JP3623985B2

JP3623985B2 - 抗ｌｄ７８ポリペプチドモノクローン抗体

Info

Publication number: JP3623985B2
Application number: JP14257794A
Authority: JP
Inventors: 佳秀藤山; 敏雄井手; 巧佐々木; 幸男時吉; 義孝今川
Original assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Current assignee: Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
Priority date: 1993-05-31
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 2005-02-23
Anticipated expiration: 2020-02-23
Also published as: JPH0767689A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は免疫異常及び血球貪食性組織球食作用（ＨｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃＨｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ；以下、ＨＨと称することがある）等に起因する疾患の診断、予防もしくは治療に有用な、並びに生化学及び組織学の研究に有用な新規物質を提供する免疫学的技術に関する。より詳しくは、自己免疫疾患例えば潰瘍性大腸炎やクローン病を初めとする炎症性腸疾患患者の患部及びＨＨに起因する疾患、例えば血球貪食症候群（ＨｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃＳｙｎｄｒｏｍｅ；以下、ＨＳと称することがある）患者の組織中の細胞もしくは血液中のＬＤ７８ポリペプチドに結合性を有し、実質的に中和する能力を有するモノクローン抗体及び該抗体を分泌するハイブリドーマに関する。
【０００２】
【従来技術】
ヒトの免疫異常に関わる疾患は、代表例として自己免疫疾患等が知られているが、これら自己免疫疾患も器官特異的なものから非器官特異的なものまで種々存在する。例えばその中で、潰瘍性大腸炎やクローン病をはじめとする難治性炎症性腸管障害は近年増加傾向にあり、その病因解明並びに治療法の開発が急務となっている。
【０００３】
また、これら炎症性腸疾患の診断手順は、例えば潰瘍性大腸炎の場合、厚生省特定疾患・難治性炎症性腸管障害調査研究班に基づくと、次のようになっている。「慢性の粘血・血便などがあり本症が疑われる患者には、細菌学的・寄生虫学的検査を行なって感染性大腸炎を除外するとともに、直腸あるいはＳ字結腸内視鏡検査を行なって本症に特徴的な腸病変を確認する。この際なるべく生検する。これだけの検査で多くは診断が可能であるが、さらに注腸Ｘ線検査や、必要に応じては結腸内視鏡検査などを行なって、腸病変の性質や程度、罹患範囲などを検査し、同時に他の疾患を除外すること。」
【０００４】
しかし、実際にはこれらの手順では診断の断定は難しく、またこの手順自体も煩雑である。潰瘍性大腸炎と同様、クローン病の診断手順も、臨床症状、クローン病に特徴的な腸病変の確認（内視鏡、Ｘ線、生検、切除または剖検材料）および他疾患との鑑別によって行ない、更に病型の判定、全身または局所合併症の有無の確認を行なうこととなっているが、この場合も手順に煩雑性を伴い、また診断の断定も困難である。
【０００５】
現在、これら炎症性腸疾患の治療法としては、サラゾピリン、５−アミノサリチル酸、副腎皮質ステロイド、アザチオプリン、６−ＭＰ、胸腺摘出術、トラニラスト、７Ｓ−免疫グロブリン大量療法、成分栄養、ＴＰＮ、シクロスポリンＡ、メトロニダゾールなどの薬物療法が行なわれているが、これらは根治的治療とはいえず、むしろ長期連用による重篤な副作用の原因ともなり、より有効な治療剤の開発が望まれている。
【０００６】
一方、血球貪食を伴うｈｉｓｔｉｏｃｙｔｅ（組織球）の増殖を示す疾患はＨｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓとしてまとめられることより、ＨＨと呼ばれている。１９７９年、Ｒｉｓｄａｌｌらは、全身性ウイルス感染時の、血球貪食を伴う異型性のない組織球のびまん性増殖をウイルス関連血球貪食症候群（ｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃｓｙｎｄｏｒｏｍｅ；以下、ＶＡＨＳと称することがある）という疾患単位で報告した（Ｒｉｓｄａｌｌ，Ｒ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｃａｎｃｅｒ，４４：９９３−１００２，１９７９）。Ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃｓｙｎｄｏｒｏｍｅ（以下、ＨＳと称することがある）には、ＶＡＨＳの他にこれまでに、悪性腫瘍などに伴う反応性のもの（ＲｅａｃｔｉｖｅＨＳ；ＲＨＳ）と家族性に発症するもの（ＦａｍｉｌｉａｌＨｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃＬｙｍｐｈｏｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ；以下、ＦＨＬと称することがある）とが知られている。
