨基酸残基取代SEQ ID NO: 3的残基D1、D30、D33、D74、D98、E27、E97中的任一个或任意组合：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。除非另有说明，本发明的有意思的实施方案涉及抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 2(或其变体)作为重链，且SEQ ID NO: 3的变体作为轻链，其中SEQ ID NO: 3的残基D1、D30、D33、D74、D98、E27、E97的任一个或任意组合被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。这些突变将被称为“电荷补丁”突变。在优选的实施方案中，SEQ ID NO： 3的CDR1和CDR3区的E27和E97两者中至少一个被不带电氨基酸残基取代，所述不带电氨基酸诸如选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。在优选的实施方案中，SEQ ID NO： 3的CDR1和CDR3区的E27被突变为谷氨酰胺且E97被选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。在另外的实施方案中，E27保持未突变，而E97被突变为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸，更优选地突变为选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。在另一个实施方案中，残基E97保持未突变，而E27被取代为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸，更优选地被取代为选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。

本发明的另一个方面是基于这样的观察结果：由于配位区域内的相互作用而形成了Fab-Fab二聚体。由于mAb包含两个Fab，预想mAb能够二聚化，所述二聚化可能影响黏度特性。因此，本发明的另一个方面涉及突变SEQ ID NO: 2（即mAb 0170的可变红重链区）的Fab-Fab相互作用区中的残基以减少Fab-Fab二聚化。这些突变被称为“Fab-Fab相互作用”突变。因此，本文的方面涉及SEQ ID NO: 2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ. ID NO 3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98中的任一个被取代为选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸。除非另有说明，本发明有意思的实施方案涉及一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 2的变体，其中SEQ ID NO: 2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ. ID NO 3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98中的任一个（“Fab-Fab相互作用”突变）被另一种氨基酸取代，所述另一种氨基酸是诸如天然氨基酸，优选地选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸。优选地，SEQ ID NO 2的残基A59和N57中至少一个被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸；更优选丝氨酸或酪氨酸。在一个实施方案中，A59保持未突变而N57被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸；更优选丝氨酸或酪氨酸。在另一个实施方案中个，N57保持未突变而A59被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸。在至少一种实施方案中，A59和N57两者均被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸；更优选丝氨酸或酪氨酸。

在一个有意思的实施方案中，i）SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3区的至少一个带负电残基被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸，且ii）SEQ ID NO: 32的Y32、R52、 S55、 S56、 N57、 A59、 M102、I104和R106或SEQ. ID NO：3的F32、 D33、 Y34、 Y53、 R54、 D98残基中的至少一个残基（“Fab-Fab相互作用”突变）被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸和色氨酸、组氨酸和酪氨酸。

在合适的实施方案中，SEQ ID NO: 3的E27和E97之一或两者被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸，而SEQ ID NO: 2的A59和N57之一或两者被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸；更优选丝氨酸或酪氨酸。

本发明另外的方面是基于这样的观察结果：在TREM-1的SEQ. ID NO 1的位置Y90上的Ala取代改善了SEQ. ID NO 3对TREM-1的亲和力。据发现，Y90与SEQ. ID NO 3的苯丙氨酸残基相互作用。为了改善Fab-TREM-1相互作用的SEQ ID NO: 3的突变被称为Fab-TREM-1相互作用突变。在本发明的该方面的一个实施方案中，SEQ ID NO: 3的位置32的苯丙氨酸被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸，优选地选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸和亮氨酸。在有意思的实施方案中，SEQ ID NO: 3的F32被突变为丙氨酸或丝氨酸。

SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3中的电荷补丁突变降低了流体动力学半径（Rh）而Fab-Fab相互作用区中的突变增加了Rh（图6）。“Fab-TREM-1相互作用”位点中的突变不影响Rh且对黏度影响甚微（图6和1，表3C和3E）。

表 1生成的SEQ ID No (0170) mAb变体的概述。L =轻链，H =重链。

通过DLS或微观流变学确定了mAb 0170变体的黏度，并且显示“电荷补丁” 突变和“Fab-Fab相互作用”突变降低了黏度。据发现，包含电荷补丁突变E27Q和E97Q的mAb变体0318具有最低黏度。

