CN101580546A - 人源抗人干扰素α抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人源抗huIFN－α抗体，本发明通过基因工程手段和噬菌体表面呈现技术结合运用，从人全合成单链抗体库中筛选出抗人干扰素α(huIFN－α)的基因工程单克隆抗体，并获得其抗体基因，完成抗体蛋白的免疫活性和生物活性鉴定，为将来临床治疗系统性红斑狼疮提供新的特异性抗体药物。

Description

人源抗人干扰素α抗体及其应用
技术领域
本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，尤其是特异性针对系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)的治疗靶蛋白人干扰素α(huIFN-α)，具有中和狼疮病人血液中和huIFN-α升高引起的全身性疾病的治疗用基因工程抗体。
背景技术
利用抗体分子的阻断作用研发的抗体药物是近年来生物医药领域中发展起来的新生力量。据统计，自1984年第一个基因工程抗体人-鼠嵌合抗体OKT3诞生以来，目前经FDA批准上市的有约20种基因工程改造的抗体药物，另有150种正在进行临床研究阶段，预计到2008年，抗体药物收入将占到整个生物技术类产品收入的30％，所以它们在针对肿瘤、心血管、自身免疫性疾病等的治疗上有着极其广泛的应用前景。
回顾治疗性抗体的研究历程，早期的鼠源性抗体由于其相对于人类的异物性已经不适用于临床，所以制备人源性抗体(全人抗体)是目前治疗性抗体研发的主要策略。在人源性抗体研究领域，人源抗体制备技术主要有人源抗体库技术(天然、半合成和全合成)，转基因小鼠、人-人杂交瘤技术、人B细胞永生化技术等。利用噬菌体抗体展示库技术制备人源抗体库是其中主要的方法之一。采用噬菌体抗体库技术筛选抗体不必进行动物免疫，易于制备稀有抗原的抗体及筛选全人源性的高亲和力抗体。人源抗体库可进一步分为免疫库和非免疫库。在一些急性感染性疾病痊愈患者外周中如果存在高滴度的中和抗体，那么可以通过获得有效免疫的人抗体库，筛选获得所需要的抗体，这当然是最理想的。但对于癌症、自身免疫疾病和心血管疾病等的关键靶分子往往是由自身抗原组成，或者很难在体内诱导有效的免疫应答，或者其作用机理是和免疫阻断有关，所以非免疫抗体库在筛选针对与这些疾病相关的靶分子的治疗性抗体中具有更广泛的应用性。非免疫抗体库包括天然大容量抗体库和合成抗体库，它是一种不经过免疫就能获得针对某种抗原的基因工程抗体的技术。2000年Achim Knappik详细报道了构建人源全合成抗体库的方法，并构建了库容量为2×109的全合成抗体库。非免疫抗体库特别是合成抗体库技术在筛选治疗性抗体药物方面显示了良好的前景。
系统性红斑狼疮(SLE)是一种以产生核抗体为特征，并形成免疫复合物沉积于组织，激活补体，造成组织损伤的一种多系统受累的疾病。SLE病人的发病特点是复发与缓解交替出现。其发病机制目前仍不是很清楚。很久以来人们就发现SLE患者的血清中，I型干扰素的水平明显升高，而且升高的程度与病情的进程具有很强的关联性；而稳定期的SLE病人或SLE易感者，在病毒感染后可能会复发或发生SLE，这一现象提示可能与病毒诱导大量IFN-α的产生有关。在动物实验中，当未发病的NZB/W子一代小鼠中被注射IFN-α后，则可以迅速导致这些小鼠产生严重的类似于SLE的病理特征，由此直接证实了IFN-α在实验性SLE发病中的作用。由于IFN-α本身具有多种免疫调节作用，所以SLE患者(特别是活动期患者)外周中高水平的IFN-α可能通过作用于多种免疫细胞，如T细胞、B细胞参与SLE发病中的多种临床表现。虽然目前对于SLE患者外周中高水平IFN-α产生的确切机制尚不明确，但是IFN-α和SLE临床的密切关系使其成为SLE临床治疗中重要的靶点分子，通过设计分子阻断IFN-α和受体结合，有望起到缓解和治疗SLE的目的。
利用抗体库技术研究开发抗huIFN-α的基因工程治疗性抗体是获得治疗系统性红斑狼疮的有效的抗体药物有效途径。目前，国际上有一例通过对鼠源抗huIFN-α抗体进行人源化改造，目的是得到治疗胰岛素依赖的糖尿病(insμlin dependent diabetes mellitus，IDDM)和SLE的抗体药物的报道(Anan Chuntharapai，Jadine Lai，Xiaojian Huang et a1.Characterization and humanization of a monoclonal antibody that neutralizes human leukocyteinterferon：a candidate therapeutic for IDDM and SLE.CYTOKINE.2001.15：250-260)。但鼠源抗体的人源化改造尚不能完全消除宿主产生抗抗体引起的过敏反应。美国的Medarex公司采用转基因鼠技术，将人的抗体基因转入小鼠中，这种技术与单克隆抗体技术结合，得到了大量全人源的单克隆抗体，其中也包括针对huIFN-α的全人源的单克隆抗体(欧洲专利号EP1781705，美国专利号：20070014724)，得到可以治疗自身免疫疾病(如SLE)和免疫排斥反应的药物。目前Medarex公司开发的其中一株全人源的单克隆已经进入了二期临床试验。以转基因鼠技术为平台筛选人源单克隆抗体，可以有效得到治疗用的人源单抗，绕过了对鼠源抗体进行人源化的技术瓶颈，加快了治疗用单抗的研发效率。但是获得整合了人抗体基因的转基因鼠从技术上讲难度较大，相比较而言，从全合成抗体库中得到的人源抗huIFN-α1b抗体，技术难度相对较低，获得抗体的时间短，而且获得的人源抗huIFN-α1b的单抗，也能显著减少过敏反应，增加抗体稳定性和生物学活性，也将成为有效治疗系统性红斑狼疮的抗体药物。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种人源抗人干扰素α抗体及其活性片段。
本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的基因。
本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备治疗干扰素过量引起的疾病的药物中的应用。
本发明运用噬菌体表面呈现技术，从已构建的全合成人源单链抗体库中，通过多轮的生物淘洗(bio-panning)，筛选获得特异性抗人干扰素α(huIFN-α)的单链基因工程抗体(single chain variable fragment，scFv)。筛选获得的scFv抗体包括9株scFv抗体，分别命名为AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3、AIFNa1scFv4、AIFNa1scFv5、AIFNa1scFv6、AIFNa1scFv7、AIFNa1scFv8、AIFNa1scFv9。
这9株重组抗体是由存在于抗体轻链和重链基因可变区中的高变区(CDRs)的特异性基因序列决定的，并在原核细胞中获得有效表达的特异性结合人干扰素α(huIFN-α)的功能性抗体。它们特异性识别人干扰素α1b(huIFN-α1b)抗原，其中有3株针对人干扰素huIFN-α1b，与huIFN-α1b具有明显的免疫杂交反应(Western Blot，WB)和酶联免疫(ELISA)反应，具有阻断huIFN-α1b与受体结合的中和活性功能。
AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3、AIFNa1scFv4、AIFNa1scFv5、AIFNa1scFv6、AIFNa1scFv7、AIFNa1scFv8、AIFNa1scFv9特异性的轻链和重链可变区基因来源于人源全合成抗体基因库的特异性富集筛选。其轻链和重链可变区相应的三个CDR区序列组合及其CDR区之间框架区序列组成了每个抗体可变区序列特征，AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3、AIFNa1scFv4、AIFNa1scFv5、AIFNa1scFv6、AIFNa1scFv7隶属于抗体重链家族VH3，抗体轻链家族VL1，AIFNa1scFv8、AIFNa1scFv9隶属于抗体重链家族VH3，抗体轻链家族VL3。抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列及其互补所决定，6个相应的CDR区氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，决定本发明中每个抗体的抗原结合特征和抗huIFN-α1b功能特征。决定每株中和抗体功能的抗体轻链和重链可变区氨基酸详细序列及其比较结果如图2所示，图中“-”符号表示与第一行抗体序列相同的氨基酸，阴影部分为CDR区。