【０００７】
ＶＡＨＳは、全身ウイルス感染症に関連した血球貪食像を認める良性の全身性組織球増殖性疾患とされているが、その病態に関しては不明な点が多い。関連ウイルスとして、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ＶＺＶ（ｖａｒｉｃｅｌｌａｚｏｓｔｅｒｖｉｒｕｓ）、ＥＢ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ）ウイルス、パラインフルエンザウイルス、アデノウイルス等が関与する感染症、その他Ｘ−ｌｉｎｋｅｄｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｓｙｎｄｒｏｍｅやＡＩＤＳ、骨髄移植、悪性リンパ腫などの基礎疾患を有する免疫不全状態にある個体が合併することが知られているが、健康人でも罹患する。また、ＶＡＨＳは、発熱、全身性リンパ節腫張、肝機能異常、汎血球減少等の症状を呈する。ウイルス感染が引き金となることと考えられており、ＥＢウイルスやサイトメガロウイルスなどの感染に伴う例が多いが、骨髄、リンパ節に血球を貪食した異型性のない組織球のびまん性増殖が認められることにより診断されている。
【０００８】
Ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓの臨床症状は、悪性、反応性を問わず極めて類似しており、その鑑別診断は主に病理学的に行なわれている。最近ではＨＨの臨床症状として、血清フェリチン（ｆｅｒｒｉｔｉｎ）が著増することがＥｚｕｍｉら（Ｃａｎｃｅｒ，６１：２０７１−２０７６，１９８８）により明らかにされている。あるいは、新名主ら（臨床血液３３（４）：５４５−５４７，１９９２）は、血清ネオプテリン（ｎｅｏｐｔｅｒｉｎ）の測定がＨＨの病勢の指標となることを示唆しているが、明確で早期に診断できる体外診断薬は現在のところ存在しない。
これらＨＨの組織球賦活化の機序としては、例えばＶＡＨＳの場合ウイルス感染等により産生された何らかのサイトカインの関与が推察されているが、詳細は不明である。
【０００９】
ところで、ＬＤ７８は、Ｏｂａｒｕら（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１９８６；９９：８８５−８９４）によりヒト扁桃リンパ球をＴＰＡとＰＨＡで刺激した際、強く誘導されるｍＲＮＡより調製されたｃＤＮＡであることが明らかにされているが、これまでそのタンパク質の生理活性について、ヒト造血前駆細胞の増殖抑制作用（Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９９２；８３：４９９−５０４）、ラット歯骨細胞分化増強作用（ＢｏｎｅａｎｄＭｉｎｅｒａｌ１９９２；１９：２１５−２２３）、骨髄細胞増殖抑制作用（Ｂｌｏｏｄ１９９０；７６：１１１０−１１１６）等が報告されてはいるものの、特に疾患との関連については不明であった。そこで、本発明者らはＬＤ７８が純化された経緯より考察し、ＬＤ７８ポリペプチドが炎症性のサイトカインであると考え、炎症が持続的に生じている疾患すなわち自己免疫疾患等での発症に関与していると推察し、ＬＤ７８ポリペプチドが自己免疫疾患、特に潰瘍性大腸炎およびクローン病を初めとする炎症性腸疾患に関与していることを発見した。この発見により、生体中のＬＤ７８ポリペプチドを検出することで炎症性腸疾患の早期診断が可能となった。
【００１０】
また、ＬＤ７８は、マクロファージの組織障害性や腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ガンマインターフェロン（ＩＦＮγ）などのサイトカイン産生を増強させることが知られている。一方、ＨＨは、ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒｐｈａｇｏｃｙｔｅｓｙｓｔｅｍ（ＭＰＳ）の増殖性疾患であり、その中で血球貪食症候群（ＨＳ）では、血清ＩＦＮγの上昇が血球減少時に認められることが報告されている（小池ら、臨床血液，３４（５）；５５７−５６１，１９９３）。これらのことより、ＬＤ７８がＨＳに関与していると考え、抗ＬＤ７８モノクローン抗体を用いて、例えば免疫組織化学的に検討したところ、ＬＤ７８がＨＳに深く関与していることを発見した。この発見により、生体中（組織、血清、血液や骨髄中の細胞）のＬＤ７８ポリペプチドを検出することでＨＳの早期診断が可能となり、本発明のモノクローン抗体の新たな有用性が開拓された。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