分别确定了mAb 0170变体对人TREM-1-Fc和食蟹猴TREM-1-Fc的结合动力学。发现所有mAb 0170变体对人TREM-1-Fc均具有相似的亲和力。有趣的是，据发现，mAb变体SEQID NO: 9(其包括“Fab-TREM-1相互作用”突变)对食蟹猴TREM-1-Fc具有增加的亲和力（表2）。

表2:抗-TREM-1 mAb变体分别对人TREM-1-Fc和食蟹猴TREM-1-Fc的亲和力。

在一个实施方案中，将来自SEQ ID NO: 9的突变与SEQ ID NO: 5的突变组合以生成来自SEQ ID NO: 14的轻链，并且将来自SEQ ID NO: 14的轻链的突变进一步与来自SEQID NO: 16的重链组合，得到对TREM-1改善的亲和力以及低黏度。包含SEQ ID NO: 14的组合突变的mAb变体保留了对TREM-1-Fc增加的亲和力，且所述突变对人TREM-1-Fc的亲和力没有负面影响。因此，本发明设想了：同时包含“电荷补丁”突变和“Fab-TREM-1相互作用”突变的实施方案，以及同时包含“电荷补丁”突变和“Fab-Fab相互作用”突变的实施方案，以及同时包含“Fab-Fab相互作用”突变和“Fab-TREM-1相互作用”突变的实施方案以及同时包含“Fab-Fab相互作用”突变、“Fab-TREM-1相互作用”突变和“电荷补丁”突变的实施方案。

表3A:mAb 0170、0317和0318的黏度对蛋白浓度。

表3B：mAb 0319和0320和321的黏度对蛋白浓度。

表3C：mAb 0322、0323和324的黏度对蛋白浓度。

表3D：mAb 0325、0326和0330的黏度对蛋白浓度。

表3E mAb 0322和0333的黏度对蛋白浓度。

本发明的非限制性实施方案还包括:

1. 能够结合并阻断SEQ ID NO: 1的TREM-1的抗体或其片段，其特征在于所述抗体或所述抗体的抗体片段在50 mg/mL的浓度下具有小于5 cP，诸如小于4 cP，优选地小于3 cP的黏度（其中测定相对于蛋白质浓度条件的黏度的方法是常规的或如本文所述）。

2. 能够结合并阻断TREM-1的抗体或其片段，其特征在于所述抗体或所述抗体的抗体片段在80 mg/mL的浓度下具有小于5 cP，优选地小于4 cP的黏度（其中测定相对于蛋白质浓度条件的黏度的方法是常规的或如本文所述）。

3. 根据实施方案1或2的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段以小于0.5 nM，诸如小于0.4 nM，优选地0.3 nM或更小的针对SEQ ID NO: 1的KD阻断TREM-1功能。

4. 一种抗体或其片段，其中所述抗体或其片段与mAb 0170竞争结合至SEQ IDNO: 1，并且具有如下黏度概况：

（A）所述抗体或所述抗体的抗体片段在50 mg/mL的浓度下具有小于5 cP，诸如小于4cP，优选地小于3 cP的黏度；或

（B）所述抗体或所述抗体的抗体片段在80 mg/mL的浓度下具有小于5 cP，优选地小于4cP的黏度。

5. 一种抗体或其片段，其能够特异性结合并阻断TREM-1，其中所述抗体或其片段具有SEQ ID NO: 2的“Fab-Fab相互作用”突变。

6. 一种抗体或其片段，其能够特异性结合并阻断SEQ ID NO: 1的TREM-1，其中所述抗体或其片段具有“电荷补丁”突变，诸如其中SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3的带负电残基中的至少一个被未带电残基取代。

7. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其中带负电氨基酸被能够形成氢键配偶体的氨基酸残基取代，诸如Asp或Glu残基被突变为Asn、Gln、Ser和Thr中任一种。

8. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其具有相比mAb 0170更低的黏度，但是仍具有小于0.5 nM的针对SEQ ID NO: 1的K_D。

9. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其通过取代SEQ ID NO: 2和/或3的未带电氨基酸（其涉及与具有改变的大小或氢键电势的氨基酸的特异性“Fab-Fab相互作用”）而具有相比mAb 0170降低的黏度、小于0.5 nM的针对SEQ ID NO: 1的K_D和小于0.6nM的针对SEQ ID NO: 17的K_D。

10. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其能够特异性地结合并阻断SEQ ID NO: 1的TREM-1并且包含SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的变体或两者，其中所述变体选自SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3的“Fab-Fab相互作用”突变、“Fab-TREM-1相互作用”突变和“电荷-补丁”突变。

11. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其包含“Fab-TREM-1相互作用”突变，诸如其中SEQ ID NO: 3的一个Phe残基被取代为Ala或Ser。

12. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其与SEQ ID NO: 2或3竞争结合SEQ ID NO: 1，并且其具有这样的表位，所述表位包含氨基酸残基D38、V39、K40、C41、D42、Y43、T44和L45中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或全部以及SEQ ID NO: 1的氨基酸残基E46、K47、F48中一个、两个或全部。

13. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其与SEQ ID NO: 3竞争结合，并且其包含这样的LC，所述LC中SEQ ID NO: 3的位置29和97的谷氨酸（E）残基中的一个或两个被突变为丝氨酸（S）或谷氨酰胺（Q），诸如其中E27Q、E97S，诸如其中E27和E97被突变为谷氨酰胺或其中E27保持未突变而E97被突变为S（E27，E97S)，或其中E27保持未突变而E97被突变为Q (E27，E97Q)，或其中E97保持未突变而E27被突变为Q或S，更优选地突变为Q(E27， E97Q)。

14. 根据本发明的任意实施方案的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 3，其中位置32的苯丙氨酸（F32）被突变，诸如突变为A（mAb 0322）或S（mAb 0323）。

15. 根据任意实施方案的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 2，其中残基N57和残基A59中的一个或两个已被突变，诸如其中A59已被突变为酪氨酸，或其中残基N57已经被突变为丝氨酸，或其中残基N57已经被突变为丝氨酸且A59已被突变为酪氨酸。

16. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 2的变体，其中涉及特异性Fab-Fab相互作用的不带电氨基酸被具有改变的大小或氢键电势的氨基酸取代，诸如其中丙氨酸（A）或天冬氨酸（N）被Ser、Thr、Phe、Tyr和Trp中任一种取代。

17. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 3的变体且与SEQ ID NO: 3竞争结合，其中SEQ ID NO: 3的位置29和97的谷氨酸（E）残基中的一个或两个被突变为丝氨酸（S）或谷氨酰胺（Q），诸如其中E27、E97两者均被突变为谷氨酰胺（318），或其中E27保持未突变而E97被突变为S（E27，E97S)，或其中E27保持未突变而E97被突变为Q (E27，E97Q)，或其中E97保持未突变而E27被突变为Q或S，更优选地突变为Q(E27，E97Q)。

18. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 2的变体且与SEQ ID NO: 2竞争结合，其中残基N57和残基A59中的一个或两个已被突变，诸如其中A59已被突变为酪氨酸，或其中残基N57已经被突变为丝氨酸，或其中残基N57已经被突变为丝氨酸且A59已被突变为酪氨酸。

19. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 4。

20. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 5。

21. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 6。

22. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 7。

23. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 8。

24. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 9。

25. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 10。

26. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 11。

27. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 12。

28. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 13。

29. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 14。

30. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 15。

31. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 16。

32. 一种抗体或其片段，其包含SEQ ID NO：4至16中的任一者。

33. 一种组合物，其包含如实施方案1-32中任一项定义的抗体。

34. 本发明的诸如实施方案1-32的抗体，用作药物。

35. 本发明的诸如实施方案1-32的抗体，用于治疗选自炎性疾病或自身免疫疾病的疾病。

36. 根据实施方案35的抗体，其中所述疾病选自类风湿性关节炎和炎症性肠病。

37. 本发明的诸如实施方案1-32的抗体在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自炎性疾病或自身免疫疾病的疾病。

38. 根据实施方案35的用途，其中所述疾病选自类风湿性关节炎和炎症性肠病。

39. 治疗选自炎性疾病或自身免疫疾病的疾病的方法，其包括施用本发明的抗体（诸如实施方案1-32中任一项的抗体）、包含本发明的抗体的组合物或包含本发明的抗体的药物。

