CN104292331B - 人源抗人α干扰素抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人源抗人α干扰素抗体及其编码基因与应用。通过基因工程手段和噬菌体表面展示技术结合运用，从全合成单链人抗体库中筛选出抗人IFNα多个亚型的基因工程单链抗体，并获得其抗体的可变区基因序列，在此基础上构建全人单克隆Fab及IgG抗体重组载体，经哺乳动物细胞表达、纯化获得高纯度抗体分子。本发明获得抗体的Fab与人IFNα‑2结合的亲和力不大于0.5nM，与IFNα‑1的亲和力不大于5nM。本发明抗体能够在细胞水平有效阻断IFNα‑2等多个亚型IFNα的生物学活性，本发明为治疗干扰素相关疾病，如系统性红斑狼疮等自身免疫病提供了一种特异性抗体药物。

Description

人源抗人α干扰素抗体及其应用

技术领域

本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是特异性针对多种亚型人α干扰素(interferon alpha，IFNα)，通过阻断IFNα与IFNα受体的结合，抑制IFNα的生物学功能，从而达到治疗系统性红斑狼疮等与IFNα相关的自身免疫性疾病的治疗用基因工程抗体。

背景技术

干扰素(interferon，IFN)是由病毒或其他种类的干扰素诱导剂，刺激网状内皮系统、巨噬细胞、淋巴细胞以及体细胞所产生的一种糖蛋白。干扰素是一种广谱抗病毒剂，并不直接杀伤或抑制病毒，而主要是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。它们在多种细胞上具有广谱的抗病毒、抗增殖、免疫调节和诱导分化作用。干扰素的作用有以下几个特点：①间接性；②广谱性；③种属特异性：一般在同种属细胞中活性高，对异种细胞无活性；④发挥作用迅速：干扰素既能中断受染细胞的病毒感染又能限制病毒扩散；在感染的起始阶段，体液免疫和细胞免疫发生作用之前，干扰素发挥重要作用(陆再英，钟南山等，内科学，第7版)。干扰素作为一种重要的细胞因子药物，在多种恶性肿瘤的治疗以及病毒性疾病的防治方面发挥了巨大作用。

干扰素分为Ⅰ型、Ⅱ型和III型。Ⅰ型干扰素有7种：IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-τ，人类没有IFN-δ和IFN-τ；Ⅱ型仅有IFN-γ(且仅有一个亚型)，III型干扰素有IFN-λ(目前发现的至少有三个亚型)。根据报道，I型干扰素中的IFN-α约有十三个亚型，部分亚型又可根据等位基因的差异再进行细分。不同种类的I型干扰素及其分型具有差异的特异活性，但其生物学功能是一致的。全部的I型干扰素具有共同的受体IFNAR。IFNAR含有IFNAR1和IFNAR2两条链，且都是糖蛋白。其中，IFNAR2有三种不同的剪接形式：长型跨膜受体(IFNAR2c)、短型跨膜受体(IFNAR2b)和可溶性受体(IFNAR2a)。I型干扰素通过结合单独的IFNAR2c或者IFNAR1与IFNAR2c复合膜受体，激活下游JAK-STAT途径产生一系列生物学反应。

传统研究一般都关注干扰素在抗病毒、抗肿瘤方面的效果和作用，随着近些年研究的深入，干扰素在免疫调节和诱导分化方面的功效越来越受重视。例如，I型干扰素可促进幼稚T细胞向Th1分化；可维持记忆性T细胞的存活以及功能活力；可促进浆母细胞分化成浆细胞，增强抗体的产生；可诱导/激活树状细胞的形成等。此外，大量研究显示，多种自身免疫性疾病可能与I型干扰素的高表达存在相关性。特别地，高水平的IFNα与包括胰岛素依赖的糖尿病(insulin-dependent diabetes mellitus，IDDM)、系统性红斑狼疮(systemiclupus erythematosus，SLE)和自身免疫性甲状腺炎(autoimmune thyroiditis)等多种疾病的活动密切相关。由此，IFNα活性的阻断策略可能对多种自身免疫病患者有益。目前，国外有两株针对IFNα的抗体，MedImmune公司的Sifalimumab和Genetech公司的Rontalizumab，已相继进入SLE治疗的II期临床试验阶段，用于银屑病、皮肌炎、多肌炎等多种自身免疫病治疗的临床研究也正在进行。

人抗体是治疗性抗体发展的最终方向，临床上应用人抗体，尤其是在自身免疫性疾病的治疗中，可最大限度减少抗体的免疫原性、延长药物在体内的半衰期并可借助人免疫球蛋白Fc段介导免疫调理、ADCC及CDC等效应，进而增强抗体的生物学效应。人抗体的主要研制手段包括抗体库技术和转基因小鼠技术。其中，抗体库技术因其具有简单、便捷和灵活等特点，广受抗体开发者的青睐，目前，该技术已经非常成熟，被认为是目前最成功的开发治疗性抗体的技术手段之一。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供人源抗IFNα抗体及其活性片段的氨基酸序列。