現行の診断法及び治療法においては、炎症性腸疾患等の自己免疫疾患あるいはＨＨに関わる明確な診断もしくは症状を十分に阻止することはできず、当該疾患の発症頻度は最近１０年間においても減少が観られない。したがって、本発明はこれら炎症性腸疾患等自己免疫疾患およびＨＨとりわけＨＳの早期診断あるいは発症に対して極めて高い効果を有する自己免疫疾患関連疾病の予防、診断及び治療薬を提供することを目的とする。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は前述した問題点を解決するもので、本発明者等が自己免疫疾患、特に炎症性腸疾患、あるいはＨＨ、特にＨＳにおいて直接検出できる診断薬を提供すべく鋭意研究を重ねた結果、自己免疫疾患例えば潰瘍性大腸炎やクローン病の病巣に存在する物質、または同様にＨＨ例えばＨＳの単球・マクロファージ等が産生する物質すなわちＬＤ７８ポリペプチドを抗原として認識し、このものに特異的に結合することのできるモノクローン抗体を見出し、本発明に到達したものである。すなわち本発明は自己免疫疾患病巣部位に多く存在する、あるいはＨＨの単球・マクロファージ等の産生するＬＤ７８ポリペプチドを抗原として認識するモノクローン抗体に関するものである。
【００１３】
本発明のモノクローン抗体は、炎症の生じていない正常な組織あるいは細胞では、病巣部位に比べてその部位での認識は極端に弱い。自己免疫疾患病巣部位は、いずれも抗原となり得るが、特に治療および診断の観点から好ましい病巣部位の抗原としては、腸管リンパ球、腸管上皮内リンパ球（ＩＥＬ）あるいは関節滑膜リンパ球、甲状腺、末梢血等を挙げることができる。さらに、本発明のモノクローン抗体は、ＨＨ以外の疾患例えば再生不良性貧血（ＡＡ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭｏＬ）、急性骨髄単球性白血病（ＡＭＭｏＬ）、および特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、鉄欠乏性貧血（ＩＤＡ）等の骨髄穿刺液組織切片での認識は極端に弱い。ＨＳ疾患（ＶＡＨＳ，ＲＨＳ，ＦＨＬ）の単球・マクロファージ等が産生するＬＤ７８ポリペプチドは、いずれも抗原となり得るが、好ましい抗原としては、肝臓、脾臓、リンパ節、骨髄、末梢血等の単球・マクロファージ等が産生するＬＤ７８を挙げることができる。
【００１４】
本発明のモノクローン抗体は、抗ＬＤ７８ポリペプチド抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞から産生することができる。この製造方法について更に詳しく述べると、まず遺伝子組換え技術を用いて作製した組換えＬＤ７８ポリペプチド（例えば酵母を宿主としての組換えタンパク質の生産）を動物に感作する。感作された動物においても、その種に特異的なＬＤ７８ポリペプチドの存在があるため、この１回の感作では、目的とする抗体を産生する感作細胞を得難い。そこで、本発明者等はヒトＬＤ７８ポリペプチドと感作される動物の有するＬＤ７８ポリペプチドと相同性の認められない２箇所の領域に対するタンパク質を合成し、これらを続けて動物に感作する。このようにして感作された動物の脾臓（他に胸腺、末梢リンパ節、末梢血等）より感作細胞を単離して抗ＬＤ７８ポリペプチド抗体産生細胞を得、これをミエローマ（Ｍｙｅｌｏｍａｃｅｌｌ）と融合させ、抗体産生性融合細胞（Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ）を得る。この融合細胞を複数のウェルに分注し、培養し、各ウェルのその上清を酵素抗体法等の手段により分析し、組換えＬＤ７８ポリペプチドおよび天然型ＬＤ７８ポリペプチドと特異的に結合するモノクローン抗体を製造することができる。
【００１５】
ところで、このモノクローン抗体は自己免疫疾患、例えば潰瘍性大腸炎やクローン病あるいはＨＨ例えばＨＳの進展を測定する反応試薬として用いることができるものである。すなわち、この抗体の認識する抗原のあるものは、その一部が血液中に流出するので、その場合、採取した血清中のその流出抗原をモノクローン抗体を反応試薬として、例えば酵素、放射性同位元素、蛍光物質等の標識物質を結合せしめた種々の免疫測定法、例えば酵素免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）等により定量することにより免疫異常疾患及びＨＨの進展度を測定することができる。このようにして、自己免疫疾患病巣部位あるいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質を抗原として得られる抗体産生細胞である抗ＬＤ７８ポリペプチドモノクローン抗体は、その１種または２種以上を用いることにより自己免疫疾患の反応試薬として使用される。