实施例

实施例1：mAb0170 变体的流体动力学半径和黏度

据发现，WO2013/120553的mAb0170的流体动力学半径比期望的（5-6 nm）更高（9-10nm）。通过使用DynaPro平板读取器(Wyatt Inc.)设置的96孔板的动态光散射分析确定流体动力学半径。使用的板为Corning 3540分析平板(Corning)。对于mAb0170变体，总样品体积为大约20μL且温度保持在25 ℃（图6）。

可变轻链的CDR1和CDR3中的电荷补丁突变将Rh降低至单体mAb的期望水平，而Fab-Fab相互作用区中的突变似乎增加了Rh。Fab-TREM-1相互作用位点中的突变没有影响Rh。

通过DLS确定mAb0170变体0317、0318、0319、0320、0321、0322、0323、0324、0325、0326和0330的黏度。Wyatt DynaPro平板读取器上使用Corning 3540底部透明、黑色未处理的聚苯乙烯微孔板和来自Phosphorex Inc.的具有平均直径206.5 nm光滑的聚苯乙烯纳米球(目录号106)测量流体动力学半径。将蛋白样品转移至Corning 3540平板中并使用顶部密封覆盖。将样品离心并且在Wyatt DynaPro DLS平板读取器上测量蛋白样品的流体动力学半径。向每孔添加0.5μL聚苯乙烯小珠并抽吸混合。将样品再次离心并且在WyattDynaPro DLS平板读取器上测量蛋白样品的流体动力学半径。

蛋白样品的黏度按以下计算：

黏度(蛋白) = (流体动力学半径(小珠，测量的)×黏度(缓冲液))/流体动力学半径(小珠，真实)

其中黏度(蛋白)是计算的蛋白溶液的黏度，流体动力学半径(小珠，测量的)是在蛋白溶液中测量的聚苯乙烯小珠的流体动力学半径，黏度(缓冲液)是缓冲液的黏度且流体动力学半径(小珠，真实)是小珠的真实平均直径（He 等人, Anal Biochem, 399, 141-143,2010）。

通过微观流变学确定mAb0170变体0332和0333的黏度。对于流变学分析，使用附接有30G Novofine针的250 μl Hamilton LT注射器(Hamilton-Bonaduz Inc)。将注射器置于固定于平台上的定制的铝架。通过TAXTPlus Texture Analyzer驱动注射器的活塞，其通过预定的注射速度测量活塞上所得的力。使用三种不同注射速度测试各个样品。使用交叉速度和测量的力分别计算剪切速率和剪切力。黏度可以与剪切速率的关系表示：

η_蛋白质 = τ_W/γ = (∆PD⁄4L)/((32Q)⁄(πD³ ))

其中η_蛋白质是蛋白溶液的黏度，γ是表面剪切速率，τ_W是剪切力，P是驱动活塞产生的压力，Q是流体穿过毛细管针头的容积流率，且D和L分别是毛细管的直径和长度（Allahham 等人, 2004; Intl J Pharm 270, 139-148）。黏度η蛋白通过D、L和Q的已知值和测量的P值计算。

分析显示，“电荷补丁”突变和“Fab-Fab相互作用”突变均降低黏度（图1）。据发现，包含电荷补丁突变E27Q和E97Q的mAb变体SEQ ID NO: 5具有最低黏度。

实施例2：mAb0170 变体动力学

分别确定mAb 0170变体对人TREM-1-Fc和食蟹猴TREM-1-Fc的结合动力学。在ProteOnAnalyzer (BioRad)上执行结合研究，其通过表面等离子体共振实时测量分子相互作用。实验在25ºC运行且样品在15 ºC贮存于样品室。由ProteOn报道的信号（RU，反应单位）与六个平行流通池中的独立传感芯片表面上的质量直接相关。根据制造商说明书，将来自Biacore人或小鼠Fc捕获试剂盒的抗人Fc单克隆或抗鼠Fc多克隆抗体以水平方向固定于GLM传感芯片的流通池上。在每个实验中捕获抗体的最终固定水平为大约2600-6000 RU。纯化的单克隆小鼠或重组表达的抗-hTREM-1抗体的捕获通过以下来进行：将抗体在电泳缓冲液（10 mMHepes 0,15 M NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% 表面活性剂P20, pH 7.4）中稀释至5-10 nM，随后在30 μL/min以垂直方向注射60 sec，产生仅具有固定的抗-Fc抗体的临近全部流通池的参考交叉点。这通常导致大约100-300 RU的测试抗体的最终捕获水平和30-90 RU的分析物Rmax值。通过在水平方向对全部流通池注射分析物（抗原）进行hTREM-1或cTREM-1蛋白的结合，以允许对不同的捕获的抗-TREM-1抗体的结合与对参考交叉点的结合进行比较性分析。hTREM-1或cTREM-1蛋白经1:3或1.2-100 nM系列稀释或进入电泳缓冲液，以100 μL/min注射250s并允许解离600s。在分析物的每个注射周期后经由10 mM 甘氨酸，pH 1.7和50 mMNaOH在100 μL/min的两次18 s注射后再生成GLM表面。该再生步骤将抗-TREM-1抗体和任何结合TREM-1蛋白从固定的捕获抗体表面移除，并且允许接下来的相互作用样品对的后续结合。再生程序不能直接移除芯片表面的固定的抗-Fc捕获抗体。