本发明的第二个目的在于提供编码上述抗体或其活性片段的编码基因。

本发明的第三个目的在于提供上述抗体及其活性片段在制备治疗IFNα相关的自身免疫性疾病药物中的应用。

本发明提供的抗体可变区氨基酸序列模式为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。在此，FR1～4代表4个框架区域，CDR1～3代表3个高变区。FR1～4可以是从恒定区序列分离而来(比如人免疫球蛋白轻重链类、亚类或亚家族最常用的氨基酸)，也可以是从个人抗体框架区分离而来或从不同的框架区基因组合而来。例如Kabat等库中收录的众多人抗体框架区序列。其中，重链为人免疫球蛋白亚群人重链VH III家族，轻链为Lambda I家族。关于轻重链的CDR区，通过丙氨酸扫描及其他同类氨基酸突变，获得大量突变体，对轻链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明：CDR1L序列为:SGSSSNX1GSNX2VX3(SEQ ID NO1)，其中，X1可以是Ile、Val或Met，优选为Ile；X2可以是Tyr、Lys、Arg或Leu，优选为Tyr；X3可以是Ser、Gly或Ala，优选为Ser。CDR2L序列为：DXNQRPS(SEQ ID NO2)，在此，X可以是Asn或Thr，优选为Asn。CDR3L序列为：QSX1DX2X3LVX4(SEQ ID NO3)，其中，X1可以是Asn、Ser或Ala，优选为Asn；X2可以是Ala、Met或Leu，优选为Ala；X3可以是Ser、Gly或Ala，优选为Ser；X4可以是Glu、Met、Lys、Asp、Thr、Ala或Gly，优选为Glu。对重链CDR1、CDR2和CDR3的突变体评价结果表明：CDR1H序列为：SX1X2MS(SEQ ID NO4)，其中，X1可以是Tyr、Gly、Leu、Val、Met或Ala，优选为Tyr；X2可以是Ala、Ser或Gly，优选为Ala。CDR2H序列为：AISGSGGSTXYADSVKG(SEQ IDNO5)，在此，X可以是Tyr、Asn、Leu、Ile、Met或Val，优选为Tyr。CDR3H序列为：YX1SX2X3X4SFDY(SEQ ID NO6)，其中，X1可以是Tyr、Trp、Ser、Pro或Ala，优选为Tyr；X2可以是Phe、Leu和Met，优选为Phe；X3可以是Tyr、Val、Pro、Phe或Ala，优选为Tyr；X4可以是Thr、Ala、Gly、或Asn。对该抗体的轻重链CDR区进行丙氨酸扫描，结果表明，轻链CDR1、CDR2及重链CDR3对抗体与IFNα-2的结合至关重要；除重链CDR2外的其他CDR区对抗体结合IFNα-1的影响都十分明显，仅单个氨基酸的变化可引起亲和力几倍至几十倍的改变，具体见实施例3。

因此，本发明提供了一种人源抗人IFNα抗体，其轻链包含以下CDR氨基酸序列，CDRL1序列如SEQ ID NO.1所示，CDRL2序列如SEQ ID NO.2所示，CDRL3序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，本发明提供的人源抗人IFNα抗体其重链CDR3含有如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列。

更进一步地，其重链可变区包含以下CDR氨基酸序列，CDRH1序列如SEQ ID NO.4所示，CDRH2序列如SEQ ID NO.5所示，CDRH3序列如SEQ ID NO.6所示。

本发明提供的人源抗人IFNα抗体，其轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

本发明提供的人源抗人IFNα抗体，其重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

优选地，本发明提供的人源抗人IFNα抗体轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明提供的抗体可以为单链抗体、Fab、微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD中的一种。

本发明提供的抗体为全抗体或各种其他形式的基因工程抗体。如，抗IFNα抗体可以是全抗体或抗体片段。抗体分子本身可用于治疗和诊断。抗体可以被标记、交联或偶联及与其他蛋白或多肽分子融合表达形成复合物(如细胞毒性物质、放射性核素和\或化学分子等)用于诊断和治疗。

本发明更进一步提供：编码抗体的独立基因，表达载体，载体转染宿主细胞相关控制技术及宿主细胞，抗体表达流程及在细胞培养上清中回收抗体的方法。

编码上述抗体轻链可变区的基因为如下1)、2)或3)所示：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述轻链可变区的DNA分子。

编码上述抗体重链可变区的基因为如下1)、2)或3)所示：

1)其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述轻链的DNA分子；

3)与1)限定的DNA序列具有70％以上的同源性且编码所述重链可变区的DNA分子。

在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低的离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(V/V)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在70％以上，较佳地至少80％以上，更佳地90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。

本发明提供了含有上述基因的表达载体以及含有所述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表达盒。

本发明提供了制备人源抗人IFN-α抗体的方法，利用噬菌体展示抗体库技术筛选抗IFNα特异性单链抗体，获得抗体轻重链可变区基因，并将其克隆入全抗体表达载体，通过哺乳动物表达系统对其进行全抗体表达，获得其全抗体蛋白。

上述方法中，所述的抗体轻重链可变区基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQID NO.10所示。