在本发明中，抗体的轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如以下各组所示：SEQID No.1和2所示的氨基酸序列、SEQ ID No.3和4所示的氨基酸序列、SEQ ID No.5和6所示的氨基酸序列、SEQ ID No.7和8所示的氨基酸序列、SEQ ID No.9和10所示的氨基酸序列、SEQ ID No.11和12所示的氨基酸序列、SEQ ID No.13和14所示的氨基酸序列、SEQ ID No.15和16所示的氨基酸序列以及SEQ ID No.17和18所示的氨基酸序列。
应当理解，在不影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可根据序列表SEQ IDNo.1～18所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列，例如在非高变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明包括所述的抗体经过改造得到的各种衍生抗体。氨基酸的替换按如下各组进行：
组1：leucine(亮氨酸)，isoleucine(异亮氨酸)，norleucine(正亮氨酸)，valine(缬氨酸)，norvaline(正缬氨酸)，alanine(丙氨酸)，2-aminobutanoic acid(2-氨基丁酸)，methionine(蛋氨酸)，O-methyl serine(2-甲基丝氨酸)，t-butyl glycine(叔丁基甘氨酸)，t-butylalanine(叔丁基丙氨酸)，cyclohexylalanine(环己基丙氨酸)；组2：aspartic acid(天门冬氨酸)，glutamic acid(谷氨酸)，isoaspartic acid(异天门冬氨酸)，isoglutamic acid(异谷氨酸)，2-aminoadipic acid(2-氨基己二酸)，2-aminosuberic acid(2-氨基辛二酸)；
组3：asparagine(天门冬酰胺)，glutamine(谷氨酰胺)；
组4：lysine(赖氨酸)，arginine(精氨酸)，ornithine(乌氨酸)，2，4-diaminobutanoic acid(2，4-二氨基丁酸)，2，3-diaminopropionic acid(2，3-二氨基丙酸)；
组5：proline(脯氨酸)，3-hydroxyproline(3-羟基脯氨酸)，4-hydroxyproiine(4-羟基脯氨酸)；
组6：serine(丝氨酸)，threonine(苏氨酸)，homoserine(高丝氨酸)；
组7：phenylalanine(苯丙氨酸)，tyrosine(酪氨酸)
组内各氨基酸之间的替换并不改变抗体蛋白的活性，由这些改变得到衍生抗体。
此外，考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。例如本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。
可将上述编码单链抗体的基因克隆到表达载体中，进而转化宿主，通过诱导表达获得单链抗体。
此外，可将上述抗体的轻链编码基因和重链编码基因分别克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达抗干扰素α的全抗免疫球蛋白。
在本发明实施例中，将上述3株scFv抗体(AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3)的轻链和重链基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-K-CH3并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现了全抗体的分泌型表达，得到全抗体AIFNa1 IgG1、AIFNa1IgG2和AIFNa1 IgG3。
用ELISA和Western Blot对所获人源单抗的免疫学特性进行鉴定。结果表明三株人源单克隆抗体均特异性针对huIFN-α1b，而对其他结构相近的干扰素家族抗原如huIFN-α2b和huIFN-γ则没有反应性。Western Blotting实验结果也表明，3株抗体只特异性识别变性的huIFN-α1b蛋白。
采用体外细胞学实验测定了所获得的三株全抗体的免疫中和活性，结果显示其中一株具有拮抗基因工程来源的huIFN-α1b和系统性红斑狼疮患者外周血清介导的干扰素刺激基因的表达上调。
本发明在国际上首次获得9株抗huIFN-α1b的scFv噬菌体抗体，并在原核与真核系统中表达了3株scFv段抗体及其全抗体，完成了全抗体体外免疫调节功能的检测，这一结果的获得为系统性红斑狼疮的治疗带来了希望。利用上述获得的人源中和性抗huIFN-α1b基因工程抗体可变区基因以及上述每个抗体基因特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和huIFN-α1b免疫学活性的抗体产物，制成临床上用于治疗由系统性红斑狼疮病人体内外周huIFN-α1b过量引起的全身性疾病的特异性抗体药物，从而为治疗系统性红斑狼疮提供新的手段。基于上述抗体基因及其直接或间接的基因产物，可制成注射型抗体制剂用于人体内由干扰素过量引起的多种自身免疫疾病的治疗。
附图说明
图1显示的是phage-ELISA验证9株噬菌体单链抗体对huIFN-α1b的结合特异性；
图2显示的是本发明抗人IFN-α1b抗体可变区氨基酸序列的比较图；
图3显示的是ELISA检测5株单链抗体的结合特性；
图4显示的是用Western Blot检测原核表达的3株单链抗体的结合特性；
图5显示的是用Pull Down检测表达的株人的特异性结合情况图；
图6显示的是纯化后IgG的SDS-PAGE电泳图；
图7显示的是ELISA检测5株IgG全抗体的结合特性；
图8显示的是用Western Blot检测表达的3株人的特异性结合情况图；
图9显示的是IFN-α及抗huIFN-α1b抗体处理正常人PBMCs后IFN-α诱导基因ISG15的变化情况；
图10IFN-α及抗huIFN-α1b抗体处理正常人PBMCs后IFN-α诱导基因ITIF-1的变化情况；
图11显示的是加入SLE病人(IFN-α升高)及正常人血清并用抗huIFN-α1b抗体中和后正常人PBMCs中IFN-α诱导基因ISG15的变化情况。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1
本例运用噬菌体表面呈现技术，构建了人源全合成基因工程抗体文库。用纯化的huIFN-α1b对全合成噬菌体抗体库进行富集筛选，并在E.coli中进行分泌表达。通过ELISA、Western Blot及Pμll Down鉴定scFv抗体对huIFN-α1b特异性结合的功能活性，并进行序列测定。然后将阳性克隆的轻链和重链可变区基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-K-CH3转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。用ELISA和Western Blot对所获人源单抗的免疫学特性和免疫调节功能进行鉴定。
材料与方法
1.细胞、载体和抗原制备
人源全合成抗体库由军事医学科学院构建(杜威世，王双，孙志伟等.全合成人源性噬菌体抗体库的构建.军事医学科学院院刊，2006，30：319-322)，筛选抗体库的抗原为原核构建表达纯化的huIFN-α1b(浓度为1mg/ml)，菌株为XLI-Blue(美国Stratagene)；所用噬菌体为M13KO7(美国Invitrogene公司)。杆状病毒表达载体为pAC-K-CH3(德国PROGEN PR3003)(Liang，M.F.，Stefan，D.，Li，D.X.，Queitsch，I.，Li，W.，and Bautz，E.F.Bacμlovirusexpression cassette vectors for rapid production of complete human IgG from phagedisplayselected antibody fragments.Journal of Immunological Methods.247：119-130.)，昆虫细胞Sf9及293T细胞来自美国细胞培养中心(ATCC)。huIFN-α1b的构建与表达参考了文献(李武平，吕宏亮，侯云德等.干扰素-β1b的高效表达、纯化及抗病毒活性研究.病毒学报，2002年第03期)，并作了修改，具体方法如下：PCR扩增人干扰素α1b(huIFN-α1b)基因序列，测序鉴定后，将其克隆入原核表达载体pET30a(美国invitrogen)，通过将重组质粒转化大肠杆菌RossetaTM(DE3)进行蛋白表达。表达的huIFN-α1b经Ni金属螯合亲和层析纯化。
