MXPA04007262A

MXPA04007262A - Anticuerpos monoclonales humanos para antigeno de membrana especifico de prostata (psma).

Info

Publication number: MXPA04007262A
Application number: MXPA04007262A
Authority: MX
Inventors: T Tino William
Original assignee: Medarex Inc
Priority date: 2002-01-28
Filing date: 2003-01-28
Publication date: 2004-10-29
Also published as: EP1519747A2; WO2003064606A2; AU2003224604B2; NZ534687A; WO2003064606A3; EP1519747A4; KR20040077889A; CA2474616A1; CN1652821A; JP2005518789A; BR0307216A

Abstract

Se divulgan anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen a PSMA, y composiciones y moleculas basadas en anticuerpos relacionadas. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos en un animal transgenico no humano, por ejemplo, un raton transgenico, que puede producir multiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos mediante el hecho de ser sometidos a recombinacion V-D-J- y cambio de isotipo. Se divulgan tambien composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos humanos, animales transgenicos no humanos e hibridomas que producen los anticuerpos humanos, asi como metodos terapeuticos y de diagnostico para utilizar los anticuerpos humanos.

Description

ANTICUERPOS MONOCLOMALE3 HUMANOS PARA ANTiGENO DE MEMBRANA ESPECÍFICO DE PRÓSTATA (PSMA) SOLICITUDES ??nA TONADAS La presente solicitud reclama prioridad sobre la solicitud de utilidad norteamericana No. de Serie 10/059, 9"89 presenta el día 28 de enero de 2002 que es una continuación en parte de la solicitud internacional PCT /USGO/20247 presentada el día 26 de julio de 2000 que reclama prioridad sobre" lar- solicitud provisional norteamericana No. de serie 60/146,285 presentada el 29 de julio de 1999, solicitud provisional norteamericana No. de serie 60/158, 759 presentada el día 12 de octubre de 1999 y solicitud provisional norteamericana No. de serie 60/188,087 presentada el dia 9 de marzo de 2000. El contenido entero de cada una de estas solicitudes se incorpora aquí por referencia . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer de próstata es na cansa importante de morbilidad y mortalidad entre ios hombres. Los tratamientos del cancer. de próstata incluyen intervención quirúrgica, ormonas, radiación y quimioterapia. Existen pocos tratamientos eficaces para una enfermedad prostética metastásica. Por consiguiente/ la identificación de genes y/o productos góni ce que representa44"1 marcadores de diaqnóstico y pronóstico asi coroo blancos para terapia es esencial. El antigeno esOecifico de próstata (PSA) es un marcador de cáncer de este tipo que es útil en el diagnóstico clínico y determinación de la etapa de cáncer de próstata. Sin embargo, PSA no puede diferenciar la hiperplasia prcstatica benigna (BPH) de prostatitis o cáncer de próstata en el rango de 4-10 5 ng/ml, requiriendo por consiguiente - de u » evaluación psicológica y/o histológica para confirmar el diagnóstico correcto ..(Barren, R.J. y colaboradores (1998) Prostate ~ 1»CO..1a.0(J1j_.1x0O OO.A/. . El antigeno de membrana especifico para próstata (PSMA) es 10 una glicoproteina de transmembrana de tipo II de 750 aminoácidos de aproximadamente 110 kD que tiene una homología del 54% con el receptor para transferina. PSMA tiene 3 dominios estructurales, incluyendo un dominio intracelular de 19 aminoácidos, un dominio de transmemi rana de 24 aminoácidos 15 y un dominio extracelular de 707 aminoácidos. La proteína de PSMA despliega una actividad neurocarboxipeptidasa y folato hidrolasa y se reporta que participa en la regulación neuroendocrina del .^crecimiento de_ la próstata y diferenciación (Heston, W.D. (1996) Urologe-Ausgabe A. 20 35:400-407). PSM'' es una forma alternativamente empalmada de PSMA que se localiza en el citoplasma. PSMA es expresado predominantemente por células epiteliales prostéticas. La expresión de PSMP es incrementada en cáncer de próstata, especialmente en carcinomas refractarios a ~2~5 hormonas, metastásico s~, poco" dírerenciados tGregorakis; A K. y colaboradores (1998) Seminars in Urologic Oncoiogy [Seminarios en oncología urológica] 16:2-12; Silver, D. A. (1997) Clinical Cáncer Research 3:31-85) . Una expresión de bajo nivel de PSMA se observa en tejidos extraprostáticos como por ejemplo intestino delgado, glándula salivaría, mucosa duodenal, túbulos renales próximos y cerebro (Silver, D. A. (1997) Clinical Cáncer Research 3:81-85). PSMA es también expresado en cé~l"ula3''~~endote:biales de vasos capilares en áreas peritumorales y endotumorales de ciertas malignidades, incluyendo carcinomas de células renales y carcinomas de colon, pero no en vasos sanguíneos de tejidos normales. Además, se reporta que PSMA se relaciona con la angiogénesis tumoral (Silver, D. A. (1997) Clinical Cáncer Research 3 : 81-85) . Por consiguiente, PSMA representa un blanco valioso para el tratamiento de cáncer de próstata y varias otras enfermedades caracterizadas por la expresión de PSMA. COMPENDIO DE LA INTENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos moncclonaies humanos aislados que se unen a antígeno de membrana específico para próstata (PSMA) de ser humano, así como inmunoconj ?.gados , moléculas bi específicas y otras composiciones terapéuticas que contienen tales anticuerpos solos o en combinación con agentes terapéuticos adicionales. En particular, anticuerpos humanos de la presente invención se unen a un e itopo de proteina nativa en PSMA de ser humano (por ejemplo, un epitopo localizado en el dominio excraceiuiar de PSMA de ser numanc) e mliioe el creciiuieri c y/o median la muerte de células que expresan PSMA (por ejemplo, mediante lisis o fagocitosis) -=en presencia de células efectoras humanas, como, por ejemplo, células polimorfonucleares , monocitos, macrófagos . y células ciend i c s . Por consiguiente, los anticuerpos pueden ser utilizados en varios métodos para diagnosticar, tratar y/o prevenir enfermedades relacionadas con la expresión de PSMA, especialmente tumores y cánceres que expresan PSMA, como por ejemplo cáncer de próstata, cáncer de colon y carcinoma renal . Anticuerpos humanos aislados de la presente Invención 5 incluyen varios isotipos de anticuerpo, como por ejemplo IgGl, (por ejemplo IgGlk), IgG2, IgG3, IgG4, IgV. IgAl, IgA2, IgAsec, IgD e IgE. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos de longitud completa (como por ej.empJ-O IgGl ó IgG3) o bien pueden incluir solamente una porción de enlace con antigeno ü (como por ejemplo, un Fab, F(ab')2, Fv, o un fragmento Fv de cadena sencilla) . Anticuerpos terapéuticos particulares de la presente invención incluyen anticuerpos monoclonales humanos (HuMAb) . , ^ --, uúx ovillO Llouc OS 5 fuñcTbnalmente equivalentes que, por ej emplo, ( a ) son codificados por ácidos nucleicos de cadena pesada de ser humano y de cadena ligera de ser humano que comprenden secuencxas de núcleotidos en sus regiones variables GC conformidad con lo establecido en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 ó 9 y SEQ ID NOS : 2, 4, 6, 8 ó 10, respectivamente, y modificaciones conservadoras de las mismas, y/o (b) incluyen regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera que comprenden las secuencias de aminoácidos establecidas en SEQ ID NOS: 11, 12, 13, 14 ó 15 y SEQ ID NOS: 16, 17, 18, 19 ó 20, respectivamente, y modificaciones conservadoras de las mismas . Otros anticuerpos humanos particulares de la presente invención incluyen los que comprenden un dominio de CDR que tiene una región CDRl de cadena pesada y de cadena ligera de ser humano, una región CDR2 de cadena pesada y de cadena ligera de ser humano, y una región CDR3 de cadena pesada y de cadena ligera de ser humano, en donde (a) las CDRl, CDR2 y CDR3 de las regiones de cadena pesada de ser humano comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 mostradas en la Figura 19 (SEQ ID NOS: 21-35), y modificaciones de secuencias conservadoras de las mismas y (lo) las CDRl, CDR2 y CDR3 de Tas regiones de cadena ligera de ser humano comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos. ae regiones CDR1, CDR2 y CDR3 mostradas en las Figuras 22 y 23 (SEQ ID NOS: 36-50), asi como-" modificaciones de secuencias conservadoras de -las mismas. Otros anticuerpos particulares de la invención incluyen anticuerpos monocionaies húmanos que~~se unen con un epítopo definido por el anticuerpo 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 o 16F9 y/o que compiten para enlace con PSMA con anticuerpo 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 o 16F9, o bien que tienen otras características de unión funcionales presentadas por el anticuerpo 4A3, 7F12, 8A1Í, 8C12 o 16F9. Tales anticuerpos incluyen, por ejemplo, los que se unen con PSMA con una constante de disociación (Kc) de 10"' M o menos, como por ejemplo 10"" M o menos, 10_a M o menos, 10'"10 M o menos, o hasta inferior (por ejemplo 10"11 M o menos) . ai^s anfirnpr-pos incluyen adicionaimente los que reaccionan de manera cruzada- con anticuerpo anti-PSMA de murino 3C6 (Número de Acceso ATCC HB 12491), pero no presentan reactividad cruzada con anticuerpos anti-PSMA de murino 4D4 (Número de Acceso ATCC HB 12493) o 1G9 (Número de En otro aspecto H la invención,, los anticuerpos anti-PSMA de ser humano son derivados, enlazados con otra molécula funcional o bien co-expresados con otra molécula funcional, / como por ejemplo, otro péptido o proteína (por ejemplo, un fragmento Fab' ) . Por ejemplo, un anticuerpo o porción enlace con antigeno de la invención puede estar unido funcionalitiente (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra raanera)~-con una o- varias otras entidades moleculares, como por ejemplo otro anticuerpo (por ejemplo, para producir un anticuerpo biespecífico o muiriespecifico) , una citotoxina, un ligando ceiiilar o un antígeno. Por consiguiente, la presente invención abarca una gran variedad de conjugados de anticuerpos, moléculas biespecíficas y multiespecíficas, así como proteínas de fusión, todas las cuales se unen con células que expresan PSMAy que enfocan otras moléculas a las células, o bien que se unen con 13MA y con otras moléculas o células. En una modalidad particular, la invención incluye una molécula biespecífica o multiespecí fica que comprende por lo meno.s una especificidad de enlace para PS A que es un anticuerpo anti-PSMA humano (o fragmento mimético del mismo) y una segunda especificidad de enlace para un receptor Fe, por ejemplo, un receptor FcyRI de ser humano o Fea de ser humano, u otro antígeno o una célula de presentación de antígeno . (APC) . La segunda especificidad de enlace puede ser también n anticuerpo o fragmento del mismo (por ejemplo, un Fab, Fab', F(ab') , Fv, o un Fv de cadena sencilla), como por ejemplo un anticuerpo humano o una porción del mismo, o bien un anticuerpo quimérico" o "humanizado" o una porción de3 mismo (por ejemplo, que tiene una región variable, o por lo men Ó una región de determinación de complementarxedad (CDR) , que se deriva de un anticuerpo no humano (por ejemplo, murino) con la porción restante (las porciones restantes) siendo de origen humano. Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecificas" y" multiespecifreas que se unen tanto a FSMA de ser humano como a un receptor Fe, por ejemplo, un receptor de IgG de ser humano, por ejemplo un receptor Fc-gamma (FcyR) , como por ejemplo FcyRI (CD64), FcyRII (CD32), y FCYRIII (CD16) . Otros receptores Fe, tales como receptores de IgA de ser humano (como por ejemplo FcaRI) , pueden también ser enfocados. El receptor Fe se localiza preferentemente en la superficie de una célula efectora, como por ejemplo, un monocito, macrófago o una célula polimorfonuclear activada. En una modalidad preferida, las moléculas biespecificas y multiespecificas se unen a un receptor Fe en un sitie que es distinto del sitio de enlace de Fe de inmunoglobulina (por ejemplo IgG ó IgA) del receptor. Por consiguiente, la unión de las moléculas biespecificas y multiespecificas no es bloqueada, por niveles fisiológicos de inmunoglobulinas . En otra modalidad, la presente invención ofrece un inmunoco ug'ado, por ejemplo, una mmunotoxina, que incluye üñ anticuerpo anti-PSMA totalmente humano conjugado con un agente terapéutico, como por ejemplo, un fármaco citotóxlco, una toxina enzimáticamente activa, o un fragmento del mismo, un radioisótopo o un fármaco anci-cáncer de molécula pequeña. Alternativamente., anticuerpos humanos de la presente invención pueden ser co-administrados" con tales agentes terapéuticos y citotóxicos, pero no enlazados a ellos. Pueden ser co-administrados simultáneamente con tales agentes (por ejemplo, en una sola composición o "Separadamente! o bien pueden ser administrados antes o después de administración de tales agentes. Tales agentes pueden incluir agentes quimioterapéuticos tales como doxorubicina ( adriamicina) , sulfato de cisplatina bleomicina, carmustina, clorambucilo, ciclofosfamida hidroxiurea y combinaciones de los mismos. Anticuerpos humanos de la presente _nvención pueden también ser administrados en combinación con una terapia con radiación . En otra modalidad, la presente invención ofrece composiciones, por ejemplo, composiciones/ kits de diagnóstico y farmacéuticos, que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y por lo menos un anticuerpo anti-PSMA de ser humano o una porción de enlace con antígeno del mismo. En una modalidad- la composición comprende una combinación de anticuerpos humanos o porciones de enlace con antígeno de los mismos, preferentemente cada uno de los cuales se une a un epítopo distinto. Por ejemplo" uña" composicioñ farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal humano que media la muerte altamente efectiva de células blanco en presencia de células efectoras puede ser combinado con otro anticuerpo monoclonal humano que inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA. Asi, la combinación proporciona terapias '"'múltiples adaptadas para proporcionar el máximo beneficio terapéutico. Composiciones, por ejemplo, composiciones farmacéuticas que comprenden una combinación de por lo menos un anticuerpo' anti-PSMA humano o una porción de enlace con antigeno del mismo y por lo menos una molécula biespecífica o multiespecifica de la invención, está también dentro del alcance de la presente invención. En otra modalidad, la presente invención ofrece un método para inhibir la proliferación y/o crecimiento de una célula que expresa PSMA y/o induce la muerte de una célula que expresa. PSMA, mediante la puesta en contacto de las células (por ejemplo per administración a. vn snj n) ron imo o Ara l s anticuerpos humanos de la invención —y/o composiciones terapéuticas relacionadas, derivados, etc. que contienen ios anticuerpos de conformidad con lo descrito arriba. En una modalidad particular, el método comprende la puesta en contacto de células que expresan PSMA ya sea in vitre o in vivo con un c varios anticuerpos anti-^SMA de ser humano de la invención en presencia de una célula efectora humana. El método puede ser empleado en cultivo, por ejemplo, in vi tro o ex vi ve, por ejemplo, cultivos que comprenden células que expresan PSMA y célalas efectoras) . Por ejemplo, una muestra que contiene células que expresan PSMA y células efectoras. Por ejemplo, una muestra que contiene células que expresan 5 PSMA y células efectoras puede ser -cultivada* in vi tro y combinada con un anticuerpo de la invención. Alternativamente, el método puede efectuarse en un sujeto, por ejemplo-," como parte de un protocolo m vi vo, por ejemplo terapéutico o profiláctico) . 10 Para su uso en tratamiento y prevención in vi vo de enfermedades mediadas por PSMA, anticuerpos humanos de la presente invención pueden ser administrados a pacientes (por ejemplo, sujetos humanos) en dosificaciones terapéuticamente efectivas (por ejemplo, para inhibir, eliminar o prevenir el 15 crecimiento de células que expresan PSMA) empleando cualquier vía de administración adecuada para productos clínicos basados en anticuerpos como se sabe bien en la técnica, como por ejemplo, mediante inyección o infusión. Por consiguiente, anticuerpos humanos de la presente 2U invención pueden ser utilizados para tratar y/o prevenir varias enfermedades caracterizadas por expresión de PSMA mediante la administración .de una dosificación adecuada (o serie de dosificaciones) de los anticuerpos a paciente que padecen de tales enfermedades. Ejemplos de enfermedades que ~2 pueden ser tratadas (por ejemplo, mejorar o prevenir) mediante el use de los métodos y composiciones de la invención incluyen, sin limitarse a estas enfermedades, cánceres, como por ejemplo cáncer de próstata, cáncer de colon, y carcinoma renal. En una modalidad particular' de la invención, el paciente puede ser tratado adicionalmente ... con un agente quimioterapéutico, radiación., o un agente que modula, por ejemplo incrementa la expresión o actividad de un receptor Fe, por ejemplo, un receptor FCOÍ O un receptor FCY, como por ejemplo una citocina. Citocinas. típicas para su administración durante el tratamiento incluyen factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , interferon-? (IFN-?) , y factor de necrosis tumoral (TNF) . Agentes terapéuticos típicos incluyen, entre otros, agentes anti-neoplásicos como por ejemplo doxorubicina (adriamicina) , sulfato de cisplatina bleomicina, carmustina, clorarbucilo, así como ciclofosfamida hidroxiurea .. En otra modalidad, la presente invención ofrece un método para la detección in vitro o in vivo de la presencia de P3MA o células que expresan PSMA, por ejemplo, para diagnosticar un enfermedad relacionada con PSMA. Esto puede lograrse, por ejemplo, mediante la puesta en contacto de una muestra a probar, opcionalmente junto con una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano de la invención (o bien una porción de enlace con antígeno del mismo) bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y i-'Gi-IA. .La ror acion de complejo es detectada e to ces (por ejemplo, mediante la utilización de ELISA) . Cuando se utiliza una muestra de control junto con la -muestra—de prueba, el complejo es detectado en ambas ¦ muestras y cualquier diferencias estadísticamente significativa en -la formación de co pl jos entre las muestras es ~??a indica^c on de ra presencia de PSMA en la muestra de prueba. En otro aspecto, la presente invención ofrece un animal no humano transgénico, como por ejemplo un ratón transgénico (se conoce también aquí como "ratón HuMAb") que expresa un anticuerpo monoclonal totalmente humano que se une a PSMA. En una modalidad particular, el animal no humano transgénico es un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de ser humano que codifica la totalidad o una parte de un anticuerpo anti-PSMA —de. la invención. . Para generar anticuerpos anti-PSMA humanos, el animal no humano transgénico puede ser inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno PSMA y/o células que expresan PSMA. Preferentemente, el animal no humano transqénico, por ejemplo, el ratón transgen: co, puede producir múltiples isotipos de anticuerpos monocionales humanos para PSMA (por ejemplo, IgC, Ga?~ /o IqW) m^dTañte" i <i sometimiento a reconciliación V-D-u y cambio de isotipo. Ei cambio de isotipo puede ocurrir, por ejemplo, mediante cambio de isotipo clásico o no clásico. Por consiguiente, en otra modalidad, la invención ofrece células B aisladas derivadas de un animal no humano transgénico de conformidad con lo descrito arriba, como por ejemplo, un ratón transgénico, que expresa anticuerpos anti-PSMA de- aer humano. Las células B aisladas pueden ser después — inmortalizadas por fusión con una célula inmortalizada para proporcionar una fuente (por ejemplo, un hibridoma) de anticuerpos anti-PSMA de ser humano. Tales hibridomas (es decir que producen anticuerpos anti-PSMA humanos) están también incluidos dentro del alcance de la presente invención . Como se presenta a título de ejemplo aquí, anticuerpos anti-PSMA humanos pueden ser obtenidos directamente de hibridomas que expresan el anticuerpo, o bien pueden ser clonados y expresados recombinantemente en una célula huésped, como por ejemplo transfectoma (por ejemplo, un transfectoma que consiste de células CHO inmortalizadas o células linfocíticas) . Por consiguiente, la presente invención ofrece métodos para la producción de anticuerpos monoclonales humanos que se unen a PSMA de ser humano. En una modalidad particular, el método incluye la inmunización de un animal no humano transgénico, como por ejemplo, üñ ratón transgénico, de conformidad con lo previamente descrito (por ejemplo, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser hum no y LUÍ transgen e cadena ligera de ser humane que codifica la totalidad o una parte de un anticuerpo anti-PSMA) , con una preparación purificada o enriquecida de antigeno PSMA de ser humano y/o células jgue expresan PSMA de ser humano. Células B (por- ejemplo células B esplénicas) del animai se obtienen entonces y se rusionan con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humanos contra PSMA. En otro aspecto adicional, la invención ofrece moléculas de ácido nucleico que codifican la totalidad o una parte de un anticuerpo anti-PSMA monoclonal humano (por ejemplo, que codifica por lo menos una cadena ligera o cadena pesada del anticuerpo) , asi como vectores de expresión recombinantes que incluyen tales ácidos nucleicos y células huéspedes transíectadas con tales vectores. Métodos para la producción de los anticuerpos mediante . cultivo., de tales células huéspedes están también dentro del marco de la presente invención. Ácidos nucleicos particulares proporcionados por la presente invención comprenden las secuencias de nucleótidos mostradas en SEO ID NOS: 1, 3, 5, 7 ó 9 y SEO ID NOS: 2, 4, 6, 8 ó 10, que codifican las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, anticuerpos humanos anti-PSMA (HuMAbs ) 4Á37~ F12 , ~8?G? ~^ 2 ?~^G6¥ .

Otras características y ventajas de la presente invención son aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos que no deben considerarse como limitativos. E contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas mencionadas en esta solicitud se incorporan expresamente aquí por referencia. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS - La. 1? X y ??G? 1 6 S ??G?s. Cfla I Ca ?.T Í33.1~r*c¾~S " CJUe ITIU. ß St IT a. J. a. reactividad (ELISA de fase sólida) de HuMAb 11C10 con PSMA de longitud completa y proteínas de fusión expresadas bacterialmente que contienen fragmentos de PSMA que corresponden a los aminoácidos 1-173, 134-437 y 438-750. Los ensayos fueron efectuados utilizando el anticuerpo 7E11 de murino como cci.trol. La Figura 2 es una gráfica que muestra la reactividad (ELISA de fase sólida) de anticuerpos monoclonales anti-PSMA de ser humano con fracciones de membrana de células LNCaP y PC3 de adenocarcinoma prostático de ser humano— La absorbencia de fondo a 405 nm fue 0.05. La Figura 3 es una gráfica de barras que muestra el efecto de la desnaturalización térmica de PSMA aislado sobre el enlace con proteína. PSMA purificado, con o sin desnaturalizaci n térmica, fue revestida en placas de 96 pozos y tratado con los anticuerpos indicados. El anticuerpo unido fue detectado por ELISA. ' 1 La Figura 4 muestra la inmunoprecipi ación de PSMA a partir de Usados de detergentes de células LNCaP utilizando HuMA s. en gel SDS, absorbida en membranas PVDF y sondeada con el anticuerpo 4D8 anti-PSMA de muriño (car-riles 2-7) . El carril 1 muestra el lisado de célula LNCaP total. Los carriles 2-7 muestran la inmunoprecipitación con los anticuerpos 7F12, 3A11, 8C12 y 16F9. Las posiciones de PSMA y PSM' son indicadas a través de flechas. La Figura 5 muestra gráficas que miden la respuesta de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de HuMAbs 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 y 16F9 empleando células blanco LNCaP con PBMC s de dos donadores (Paneles A y B) , cada uno en una proporción E:T de 100:1. La Figura 6 muestra una molécula biespecífica totalmente humana, 14A8 x 8C12, que se une con CD89 (FccxR) y con PSMA. La molécula contiene un fragmento de anticuerpo anti-CDS9 F abf (derivado de anticuerpo monoclonal anti-CD89 de ser humano, Í4A8) químicamente enlazado por enlace disuifuro a un fragmento de anticuerpo anti-PSMA F ab' derivado de anticuerpo anti-PSMA monoclonal humano, 8C12) . La Figura 7, panel A es una gráfica que muestra la extotoxrcidad celular de die t e anticuerpo mediada por moñocíto T¾ITCrcrr~"3e~'cCtülas que exp~regem~FSM¾r-a Lravés~úe—ra" molécula biespecifica 14A8 x 8C12 mostrada en la Figura 6 en función de la concentración de moléculas biespecíficas . Los resultados son medidos como porcentaje de lisis celular específica sin utilizar inhibidor, 50 µ?/p?? anti-FcR R (14A8) F(ab')2 libre y 50 ?/?a? anti-FcYRI (H22) F(ab')2 libre; el panel B es una gráfica que muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo- mediado por monocitos (ADCC) de células LNCaP a través de l'sr molécula especifica 1 A8 x SC12 y anticuerpo monoclonal 8C12 en una proporción efector : blanco de 100:1. El panel C es una gráfica que muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediado por monocito (ADCC) de células LNCaP a través de la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 en ausencia de inhibidor, o en presencia de cantidades en exceso de 14A8 F(ab')2 o H22 F(ab')2, y con una proporción efector : blanco de 100:1. Figura 8 , el panel A es una gráfica que muestra la ci to^ v i r- i dan celular dependiente de anticuerpo mediante por neutrófilos (ADCC) de células que expresan PSMA a través de la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 mostrada en la Figura 6 en función de la concentración de moléculas biespecificas . Los resultados fueron medidos como porcentaje de lisis de células especificas sin utilizar inhibidores, 25 ug/ml de fm fi - RryR ?4?8) F(ab';2 libre y 25 ug/ml anti-FcyRI (H22) F(ab'')2 libre: el panel B es una gráfica que muestra la citotoxicidad celular dependiente ~3 anticuerpo íñedTado por neutrofilo8 (ADCC) de células LNCaP a través de la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 en ausencia de inhibidor o en presencia de cantidades en e ceso e 14A0 F ( b' ) ¿-' !±<_.¿. F(ab')2, y una proporción efector : blanco de 200:1. 5 La Figura 9, panel A es una gráfi-ca que -=¦ muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediado por sangre (ADCC) de células que expresan P5MA.. a través de la molécula biespecifica Í4A8 x 8CI2 mestr-a-d-a en la Figura 6 en función de la concentración de moléculas biespecificas . Los 10 resultados fueron medidos como porcentaje de lisis celular especifica sin agregar inhibidor, 25 µ?/p?? de anti-FcRaR (14A8) F(ab')2 libre y 25 ug/ml de anti-FcyRI (H22) F(ab')2 libre; el panel B es una gráfica que muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediado por sangre (ADCC) 15 de células LNCaP a través de la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 en ausencia de inhibidor, o en presencia de cantidades en exceso de 14A8 F(ab')2 ó H22 F(ab'}2. La Figura 10 es una gráfica que muestra la fagocitosis mediada por molécula biespecifica (14A8 x 8C12) de células 20 que expresan PSMA (LNCaP) por macrófagos derivados de monocitos (MDM) (circuios) . Los resultados fueron medidos, porcentaje de fagocitosis tanto en presencia como en ausencia de anticuerpo 14A8 en exceso como inhibidor y anticuerpo H22 como control (rombos) . ~2~5 La Figura ? es uñar ~gr¾frua que "muestra:—ra —fagtJCltJB'rs" U mediada per moléculas biespecificas (14A8 x 8C12) y la fagocitosis mediada por anticuerpos (8C12) de células iamorales L CaP por macrófagos derivados de moaocitos (MDI-í) . La Figura 12 es una gráfica que muestra la fagocitosis mediada por moléculas biespecificas (14A8 x 8€12) de células tumorales LNCaP por macrófagos derivados de monocitos (MDM) (circuios) . El inserto es una gráfica que muestra la fagocitosis mediada por la molécula biespecí tica 14AG x GC12 (1 g/ml) en presencia de 14A8 F(ab')2 o H22 F(ab')2 en exceso. La Figura 13 es una gráfica de barras que muestra la biodistribución de l25I-4A3 en ratones desnudos con tumores de células LNCaP. Los animales fueron inyectados con 100 ]ig de 125I-4A3 a través de la vena de la cola y jacrificados 0.25 y 24 horas después de la inyección. La cantidad de radioactividad presente en cada tejido fue determinada. Los «latos muestran los resultados de animales por duplicado en caca punto de Tiempo. La Figura 14 es una gráfica que muestra la internalización y procesamiento de HuMAb marcado con l25J. por células LNCaP en cultivo. Las células LNCaP fueron marcados con anticuerpo yodinado, lavadas de manera extensa. y la cantidad de marcador, de enlace de superficie celular internalizado y convertido en producto soluble TCA fue determinada en los tiempos indicados. Se muestran Tos" resul ados para tres" HuMAbs que conservaron sus propiedades de enlace con antígeno después de yodinación, así como IgGi humana y relevante como control negativo. La Figura 15 es una gráfica que muestra el efecto de la yodinación con 12sI sobre la capacidad" de enlacé de antígeno con ciertos HuMAbs -anti-PSMA. Los resultados muestran la cantidad de HuMAb marcado con I25I unido a PSMA de LNCaP purificado nativo inmovilizado, en función del fctctur ae dilución del anticuerpo. La Figura 16 incluye gráficas que muestran el efecto del marcado con DOTA sobre la capacidad de enlace de antígeno de ciertos HuMAbs anti-PSMA. Los resultados muestran la cantidad de HuMAb marcado con DOTA, o bien anticuerpo no conjugado que se une a PSMA, de conformidad con lo medido por ELISA, en función del título de la cantidad de anticuerpo (en ug/ml) . La Figura 17A y la Figura 17B muestran las secuencias de nuclcctidcs de las regiones ,; y vL. respectivamente, Dará cada uno de ios siguientes: HuMAb 4A3, 7F12, 8C12, 8A11 y 16F9. La Figura 18 es una comparación de alineación de la secuencia de nucleótidos de las regiones V de cadena pesada de HuMAbs 4A3, 7F12, 3A11, 8C12, 16F9, y la región V de cadena correspondiente de la secuencia nucleótidos de linea germinal . La figura 19 es una comparación de alineación de la secuencia de aminoácidos de la región V de cadena pesada de HuMAbs 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, 16F9, y la región V de cadena correspondiente de la secuencia de aminoácidos de line germinal. 5 La figura 20 es una comparación de alineación de la secuencia de nucleótidos de la región V de cadena ligera (kappa) de HuMAbs 4A3, 7F12, 8C12, y la región V de cadena coi L tispondiente de la secuencia de nucleótidos de linea germinal . 10 La figura 21 es una comparación de alineación de la secuencia de nucleótidos de la región V de cadena ligera (kappa) de HuMAbs 8A11, 16F9, y la región de cadena V correspondiente de la secuencia de nucleótidos de linea germinal.' La figura 22 es una comparación de alineación de la secuencia 15 de aminoácidos de la región V de cadena ligera (kappa) de HuMAbs 4A3, 7F12, 8C12, y la región V de cadena correspondiente de la secuencia de aminoácidos de linea germinal . .· . - La figura 23 es una comparación de alineación de la secuencia 20 de aminoácidos de la región V de cadena ligera (kappa) de HuMAbs 8A11, 16F9, y la región V de cadena correspondiente de la secuencia de aminoácidos de línea germinal , DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece terapias novedosas basadas en ~2~5 anticuerpos para el tratamiento y diagnostico de enfermedades que se caracterizan por la expresión de antiyeno de membrana especifico para próstata (se conoce a continuación como "F3Í-ÍA") . Las terapias de la invención emplean anticuerpos monoclonales humanos aislados y/o composiciones relacionadas que contienen los anticuerpos que se unen a -· un epitopo presente en PSMA. En una modalidad particular ejemplificada aquí, los anticuerpos humanos son producidos en un animal tr~ansgenico no humano, por ejemplo, un ratón transge ico', capaz de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para PSMA (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) mediante el sometimiento a recombinación V-D-J y cambio de isotipo. Por consiguiente, aspectos de la invención incluyen no solamente anticuerpos, fragmentos de anticuerpo, j composiciones farmacéuticas de los mismos, sino también animales transgénicos no humanos, células B e hibridomas que producen anticuerpos monoclonales. Métodos para utilizar los anticuerpos de la invención para detectar una célula que expresa PSMA o para inhibir el crecimiento, diferenciación y/o movilidad de una célula que expresa PSMA, ya sea in vivo o in vitro, están también abarcados dentro del marco de la presente invención. Para que la presente invención pueda ser más fáci.1 mente entendida, se deben definir primero _ algunos términos. Definiciones adicionales se presentan a continuación en toda la descripción detallada.