此处所公开和要求保护的SEQ ID NO.1～8所示序列包括“保守序列修饰”，即不明显影响和改变所述抗体或含有所述氨基酸序列抗体的结合特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。所述保守序列修饰包括核苷酸或氨基酸替换、添加或缺失。可以通过本领域的标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变等将修饰导入SEQ ID NO.1～8中，如本发明实施例3中通过对抗体CDR区进行丙氨酸扫描和对部分位点进行氨基酸突变，即为保守序列修饰的范例。保守氨基酸替换包括氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基或其他氨基酸残基代替。本领域中，已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电的极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，优选用来自于同一侧链家族的另一种氨基酸残基代替人抗IFNα多个亚型的抗体中的非必须氨基酸残基。

因此，此处公开的核苷酸序列编码的抗体或/和含有此处公开的氨基酸序列的抗体包括基本上由经保守序列修饰的相似序列编码的，或含有经保守序列修饰的相似序列的抗体，均应视为本发明的范畴。

此外，考虑到密码子的简并性，编码本发明SEQ ID NO.1～8所述抗体的基因可以但不局限于SEQ ID NO.9和10，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行修改，获得编码相同抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏好性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

本发明还提供一种抗体靶向药物分子，包含连接于化学分子、放射性同位素、多肽分子、毒素或生物大分子的上述人源抗人IFNα抗体。连接方式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。

本发明还提供一种双特异性或多特异性分子，包含上述人源抗人IFNα抗体或抗体的抗原结合部位。

一种抗体与其他蛋白或/和多肽的融合蛋白，包含上述人源抗人IFNα抗体和功能性蛋白或多肽分子的复合物。

上述融合蛋白是将抗体基因与融合蛋白基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。

本发明还提供了含有上述人源抗人IFNα抗体的药物、制剂或检测试剂。

本发明同样提供含有抗体的组分和药理学上可接受的递送分子或溶液。本治疗用组分为无菌，可低温冻干。

本发明提供了人源抗人IFNα抗体在制备以IFNα为靶标的疾病治疗药物中的应用。所述的疾病为系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、银屑病、多肌炎、皮肌炎、硬化病、类风湿性关节炎等。

本发明提供一种抗人IFNα多个亚型的抗体，该抗体可以抑制IFNα所表现的一种或多种生物学活性。本抗体通过阻碍IFNα与其受体结合发挥作用，也可以通过降低体内IFNα水平发挥作用。IFNα拮抗剂所具有的所有干扰功能均应平等地视为本发明的目的。

在本发明的实施例中，申请人利用自构建的库容量达到1.35×10¹⁰的大容量全合成噬菌体单链人抗体资源库(ZL.200910091261.8)，以IFNα_1b和IFNα_2b为靶标，通过交替筛选获得了一株针对多种亚型人IFNα的功能抗体AIA22，其轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，AIA22抗体的氨基酸序列和DNA序列分别如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

本发明运用噬菌体表面展示技术，从大容量全合成人源单链抗体库中，通过多轮的生物淘洗(bio-panning)，筛选获得特异性抗人IFNα的单链基因工程抗体(single chainvariable fragment,scFv)。在本发明实施例中，将上述抗体轻重链可变区基因分别克隆入全抗体哺乳动物细胞瞬时表达载体pABL和pABG1中，通过共转染HEK293-T细胞进行瞬时分泌表达，亲和纯化获得全抗体AIA22。

本发明描述的抗体AIA22具有良好的治疗应用前景，主要表现为通过与重组人IFNα-1、IFNα-2、IFNα-4、IFNα-5、IFNα-6、IFNα-8、IFNα-14、IFNα-17、IFNα-21等多个亚型的特异性结合活性，能够有效阻断其对Daudi细胞增殖的抑制作用。

采用BIAcore3000系统对AIA22与IFNα-1b和IFNα-2b的结合能力进行检测，结果表明，该抗体Fab与IFNα-2b的亲和力K_D为0.213nM，与HSA-IFNα_1b融合蛋白的亲和力K_D为3.24nM。

本发明通过大容量全合成抗体库技术筛选获得1株抗人IFNα多个亚型的全人源抗体和一系列亲和力保持不变或提高的突变体抗体，并证实所发明抗体均特异性与IFNα结合，并抑制其生物学功能。利用上述获得的全人源抗IFNα基因工程抗体可变区基因以及抗体序列特征下的全抗体基因，可以在原核细胞、酵母细胞、真核细胞及任何重组系统中表达和生产此抗体，或以此为基础的改建后的含有此抗体基因的任何其它基因，获得具有抑制IFNα生物学活性的抗体产物，或利用体外标记或交联的方法获得的复合物，制成临床上用于治疗与IFNα相关的自身免疫性疾病的特异性抗体药物。

附图说明

图1所示为载体图谱，其中图1A为pABL载体图谱，图1B为pABK载体图谱，图1C为pABG1载体图谱。

图2所示为采用FreeStyle^TMHEK293-T瞬时表达系统表达并通过ProteinA柱亲和纯化获得的AIA22、Sifalimumab全抗体SDS-PAGE非变性电泳图；1:Pr Marker，2:AIA22，3:Sifalimuamb。

图3所示为AIA22全抗体以浓度梯度结合多种类型抗原的ELISA特异性鉴定结果；图例所示为抗原类型及其包被浓度。

图4所示为利用BIAcore3000系统测定AIA22与IFNα-2b和HSA-IFNα-1b的亲和力曲线。其中，图4A：为测定AIA22与IFNα-2b亲和力结果，从上至下曲线代表的IFNα-2b浓度依次为20nM、10nM、5nM、2.5nM、1.25nM和0.625nM；图4B：为测定AIA22与HSA-IFNα-1b亲和力结果，从上至下曲线代表的HSA-IFNα-1b浓度依次为400nM、200nM、100nM、50nM、25nM和12.5nM。