抗体和抗原之间的结合亲和力通过确定由复合物形成和解离的动力学的测量结果所确定的平衡解离常数 (K_D)来进行定量。使用ProteOn评估软件用于数据分析，通过拟合数据至1：1Langmuir模型检索对应于单价复合物的结合和解离的速率常数诸如k_a (结合常数)和k_d (解离常数)。K_D通过方程式K_D = k_d / k_a而与k_a和k_d关联。

在数据分析前通过双重参考（减去参考表面信号以及对捕获的抗-TREM-1抗体的空白缓冲液注射）处理结合曲线。这允许修正样品注射期间的设备噪音、体积偏移和漂移。

据发现，所有mAb 0170变体均具有与mAb 0170对人TREM-1-Fc的相似的亲和力。有趣的是，包含“Fab-TREM-1相互作用”的mAb变体，诸如mAb 0322，对食蟹猴TREM-1-Fc具有增加的亲和力（表2）。

实施例3：mAb 0330和mAb 0333的动力学和黏度

为了生成对食蟹猴TREM-1具有改善的亲和力并具有低黏度的mAB，将SEQ ID NO 9的突变与SEQ ID NO 5的突变组合,发现其具有mAb0170 变体中最低的黏度,而与SEQ ID NO:11组合,发现其对黏度影响有限。包含组合突变的mAb变体（mAb 0330和mAb 0333）保留了对TREM-1-Fc增加的亲和力，且所述突变没有影响对人TREM-1-Fc亲和力。相比WO2013/120553中的mAb 0170，mAb 0330和mAb 0333的黏度显著降低。

实施例4：BWZ’36/hTREM-1稳定细胞系的培养

在补充有10% FCS (Cat# 16140-071, Gibco, New York, USA), 1% Pen/Strep(Cat# 15070-06, Gibco)，1 mM 丙酮酸钠(Cat #11360, Gibco), 5 µM -2ME (Cat#31350-010, Gibco)和2 mM L-谷氨酰胺(Cat # 25030, Gibco)的RPMI 1640 w/o酚红（(Cat# 11835, Gibco, Carlsbad CA, USA)）中培养BWZ’36/hTREM-1报道细胞。不需要特定的板或包覆。添加10 ml Versene (Cat # 15040, Gibco)以分离细胞，随后将其转移至管中，以1200 rpm离心5分钟并在新鲜RPMI 1640 w/o酚红中洗涤。这些细胞随后可用于测定或进一步增殖的再培养。

实施例5：mAb 0170变体的功能特征

使用由Bioxell提供的报道细胞系（BWZ’36/hTREM-1）确定抗-TREM-1 mAb 0170变体对人TREM-1信号传导的抑制能力。使用重组蛋白形式的或在与mAb温育前由活化的嗜中性粒细胞表达的PGN和TREM-1配体PGLYRP1刺激报道细胞系。据发现，变体抑制TREM-1信号通路的效力是临床相关的并且等同于 WO2013/120553的mAb 0170（图2A和B）。

类似地，确定了三种具有最低黏度的mAb0170变体的抑制食蟹猴TREM-1信号通路的能力，并且两种变体观察到对食蟹猴TREM-1具有增加的亲和力。在使用成熟的报道细胞系TE 426.27的该测定中，观察到了mAb变体与WO2013/120553的mAb 0170相似的效力（图3）。