【００１６】
さらに、この抗体を予防もしくは治療に用いる場合、以下の機構が考慮され得る。モノクローン抗体を血管内に投与して病巣部との間に免疫複合体を形成させる。この複合体はそれ自体で白血球の遊走能があり、この複合体により補体が活性化され、それにより多核白血球（ＰＭＮ）、次いでマクロファージは自らのＦｃ受容体（ＦｃＲｅｃｅｐｔｏｒ）を介して複合体に結合することにより貪食機能が活性化される。この複合体を貪食したマクロファージがそのまま血中へ流出することにより、病巣部の退縮が起こり、免疫異常は治癒するものである。本発明によってもたらされる抗体、もしくは該抗体に由来しヒトへの投与が可能な形態へ誘導されたキメラ抗体等のヒト型化抗体を含有するヒト自己免疫疾患あるいはＨＨの予防・治療剤においては、有効成分としての当該抗ＬＤ７８ポリペプチドモノクローン抗体と公知の適当な賦形剤を組み合わせて予防・治療剤とすることができ、液状で使用することもできるし、好適な安定化剤と共に凍結乾燥して保存することも可能である。
【００１７】
【本発明の作用並びに効果】
抗自己免疫疾患病巣部位あるいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質に対する抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合細胞から得られ、自己免疫疾患病巣部位あるいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質を特異的に認識する本発明のモノクローン抗体は、正常な血管は認識せず、自己免疫疾患病巣、例えば潰瘍性大腸炎やクローン病の病巣部の腸管粘膜層またはＩＥＬ（粘膜上皮細胞間リンパ球）あるいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質を認識し、これらに特異的に結合することができるものである。従ってこのモノクローン抗体に標識物質を結合せしめて血管内に投与し、自己免疫疾患の部位、あるいはＨＨの単球・マクロファージ等が産生する物質、それら疾患の進展度を予測することが可能であり、また、血液中に流出されるＬＤ７８ポリペプチドを測定する体外診断薬としても利用できる。さらに、該モノクローン抗体と病巣部との間の免疫複合体は、それ自体、マクロファージの動員効果、ひいてはマクロファージの貪食機能の活性化を促し、炎症性腸疾患を初めとする自己免疫疾患の治療に有効なものである。なお、本発明で提供されるモノクローン抗体を産生する代表的なハイブリドーマは工業技術院生命工学工業技術研究所（生工研）に受託番号第１３５７２号（ＦＥＲＭＰ−１３５７２）として寄託されている。
【００１８】
本発明によってもたらされるモノクローン抗体は、自己免疫疾患特に潰瘍性大腸炎やクローン病を初めとする炎症性腸疾患並びにＨＨの免疫組織学的鑑別あるいは血液診断等に特に有用である。また、自己免疫疾患の予防および治療への応用可能な抗体である。
【００１９】
以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何等これらに限定されるものではない。
【００２０】
【実施例】
試験例
（潰瘍性大腸炎モデルマウス由来腸間膜リンパ球中でのＬＤ７８の検出）
６〜１０週令のＢＡＬＢ／ｃマウスに５％デキストラン硫酸塩水溶液（ＤＳＳ）を自由飲水投与し、潰瘍性大腸炎モデルマウスを作出した（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１９９０，９８：６９４−７０２）。ＤＳＳ投与後、２日毎に８日目までのモデルマウスの腸管膜リンパ節リンパ球を採取し、ＲＮＡをグアニジウムチオシアネート法（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，１９８９：７．１８−７．２２）により調製した。調製したＲＮＡを基に、ＲＴ−ＰＣＲ法（ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，１９９０：２１−２７）にてマウスＬＤ７８の検出を行なった。その結果、２日目からマウスＬＤ７８の発現が確認され、その発現量は病変の進行と共に増加していた。このことより、ＬＤ７８の発現が潰瘍性大腸炎を初めとする各種自己免疫疾患に関与していることが解明された。
【００２１】