2.噬菌体抗体库的富集筛选
筛选抗原为huIFN-α1b，使用时用1×PBS(NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g溶于800ml ddH2O中，用HCl调pH至7.4，定容到1L)稀释至工作浓度，包被免疫管。富集筛选方法基本按文献进行(杜威世，王双，孙志伟等.全合成人源性噬菌体抗体库的构建.军事医学科学院院刊，2006，30：319-322)，具体如下：
用1×PBS稀释的纯化huIFN-α1b抗原(10μg/ml)溶液包被免疫管，每孔1ml，4℃过夜；次日用1×PBST(1×PBS，0.05％Tween20，pH7.2)洗去未吸附的抗原，用含4％BSA蛋白的1×PBS溶液37℃封闭1小时，弃封闭液；每孔加入90μl噬菌体抗体库(MOI为1012，各子库按库容量以1∶1混合投入筛选)，37℃孵育2小时，弃去孔中未结合的噬菌体，并用1.5ml的1×PBST水平震荡洗涤(450rpm)，共10遍，以充分去除未吸附的噬菌体；最后用1×PBS洗三遍，吸净孔中的液体；后每孔加入1ml Glycine-HCl(100mM，pH2.2)的洗脱液，室温震荡洗涤(600rpm)10分钟。加入适量的2M Tris-HCl(100mM，pH＝2.2)，以中和含噬菌体的洗脱液；将洗脱的噬菌体立即加入5ml新鲜制备的XLI-Blue菌液中(OD600＝0.7)，室温孵育15-20分钟；然后150rpm，37℃震荡培养1小时，立即取10μl涂布含CTG(100μg/ml氯霉素，40μg/ml安苄青霉素，40mM葡萄糖)的LB培养平皿用以滴定噬菌体；其余细菌根据噬菌体的产出量涂CTG培养平板，37℃细菌培养箱培养过夜。次日用涂布棒将平板上长出的细菌全部刮下，取部分刮下的细菌加入到100ml的CTG液体培养基中至OD600＝0.3，继续培养细菌至浓度达到OD600＝0.5，加入辅助噬菌体M13K07(滴度为1012/ml)200μl，37℃静置15-20min后，37℃150rpm振荡培养1小时，加入卡那霉素(终浓度50μg/ml)，37℃培养过夜。将培养过夜的细菌悬液6500rpm离心15min，收集细菌培养上清，将上清转入干净的三角烧瓶中，加入4％的PEG8000，3％的NaCl，充分溶解后冰浴30min以上。9000rpm离心20min，弃上清。沉淀用PBS溶解，冰浴15min，12000rpm离心5min，得到的上清即为第一轮富积得到的抗体库，将上清转入Eppendorf管中，加3％的BSA冻存备用。滴定噬菌体滴度后，进行下一轮筛选。如此反复筛选3次。挑取第三轮富集筛选得到的克隆，采用phage-ELISA对噬菌体抗体的结合活性进行鉴定，对鉴定得到的阳性克隆，测序获得抗体基因序列。
3.scFv段抗体的诱导表达与纯化
人源中和性抗huIFN-α1b基因工程scFv抗体可溶性表达产物的制备基本按文献进行(Timothy J.LaRocca，Laura I.Katona，David G.Thanassi et al.Bactericidal Action of aComplement-Independent Antibody against Relapsing Fever Borrelia Resides in Its VariableRegion.The Journal of Immunology，2008，180：6222-6228)，具体为：将带有阳性抗体轻、重链基因插入的阳性克隆扩增后按常规方法提取质粒DNA，并用5’端分别带有NcoI和XhoI的PCR引物扩增scFv抗体基因(上游引物scFv-pET22-L：CATGCCATGGCCGATATCGTTCTGAC，下游引物scFv-pET22-R：CCGCTCGAGGCTCGACACGGTCACCAGAG)，PCR片段回收后经NcoI和XhoI酶切，与相同双酶切的pET22b载体片段连接，获得重组单链抗体表达质粒，转化BL-21(DE3)感受态细胞，过夜培养后，挑取氨苄抗性的阳性单个菌落，接种2×YT细菌培养液扩大培养，PCR鉴定片段插入完整后，以1/100比例将阳性工程菌在新的2×YT细菌培养液中培养至OD600＝0.7时，加入20μM IPTG，20℃诱导表达过夜。收获细菌，离心后弃上清，在沉淀中加入原培养液1/10体积的PBS(0.02M pH7.4)重悬，反复冻融三次，4℃ 12000rpm离心30分钟，上清中含有诱导表达的scFv抗体，可用于进一步的免疫学特性鉴定。阴性对照为载体pET22b转化菌按同样方法制备的细菌裂解液。单链抗体的纯化采用Ni金属螯合亲和层析法，按试剂盒中的常规步骤进行。
4.人源抗huIFN-α1b单链抗体的免疫学特性检测
4.1phage-ELISA检测scFv噬菌体抗体的表达
用0.1M NaHCO3(pH9.6)的包被液稀释huIFN-α1b2μg/mL，取100μl加入聚氯乙烯96孔平底板中，4℃包被过夜；4％脱脂奶封闭，37℃孵育1h后，弃上清，加入表达的scFv噬菌体抗体，37℃孵育1h后，PBST洗涤三次，加入酶标抗M13二抗(美国Sigma，1∶4000稀释使用)，37℃孵育1h；PBST洗涤五次后，加入100L显色液(A+B)显色，最后加入2MH2SO4终止反应，酶标仪检测吸光度A(450)值。
4.2 Western Blot检测scFv单链抗体的分泌表达
单链抗体分泌表达上清经超滤浓缩后进行10％的SDS-PAGE电泳，对应的阴性对照为载体pET22b转化菌按同样方法制备的细菌超滤浓缩的细菌表达上清。采用半干法将聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白质转移到NC膜。转膜后对凝胶进行考马斯亮兰染色以检查蛋白质是否转移完全。将含标准分子量蛋白的泳道剪下，标注标准分子量参照蛋白位置。将NC膜在含5％脱脂奶粉的1×PBS中室温封闭2小时，1×PBST洗涤3次后与HPR标记的鼠抗His抗体(Sigma公司，1∶500使用)室温反应1小时。1×PBST洗涤3次后放入DAB底物显液色中显色，至棕色阳性条带出现，将NC膜置于双蒸水中终止反应，干燥后避光保存。
4.3 Western Blot检测scFv单链抗体的结合特异性
采用纯化的huIFN-α1b、huIFN-α2b和huIFN-γ为抗原用以Western Blotting的方法鉴定单链抗体的结合特异性。具体如下：将上述纯化的三种抗原(5μg)经SDS-PAGE电泳后，采用半干法转移到NC膜。转膜后对凝胶进行考马斯亮兰染色以检查蛋白质是否转移完全。将标准分子量蛋白泳道剪下，标出分子量标准的参照蛋白位置。对NC膜采用含5％脱脂奶室的1×PBS温温封闭2小时。将含有AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3表达产物原液的一抗工作液与封闭的NC膜在室温孵育2小时。1×PBST洗涤3次后与HPR标记的抗His抗体(Sigma公司，1∶1000使用)室温反应1小时，1×TBST洗涤3次后，放入DAB底物显液色中，至棕色阳性条带出现，将NC膜置于双蒸水中适时终止反应，干燥后避光保存。
4.4 Pμll Down检测scFv单链抗体的结合特异性
将50μg/ml单链抗体与100μg/ml huIFN-α1b于4℃孵育1小时，后加入4μg的Ni-resin(结合蛋白的能力为8μg/μl)继续孵育1小时，3000rpm离心5min，弃上清，沉淀以1×PBS洗涤，3000rpm离心5min收集沉淀，如此洗涤3-5遍后，用20μl 1×PBS重悬沉淀，并加入蛋白上样缓冲液煮沸处理5分钟，并进行15％SDS-PAGE电泳，然后常规的考马氏蓝染色和脱色后检测。
5.人源scFv单链抗体可变区基因的核酸序列分析