El término "Antígeno de Membrana Especifico para Próstata", '?PSMA'' , y "antigeno PSMA", se emplean de manera intercambiable aquí e incluyen variantes, i50formas y homólogos de especie de PSMA de ser humano. Por consiguiente, anticuerpos humanos de la presente invención pueden, en algunos casos, reaccionar de manera cruzada con PSMA de especies que no - son humanas, u otras proteínas estructuralmence ' relacionadas con PSMA de ser humano (homólogos de PSMA de ser humano) . En otros casos, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para PSMA de se humano y no presentan reactividad cruzada para especie o reactividad cruzada de otros tipos. Como se emplea aquí, el término "inhibe el crecimiento" (por ejemplo, con referencia a las células) incluye cualquier disminución medible del crecimiento de una célula cuando esta en contacto con un anticuerpo anti-PSMA en comparación con el crpr.imienro de la misma célula no en contacto con un anticuerpo anti-PSMA, · por · ejemplo, la inhibición de crecimiento de una célula en por lo menos 10%, 20%, 30%. 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%, ó 100%. El término "anticuerpo", como se utiliza aquí, incluyen anticuerpos enteros y cualquier fragmento de enlace con antígeno . (es decir, "porción de enlace con antígeno") o cadena individual del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteina que comprende por lo menos' dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro o una porción de enlace con antigeno del mismo. Cada cadena pesada consiste de ana región variable de Cadena pesada (abreviada aquí como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada consiste de tres dominios CHi, CH2 y CH3. Cada cadena- ligera consiste de una región variable de cadena liger-a (abreviado a continuación como VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera consiste de un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden ser subdivididas a su vez adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, que se conocen como regiones determinantes de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que son más conservadas, las cuales se conocen como regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL consiste de tres CDRs y cuatro FRs, que se colocan desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el orden siguiente: FR1 , CDR1, FR2, CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera—eontienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace de la inmunoglobulina con tejidos huéspedes o factores, incluyendo varias células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq)_. del sistema clásico de componentes . El término "porción de enlace con antig^ cT^de urT antTcuerp"c (o bien simplemente "porción de anticuerpo"), como se emplea aquí, se refiere a uno o varios fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de enlazarse específicamente con un antigeno (por ejemplo, PSMA) . Se ha mostrado que la función de enlace con antigeno de un anticuerpo puede ser efectuada por fragmentos de un .anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro de 1 " término "porción, de enlace con anüigeno" de un anticuerpo-incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, y CHi; (ü) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados por un puente disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CHI; (iv) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341 : 544-546), que consiste de un dominio VH; y (vi) una región determinante de ccmplementariedad -aislado (CDR) . Además, .aún cuando los dos dominios del fragmento Fv, Vi, y VH, son codificados por genes separados, pueden estar unidos, empleando métodos recombinantes, a través de un enlazador sintético que permite que formen una sola cadena de proteina en donde las regiones VL y VH se acopian para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena sencilla (scFv) ; vóase, por ejemplo^ ???3 y colaboradores ~(?F8?~) Science 242: 423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc . Nati. Acad. Sci. Estados Unidos de América 85_:5879-58863) . Tales anticuerpos de cadena sencilla se contemplan Lambiéu que estén abarcados dentro del marco del término "porción de enlace con antigeno" de un anticuerpo .· Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por parte de las personas con conocimientos en la materia, y los fragmentos "Son tamizados para determinar su utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. El término "epítopo" se refiere a un determinante de proteina capaz de enlazarse específicamente con un anticuerpo. Los epítopos consisten habitualmente de agrupamientos de moléculas de superficie químicamente activa tales como aminoácidos o cadenas laterales de azucares y tienen habitualmente características estructuras tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Epítopos conformaoionales y no conformacionales se distinquen en la medida en que el enlace con los primeros pero no con ios últimos se pierde en presencia de solventes desnaturalizantes. El término "epítopo convencional nativo" o "epítopo de proteína nativa" se utiliza de manera intercambiable, e i cluyen ppí topos . de proteina que resultan del doblado conformacional de la molécula de PSMA que surgen cuando aminoácidos de porciones diferentes ~dlT TaTsecuencia lineal-de 23 la molécula de ?SM?. se acercan es rechamente en un espacio tridimensional. Tales epitopos conformacionales están distribuidos eii el lado extraceluiar de la membrana plasmática. 5 El término "molécula biespecif ica" incluye cualquier agente, por ejemplo, una proteina, un péptido, o complejo de proteina o péptido que tiene dos especificidades de enlaces diferentes. For je lo, la itioi cu-tct' puede unirse o interactuar con (a) un antigeno de superficie celular y (b) 10 un receptor Fe en la superficie de una célula efectora. El término "molécula multiespecifica" o "molécula heteroespecí fica" se contempla para incluir cualquier agente, por ejemplo, una proteina, un péptido, o complejo de proteina o péptido, que tiene más que dos especificidades de enlace 15 diferentes. Por ejemplo, la molécula puede unirse o interactuar con (a) un antigeno de superficie celular, (b) un receptor Fe en la superficie de una célula efectora, y (c) per lo menos otro componente.. Por consi guíente, la invención incluye, sin limitarse a estos ejemplos, moléculas 20 biespecifleas, triespecificas, tetraespecí ficas, y con multiespecificidades variadas que se enfocan hacia antígeno de superficie celular, por ejemplo. PSMA, y otros blancos, por ejemplo, receptor de Fe en células efectoras. El término "anticuerpos biespecificos" incluye también ~2~5 3xa"cuerpos". Xos "S acuerpós sdrT anticuerpos" biespectficos~ bivalentes en donde los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena de polipéptido, pero empleando un eniazador que es demasiado corto para permitir el acoplamiento ent e ice dos' dominios en la misma cadena, obligando asi los dominios a acoplarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de enlace coa. antigeno (véase, por ejemplo, Hoiliger, P y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad. colaboradores (1994) Structure 2j_1121-1123) . El término "derivados de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo, por ejemplo, un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. Como se emplea aquí, un anticuerpo humano es "derivado de" una secuencia de linea germinal particular si el anticuerpo es obtenido a partir de un sistema que utiliza secuencias de inmunoglobulinas humanas, por ejemplo, mediante la inmunización de un ratón transgénico que lleva genes de inmunoglobulina human o bien mediante la exploración de.. una biblioteca de genes de inmunoglobulina, humana. Un anticuerpo humano "derivado de" una secuencia de inmunogiobulina de linea germinal humana puede ser identificado, por ejemplo, mediante la comparación de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con la secuencia ce aminoácidos de inmunoglobulinas de línea germinal de ser humano. Un aTilr ctTer -o^^ mH^ 'ti-rrirca-m-en-te—t ene—ptxr ro-merios una. identidad del 90% en cuanto a aminoácidos para una secuencia de aminoácido codificada por un gen de inmunoglcbulina de linea germinal humano y que contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo humano como siendo humano en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de linaa germinal de otras especies (por ejemplo, ^secuencias de linea germinal de una homología de por lo menos 95%, o hasta por lo menos 96%, 97%, 98% ó 99% de. identidad en la secuencia de aminoácidos con relación a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia de línea germinal humana particular presentara no más que 10 diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal de ser humano. En algunos casos, el anticuerpo humano puede desplegar no más que 5, o hasta no más que 4, 3, 2 ó una diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Como se emplea aquí, el término "heteroanticuerpos" se refiere a dos o más anticuerpos, fragmentos de enlace de anticuerpo (por ejemplo, Fab) , derivados de los mismos, o bien regiones de enlace de antígeno unidas entre ellas, por _ts mrerRJS" ~do ~~de ~1ra curares -trenen—esp^^i-ifHrc-iiade-s- dfcfe-ren-tesr- Estas especificidades diferentes incluyen una especificidad de enlace para un receptor Fe en una célula efectora, y una especificidad de enlace para un antigeno o epicopo en na célula blanco, como por ejemplo, una célula tumoral . El término "anticuerpo humano", como se emplé~á aquí, se contempla para incluir anticuerpos que tienen regiones variables y regiones constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la presente invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de linea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o especifica para sitio in vitro o por mutación somática in vivo. Sin embargo, el término "anticuerpo" como se emplea aquí no pretende incluir anticuerpos en los cuales secuencias de CDR derivadas de línea germinal de otras especies de mamíferos, como por e emplo ratón, han sido injertadas en secuencias de estructura de ser humano. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se emplean aquí se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de una composición molecular única. Una composición de anticuerpos monoclonales crecenta una sola especificidad de e la.ee...y . afinidad para un epítopo particular, Por consiguiente, el término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que presentan una" soló, especificidad de enlace que tienen regiones aria le y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de linea germinal de ser humano. En una modalidad, ios anticuerpos monoclonales humanos son producidos por un hibridoma que incluye una célula B obtenida a partir de un · animal no humano transgénico, por - ejemplo, un rato transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano y un transgen de cadena ligera de · ser humano fusionados con una célula inmortalizada. El término "anticuerpo humano recombinante" , como se emplea aquí, incluye todos los anticuerpos humanos preparados, expresados, creados o aislados por medios recombinantes , como por ejemplo (a) anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico o transcromosómico para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado a partir de ahí (descrito adicionalmente en la sección I, aba o),- ( ) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar anticuerpo, por ejemplo, a partir de un transíectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos de combinación, recombinante, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por otros medios que incluyen el empalme de secuencia? d» gen H inmunoglobulina humana sobre otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes de ivabas dé" secuencias de xnmunoglobulina de línea germinal de ser humano. En ciertas modalidades, sin embargo, tales anticuerpos humanes recombinantes pueden ser sometidos a mutagénesis in vitro (o bien cuando un animal transgénico 5 para secuencias de -Ig humana se -utilizan, mutagénesis somática in vivo] y por consiguiente., las secuencias de aminoácidos de las .regiones VH y VL de los anticuerpos recomhinantes son secuencias que, mientras son derivadas de las secuencias VH y VL de línea germinal humana y relacionados 10 con tales secuencias VH y VL, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de línea germinal de anticuerpo humano in vi vo . Como se emplea aquí, un "anticuerpo heterólogo" se define con relación al organismo no humano transgénico que produce dicho 15 anticuerpo. Este término se refiere a un anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos o una secuencia de ácido nucleico codificadora que corresponde a lo que se encuentra en un organismo . que no consiste del animal no humano transgénico, y en general de una especie otra que la especie 20 del animal no humano Lransgénico. Como se emplea aquí, un "anticuerpo heterohíbrido" se refiere a un anticuerpo que tiene una cadena ligera y una cadena pesada de orígenes diferentes. Por ejemplo, un anticuerpo que tiene una cadena pesada humana asociada con una cadena ligera ~2~5 dé ituriño e~s un artrctierpe--—¾efee^e-h-í-brí-úo- Ej-eroplo-s de- anticuerpos etarohibridos incluyen anticuerpos quiméricos y humanizados, como se comentó arriba. ün "anticuerpo aislado'", como se utilizó aquí, se contempla para referirse a un anticuerpo sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen especificidades arttigénica's diferentes (por ejemplo un anticuerpo aislado que se-une específicamente a PSMA es sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos otros que-f^SMA) . Un anticuerpo aislado que se une específicamente a un epítopo, isoforma o variante de PSMA de ser humano puede sin embargo tener una reactividad cruzada con otros antígenos relacionados, como por ejemplo, de otras especies (por ejemplo, homólogos de especies de PSMA) . Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libia de otro material celular y/o sustancia química. En una modalidad de la invención, una combinación de anticuerpos monoclonales "aislados" que tienen especificidades diferentes se combinan en una composición bien definida. -— Como se emplea aquí, un "enlace específico" se refiere a un anticuerpo que se enlace a un antígeno predeterminado. Típicamente, el antígeno se une con una constante de disociación KD de 10"' M o menos, y se une a un antígeno predeterminado con una Kn que es por lo menos dos veces menor que su KD para enlazarse con un antígeno no específico (por ej emplo, BSA, caséTña un antigeno estrechamente relacionado. Las expresiones "un anticuerpo que reconoce un antigeno" y "un anticuerpo especifico para un antigeno" se utilizan de manera intercambiable aqui con el término "un anticuerpo que se une específicamente con un antígeno".

Como se emplea aquí, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10~8 M o menos, con mayor preferencia 10~9 M o menos y con preferencia aún mayor ÍCT10 M o menos. Sin embargo, un enlace de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpos. Por ejemplo, un enlace de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10~7 M o menos, con mayor preferencia 10~8 M o menos.

El término "Kassoc" o "Ka", como se emplea aquí, se refiere a la tasa de asociación de una interacción particular anticuerpo-antígeno, mientras que el término "KdiS" ó como se emplea aquí, se refiere a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "KD" como se emplea aquí, se refiere a la constante de disociación que se obtiene a partir de la razón de KD a Ka (es decir, Kd/Ka) y se expresa como concentración molar (M) .

JO Como se emplea aqui, el término "isotipo" se refiere a una clase de anticuerpo (por ejemplo IgM o IgGl) codificada por genes cíe región constante de cadena pesada. Como se emplea aquí, la expresión "cambio de isotipo" se refiere a un fenómeno a - través del cual la- clase o-iso-tipo de un anticuerpo cambia de una clase Ig a., una de las demás clases Ig. Como se emplea aquí', "el término "isotipo no cambiado" se refiere a la clase isotipica de cadena pesada producida cuando no se lleva a cabo ningún cambio de isotipo; el gen CH que codifica el isotipo no cambiado es típicamente el primer gen CH inmediatamente corriente abajo del gen VDJ funcionalmente reacomodado. El cambio de isotipo ha sido clasificado como cambio de isotipo clásico o no clásico. Un cambio de isotipo clásico ocurre por eventos de recombinación que incluyen por lo menos una región de secuencia de cambio en l fr^nsgen. Un cambio de isotipo no clásico puede ocurrir, por ejemplo, mediante recombinación homologa entre s. de ser humano y ?µ de ser humano (deleción asociada con d) . Mecanismos alternativos de cambio no clásico, como por ejemplo recombinación intertransgen y/o intercromosómica, entre otros, pueden ocurrir y efectuar, cambio de isotipo. Como se utiliza aquí, el término "secuencia de cambio" se refiere a la secuencia de ADN responsables de la recombinación de cambio. Una secuencia donadora de cambio"', típicamente una región de cambio µ, estará 5' (es decir, corriente arriba) de la región de cóhstructo a remover durante la reconibi-iació-- e cambio. La región "aceptadora de cambios" se encontrará entre la región de constructo a remover y la región constante de reempl-azo (por- ejemplo, ?, e, etc.) . Puesto que no hay ningún sitio., específico en donde ocurre siempre la recombinación, la- secuencia génica final típicamente no será previsible a partir—del constructo. Como se emplea aquí, un "patrón de glicosilación" se define como el patrón de unidades de carbohidrato covalentemente unidas a una proteína, más específicamente a una proteína de inmunoglobulina. Un patrón de glicosilación de un anticuerpo heterólogo puede ser caracterizado como sustancialmente similar a patrones de glicosilación que ocurren naturalmente en anticuerpos producidos por la especie del animal transgénico no humano, cuando una persona con conocimientos ordinarios en la materia reconocería el patrón de glicosilación del anticuerpo heterólogo.. como más similar a dicho patrón de glicosilación en la especie del animal transgénico no humano que en ia especie a partir del cual los genes CH del transgen fueron derivados. F.l término "que ocurre naturalmente" co o se emplea aquí, seaún lo aplicado a un objeto se refiere al hecho que un objeto puede ser encontrado en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipeptidos o p^TlrrucleótTd¾~s presen a erT 3 d un organismo (incluyendo virus) que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no ha sido modificada intencionalmente por el hombre en e laboratorio ocurre naturalmente. El término "reacomodado" como se utiliza aquí se refiere a una configuración de . locus de inmunoglobulina de cadena pesada o de cadena ligera en donde un segmento V se coloca iniciediatamenté adyacente a un segmento D-J o d en -una conformación que codifica esencialmente un dominio VH o VL completo, respectivamente. Un locus de gen de inmunoglobulina reacomodado puede ser identificado por comparación con ADN de linea germinal; un locus reacomodado tendrá por lo menos un elemento de homología de heptámero/nonámero recombinado. El término "no reacomodado" o "configuración de linea germinal" como se emplea aquí con referencia a un segmento V se refiere a la configuración en donde el segmento V no es recombinado para que esté inmediatamente adyacente a un segmento D o J. - —- - El término "molécula de ácido nucleico", como se emplea aquí, incluye moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser de una sola cadena o de cadena doble- pero preferentemente se trata de ADN de cadena doble. El término "molécula de ácido nucleico aislada" como se utiliza aquí con referencia a cidos nucleicos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos Cpcr ejemplo Vf, VT CDR3) que se unen con PSMA, se refiere a una molécula cié ácido nucleico en donde las secuencias de nucleotidos que codifican el anticuerpo o porción de anticuerpo son libres de otras secuencias de nucleótidos que codifican anticuerpos o porciones de anticuerpos que se unen con antigenos otros que PSMA, dichas otras secuencias pueden flanquear naturalmente el ácido nucleico en el ADN genómico humano. En una iuGu.ct-L Q. u., t:x aiiL itueipu anuí rorin ui»anur mismo, incluye la secuencia de nucleótidos o aminoácidos de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9, asi como regiones variables de cadena pesada (VH) y cadena ligera (VL) que tienen las secuencias mostradas en SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 ó 9 y 2, 4, 6, 8 ó 10, respectivamente. De conformidad con lo divulgado y reclamado aquí, las secuencias establecidas en SEQ ID NOS: 1-58 incluyen "modificaciones conservadoras de secuencia", es decir, modificaciones de secuencias de nucleótidos y aminoácidos que no afectan significativamente ni alteran las características de enlace del anticuerpo codificado por la secuencia de nucleótidos o que contienen la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras de secuencias incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Modificaciones pueden ser introducidas en SEQ ID NOS: 1-58 por técnicas estándares conocidas en el arte, tales como mutagénesis diTig da por sitio y mufagenesís~ mediada póT reacción en cadena de pciimerasa. Sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen las sustituciones en las cuales el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas - laterales similares han sido definidas en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, glicina, arginina, histxdina) , cadenas lacérales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina , prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales ramificadas en beta ;por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) , y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, h i <=;<- i H -i n ) Así. un residuo de aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-FSMA -de ser humano es preferentemente reemplazado por otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, en otra modalidad, mutaciones pueden ser introducidas en forma aleatoria a lo largo de la totalidad o un parte de una secuencia codificadora de anticuerpo anti- PSMA, como por ejemplo por mutagénesis de saturación, y los anticuerpos anti-PSMA modificados resültañl:"es pueden ser tamizados para determinar su actividad de enlace. Por consiguiente, anticuerpos codificados por las secuencias de nucleótidos (región variable de cadena pesada y de cadena ligera) divulgadas aquí y/o que contienen las secuencias de aminoácidos (región variable de cadena pesada y de cadena ligera) divulgadas aquí (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1-50) incluyen anticuerpos sustancialmente similares codificados per secuencias similares o que contienen secuencias -similares que han sido modificadas de manera conservadora. Comentarios adicionales en cuanto a cómo tales anticuerpos sustancialmente similares pueden ser generados con base en las secuencias parciales (es decir, regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera) divulgadas aquí como SEQ ID NOS: 1-50 se proporciona abajo. Para ácidos nucleicos, el término "homología sustancial" indica que dos ácidos nucleicos o secuencias designadas de los mismos, cuando están óptimamente alineados y comparados, son idénticos, con inserciones o deleciones de nucleótidos apropiadas, en por lo menos aproximadamente 80% de los nucleótidos, habitualmente por lo menos aproximadamente 90% a 95%, y con mayor preferencia por lo menos aproximadamente 98% a 99.5% de los nucleótidos. Alternativamente existe homología sustancial cuando los segmentos se hibrídan bajo condiciones selectivas de hibridación, con el complemento de la cadena, la ideTTt±¾ad nrorceirtuad:—entre—dos—secuencias—depende—del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, porcentaje de homología = número de posiciones idén icas/núraero total de posiciones x 100) , tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que debe introducirse para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de las. secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias pueden lograrse utilizando un algoritmo matemático de conformidad con lo descrito en los ejemplos no limitativos presentados abajo. La identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos puede ser determinada empleando el programa GAP en el paquete de programática GCG (disponible en http : //www. gcg . com) , utilizando una matriz NWSgapdna . CMP y un peso de espacio de 4'0, 50, 60, 70 u 80, y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 6 ó 6. La identidad porcentual entre dos secuencias de nucleótidos de aminoácidos puede también ser determinada utilizando el algoritmo de E. Meyers, .y W. Miller {Comput. Appl. Biosci . , 4:11-17 (1988)) que ha sido incorporada en el programa ALiGN (versión 2.0), utilizando una Labia de residuos de pesos PAM120, una penalidad de longitud de espacio de 12 y una penalidad de espacio de 4. Además, la identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácidos puede ser determinada empleando el algoritmo Needleman unsch {?~~???: p±??~. $#r4*4=¾-53- t9?-Q 1 qxre ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GüG (disponible en http : / /www . gcg . com) , utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM25U, con un peso de espacio de 16, 14. 12,. 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5 ó 6. ' - Las secuencias de ácido nucleico y proteina de la presente invención pueden ser utilizadas adicionalmente como una "secuencia de oúsqueda"' para efectuar una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden efectuarse utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Búsquedas de nucleótidos con BLAST pueden efectuarse a través del programd NBLAST, resultado = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Se pueden ^ec u^ hú qu^d»? H > nrn pína BLAST non e] programa XBLAST. resultado = 50, longitud de palabra— = 3 para obtener secuenci as de aminoácidos homologas a las moléculas de proteina de la invención. Para obtener las alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST de conformidad con le descrito en Altschul y c 1 eboradores,- (1997) Nucleic Acids Res, 25(17) :3 89-340?. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, los parámetros por omisión de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y B AST) pueden emplearse. Véase http : //www . ncbi . nlm. nih . go . Los ácidos nucleicos pueden estar r s nles en células enteras, en un lisado celular o bien en forma sustancialmente pura o parcialmente purificada. Un -ácido -nucleico es "aislado" o "tornado sustancialmente · puro" cuando es purificado lejos de otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, por técnicas estándares, incluyendo tratamiento alcaiino/SDS, formación de bandas de CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otras técnicas bien conocidas. Véase, F. Ausubel y colaboradores, ed. Current Protocols in Molecular Biology [Protocolos Actuales en Biología Molecular], Greene Publishing y Wiley Interscience, Nueva York (1987). Las composiciones de ácido nucleico de la presente invención si 'i " stán rpnipntemente en la secuencia nativa íexcepto en el caso de sitios de restricción modificados y similares)-, ya sea de AD c, genómico o mezclas pueden ser mutadas, de conformidad con técnicas estándares para proporcionar secuencias de gen. Para secuencias codificadoras, estas mutaciones pueden afectar las secuencias de aminoácido según lo d ?^^ r.n a ticula , secuencias de ADN sustancialmente homologas o derivadas de cambios constantes V, D, J nativo y otras secuencias de este tipo descritas aquí se contemplan (en donde el término "derivado" indica que una secuencia es idéntica o modificada a partir de otra secuencia) . un ácido nucleico está "enlazado operativamente" cuando esta colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor o realzador · está enlazado operativamente a una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia. Con relación a secuencias' reguiadoras de la transcripción, el término "enlazado operativamente" significa que las secuencias de ADN que se está enlazando son contiguas y, en caso necesario, para unir dos regiones codificadoras de proteina, contiguas y en cuadro lectura. Para secuencias de cambio, el término "enlazado operativamente" indica que las secuencias pueden efectuar recombinaciones de cambio. El término "vector", como se emplea aquí, se refiere a una molécula de ácido nucleico que puede transportar otro ácido nucleico al cual está enlazada. Un tipo de vector es un "plásmido", lo que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular en el cual segmentos adicionales de ADN puede ser ligados. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos adicionales de ADN pueden ser ligados en el genoma viral. Ciertos vectores . son capaces de replicactón autónoma en una célula huésped en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación asi como vectores de mamífero episómicos) .

Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamíferos xio episómicos) pueden ser integrados en el genoma de una célula huésped al ser introducidos en la célula huésped, y por consiguiente son replicados 1 untos con el genoma huésped. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes al cual están enlazados operativamente. Tales vectores se conocen - a continuación como "vectores de expresión recombinante" " (o oren siiiV ie ente , "vectores cié expresión") . En general, vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recom inante tienen frecuentemente la forma de plásmidos. En la presente especificación, "plásmido" y "vector" pueden emplearse de manera intercambiable puesto que el plásmido es la forma de vector más comúnmente utilizada. Sin embargo, la invención incluye otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados defectuosos oara replicación) , crue desempeñan funciones equivalentes. El término .^-^sé ula huésped recombinante" (o simplemente "célula huésped"), como se emplea aquí, se refiere a una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Se entenderá que tales términos se contemplan como refiriéndose no so.l amenté a la célula sujeto particular, sino también, a la progenie de dicha célula. Puesto que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones subsiguientes deTdo ya sea sí mutaciones ó ír-TIuelTcTas ambientales, dicha progenie de hecho puede no ser idéntica a la célula de origen, pero se siguen incluyendo dentro del Células huéspedes recombinantes incluyen, por ejemplo, células CHO y células linfociticas . Como se emplea aquí, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano.. El término "animal no humano" incluye todos ios ve ebrados, por ejemplo, mami cros y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Los términos "animal no humano transgénico" se refiere a un animal no humano que tiene un genoma que comprende uno o varios transgenes o transcromosomas de cadena pesada y/o cadena ligera (ya sea integrados o no integrados en el ADN genómico natural del animal) y que puede expresar anticuerpos totalmente humanos. Por ejemplo, un ratón transgénico puede tener un transgen de cadena ligera de ser humano y o bien un transgen de cadena pesada de ser humano o un transeromosoma de cadena pesada de ser humano, de tal manera que el ratón produzca anticuerpos anti-PSMA humanos cuando es inmunizado con antígeno PSM y/o células que expresan PSMA. El transgen de cadena pesada de ser humano puede estar integrado en el PON cromosómico del ratón, como en el caso de ratones HuMAb transgénicos, por ejemplo, o bien el transgen de cadena pesada de ser humano puede estar mantenido c¾" mahé a extracroiíiosóii =, como T el caso de ratones transcromosómicos (por ejemplo, KM) según lo descrito en el ou ufueii LO «JO U2/434 C. rales ratones transgc iccs y transcromosómicos pueden producir múltiples isotipos de anticuerpos monocionales humanos para PSMA (por ejemplo, IgG, IgA y/o Ig?) mediante sometimiento a recombinación V-D-J y cambio de isotipo. Varios aspectos d la invención se describen con desalíes adicionales en las sub-secciones siguientes: I . Producción de Anticuerpos Humanos para PSMA Anticuerpos monocionales humanos (mAbs) de la presente invención pueden ser producidos a través de varias técnicas, incluyendo metodología de anticuerpo monoclonal convencional, por ejemplo, la técnica de hibridación de células somáticas estándares de Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495. Aún cuando procedimientos de hibridación de células somáticas se prefieren, en principio, otras técnicas para la producción de anticuerpo moncdona! pueden emplearse, por ejemplo, transf rmación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para la preparación de hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridoma en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Protocolos de inmunización v técnicas para aislar esplenocitos inmunizados para fusión se conocen en la técnica. Socios de fusión (por ejemplo, celulas dé mieloma dé murinoG procedimientos de~ fusión se conocen también. En una modalidad preferida, anticuerpos monocionaies humanos dirigidos contra PSMA pueden ser generados empleando ratones transgénicos o transcromosómicos que llevan partes del sistema inmune humano en lugar del sistema del ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos. incluyen ratones conocidos aquí como ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se conocen colectivamente como "ratón transgénico" . El ratón HuMAb contiene un miniloci de gen de inmunoglobulina de ser humano que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada de ser humano (µ y ?) no reacomodadas y secuencias de inmunoglobulina de cadena ligera ?, junto con mutaciones dirigidas que desactivan los loci de cadenas µ y ? endógenas (Lonberg y colaboradores (1994) Nature 368(6474) : 856-359) . Por consiguiente, los ratones presentan una expresión reducida TgM de ratón o ? y, en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadena pesada de ser humano y cadena lia°ra introducidos son sometidos a cambio de clase y mutación somática para generar igG monocionai de ser humano de alta afinidad (Lonberg, N. y colaboradores (1994), supra; revisado en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Phamtc-cl gy li 3 -49-1.01 : Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. _ev, Tmmunol . Vol. 13: 65-93, y Harding, F. y Lonberg, N. (1995) Ann N. Y. Acad Sci ?64 5~36=5?6~? ra preparación de ratones HuM¾b se describe con detalles en la Sección II abajo y en Taylor, L. y colaboradores (1992) Nucieic Acids Res a± boradores (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon y colaboradores (1993) Proc. Nati. Acad Sed USA 90:3720-3724; Choi y colaboradores (1993) Nature Genética 4:117-123; Chen, J. y colaboradores (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon y colaboradores (1934) J. Inmunol . 152:2912-2920; Lonberg y colaboradores (1994) Nature 368(6474): 856-859; Lonberg, N: (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Taylor, L. y colaboradores (1994) International Immunology 6:579-591; Lonberg, N. y Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol . Vol. 13: 65-93; Harding, F. y Lonberg, N . (1995) Ann. N.Y. Acad Sci 764:536-546; Fishwild, D. y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, cuyos contenidos se incorporan aqui por referencia en su totalidad. Véase asimismo, las Patentes Norteamericanas Nos.- 5,545, 806; 5,569,825; 5,625,126; 5, 633,425; 5,789,650; 5, 877, 397; 5,661,016; 5,814,318; 5, 874,299; y 5, 770,429; todas de Lonberg y Kay, y GenPharm International; Patente Norteamericana No. 5,545,80788 de Surani y colaboradores; Publicaciones Internacionales Nos. WO 98/24884, publicada el 11 de iunio de 1998; WO 94/25585, publicada el 10 de noviembre de 1994; WO 93/1227, publicada ?— de jühio de—?9"9 7— O— 9 2TSt5 r publicada—el— 23—de diciembre de 1992; WO 92/03918, publicada el 19 de marzo de 1992, cuyas divulgaciones se incorporan aquí por referencia en su totalidad. AlterriatixraitienLe, los ratones transgénicos HC012" descritos en el Ejemplo 2, pueden ser utilizados para generar anticuerpos anti-PSMA humanos. . . . Inmuni zacíones Para generar anticuerpos monoclonales tota.l mente humanos para PSMA, ratones HuMAb pueden ser inmunizados -con una preparación purificada o enriquecida de antigeno PSMA y/o células que expresan PSMA, de conformidad con lo descrito por Lonberg, N. y colaboradores (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 y WO 98/24884. Preferentemente, los ratones tendrán de 6 a 16 semanas de edad al ^.omento de la primera infusión. Por ejemplo, una preparación purificada o enriquecida (5-20 ]ig) de antígeno PSMA (por ejemplo, purificada a partir de células LNCaP que expresan PSMA) puede emplearse para inmunizar ios ratones HuMAb de manera i traperitoneal . E el caso en el cual las inmunizaciones utilizando una preparación purificada o enriquecida de antigeno PSMA no resulta en anticuerpos, los ratones pueden ser también inmunizados con células, de expresan PSMA, por ejemplo, una linea de células tumorales para promover respuestas inmunes. La experiencia acumulada, los antigenos han mostrado que los ratones transgénicos HuMAb responden típicamente me^or cuando son inmunizados inicialmenre de manera intraperitoncal (IP) con antigeno en adyuvante completo de Freund, seguido cada tercera semana por inmunizaciones I.P. ¡hasta un total 6 I con antigeno en adyuvante incompleto de Freund, seguido cada tercer semana por inmunizaciones IP/SC (hasta un total de 10) con antigeno en adyuvante incompleto de Freund. La respuesta inmune puede ser monitoreada en el transcurso del protocolo de inmunización con muestras plasmáticas obtenidas por sangrados retroorbitales . El plasma puede ser revisado por ELISA (de conformidad con lo descrito aba o), y ratones con títulos suficientes de inmunoglobulina humana anti-PS A pueden ser utilizados para fusiones. Los ratones pueden recibir refuerzos intravenosos con antígeno 3 días antes del sacrificio y remoción del bazo. Se espera que 2-3 fusiones para cada antígeno pueden ser necesarios. Varios ratones serán inmunizados con cada antígeno. Por ejemplo, un total de doce ratone» IIuMAb de las c^pas HC07 y HC012 pueden ser inmunizadas. Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos para PSMA Para generar hibridomas que producen anticuerpos monoclonales humanos para PSMA., esplenocitos y células de nodo linfático proveniente» d¿ ratones inmunizados pueden ser aislados y fusionados en una línea de células e inmortalizar la apropiada, por ejemplo, línea de célula-de~mieioma de rstónr.- Los hibridomas resultantes pueden ser tamizados para determinar ia producción de anticuerpos específicos para antigeno. Por ejemplo, 3ucpensi0n.es individuales de células de linfocitos esplénicos provenientes de ratones inmunizados pueden ser fusionadas con un sexto del número de células de mieloma de ratón no secretorio P3X63-Ag6.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG 50%. Las células son colocadas en placas a una densidad de aproximadamente ? x 0" en placa de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en medio selectivo que contiene Suero de Clon fetal al 20%, medio acondicionado "653" al 18%, origen al 5% ( IGEN) , L-glutamina 4 mM, L-glutamina 1 mM, piruvato de sodio 1 mM, HEPES 5 mM, 2-mercaptoetanol 0.055 mM, 50 unidades/mi de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina y IX HAT (Sigma se agrega HAR 24 horas después de ia fusión) . Después de aproximadamente dos semanas, las células pueden ser cultivas en medio en el cual HAT es reemplazado por HT. Pozos individuales pueden ser después tamizados por ELISA. para determinar la presencia de anticuerpos IgM e IgG monoclonales anti-PSMA humanos. Una vez que ocurre un crecimiento extenso de hibridoma, el medio puede ser observado habitualmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpos pueden ser colocados en placas otra vez, tamizados otra vez, y si siguen positivos a a IgG humana/ anticuerpos monoclona-las—an_ti-PSMA, pueden ser sub-clonados por lo menos dos veces por dilución limitante. Los sub-clones estables pueden ser después ulii ádos j.n v_ o a generar peq e as canti.Já ic ce anticuerpo en medio de cultivo tisular para caracterización. Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos monoclonales Humanos para PSMA Anticuerpos humanos de la invención pueden ser producidos en un u sfectoiua de ceiu-ia nuespeo. utilizando, por cjcmpio, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de gen como se conoce en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202) . Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo del mismo, ADNs que codifica cadenas pesadas y ligeras de longitud completa o parciales pueden obtenerse mediante técnicas estándares de biología molecular (por ejemplo, amplificación por reacción en cadena de polimerasa, mutagénesis dirigida por sitio) y pueden insertarse en vectores de expresión de tal manera que los genes sean enlazados operativamente con secuencias de control de transcripción y traducción. En este contexto, el término "enlazado operativamente" significa que un gen de anticuerpo está ligado en un vector de tal manera que secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirvan su función contemplada de regular la transcripción y traducción del gen cíe ánticuerpoT Las secuencias "de la D expresión y control de expresión se seleccionan para que sean compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. £1 gen de cadena ligera de anLicuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo pueden ser insertados en vector separado o bien, más típicamente, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo son. insertados en el vector de expresión por métodos estándares (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios -en el fragmento de gen de anticuerpo y vector, o bien ligación de extremo aplanado si no están presentes sitios de no restricción) . Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos aquí pueden utilizarse para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo mediante su inserción en vectores de expresión que ya están codificando regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado, de tal manera que el segmento VH esté enlazado operativamente al segmento, o . a los s.egmentos CH dentro del vector y de tal manera que el segmento Vx esté enlazado operativamente al segmento CL dentro del vector. Además o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula huésped. El gen de la cadena de anticuerpo puede ser clonado en el vector de tal manera que él pép Idd" dé sénaT "eslíe" enlazado en cuadro al extremo amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de iniuunoCj lobulina o un péptido de se al heterclcgc ' ss decir, un péptido de señal de una proteína no inmunoglobulina) . Además, de los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la presente invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" incluye promotores, realzadores y otros elementos de control de expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras son descritas, por ejemplo, en Goeddel; Gene Expression Technology, Methods in Enzymology [Tecnología de Expresión Génica. Métodos en Enzimología] 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como lo observarán las personas con conocimientos en la materia del diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguiadoras puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Secuencias reguladoras preferidas para expresión en células de huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos veles de expresión de proteina en" células dé mamiteroV como 5 / por ejemplo promotores y/o realzadores derivados de citomegalovirus (C V) , Virus del Simio 40 (SV40) , adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío rinci al de adenovirus (AdMLP) y pol.i orna. Alternativamente, secuencias reguladoras no virales pueden ser utilizados, como por ejemplo el promotor de ubiquitina o el promotor de ß-globina. Además de los genes de cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de ' expresión recoiíOjinanoe de la presente invención pueden llevar secuencias adicionales como por ejemplo secuencias que regulan la replicación del vector en células huéspedes (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes de marcadores seleccionados. El gen de marcador seleccionable facilita la selección de células huéspedes en las cuales el vector ha sido introducido (véase, por ejemplo, Patentes Norteamericanas Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel y colaboradores). Por ejemplo, >r í í G-?t??t,??-? 1 gen de marcador seleccionado proporciona resistencia a fármacos, como por ejemplo G418, higromicina o rnetotrexato, en una célula huésped en le cual el vector ha sido introducido. Genes de marcadores seleccionóles preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso den células huéspedes dhfr- con s o l óp siTTiri i i fi.canión de rnetotrexato) y el gen neo (para selección de G418). Para la expresión de las cadenas ligeras" y pesadas, el vector de expresión c ios vectores de expresión que codifica (n) las cadenas ligeras y pesadas es transfectado en una célula nuésped por técnicas estándares. Lac varias formas del término "transíección" abarcan una amplia gama de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, por ejemplo, electropcración, precipitación de calcio-fosfato, transfección de DEAE-dextrano y similares. Aún -cuando es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células huéspedes procarióticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y con mayor preferencia en células huéspedes de mamífero, es la más preferida puesto que algunas células eucarióticas y en particular células de mamífero, presentan una mayor propensión que células procarióticas a ensamblar y secretar un anticuerpo inmunológicamente activo y apropiadamente d blado. La expresión procariótica de genes de anticuerpo ha sido reportada como ineficaz para la producción de altos rendimientos de anticuerpo activo (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13). Células huéspedes de mamífero preferidas para la expresión de los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen Ovario rip Hámster Chino (células CHO) (incluyendo células dhfr-CHO, descritas en Uriaub y Chasin (1980) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 77:4216-4220, que se üTTIizañ c~o~n un marca-dar seleccionabie con DKifR, por ejemplo, de conformidad con lo descrito en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) Mol. Bioi. i 5 : óü i - 62 i ) , células de mieioma NSO, células COS y células SP2. En particular, para su uso con células de mieioma NSO, otro sistema'' de expresión preferido es el sistema de expresión de gen GS divulgado en los documentos O 87/04462, O 89/01036 y EP 338, 841. Cuando vectores de expresión recóiribinante que codifican genes de anticuerpo son introducidos en células de huésped de mamífero, los anticuerpos son producidos mediante el cultivo de las células huéspedes durante un lapso de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huéspedes o, con mayor preferencia, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en donde las células huéspedes crecen. Los anticuerpos pueden ser recuperados del medio de cultivo utilizando métodos estándares de purificación de proteína. U n r/p S m ncias de Anticuerpos Parciales para Expresar Anti-cuerpos Intacto3 A los anticuerpos interactúan con antígenos blanco predominantemente a través de residuos de aminoácido que se localizan en las seis regiones determinantes de comolementariedad (CDRs) de cadenas pesadas y ligeras. Por es a ra ón., las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más diversas entre anticuerpos individuales que secuencias fuera de la CDRs. Puesto- que las secuencias " de- DPT son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antí geno, es posible expresar anticuerpos recomomantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos que ocurren naturalmente mediante la construcción de "la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR a partir del anticuerpo específico que ocurre naturalmente injertado en secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con propiedades diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L. y colaboradores, 1998, Nature 332:323-327; Jones, P. y colaboradores, 1986, Nature 321:522-525; y Queen, C. y colaboradores, 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. U . S . A . 86:10029-10033) . Tales secuencias de estructura pueden ser obtenidas a partir de base de datos de ADN públicas que incluyen secuencias de gen de anticuerpos de línea germinal. Estas secuencias de línea germinal son diferentes de las secuencias maduras de gen de anticuerpo ?????- qij p no incluyen genes variables ensamblados totalmente, que se forman mediante la unión V(D)J durante la maduración de células B. Secuencias de gen de línea germinal serán también diferentes de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad de manera regular a través de la región variable. Por ejemplo, mutaciones «om.áf ir so relativamente infrecuentes en la porción amíno- terminai de la región de estructura. Por ejemplo, mutaciones somáticas son relativamente infrecuentes en la^porción amiño17 terminal de la región de estructura I y en la porción carboxí-terminal de la región de estructura 4. Además, muchas s LdCioriSS som ticas no alceran sigmficáii aiscntc la^ propiedades de enlace del anticuerpo. Por esta razón, no es necesario obtener todas las secuencias de · ADN de un anticuerpo particular con el objeto de recrear un anticuerpo recombinante intacto que tiene propiedades de enlace simiiares a iás propiedades del anticuerpo or-iginai (véase PCT/US99/05535 presentada el 12 de marzo de 1999,- que se incorpora aquí por referencia para todos los propósitos) . En la secuencia de cadena pesada y ligera parcial que abarca las regiones de CDR es típicamente suficiente para este propósito. La secuencia parcial se utiliza para determinar qué segmentos de genes de unión y variable de línea germinal contribuyeron a los genes variables de anticuerpos recombinados. La secuencia de línea germinal es después utilizada para llenar las porciones faltantes de las regiones variables. Secuencias líderes de .cadena pesada y ligera son disociadas durante la maduración de proteína, y no contribuyen a las propiedades del anticuerpo final. Por esta razón, es necesario utilizar la secuencia líder de línea germinal correspondiente para constructos de expresión. Para agregar secuencias faltantes, secuencias de ADNc clonadas cab pueden ser combinadas con oligonucleótidos sintéticos por ligación o amplificación. por reacción" en cadena de pT5 imera:s~a~ Alternativamente, toda ia región variable puede ser sintetizada como un conjunto de oiigonucleótidos cortos que se empalma, y combinada con amplificación por reacción en cadena de polimerasa para crear un clon de región variable totalmente sintético. Este proceso tiene ciertas ventajas como por ejemplo la eliminación o inclusión de sitios de restricción particulares o la optimización de codones par iculares . Las secuencias de nucleótidos de transcriptos de cadena pesada y ligera provenientes de hibrídomas se utilizan para diseñar un conjunto empalmado de oiigonucleótidos sintéticos para crear secuencias V sintéticas con capacidades de codificación de aminoácidos idénticas con relación a las secuencias naturales, ijas secuencias de cadena pesada y kappa sintéticas pueden diferir de las secuencias naturales en tres formas: series de bases de nucleótidos repetidas son interrumpidas para facilitar la síntesis d<= oí i gonvcleótidos y amplificación por reacción en cadena de polimerasa; sitios-de inicio de traducción óptimos son incorporados de conformidad con las reglas de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870); y sitios HindIII son manipulados corriente arriba de los sitios de inicio de traducción. Para reaiones variables tanto de cadena es da como de cadena ligera, las secuencias de cadena codificadoras optimizadas y no codificadoras correspondientes son divididas en 30^50 nuciectidos aproximadamente en la parte media del oligonucleótido no codificado correspondiente. Asi, para cada cadena, ios oiigonucieótidos pueden ¿er ensarabiados en ios grupos de cadena doble que se empalman que abarcan segmentos de 150-400 nucleótidos . Los conjuntos son después utilizados como templados para producir productos de amplificación por reacción en cadena de polimerasa de 150-400 nucleótidos. Típi amente, un grupo de oiigonucieótidos de región variable individual será dividido en dos grupos que son amplificados separadamente para generar los productos de PCV que se empalman. Estos productos que se empalman son después combinados por amplificación por PCT con objeto de formar la región variable completa. Puede ser también deseable incluir un fragmento que se empalma de la región constante de cadena pesada o ligera (incluyendo el sitio Bbsl de la cadena ligera kappa o el sitio Agel de la cadena pesada gamma) en la amplificación por reacción en cadena de polimerasa para generar fragmentos que pueden ser fácilmente clonados en los constructos de vectores de expresión. Las regiones variables de cadena pesada y ligera reconstruidas son después combinadas con secuencias de promotor clonado,- inicio de traducción , región constante, región no traducida 3' , poliadenilación y terminación de transcripción, para formar constructos de vectores de expresión. Los constructos de expresión de cadena pesada y ligera pueden ser combinados en un solo vector, cc- transfectados, transfectados en serie o transíectados separadamente en células huéspedes que son después fusi adas para formar un célula huésped que expresa ambas cadenas . 5 Plásmidos para su uso en la construcción de vectores de expresión para IgGK de ser humano se- describen abajo. Los plásmidos fueron construidos de tal manera que secuencias de ALiNc de cadena pesada V y cadena ligera V appa amplificadas por reacción en cadena de polimerasa pudieran utilizarse para 10 reconstruir minigenes de cadena pesada y ligera completos. Estos plásmidos pueden ser utilizados para expresar anticuerpos completamente humanos o bien anticuerpos Igd o IgG4K quiméricos. Plásmidos similares pueden ser construidos para expresión de otros isotipos de cadena pesada o para 15 expresión de anticuerpos que comprenden cadenas ligeras lambda . Asi, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de anticuerpos anti-PSMA—humanos de la presente invención, 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9, se utilizan para 2U crear anticuerpos anti-PSMA humanos estructuralmente relacionados que conservan por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de al invención , como por eiemplo enlace con PSMA. Más específicamente, una o varias regiones CDR de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9 pueden -2-5— com lrra-rs"e™"cte—TttaxreTa re"coirib±nHrrt¾™ con "regiones de estructura humanas conocidas y CDRs para crear anticuerpos anti-PSMA i üiuanos recoint)inantT?G?TG?tT ma ipu ± 3uOs, adicionales de la Por consiguiente, en otra modalidad, la invención ofrece método para preparar un anticuerpo anti-PSMA que comprende: preparar un anticuerpo que comprende: (i) regiones de estructura de cadena pesada de ser humano y CDRs de cadena pesao.a oe ser humano, en donoe por lo menos una de las CDRs de cadena pesada de ser humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de CDRs mostradas en la Figura 19 (SEQ ID NOs : 21-35); y (2) regiones de estructura de cadena ligera de ser humano y de CDRs de cadena ligera de ser humano, en donde por lo menos una de las CDRs de cadena pesada de ser humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre las secuencias de aminoácidos de CDRs mostradas en las Figuras 22 y 23 (SEQ ID en donde, el anticuerpo conserva la capacidad de unirse con PSMA. La capacidad dei anticuerpo para unirse con PSMA puede ser determinada empleando ensayos de enlace estándares, tales como los presentados en los Ejemplos (por ejemplo, ELISA) . Puesto que se sabe en la técnica que dominios CDR3 de cadenr. pesada y ligera de anticuerpos desempe an una funció particularmente importante éñ La especificidad/afinidad de enlace de un anticuerpo para un antigeno, los anticuerpos recombinantes de la presente invención preparados de conformidad con lo indicado arriba comprenden preferentemente las CDR3s de cadena pesada y ligera de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9. Los anticuerpos pueden comprender además las CDR2s de 4A3, 7F12, b'Ail, 8C12 ó 16F9. Los anticuerpos pueden comprender además las CDRis de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9. Por consiguiente, la invenció ofrece ademas anticuerpos anti-PSMA que comprende: (1) regiones de estructura de cadena pesada de ser humano, una región de CDR1 de cadena pesada de ser humano, una región CDR2 de cadena pesada de ser humano, y una región CDR3 de cadena pesada de ser humano, en donde la región CDR3 de cadena pesada de ser humano se selecciona entre las CDR3s de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9 como se muestra en la Figura 19 (SEQ ID NOs : 23, 26, 29, 32 ó 35); y (2} regiones de estructura de cadena ligera de ser humano, una región CDR1 de cadena ligera de ser humano, una región CDR2 de cadena ligera de ser humano, y una región. CDR3 de cadena ligera de ser humano, en donde la región CDR3 de cadona ligera de ser humano se selecciona entre las CDR3s de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9 como se muestra en las Figuras 22 y 23 (SEQ TD NOs: 38, 41, 44, 47 ó 50), en donde el anticuerpo se une con PSMA. El anticuerpo puede comprender ademas la CDR2 de cadena pesada y/o la CDR2 de cadena ligera de 4A3, 7F12, ~8A11, 8C12 ó 16F9. El anticuerpo puede comprender además la CDP.l de cadena pesada y/o la CDR1 de cadena ligera de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9. ?r&i.e en L i feii Le , l s CDR1, 2 y/o 3 de ios anticuerpos manipulados descritos arriba comprenden ia(s) secuencia (s) de aminoácido exacta (s) de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9 divulgadas aquí. Sin embargo, una persona con conocimientos ordinarios en la materia observará que algunas desviaciones 16F9 pueden ser posibles mientras se siga conservando la capacidad del anticuerpo para unirse con PSMA en forma efectiva (por ejemplo, sustituciones conservadoras). Por consiguiente, en otra modalidad, el anticuerpo manipulado puede consistir de una o varias CDRs con un nivel de identidad por ejemplo, de 90%, 95%, 98% ó 99.5% con una o varias CDRs de 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 ó 16F9. Además de unirse simplemente con PSMA., los anticuerpos manipulados tales como los descritos arriba pueden ser seleccionados por su retención de otras propiedades funcionales de anticuerpos de la invención, como por ejemplo: l) unirse a células vivas que expresan PSMA de ser humano; 2) unirse a PSMA de ser humano con una KD de 10"° M o menos (por ejemp]o, 1 O"9 M o 10"10 M o menos); 3) unirse a un epítopo único en PSMA (para eliminar la posib lidad que anticuerpos monoclonales con actividades complementarias cuando se utilizan en combinación pudiesen competir para enlazarse con el mismo epitopo) ; 4) i ibir el ta iiuj-eri o de células tumorales que expresan PSMA in vivo; y/o 5) fagocitosis y/o muerte de células que expresan PSMA en presencia de células efectoras humanas (por ejemplo, en un ensayo ADCC) . üár¿ict&£i zaciói'i cíe Enlace efe Anticuerpos Monoel onsl s Humanos con PSMA Anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención pueden ser probados para enlace con PSMA, por ejemplo, a través de ELISA estándar. En resumen, placas de itiicrotitulación son revestidas con PSMA purificado a 0.25 µ?/ml en PBS, _¡ después bloqueados con albúmina sérica bovina 5 al 5% en PBS. Las diluciones de plasma de ratones inmunizados con PSMA se agregan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a una temperatura de 37°C. Las placas son lavadas con PBS/Tween y después incubadas con un reactivo policlonal especifico para Fe de IgG anti-humana de cabra conjugado con ü fosfatasa alcalina durante i hora a una temperatura de 37°C. Después de lavado, las placas son reveladas con un sustrato de pNPP (1 mg/ml) . y analizadas a OD de 405-650. Preferentemente, ratones que desarrollan los títulos más altos serán utilizados p ra fusiones. 5 UrT ensayo ET,TS7Á~~"de cof¡1foTmi"oa¾ con " l"c—descrito arriba pueda también utilizarse para tamizar hibridomas que muestran una reactividad positiva con inmunógeno de PSMA. Los hibridomas que se unen con alca avidez a o con PSMA serán subcionauos y caracterizados adi cionalmente . Un clon de cada hibridoma que conserva la reactividad de las células de origen (por ELISA) , puede ser seleccionado para formar un banco de células de 5-10 frascos almacenados a una temperatura de -140°C, y para purificación de anticuerpos. Para purificar anticuerpos anti-PSMA humanos, hibridomas seleccionados pueden ser cultivados en frascos rotatorios de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonales. Sobrenadantes pueden ser filtrados y concentrados antes de cromatografía por afinidad con proteína A-sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) . IgG eluido puede ser revisado por electroforesis en gel y cromatografía de líquidos de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución amortiguadora puede ser camb pn P , y la concentración puede ser determinada por OD2S0 utilizando un coeficiente de extinción-de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden ser diluidos en alícuotas y almacenados a una temperatura de -80°C. Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-PSMA de ser humano se unen con epítopos únicos, cada anticuerpo puede ser bio ir>'51 ado . utilizando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford., ID . Estudios de competencia utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos" ,? monoclonal.es biotimlados pueden ser efectuados empleando placas ELISA revestida con PSMA de conformidad con lo descrito arriba. El enlace de mAD oiotinilauo puede ser detectado con una sonda de strep-avidin-fosfatasa alcalina. Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados,- ELISAs de isotipo pueden efectuarse. Pozos de placas de microtitulación pueden ser revestidos con 10 µ?/p?? de Ig antihumana durante la noche a una temperatura de °C. Después de bloquear con BSA al 5%, las placas reaccionan con 10 g/ml de anticuerpos monoclonales o controles de isotipos purificados, a temperatura ambiente durante dos horas. Los pozos pueden ser después reaccionados ya sea con IgGl humana o con sondas conjugadas con fosfatasa alcalina especificas para IgM de ser humano. Las placas son reveladas y analizadas de conformidad con lo descrito arriba. Con el objeto de demostrar el enlace de anticuerpos iiiunu iuiiaies con ocluías vivas que x resa PSMA, se puede utilizar citometria de flujo. En resumen, lineas de células que expresan PSN171. (cultivado en condiciones de cultivo estándares) se mezclan con varias concentraciones de anticuerpos monoclonales en PBS que contiene Tween 80 al 0.1% y suero de ratón al 20%, y se incuba durante 1 hora a una Lfeiu t;j.aLu de 37°C. Después del lavado, las . células reaccionan con anticuerpo IgG anti-humano marcado con Fluoresceína bajo las mismas condiciones que la tinción de anticuerpo primario. Las muestras pueden ser analizadas por instrumento FACScan empleando propiedades de difusión luminosa y lateral para enfocar células individúalas . Un ensayo alternativo empleando microscopía de fluorescencia puede emplearse además del ensayo de citometría de flujo o en lugar de dicho ensayo. Las células pueden ser teñidas exactamente de conformidad con lo descrito arriba y examinadas por microscopía de fluorescencia. Este método —¦ permite la visualización de células individuales, pero pueden tener una sensibilidad disminuida según la densidad del antígeno . IgGs humanas anti-PSMA pueden ser probadas adicionalmente para reactividad con antigeno PSMA por análisis Western blot .