图5所示为AIA22和Sifalimuab阻断IFNα_2b抑制Daudi细胞增殖活性的结果；使用的IFNα_2b抑制Daudi的增殖浓度为25pM。

图6所示为AIA22对不同IFNα亚型的中和活性图。纵坐标表示AIA22对不同亚型的EC50值与各亚型IFNα使用浓度的比值，比值越小，表明AIA22对该亚型的中和活性越强。

图7所示为AIA22部分突变体阻断IFNα不同亚型的抑增殖活性结果；图7A：为阻断IFNα_2b活性，IFNα_2b的使用浓度为25pM；图7B：为阻断IFNα_1a活性，IFNα_1a的使用浓度为36pM。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1特异性人源抗人α干扰素抗体的筛选与鉴定

一、材料与方法：

1.材料：大容量全合成噬菌体单链抗体库由中国人民解放军军事医学科学院构建(ZL200910091261.8)，库容量1.35×10¹⁰。筛选抗体库的抗原为在大肠杆菌中重组表达的人IFNα_2b(以色列ProSpec-Tany公司)以及与人血清白蛋白(HSA)融合表达的HSA-IFNα_1b和HSA-IFNα_2b(抗体在线公司)。菌株为XL1-Blue(美国Stratagene)；所用噬菌体为M13KO7(美国Invitrogene公司)。真核表达载体pABG1、pABK和pABL为本室保存，载体结构图谱如图1所示，哺乳动物细胞FreeStyle^TMHEK293-T购自Invitrogene公司。MedImmune公司Sifalimumab的可变区核酸序列合成服务由北京天一辉远生物科技有限公司提供。

2.方法

2.1噬菌体抗体库的呈现，参照Pharmacia公司的Recombinant phage selectionmodule用户手册(Cat.NO.XY-040-00-05)进行，但稍作修改，具体如下：

取冻存的抗体库，在200ml2×YT-CTG(氯霉素C终浓度为100ug/mL，四环素T终浓度为10ug/mL，Glucose终浓度为0.5％)培养基中37℃，220rpm培养至OD600＝0.5，按MOI＝20∶1的比例加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置20min。37℃，150rpm缓慢摇床培养1h，加入卡那霉素至终浓度为50μg/ml，并加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，于30℃，220rpm摇床培养10～12h。次日，离心收取培养上清加入1/5体积的PEG8000buffer(20％PEG8000+2.5mol/LNaCl)，混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体。4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀重悬于5ml含2％BSA和15％甘油的PBS缓冲液中，-70℃冻存备用。

2.2噬菌体滴度的测定

挑取宿主菌(XL1-Blue)单克隆接种于LB培养基，37℃，摇床培养至对数生长期(OD₆₀₀＝0.5)。取50μl制备好的噬菌体悬液，用LB培养基进行系列10倍梯度稀释。向稀释到一定倍数的悬液中加入对数生长期的宿主菌，37℃，150～180rpm摇床培养1h。取培养后的菌液100或200μl涂布在LB平板上，37℃培养过夜，次日，计数菌落数，并计算滴度。

2.3抗IFNα多个亚型特异性抗体的淘选，参照Pharmacia公司的Recombinantphage selection module用户手册(Cat.NO.XY-040-00-05)稍作改动，用IFNα_2b和HSA-IFNα_1b交替进行淘选，具体如下：