上記ＲＴ−ＰＣＲ法に使用したプライマーの塩基配列（サワディーテクノロジー社製）は以下に示す。

【００２２】
実施例１
（モノクローン抗体の調製）
抗原の調製
（１）組換えＬＤ７８ポリペプチドの調製
特開平３−２２８６８３「生理活性ペプチドＬＤ７８α、ＬＤ７８βおよびその製法、これに用いる組換えプラスミド」の明細書中に記載された方法により調製した。以下に、簡単にその調製法を記載する。
【００２３】
ヒトＬＤ７８α遺伝子およびＬＤ７８β遺伝子を組み込んだプラスミドを構築した。続いて、このプラスミドにより形質転換された組換え酵母を培養することにより、目的とする組換えＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドを大量に製造する方法を確立した。すなわち、形質転換酵母を酢酸アンモニウムの存在下で培養し、培養後、その培養上清中に分泌されたＬＤ７８α及びＬＤ７８βポリペプチドが集積される。そこで、酵母菌培養上清を分画分子量１０，０００の限外濾過膜（ミリポア社）を用いてＬＤ７８ポリペプチドの濃縮・回収を行なった。更に、陰イオン交換カラム（ファルマシア社）を用いて精製した後、凍結乾燥を行ない、目的の組換えＬＤ７８ポリペプチドを得た。これを免疫用抗原及びアッセイ用抗原として用いた。
【００２４】
（２）合成ペプチドの作製
ＬＤ７８αのアミノ酸配列第１３〜３３番目に対応する合成ペプチド（ＦＳＹＴＳＲＱＩＰＱＮＦＩＡＤＹＦＥＴＳＳ；ＬＤ−１）および第５０〜７０番目に対応する合成ペプチド（ＶＣＡＤＰＳＥＥＷＶＱＫＹＶＳＤＬＥＬＳＡ；ＬＤ−２）を免疫抗原及びアッセイ用抗原として使用した。
【００２５】
上記ペプチドの化学合成にはＡＢＩ４３０Ａペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシステム社）のＭＡＰＳ（４−ｂｒａｎｃｈ）法を用いた。その結果、粗生成物が得られ、ＴＦＭＳＡ法によりレジンからペプチドを切り出した後、逆相高速液体クロマトグラフィー（逆相ＨＰＬＣ）による精製を行なった。逆相ＨＰＬＣによる精製を３回繰り返し、得られたピーク画分を集め、アミノ酸分析を行なった結果、ＬＤ７８αのアミノ酸組成と一致したことより、所望の上記配列を有するＬＤ７８の合成ペプチドと断定した。得られた合成ペプチド（ＬＤ−１，ＬＤ−２）を凍結乾燥し、免疫用抗原及びアッセイ用抗原として用いた。
【００２６】
（３）マウスの免疫感作
一例として、前記で調製した組換えＬＤ７８ポリペプチド及び合成ペプチドによる免疫感作を以下に示す。
【００２７】
４〜８週齢のＣ３Ｈ／ＨｅＮマウス群を使用した。初免疫感作は腹腔内経路でフロイント完全アジュバント存在下で組換えＬＤ７８ポリペプチド２０μｇを１回接種した後、３週後に腹腔内経路で合成ペプチド２０μｇをフロイント不完全アジュバント存在下で１回免疫する。その２週後にフロイント不完全アジュバント存在下で腹腔内経路で合成ペプチド２０μｇを免疫した。その２週後に静脈内経路で合成ペプチド２０μｇを接種した。
【００２８】
（４）細胞融合及びハイブリドーマの培養
最終免疫の３日後に、常法によりマウスから脾臓細胞を採取した。
脾臓細胞をミエローマ細胞ｐ３Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１と細胞数５対１の割合で混合して、遠心処理（１，２００ｒ．ｐ．ｍ．／５分）して上清を除き、沈澱した細胞塊を充分ほぐした後、攪はんしながら、１ｍｌの混合液（ポリエチレングリコール−４０００（２ｇ），ＭＥＭ（２ｍｌ），ジメチルスルホキシド）を加えた。５分間３７℃にてインキュベートした後、液の全量が５０ｍｌになるようにゆっくりとＭＥＭを加えた。遠心分離後（９００ｒ．ｐ．ｍ．／５分）、上清を除き、ゆるやかに細胞をほぐした。これに正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地に牛胎児血清１０％を加えたもの）１００ｍｌを加え、メスピペットを用いてゆるやかに細胞を懸濁した。
【００２９】
懸濁液を２４穴の培養プレートに分注し（１ｍｌ／穴）５％の炭酸ガスを含む培養器中で、温度３７℃で２４時間培養した。次に、１ｍｌ／穴のＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン（１×１０^−４Ｍ），チミジン（１．５×１０^−３Ｍ）及びアミノプテリン（４×１０^−７Ｍ））を加え、さらに２４時間培養した。その後、２日間、２４時間毎に、１ｍｌの培養上清を同量のＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除く）と交換し、前記と同様にして１０〜１４日間培養した。
【００３０】