En resumen, extractos de células provenientes de células que expresan PSMA pueden prepararse y someterse a electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico (SDS).

Después de la electroforesis, ios antígenos separados serán tra-nsferidos a membranas de nitrocelulosa, bloqueados con. suero de ratón al 20%, y sondeados con anticuerpos monoclonales a probar. El enlace de IgG de ser humano puede detectarse empleando fosfatasa alcalina anti-IgG de ser humano y revelado con tabletas de sustrato BCIP/NBT (Sigma r.hem. C.n .. st. Louis. MO) . Actividades Fagociticas y de Muerte Celular de Anticuerpos Monoclonales Humanos para PSMA Además de enlazarse específicamente con PSMA, anticuerpos anti-PSMA monoclonaies humanos pueden ser probados para determinar su capacidad de mediax l fago i LOSÍÓ y muerte de células que expresan PSMA. La prueba de actividad de anticuerpo monoclonal in vi tro proporcionará un tamizado inicial antes de probar modelos in vivo. En resumen, células polimorfonucleares (PMN) , - u otras células electoras, de donadores sanos pueden ser purificadas por centrifugación de densidad Ficoll Hypaque, seguida por lisis de eritrocitos contaminantes. Las PMN lavadas pueden ser suspendidas en RPMI complementado con suero de becerro fetal térmicamente desactivado al 10% y se pueden mezclar con células marcadas con D1Cr que expresan PSMA, en varias proporciones entre células efectoras y células tumorales (células efectoras : células tumorales). IgGs anti-PSMA de ser humano purificadas pueden ser agregadas en varias concentraciones. Q nii He ut- i ? 7.a TgG humana irrelevante como control negativo. Ensayos pueden ser efectuados durante 0-120 minutos a una temperatura de 37 °C. Muestras pueden ser ensayadas para citólisis mediante la medición de la liberación de 51Cr en el sobrenadante de cultivo. Anticuerpos monoclonaies anti-PSMA pueden también probarse en combinaciones entre ellos para dete^mi si la ritól i es incrementada con múltiples anticuerpos monoclonaies. Anticuerpos monoclonaies humanos que se unen "con PSMA pueden también ser probados en modelo ir. vivo (por e emplo, en ratones) para determinar su eficacia en la mediación de la fagocitosis y muerte de células que expresan PSMA, por ejemplo. células tumorales . Estos anticuerpos pueden ser seleccionados, por ejemplo, con base -en los criterios siguientes que no se contemplan como exclusivos: 1) enlace con células vivas que expresan ESMA; 2) alta afinidad de enlace con PSMA; 3) enlace con un epitopo único en PSMA (para eliminar la posibilidad de anticuerpos monoclonales con actividades complementarias cuando se utilizan en combinación pudieran competir para enlace con el mismo epitopo) ; 4) opsonización de células que expresan PSMA; 5) medición de la inhibición del crecimiento, fagocitosis y/o muerte de células que expresan PSMA en presencia de células efectoras humanas. Anticuerpos monoclonales humanos preferidos de la invención satisfacen uno o varios, y preferentemente todos, estos criterios. En una modalidad particular, los anticuerpos monoclonales humanos se utilizan en combinación, por ejemplo, como una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales anti-PSMA o fragmentos de los mi sTnns . Por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-PSMA humanos que tienen actividades diferentes, pero complementarias pueden combinarse en una sola terapia "para /4 legrar un efecto terapéutico o de diagnóstico deseado. Una ilustración de esto seria una composición que contiene un anticuerpo monocionai humano anti-PSMA que media la muerte altamente efectiva de células blanco en presencia de células efectoras, en combinación con otro anticuerpo monocionai · anti-PSMA humano que inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA. II. Producción de Animales No Humanos Transgénicos Que-Generan Anticuerpos Anti-PSMA Monoclonales Humanos En otro aspecto, la invención ofrece animales no humano transgénicos y transcromosómicos tales como ratones transgénicos o transcromosómicos que pueden expresan anticuerpos monoclonales humanos que se unen específicamente a PSMA. En una modalidad particular, la invención proporciona un ratón transgénico o transcromosómico que tiene un genoma que comprende un transgen de cadena pesada de ser humano, de al manera que el ratón produzca anticuerpos anti-PSMA humanos cuando es inmunizado con PSMA y/o células que. expresan PSMA. El transgen de cadena pesado de ser humano puede ser integrado en el ADN cromosómico del ratón, como en el caso de ratones transgénicos, por ejemplo, ratones HuMAb, seaún lo descrito con detalles aquí y ejemplificado. Al tprnati vamente. el transgen de cadena pesr.da de ser humano puede ser mantenido de manera extracromosómica, como en el caso de ratones transcromosómicos (por ejemplo"; KHf"" según lo" descrito en el documento WO 02/43478. Tales animales transgénicos y transcromosómicos son capaces de producir múltiples isotipos de anticuerpos monoclonales humanos para PSMA (por ejemplo, IgG, IgA y/o IgE) mediante sometimiento a recombinación a V-D-J y cambio de isotipo. El cambie de isotipo puede ocurrir, por ejemplo, por cambio clásico o no clásico de isotipo. El diseño de un animal no humano transgénico o transcromosómico que responde a una estimulación por antigeno foráneo con un repertorio de anticuerpo heterólogo, requiere que los transgenes de inmunoglobuiina heterólogos contenidos dentro del animal transgénico funcionan correctamente en la vía de desarrollo de células B. Esto incluye, por ejemplo, cambio de isotipo del transgen de cadena pesada heterólogo. Por consiguiente, transgenes son construidos de tal manera que produzcan cambio de isotipo y uno o varios de los si gni nffis: (1) expresión especifica para tipo celular y de alto nivel, (2) reacomodo de gen funcional, (3) activación de respuesta a exclusión alélica, (4) expresión de un repertorio primario suficiente, (5) transducción de señales, (6) hipermutación somática, y (7) dominación del locus de anticuerpo de transgen durante la respuesta inmune. ?<~> t"odos los criterios antes mencionados tienen que cumplirse. Por ejemplo, en las modalidades en donde los loci de inmunoglobuiina endógena del animal transgénico est n ?? f ncionalmente perturbados, no es necesario que el transgen active una exclusión alélica. Además, en las modalidades en las cuales el transgen comprende un gen de inm nogiobul na de cadena pesada y/o de cadena ligera funcionalmente reacomodado, el segundo criterio de- reacomodo de gen funcional no es necesario, por lo manos en el caso del transgen ya reacomodado. Para antecedentes sobre inmunología muiecuiax , véase Fúndamental Immüno1ogy [Inmunología Fundamental], Segunda Edición, (1989), Paul William E . , ed. Raven Press, Nueva York, que se incorpora aquí por referencia . En ciertas modalidades, los animales no humanos transgénicos o transcromosómicos utilizados para generar los anticuerpos monoclonales humanos de la invención contienen transgenes de cadena pesada y de cadena ligera de inmunoglobulina heteróloga reacomodados, no reacomodados, o bien una combinación de reacomodados v no reacomodados en la línea germinal del animal transgénico. Cada -uno de los transgenes de cadena pesada comprende por lo menos un gen CK. Además, el transgen de cadena pesada puede comprender unas secuencias de cambio de isotipo funcionales que son capaces de soportar el cambio de isotipo de un transgen heterólogo que codifica, múltiples genes CH en las células B del animal transqéniro. Tales secuencias de cambio pueden ser las secuencias que ocurren naturalmente en el Ibcus de~ nmunogTobulina""ae línea / / germinal a partir de la expresión que sirve como fuente cíe los genes de CH de transgen, o bien tales secuencias de cambio pueden ser derivadas de las que ocurren en la especie que debe recibir el constructo de - transgen (el animal transgénico) . Por ejemplo, un constructo de transgen humano que se utiliza para producir un ratón transgénico puede producir una frecuencia mayor de eventos de cambio de isotipo si incorpora secuencias de carabio similares a las secuencia-s-que ocurren naturalmente en el locus de cadena pesada de ratón, puesto que probablemente las .secuencias de cambio de ratón son optimizadas para funcionar con el sistema de enzima recombinasa de cambio de ratón, mientras que las secuencias de cambio de ser humano no lo son. Secuencias de cambio pueden ser aisladas y clonadas por métodos de clonación convencionales o bien pueden ser sintetizadas de novo a partir de oligonucleótidos sintéticos que se empalman diseñados con base en la información de secuencia publicada con relación a secuencias de región de cambio., de inmunoglobulina (Mills y colaboradores, Nucí. Acids, Res. 15:7305-7316 (1991); Sideras y colaboradores, lntl . Inmuno1. 1:631-642 (1989), que se incorporan aquí por referencia). Para cada uno de los animales transgén i.r.os antes mencionados, transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada y de cadena ligera heterólogos reacomodados se encuentran en una fracción significativa de las "células ? del anImaT~trarisgeñÍco (por lo menos 10%) . Los transgenes utilizados para generar los animales ti' üdytínicos de la presente invención incluyen un transgen de cadena pesada que comprende ADN que codifica por lo menos un 5 segmento de gen variable, un segmento de gen de diversidad, un segmento de gen de unión y por lo menos un segmento de gen de región constante. El transgen de cadena ligera de inmunogIobu11nar™com rende ADN que codifica por lo menos un segmento de gen variable, un segmento de gen de unión y por 10 lo menos un segmento de gen de región constante. Los segmento de gen que codifican los segmentos de gen de cadena ligera y de cadena pesada son heterólogos para el animal no humano transgénico en la medida en que se derivan o corresponden a ADN que ^odifica segmentos de gen de cadena pesada y de 15 cadena ligera de inmunoglobulina de una especie que no consiste del animal no humano transgénico. En un aspecto de la invención, el transgen se construye de tal manera que ios segmentos de gen individuales no son -reacomodado, es decir, no son reacomodados para codificar una cadena ligera o pesada 20 de inmunoglobulina funcional. Tales transgenes no reacomodados soportan la recombinación de los segmentos de gen V, D y .1 ( eacomodación funcional) y preferentemente sopo-tan la incorporación de la totalidad o de una parte de un segmento de gen de región D en la cadena pesada de -zh5 Iftmtm^- ro T rlrra—rem^TiitcrctadB—resulLante terrtro" del animal ño humano transgénico cuando están expuestos a antígeiio PSMA. En una modalidad alternativa, los transgenes comprenden un vrúin.i~"locus" no reacoiuodado . Tales trarisgenes orrip eij-t eii típicamente una porción sustancial de los segmentos C, D y J •5 así como un cubgrupo de- los segmentos xie - gen V. En tales constructos de transgen, las varias— secuencias reguladoras, por ejemplo, promotores, realzadores, regiones de cambio de clase, secuencias de donador' 'emp lm y de aceptador e empalme para procesamiento de ARN, señales de recombinación y 10 similares, comprenden secuencias .correspondientes derivadas del ADN heterólogo. Tales secuencias reguladoras pueden ser incorporadas en el transgen a partir de la misma especie o de una especie relacionada del animal no humano utilizado en la invención. Por ejemplo, segmentos de gen de inmunoglobulina 15 de ser humano pueden ser combinados en un transgen con una secuencia realzadora de inmunoglobulina de roedor para su uso en un ratón transqénico. Alternativamente, secuencias reguladoras sintéticas pueden ser incorporadas en el transgen, en donde tales secuencias reguladoras sintéticas no 20 son homologas a una secuencia de ADN funcional la cual se sabe ocurre naturalmente en los genomas de mamíferos. Secuencias reguladoras sintéticas son diseñadas de conformidad con reqlas de consenso, por ejemplo, las reglas que especifican las secuencias permisibles del sitio " 5 axrepta'drir d¾ ^emipalme o un—ittcrt±vo ~de—promrrtoir r 3±^radcnrT—?st" ejemplo, un mini-locus que comprende una parte del locus de inmunoglobulina genómica que tiene por lo menos una deieción inte a (es decir, no un extremo de la porción; e u a porción de ADN no esencial (es decir, secuencia de intervención; intrón o porción del mismo) en comparación con el locus de Ig de línea germinal que ocurre naturalmente. En una modalidad preferida de la invención, el .animal r.ransgenico o uranscromosomico u ni zado para gen-erar anticuerpos humanos para PSMA contiene por lo menos una copia, típicamente de 2 a 10 copias y a veces 25 a 50 o más copias del transgen descrito en el ejemplo 12 de WO 98/24884 (por ejemplo, pHCl ó pHC2 ) criado con un animal que contiene una sola copia de un transgen de cadena ligera descrito en los ejemplos 5, 6, 8, i 14 de WO 98/24884, y las crías criadas con el animal sin JH descrito en el ejemplo 10 de WO 98/24884, cuyos contenidos se incorporan expresamente aquí por referencia. Se crían animales hasta la homocigocidad para cada uno de estos tres rasgos. Tales,, animales tienen el genotipo siguiente: una sola copia (por grupo haploide de cromosomas) de un mini-locus no reacomodado de cadena pesada de ser humano (descrito en el ejemplo 12 WO 98/24884), una sola copia (por grupo haploide de cromosomas) de un constucto de cadena ligera K ce ser humano reacomodado (descrito en el ejemplo 14 de WO 98/24884), y una deieción en cada locus de de C"adrena~~p"e"sada—de r^rtón—ettdógen©—que—remueve—i-a—tot-al-tdad- cíe los segmentos JH funcionales (descri o e ei ejemplo lu te O 98/24884) . Tales animales son criados con ratones que son hoitLO iyo Lie s para la. deleción de ios segmentos JH (e em lo 10 98/24884) para producir crias que son homocigóticas para la deleción de JH y hemizigóticas para los constructos de cadena pesada y ligera de ser,, humano. Los animales resultantes- reciben inyecciones de antígenos y se utilizan para la producción de anticuerpos monocionalcs humanos contra estos antigenos. Células B aisladas de un animal de este tipo son monoespecíficas con relación a las cadenas pesadas y ligeras de ser humano puesto que contienen solamente una copia de cada gen. Además, serán monoespeci ficas con relación a cadenas pesadas de ser humano o de ratón puesto que ambas copias de gen de cadena pesada de ratón endógenas no son funcionales en virtud de la deleción que abarca la región JH introducido de conformidad con lo descrito en los ejemplos 9 y 12. de WO 98/24884. Además, una fracción sustancial de las células B será monoespecífica con relación a las cadenas ligeras de ser humano y de ratón debido a la expresión de una sola copia del gen de cadena ligera ? de ser humano reacomodado excluirá alélica e isotópicamente en reacomodo de los genes de cadena lambda y ? de ratón endógenos en una fracción significativa de las células B. í-ñ maTes ño humanos tTrarrs-gérri-cos y t-r^a¾se^omo¾-éift-e©¾-- preferidos, per ejemplo, ratones, presentarán una producción de inmunoglobuiina con un repertorio significativo, e idealmente sustanciaimente similar ai repertorio ae un ratón activo. Asi, por ejemplo, en modalidades" en donde genes de Ig 5 endógenos han sido desactivados, los" niveles" totales de inmunoglobuiina estarán dentro de un rango de aproximadamente Q.l a 10 mg/ml de suero, preferentemente de 0.5 a 5 mg/ml idealmente de apro imadamente por lo "menos 1.0 mg/ml. Cuando un transgen capaz de efectuar un cambio a IgG a partir de IgM 10 ha sido introducido en el ratón transgénico, la proporción en el ratón adulto entre IgG sérica e IgM sérica será preferentemente de aproximadamente 10:1. La proporción entre IgG y IgM será mucho más baja en el ratón inmaduro. En general, más que aproximadamente 10%, preferentemente de 40 a 15 80% de las células B de bazo v de nodo linfático expresan exclusivamente proteína IgG de ser humano. El repertorio será idealmente cercano a lo mos rarlo en un ratón activo, habitual-me-n-te por lo menos aproximadamente hasta 10%, preferentemente de 25 a 50% o más. En general, por 20 lo menos aproximadamente mil inmunoglobulinas diferentes (idealmente IgG) , preferentemente de 104 a 10 o más serán producidas, según primariamente el número de regiones V, J y D diferentes introducidas en el genoma del ratón. Estas inmunoglobulinas reconocerán típicamente aproximadamente ]a -2-5 mita-d—o—más—efe—pru teínas al' LamenLe' anLxg¾nicas, por e emplo, protelna ? de estarilicocos . Típicamente, las inmunoglobulinas presentarán una afinidad para antigeno pre- seleccionados de por lo menos apioximadairter.ce lu'í-i preferentemente de por lo menos aproximadamente ??'?-G1, con 5 mayor preferencia por lo menos aproximadamente ¦·¦¦¦-!¦?^??G', 10~"M_i, 1012?-1, o más, por ejemplo, hasta lO^M"1 o -más. En algunas modalidades, puede ser preferible generar animales no humanos con repertorios predeterminados para limitar la selección de genes V representados en la respuesta de 10 anticuerpo a un tipo de antigeno predeterminado. Un transgen de cadena pesada que tiene un repertorio predeterminado puede comprender, por ejemplo, genes VH de ser humano, preferentemente utilizados en la respuesta de anticuerpo al tipo de antigeno predeterminado en seres humanos. 15 Alternativamente, algunos genes VH pueden ser excluidos de un repertorio definido por varias razones (por ejemplo, tienen una baja probabilidad de codificación de regiones V de alta afinidad para el antigeno predeterminado; tienen una baja propensión a someterse a mutaciones somáticas y afinación por 20 afinidad, o son inmunogénicos para ciertos seres humanos) . Por consiguiente, antes del reacomodo de un transgen que contiene varios segmentos de gen de cadena pesada o de cadena ligera, tales segmentos de gen pueden ser identificados fácilmente, por ejemplo, por hibridación o secuenciamiento de ~2B AL>'w, como pertenecierrcto a una e"sp"ecie de organismo—crtro—que" el animal transgénico. Los animales no humanos transgénicos y transcromosómicos, por ejemplo, ratones, de conformidad con lo descrito arriba, pueden ser inmunizados, por ejemplo con una preparación -purificada o recombinante de PSMA y/o células que expresan . PSMA de conformidad con lo previamente descrito. Alternativamente, los animales transgénicos pueden ser inmunizados con AD que codifica P M n mano . los animarl " producirán entonces células B que serán sometidos a cambio de clase a través de recombinación de ciase intra-transgen (cambio cis) y expresan inmunoglobulinas reactivas con PSMA. Las inmunoglobulinas pueden ser anticuerpos humanos (se conocen también como "anticuerpos de secuencias humanas") , en donde los polipéptidos de cadena pesada y ligera son codificados por secuencias de transaen de ser humano, que pueden incluir secuencias derivadas por mutación somática y uniones recombinatorias de región V asi como secuencias codificadas por linea germinal; estos anticuerpos ^humanos pueden ser referidos como sustancialmente idénticos a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen VL ó VH de ser humano y un segmento JL ó JL de ser humano, aún cuando otras secuencias no de linea germinal pueden estar presentes como resultado de mutación romática y uniones de recombinación diferencial V-J y V-D-J. Las regiones variables de—ada—cadena—de—airt-rcrtterpo—SOrr-t±p±caiiierrte—codifi a±a~^pü~ lo menos en un 80% por segmentos de gen V, J y en el caso de cadenas pesadas . D, de línea germinal de ser humano, variables son codificadas por secuencias "de línea germinal de ser humano presentes en el transgen; frecuentemente, 90 ó 95 por ciento o más de las secuencias de .región variable son codificadas por secuencias de línea germinal de ser humano no de línea germinal son introducidas por mutación somática y unión VJ y VDJ, los anticuerpos de secuencia de ser humano tendrán frecuentemente algunas secuencias de regiones de variable (y menos frecuentemente secuencias de región constante) que no son codificadas por segmentos de gen V, D ó J de ser humano como se encuentra en el (los) transgen (es) de ser humano en la línea germinal de ratones. Típicamente, tales secuencias no de línea germinal (o bien posiciones de nucleótidos individuales) se agruparán en CDRs o cerca de CDRS, o bien en regiones en donde se sabe que se agrupan las mutaciones somáticas. Anticuerpos humanos que se unen al antígeno predeterminado pueden resultar a partir de cambios de isotipo, de tal manera que se produzcan anticuerpos humanos rque comprenden una cadena ? de secuencia humana (por ejemplo, ??, ?2, ?3 ó ?4) y una cadena ligera de secuencia humana (por ejemplo, K) . Tales anticuerpos de ~ s¾^ireirr B~ "Ixumpnas—cun —cannfcro—de""Isotipo contienen frecuentemente una o varias mutaciones somáticas, típicamente en ia región variable y frecuentemente en una CDR o dentro de apioximadamt 10 residuos de una CDR) co o resultado de maduración por afinidad y selección de células B por antigeno, especialmente después de un reto -con antígeno secundario (o bien subsiguiente) . Estos anticuerpos de secuencias humanas de alta afinidad pueden tener KDS de 10" M c menos, por ejemplo 10"" M o menosT 10^—M~ o menos, o bien J.u 10 M o menos, o hasta menos. Otro aspecto de la invención se refiere a las células B derivadas de animales no humanos transgénicos o transcromosómicos de conformidad con lo descrito aquí. Las células B pueden ser utilizadas para generar hibridomas que expresan anticuerpos monoclonales humanos que se unen con alta afinidad (por ejemplo, KD de 10"' M o menos) a PSMA. Así, en otra modalidad, la invención ofrece un hibridoma que produce un anticuerpo humano aue tiene KD de 10"' M o menos, por ejemplo, 10"8 M o menos, 10"9 M o menas, 10"10 M o menos, o hasta menos, en donde el anticuerpo comprende: una cadena ligera de secuencia humana que consiste de (1) una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente Idéntica a una secuencia, de polipéptidos codificada ..por un segmento de gen vL de ser humano, y un segmento JL de ser humano y (2) una región constante de cadena ligera que tiene una s^corerrcxH—o¾~ polípépt icios sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen CL de ser humano ; y una cadena pesada de secuencia humana que" consiste de (1) una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente idéntica a- una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen VH de ser huiaano, opcionalmente una región D, y un segmento TJM de -ser humano, y (2) una región constante que tiene una secuencia de polipéptidos sustancialmente idéntica a una secuencia de polipéptidos codificada por un segmento de gen CH de ser humano . El desarrollo de anticuerpos monoclonales humanos de alta afinidad contra PSMA se facilita a través de un método para ampliar el repertorio de segmentos de gen de región variable de ser humano en un ratón transgénico que tiene un genoma que r m nH "n transgen de inmunoglobulina de ser humano integrado, dicho método comprende la-— introducción -en el genoma de un transgen de gen V que comprende segmentos de gen de región V que n están presentes en dicho transgen de inmunoglobulina de ser humano integrado. Frecuentemente, el transgen de región V es un cromosoma artificial de .levadura que comprende u porción de un conjunto... de segmentos de gen VH Ó VL (VK) de ser humano como puede ocurrir naturalmente en üñ genoma humano " ó bien qué pueden empalmarse juntos separadamente por métodos recombinantes, que pueden incluir segmentos de gen V fuera de orden u omitidos. Frecuentemente, por lo menos cinco o más segmentos de gen V funcionales se encuentran en el YAC. En esta variación, es posible elaborar 5 ratones transgénicos producidos por el método de -expansión de repertorio de V, en donde el ratón expresa una cadena de inm noglobul i-na que comprende una secuencia de región variable codificada por un segmento de región V presente en el transgen de región V y una región C codificada por el 10 transgen de Ig de ser humano. A través del método de expansión de repertorio V, ratones transgénicos que tienen por lo menos cinco genes V distintos pueden ser generados; así como ratones que contienen por lo menos aproximadamente 24 genes V o más. Algunos segmentos de gen V pueden ser no 15 funcionales (por ejemplo, pseudo genes y similares) ; estos segmentos pueden ser conservados o bien pueden ser ?^? sart-i mpnfp borrados por métodos recombinantes disponibles para les personas con conocimientos en la materia, si se desea . 20 Una vez que la línea germinal de ratones ha sido manipulada para que contenga un YAC funcional que tiene un repertorio de segmento V expandido,- sustanci.almente no presente en el ra sg n d Tg de ser humano que contiene los seqmentos de gen J y C, el rastro puede ser propagado y transferido a ~2~5 otros " fondos genéticos, iTicixryeTido—fOTKKTS—en—donde—e±—YAC' funcional que tiene un repertorio de segmentos V expandido es introducido en una linea germinal de ratón que tiene un transgen de Ig hum no diferente. Múltiples YACS runcionaies que tienen un repertorio de segmento V expandido pueden ser introducidos en una linea germinal para funcionar con un transgen de Ig de ser human (o bien varias transgenes Ig de ser humano) . Aún cuando nos- referimos aqui a transgenes YAC, tales transgenes cuando están- integrados en el genoina pueden presentar una falta sustancial de secuencias de levadura, tales como las secuencias requeridas para replicación autónoma en levadura; tales secuencias pueden opcionalmente ser removidas por manipulación genética (por ejemplo, digestión por restricción asi como electroforesis en gel en carneo pulsado u otro método adecuado) después la replicación de levadura ya no es necesaria (es decir, antes de la introducción en una célula ES de ratón o prozigoto de ratón) . Métodos de propaaación del rasqo de expresión de in unoglobulina de secuencia de ser humano incluyen el hecho de criar un ratón transgénico que tiene el transgen o los U transgenes de Ig de ser humano y opcionalmente que tiene un YAC funcional con un repertorio expandido de segmentos V. Tanto segmentos de gen VK como L pueden estar presentes en el YAC. El ratón transgénico puede ser cruzado en cualquier fondo deseado por la persona con conocimientos en la materia 5 Incluyeñdo fondos que cón ieríeñ otros tr¾n~sg¾"ne~s hima~rrosy incluyendo transgenes de ig de ser humano y/o transgenes que codifican otras proteínas de linfocito-" de ser humano. La mv nción ofrece Lafiibiéii uii iniaunoglob lina de secuencia cí ser humano de alta afinidad producida por un ratón transgénico que tiene un transgen -YAC con repertorio expandido de región V. Aún cuando lo anterior describe una modalidad preferida del animal transgénico de- la invención, otras mod lidad s se contemplan Irars' cuales nan sido clasificadas en cuatro categorías: I. Animales transgénicos gue contienen un transgen de inmunoglobulina de cadena pesada no reacomodada y de cadena ligera reacomodada; II. Animales transgénicos gue contienen un transgen de inmunoglobulina de cadena pesada no reacomodada y cadena ligera no reacomodada; III. Animales transgénicos que contienen un transgen de inmunoglobulina de cadena pesada reacomodada y de cadena ligera no reacomodada; —- IV. Animales transgénicos que contienen transgenes de inmunoglobulina de cadena pesada reacomodada y de cadena ligera reacomodada. Entre estas categorías de animales transgénicos,- el orden preferido de preferencia es el siguiente II > I > III > iv en donde los genes de cadena ligera endónenos (o bien por lo -m rrers—el—g-err-Kr)—han sido noqueados p_or recombinación homologa (u otro método) y I > II > III > IV en donde los genes de cadena ligera endónenos no han sido noqueados y deben ser dciu-Liiidos por exclusión alélica . III. Moléculas biespecíficas/multiespecíficas que se unen con 5 ¦ PSMA - - En otra modalidad de la invención, anticuerpos monocionales humanos para. PSMA, o bien porciones de unión con antígeno de "los mismos, pueden ser derivados o enlazados con otra" molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína (por 10 ejemplo, un fragmento Fab' ) para generar una molécula biespecífica o multiespecífica que se une a sitos de enlace múltiples o epítopos blanco. Por ejemplo, un anticuerpo o porción de enlace con antígeno de la presente invención puede estar enlazado luncionalmente (por ejemplo, por acoplamiento 15 químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) con una o varias otras moléculas de unión, como por ejemplo otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de enlace. . .. _ Por consiguiente, -la presente invención incluye moléculas 20 biespecí ficas y multiespecíficas que comprenden por lo menos una primera especificidad de unión para PSMA y una segunda especificidad de unión .para un segundo epítopo blanco. En una modalidad ^articular de la invención, el sequndo epítopo blanco es un receptor Fe, por ejemplo, FcvRI humano (CD64) o -2-5 fcráren—ttn—receptor—Fea—hramarrcí—CD89) .—?st consiguiente, Ta invención incluye moléculas biespecificas y multiespecificas que pueden enlazarse tanto con FcyR, FcocR ó FCER que expresan c lulas efectoras j ejemplo, rüonocj-tos, ríiacrc o células polimorfonucleares (PMNs)), y para enfocar células que expresan PSMA. ¦ Estas moléculas biespecificas y multiespecificas enfocan células que expresan PSMA hacia la célula efectora y, como- los anticuerpos monoclonaies humanos cíe a i nció , " c i n-*" actividades d ce-Lulas e ectoras mediadas por receptor Fe, como por ejemplo fagocitosis de una célula que expresa PSMA, citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpos (ADCC) , liberación de citocina, o generación de anión superóxido. Moléculas biespeci ficas y multiespecificas de la presente invención pueden incluir además una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión anti-Fc y una especificidad de unión anti-PSMA. En una modalidad, la tercera especificidad de unión es una porción de factor anti-incremento (EF) , como por ejemplo una -molécula que se une sobre una proteína de superficie involucrada en una actividad citotóxica y por consiguiente incrementa la respuesta inmune contra la célula blanco. La "porción de factor de antiincremento" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, como por e emplo un antígeno o un receptor, y que resulta por coTrsTgn entre-errnin^^crrenreTrto" los detériñinantes" de unión para el receptor Fc c antigeno de célula blanco. La "porción de factor anti-incremento" puede unirse con un receptor Fc o un antigeno de célula blanco. Alternativamente, la porción de factor anti-incremento "puede unirse a una entidad diferente de la entidad a la cual se -une-- La primera y segunda especificidades de enlace. Por ej-emplo, la porción de factor anti-incremento puede unirse a una célula T citotóxica (por ejemplo a través de CD2, CD3,~ ¡S¾o, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que resulta en una respuesta inmune incrementada contra la célula blanco) . En una modalidad, las moléculas biespecificas y multiespecificas de la invención comprenden como especificidad de enlace por lo menos un anticuerpo un fragmento de anticuerpo del mJ.sitio, que incluye, por ejemplo, un Fab, Fab' , F(ab Fv o un Fv de cadena sencilla. El anticuerpo puede ser también un dimero de cadena ligera o de cadena ^saHa o cualquier fragmento mínimo del mismo, como por ejemplo un Fv o un constructo --de- cadena sencilla de conformidad con lo descrito en Ladner y colaboradores, Patente Norteamericana No. 4,964,77b expedida el dia 7 de Agosto de 1990, cuyos contenidos se incorporan expresamente <^qui o referenci . Fn nn -modalidad, moléculas biespecificas y multiespecificas de la presente invención comprenden una especificidad de enlace para un FcyK o FcsR p~r"e-s¾Trte~~grr~1¾~~sn ¦e tirre-o¾ ~ una célula efectora, y una segunda especificidad de enlace para un antigeno de célula blanco, por ejemplo, PSMA. En UÍÍQ itiodaiidad, la eapecilicj-dad de enlace para un receptor Fe se proporciona a través de un anticuerpo monoclonal humano, cuyo enlace no está bloqueado por inmunoglobulina G humana ( IgG) . Como se emplea aquí, el término "receptor para - IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor de transmembrana o soluble agrupados en tres clases de receptores Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) . En una modalidad preferida, el receptor Fcy es un FcyRI de alta afinidad de ser humano. El FcyRI de ser humano es una molécula de 72 kDa que muestra una alta afinidad para IgG monomérica (10?-10' M"*) . La producción y caracterización de estos anticuerpos monoclonales preferidos se describen en Fanger y colaboradores, en la solicitud FCT WO 88/00052 v en la Patente Norteamericana No. 4, 954,61-7 cuyas enseñanzas se incorporan totalmente aquí por referencia. Estos anticuerpos se unen a .un epitopo de FcyRI, FcyRII o FcyRI II en un sitio distinto de sitio de unión Fcy de receptor y, por consiguiente, su unión no está bloqueada, sustancialmente por niveles fisiológicos de IgG. Anticuerpos anti-FcyRI específicos útiles en la invención son mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El hibridoma que próduce^mAb 3"2_^s a~~disponible en la American Type Culture Ccliection, Número de Acceso ATCC HB96469. En otras modalidades, el anticuerpo antireceptor CY es una forma humanizada del anticuerpo monoclonai 22 (H22) . La producción y caracterización del anticuerpo H22 se 5 describe en Graziano, R. F. y colaboradores (1995) J. Immunol 155 (10); 4996-5002 y PCT/US93/10384. La linea de células que producen anticuerpo H22 fue depositada en la American Type Culture CollectioTi bajo la designación HA022CL1 y tiene el número de acceso CRL 11177. 10 En otras modalidades preferidas, la especificidad - de unión para un receptor Fe proporciona a través de un anticuerpo que se une a un receptor para IgA de ser humano, por ejemplo, un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89) ) , cuyo enlace preferentemente no es bloqueado por inmunoglobulina humano A (IgA). El 15 término "receptor para IgA" incluye el producto génico de un gen oc (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica varias isoformas de transmenibrana -alternativamente empalmadas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, 20 granulocitos eosinofílieos y neutrofílieos , pero no en poblaciones de células no efectoras. FCOÍRI tiene afinidad media (* 5 x 10' M"1) tanto para TgA] como para IgA2, dicha afinidad se incrementa al estar 3xpuesto a citocinas, como por ejemplo G-CSF o GM-CSF (Morton, H. C. y colaboradores -2-5 —er-rtrrra±—tevrews" in ímmunology—_r&T^2¾=í¾O")"T "'" "Cuatro anticuerpos monocionaies específicos para FCOÍRI ,¦ identificados como A3, A59, A2 y A77, que se unen fuera de FcaRI con el dominio de enlace de ligando Ic¡A, ???? Sido descritos (Monteiro, R. C. y colaboradores 1992, J. Immuncl. 148: 1764) . ' " —- " FcaRI y FcyRI son receptores de activadores preferidos para su uso dentro del marco de la presente -invención, puesto que son (i) expresados primariamente" en -células electoras inmunes, como por ejemplo monocitos, PMNs, macrófaqos y células dendríticas ; (2) expresados en niveles elevados (por ejemplo 5,000-100,000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (por ejemplo, ADCC, fagocitosis); (4) median una presentación incrementada de antígenos, incluyendo autoantígenos , enfocados a ellos. En otras modalidades, moléculas biespecí ficas y multiespecíficas de la presente invención, comprenden además una especifj c> ^H enl ce que reconoce, por ejemplo, se une con un antígeno de célula blanco, por- ej-e-mplo, PSMA. En una modalidad preferida, la especificidad de enlace se proporciona a través de un anticuerpo monocionai humano de la presente invención. La expresión' "anticuerpo específico para célula efectora" como se em lea aquí se refiere a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo funcional que se une con receptor de Fe o células efectoras . Anticuerpos preferidos para su uso d^rrtTü —de~T marco de la presente invención se unen al receptor Fe o células efectoras en un sitio que no está unido por iximunogiobuiina endógena . Como se emplea aquí, el término "célula efectora" se refiere a una célula inmune e involucrada en la -fase efectora- de una respuesta inmune, a diferencia de las fases de activación y rases cognoscitivas de una respuesta inmune. Células inmunes de ejemplo incluyen una célula de origen raíeloide o~'l"info:tde y como por ejemplo linfocitos (por ejemplo células B y células ? que incluyen células T citolíticas (CTLs) ) , células asesinas, células asesinas naturales, macrófagos, monocitos, eosinófilos, neutrófilos, células polimorfonucleares , granulocitos, mastocitos y basófilos. Algunas células efectoras expresan receptores Fe específicos y llevan a cabo funciones inmunes específicas. En modalidades preferidas, una célula efectora puede inducir una citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos ÍADCC) , por el emolo, un neutrófiio capaz de inducir ADCC. Po-t- ejemplo, monocitos, macrófagos que expresan FcR participan en la muerte específica de células blanco y presentación de antígenos a otros componentes del sistema inmune, o bien se unen con células que presentan antígenos. En otras modalidades,- una célula efectora puede someter un antígeno blanco, célula blanco o microorganismo a fagocitosis. La expresión de un FcR particular eñ uña célula efectora puede ser regulada por" 96 factores humorales tales como citecinas . Por e emplo, la expresión de FcyRI es regulada de manera ascendente por ii"i ¿rfcl n gamm (IF —?) . Esta expresión incrementada aumenta la actividad citotóxica de células que llevan FcyRI contra blancos. Una célula efectora puede someter un antígeno blanco o célula blanco a fagocitosis o iisis. La expresión -"célula blanco" se refiere a una célula no deseable en u " sujeto (por ejemplo un ser humano o un animal) , que puede ser enfocada por una composición (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano, una molécula biespecifica o una molécula multiespecifica) de la invención. En modalidad, preferidas, la célula blanco es una célula que expresa o sobreexpresa PSMA. Células que expresan PSMA incluyen típicamente células tumorales como por ejemplo células de vejiga, mama, colon, riñon, ovario, próstata, riñon, célula escamosa, célula de pulmón (no células oeaueñas), y células de tumor de cabeza y cuello. Otras células blanco incluyen células de fibroblasto sinovia!. . Mientras se prefieren anticuerpos monoclonales humanos, otro Ü anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas o multiespecificas de la presente invención son anticuerpos monoclonales de mur. no, quiméric s y humanizados. Anticuerpos monoclonales humanos de ratón quiméricos (es decir, anticuerpos quiméricos) pueden ser producidos por 5 técnica~s~" de ADN recómbinante conocidas eñ éT ár~te~; Por" e emplo, un gen que codifica la región constante de Fe de una molécula de anticuerpo monoclonal de marino (o de otras especies) es digerido con enzimas de .eot.ixCciúü para remover la región que' codifica el Fe de murino, y la porción equivalente de ~u gen que codifica una región constante de Fe de ser huma-no es sustituido. (véase, Robinson y colaboradores, Publicación - de Patente Internacional PCT/US86/ 02269; Akira y cülabor a oi e= , Publicación de Fatente Europea 184,187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171,496; Morrison y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 173,494; Neuberger y colaboradores, Solicitud Internacional WO 86/01533; Cabilly y colaboradores Patente Norteamericana No. 4,816,567, Cabilly y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 125,023, Better y colaboradores, (1988 Science 240:1041-1043); Liu y colaboradores (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu y colaboradores, 1987, J. Immunol -1 9:3521-3526; Sun y colaboradores (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y o©-±aboradores , 1987, Ca c . Res. 47:999-1005; Wocd y colaboradores (1985) Nature 314:446-449; y S aw v colaboradores, 1988, J. Nati Cáncer Inst. 80:1553-1559) . El anticuerpo quimérico puede ser humanizado adicionalmente mediante el reem.pla.zo de secuencias d la región ar abl de Fv no directamente involucrada en enlace de antíaeno cen secuencias equivalentes de las regiones variables de Fv de ser ?tatt????t G RH^HÍ¾S generales cte an icuerpos quiméricos humanizados se proporcionan por Morrison, S . L, , 1985. Science 229: 1202-1207 y por Oi y colaboradores, L'Jtík, Eio echniques 4:124. Esu = mtl-odos incluyen el Cui s aniienco , manipulación y expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican la totalidad o una parte de las regiones variables de Fv de inmunoglobulina de por lo menos una de una cadena ligera o cadena pesada. Fuentes tales como ácido nucleico son bien conocidas por parte de · -ias personas con conocimientos en la materia y, por ejemplo, pueden obtenerse a partir de 7E3, un hibridoma que produce anticuerpo anti-GPIIbIIIa. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo quimérico, o fragmento del mismo, puede ser entonces clonado en un vector de expresión apropiado. Anticuerpos humanizados adecuados pueden alternativamente ser producidos por sustituido de CDR según patente norteamericana 5,225,539; Jones y colaboradores, 1986 ature 321:552-525, Verhoeyan y colaboradores, 1988 Science 239:1534; y Beidler y colaboradores,- 1988 J. Immunol. 141:4053-4060. Todas las CDR.S de un anticuerpo humano particular pueden ser reemplazadas con por lo menos una parte de CDR no humana y solamente algunas de las CDRs pueden ser reemplazadas con CDRs no humanas . Es solamente necesario reemplazar el número de CDRs que se requiere para enlace del anticuerpo humanizado con el receptor Fe. Un "aiitrctrexpo pue e ^e~r niinaTrr^ardD-pOr^—cualqui^er-método' que es capaz de reempl zar por lo menos una parte de una CDK de un anticuerpo humano con una uR derivada de un anticuerpo no ,~ para preparar los anticuerpos humanizados de la presente •5 invención (solicitud de patente Británica GB 2188638A, presentada el día 26 de Marzo de 1987), cuyos contenidos se incorporan expresamente aquí por referencia. Las CDRs humanas pueden ser reemplazadas per CDRs no humanas utilizando - mutagénesis dirigida a sitio de oiigonucleótidos de 10 conformidad con lo descrito en la solicitud internacional WO 94/10332 titulada, Humanized Antibodies to Fe Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes. Dentro del alcance de la presente invención se encuentran también anticuerpos quiméricos y humanizados er donde 15 aminoácidos específicos han sido sustituidos, removidos o agregados. En particular, anticuerpos humanizados preferidos tienen sustituciones de aminoácidos en la región de estructura, con el objeto de mejorar la unión con el antigeno. Por ejemplo, en un anticuerpo humanizado que tiene 20 CDRs de ratón, aminoácidos localizados en la región de estructura de ser humano pueden ser reemplazados por los aminoácidos localizados en las posiciones correspondientes en el anticuerpo de ratón. Tales sus ituciones me Oj an el enlace de los anticuerpos humanizados con el antigeno,- en algunos ~2"5 casra Arrtrrcuerpcrs— en ios croales amirro-áciders han s~rdo agregados, removidos o sustituidos se conocen como anticuerpos modificados o anticuerpos alterados. El téüftiio anticut;i.pu íuud £icados incluye también anticuerpos tales como anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados que han sido modificados,- por ejemplo por ¦ remoción, adición o sustitución de partes del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo puede ser modificado mediante la remoción de la región constante y su reemplazo por una región constante cuyo propósito es incrementar la vida media, como por ejemplo vida media sérica, estabilidad o afinidad del anticuerpo. Cualquier modificación esté dentro del alcance de la presente invención en la medida en que la molécula biespecifica y multiespecifica tiene por lo menos una región de enlace con antigeno especifica para un FcyR y activa por lo menos una función efectora. Moléculas biespecificas y multiespecificas de la presente invención pueden elaborarse mediante la utilización de técnicas químicas (véase, por ejemplo, D. M. Kranz y colaboradores (1981), Proa. Nati. ñcad. Sci. EUA 78:5807} ,-técnicas "polidomas" (véase patente norteamericana No. 4,474,893, de Reading) , o bien técnicas ADN recombinantes. En particular, mo.léculas biespecíficas y multiespecificas de la _ presente invención pueden ser preparadas mediante la conjugación de las especificidades de enlace de constituyentes, por "ejem lo-; las" ~c^p"e¾~ i^dades de enlace anti-FcR y anti-PSMA, empleando métodos conocidos y descritos en los ejemplos proporcionados aquí. Por ejemplo, cada especificidad de enlace de ia molécula biespecifica y multiespecifica puede ser generada separadamente y después conjugada entre ellas. Cuando las especificidades de enlace son proteínas o péptidos, varios agentes de acoplamiento o reticulación pueden emplearse para- conjugación covaiente. Ejemplos de ayenL.es de reticulación ~ incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA) , 5, 5' -ditiobis ( ácido 2-nitrobenzoico) (DTNB) , o-fenilendimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3- ( 2-piridiltio) propionato (SPDP) , y 4- (N-maleimidometil) ciclohexan-1-carboxilato de sulfosuccinimidilo (sulfo-SMCC) (véase como por ejemplo, Karpovsky y colaboradores (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA y colaboradores (1985) Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 82:8648) . Otros métodos incluyen los métodos descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 11-8-132); Brennan y colaboradores (Science (1985) 229:81-83), y Glennie y colaboradores (J. Immunol. (1987) 139:2367-2375) . Agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCG, ambos disponibles en Pierce Chemical Co. (Bockford. 1.1.) . Cuando las especificidades de enlace son anticuerpos, por ejemplo, dos anticuerpos humanizados), pueden ser conjugados a través Se enlace sulfhidrilo "ele las regiones H articulación. C-terminales de las des cadenas pesadas. En la modalidad particularmente preferida, la región de articulación es modificada para contener un núme o impar de residuos sulfhidrilo, preferentemente uno, antes de la 5 conjugación. Alternativamente, ambas especificidades de enlace pueden ser codificadas en el mismo vector y expresadas y ensambladas en la misma célula huésped. Este método es especialmente útlicuando la molécula biespecifica y multiespecifica es un mAb x 10 mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab' ) 2 o proteina de fusión ligando x Fab. Una molécula biespecifica y multiespecifica de la invención, por ejemplo una molécula biespecifica, puede ser una molécula de cadena simple, por ejemplo, un anticuerpo biespecí i-ico de cadena simple, una molécula biespecifica de 15 cadena simple que comprende un anticuerpo de cadena simple y un determinante de enlace, o bien una molécula biespecifica He rsd na s.im le que comprende dos determinantes de enlace. Moléculas biespecificas y multiespecificas- pueden también ser- moléculas de cadena simple o bien pueden comprender por lo 20 menos dos moléculas de cadena simple. Métodos para la preparación de moléculas biespecificas y multiespecificas se describen por ejemplo en la patente norteamericana No. 5. ?tO .?03; Patente Norteamericana No. 5,455,030; Patente norteamericana No. 4,881,175; Patente norteamericana No. ~2T5 ""57T , J Patente norteamericana ?d~. 5 T51, 513; Patente norteamericana No. 5,476,786; Patente Norteamericana No. 5,013,653; Patente Norteamericana No. 5,258,498; y Patente norteamericana No. 5,482,858. El enlace de las moléculas biespecificas y multiespecificas sobre' sus blancos específicos puede ser confirmado por ensayo inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) , un radioinmunoensayo (RIA) , análisis FACS, un bioensayo (por ejemplo, inhibición "de crecimiento), o bien un ensayo Western Blot. Cada uno de estos ensayos detecta generalmente la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés particular mediante el empleo de un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos FcR-anticuerpo pueden ser detectados empleando por ejemplo, un anticuerpo enlazado con enzima o un fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente con los complejos anticuerpo-FcR . Alternativamente, les compl jo* pueden ser detectados empleando cualquier otro inmunoensayo o varios otros inmunoensayos . Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado radioactivamente y utilizado en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays [Principios de Radioinmunoensayo],- Séptimo curso de Capacitación en ater a e Técnicas de Ensayo de Radioligando, The Endocrine Society, Marzo 1986, que se incorpora aquí por referencia) . El isótopo radioactivo puede ser detectado por medies tales como el uso un contador de rayos gamma o un contador de centelleo o bien mediante autoradiografia . IV. Conjugados de Anticuerpo/Inraunotoxinas En otro aspecto, la presente invención presenta un anticuerpo -monoclonal anti-PSMA humano o un fragmento del mismo conjugado con otra porción terapéutica como por ejemplo ci totoxJ.na, f rmaco o radioisótopo.' Cuando se conjugan con una citotoxina, estos conjugados de anticuerpos se conocen como " inmunotoxinas" . Un agente citotóxico o citotoxina incluye cualquier agente que es perjudicial para las células (por ejemplo las mata) o bien que inhibe su crecimiento. Ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, metina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides , proeaina, tetracain, lidocaina, propanolol y asi como puromicina y análogos homólogos de estos. Agentes terapéuticos incluyen también, por ejemplo, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6- mercaptopurina,- 6-t ioguanina. citarabina, 5-fluorouracil deoarbazina) . aaentes de alquiiación (por ejemplo, mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina " CCCNUn "ciclotosfamida, busulFaño, 10"/ dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, asi como cisplatina cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) ) , antraciciinas (por ejemplo, daunorubicina (antes dannoiuxcma) y doxorubicina} ,- antibióticos (por ejemplo, dactinomicina ' (antes actinomicina) , bleomicina, mitramicina, y antramicina - (AMC)), asi como agentes anti-mitóticos (por ejemplo,- vincristina y vinblastina) . Otros ejemplos de citotoxinas 'terapéuticas que pueden ser conjugadas a un anticuerpo" de" la- invención incluyen calicheamicinas y duocarmicinas . Anticuerpo humanos de la presente invención pueden también ser conjugados con un radioisótopo, por ejemplo yodo radioactivo, para generar radiofarmacéuticos citotóxicos o no citotóxicos para el tratamiento o diagnóstico de padecimientos relacionados con PSMA (por ejemplo tumores) . Conjugados de anticuerpos de la presente invención pueden ser utilizados para modificar una respuesta biológica dada, y la porción f rmaco"! óP G? nn pretende limitarse a a entes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, la porción farmacéutica puede ser una proteína o un pciipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir como por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa, c fragmento activo de la misma, como por ejemplo abrina, ri cipa A,, er.otoxina de seudomonas. o toxina de difteria; una proteína como por ejemplo factor de necrosis tumoral o interferon-?; o bien mod f cadbres déTa respuesta biológica lüb como por ejemplo lintocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 PIL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), factor de estimulación de colonias de macrófayo granuiocitos ("GM- CSF"), factor de estimulación de colonias de granuiocitos 5 ("G-C3F") u otros factores de crecimiento. Técnicas para conjugar tal porción terapéutica con anticuerpos son bien conocidos, por ejemplo, véase Arnon y colaboradores, "Monoclonal Antibodies For Irunaunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies And Cáncer 10 Therapy, Reisfeld y colaboradores (eds.), pp 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985) ; Hellstrom y colaboradores, "Antibodies For Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a Edición) , Robinson y colaboradores (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987) ; Thorpe, "Antibody Carriers Of Cyt toxic Agents In 15 Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications , Pinchera y col boradores (eds.), p . 475-506 (1985); "Analysis, Results, And- Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies For 20 Cáncer Detection And Therapy, Baldwin y colaboradores (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe y colaboradores, "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin r.onjngates", Jnrau.no1. Rev., 62:119-58 (1982). V. Composiciones Farmacéuticas ~2l5 En afro" a_Sp~e~cto~ la" presente invención ofrece uña I O 3 composición, por ejemplo,- una composición farmacéutica, que contiene uno o varios anticuerpos monoclónales humanos o porción (es) de enlace con antigenc de los mismos, de la presente invención, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden inciuir uno o varios anticuerpos humanos (por ejemplo dos o más anticuerpos humanos diferentes) de la presente invención) . En una modalidad, la presente invención ofrece una composición terapéutica que comprende una combinación de anticuerpos anti-PSMA humanos que se unen a diferentes epitopos en PSMA humano y que tienen actividades complementarias, por ejemplo, como composición farmacéutica. Por ejemplo, un anticuerpo monoclonal humano que media la muerte altamente eficaz de células blanco en presencia de células efectoras puede combinarse con otro anticuerpo monoclonal humano que inhibe el crecimiento de células que expresan PSMA. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende uno o varios inmunoconjugados o moléculas biespecificas (o multiespecíficas) de la invención. Composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden también administrarse en terapia de combinación, por ejemplo, combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de eoi^i-nacrón—puede—rrrrfrtti —rara —COmpxrsd ±"ón~~ "de Ta" présente i i ? invención con por io menos un agente anti-tumor u otra terapia convencional. -La aceptable" incluye cualquier solvente, medio de- dispersión, revestimiento, agentes antibacteriano y antifungal,- agentes isotónicos y de retardo de absorción, y similares fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehiculo.._es adecuado para administración intravenosa, intramuscular-, ¦ subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo por inyección o infusión) . Según la vía de administración, el compuesto activo, es decir anticuerpo, molécula biespecifica y multiespecifica, puede ser revestido en un material para proteger el compuesto contra la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar el compuesto. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que conserva la actividad biológica deseada del compuesto de origen y no causa efectos toxicológicos indeseados (véase, por . ejemplo, Berge, S. M. y colaboradores (1977J, J.. Pharm. Sci. 66:1- 19^ Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de bases. Sales de adición de ácido incluyen las sales derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido brcmhídrico, ácido hidroyódico, ácido fosforoso "y similares asi cumo ~a~T5aTtír cte~ á~c±ttos orgánicos X X X rio tóxicos tales como ácidos monocarboxincos y dicarboxilicos alifáticos, ácidos alcanoicos sustituidos con ^ _i _ — — * — - ,-,rn .H sulfónicos alifáticos y aromáticos y similares. Sales de adición de - bases incluyen las sales derivadas de metales alcalinos térreos tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, asi como a partir de aminas orgánicas no tóxicas, como por- ejemplo ?,?' -dibenciletilendiamina, M-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaina y similares. Una composición de la presente invención puede ser administrada a través de varios métodos conocidos en la técnica. Como lo observará una persona con conocimientos en la materia, la vía y/o modo de administración variará según los resultados deseados. Los compuestos activos pueden ser preparados con vehículos que protegerán el compuesto contra una liberación rápida, como por ejemplo a través de una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes,, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulados . Polímeros biodegradables , biocompa tibies pueden ser utilizados, por ejemplo etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colage, poliortoésteres y ácido poiiláctico. Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones son patentados o generalmente conocidos por parte de Tas personas con conocimien os eñ la materia . i 1Z véase, por e emplo, Susíained and Controlled Reléase Vrug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed. , Maree1 Dekker, Inc. Nue York, 1978. Para administrar un compuesto de la- invención a través de ciertas vías de administración, puede ser necesario revestir el compuesto con un material para evitar su desactivación o bien co-administrar dicho compuesto con un material para pi evenir su desactivación. Po ejemplo, si compuesto puede ser administrado a un sujeto en un vehículo apropiado, como por ejemplo liposomas, o bien un diluyente. Diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones salinas y soluciones amortiguadas acuosas. Los liposomas incluyen emulsiones CGF de agua-en aceite-en agua así como liposomas convencionales (Strejan y colaboradores (1984) J. Neuroimmunol . 7:27) Vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea. de. soluciones, o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en ia técnica. Excepto en la medida en que estos medios o agentes son i ncompatibles con el compuesto activo, su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención se contempla. Compuestos activos suplementarios pueden también incorporarse LctS composiciones tera utic s deoen hípicamente ser estériles y estables en ias condiciones de fabricación y almacenamiento . Las composiciones pueden ser formuladas como solución, microemulsión, liposoma, u otra estructura ordenada • •5 adecuada para una alta concentración de fármaco. El vehículo puede ser un solvente o un medio de dispersión que. contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicer.ol, mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede 10 ser mantenida, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento, por ejemplo lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partícula en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes . En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, como por 15 ejemplo azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. Una absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser producida, mediante la inclusión en la composición de . un agente que retarda la absorción, como por ejemplo, sales de 20 monoestearato y gelatina. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación de un compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o varios de los ingredientes enumerados arriba, según lo requerido, las dispersiones son preparadas mediante .i 5 incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de O. s>p6L a 1 Olí báSICO 105 erfiSS ? ?5G6?1?3G??6 ? ISqUCll CS entre los mencionados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos conocidos de preparación son secado en vacío y liofiiización que proporcionan un polvo del ingrediente activo mas cualquier ing ie e aoic onal oeseacc a partir de una solución previamente filtrada de manera estéril. Regímenes de dosificación son ajustados para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, se puede administrar un bolo único, varias dosis divididas pueden ser administradas con el paso del tiempo o bien la dosis puede ser reducida proporcionalmente o incrementada proporcionalmente según lo indicado por las necesidades de la situación terapéutica. Es especialmente provechoso formular composiciones parenterales e .-¦ formas unitarias de dosificación para facilitar . la administración y la uniformidad de la dosificación. Formas unitarias de dosificación se utilizan aquí para referirse a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo que se calcula para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con er±—elrrcuro—a^rma"céTrtico—requeridos—ta e"s HCÍTF±ca"üÍoñ para las formas unitarias de dosificación de la invención dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto limitaciones inherentes a la técnica de formación de compuestos con dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, por ejemplo ácido ascórbico, hidrocloruro de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes solubles en agua como por ejemplo palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT) , lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agente., de quelación de metal como por ejemplo ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA) , sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares. Para las composiciones terapéuticas, formulaciones de la presente invención incluyen las formulaciones adecuadas para administración oral, nasal, tópica. (incluyendo bucal y sublingual), rectal, vaginal y/o parenteral. Las formulaciones pueden ser convenientemente presentadas en formas unitarias de dosificación y pueden prepararse a través de cualquier método conocido en la técnica de la farmacia. La cantidad de ingrediente activo que puede -combis-ar-s-e—eoft—un material—-e½ietriro—para—?tt>drrclT una: Hforma i 10 unitaria de dosificación variará según el sujeto a tratar y el modo particular de administración . La cantidad ae ingrediente activo que será combinada con vehículo para producir una forma unitaria de dosificación será generalmente 5 la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. En general, entre un cien por ciento, esta cantidad estará dentro de un rango de aproximadamente 0.01 por ciento a aproximadamente 99 por ciento do ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 0.1 por ciento a 10 aproximadamente 70 por ciento, con mayor preferencia de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento. Formulaciones de la presente invención que son adecuadas para administración vaginal incluirán también pesarlos, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones de rociado, 15 que contienen vehículos tales como los conocidos en la técnica por ser apropiados. Formas de dosificación para la administración tópica o transdérmica de composiciones de esta invención incluyen polvos, rocíos, ungüentos, pastas, cremas, lociones, geles, soluciones, parches e inhalantes. El 20 compuesto activo puede mezclarse bajo condiciones estériles con un vehículo farmacéuticamente aceptable o bien con conservadores, amortiguadores o impelentes según lo requerido . Las expresiones "administración parenteral" y "administrado ~2~5 parentreraímente'' como sé utiliza aqui se refiere ~a modos de administración otros que la administración enteral y tópica, habítualmente por inyección, e incluye, sin limitación, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal , transtraqueal , subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsuiar, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal . Ejemplos de - vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, etanol, polioles (por ejemplo glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, y similares) , asi como mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ásteres orgánicos inyectables como por ejemplo oleato .le etilo. Se puede mantener una fluidez apropiada, como por ejemplo, a través del uso de materiales de revestimiento, como por ejemplo lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en el caso de dispersiones, y mediante el uso de surf ctantes Estas composiciones pueden contener también adyuvantes, tales como conservadores, humectantes, emulsificantes y agentes de dispersión. La prevención de la presencia de microorganismos puede asequrarse tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de varios agentes ant-i-bacterianos— arrt i fúngales,—como—poir- ejemplo, pa~rabeno, clorobutano, ácido fenol sórbico y similares. Puede también ser deseable incluir agentes isotómeos tales como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones . Además, una absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede- ser causada por la inclusión de agentes que recaudan la retardan la absorción como por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina. Cuando ios compuestos de la presente invención se administran como farmacéuticos, a seres humanos y animales, pueden ser administrados solos o bien como composiciones farmacéuticas que contienen como por ejemplo de 0.01 a 99.5% (con mayor preferencia de 0.1 a 90%) de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Independientemente de la vía de administración seleccionada, los compuestos de la presente invención que pueden ser utilizados en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas - de dosificación farmacéuticamente aceptables por métodos convencionales conocidos por parte de las personas con conocimientos en la materia. Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar con el objeto de obtener una cantidad de ingrediente activo que es efectivo para lograr la respuesta re^péTTtica desead¾ arran un - clrrerr e—p"ariri~cu ar, composición particular y modo de administración particular, sin presentar toxicidad para el paciente. El nivel de dosificación que se selecciona depender de anos f ctores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención que se emplean o del éster, sal o amida de la misma, las vías de administración, la hora de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular que se está empleando, la duración ctei tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales que se utilizan en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, el estado general de salud y la historia médica previa del paciente que está en tratamiento y factores similares bien conocidos en la técnica médica. Un médico veterinario con capacidad ordinaria en la técnica puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de la composición farmacéutica eme se requiere. Por ejemplo, el médico o veterinario podría pesar con dosis de compuestos de la invención empleadas en la composición farmacéutica a niveles inferiores que el nivel requerido para lograr el efecto terapéutico deseado e incrementar gradualmente la dosificación hasta lograr el efecto deseado. En general, una dosis diaria adecuada de una composición de la presente invención será la cantidad del compuesto que es la dosis más -fea-a—eficaz—para- predu i-r—tm -efecto—terapéxittccr. ^Dxclra-dosis efectiva dependerá generalmente de los factores descritos arriba. Es preferible que la administración sea intravenosa, iiiL aiúubcuiar, intraperiLoiieal o subcut nea, preferentemente próxima al sitio del blanco. Si se desea, la dosis diaria efectiva de una composición terapéutica puede administrarse como dos, tres, cuatro, cinco, seis o más dosis administradas separadamente a intervalos apropiados durante el día, opcional ente en formas unitarias de dosiiicacxo . ient s es posible- que un compuesto de la presente invención sea administrado solo, es preferible administrar el compuesto como una formulación farmacéutica (composición) . Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede ser administrada con un dispositivo de inyección hipodérmico sin aguja como por ejemplo los dispositivos divulgados en las patentes norteamericanas Nos. 5, 399,163; 5, 383, 851; 5, 312,335; 5, 064,413; 4,941,-880; 4,790,824 ó 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos bien U conocidos útiles en la presente invención incluyen: patente norteamericana No. 4,487,603 que divulga una bomba de microinfusión iraplantable para suministrar fármaco a un régimen controlado; patente norteamericana No. 4,486,194, que divulga un dispositivo terapéutico para administrar fármacos 5 a través de la piel; patente norteamericana o~¡ 4,4477~23 , que divulga una bomba de infusión de fármaco para suministrar fármacos a una velocidad de infusión precisa; patenle norteamericana No. 4,447,224, que divulga un aparato de infusión implantable de flujo variable para la administración continua de fármaco; patente norteamericana No. 4,439,196, qu^ divulga un sistema de administración de fármaco osmótico que tiene compartimientos de cámaras múltiple?; y patente norteamericana No, 4,475,196, que divulga un sistema de administración de fármaco osmótico. Estas patentes se incorporan aquí por referencia. Muchos otros implantes, sistemas de administración y módulos de este tipo son conocidos por parte de las personas con conocimientos en la mate ia . En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la presente invención pueden ser formulados para asegurar una distribución apropiada in vivo. Por ejemplo, la barrera hematoencefálica (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofilicos . Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la presente invención aliaviesan la barrera hematoencefálica (si se desea) , pueden ser formulados, por ejemplo, en liposomas. Para métodos de fabricación de lipcso as, véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,522,811; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender una o varias porciones selectivamente transportadas en células u órganos específicos con el objeto por ejemplo, V. V. Ranade (1989), J. Clin. Phar acol . 29:685). Ejemplos de porciones para enfocar incluyen folato o biotina (véase, por ejemplo, patente norteamericana No. 5,416,016 de Low y colaboradores); manósidos (Umeza a y colaboradores, (1988) Biochem Biophys. Res. Co un. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman y colaboradores (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais y colaboradores (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor de proteina A de surfactante (Briscoe y colaboradores (1995) Am. J. Physiol. 1233:134), diferentes especies que pueden comprenderlas formulaciones de la invención, asi como componentes de las moléculas inventadas; pl20 (Schreier y colaboradores (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); véase también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Imunomethods 4:273. En una modalidad de la invención, los compuestos terapéuticos de la invención son formulados en liposomas; en una modalidad más preferida, los liposomas incluyen una porción de enfoque. En una modalidad especialmente preferida, los compuestos terapéuticos en los liposomas son administrados por inyección de bolos en el sitio próximo al tumor o a la infección. La composición debe ser fluida en la medida en que existe una posibilidad de administración con jeringa. Debe presentar estabilidad en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser conservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. Una "dosificación terapéuticamente efectiva" inhibe " " preferentemente el crecimiento de tumores en por lo menos 1 aproximadamente 20%, con mayor preferencia -en po lo menos aproximadamente 40%, con preferencia aun mayor en por lo menos aproximadamente 60%, y con preferencia muy especial en por lo menos aproximadamente 00% en comparación con los ~ sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el cáncer puede ser evaluada en un sistema de modelo de animal predictivo de la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede ser evaluada mediante el examen y la capacidad del compuesto para inhibir, dicha inhibición in vitro por ensayos conocidos por 5 parte de las personas con experiencia en la materia. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o bien mejorar de otra forma los síntomas en un sujeto. Un persona con conocimientos ordinarios en la materia podrá determinar 0 tales cantidades con base en factores tales como el tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o vía de administración sel cci onada - La composición debe ser estéril y fluida en la medida en que la composición se administra por medio de una jeringa. Además £ de-— gu-a7 ei—-^vettit ai-o— puede s-ex urraí sr3ruct'oñ saliña amortiguada isotcnica, etanoi, poiiol (por ejemplo glicerol, propilengiicoi asi como polietilenglicol liquido y similares) y mezclas adecuadas de ios mismos. Se puede mantener una fluidez apropiada como por ejemplo, mediante el uso de revéstimiéñt'ó por lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de partículas en caso de dispersión y mediante el use -de surfactantes . En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, como por eieiupio, azúcares, polialcoholes tales como manitol o sorbitol, y cloruro de sodio en la composición. Una absorción de largo plazo de las composiciones inyectables puede provocarse mediante la inclusión en la composición de un agente que retarda la absorción, por ejemplo monoestearato de aluminio o gelatina . Cuando el compuesto activo es adecuadamente protegido, de conformidad con lo descrito arriba, el compuesto puede ser administrado oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. VI. Usos y métodos de la invención Los anticuerpos anti-PSMA monoclonales humanos y derivados/conjugados relacionados y composiciones de la presente invención tienen varias utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo. Por ejemplo, estas moléculas pueden ser administradas a células en cultivo, por ejemplo in vitro o ex vivo. Alternativamente pueden ser administradas a un sujeto, por ejemplo in vivo para tralar, prevenir o diagnosticar varios padecimientos relacionados con PSMA. Corao se tíia i a aquí, el ???a ??? "sujeto" se contempla ara IÜCJ.ÜÍI tanto animales humanos como no humanos. Sujetos preferidos incluyen ¦ pacientes humanos que presentan padecimientos caracterizados por la expresión de PSMA, típicamente una expresión aberrante de PSMA (por ejemplo, sobreexpresión) . Por consiguiente, los métodos y composiciones de la presente invención pueden ser utilizados para tratar sujetos, con padecimientos tumorigénicos caracterizados por la presencia de células tumorales que expresan PSMA incluyendo, por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de colon, y carcinoma renal. El término "animales no humanos" de la presente invención incluye todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. En una modalidad preferida, la invención ofrece un método para el tratamiento de cáncer de próstata en un sujeto, dicho método comprende la administración al sujeto de uno de ios anticuerpos anti-PSMA de la invención. En otra modalidad, el anticuerpo anti-PSMA. es administrado en forma de un conjugado, en donde ei anticuerpo está, unido., por ejemplo, a un agente radioactivo o un fármaco citotóxico. En otra modalidad, el anticuerpo anti—PSMA es administrado como molécula biespecífica, por ej empio, enlazado á anti-i'cyRl o .L '¿ anti-Fccí . Anticuerpos humanos de la presente invención pueden ser piobauos iniciaiiiieiiLe para actividad de enlace asociada con uso terapéutico o de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, composiciones de la presente invención pueden ser · probadas empleando ELISA y ensayo citométrico de flujo descritos en los ejemplos abajo. Además, la actividad de estas moléculas en el accionaHiiento de por lo menos una ac ividad" "de células efectoras mediadas por efectores, incluyendo citólisis de células que expresan PSMA puede ensayarse. Protocolos para ensayar la fagocitosis mediada por células efectoras se describen en los ejemplos siguientes. Anticuerpos humanos de la presente invención son también útiles adicionalmente en la terapia y diagnóstico de 5 enfermedades relacionadas con PSMA. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas multiespecificas o biespeci ficas oueden emplearse, por ejemplo, para provocar in vitro o in vivo una o . arias de las siguientes actividades biológicas: opsonización de una célula U que expresa PSMA; mediación de la fagocitosis o citólisis de una célula que expresa PSMA en presencia de células efectoras humanos; o bien inhibición del crecim.iento de una célula que expresa PSMA. Métodos adecuados para la administración de anticuerpos y 5 composiciones dé la presenté ~l_nvencioñ son bien conocidos en la técnica. Dosificaciones adecuadas pueden ser determinadas con los conocimientos de la técnica y dependerán de la edad y . Anticuerpos anti-PSMA humanos de la presente invención pueden 5 también ser -co-administrados con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, o bien podrán ser administrados con otras terapias conocidas, como por ejemplo, u ^ e i anti"-cancer, como por eje lo, ra.oiacion. Taj_es agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes 10 antineoplásicos, tales como doxorubicina ( adriamicina) , sulfato de cisplatina bleomicina, carmustina, clorambucilo, y ciclofosfamida hidroxiurea que, en si, son solamente eficaces a niveles que son tóxicos o sub-tóxicos para un paciente. La cisplatina se administra de manera intravenosa en forma de 15 una dosis de 10 mg/?tt una vez cada cuatro semanas y la adriamicina se administra de forma intravenosa como una dosis de 60-75 mg/nt1 cada 21 días. La co-administración de los anticuerpo anti-PSMA humanos o fragmento de enlace con antigeno de los mismos,- de la presente invención con agentes 20 quimioterapéuticos ofrece dos agentes anti-cáncer que operan a través de mecanismos diferentes que proporcionan un efecto citotóxico . a las células tumorales humanas. Dicha coadministración puede resolver problemas causados por el desarrollo de la resistencia a les fármacos o un cambio en la _2.5 antigenici dad de—l-ae- eé-l-u-ias—feumora-le~s que- odrirá srex qire se- volvieran no reactivas con el anticuerpo. Células efectoras específicas para blanco, por ejemplo, cel -Las efectoras enlazadas a anticuerpos humanos, multiespecí ficas o biespecí ficas de la invención, pueden también. utilizarse como - agentes - terapéuticos. Células efectoras para enfocar puede ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos o monocitos . Otras células inciuveri eosmófilos, células asesinas naturales y otras células que llevan receptores para IgG o IgA. Si se desea, células efectoras pueden ser obtenidas a partir del sujeto a tratar. Las celas efectoras específicas para blanco pueden ser administradas en forma de una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 10a - 103 pero variará según el propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener una localización en la célula blanco, por ejemplo, una célula tumoral que expresa PSMA, y para lograr la muerte celular por ejemplo mediante fagocitosis. Las vías de administración pueden variar también. Una terapia con células efectoras específicas para blanco puede llevarse a cabo en combinación con otras técnicas par ala remoción de células blanco. Por ejemplo, una terapia anti-tumor utilizando las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecifzeas y rrirespecíTicas ) cte la invención yfo células —electoras equipadas con estas composiciones puede emplearse en combinación con quimioterapia. Además, una inmunoterapia de combinación ec ser utilizaca para d g eos c i cic e efectoras citotóxicas distintas hacia el rechazo de una 5 célula tumoral. Por ejemplo, anticuerpos anti-PSMA enlazados a anti-FcvRI o anti-CD3 pueden utilizarse en combinación con agentes de enlace específicos con receptores para IgG o IgA. oléc l s ies ec].ness y muitiespecificas ce s. es te invención pueden también utilizarse para modular los niveles 10 de FCYR o FcaR en células efectoras, como por ejemplo mediante recubrimiento y eliminación de receptores en la superficie de la célula. Las mezclas de receptores anti-Fc pueden también emplearse para este propósito. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, 15 moléculas multiespecí ficas y biespecí ficas) de la presente invención que tienen sitios de enlace con complemento, como por ejemplo porciones de IgGl, -2 ó -3 o IgM que se unen con complemento, pueden también utilizarse -~n presencia de complemento. En una modalidad, el tratamiento ex vivo de una 20 población de células que comprenden células blanco con un agente de enlace de la invención y células efectoras apropiadas puede complementarse mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de células blanco revestidas con un agente de enlace de la ~2~5 preservEe~ TTveñcloñ puede" Tre~jrorarse -tra és— e— rntHcre—de" proteínas de complemento. En otra modalidad, células blanco revestidas con las composiciones (por ejemplo, anticuerpo humanos, moléculas multiespecificas y biespeeíficas ) de la presente invención pueden también ser lisadas por complemento. ' En otra modalidad, las composiciones de la-invención no activan el complemento. Las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecificas y biespeclficas) de la invención pueden también ser administradas juntas con complemento. Por consiguiente, dentro del marco de la presente invención se encuentran composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moléculas multiespecificas o biespeeíficas y suero o complemento. Estas composiciones son provechosas en la medida en que el complemento se localiza en cercanía estrecha con los anticuerpos humanos, moléculas multiespecificas o biespeeíficas . Alternativamente, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecí f cas o biespeeíficas de la invención y el complemento o suero pueden administrarse separadamente.. Asimismo, dentro del alcance de la presente invención se encuentran kits que comprenden las composiciones (por ejemplo, anticuerpos humanos, moléculas multiespecificas y biespeeíficas) de la invención así como instrucciones de uso. El kit puede con e er ademá por lo menos rn reactivo adicional, como por ejemplo complemento, o bien uno o varios anticuerpos humanos adTc~foñ"ales de ia""iñvención ( or "e emplo un anticuerpo humano que tiene una actividad compleméntela:id que se une a un epitopo en un antigeno PSMA distinto del i e a ticu o humano) . En otras modalidades, el sujeto puede ser tratado adicionalmente con un agente - que modula, por ejemplo, · incrementa o inhibe, la expresión o actividad de receptores Fcy o Fea por ejemplo mediante el tratamiento del sujeto con una citocina. Citocinas prefe idas para s adniinisc acion durante el tratamiento con la molécula multiespecifica incluyen factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de estimulación de colonias de macrófagos granulocitos (Gm-CSF) , interferon-? (IFN-?) , y factor de necrosis tumoral (TNF) . Las composiciones (por ejemplo anticuerpos humanos, moléculas multiespecificas y biespecificas ) de la presente invención pueden también utilizarse para enfocar células que expresan FcvR o PSMA, por ejemplo, para el marcado de tales células. Para este uso, el. agente de enlace puede estar enlazado a una molécula que puede ser detectada. Asi, la invención ofrece métodos para localizar ex vivo o in vitro células que expresan receptores Fe, como por ejemplo FcyR o PSMA. La etiqueta detectable puede ser, por ejemplo, un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor enzimático . -ÍJ&S — a ticue pos—humanos—de—ta -presente —xnveTrcirón pueden Í JZ también ser utilizados ?G? detectar ia presencia de an icreno PSMA en una muestra o bien para medir la cantidad de antigeno PSMA un muestra, mediante ia puesta en contacto (po ejemplo, junto con una muestra de control)- con el anticuerpo -- monoclonal humano bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y PSMA. La formación de un complejo es detectada entonces, en donde una... diferencia de inforrn cien de com le o entre la muestra e comparación con la muestra de control es una indicación de la presencia de antigeno PSMA en la muestra. En otra modalidad, la invención ofrece un método para detectar la presencia o cuantificar la cantidad de células que expresan Fe in vivo o in vitro. El método comprende (i) la administración a un sujeto de una composición (por ejemplo, una molécula multiespecificas o biespecíficas ) de la invención o un fragmento de la misma, conjugada con un marcador detectable; (ii) la exposición del sujeto a un medio para . detectar dicho marcador detectable,..para identificar áreas que contienen células que expresan Fe. La presente invención se ilustra además a través de ios ejemplos siguientes que no deben considerarse como limitativos. El contenido de todas las figuras y de todas las referencias, patentes y publicaciones de patentes publicadas en esta solicitud se incorporan expresamente aquí por referencia . : : : ~~ ? cu-] r IJUO Métodos y Materiales E sa os ce ü ini c para anticuerpos lonoclonales específicos • para PSMA: Se detectaron PSMA-HuMAbs utilizando un ensayo basado en - ELISA de fase sólida. PSMA purificado por inmunoafinidad a partir de células LNCaP o bien proteínas de fusión expresadas bacterialmente que contienen fragmentos derivados de PSMA, fueron aplicados en placas de 96 pozos Maxi-Sorp (Nunc, Rochester, NY) con incubación durante la noche a una temperatura de 4°C. Las placas fueron lavadas con PBS-0.2% Tween 20 y bloqueadas con BSA al 5% en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Cincuenta µ? de sobrenadante de los cultivos de hibridomas se agregaron a los pozos revestidos con PSMA y las placas fueron incubadas durante 2 horas a temperatura ambiente. Las placas fueron lavadas como arriba y se agregaron a cada pozo 50 µ? de una cadena H&L anti-IgG humana de conejo diluida 1:1000 (ICN, Costa Mesa, CA.)_„ a cada pozo. Después de incubación de...1 hora .a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas como arriba y se agregaron 50 µ? de una dilución 1:2000 de proteína A conjugada con HRP (Sigma, St. Louis, MO) . Después de una incubación de una hora a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas como arriba y se agregaron 100 µ? de ABTS (150 mg de ácido 2, 2 ' -azino-bi (3-etilbenztiazolin-6-sulfónico en 500~?? ~3ß~¾??<G?" ""clír'íco" ???G??:,- H" 4. 35/H2C2 ? 1C t?—?2?2-al" 30¾ por 10 mi de solución de ABTS) cromágeno/ sustrato a cada pozo. Después de un tiempo de incubación de b minutos, la detención (SDS/dimetilformamida) y se leyó la absorbencia a 5 ¦ 405 nm en · un lector 'de microplacas. Las células de- hibridoma que producen los sobrenadantes con valores A4U3 altos fueron clonadas mediante dilución limitante y sometidas a análisis uICIOn i . Aislamiento de proteina de anticuerpo : Anticuerpos 10 monoclonales fueron aislados a partir de un bioreactor Cellmax (Célico, Laguna Hills, CA) , utilizando un medio RPMI- 1640 que contenia de 1 a 5% de Fetalclone (Hyclone, Logan, UT) . Anticuerpos monoclonales fueron purificados por cromatografía en una columna de Protein A-Agarose de 15 conformidad con las especificaciones del fabricante (KPL, Gaithersburg, MD) . Preparación de membranas de células LNCaP: Células LNCaP fueron raspadas de platos de plástico, lavadas de manera extensa en PBS, resuspendidas en 10 volúmenes de agua 20 desionizada, y homogeneizadas por tres recorridos con un homogeneizador Dounce. La fracción de membrana fue aislada por centrifugación a 15, 000 x g durante 45 minutos y la pella fue resuspendida en PBS. La concentración de proteina de la pella de membrana fue determinada empleando el kit Pierce "2~5 tKocrford,~ ??) BCA.~ Experimentos de desnaturali ación térmica: Una alícuota de PSMA purificado por inmunoafinidad proveniente de células LíCair (40 üCj'/ml en PBS } IÜ desna uraliz d te iiic iuciice mediante ebullición durante 10 minutos" y enfriada en hielo. Esto, y una alícuota idéntica que- no fue desnaturalizada térmicamente, fueron diluidos 1:4 en PBS y se agregaron 50 µ? a pozos de una placa Maxi-Sorp de 96 pozos (Nunc) y revestido durante ra noche a una cemperatura de 4°~C. Después del revestimiento, todas las placas fueron bloqueadas con BSA al 5% en PBS durante 1 hora, lavadas en PBS y sometidas a ELISA emparedado estándar utilizando los anticuerpos primarios indicados de conformidad con lo descrito arriba. Análisis Western Blot: Se llevó a cabo un análisis Western Blot después de SDS-PAGE d PSMA que contenía fracciones y se transfirió a membranas PVDF. Los blots fueron bloqueados durante la noche en TBS que contenía leche sin grasa al 5% e incubados con anticuerpo purificado presentes en una concentración de 5 "ug/ml en TBS . durante - 1 hora. Los blots fueron lavados 5 veces con TBS que contenía 0.5% de Tween-20 (TBS-Tj , los blots fueron revelados utilizando un Jcit de sustrato quimioluminiscente LumiGLO (KPL, Gaithersburg, MD) , y visualizados por exposición a película de rayos X. Estudios _ de Inmunopre ipitació : Un iisado de detergente de células LNCaP fue preparado mediante la adición de PBS que ccrrrtren a^—??^^t?—i—3r%—a—células—LNCaP,—iricttbmrcto—durante—G iJO ho a, y sometiendo a centrifuydción para remo er el material en partículas. El lisado fue pre-depurado por adición de ?d? „ i durante 1 hora a temperatura ambiente, seguido por adición de 5 150 µ? de perlas de Protein G-Sepharose empacadas -por-- mi - de - lisado. La fracción sobrenadante fue utilizada después de .centrifugación para remover las perlas. Alícuotas de 100 µ? . proteína de anticuerpo e incubadas durante la noche a 4°C. Ai 10 final de este período, se agregaron 20 µ? de Protein G- Sepharose empacadas fueron agregadas a cada tubo y los tubos fueron incubados durante 1 hora a 4°C. Después de lavado extenso con amortiguador de lisis, se agregaron 50 µ? de amortiguador de muestra Laemmli (Bio-Rad) a cada muestra y 15 los tubos fueron calentados a 95°C durante 10 minutos. Los tubos fueron centrifugados durante 2 minutos y se cargaron 25 µ? de cada muestra en un gel SDS-PAGE y se sometió a . electr.oforesís a 175 volts durante 60 minutos. Las muestras sometidas a electroforesis fueron eíectrobloqueadas en 20 membranas PVDF para análisis Western blot utilizando el anticuerpo anti-PSMA de murino 4D8 (5 g/ml) y reveladas de conformidad con lo descrito arriba. Citometría de flujo: células LNCaP y PC-3 fueron recién cosechadas de frascos de cultivo de tejido y se preparó una ~^t5~ susperrsi n individual de cré±rr¡]ras~: Suspeiryiunes de células 13 I L CaP fueron ya sea teñidas con anticuerpo primario directamente o después de fijación con paraformaldehído al 1% e PBS. Aprcxiiuadaiáente un milicn de cél las fueron resuspendidas en PBS que contenia BSA ai 0.5% y 50-200 ug/ml 5 de anticuerpo primario e incubadas en hielo durante 30 minutos. Las células fueron lavadas dos veces con PBS que contenía BSA . al 0.1%, NaN5 ai 0.01%, resuspendidas en 100 µ? e IgG S-FÍL —huma de~ cabra con] uysdo con FITC diiui-ds txOO (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) , e incubadas en 10 hielo durante 30 minutos adicionales. Las células fueron lavadas otra vez dos veces, resuspendidas en 0.5 mi de amortiguador de lavado, y analizadas para tinción fluorescente en un citómetro FACScalibur (Becton-Dickinson con un software de adquisición CellQuest. 15 Marcado con FITC de anticuerpos monoclonales : Anticuerpos monoclonales purificados fueren dializados primero de manera extensiva contra amortiquadores de carbonato de sodio 0.3M, pK 9.5... Una .solución . madre . de isotiocianato de fluoresceina (FITC) fue preparada mediante la disolución de 1 mg de FITC 20 sólido en i mi de DMSO. Se agregó gota a gota ia solución madre de FITC con mezclado constante en una cantidad para proporcionar 50 pg de FITC por mg de proteina de anticuerpo. Una vez agregada, la solución fue incubada en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1-3 horas. Se aisló anticuerpos ~25~ marcado con "FTTC™ por filtración err g"ei en x ar ""Columna" Sephadex G-IO equilibrada en PBS . Marcado con DOTA de 4A3 y 7F12: Cinco miligramos de protema de anticuerpo 4A3 y 7 12 fue marcada ccn DOTA a través as acoplamiento directo de uno de los cuatro grupos de ácido carboxílico de DOTA a grupos amino - de - la proteína de anticuerpo. DOTA (ácido tetraazaciclododecantetraacídico) es un agente de quelación común que puede utilizarse para formar radionúclidos en compiejo. La proteína- en aproximadamente i.5 mi de PBS fue lavada primero en un concentrador centrífugo con un corte de Mr 25, 000 utilizando 5 x 4ml de DTPA (ácido dietilentriaminpentaacético) al 1%, pH 5.0 en un período de 24 horas. El amortiguador de anticuerpo fue después cambiado a fosfato 0.1M, pH 7.0 usando el mismo procedimiento. Un éster activo de DOTA fue creado mediante la disolución de 30 mg (0.072 mmol) en 0.4 mi de agua y el pH fue ajustado en 7.3 con NaOH. Se agregaron entonces diez mg de l-etil-3-(3- dimetiiaminopropil) carbodiimida y la mezcla fue enfriada en hielo durante una hora y agregada a la solución... de anticuerpo y agitada a una temperatura de 4°C durante la noche. El conjugado resultante DOTA anticuerpo fue separado del DOTA en exceso y otros reactivos por lavado repetido con NHOac 0.3 M y concent ación centrífuga. Estudios de inhibición de anticuerpos: Aproximadamente un millón de células LNCaP fueron tratadas inicialmente con 200 pg/ml "de K , 7?S2G, '?G?, 8UT2, G¾?9,~ pnrtTtcaass o anticuerpo IgG; humano irrelevante en PBS durante una hora en hielo. Después de lavado, las células fueron incubadas con 50 üy/iíLj. <u>d all i_.LCU.eI O íUOuú lOuax humano conjugado con FITC durante una hora en hielo. Después ' de lavado, las células fueron teñidas con 10 µ?/p?? -de yoduro de propidio y analizadas por citrometria de flujo en un FACScalibur con software CellQuest. Biodist ibiáción de Kuí4Ab marcado con JI en ratones desnudos que llevan tumores de células LNCaP: Células LNCaP, 2x106 en Matrigel al 50% (Becton-Dickinson (150 µ? volumen total)), fueron inyectadas subcutáneamente en ratones desnudos . Cuando los tumores alcanzaron un tamaño de aproximadamente 0.5 cm de diámetro, los animales fueron sometidos a marcado in vivo con anticuerpo marcado con 123I a través de administración i.v. a 5 través de la vena de' la cola de 100 µg de anticuerpo (que contenia 5- a 35 ]iCi de 122I) . Después de varios puntos de tiempo, los animales fueron sacrificados y el nivel de ¦ ¦ marcador l7¾I presente . en órganos y... te idos normales individuales, asi como tejido tumoral, fue determinado. 0 Un miligramo de proteina de anticuerpos fue yodinada con i- a 1.5 mCi de l25I utilizando yodo perlas (Pierce) de conformidad con las instrucciones del fabricante. Internalización de HuMAbs marcados cor ^_~=I : Células LNCaP fueron colocadas en placas de 6 pozos y se dejaron hasta que 5 alcanzaran casi conrluencTa- El-medrlo-fiie^^de-s uBs-Trerao- rdO—y los pozos fueron lavados con PBS para remover las células no adherentes . Las células fueron después marcadas con KuMAb ííái' áuú con "^l o Ic¡G ??????G?? i.r Gelevante con cor espondenci de isotipo presente en una concentración de 10 µ?/p?? en un volumen total de 1.5 mi - en medio de cultive fresco - e incubadas en un incubador a una temperatura de 37 °C durante 10 minutos, al final de este periodo, el medio fue removido, las células fueron lavadas en forma e ue ss con i'3S ara remover el anticuerpo marcado no unido, se agregaron 1.5 mi de medio de cultivo, y las placas fueron devueltas al incubador a 37° durante el tiempo de incubación deseado. A 9 (inmediatamente después de la adición del medio de cultivo), 4, 18 y 28 horas de incubación, el medio de cultivo fue removido, centrifugado para eliminar las células no adherentes. La fracción de sobrenadante fue enfriada en hielo, y sometida a precipitación por TCA mediante adición de TCA ai 100% para proporcionar una concentración final de TCA • de .10%., Después de incubar en hielo durante 10 minutos, .la- fracción fue centrifugada durante 10 minutos a. 1000 x g y el sobrenadante fue removido. La cantidad de radioactividad presente tanto en fracciones solubles como insoiubles de TCA fue determinada en un contador de rayos gamma. Las células adherentes presentes en los pozos después de la remoción del medio para precipitación de TCA fueron liberadas utilizando tripsina y colocadais eró ün tubo para cónteó ~TTnto coñ un lavado de 1 mi con NaOH 0.1N. La radioactividcid unida a Ias células fue también determinada en un contador de rayos „ i „ „ unidos a la célula que fue internalizada, procesada y distribuida en la fracción soluble- TCA fue graficada contra el tiempo. La proteina de anticuerpo purificada, 0.5 rag, fue yodinada Í,.OÜ -L _L uc x c iiJ_ i_iu± j- V- t- J—L. L, - El marcado de cada anticuerpo fue comprendido entre 0.4 y 1.6 µ?/µ? de proteínas de anticuerpo. Tamizado con ADCC y CDC de HuMAbs : Pruebas de ADCC y CDC fueron ensayos de liberación de DlCr de cuatro horas utilizando células LNCaP como células blanco. Los ensayos fueron efectuados en placas de 96 pozos con 2500 blancos p_r pozo por triplicado empleando una proporción entre célula efectora y célula blanco (proporción E:T) de 100:_!. Las células electoras fueron de PBMC's aisladas de un donador macho y un donador hembra.. Para ...ensayos . CDC, plasma humano fresco en una concentración final de 1:200 fue utilizada como frente de complemento. Tamizado de reactividad cruzada tisular de HuMAbs por IHC: Las condiciones de tamizado de reactividad cruzada por IHC fueron optimizadas primero mediante el uso ce una concentración fija de anticuerpo monoclonal humane no conjugado púFxf"icado (5 µ¾7¾ ) y^variss coir T rac± ^s~~ d¾~ anticuerpo secundario anti-IgGi humano de cabra biotinilada en secciones de tejido congelado fijadas por tratamiento con acetona durante 10 minutos después de criotomía o bien con formalina amortiguada neutral al 10% durante 10 segundos • "5 inmediatamente antes de la tinción. ¦ Con base en' estas condiciones, se llevó a cabo la segunda prueba con la concentración de anticuerpo secundario optimizada- con varias concentraciones de anticuerpo primario Hu ft . Con base en estos resultados, se efectuó un tamizado tisular 10 en secciones congeladas humanas después de fijación en acetona durante 10 minutos al momento de la criotomía seguido por 10 segundos en formalina amortiguada neutral al 10% inmediatamente antes de la tinción. La tinción fue efectuada con anticuerpo primario en una concentración de 5 ug/ml que 15 contenía 1.5 mg/ml de IgG portador en exceso seguido por 7.5 ug/ml de anticuerpo secundario anti-IgG humano de cabra biotinilado aue contenía 1.5 ma/ml de IQG portadora en exceso. Se incluyeron IgG de conejo agregado ¦ térmicamente (1 mg/ml), suero de cabra normal al 5%, y BSA al 1% en el bloque 20 de proteína de las secciones. Ejemplo 1 Generación de ratones enfocados a Cmu para la producción de anticuerpos humanos anti-PSMA Construcción de un vector que enfoca CMD: El plásmido pTCEmn contiene un fragmento EcoRI/Xhol del locus de cadena pesada 25 de Ig de muri.no que abarca el gen mü^ que fue "ab enldo de una biblioteca de fagos lambda genómica de Balb/C (Marcu y colaboradores, Cell 22: 187, 1980). Este fragmento genómico J. u-c o uJJCxuU uu tii - I I - (Marsh y colaboradores; Gene 32, 481-485, 1984). Las -' secuencias 'de cadena pesada " incluidas' en pICEmu se extienden corriente abajo del sitio EcoRI localizado justo 3' del realzador intrónico mu hasta el sitio Xhol localizado ap o imadamente i kilo base corriente b jo del último exon de transmembrana del gen mu; sin embargo, la mayor parte de la región repetida, de cambio de mu ha sido removida por pasaje en E. coli. El vector de enfoque fue construido de la siguiente manera. Un fragmento de 1.3 kb de HindIII/Smal fue portado de pICEmu y subclonado en pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) digerido con HindI II/SmaI . Este fragmento pICEmu se extiende desde el sitio de HindITI localizado aproximadamente 1 kilo base 5' de Cmul hasta el sitio Smal localizado dentro de Cm l. El plásmido resultante fue digerido con Smal/Spel y el fragmento Smai/Xbal de aproximadamente 4 kb desde pICEmu, extendiéndose desde el sitio Smal en Cmul 3' hasta el sitio Xbal localizado justo corriente abajo del último exón de Cmu, fue insertado. El plásmido resultante pTARl, fue linealizado en el sitio Smal, y se insertó un cassette de expresión neo. uo -c aoSeLi_e ycu licw ?^????,??± de transcripción del promotor de fosfoglicerato quinasa (pgk) de ratón (fragmento Xbal/Taql; Adra y colaboradores (198'/) Gene 60: 65-74) y que contiene el sitio de poliadenilación pgk { tracjitieuto PvuII/Iiindill ; Boer y colsDorado es ^i9 0j Biochemical Genetics 28: 299-308). Este cassette fue obtenido a partir del plásmido ¦· pKJl (descrito por Tybulewicz -y colaboradores (1991) Cell 65: 1153-1163) a partir del cual el cassette neo fue removido - como un fragmento EcoRI/HindIII y subcioaado en pGEM-7Zf(+) digerido con EcoRI/HindIII para generar pGEM-7 (KJ1) . El" cassette neo fue removido de pGEM-7 (KJ1) por digestión con EcoiRI/SalI, aplanado en los extremos y subclonado en el sitio SamI del plásmido pTARl, en la orientación opuesta de las secuencias de Cmu genómicas. El plásmido resultante fue linealizado con Not I, y se insertó un cassetLe de timidina quinasa (tk) de virus de herpes simplex para permitir enriquecimiento de los clones de ES que llevan recombinantes homólogos, de conformidad con lo descrito por Mansour y colaboradores (1988) Nature 336: 348- 352. Este . cassette consiste de las secuencias codificadoras del gen de tk entre el promotor pgk de ratón y sitio de poliadenilación, de conformidad con lo descrito por Tybulewicz y colaboradores (1991) Cell 65: 1153-1163. El vector de enfoque CDM resultante contiene un total de apro imadamente 5.3 kb de homología con el locus de cadena pesada y es diseñada para generar un gen mu itiutante en el cual ha sido insertado un cassette de de expresión neto en el sitio Smal único del primer exon de Cmu. El vector de enfoque fue iinealizado con Pvul, que corta dentro de secuencias de piásiuidos, anees de eiectropurauión eii células ES . Generación y análisis de células ES enfocadas; Células ES de - AB-l (McMahon, A.P. y Bradley, . , (1990) ) - Ce-i.r -62: 1073- 1085) fueron cultivadas en capas de aiimentador de células SNL76/7 mitóticamente inactivas (ibid.) esencialmente de cunfonuidad con lo desee ito (Robertson, E. J. "(198/) en Teratocarcinomas and Embryonic Ste Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71- 112) . El vector de enfoque de CMD Iinealizado fue sometido a electroforación en células AB-l a través de los métodos descritos por Hasty y colaboradores (Hasty, P. R. y colaboradores (1991) Nature 350: 243-246) . Las células sometidas a electroporación fueron colocadas en platos de 100 mm a una densidad de 1-2 x 10° células/plato. Después de 24 horas, se agregaron G41S (200 microqramos/ml de componente activo) y FIAÜ (5 x 10" 'M ai medio, y -.se permitió-- el desarrollo de clones resistentes al fármaco en un periodo de 8-9 días. Los clones fueron recogidos, tripsinizados, divididos en dos porciones, y expandidos adicionalmente . La mitad de las células derivadas d cada clon fue después congelada y la otra mitad analizada para recombinación homologa entre secuencias de vector y secuencias blanco. Se efectuó ü~ñ análisis de AUN mediante hibridación Southern biot . El AiM fue aislado de los clones de conformidad con lo descrito por Laird y colaboradores (Laird, P. W. y coiauo auores , " genómico aislado fue digerido con Spel y probado con un ""5' fragmento SacI de 915 pares de bases, sonda A (véase Figura · - -* 1) , que se híbrida con la secuencia entre el realzador • intrénico de mu y la región de cambio de mu. La sonda A detecta' un fragmento Spel de 9.9 kb de iocus de tipo - silvestre y una banda de diagnóstico de 7.6 kb de un locus de 10 mu que se ha recombinado de manera homologa con el vector de enfoque de CMD (el cassette de neo expresión contiene un sitio Spel). De 1132 clones resistentes a G418 y FIAU tamizados por análisis Southern blot, 3 presentaron la banda Spel de 7.6 kb indicadora de recombinación homologa en el 15 locus de mu. Estos tres clones fueron digeridos adicionalmente cor. las enzimas Bgll, BstXI, y EcoRI para verificar que el vector estaba integrado de manera homologa - en el gen de mu. Cuando se híbrido con la sonda- -A, . Southern blots de ADN tipo silvestre digerido con Bgll, BstXI, o EcoRI 20 producen fragmentos de 15.7, 7.3 y 12.5 kb, respectivamente, mientras que la presencia de un alelo de mu enfocado se indica a través de fragmentos de 7.7, 6.6 y 14.3 kb, respectivamente. Los 3 clones positivos detectados por el - digestor Spel mostraron el diagnóstico de fragmento de —2~5 r^ trrirc^ rón BgíT BstXI , y EcruRi esperado de rrise~rT-rrÓ7i ctel 1 / cassette neo en el exón Cmul. Generación de ratones que llevan el gen mu mutados: Los tres clones de E5 enfocados, designadob uúruero 264,272, y 408, fueron descongelados e inyectados en blastocistos C57BL/6J de 5 conformidad con lo descrito por Bradley (Bradley, A. (1987) en Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113- 151) . Blastocistos inyectados fueron transteridos en úteros de hembras pseudo preñadas para generar ratones quiméricos 10 que representan una mezcla de células derivadas de las células de ES ingresadas y el blastocisto huésped. La magnitud de la contribución de células ES a la quimera puede estimarse visualmente a través de la cantidad de coloración de revestimiento agutí, que se deriva de la línea de células 15 ES, en el fondo negro de C57BL/6J. Los clones 272 y 408 produjeron solamente quimeras de bajo porcentaje (es decir, bajo porcentaje de pigmentación agutí), pero el clon 264 produjo quimeras de sexo masculino de alto porcentaje. Estas quimeras fueron cruzadas con hembras C57BL/6J y criadas agutí 20 fueron generadas, lo que es una indicación de transmisión de línea germinal del genoma de células ES. El tamizado del gen mu enfocado fue efectuado por análisis Western b]ot por ADN digerido con Bgll de biopsias de la cola "(de conformidad con lo descrito arriba ara análisis de ADN de células ES) . "2-5 Apro^i ia iaiixenlre"" ¾r~5ü% de' ras curtas agutí ~presentaron- uña banda Bgll de hibridación de 7.7 kb además de la banda de tipo silvestre de 15.7 kb, lo que demuestra una transmisión de línea germinal de gen mu enfocado. Análisis de atones transgénicos para desactivación funcional del gen mu: Para determinar si la inserción del cásete neo en Cmul ha desactivado el gen de cadena pesada de Ig, se cruzó una quimera de clon 264 con un ratón nomocigótico para mutación JHD, que desactiva la expresión, de cadena pesada como resultado de la deleción de segmentos de gen JH (Chen y colaboradores, (1993) Immunol . 5:647-656). Cuatro crías agutí fueron generadas . Se obtuvo suero de estos animales a la edad de un mes y se ensayó a través de ELISA para determinar la presencia de IgM de murino . Dos de las cuatro crías presentaban una ausencia total de IgM (véase Tabla 1) . El genotipificado de los cuatro animales por análisis Southern blot de ADN de biopsias da cola por digestión Bgll e hibridación con sonda A (véase Figura 1) , y por digestión con St 'I e hibridación con un fragmento EcoRI/Stul de 475 pares de bases (ibid.) demostró que los animales que no expresaban IgM sérica son los animales en los cuales un alelo del locus de cadena pesada lleva la mutación JHD, el otro alelo la mutación Cmul . P.atones heterocioóticos oara. la mutación JHD resen an niveles He ti o silvestre de ?s sérica. Estos datos demuestran que la mutación, de Cmul desactiva la expresión del gen mu.