用Qiagen Miniprep Kit(德国QIAGEN)制备质粒DNA进行核酸序列分析。测序引物为5’-AGCCCACCTCAACGCAATT-3’。测序结果和Internet V-Base基因库中抗体基因序列进行序列比对。
6.全抗体重组表达质粒的构建
将获得的scFv抗体的重链(SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.34、SEQ ID NO.36)以引物(VH3L：gtaactcgagAGCGGTGGCGGTCTGGTG，VHR：gaagctagcGCTCGACACGGTCACCAGAGTG)PCR扩增后用XhoI/NheI双酶切，连接入pAC-K-CH3载体(德国PROGEN PR3003)，再将轻链(SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.33、SEQ ID NO.35)以引物(vy31：gtaagagctcACCCAGCCGCCGAGCGTG，VY1L：gtaagagctcACTCAACCTCCGTCTGTTTCTGG，VY3R：CTTGAAGCTTGGTGCCACCGCCAAAC)PCR扩增后经SacI/HindIII位点连接进去，构建成全抗体表达载体。
7.转染和扩毒
采用美国Pharmogen公司的BacμloGold共转染试剂盒进行转染。操作方法略述如下：将5μg的重组质粒DNA与0.5μg的BacμloGold线性DNA混合后，并加入转染试剂转染生长密度为50％的Sf9细胞，27℃培养4天后，收集含有重组病毒的毒种细胞培养上清进行病毒滴定和扩增。具体操作见Bacμlovirus expression vector system手册。
8.全抗体IgG分泌表达和纯化
将重组病毒感染生长密度70％左右的Sf9细胞，27℃吸附1h.改用SF-900II无血清培养液，27℃培养3～5天后收集上清。并采用Protein-A亲和层析法(Amersham，美国)直接纯化诱导表达上清(Harlow E，Lane D.“Antibodies：A Laboratory Manual”.Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1988.)。
9.抗huIFN-α1b人源IgG抗体的免疫学特性检测
9.1昆虫细胞表达IgG抗体的免疫荧光(IFA)检测
利用已获得的抗人huIFN-α1b的IgG全抗体基因的重组质粒，转染Sf9细胞，经过3次扩增获得重组杆状病毒，感染Sf9细胞，27℃培养约4-5天，收获细胞，1×PBS洗涤一次，滴加至载玻片上，吹干，在丙酮中固定15min并干燥，制成病毒抗原片。滴加FITC标记的抗人IgG-Fc抗体溶液(美国Sigma，1∶80)，37℃温育30min后，1×PBS冲洗，晾干，显微镜下观察Sf9细胞的荧光表达率和表达强度，阴性对照细胞为转染空载体的sf9细胞。
9.2IgG全抗体特异性结合huIFN-α1b的ELISA检测
用0.1M NaHCO3(pH9.6)的包被液稀释huIFN-α1b、IFN-α2b、IFN-γ、BSA至2μg/ml，取100μl加入聚氯乙烯96孔平底板中，4℃包被过夜；4％脱脂奶封闭，37℃孵育1h后，弃上清，加入sf9细胞表达的全抗体IgG上清，37℃孵育1h后，PBST洗涤三次，加入HRP标记的抗IgG-Fc二抗(美国Sigma，1∶1000稀释使用)，37℃孵育1h；PBST洗涤五次后，加入100L底物显色液(A+B)显色，最后加入2MH2SO4终止反应，酶标仪检测吸光度(A＝450)值。
9.3 IgG全抗体特异性结合huIFN-α1b的Western Blotting检测
将纯化的huIFN-α1b抗原经SDS-PAGE电泳后，半干法转移到NC膜。对NC膜在含5％脱脂奶粉的1×PBS室温封闭2小时后，分别置于含AIFNa1IgG1、AIFNa1IgG2和AIFNa1IgG3表达产物的一抗工作液中室温孵育2小时，1×PBST洗涤3次，并于HPR标记的抗IgG-Fc二抗(Sigma公司，1∶1000使用)室温反应1小时。1×PBST洗涤3次后，置于DAB底物显液色中，至棕色阳性条带出现适时终止反应，避光保存。
10.抗huIFN-α1b人源IgG抗体免疫中和活性的检测
10.1抗huIFN-α1b人源IgG抗体中和活性检测
收集正常人新鲜外周血标本，密度梯度离心法分离获得外周血单个核细胞(PBMCs)，将获得的PBMCs以1×105/孔的细胞量种入96孔培养板，分别加入合成的人IFN-α(100ng/mL)和不同浓度的抗huIFN-α1b抗体(0μg/mL、3μg/mL、12μg/mL)，37℃和5％CO2条件下孵育4小时，后收集细胞，检测上述不同培养条件下IFN-α诱导基因(ISG15和IFIT-1)的表达差异来评估抗huIFN-α1b抗体的免疫中和活性。收集的细胞采用TRIzolTM试剂(Invitrogen公司)抽提RNA，以随机引物进行逆转录(ReverAidTM M-MμlV逆转录酶，Fermentas公司)获得cDNA，并采用实时定量PCR(SYBR premix Ex TaqTM，Takara公司)技术检测样本中ISG15和ITIF-1基因的表达。ISG15和IFIT-1的引物序列分别为：ISG15 forward：5’-GAG AGG CAG CGAACT CAT CT-3’；Reverse：5’-AGC TCT GAC ACCGAC ATG G-3’；IFIT-1forward：5’-GCA GAA CGG CTG CCT AAT TT-3’；Reverse：5’-TCAGGC ATT TCA TCG TCA TC-3’。PCR反应的内参基因的引物序列如下：GAPDH(200nMforward)5’-CTGGAACGGTGAAGGTGACA  -3’，(200nM reverse)5’-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3’。经7500Real-time PCR系统(Applied Biosystem)进行40个循环后计算得到Ct值，以2-ΔCt值代表目的基因的相对表达量(-ACt＝-(Ct目的基因-Ct内参基因))。对样品获得的数据进行平均值和SD值的统计分析。
10.2 抗huIFN-α1b人源IgG抗体中和SLE病人血清IFN-α的效应检测
为了评估抗huIFN-α1b抗体是否具有临床应用的价值，在上述中和活性试验的基础上，本实验组又利用含升高的IFN-α的SLE病人血清及正常人对照血清(以1/10体积比加入培养基)处理正常人PBMCs，并加入抗huIFN-α1b抗体(24μg/mL)对血清中IFN-α的作用进行中和，37℃和5％CO2条件下孵育4小时后，收集细胞检测IFN-α诱导基因(ISG15)的表达差异来评估抗huIFN-α1b抗体对血清中IFN-α的免疫中和活性。方法同上，即收集的细胞采用TRIzolTM试剂(Invitrogen公司)抽提RNA，以随机引物进行逆转录(ReverAidTM M-MμlV逆转录酶，Fermentas公司)获得cDNA，并采用实时定量PCR(SYBRpremix Ex TaqTM，Takara公司)技术检测样本中ISG15基因的表达。所用ISG15及内参基因引物序列同上。经7500Real-time PCR系统(Applied Biosystem)进行40个循环后得到Ct值，以2-ΔCt值代表目的基因的相对表达量(-ΔCt＝-(Ct目的基因-Ct内参基因))。对样品获得的数据进行平均值的统计分析。
11.非高变区突变后的抗体对huIFN-α1b抗性的研究
基于AIFNa1IgG1轻链可变区氨基酸序列，将SEQ ID No.1所示氨基酸序列的第(44)位的(丙氨酸，A)替换为(缬氨酸，V)，将其重链可变区的第(40)位的(丙氨酸，A)替换为(缬氨酸，V)。分别合成AIFNa1IgG1的轻链编码核酸序列(在相应位置将密码子GCA替换为GUU或GUG或GUA或GUC)以及重链编码核酸序列(在相应位置将密码子GCA替换为GUU或GUG或GUA或GUC)。按照上述6～10的方法，将轻链基因和重链基因克隆到pAC-K-CH3中，并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达，并对该突变体进行免疫学检测。
结果
1.人源抗人huIFN-α1b抗体库的筛选