コロニー状に生育した融合細胞（約３００個）の認められたそれぞれの穴について、１ｍｌの培養上清を同量のＨＴ培地と交換し、その後、２日間、２４時間毎に、同様の交換を行なった。ＨＴ培地で３〜４日培養した後、培養上清の一部を採り、以下に述べるスクリーニング法にて目的のハイブリドーマを選別した。
【００３１】
（５）ハイブリドーマのスクリーニング
目的のハイブリドーマの選別には下記のＥＩＡ法、ウエスタン・ブロット法を組み合わせて行なった。
【００３２】
▲１▼ ＥＩＡ法
９６穴のマイクロテストプレートに前記のごとく作製した合成ペプチド抗原、もしくは精製組換えポリペプチド（蛋白質濃度２μｇ／ｍｌ）を１００μｌ／穴で加え、４℃で一晩インキュベートすることにより固相化した。さらに、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）溶液１５０μｌを加え、同様にインキュベートしてマスキングを行なった。このようにして作製した抗原固相化プレートに細胞融合法によって得られたハイブリドーマおよびクローニング後のハイブリドーマの培養上清を加えて、４℃で１．５時間インキュベート後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液（カッペル社製、５，０００倍希釈）を１００μｌ／穴加えた。４℃で１時間インキュベート後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳにて５回洗浄し、その後ＴＭＢＺ基質溶液を加え、常法により発色させ、その吸光度を波長４５０ｎｍにて測定した。こうして組換えヒトＬＤ７８ポリペプチドもしくは合成ペプチドと強く反応するハイブリドーマクローンを選択した。
【００３３】
▲２▼ ウエスタン・ブロッティング法
組換えＬＤ７８ポリペプチド或いは天然型ＬＤ７８（ＨＴＬＶ−１感染Ｔ細胞株の培養上清より精製したもの；精製法は組換えＬＤ７８ポリペプチド精製法と同様）を２０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動し、ゲル中のＬＤ７８ポリペプチドをニトロセルロース膜上に移行させ、膜を０．４〜０．５ｃｍ幅に切断した。各細片をハイブリドーマ培養上清液に浸し、一晩インキュベートした。その後、細片をＰＢＳで３回洗浄した後、ビオチン標識抗マウスＩｇＧ（ＴＡＧＯ社製）の１：７５０希釈液中で２時間保温した。細片をＰＢＳで３回洗浄後、西洋わさびペルオキシダーゼを結合させたアビジン（シグマ社製）（１：１０００希釈）に浸し、１時間保温した。ＰＢＳで３回洗浄後、４−クロロ−１−ナフトールを用いる発色試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）で発色させ、ＬＤ７８ポリペプチドの発色バンドを示すハイブリドーマを選びクローニングした。クローニング後のハイブリドーマクローンについても同様の手法で選別した。上記の選別方法によって所望のモノクローン抗体を産生するハイブリドーマ（λ７８δ）株が得られた。
【００３４】
（６） λ７８δ株によるモノクローン抗体の製造
プリスタン処理した８週齢のＢＡＬＢ／ｃ＊Ｃ３Ｈ／ＨｅＮＦ１雌マウスに前記実施例で得られたハイブリドーマλ７８δ株の５×１０^６個／匹を各々のマウスの腹腔内に投与した。１０〜２１日目後に、腹水癌が誘発された。マウスから腹水を採り、３０００ｒ．ｐ．ｍ．／５分の遠心処理により固形成分を除去した後、アフィゲルプロテインＡＭＡＰＳ−ＩＩキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにて精製した。
【００３５】
実施例２
（λ７８δ抗体の性状解析）
（１）抗体の特性
得られた抗体λ７８δのアイソタイプ、サブクラスの決定は各種抗マウスイムノグロブリンサブクラス抗体を吸着させたマイクロプレートを用いたＥＬＩＳＡ法で同定することができ、その結果ＩｇＧ１，κであることが判明した。また、ゲル電気泳動、並びに等電点電気泳動による解析の結果、分子量約１５万ダルトン、等電点（ｐＩ）は６．７であることが判った。
【００３６】
（２）合成ペプチドとの反応性
得られた抗体の反応性を各種合成ペプチド、ＬＤ−１及びＬＤ−２の合成ペプチドを使用して確認した。方法は前述したハイブリドーマのスクリーニングの（１）ＥＩＡ法の項に示した。図１に示すように、λ７８δ抗体は、ＬＤ−１ペプチドとは反応しないが、ＬＤ−２ペプチドと強く反応する抗体であることが示された。
【００３７】
（３）天然型ＬＤ７８及び組換えＬＤ７８ポリペプチドとの結合特性（ウエスタン・ブロッティング法）
λ７８δ抗体の天然型及び組換えＬＤ７８ポリペプチドとの反応性を調べる為に、ウエスタン・ブロッティングを行なった。方法は前述したハイブリドーマのスクリーニングの▲２▼ウエスタン・ブロッティング法の項に準じた。Ａのストリップは陽性コントロールとして組換えＬＤ７８免疫ヤギ抗血清を用いたが、この部分にＬＤ７８のバンドが観察された。Ｂのストリップは、組換えＬＤ７８及び天然型ＬＤ７８ポリペプチドと結合し、ＬＤ７８ポリペプチドの生理活性を阻害する能力を有するλ７８δモノクローン抗体を用いている。これにより、本発明に基づくλ７８δ抗体は、明確に天然型及び組換えＬＤ７８ポリペプチドを認識していることが判明した（図２）。