而且，评价了mAb变体阻断从来自健康供体的原代细胞释放TNFa的效力。在该测定中，在低氧条件下将单核细胞分化成M2巨噬细胞以增加TREM-1表达，且在与mAb温育前使用PGN和重组PGLYRP1活化。据发现，mAb变体在抑制TREM-1-介导的从低氧M2巨噬细胞释放TNFa中具有与0170一样的效力。

实施例6：Fab 0170-Fab 0170复合物的晶体结构

通过Fab 0170-Fab 0170晶体结构的结晶分析评估mAb 0170分子通过特定的自我相互作用进行相互作用的潜力。

材料：在由10 mM 磷酸盐、2.68 mM Kcl、140 mM NaCl在pH 7.4下组成的缓冲液中在蛋白浓度8.5 mg/mL的mAb 0170 (SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19)的Fab区。

方法：mAb 0170的Fab区在悬滴蒸汽扩散实验中通过2 μL蛋白溶液与2 μL储存溶液混合的液滴和0.5 mL由20%(w/v) PEG 8000, 200 mM K₂HPO₄构成的储存液的平衡结晶化。讲晶体转移至由2 μL 35% (w/v) PEG3350, 200 mM K₂HPO₄ 组成的液滴，并且固定在0.2 mm直径的litholoop（Molecular Dimensions Limited）中并且在液氮中迅速冷却。

在MAXLAB 911-2, Lund University, Sweden上在100 K使用低温流收集X-射线衍射数据。使用XDS数据包(Kabsch, Acta Crystallogr. D66, 133-144 (2010))将原始数据索引、生成并测量。晶体的空间组为P2(1)2(1)2(1)，具有单位晶胞参数a = 62.4 Å, b =110.9 Å, c = 158.4 Å。收集2.40 Å分辨率的数据。使用应用CCP4i程序组(Potterton 等人, Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))的Phenix软件通过分子取代解析结构（Adams 等人, Acta Crystallogr. D66, 213—221 (2010)）。检索模型是来自pdb入口1AD0.pdb (85%同一性)的重链和来自pdb入口2QRG (94%同一性)的轻链的结构。使用来自CCP4i程序组的Refmac5实施结构精修（Murshudov 等人, Acta Crystallogr. D53, 240-255 (1997)）。使用Coot版本7(Emsley 等人, Acta Crystallogr. D66, 486-501 (2010))用于手动结构重建和验证。

结果与讨论

mAb 170 Fab区的晶体结构在不对称单元中含有四个Fab分子（重链被标记为A和C，轻链被标记为B和D）。Fab分子被包装为二聚体，其中一个Fab分子的抗原结合区与另一个Fab分子的抗原结合区相互作用。晶体结构中不可能包括并改善SEQ ID NO: 19的最后的半胱氨酸，尽管其预期与来自重链的SEQ ID NO: 18的Cys以二硫键相连。在该范围存在一些超2Fo-Fc和Fo-Fc电子密度的指示，且可能在Fab分子的子集中存在二硫键。对来自不对称单元中SEQ ID NO: 18的链A的残基G26、K78-N79、I104-R105和S138-E141和对于不对称单元中的SEQ ID NO: 18其它Fab分子中链C的E1、G26-F 27、M102-R105、S136-E141、S195-K200没有显著的sigmaa加权2Fo-Fc电子密度。同样对来自SEQ ID NO: 19链D的残基D30-Y34失去显著的sigmaa加权2Fo-Fc电子密度。这些残基不包括在晶体结构中，但是通过与WO2013/120553公开的人抗-TREM-1 mAb 0170晶体结构的mAb 0170片段晶体结构叠加而被包括在Fab-Fab交界面的分子相互作用分析中。

mAb 0170 Fab片段结构的质量参数显示结构的总R-因子= 24%且Free R-factor= 30%。总相关系数为0.93且衍射组分精度指数，DPI=0.3 Å (Cruickshank, ActaCrystallogr. D55, 583-601 (1999))。结构中的键长与理想键长的均方根偏差= 0.025 Å且与理想键角度的均方根偏差=2.326° (Engh and Huber, Acta Crystallogr. A47,392-400 (1991))。