Ratón IgM sérica Genotipo de 42 <0, 002 CMD/JHD 43 196 +/JHD ¦ 44 <0.002 CMD/JHD 45 174 +/JHD 129 x BL6 Fl 153 ' + JHD <0.002 JHD/JHD La Tabla 1 muestra los niveles de IgM sérica detectados por-ELISA en el caso de ratones que llevan tanto las mutaciones CMD como JHD (CMD/JHD) , para ratones heterocigóticos para la mutación JHD (+/JHD) , para ratones (129Sv x C57BL/6J)F1 de tipo silvestre (+/+)/ y para ratones deficientes en células B homocigóticos para la mutación JHD (JHD/JHD) . Ejemplo 2 Generación de ratones transgénicos HC012 para la producción de anticuerpos humanos anti-PSMA. El „ transgen de cadena pesada humano HC012: El .transgen HC012 fue generado mediante la. co—inyección del inserto de 80 kb de pHC2 (Tayior y colaboradores, 1994, Int. Immunoi., 6:579-591) y el inserto de 25 kb de pVx6. El plásmido pVx6 fue construido de conformidad con lo descrito abajo, un fragmento de ADN de HindIII/Sall de 8.5 kb, gue comprende j- ycu HI J-u \i j. -i / jiUmciiiw uc nuca yciii ildi j UULU ??? aproximadamente 2tt$ k¾ cte flancO 5"*^ y 5 kb de secuencia 'jcnóíuic£ d,e flanco 3' f e subclon¾d.o en 'vector de ld&iciiGu pSP72 (Promega, Madison, WI) para generar el plásmido comprende el gen de VH5-51 (DP-73) humano de linea germinal junto con' aproximadamente 5 kb de secuencia- genómica de flanco 5' y 1 kb de secuencia genómica de flanco 3 ' , fue clonado en el vector de clonación de plásmido basado en ^"D j-Kn*"iD: i 1 c y .. ^^i ^ .^^--.^^-^-^^ ^ s ta.u-.^^ i ~ — au—x o Bes, 20:6287-6295), para generar el plásmido p251f. Un nuevo vector de clonación derivado de pGPlf, pGPlk, fue digerido con EcoRV/BamHI, y ligado a un fragmento de ADn de EcoRV/BamHI de 10 kb, que comprende el gen de VH3-23 (DP47) humano de linea germinal junto con aproximadamente 4 kb de secuencia genómica de flanco 5' y 5 kb de sjcuencia genómica de flanco 3'. El plásmido resultante, pll2.2RR.7, fue digerido con BamHI/SalI y ligado con el inserto BamHI SalI purificado de 7 kb de p251f . El plásmido resultante. pVx4, ue digerido con Xhol y ligado con el inserto Xhol/Sall de 8.5 kb de p343, 7.1.6, Se obtuvo un clon con el gen VHi-18 en ia misma orientación que los otros dos genes V. Este clon, designado pVx_6, fue después digerido con Notl y el inserto purificado de 26 kb fue co-inyectado (junco con el inserto Notl de 80 kb ^u . J_ _ - iv v ]~J ¿- ii uiiiu. xit x ai JU · X / il JLO Ulii X T? 3 "de emrnrxOTres fC5r?¾L/6J -¾?¾7¾?G) F2 de—irredio dia de" conformidad con lo descrito por Hogan y colaboradores (B. Hogan y colaboradores, Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2a Edición, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY) . Tres lineas independientes 5 de ratones transgénicos que comprenden secuencias tanto de Vx6 como de HC2 fueron establecidas · a partir de ratones que fueron desarrollados a partir de los embriones inyectados. Estas lineas son designadas (HC012) 14881, (HC012) 15083, y (HC012 ) 15087. Cada una de las tres lineas fueron después 10 cruzadas con ratones que contenían la mutación CMD descrita en el ejemplo 1, la mutación JKD (Chen y colaboradores, 1993, EMBO J. 12:811-820), y el transgen (Kco5) 9272 (Fishwild y colaboradores, 1996, Nature Biotechnology 14:845-851). Los ratones resultantes expresan transgenes de cadena ligera 15 kappa y de cadena pesada de inmunoglobulina de ser humano en un fondo homocigótico para perturbación de los loci de cadena ligera kappa y cadena pesada de ratón endógeno. Ejemplo 3. Producción de anticuerpos monoclonales humanos y biespecificos contra PSMA 20 Antígeno : Se proporciona antígeno (Northwest Biotherapeutics, Inc) en dos formas: (1) membranas celulares y (2) proteina purificada (PSMA) aislada de células LNCaP (Número de Catálogo CRL-1740; American Type Culture Collection, Rockville, MD) . Con antígeno purificado (1.05 mg/ml) , se "2"5 nevaron a cabo una inmunización y los refuerzos en la vena de la cola finales. El anticuerpo monoclonal 7E11.C5 fue obtenido de Cytogen, Inc. Princeton, NJ. Se mezclaron PSMA soluble y membranas de células LNCaP con adyuvante de Freund ya sea completo o incompleto (CFA e IFA) . Los ratones recibieron inyecciones de 0.2 ce de antígeno preparado en la cavidad intraperitoneal . Las inmunizaciones finales en la vena de la cola fueron efectuadas con PSMA soluble en PBS estéril. Ratones Transgénicos : Ratones fueron alojados en jaulas de filtro y fueron evaluados para determinar su buena condición física en las fechas de inmunización, sangrados y el día de la fusión. Se produjeron los hibridomas 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, y 16F9 por un ratón macho y ID#17018 del genotipo (CMD)++; (Hcol2) 15087+; (JKD)++; (Kco5)9272+. Las designaciones de transgenes individuales se ofrecen entre paréntesis, seguido por números de línea para transgenes integrados de manera aleatoria. Los símbolos ++ y + indican homocigótico o hemicigóticos ; sin embargo, puesto que los ratones son tamizados de manera rutinaria empleando un ensayo basado en reacción en cadena de polimerasa gue no permite distinción entre heterocigocidad y homocigocidad para los transgenes de Ig de ser humano integrados aleatoriamente, una designación + puede ser proporcionada ratones que de hecho son homocigóticos para estos elementos. Procedimiento de Inmunización: El esquema de inmunización se lista en la tabla 2. El ratón número 17018 fue fusionado el día 112 incluido entre un grupo de 10 ratones de genotipos HCo7 y HCol2. Todas las inmunizaciones fueron inyectadas en la cavidad intraperitoneal . Tres y dos días antes de la fusión, se aplicaron refuerzos IV. Tabla 2 Fecha de Inmunización: adyuvante, Sangrado actividad antígeno título* Día 1 CFA, membranas Día 13 IFA, PSMA (~ 50ug) Día 27 IFA, membranas Día 38 Título Día 40 IFA PSMA (~ 50µ?) Día 48 Título Día 55 IFA, PSMA (50ug) Día 62 Título Día 70 IFA, membranas Día 80 Título Día 84 IFA, membranas Día 94 Título Refuerzo IV día -3 y día - 2 antes de la fusión. Fusión efectuada el día 112 * Para títulos , véase Tabla 3. Preparación de Hibridoma: La línea de células de mieloma X63 ag8.653 (ATCC CRL 1580, lote F-15183) fue utilizada para las fusiones. El frasco ATCC original fue descongelado y expandido en cultivo. Se preparó una siembra madre de frascos congelados a partir de esta expansión. Las células son mantenidas en cultivo durante 3-6 meses, pasadas dos veces por semana. Se expandió P388D1 (ATCC TIB-63FL) a 200 mLs y se agotó. El sobrenadante fue sometido a centrifugación y filtrado y utilizado como un medio de adición para los hibridomas. Esta línea de células es pasada durante 3-6 meses cuando un nuevo frasco es descongelado. DMEM de alta glucosa: (Mediatech Cellgro, #1001233) que contiene FBS al 10% y penicilina-estreptomicina (Gibco, #11K1763), fue utilizado para cultivar células P388D1 y células de mieloma. Suplementos de medios adicionales se agregaron al medio de cultivo de hibridomas. El bazo de ratón número 17018 presentó un tamaño normal y proporcionó 1.78 x 108 células viables. Los esplenocitos fueron fusionados. El tamizado ELISA inicial para anticuerpos IgG, kappa de ser humano se llevó a cabo 7-10 días después de la fusión. Pozos positivos para IgG, kappa de ser humano fueron después tamizados en placas ELISA revestidas con PSMA soluble. Los hibridomas positivos para antígeno fueron después transferidos a placas de 24 pozos y eventualmente a frascos de—c^irtrv"os tisuiar. Hibridomas específicos para PSMA fueron subclonados por dilución limitativa con el objeto de asegurar una monoclonalidad. Hibridomas positivos para antigenos fueron conservados en varias etapas en el proceso de desarrollo mediante congelación de células en DMEM, FBS al 50% mas DMSO al 10% (Sigma, D2650) . Los títulos para el ratón #17018 se muestran abajo en la tabla. Los títulos son gamma específico para antígeno Hu. la respuesta al antígeno después de inmunizaciones repetidas muestra un nivel de respuesta robusta y el ratón fue preparado para la fusión. Tabla 3 Fecha Título Día 38 100 Día 48 50 Día 62 50 Día 80 1600 Día 94 3200 La fusión resultó en 38 hibridomas Hu-gamma, kappa que fueron retamizados en antígeno. Después del tamizado en antígeno (basado en ELISA) , se identificaron 5 hibridomas específicos para antígeno. Estos hibridomas fueron probados de nuevo en antígeno y los cinco clones fueron confirmados positivos para el blanco: 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 y 16F9. Los sobrenadantes de estos cinco hibridomas fueron evaluados adicionalmente . Arrt-rcu-erpos de estos cinco clones se unieron a la forma nativa de PSMA expresada en células LNCaP. Los cinco anticuerpos son isotipo gamma1 , kappa . La molécula biespecifica designada 14A8 x C12 fue elaborada por conjugación química de los fragmentos Fab'2 provenientes del anticuerpo anti-CD89 humano 14A8 o un subclon del anticuerpo 14A8, designado 14A8 y el anticuerpo anti-PSMA humano, 8C12, a través de enlaces disulfuro utilizando procedimientos estándares de reticulación (figura 6) . Ejemplo 4. Características de enlace de anticuerpos anti-PSMA. humanos Estudios ELISA en fase sólida: Las características de enlace de anticuerpos específicos anti-PSMA fueron estudiados mediante la comparación de reactividades (ELISA de fase sólida) contra PSMA de longitud completa y proteínas de fusión expresadas bacterianamente que contienen porciones de la proteína PSMA. HuMAbs 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, y 16F9 reaccionaron con PSMA purificado pero no reaccionaron con ninguna proteína de fusión que contenía una parte de la secuencia de PSMA (resultados no mostrados) . En contraste, el HuMAb 11C10 reaccionó fuertemente tanto con PSMA de longitud completa como con la proteína de fusión que contiene la secuencia de aminoácidos 1-173 de PSMA (figura 1) . Un nivel más bajo de enlace del anticuerpo 11C10 fue también observado con el fragmento de PSMA de aminoácido 134-437. Las características de enlace de anticuerpos específicos anti-PSMA de ser humano fueron también estudiadas por ELISA de fase sólida empleando fracciones de membrana de plasma derivadas de células LNCaP y de células PC3. Fracciones de membrana fueron diluidas en serie en placas de 96 pozos y secadas al aire. Las placas fueron bloqueadas con BSA al 5% y tratadas con 5 µ?/p?? de anticuerpo en PBS durante 1 hora antes de la detección empleando procedimientos ELISA estándares . Los resultados presentados en la figura 2 muestran resultados para HuMAbs 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, y 16F9 y demuestran una alta especificidad para membranas de células LNCaP en un rango de concentraciones de antigeno. Se observó poco o ningún enlace de anticuerpo arriba del fondo con membranas de células PC3. Se probó también una molécula biespecifica 14A8 x 8C12 para determinar su capacidad de enlazarse con células LNCaP que expresa PSMA y células U937 que expresa CD89 empleando ensayos similares. La molécula biespecifica se une tanto con células LCNaP como con células U937 en forma dependiente de la dosis. Los resultados ELISA con PSMA nativo y fragmentos de proteina de fusión de PSMA expresados bacterianamente muestran que todos los HuMAbs, excepto 11C10, son específicos para PSMA cuando están presentes en una conformación nativa. Para confirmar esta observación, el enlace de anticuerpo con PSMA nativo y térmicamente desnaturalizado se probó con el objeto de determinar la importancia de la conformación de proteina sobre la especificidad de enlace. La figura 3 muestra los resultados de un ensayo ELISA de fase sólida con PSMA nativo y PSMA desnaturalizado térmicamente. El anticuerpo monoclonal anti-PSMA de murino 7E11, especifico para un epitopo conformado por los primeros 6 aminoácidos de N-terminal de la proteína, se utilizó como control positivo. Los resultados indican que la desnaturalización térmica no tiene ningún efecto sobre el enlace de 7E11, lo que es consistente con su reconocimiento de un epitopo de secuencia lineal. En contraste con estos resultados, los anticuerpos 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 y 16F9 se unen todos fuertemente a PSMA purificado nativo. Sin embargo, la desnaturalización térmica de PSMA canceló virtualmente el enlace con anticuerpos lo que indica lo que se requiere de una conformación de proteína nativa para enlace con anticuerpo. De manera consistente con este resultado, los anticuerpos 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 y 16F9 fueron ineficaces para detectar PSMA en un análisis Western blot (no se muestran los resultados) . Por consiguiente, HuMAbs 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, y 16F9 no reconocen epítopos de secuencias lineales de amino ácidos si no que se unen a epítopos conformacionales de proteína, es decir, epítopos de proteína nativos que resultan del doblado conformacional de las moléculas de PSMA que ocurren cuando aminoácidos de porciones diferentes de la secuencia lineal se unen en cercanía estrecha en un espacio tridimensional. Dichos epítopos conformacionales están distribuidos en el lado extracelular de la membrana plasmática. Inmunoprecipitación de PSMA a partir de células LNCaP: La especificidad de enlace de los anticuerpos 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, y 16F9 se estudió mediante la inmunoprecipitación de proteína derivada de un lisado de detergente NP-40 1% de células LNCaP . El lisado fue tratado con anticuerpo seguido por adición de perlas de Protein G-Sepharose. Las perlas fueron lavadas de manera extensa y el complejo inmune enlazado fue sometido a electroforesis en gel SDS y Western blot con el anticuerpo específico para epítopo de secuencia de PSMA lineal de murino 4D8. Los resultados se muestran en la figura 4. El carril 1 muestra la reactividad Western blot de PSMA y PSM' (una variante de empalme alternativo a la cual le falta los primeros 57 amino ácidos de N-terminal) presente en lisado de células LNCaP. El carril 2 muestra los resultados de inmunoprecipitación con un anticuerpo humano irrelevante con correspondencia de isotipo (IgGi) . Los carriles 3 a 7 muestran los resultados de la inmunoprecipitación con anticuerpos 4A3, 7F12, 8A11, 8C12 y 16F9, respectivamente. En cada caso, bandas intensas que correspondan tanto a PSMA como a PSM' se observan indicando que estos anticuerpos se unen a epítopos de proteínas presentes dentro del dominio extracelular de la proteína.