第一轮IFNα_2b筛选：将重组蛋白抗原IFNα_2b用包被液稀释为20μg/ml(第二、三轮包被浓度分别为5ug/mL和1ug/mL)包被免疫管，1ml/管，4℃包被过夜。次日，免疫管用PBS洗涤2遍，2min/遍，然后用2％BSA37℃封闭2h(以后各轮交替使用0.2％酪蛋白和2％BSA，)。制备好的噬菌体抗体库用封闭液(同免疫管封闭液，0.1％Tween20，包被抗原为HSA融合蛋白时，相应加入终浓度40ug/mL的HSA封闭)37℃封闭30min。将预封闭后的噬菌体抗体库加入封闭后的免疫管中，4℃作用过夜。弃免疫管中溶液，进行洗涤：PBST洗10次，5min/次，PBS洗5次，5min/次(以后各轮洗涤强度逐渐加大，依次为：第二轮PBST洗15次，5min/次，PBS洗10次，5min/次；第三轮PBST洗15次，5min/次，PBS+NaCl洗15次，5min/次)。加入1ml0.2mol/L的Glycine-HCl(pH2.2)洗脱，室温作用10min，立即用1mol/L Tris中和至pH7.4(在第三轮筛选中，首先加入1ml0.2mol/L的Glycine-HCl(pH4.5)洗脱，室温作用10min，弃去洗脱液，用PBS洗涤2次，3min/次。然后再按照常规洗脱)。吸出中和后的洗脱液，向其中加入9ml对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue，37℃缓慢摇床培养1h；同时，将免疫管用PBS洗涤一次后，用1ml对数生长期的大肠杆菌XL1-Blue直接感染，37℃，150rpm摇床培养1h，然后将从洗脱后的感染菌液和直接感染的菌液中各取1％涂2×YT-CTG平板上，37℃培养至形成清晰的菌落，对克隆数进行统计，并计算投入产出比。同时将剩余菌液涂2×YTCTG平板，37℃培养过夜。用液体2×YT-CTG培养基将菌落刮取下来，取适量菌液投入100ml2×YTCTG液体培养基中，37℃摇床培养至OD600＝0.5时，按MOI＝20∶1加入辅助噬菌体M13KO7，室温静置20min，30℃，150rpm摇床培养1h，加入等体积的2×YT-CT培养基(C、T浓度同前)，并加入卡那霉素K至终浓度为50μg/ml，IPTG至终浓度0.15mM，继续在30℃、200rpm摇床培养10h，离心收取培养上清加入1/5体积的PEG8000buffer(20％PEG+2.5mol/L NaCl)，混匀后于冰上放置45min，沉淀噬菌体。4℃，10000g离心20min，弃上清，沉淀重悬于5ml含0.2％酪蛋白的PBS缓冲液中，-70℃冻存备用。将三份噬菌体测定滴度，按比例合并，投入第一轮的HSA-IFNα_1b筛选。第一轮HSA-IFNα_1b筛选包被抗原HSA-IFNα_1b浓度为60ug/mL(第二轮为15ug/mL)，筛选过程其余步骤如前所述。第三轮仅用IFNα_2b筛选。

2.4噬菌体ELISA鉴定阳性克隆

挑取经筛选后的克隆于96孔深孔板中，每孔250μl2×YTCTG培养基，37℃摇床培养至OD600＝0.5，加入1×10⁸pfu/mL的辅助噬菌体，室温静置15min，37℃，150rpm摇床培养1h，加入等体积2×YT-CTKI(卡那霉素K终浓度为50μg/ml，IPTG终浓度为0.2mmol/L)，30℃摇床培养过夜。次日，离心收取上清，加入BSA至终浓度2％，加入Tween-20至终浓度0.1％，37℃静置15min，备用。抗原(HSA-IFNα_1b和HSA-IFNα_2b)分别用包被液稀释至2μg/ml，加入96孔酶联板，50μl/孔，4℃包被过夜。次日，弃包被液，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，每次3min，用2％BSA+0.1％Tween-20封闭，200μl/孔，37℃，2h。弃去封闭液，加入经封闭后的单克隆噬菌体抗体，50μl/孔，37℃，静置1h。弃去液体，用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。将HRP标记的鼠抗M13抗体用PBST稀释，稀释比例为1∶5000，同时加入终浓度2％的BSA，37℃预封闭15min。将预封闭后的鼠抗M13抗体加入酶联板，50μl/孔，37℃静置30min。弃去液体，酶联板用PBST洗2次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。弃去洗涤液，加入OPD底物显色液，50μl/孔，室温静置显色。用2M H₂SO₄终止显色。酶标仪测定光吸收值OD492/630。

包被缓冲液(pH9.6)：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，双蒸水加至1L；

封闭液：1×PBS+2％BSA(或0.2％酪蛋白)+0.1％Tween20；

洗涤液PBST：1×PBS+0.1％Tween20；

OPD底物液稀释液：0.2M Na₂HPO₄(28.4g/L)25.7ml，0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml,蒸馏水，50ml。

2.5噬菌体单链抗体转换为全抗体

载体pABG1和pABL分别用于克隆V_H和V_L可变区基因，分别采用引物H3F(SEQ IDNO11)和HR(SEQ ID NO12)扩增V_H3可变区基因；L1F(SEQ ID NO13)和LR(SEQ ID NO14)扩增V_L1可变区基因。V_L1可变区基因利用酶切位点BsrG I和Hind III克隆入载体PABL，V_H3可变区基因利用酶切位点Afl II和NheI克隆入载体pABG1。重组质粒转化大肠杆菌Top10，通过对重组质粒进行菌液PCR及测序鉴定，获得构建正确的全抗体轻、重链表达载体。大提质粒后将抗体轻重链以摩尔比1：1转染FreeStyle^TMHEK293-T细胞，进行全抗体的瞬时表达，经ProteinA亲和层析柱对表达上清进行纯化，并对纯化后的全抗体进行电泳分析、亲和力和特异性测定等。

2.6Sifalimumab的全抗体改造、表达和纯化

Sifalimumab的序列信息参见专利US7741449B2。Sifalimumab轻重链氨基酸序列如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。设计其可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.17和SEQ IDNO.18，在轻链两端引入酶切位点Xba I和Kas I，在重链两端引入酶切位点Afl II和Nhe I，分别利用酶切连接操作克隆入载体pABK和pABG1。重组质粒转化大肠杆菌Top10，通过对重组质粒进行菌液PCR及测序鉴定，获得构建正确的全抗体轻、重链表达载体。大提质粒后将抗体轻重链以摩尔比1：1转染HEK293-T细胞，进行全抗体的瞬时表达，经ProteinA亲和层析柱对表达上清进行纯化，以其为对照抗体开展后续研究。