使用CCP4程序组中的程序NCONT，以分子间距离4Å的截止实施分子间距离的分析(Potterton 等人, Acta Crystallogr. D59, 1131-1137 (2003))（表4）。分析显示，来自SEQ ID NO: 2的氨基酸残基N57和A59属于涉及晶体结构中Fab-Fab相互作用的那类氨基酸。

表4. 基于WO2013/120553公开的人源化抗-TREM-1 mAb 0170晶体结构与在此观察到的mAb 0170 Fab区晶体结构的叠加而预测的Fab-Fab相互作用。

序列表

<110> Novo Nordisk A/S

<120> 定点诱变TREM-1抗体以降低黏度

<130> P45251WO-PJG

<150> EP14177547.8

<151> 2014-07-17

<150> EP14194893.5

<151> 2014-11-26

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 234

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser

1 5 10 15

Glu Leu Arg Ala Ala Thr Lys Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Leu Lys

20 25 30

Glu Gly Gln Thr Leu Asp Val Lys Cys Asp Tyr Thr Leu Glu Lys Phe

35 40 45

Ala Ser Ser Gln Lys Ala Trp Gln Ile Ile Arg Asp Gly Glu Met Pro

50 55 60

Lys Thr Leu Ala Cys Thr Glu Arg Pro Ser Lys Asn Ser His Pro Val

65 70 75 80

Gln Val Gly Arg Ile Ile Leu Glu Asp Tyr His Asp His Gly Leu Leu

85 90 95

Arg Val Arg Met Val Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln

100 105 110

Cys Val Ile Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Pro His Met Leu Phe Asp Arg

115 120 125

Ile Arg Leu Val Val Thr Lys Gly Phe Ser Gly Thr Pro Gly Ser Asn

130 135 140

Glu Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Lys Ile Pro Pro Thr Thr Thr Lys

145 150 155 160

Ala Leu Cys Pro Leu Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro

165 170 175

Pro Lys Ser Thr Ala Asp Val Ser Thr Pro Asp Ser Glu Ile Asn Leu

180 185 190

Thr Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile

195 200 205

Leu Leu Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu

210 215 220

Phe Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Val Pro

225 230

<210> 2

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体重链

<400> 2

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Met Gly Ile Arg Arg Gln Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 3

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<221> 链

<222> (1)..(218)

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 3

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

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Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 4

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 4

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

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Ser Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 5

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Thr Phe

20 25 30

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

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<210> 6

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 6

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

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<210> 7

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 7

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

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210 215

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<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 9

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 9

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1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Ala

20 25 30

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

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Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

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210 215

<210> 10

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 10

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195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 11

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体重链

<400> 11

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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35 40 45

Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

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Tyr Cys Thr Arg Asp Met Gly Ile Arg Arg Gln Phe Ala Tyr Trp Gly

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305 310 315 320

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325 330 335

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<210> 12

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体重链

<400> 12

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

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260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 13

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体重链

<400> 13

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Ser Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ala

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65 70 75 80

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180 185 190

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225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

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260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

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405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 14

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体轻链

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asp Thr Ala

20 25 30

Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

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Gln Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

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195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 15

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体重链

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

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Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ala

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Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

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Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

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Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

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Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

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Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

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Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

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Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 16

<211> 448

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 人源化TREM-1抗体重链

<400> 16

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Tyr Thr Tyr Tyr Ala Ala

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440 445

<210> 17

<211> 233

<212> PRT

<213> 食蟹猴

<400> 17

Met Arg Lys Thr Arg Leu Trp Gly Leu Leu Trp Met Leu Phe Val Ser

1 5 10 15

Glu Leu Arg Ala Thr Thr Glu Leu Thr Glu Glu Lys Tyr Glu Tyr Lys

20 25 30

Glu Gly Gln Thr Leu Glu Val Lys Cys Asp Tyr Ala Leu Glu Lys Tyr

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Ala Asn Ser Arg Lys Ala Trp Gln Lys Met Glu Gly Lys Met Pro Lys

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Ile Leu Ala Lys Thr Glu Arg Pro Ser Glu Asn Ser His Pro Val Gln

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Val Gly Arg Ile Thr Leu Glu Asp Tyr Pro Asp His Gly Leu Leu Gln

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Val Gln Met Thr Asn Leu Gln Val Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Gln Cys

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Val Ile Tyr Gln His Pro Lys Glu Ser His Val Leu Phe Asn Pro Ile