【００３８】
実施例３
（潰瘍性大腸炎患者生検サンプルのλ７８δ抗体による免疫組織染色）
潰瘍性大腸炎患者患部組織（滋賀医科大学第二内科より入手）を内視鏡的生検後、λ７８δ抗体を用いて免疫組織染色を行なった。生検組織をホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋した。ミクロトームにより、包埋した組織を薄切し、次に示す方法にて免疫組織染色を行なった。λ７８δ抗体を１μｇ／ｍｌ濃度にて、３７℃、１時間インキュベートした後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて３回洗浄した。続いて、第二抗体として５００倍希釈したビオチン標識抗マウスＩｇＧ抗体（ＤＡＫＯ社製，ＣｏｄｅＮｏ．；Ｅ３５４）と３７℃、１時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０溶液にて３回洗浄した後、１０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン（ＤＡＫＯ社製；ＣｏｄｅＮｏ．Ｐ３９７）と３７℃、１時間インキュベートした。その後、発色基質ＡＥＣ（ＤＡＫＯ社製，ＣｏｄｅＮｏ．；Ｋ６９７）にて組織切片を染色した。
【００３９】
その結果、図３に示すように、λ７８δ抗体は潰瘍性大腸炎患者患部凍結組織切片中の腸間リンパ球、腸管上皮内リンパ球（ＩＥＬ）等との反応性を示した。図（図面代用写真）中、白枠矢印で示される部分が染色された反応部位である。一方、同患者中の非患部においてはλ７８δ抗体との反応は認められなかった。この点からも、明らかにＬＤ７８が潰瘍性大腸炎を初めとする炎症性腸疾患を含む各種自己免疫疾患に関与していることが、実際のヒト患者の組織を用いて、本発明の抗体を用いることによって初めて解明された。
【００４０】
実施例４
（潰瘍性大腸炎およびクローン病患者末梢血血清中のＬＤ７８ポリペプチドの検出）
潰瘍性大腸炎及びクローン病患者末梢血血清（滋賀医科大学第二内科より入手）及び健常人末梢血血清をλ７８δ抗体を用いて、血清中のＬＤ７８ポリペプチドの検出を行なった。
血清サンプルをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）にて５倍〜５０倍に希釈したものをニトロセルロース膜上にスロットブロットあるいはドットブロットした。フィルターを風乾後、１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中で、３７℃で１時間インキュベートする。その後、λ７８δ抗体をＰＢＳで５０μｇ／ｍｌに調製した溶液中で、３７℃で、１時間インキュベートした。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで３回洗浄し、ペルオキシダーゼ標識抗マウス免疫グロブリン抗体溶液（カッペル社製、３０００倍希釈）中で、３７℃、１時間インキュベートした。その後０．１％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳで５回洗浄し、その後、ＤＡＢ基質溶液を加え、常法により発色させた（図４）。
その結果、健常人末梢血血清中では、いずれのサンプルもＬＤ７８ポリペプチドが検出されなかったのに対して、潰瘍性大腸炎及びクローン病患者血清中では全てのサンプルにおいてＬＤ７８ポリペプチドが検出された。この点より、自己免疫疾患例えば潰瘍性大腸炎やクローン病患者の末梢血血清中のＬＤ７８ポリペプチドを検出することで、これら疾患の診断を行なえ得ることが、本発明により初めて明らかにされた。
【００４１】
実施例５
（ＨＳ患者骨髄穿刺液組織切片サンプルのλ７８δ抗体による免疫組織染色）
ＶＡＨＳ、ＲＨＳ、ＦＨＬ、ＡＡ、ＣＭＭｏＬ、ＡＭＭｏＬ、ＩＴＰ、ＩＤＡの患者骨髄穿刺液組織切片を用い、実施例３において記載した方法により、免疫染色を行なった（図５並びに図６）。また、ＲＨＳでは上記の組織切片の他に剖検で得られた肝、脾、リンパ節、骨髄も同様に染色した。
その結果、ＡＡ、ＣＭＭｏＬ、ＡＭＭｏＬ、ＩＴＰ、ＩＤＡの患者サンプルの単球、芽球ではほとんど染色されなかったのに対し、各ＨＳ患者サンプルでは単球、マクロファージ及び大型の単球様細胞等が強く染色された。また、ＲＨＳの肝及びリンパ節では、類洞部（ｓｉｎｕｓｏｉｄ）に著明なマクロファージの浸潤を認め、これも強く染色された。図（図面代用写真５、６）中、白枠矢印で示される部分が染色された反応部位である。一方、同患者中の非患部においてはλ７８δ抗体との反応は認められなかった。