二、结果

1.全抗体的表达纯化

对第三轮IFNα_2b筛选获得的单克隆进行鉴定，获得特异性噬菌体抗体命名为AIA22，其噬菌体单链抗体可特异性结合IFNα_2b和INFα_1b，该单链抗体的氨基酸和核苷酸序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示，其轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

将噬菌体抗体AIA22的轻、重链可变区基因以及Sifalimumab的轻、重链基因分别克隆入全抗体瞬时表达载体pABL和pABG1中，构建其全抗体轻、重链重组表达载体，并通过HEK293-T细胞瞬时表达系统实现了哺乳动物细胞瞬时分泌表达。经Protein A柱纯化后获得全抗体蛋白纯品，其SDS-PAGE电泳结果如图2所示，抗体纯度较高，电泳条带位置符合预期，可以用于后续实验。

3.AIA22的特异性鉴定

在全抗体水平上对AIA22的特异性进行分析，以HSA-IFNα_1b和HSA-IFNα_2b为阳性抗原，IFNω、HSA、His-IL6R(带His标签的IL6R)、VEGF、TNF、AHC-Aβ-T(AHC、Aβ片段以及肉毒毒素融合蛋白)以及HEK293碎细胞上清为对照抗原，4℃过夜包被酶联板，加入纯化后梯度稀释的AIA22全抗体，以HRP标记抗人IgG抗体为二抗进行ELISA，检测AIA22全抗体的特异结合活性。结果如图3所示，可以看出，AIA22与目标抗原HSA-IFNα_1b和HSA-IFNα_2b的结合是特异的。

实施例2 AIA22亲和力和体外中和活性分析

一、材料与方法：

1.材料：CM5芯片购自GE Healthcare Life Sciences公司。IFNα_1、IFNα_2、IFNα_4、IFNα_5、IFNα_6、IFNα_8、IFNα_10、IFNα_14、IFNα_16、IFNα_17、IFNα_21等亚型均购自PBL公司(货号11002-1)。Daudi细胞(人Burkitt's淋巴瘤细胞)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。CCK-8购自日本同仁化学株式会社。新生牛血清NCS购自PAA公司。RPMI1640细胞培养基购自Gibco公司。其它涉及材料同实施例1。

2.方法

2.1BIAcore3000系统测定抗体亲和力

本例采用BIAcore3000系统检测AIA22对IFNα_2b和HSA-IFNα_1b的亲和力，具体操作步骤如下：

将纯化后抗体AIA22用HBS-EP缓冲液稀释至1ug/mL，并偶联至预先包被有Prot-G的CM5芯片上，偶联条件：温度25℃，流速5μL/min，偶联目标值为200RU。抗原IFNα_2b作为流动相，用HBS-EP作两倍浓度梯度稀释，其浓度范围为20nM～625pM。测试条件：温度25℃，流速30μL/min；结合时间为3min，解离时间为15min。完成一个反应后，对芯片进行再生，再生条件：3M MgCl₂，30uL/min×30s，再生后继续偶联同样目标值的AIA22，进行下一轮反应。实验完毕，扣除空白对照和无关抗体对照响应值，用BIAevaluation软件进行结果分析。

以HSA-IFNα_1b作为抗原，重复上述过程，其浓度范围为400nM～12.5nM，结合时间为4min，解离时间为20min，其它条件不变。

2.2AIA22体外中和活性分析

IFNα功能(包括在系统性红斑狼疮SLE病理中的作用)的发挥是通过与细胞表面的I型干扰素受体IFNAR结合，激活下游JAK-STAT通路得以实现的。IFNα抑制Daudi细胞的增殖也是如此。人IFNα抑制体外培养的Daudi细胞增殖效果明显，并存在确定的量效关系。通过评价AIA22在体外阻断人IFNα与IFNAR的结合，促进Daudi细胞增殖的情况，可以间接反映出其在疾病治疗当中的实际作用。

通过抑制实验探究不同亚型人IFNα抑制Daudi增殖的细胞毒性曲线，从而确定其有效抑制浓度；在此基础上通过抗体阻断实验验证抗人IFNα抗体AIA22的体外中和活性。具体操作如下：

2.2.1IFNα抑制Daudi细胞增殖的细胞毒性曲线

1)细胞悬液计数，并用含10％NCS的RPMI1640培养基将细胞悬液稀释至2x10⁵个/mL的最终密度，按50uL/孔接种细胞至96孔板；

2)以2ug/mL(或300IU/mL)为起始浓度(HSA融合的IFNα起始浓度采用20ug/mL，作2倍系列稀释)，用完全培养基对待测IFNα亚型进行1.5倍系列稀释，作14个稀释度，混匀后按50uL/孔加入相应孔中。同时设置“细胞+空白培养基”、“无细胞+空白培养基”以及“无细胞+含最高剂量IFNα空白培养基”的对照。

3)480rpm×3min振摇培养板，然后置于37℃，5％CO2细胞孵箱孵育72h；

4)按10uL/孔加入CCK-8，240rpm×3min振摇培养板，使充分混合，37℃，5％CO2孵育3h后，用酶标仪检测吸光值OD450nm/OD630nm；

5)记“细胞+空白培养基”孔的显色值为A0，含IFNα实验孔显色值为As，“无细胞+含高剂量IFNα空白培养基”的对照孔显色值为Ab；则细胞的存活率(％)＝[(As-Ab)/(A0-Ab)]×100％，作细胞毒性曲线。