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Cys Leu Val Val Thr Lys Gly Ser Ser Gly Thr Pro Gly Ser Ser Glu

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Asn Ser Thr Gln Asn Val Tyr Arg Thr Pro Ser Thr Thr Ala Lys Ala

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Leu Gly Pro Arg Tyr Thr Ser Pro Arg Thr Val Thr Gln Ala Pro Pro

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Glu Ser Thr Val Val Val Ser Thr Pro Gly Ser Glu Ile Asn Leu Thr

180 185 190

Asn Val Thr Asp Ile Ile Arg Val Pro Val Phe Asn Ile Val Ile Ile

195 200 205

Val Ala Gly Gly Phe Leu Ser Lys Ser Leu Val Phe Ser Val Leu Phe

210 215 220

Ala Val Thr Leu Arg Ser Phe Gly Pro

225 230

<210> 18

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于结晶化的表达构建体

<400> 18

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Gly Arg Ile Arg Thr Lys Ser Ser Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Met Gly Ile Arg Arg Gln Phe Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

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Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

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Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215

<210> 19

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 用于结晶化的表达构建体

<400> 19

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Thr Phe

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Asp Tyr Ser Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro

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Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Asp

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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn

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Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.能够结合并阻断TREM-1的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体或片段在80 mg/mL的浓度下具有小于5 cP，优选小于4 cP的黏度。

2.抗体或其片段，其中SEQ ID NO: 3的CDR1和CDR3区中的一个或多个带负电残基被不带电氨基酸残基取代。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 3的变体，其中SEQ IDNO: 3的残基D1、D30、D33、D74、D98、E27、E97（“电荷补丁”突变）中的任何一个或多个被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。

4.根据权利要求3所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO 3的CDR1和CDR3区的E27和E97中的至少一个或两者被不带电氨基酸残基取代，所述不带电氨基酸诸如选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸。

5.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO 3的E27被突变为谷氨酰胺且E97被选自甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。

6.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO 3的E97被突变为谷氨酰胺且E27被选自甘氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。

7.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO: 3的E27和E97被突变为谷氨酰胺。

8.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO 3的E27保持未突变而E97被突变为选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸，更优选突变为选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸。

9.根据权利要求3或4所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO 3的残基E97保持未突变而E27被选自甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸的氨基酸取代，更优选被选自丝氨酸和谷氨酰胺的氨基酸取代。

10.抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 2的变体，其中SEQ ID NO: 2的残基Y32、R52、S55、S56、N57、A59、M102、I104和R106或SEQ. ID NO 3的F32、D33、Y34、Y53、R54、D98（“Fab-Fab相互作用”突变）中的任一个被另一种氨基酸取代，所述另一种氨基酸是诸如天然氨基酸，优选地是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸。

11.根据权利要求10所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO: 2的残基A59和N57中的至少一个被突变为氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。

12.根据权利要求10所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO: 2的残基A59保持未突变而N57被突变为另一种氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。

13.根据权利要求10所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO: 2的残基N57保持未突变而SEQ ID NO: 2的A59被突变为另一种氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。

14.根据权利要求10所述的抗体或其片段，其中SEQ ID NO: 2的A59和N57两者均被突变为另一种氨基酸残基诸如天然氨基酸，优选是选自以下的氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸，更优选丝氨酸或酪氨酸。

15.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其片段，其中：

i) SEQ ID NO：3的CDR1和CDR3区的至少一个带负电残基被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸且

16.根据前述权利要求中任一项所述的抗体或其片段，其中：

i) SEQ ID NO：3的E27和E97之一或两者被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸和酪氨酸；且

ii) SEQ ID NO：2的A59和N57之一或两者被突变为选自以下的氨基酸残基：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、精氨酸、色氨酸、组氨酸和酪氨酸；更优选丝氨酸或酪氨酸。

17.抗体或其片段，其包含SEQ ID NO: 3的变体，其中在SEQ ID NO: 3的位置32的苯丙氨酸被突变为选自以下氨基酸残基的氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸，优选地选自丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、缬氨酸和亮氨酸，更优选地其中SEQ ID NO: 3的F32被突变为丙氨酸或丝氨酸。

18.抗体或其片段，其包含SEQ ID NO：4至16中的任一者。