Enlace de HuMAb con PSMA expresado en células LNCaP vivas: El enlace de anticuerpo por células LNCaP viables y no viables (fijadas) fue estudiado por citometría de flujo utilizando anticuerpo IgGi humano irrelevante como control. Las células viables son una formación de células negativas para yoduro de propidio. Las células fijadas fueron tratadas con para formaldehido al 1% en PBS antes del tratamiento con anticuerpos primarios. Se observó un enlace fuerte de los anticuerpos 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, y 16F9 tanto con células LNCaP vivas como con LNCaP fijadas. Se observó una tinción negativa con células PC3 o bien cuando un anticuerpo humano irrelevante con isotipo correspondiente fue utilizado con células LNCaP. En comparación, los resultados de enlace con anticuerpo con anticuerpos específicos para epitopos lineales de murino empleando la misma preparación de células viables y células fijadas y el control de anticuerpo de murino irrelevante demostró un enlace significativamente menor con células vivas. El enlace con células fijadas fue mayor, sin embargo, ningún anticuerpo de epítopo lineal fue comparable bajo ninguna condición en el enlace observado con HuMAbs conformacionales encontrados utilizando anticuerpo IgGj humano irrelevante como control. No se detectó enlace de anticuerpos de epitopos lineales o conformacionales de murino o de ser humano en experimentos utilizando células PC3 negativas para PSMA (no se muestran los resultados) . Por consiguiente, HuMAbs muestran un enlace de anticuerpo fuerte con células LNCaP vivas y se unen a un epitopo relacionado al epitopo unido por el anticuerpo conformacional de murino 3C6. Análisis FACS de competencia de enlace con anticuerpos: Estudios de competencia de enlace con anticuerpos fueron efectuados para determinar si cada anticuerpo se unía a un epitopo similar o distinto en PSMA. En estos experimentos, células LNCaP fueron tratadas primero con IgGi humana irrelevante o bien con HuMAbs específicos para PSMA, lavadas extensivamente, y marcadas con HuMAbs individuales marcados con FITC antes de análisis por citometría de flujo. La capacidad de HuMAbs no marcados para bloquear el enlace de HuMAb marcado con FITC fue probada. Se encontró un enlace fuerte de anticuerpos marcados con FITC en cada caso con células previamente tratados con Igd humana irrelevante. En contraste, el pretratamiento, con HuMAbs específicos anti-PSMA proporcionó una inhibición sustancial de enlace con anticuerpo marcado con FITC en cada caso. Conjuntamente, estos datos muestran que el comportamiento de enlace competitivo de 7F12 y 16F9 con los demás HuMAbs son similares. Ligeras variaciones en cuanto a la magnitud de la inhibición del enlace se observan con diferentes acoplamientos de anticuerpos. Por ejemplo, 8C12 inhibe efectivamente el enlace de 4A3, 8A11 y 8C12 pero tiene un efecto mucho menor sobre 7F12. Globalmente, epitopos conformacionales ligeramente diferentes pero estrechamente distribuidos son reconocidos por estos anticuerpos. Competencia de enlace de HuMAb con anticuerpos conformacionales para PSMA de murino: Anticuerpos específicos para PSMA de murino designados 1G9, 3C6, y 4D4 fueron desarrollados los cuales están enfocados hacia epitopos conformacionales de proteína. Estudios de competencia de anticuerpos, de conformidad con lo medido por citometría de flujo, fueron efectuados con anticuerpos 1G9, 3C6 y 4D4 para determinar si los HuMAbs reconocen epitopos en común con anticuerpos de murino. La capacidad de HuMAbs no marcados para bloquear el enlace de 1G9, 3C6 y 4D4 marcados con FITC fue probada. El pretratamiento de células LNCaP con HuMAbs, seguido por marcado con 4D4 y 1G9 de murino marcado con FITC, indicó resultados similares con poca o ninguna inhibición aparente. En contraste, una inhibición significativa de FITC-3C6 se observó por HuMAbs 4A3, 7F12, 8A11, 8C12, y 16F9 lo que indica que cada uno de ellos se une con un epítopo similar o estrechamente distribuido según lo reconocido 3C6. Afinidad de enlace de HuMAbs conformacionales para PSMA sobre células LNCaP: HuMAbs de PSMA son altamente sensibles a la conformación nativa de PSMA. Numerosos experimentos para determinar constante de afinidad utilizando PSMA purificado fracasaron en el objetivo de proporcionar resultados confiables o reproducibles . Se efectuaron experimentos para tener una cierta información de enlace por afinidad a partir de PSMA nativo según lo expresado en células LNCaP viables. Para probar la afinidad de enlace de cada anticuerpo para PSMA nativo, se efectuó un ensayo de citometria de flujo en donde la concentración de anticuerpo primario fue variada para un número fijo de células LNCaP (1 x 10°) con exceso de anticuerpo secundario marcado con FITC. Los datos en la tabla 4 muestran los resultados expresados como la concentración de anticuerpo que se requiere para proporcionar un cambio semimáximo en cuanto a la intensidad del marcado celular. Estos resultados demuestran que las afinidades de enlace más elevadas fueron encontradas con anticuerpos 4A3, 7F12, y 16F9. El anticuerpo 8C12 presentó una afinidad de enlace aproximadamente 3 veces menor seguido por el anticuerpo 8A11 con una afinidad de enlace aproximadamente 20 veces menor que los anticuerpos de alta afinidad. Tabla 4 Anticuerpo Anticuerpo requerido para un cambio semimáximo (µ/ml) 7F12 7 4A3 9 16F9 10 8C12 28 8A11 195 Ejemplo 5. Actividad ADCC y CDC de anticuerpos anti-PSMA humanos y biespeci ieos . I. Actividad citotóxica mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) de anticuerpos anti-PSMA humanos: La capacidad de que HuMAbs anti-PSMA medie la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) o la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) fue probada para cada anticuerpo conformacional descrito en los ejemplos arriba en experimentos utilizando PBMC's de dos donadores. Los resultados mostrados en la figura 5A y en la figura 5B indican una ADCC fuerte para cada HuMAb. Cada HuMAb presentó un titulo similar y una reactividad similar a la Herceptina como control positivo (Figura 5B) . No se observó ninguna actividad CDC a partir de ningún HuMAb (datos no mostrados) .