以纯化的huIFN-α1b(10μg/ml)为抗原对全合成抗体库进行筛选，经3轮筛选后随机挑取1500个克隆扩增培养收集上清。以纯化的huIFN-α1b抗原(2μg/ml)包被96孔板，加入待测样品上清，通过HRP标记的抗人M13二抗(sigma公司，1∶4000稀释使用)检测待测样品中抗体表达阳性率。结果显示，经三轮筛选后，共获得300株人源scFv表达阳性克隆。300株人源scFv表达阳性克隆中，通过phage-ELISA，采用纯化的huIFN-α1b、huIFN-α2b和huIFN-γ抗原对抗体的结合特异性进行复筛检测，获得100个与huIFN-α1b特异性结合的克隆。
2.人源抗人IFN抗体scFv抗体的序列分析
用DNASTAR、Mega3.0序列分析软件进行分析处理，比较Internet V-Base基因库中的IgG序列，上述100株人源抗huIFN-α1b基因工程抗体中，对86株抗体的序列进行了测序，86个克隆分别属于9个不同的抗体序列，共发现9株带有不同的抗体轻重链可变区序列及其组合的抗体，其重链可变区主要分类在IgG VH3家族，其轻链可变区主要分类在IgG VL1和VL3家族。图2为9株人源抗huIFN-α1b基因工程抗体的可变区基因的氨基酸序列及其相互比较，图中以第一行抗体序列为比较的标准序列，“-”符号表示与第一行抗体序列相同的氨基酸，阴影部分为CDR区。具体的，人源单链抗体AIFNa1scFv1的蛋白序列如SEQ ID NO.1和2，单链抗体AIFNa1scFv2的蛋白序列如SEQ ID NO.3和4，单链抗体AIFNa1scFv3的蛋白序列如SEQ ID NO.5和6，单链抗体AIFNa1scFv4的蛋白序列如SEQ ID NO.7和8，单链抗体AIFNa1scFv5的蛋白序列如SEQ ID NO.9和10，单链抗体AIFNa1scFv6的蛋白序列如SEQ IDNO.11和12，单链抗体AIFNa1scFv7的蛋白序列如SEQ ID NO.13和14，单链抗体AIFNa1scFv8的蛋白序列如SEQ ID NO.15和16，单链抗体AIFNa1scFv9的蛋白序列如SEQID NO.17和18。
3.人源抗huIFN-α1b噬菌体单链抗体的结合特性
为了鉴定这9株不同的噬菌体抗体能否稳定结合huIFN-α1b，我们采用phage-ELISA对9株抗体的结合特异性和稳定性进行多次验证，phage-ELISA实验中采用了3种抗原，分别为huIFN-α1b、huIFN-α2b和huIFN-γ，ELISA测定结果显示，其中有5株抗体与huIFN-α1b结合的ELISA值明显高于huIFN-α2b和huIFN-γ，有两倍以上差异，结果表明，最后获得5株抗体(AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3、AIFNa1scFv8、AIFNa1scFv9)能够稳定而且特异性结合huIFN-α1b，而与无关抗原huIFN-α2b和huIFN-γ无交叉反应，结果见图1。
4.人源抗huIFN-α1b单链抗体的结合特异性
为了进一步证实所获得的5株重组scFv抗体是特异性的针对huIFN-α1b，本发明进一步通过ELISA、Western Blot和Pull Down鉴定原核分泌表达的scFv抗体的功能活性。ELISA结果表明细菌中分泌表达的单链抗体AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3与huIFN-α1b反应，但与重组蛋白huIFN-α2b、huIFN-γ不反应，如图3所示。Western Blotting结果表明AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3可分别与变性的huIFN-α1b反应，但与重组蛋白huIFN-α2b、huIFN-γ不反应，如图4所示。这提示AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3所针对的huIFN-α1b的抗原决定簇为线性抗原决定簇。Pull Down结果表明表明AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3可与huIFN-α1b反应形成复合物，如图5所示。
5.全抗体IgG表达和纯化
将3株经过结合特异性验证的scFv抗体(AIFNa1scFv1、AIFNa1scFv2、AIFNa1scFv3)的轻链和重链基因，分别克隆入全抗体表达载体pAC-K-CH3转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达。采用Amersham公司的Protein-A亲和层析柱直接纯化表达上清，通过SDS-PAGE检验全抗体IgG的表达及纯化情况，结果证实得到较纯蛋白，可清晰观察到解链后的抗体轻、重链，分别位于约28KD、55KD处，通过非变性的SDS-PAGE分析，得到未解链的抗体蛋白，位于150KD处左右，如图6所示。
6.人源抗huIFN-α1b全抗体的结合特异性
为了证实所获得的重组IgG抗体(AIFNa1IgG1、AIFNa1IgG2、AIFNa1IgG3)是特异性的针对huIFN-α1b，本发明进一步通过ELISA和Western Blot鉴定全抗体IgG的功能活性。ELISA结果与验证scFv抗体功能活性相一致，纯化的全抗体AIFNalIgG1、AIFNa1IgG2、AIFNa1IgG3与huIFN-α1b反应，但与重组蛋白huIFN-α2b、huIFN-γ和BSA不反应，如图7所示。Western Blotting结果表明AIFNa1IgG1、AIFNa1IgG2、AIFNa1IgG3可分别与变性的IFN-α1b反应。这提示AIFNa1IgG1、AIFNa1IgG2、AIFNa1IgG3所针对的IFN-α1b的抗原决定簇为线性抗原决定簇。如图8所示。
7.人源抗huIFN-α1b全抗体的免疫中和活性
为了证实合成的人源抗huIFN-α1b抗体是否具有免疫中和活性及对其中和活性进行初步的评估，本发明将获得的的抗体(AIFNa1IgG1、AIFNa1IgG2、AIFNa1IgG3)作用于IFN-α处理过的正常人PBMCs，发现正常人PBMCs在IFN-α的作用下，IFN-α诱导基因(ISG15和IFIT-1)的表达明显升高，但是加入抗huIFN-α1b抗体后这两个基因的表达都被明显的抑制，并且呈现比较好的剂量依赖性，即随着加入的抗huIFN-α1b抗体的增加，抑制IFN-α诱导基因表达的作用就越明显。由此说明本次制备的人源抗huIFN-α1b抗体具有良好的中和活性。其对ISG15和IFIT-1的作用分别如图9和图10所示。抗huIFN-α1b抗体对血清中IFN-α的中和作用也很明显。在病人血清IFN-α的作用下，IFN-α诱导基因ISG15的表达明显升高，在抗huIFN-α1b抗体的作用下则可降低到正常血清处理或无刺激培养条件下的基因表达水平，如图11所示。提示本发明具有良好的治疗性应用前景。
8、非高变区突变后的抗体对huIFN-α1b抗性影响
按照上述6～10的方法，将基于AIFNa1IgG1修改后的轻链基因和重链基因克隆到pAC-K-CH3中，并转染昆虫Sf9细胞，利用杆状病毒/昆虫细胞系统实现全抗体的分泌型表达，得到突变体AIFNa1IgG1’。对该突变体进行免疫学检测，ELISA结果表明纯化的全抗体AIFNa1IgG1’与huIFN-α1b反应，但与重组蛋白huIFN-α2b和huIFN-γ不反应，且亲和力和特异性与AIFNa1IgG1’基本相同。Western Blotting结果表明AIFNa1IgG1’可与变性的IFN-α1b反应。
序列表
<110>中国疾病预防控制中心病毒病所
<120>人源抗人干扰素α抗体及其应用
<130>KHP09112369.1
<160>50
<170>PatentIn version 3.5
SEQ ID NO.1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Asp Asn Asn Glu
Asn Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Tyr Ile Asp Phe Gly Asp His Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Arg Asp Asp Ser Asp
Ser Leu Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.4
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Thr Pro Cys Thr