これらの点より、明らかに、各種ＨＳを初めとするＨＨ疾患において、血球貪食やサイトカイン異常高値に単球、マクロファージ等の細胞自身の産生するＬＤ７８が関与していることが、実際のヒト患者の組織を用い、本発明の抗体を用いることで初めて解明された。
【００４２】
以上のように、λ７８δ抗体を各種自己免疫疾患あるいはＨＨの診断に応用することが可能であることが判った。診断法としては、例えばフローサイトメトリー法、ウェスタン・ブロット法、ＥＩＡ法、ＲＩＡ法、患者組織を用いての免疫染色法であるｈｉｓｔｏ−ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法等が好適に適用される。
【００４３】
実施例６
（生理活性阻害効果測定法）
３．５ｃｍのシャーレ（ファルコン社）で、ヒト骨髄単核細胞［Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ７６，５０１−５０７（１９９０）］３×１０^５個を、１．２％メチルセルロース及び１０％牛胎児血清を含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｅｄｉｕｍ）培地（ＧＩＢＣＯ社）（６０μｇ／ｍｌカナマイシン、２ｍｍｏｌ／ＬＬ−グルタミン、５０μｍｏｌ２ーメルカプトエタノール、２ｎｇ／ｍｌヒトインターロイキン３含有）中で、５％ＣＯ_２の存在下、１０日間培養すると、約４００個のコロニーが形成される。この系に、１００ｎｇ／ｍｌの天然型もしくは組換えＬＤ７８ポリペプチドを添加して培養する。その際、更にλ７８δ抗体を添加しておく。
【００４４】
その結果を表１に示す。培養１０日目に形成される顆粒球マクロファージのコロニーを計測すると、１００ｎｇ／ｍｌ以上のＬＤ７８を添加した場合は、ＬＤ７８無添加に比べて、コロニー数の顕著な抑制が観察される（Ｊｐｎ．Ｊ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．，８３，４９９−５０４，１９９２）。一方、λ７８δ抗体及びＬＤ７８を添加した場合は、ＬＤ７８による骨髄単核細胞の顆粒球、マクロファージのコロニー形成の減少は認められない。従って、λ７８δ抗体にはＬＤ７８の生理活性を阻害する特性を有していることが示された。
【００４５】
【表１】

【００４６】
以上のように、λ７８δ抗体の有する生体中で自己免疫疾患に起因しているＬＤ７８ポリペプチドの生理活性を阻害する作用により、自己免疫疾患の治療の可能性が示される。
【００４７】
【配列表】

【００４８】
【配列表】

【００４９】
【配列表】

【００５０】
【配列表】

【００５１】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明によるモノクローン抗体（λ７８δ抗体）の性状解析に用いた合成ペプチド（ＬＤ−１，ＬＤ−２）との反応性を示す図である。
【図２】本発明によるモノクローン抗体（λ７８δ抗体）の天然型および組換えＬＤ７８ポリペプチドとの反応性を示す図である。各抗体の初期濃度は５０μｇ／ｍｌである。
【図３】本発明によるモノクローン抗体（λ７８δ抗体）の潰瘍性大腸炎患者生検サンプルとの反応性を示す生物の形態図（図面代用写真）である。
【図４】本発明によるモノクローン抗体（λ７８δ抗体）の潰瘍性大腸炎及びクローン病末梢血サンプルとの反応性を示す図である。
【図５】本発明によるモノクローン抗体（λ７８δ抗体）のＶＡＨＳおよびＦＨＬ患者生検サンプルとの反応性を示す生物の形態図（図面代用写真）である。
【図６】本発明によるモノクローン抗体（λ７８δ抗体）のＲＨＳ患者生検サンプルとの反応性を示す生物の形態図（図面代用写真）である。

Claims

生物学的試料中に存在するＬＤ７８ポリペプチドを測定することを特徴とする、潰瘍性大腸炎およびクローン病より選ばれる難治性炎症性腸管障害の検出方法。
生物学的試料中のＬＤ７８ポリペプチドを測定するにあたり、当該ＬＤ７８ポリペプチドに結合性を有するモノクローン抗体を利用する、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、免疫比濁法および免疫拡散法より選択される測定方法により構成される請求項１に記載の方法。
生物学的試料中に存在するＬＤ７８ポリペプチドを測定することを特徴とする、血球貪食性組織球食作用（Hemophagocytic Histiocytosis;以下、ＨＨと称することがある）に起因する疾患の検出方法。
生物学的試料中のＬＤ７８ポリペプチドを測定するにあたり、当該ＬＤ７８ポリペプチドに結合性を有するモノクローン抗体を利用する、酵素免疫測定法、放射免疫測定法、ウェスタンブロット法、凝集法、免疫比濁法および免疫拡散法より選択される測定方法により構成される請求項３に記載の方法。