2.2.2抗IFNα抗体AIA22体外中和活性评价

1)细胞悬液计数，并用含10％NCS的1640培养基将细胞悬液稀释至2×10⁵个/mL的最终密度，按50uL/孔转接细胞至96孔板(每种干扰素亚型占2列，对应每种抗体的14个浓度梯度，同时，抗体的每个浓度对应一孔不含干扰素的对照，即每一对mAb/IFN需要8x4孔，同时设2个复孔，总共需要接种的细胞孔数按此计算)；

2)分别用含有IFNα的完全培养基(使用浓度根据毒性曲线确定，取恰好完全抑制细胞增殖的浓度)和不含干扰素的完全培养基对抗IFNα抗体AIA22进行2.5倍系列稀释，抗体起始浓度为100ug/mL，作14个稀释度，混匀后按50uL/孔加入相应孔的细胞中。此时，每孔细胞最终密度为1×10⁴个/100uL/孔；抗体浓度为50ug/mL(312nM)到134pg/mL(0.84pM)；同时设置不含抗体(仅含IFNα)和空白培养基对照孔。

3)37℃，5％CO₂细胞孵箱孵育72h；

4)按10uL/孔加入CCK-8，240rpm×3min振摇培养板，使充分混合，37℃，5％CO₂孵育3h后，用酶标仪检测吸光值OD450nm/630nm；

5)数据处理：以不含抗体孔作为0％阻断效率，以各抗体浓度下不含干扰素的孔作为100％阻断效率，计算各浓度抗体/干扰素对应的阻断效率，通过CurveExpert拟合抗体浓度-阻断效率曲线，计算EC₅₀值。

二、结果

1.BIAcore3000系统测定抗体亲和力：

CM5芯片偶联抗体AIA22，以浓度梯度的HSA-IFNα_1b和IFNα_2b为流动相，采用BIAcore3000系统测定抗体与HSA-IFNα_1b、IFNα_2b的亲和力，依托BIAevaluation软件，分析曲线特征，选取适当拟合区间，拟合曲线并计算抗体亲和力(图4A和图4B)，结果如下表所列。

表1 AIA22结合特征

IFNα亚型	Ka(1/ms)	Kd(1/s)	KD(nM)
				IFNα-2b	2.27×106	4.84×10-4	0.213
HSA-IFNα-1b	7.41×104	2.41×10-4	3.24

2.AIA22体外中和活性分析

Daudi细胞细胞表面表达有IFNAR受体，IFNα通过与INFAR受体结合对该细胞的增殖具有抑制作用。利用抗体与IFNα的结合，可阻断IFNα与受体间信号的传导，从而阻断IFNα对细胞增殖的抑制作用，使细胞的增殖活性得以恢复。阻断效率由细胞活性体现。本发明采用Daudi增殖实验检测了AIA22对人IFNα多种亚型的中和活性，拟合计算其EC₅₀值，结果如图5、图6及表2所示。其中，AIA22与Sifalimumab对IFNα_2b的体外活性评价的结果比较如图5所示。前述结果显示，AIA22对IFNα_2b的亲和力在略低于Sifalimumab(0.1nM)的情况下，显示了较优的中和活性。图6显示了AIA22对不同亚型的EC50值与各亚型IFNα使用浓度(完全抑制Daudi增殖的IFNα浓度临界值)的比值，比值越小，表明AIA22对该亚型的中和活性越强；表2详细给出了AIA22中和不同亚型IFNα活性的EC50值以及1000倍EC50浓度下的IFNα活性抑制率；可以看出，AIA22对多种亚型均有中和活性，尤以对IFNα-2活性最强。

表2 AIA22中和IFNα不同亚型抑制Daudi细胞增殖的活性

NS＝not significant

“1000×”栏表示抗体浓度为IFNα浓度1000倍时的中和活性。

实施例3 AIA22轻、重链CDR区丙氨酸扫描及突变体评价

一、材料与方法：

1.材料：Fortebio Octet系统以及Anti-Human IgG Fc Capture购自艾瑞生物技术(上海)有限公司。其它涉及材料同实施例1、实施例2。

2.方法

2.1丙氨酸扫描

分别设计定点突变引物对AIA22抗体6个CDR区进行丙氨酸扫描，如果其在该位置是丙氨酸，则将其分别突变为Gly和Ser。方法采用质粒定点突变的方法进行，具体实施方法可参照文献[王荣浩，陈瑞川，刘润忠。快速点突变的优化方法。厦门大学学报(自然科学版)，2008,Vol47，sup2,282-285]。