Cys Arg Gln Pro Ala Cys Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
Gly Ser Asp Phe Gly Asp Ser Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.5
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Arg Asp Ser Gly Val
Gly Ala Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg His Trp Trp Ala Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.7
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Asp Asn Asn Glu
Asn Glu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Tyr Ile Asp Phe Gly Asp His Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Asp Lys Glu Glu
Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Asn Val Tyr Asn Ile Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.1l
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Lys Asp Ala Ser Leu
Leu Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.12
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Gln Thr Tyr Gly Arg Met Asp Tyr Trp Gly Gln Ala Leu Trp
SEQ ID NO.13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Asp Asn Asp Asp
Phe Ser Phe Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Gln His Tyr Ser Val Phe Ala Ala Trp Gly Gln Gly Thr Leu
Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.15
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Arg Asp Gly Ser Leu Phe Ala
Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.16
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Trp Arg Arg Phe Ile Arg Gly Val Asp Pro Trp Gly Gln Gly
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.17
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Lys Ser Ala Ala Leu Leu Arg
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
SEQ ID NO.18
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Arg Leu Trp Arg Ser Lys Arg Trp Val Arg Ser Leu Gly Gln Gly
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
SEQ ID NO.19
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt    60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg    120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg    180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa    240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag gtgcgggata acaacgagaa tgagtgggtg    300
tttggcggtg gcacc                                                     315
SEQ ID NO.20
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgttata ttgattttgg ggatcatatg    300
gatttctggg gtcagggcac tctggtgacc gtgtcgagc                           339
SEQ ID NO.21
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt    60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg    120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg    180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa    240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag tcgcgggatg acagcgattc gttgcttgtg    300
tttggcggtg gcacc                                                     315
SEQ ID NO.22
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa acaccctgta cctgcagatg acagcctgcg    240
tgcggagata ccgcggtgta ttattgcgca cgtggttctg attttgggga ttctttcgct    300
ttctggggtc agggcactct ggtgaccgtg tcgagc                              336
SEQ ID NO.23
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt    60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg    120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg    180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa    240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag gcgcgggata gcggcgttgg ggcgtttgtg    300
tttggcggtg gcacc                                                     315
SEQ ID NO.24
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgtcatt ggtgggcggc gatggattac    300
tggggtcagg gcactctggt gaccgtgtcg agc                                 333