2.2.ELISA检测相对亲和力

抗原(HSA-IFNα_1b和HSA-IFNα_2b)分别用包被液稀释至3μg/ml，加入96孔酶联板，50μl/孔，4℃包被过夜。次日，弃包被液，酶联板用含2％脱脂奶粉的PBS封闭，50μl/孔，37℃，30min。弃去封闭液，加入经PBST牛奶(2％脱脂奶粉、0.1％Tween20)梯度稀释的亲本抗体和突变体抗体(初始浓度1ug/mL)，50μl/孔，37℃，静置1h。弃去液体，用PBST洗3次，200μl/孔，每次5min。将HRP标记的鼠抗人IgG Fc抗体用PBST牛奶1∶2000稀释，37℃预封闭15min；然后加入酶联板，50μl/孔，37℃静置30min。弃去液体，酶联板用PBST洗3次，PBS洗一次，200μl/孔，每次5min。弃去洗涤液，加入OPD底物显色液，50μl/孔，室温静置显色。用2MH₂SO₄终止显色。酶标仪测定光吸收值OD492nm/630nm。

2.3.ForteBio Octet对突变体亲和力的高通量比较

将待检测抗体用HEPES-EP缓冲液稀释至100nM，包被于Anti-Human IgG FcCapture，包被时间20min；包被完成后用HEPES-EP缓冲液洗涤2min，基线校准1min后，将Anti-Human IgG Fc Capture移入用HEPES-EP缓冲液稀释至20nM的IFNα样品中，结合10min，待结合曲线达到平衡后将Anti-Human IgG Fc Capture移入新的HEPES-EP缓冲体系进行抗原抗体复合物的解离，解离时间为15min。检测完成后，采用配套Data Analysis分析软件对亲和力进行分析。

2.4.突变体与亲本抗体细胞学活性比较

具体实施方法同实施例2中2.2.2；抗体剂量使用的基本原则是参考前期实验数据，在其对应浓度两侧取合适的浓度梯度样点。

二、结果

在AIA22氨基酸序列基础上，采用定向突变的方法，对轻重链6个CDR区的全部氨基酸位点进行丙氨酸扫描。用ELISA检测相对亲和力，对部分突变体同时也采用ForteBioOctet系统精确检测其亲和力的变化，结果如表2所列(序列采用Kabat编秩规则)。丙氨酸扫描结果提示，除重链CDR2以外，其余各CDR区均存在对结合活性影响较大的位点，特别是对IFNα_1b的结合影响较为明显。其可能原因是这些位点的氨基酸直接参与相互作用，或者是这些位点的氨基酸对于维持抗体的正确的整体空间构象至关重要。特别地，轻链的G25、S27、S31a、Y32、N51、E96等位点以及重链的A33、Y96、S97、F98、Y99等位点对于抗体的结合活性影响较大。通过对部分位点的随机突变，并对突变体进行ELISA相对亲和力检测和ForteBio Octet系统亲和力比较的评价(结果未详细列出)，多个位点的突变均能在保证抗体对IFNα-2b亲和力无显著改变的前提下显著提高对IFNα_1b的亲和力；同时，在阻断IFNα_1b的抑增殖活性方面也有一定程度的改善，细胞学活性结果如图7A、图7B所示。

表3 AIA22轻重链CDR区丙氨酸扫描及定点突变结果列表

说明：表中相对AIA22亲合力栏对应数值为计算得到的突变体抗体的解离常数Kd与亲本抗体的Kd之比值，比值越小，代表亲和力提高约显著；相反，数值越大，表示亲和力降低明显。

*表中未列出的CDR区位点均是由于表达异常未能获得样品导致未能对其进行检测*。

Claims (15)

1.一种人源抗人IFN-α抗体，其特征在于，其轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

2.如权利要求1所述的抗体，其特征在于，其为微型抗体、嵌合抗体或全抗体免疫球蛋白IgG1、IgG2、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD。

3.一种抗体片段，其为单链抗体或Fab，其特征在于，其轻链可变区和重链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

4.编码权利要求1所述抗体的基因。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，编码轻链可变区的基因，其核苷酸序列如SEQID NO.9所示；编码重链可变区的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

6.含有权利要求4~5任一所述基因的表达载体。

7.含有权利要求6所述表达载体的宿主细胞或表达盒。

8.一种抗体靶向药物分子，其特征在于，包含连接于放射性同位素、多肽分子、毒素的权利要求1或2所述的抗体或权利要求3所述的抗体片段。

9.如权利要求8所述的抗体靶向分子，其特征在于，连接方式为抗体被标记、体外交联或分子偶联。

10.一种双特异性或多特异性分子，其特征在于，包含权利要求1或2所述抗体或抗体的抗原结合部位或权利要求3所述的抗体片段。

11.一种抗体与其他蛋白或/和多肽的融合蛋白，其特征在于，包含权利要求1或2所述抗体和功能性蛋白或多肽分子或权利要求3所述的抗体片段的复合物。

12.如权利要求11所述的融合蛋白，其特征在于，将抗体基因与免疫毒素或细胞因子基因连接构建重组表达载体，通过哺乳动物细胞或其他表达系统获得重组融合蛋白分子。

13.含有权利要求1或2所述抗体或权利要求3所述的抗体片段的药物、制剂或检测试剂。

14.权利要求1或2所述抗体或权利要求3所述的抗体片段在制备与IFNα相关的自身免疫性疾病治疗药物中的应用。

15.如权利要求14所述的应用，其特征在于，所述的疾病为系统性红斑狼疮、胰岛素依赖型糖尿病、自身免疫性甲状腺炎、银屑病、多肌炎、皮肌炎、硬化病、类风湿性关节炎。