SEQ ID NO.25
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt    60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg    120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg    180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa    240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag gtgcgggata acaacgagaa tgagtgggtg    300
tttggcggtg gcacc                                                     315
SEQ ID NO.26
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgttata ttgattttgg ggatcatatg    300
gatttctggg gtcagggcac tctggtgacc gtgtcgagc                           339
SEQ ID NO.27
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt    60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg    120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg    180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa    240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag gtgagggata aggaggagtt tgtgtttggc    300
ggtggcacc                                                            309
SEQ ID NO.28
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgtaatg tgtataatat tttcgatgcc    300
tggggtcagg gcactctggt gaccgtgtcg agc                                 333
SEQ ID NO.29
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt    60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg    120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg    180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa    240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag gcgaaggatg ccagcttgct gtttgtgttt    300
ggcggtggca cc                                                        312
SEQ ID NO.30
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgtcaga cttatgggcg gatggattac    300
tggggtcagg cactctggtg accgtgtcga gc                                  332
SEQ ID NO.31
gatatcgttc tgactcaacc tccgtctgtt tctggtgcac cgggtcaacg tgttactatt    60
agctgctctg gcagctctag caatattggt agtaactatg ttagctggta tcagcaactg    120
ccgggtactg caccgaaact gctgatttat gataataacc agcgcccctc aggtgttccg    180
gatcgtttta gtggcagcaa aagcggtacc agcgctagtc tggcaattac tggtctgcaa    240
agcgaggatg aggcggacta ttactgccag gtgcgggata acgacgattt ttcttttgtg    300
tttggcggtg gcacc                                                     315
SEQ ID NO.32
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgtcagc attatagtgt gttcgctgcc    300
tggggtcaag gcactctggt gaccgtgtcg agc                                 333
SEQ ID NO.33
agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc    60
acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt    120
caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc    180
tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag    240
gatgaggcgg actattactg ccaggtgcgg gatggcagct tgtttgctct ggtgcttggc    300
ggtggcacc                                                            309
SEQ ID NO.34
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgttgga ggcggtttat taggggggtg    300
gatccctggg gtcagggcac tctggtgacc gtgtcgagc                           339
SEQ ID NO.35
agctacgaac tgacccagcc gccgagcgtg tcggtggcgc cgggtcagac cgcgcgtatc    60
acctgctcgg gcgatgcgct gggcgataaa tacgcgagct ggtatcagca gaaaccgggt    120
caggcaccgg tgctggtgat ttacgaagat tctaaacgcc cgtctggcat cccggaacgc    180
tttagcggct cgaattcggg caacaccgcg accctgacca ttagcggcac ccaggcggag    240
gatgaggcgg actattactg ccagtcgaag tctgccgcct tgctgagggt gtttggcggt    300
ggcacc                                                               306
SEQ ID NO.36
agcggtggcg gtctggtgca gccgggtggc agcctgcgtc tgagctgcgc agcgagcggc    60
ttcaccttta gcagctacgc gatgagctgg gtgcgccagg caccgggtaa aggtctggaa    120
tgggtgagcg cgattagcgg tagcggcggc agcacctact atgcggatag cgtgaaaggc    180
cgttttacca tctcgcgtga taactcgaaa aacaccctgt acctgcagat gaacagcctg    240
cgtgcggaag ataccgcggt gtattattgc gcacgtttgt ggaggtctaa gcggtgggtt    300
cgatccctgg ggcaaggcac tctggtgacc gtgtcgagc                           339
SEQ ID NO.37
catgccatgg ccgatatcgt tctgac                                         26
SEQ ID NO.38
ccgctcgagg ctcgacacgg tcaccagag                                      29
SEQ ID NO.39
agcccacctc aacgcaatt                                                 19
SEQ ID NO.40
gtaactcgag agcggtggcg gtctggtg                                       28
SEQ ID NO.41
gaagctagcg ctcgacacgg tcaccagagt g                                   31
SEQ ID NO.42
gtaagagctc acccagccgc cgagcgtg                                       28
SEQ ID NO.43
gtaagagctc actcaacctc cgtctgtttc tgg                                 33
SEQ ID NO.44
cttgaagctt ggtgccaccg ccaaac     26
SEQ ID NO.45
gagaggcagc gaactcatct            20
SEQ ID NO.46
agctctgaca ccgacatgg             19
SEQ ID NO.47
gcagaacggc tgcctaattt            20
SEQ ID NO.48
tcaggcattt catcgtcatc            20
SEQ ID NO.49
ctggaacggt gaaggtgaca            20
SEQ ID NO.50
aagggacttc ctgtaacaat gca        23

Claims (10)

1、人源抗huIFN-α抗体，其轻链CDR1、CDR2和CDR3以及重链CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列选自如下各组中的一组：
L-CDR1           L-CDR2   L-CDR3      H-CDR1 H-CDR2               H-CDR3
1)SGSSSNIGSNYVS  DNNQRPS  QVRDNNENEW  SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    YIDFGDHMDF
2)SGSSSNIGSNYVS  DNNQRPS  QSRDDSDSLL  SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    GSDFGDSFAF
3)SGSSSNIGSNYVS  DNNQRPS  QARDSGVGAF  SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    HWWAAMDY
4)SGSSSNIGSNYVS  DNNQRPS  QVRDKEEF    SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    NVYNIFDA
5)SGSSSNIGSNYVS  DNNQRPS  QAKDASLLF   SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    QTYGRMDY
6)SGSSSNIGSNYVS  DNNQRPS  QVRDNDDFSF  SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    QHYSVFAA
7)SGSSSNIGSNYVS  DNNQRPS  SSKEGGAKA   SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    TRWMIFDD
8)SGDALGDKYAS    EDSKRPS  QVRDGSLFAL  SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    WRRFIRGVDP
9)SGDALGDKYAS    EDSKRPS  QSKSAALLR   SYAMS  AISGSGGSTYYADSVKG    LWRSKRWVRS。
2、如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其轻链可变区氨基酸序列和重链可变区氨基酸序列选自以下各组中的一组：SEQ ID No.1和2所示的氨基酸序列、SEQ ID No.3和4所示的氨基酸序列、SEQ ID No.5和6所示的氨基酸序列、SEQ ID No.7和8所示的氨基酸序列、SEQ ID No.9和10所示的氨基酸序列、SEQID No.11和12所示的氨基酸序列、SEQ ID No.13和14所示的氨基酸序列、SEQID No.15和16所示的氨基酸序列以及SEQ ID No.17和18所示的氨基酸序列。
3、如权利要求2所述的抗体，其为单链抗体或全抗体免疫球蛋白IgG。
4、权利要求1～3任一项所述的抗体经过改造得到的衍生抗体，所述改造包括氨基酸的缺失、替换和/或插入，并且不改变抗体的活性，所述氨基酸的替换按如下各组进行：
组1：亮氨酸，异亮氨酸，正亮氨酸，缬氨酸，正缬氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，蛋氨酸，2-甲基丝氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，环己基丙氨酸；
组2：天门冬氨酸，谷氨酸，异天门冬氨酸，异谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸；
组3：天门冬酰胺，谷氨酰胺；
组4：赖氨酸，精氨酸，乌氨酸，2，4-二氨基丁酸，2，3-二氨基丙酸；
组5：脯氨酸，3-羟基脯氨酸，4-羟基脯氨酸；
组6：丝氨酸，苏氨酸，高丝氨酸；
组7：苯丙氨酸，酪氨酸，
组内各氨基酸之间的替换并不改变抗体蛋白的活性，由这些改变得到衍生抗体。
5、编码权利要求1～4任一项所述抗体的基因。
6、如权利要求5所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区的核苷酸序列和编码重链可变区的核苷酸序列选自以下各组中的一组：SEQ ID No.19和SEQID No.20所示的核苷酸序列、SEQ ID No.21和SEQ ID No.22所示的核苷酸序列、SEQ ID No.23和SEQ ID No.24所示的核苷酸序列、SEQ ID No.25和SEQ IDNo.26所示的核苷酸序列、SEQ ID No.27和SEQ ID No.28所示的核苷酸序列、SEQ ID No.29和SEQ ID No.30所示的核苷酸序列、SEQ ID No.31和SEQ IDNo.32所示的核苷酸序列、SEQ ID No.33和SEQ ID No.34所示的核苷酸序列、SEQ ID No.35和SEQ ID No.36所示的核苷酸序列。
7、含有权利要求5或6所述基因的表达载体。
8、含有权利要求7所述表达载体的宿主。
9、权利要求1～4任一项所述抗体在制备治疗huIFN-α过量引起的疾病的药物中的应用，尤其是系统性红斑狼疮。
10、含有权利要求1～4任一项所述抗体的药物或检测试剂。
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