II. Actividad de citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) de anticuerpos biespecificos anti-PSMA de ser humano: La molécula biespecifica 14A8 x 8C12 (mostrada en la figura 6) y el anticuerpo monoclonal 8C12 fueron probados para la muerte causada por ADCC mediada por células polimorfonucleares de células tumorales que expresan PSMA marcadas. En particular, células mononucleares (monocitos y neutrófilos) , asi como sangre entera, fueron aislados de donadores sanos e incubadas con células tumorales que expresan PSMA marcadas con 5ICr en presencia de la molécula biespecifica 14A8 x 8C12. Después de aproximadamente 4 horas, el sobrenadante de cultivo de los pozos fue cosechado y la liberación de 31Cr fue medida en un contador de rayos gamma. La lisis específica porcentual fue determinada de conformidad con la fórmula siguiente: (CPM experimental - CPM de fuga blanco) / (CPM de lisis de detergente - CPM de fuga blanco) x 100%. Los resultados, mostrados en las figuras 7A, 8A y 9A, demuestran que 14A8 x 8C12 media la lisis dependiente de la dosis de las células tumorales por monocitos y neutrófilos y sangre entera, respectivamente, en comparación con un anticuerpo de control. Células mononucleares y sangre entera fueron también incubados con células tumorales LNCaP marcadas con 0lCr en presencia ya sea de molécula biespecifica 14A8 x 8C12 o bien con anticuerpo monoclonal 8C12 (Figuras 7B, 7C, 8B y 9B) . Las células LNCaP fueron marcadas con 100 yCi de 51Cr durante una hora a una temperatura de 37 °C (C02 al 5%) antes de incubación con células mononucleares y sangre entera, junto con varias concentraciones de anticuerpo biespecífico o monoclonal. Después de una incubación de 16 horas, el sobrenadante fue cosechado y analizado para determinar la radioactividad de conformidad con lo descrito arriba. ADCC inducido por monocitos : Como se muestra en la figura 7A, la molécula biespecifica 14A8 x C8C12 medió la muerte celular de células tumorales que expresan PSMA por monocitos de manera dependiente de la dosis. La adición de 50 µg/ml de Fab'2 de 14A8 bloqueo totalmente ADCC de las células tumorales por 1 g ml de la molécula biespecifica 14A8 X 5 8C12, lo que demuestra que la muerte de células blanco fue mediada exclusivamente por CD89 en las células efectoras . Como se muestra en la figura 7B, la molécula biespecifica 14A8 X 8C12 y el anticuerpo monoclonal 8C12 mediarán también la lisis dependiente de la dosis por monocitos de las células 10 tumorales LNCaP . Además, la adición de F(ab) '2 de 14A8 en exceso inhibió totalmente ADCC de las células tumorales por la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 en comparación con F(ab) '2 de H22 (anti-FcyRI humanizado), lo que indica que la muerte dirigida de células fue mediada a través de CD89 15 (véase figura 7C) . ADCC inducida por neutrófilos: Como se muestra en la figura 8A, la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 medió la muerte celular de células tumorales que expresan PSMA por neutrófilos de manera dependiente de la dosis. La adición de 20 25 g/ml de Fab'2 de 14A8 boqueo de manera significativa ADCC de las células tumorales por la molécula biespecifica, lo que demuestra que la muerte dirigida de células fue mediada específicamente por el enlace de CD89 con las células efectoras. Como se muestra en la figura 8B, la molécula "2~5 üiespecifica 14A8 x 8C12 medió también la lisis dependiente de la dosis por neutrófilos de células tumorales LNCaP. La adición de F(ab) ' 2 de 14A8 en exceso inhibió totalmente ADCC de las células tumorales por 14A8 x 8C12 en comparación con F(ab)'2 de H22 (anti-FCyRI humanizado), lo que indica que la muerte enfocada de células fue mediada a través de CD89. ADCC inducido por sangre entera: Como se muestra en la figura 9A, la molécula biespecífica 14A8 x 8C12 medió la muerte celular de células tumorales que expresan PSMA por sangre entera de manera dependiente de la dosis. La adición de 25 g/ml de Fab'2 de 14A8 bloqueo significativamente ADCC de las células tumorales por la molécula biespecífica, demostrando otra vez que la muerte dirigida de células fue mediada específicamente por el enlace de CD89 sobre las células efectoras. Similarmente, como se muestra en la figura 9B, La molécula biespecífica 14A8 x 8C12 medió también la lisis dependiente de la dosis por sangre entera de células tumorales LNCaP. La adición de F(ab) '2 de 14A8 en exceso inhibió totalmente ADCC de las células tumorales por 14A8 x 8C12 en comparación con F(ab) de H22 (anti-FCyRI humanizado) , lo que indica que la muerte dirigida de células fue mediada a través de CD89. III · Anticuerpos anti-PSMA de ser humano y anticuerpos biespecí fieos median la fagocitosis y muerte de células tumorales que expresan PSMA en presencia de células efectoras humanas : La molécula biespecífica 14A8 x 8C12 y el anticue monoclonal 8C12 fueron probados para determinar su capacidad de mediar la fagocitosis de células tumorales que expresan PSMA marcadas (células LNCaP) solas, asi como en presencia de anticuerpo Fab'2 (anti-FCaR humanizado), del4A8 en exceso o bien anticuerpo Fab'2 (anti-FCyRI humanizado) de H22 en exceso como control. En resumen, se examinó la fagocitosis mediada por moléculas biespecificas de células LNCaP por macrófagos derivados de monocitos (MDM) a través de una modificación del método descrito por Munn y colaboradores (1990) J. Exp. Med. 112:231-237. Los monocitos, purificados a partir de una fuente adulta normal leucopacs (ABI ) fueron diferenciados en placas de 24 pozos (1 x 10ó/ml) en medio libre de suero de macrófago (Gibco, Grand Island, NY) complementado con FBS al 10% y 10 ng/ml de M-CSF durante 7-12 dias. Las células LNCaP fueron marcadas con un colorante fluorescente rojo lipof lico, PKH26 (Sigma, ST. Louis, MO) . Las células LNCaP marcadas fueron agregadas as los pozos que contenían MDM en ausencia o presencia de anticuerpo biespecífico (o bien anticuerpo de control) e incubadas a 37° C durante 5-24 horas (C02 al 5%) . Células LNCaP sometidas as MDM y no sometidas a fagocitosis fueron recuperadas con tripsina, y teñidas con un mAb anti-CD33 marcado con FITC (251) y un mAb anti-CD14 (AML-2-23) durante 1 hora en hielo (4° C) . Las células fueron -ta-va-das—y—analizadas para determinar la fluorescencia de dos colores empleando el FACScan. Se calculo el porcentaje de fagocitosis como el número de células blanco positivas doble (ingeridas por MDM) dividido entre el número total de células blanco X 100%. 5 Como se muestra en la figura 10, la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 medió una fagocitosis especifica incrementada de células tumorales de manera dependiente de la dosis. La adición de Fab'2 de 14A8 bloqueo significativamente la fagocitosis de las células tumorales o la molécula 10 biespecifica, demostrando otra vez que la fagocitosis dirigida fue mediada específicamente por el enlace de CD89 con las células efectoras. De manera similar, como se muestra en la figura 11, la molécula biespecifica 14A8 x 8C12 y el anticuerpo monoclonal 8C12 mediaron también la fagocitosis de 15 células LNCaP de manera dependiente de la dosis. La figura 12 muestra que la fagocitosis mediada por 14A8 x 8C12 de células tumorales LNCaP fue mediada a través de CD89, que fue inhibida por la adición de F(ab)'2 del4A8 en exceso, en comparación con F(ab)'2 de H22 ( (anti-FCyRI humanizado) (véase 20 inserto, figura 12) . Los ejemplos anteriores demuestran la generación de anticuerpos monoclonales humanos y biespecífieos que reaccionan específicamente con alta afinidad con PSMA. Estos anticuerpos y biespecí fieos reconocen los epítopos de -2-5 pro-tre±n-a ccTTTormácional nativos presentes en el dominio extracelular de la molécula en lugar de los epitopos definidos por una secuencia lineal de aminoácidos. Además, los anticuerpos anti-PSMA humanos y moléculas biespecificas de los mismos median la muerte celular y la fagocitosis en 5 presencia de células efectoras contra células tumorales humanas que expresan altos niveles de PSMA. Ejemplo 6 Biodistribución de anticuerpos anti-PSMA humanos marcados con 1251 en tumores de células LNCaP en ratones desnudos 10 La biodistribución de HuMAb marcado con 12 I en ratones desnudos que llevan tumores de células LNCaP fue probada mediante el seguimiento de la absorción dependiente del tiempo de anticuerpo marcado en tejidos normales y tejidos tumorales. Los resultados fueron obtenidos para dos HuMAbs, 15 4A3 y 7F12. El anticuerpo 7F12 fue utilizado inicialmente con base en estudios de afinidad de enlace y disponibilidad de proteina de anticuerpo adecuada. Experimentos subsecuentes, sin embargo, demostraron que la yodinación de 7F12 cancelo virtualmente la capacidad de este anticuerpo para unirse con 20 antigeno. Por consiguiente, se obtuvieron datos útiles solamente para 4A3. Los resultados de 4A3 se muestran en la figura 13 e indican que el anticuerpo marcado se encuentra inicialmente predominantemente en la sangre y en tejidos altamente vascularizados . Esto disminuye conforme ocurre la "2"5 absorcio~ñ de tumor y el marcado de tumor es mayor en comparación con los te idos normales (el marcado es doble o mayor en comparación con los tejidos normales) después de 24 horas. Por consiguiente, ocurre una biodistribución significativa de tejido tumoral. La magnitud del marcado 5 tumoral con el tiempo después de la absorción, puede depender, en parte de niveles disminuidos de anticuerpos circulantes y de la internalización de anticuerpo unido con la liberación resultante de fragmentos de proteina de anticuerpo marcado de la célula. 10 Ejemplo 7 Análisis de la internalización de anticuerpos anti- PSMA humanos marcados con 1251 por células LNCaP La internalización de proteina HuMAb marcada con 125I fue monitoreada por análisis de la liberación dependiente del tiempo en sobrenadante de cultivo de conteos de 125I soluble 15 en TCA. Las células LNCaP, marcadas en la superficie con anticuerpo yodinado, fueron incubadas a 37° C y el sobrenadante de cultivo fue removido, se precipito TCA, y la cantidad de marcado 12 I presente en la fracción de sobrenadante se determino en los tiempos mencionados en la 20 figura 14. Los resultados indican que los anticuerpos yodinados 4A3, 16F9, 16F9 y 8A11 marcaron efectivamente las células LNCaP a la hora cero y fueron eficientemente inernalizados en las células, degradados y los fragmentos de proteina fueron liberados en el sobrenadante de cultivo. "2~5 Aproximadamente el 50% del anticuerpo originalmente unido fue recuperado en una fracción soluble en TCA después de un periodo de incubación de 18 horas con cada uno de estos anticuerpos . Resultados diferentes de enlace celular e internalización 5 fueron obtenidos para HuMAbs 7F12 y 8C12 yodinados. En particular, se encontró un marcado de células LNCaP total significativamente inferior utilizando anticuerpos 7F12 y 8C12 yodinados, lo que sugiere que la yodinación puede tener un impacto sobre la capacidad de los anticuerpos marcados 10 para unirse con antigeno. Para probar esta hipótesis, se llevo a cabo un ensayo de enlace de fase sólida utilizando PSMA de célula LNCaP purificado nativo inmovilizado y HuMAb yodinado. Los resultados mostrados en la figura 15 confirman el enlace del anticuerpo 4A3 yodinado de control positivo con 15 PSMA y demuestran también que la yodinación cancelo la capacidad tanto de 7F12 como de 8C12 para unirse con antigeno. Asi, las tasas de internalización para anticuerpos 7F12 y 8C12 no pueden ser evaluadas utilizando anticuerpos 7F12 y 8C12 marcadas con 12 I . 20 Ejemplo 8 Efecto de marcado con DOTA de HuMAbs A3 y 7F12 sobre el enlace con PSMA Los anticuerpos fueron marcados con DOTA y el se probo a través de ELISA el enlace de anticuerpo con antigeno. DOTA (ácido tetraazociclododecantetracidico) es un agente de ¦2-5 qxreiracTori común que puede utilizarse para formar radionuclidos en complejos. Los resultados en la figura 16 demuestran que los anticuerpos marcados con DOTA conservan una alta capacidad de enlace lo que indica que estos anticuerpos serán útiles para formar quelatos de 5 radiometales . Ejemplo 9 Reactividad Tisular de anticuerpos anti-PSMA. humanos que se unen con tejidos humanos normales y malignos por inmunohistoquímica Un análisis inmunohistoquimico del enlace de cinco HuMAbs 10 específicos para epítopos conformacionales presentes en el PSMA fue aplicado a un tamizado de reactividad cruzada con secciones congeladas de tejidos humanos normales y malignos. Los resultados de una sola muestra de cada tipo de tejido demuestra un enlace fuerte con el epitelio prostético y el 15 endotelio vascular de tumor de malignidades no prostéticas o de tejidos normales. No se observo ninguna tinción del endotelio vascular dentro del cáncer prostético. Otra reactividad más débil fue observada incluyendo reactividad variable de epitelio glandular de tejidos no neoplásicos, 20 reactividad cruzada potencial en tejidos cerebrales, y tinción de linfocitos del jejenum y células de Kuppfer en el hígado. Existe alguna pregunta en cuanto a los resultados de tinción no prostéticos puesto que algunos de estos tejidos "normales" fueron obtenidos del mismo donador que mostró una ¦2-5 fxre-rtre txnutoñ" vascular de tumor de tumores adyacentes o cercanos. La tinción de linfocitos puede deberse a una absorción de antigeno del tumor primario. Otros tejidos y elementos fueron negativos con estos anticuerpos. No se observaron diferencias significativas en cuanto a reactividad 5 tisular a través de IHC entre los cinco HuMAbs probados. Ejemplo 10 Afinidad de enlace La afinidad de enlace de HuMAbs anti-PSMA fue determinada empleando citometria de flujo con células LNCaP en donde el HuMAb fue diluido en una serie de tubos de células. La 10 cantidad de anticuerpo unido fue detectada utilizando un anticuerpo secundario marcado con FITC presente en cantidades de saturación. Los datos, analizados como la cantidad de proteina de anticuerpo que se requiere para un cambio semi- máximo (el cambio observado con HuMAb de saturación) , fueron 15 los siguientes: TABLA 5 Anticuerpo Anticuerpo requerido para cambio semi- máximo (µ/ml) 7F12 7 20 4A3 9 16F9 10 8C12 28 8A11 195 Estudios adicionales de afinidad en HuMAbs 4A3 y 7F12 ~2""5 uTllizaron anticuerpo radiomarcado [anticuerpo marcado con ulIn-DOTA) y enlace con un número fijo de células LNCaP. Un análisis de Scatchard fue efectuado con los datos de enlace de anticuerpo resultantes. Los resultados para los anticuerpos (4A3 y 7F12) demostraron constantes de afinidad similares con una KD = 0.5 ± 0.1 nM ó 10~lü M) . Ejemplo 11 Clonación de la región V ARNm de poliA+ y ADNc de primera cadena fueron preparados a partir de los hibridomas anti-PSMA utilizando kits de aislamiento de ARNm y de síntesis de ADNc (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Las regiones 4A3, 7F12 y 8C12 V fueron amplificación por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un panel de cebadores 5' que corresponden a secuencias de señales VH y VL (o bien VK) de ser humano. Las regiones 8A11 y 16F9 V fueron amplificadas utilizando cebadores que se unen con el extremo 5' de las secuencias de región V maduras en la estructura 1. Los cebadores de reacción en cadena de polimerasa VH y VK de 3' contenían las secuencias siguientes, respectivamente: TGCCAGGGGGAAGACCGATGG (SEQ ID NO: 57) y CGGGAAGATGAAGACAGATG (SEQ. ID NO: 58) . La reacción en cadena de polimerasa, la clonación y el secuenciamiento fueron efectuados por duplicado con el objeto de monitorear los cambios potenciales introducidos por reacción en cadena de polimerasa en las secuencias. eorrcirtrs ón "—" Los ejemplos anteriores demuestran la producción de cinco anticuerpos monoclonales totalmente humanos específicos para epitopos conformacionales en PSMA humano, así como agentes biespecí fieos terapéuticos que contienen los anticuerpos. Los cinco anticuerpos presentaron una alta especificidad de antígeno y reactividad con PSMA nativo pero no desnaturalizado. Los anticuerpos son internalizados eficientemente en células que expresan PSMA, tienen una fuerte actividad citotóxica mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC) , se biodistribuyen a tumores que expresan PSMA en modelo de animales, y tienen un desempeño similar en estudios de inmunohistoquímica de tejidos humanos, soportando su utilidad terapéutica y de diagnóstico en el tratamiento de seres humanos. Equivalentes Las personas con conocimientos en la materia reconocerán o bien podrán determinar utilizando solamente experimentos de rutina muchos equivalentes de las modalidades específicas de la invención descrita aquí. Tales equivalentes se encuentran dentro del marco de las reivindicaciones adjuntas. Incorporación por referencia Todas las patentes, solicitudes de patentes pendientes y otras publicaciones citadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Medarex, Inc. et al. <120> ANTICUERPOS MONOCLO ALES HUMANOS PARA ANTÍGENO DE MEMBRANA ESPECÍFICO DE PRÓSTATA (PSMA) <130> MXI-163CPPC <150> 10/059989 <151> 2002-01-28 <15C> PCT/US00/20247 <151> 2000-07-26 <150> 60/146285 <151> 1999-07-29 <150> 60/158759 <151> 1999-10-12 <150> 60/188087 <151> 2000-03-09 <160> 58 <170> FastSEQ for Windows Versión 4.0 <210> 1 <211> 357 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 1 gaggtgcagt tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagttttacc agctactgga tcggctgggc gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctag 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgttc ggccgctaat 300 tcttctcact ggtacttcga tctctggggc cgtggcaccc tgg cactgt ctcctca 357 <210> 2 <211> 325 <212> ADN <2I3> Homo sapiens <400> 2 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctocagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggttcca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggctcatgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaac 325 <210> 3 . . · 357 < O0> 3 caggtgcagc tgcaggagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata tagttttacc agcttctgga tcggctgggc gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 accccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gtagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gaccgctaac 300 tcctctttct ggaatttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 4 <211> 325 <212> ADN <213> Homo sapiens 00> 4 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattt'tg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggctcatgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaac 325 <210> 5 <211> 357 <212> ADN <2I3> Homo sapiens <400> 5 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaacgc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gctctggata cacctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcccggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccttc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga acagcctgaa gacctcggac accgccatgt attactgtgc gaccgctaac 300 ccctcttatt ggtatttcga tctctggggc cgtggcaccc tggtcactgt ctcctca 357 <210> 6 <211> 325 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 6 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatgat gcatccaaca gggccactgg catcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcgact ggctcatgta cacttttggc 300 caggggacca agctggagat caaac 325 <210> 7 <400> 7 agtctggagc agaggtgaaa acgcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggctctg 60 gatacacctt taccaactac tggatcggct gggtgcgcca gatgcccggg aaaggcccgg 120 agtggatggg gatcatctat cctggtgact ctgataccag atacagcccg tccttccaag 180 gccaggtcac cttctcagcc gacaagtcca tcagcaccgc ctacctgcag tggagcagcc 240 tgaagacctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgaccgc taacccctct tattggtatt 300 tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a 341 <210> 8 <211> 302 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagcgtcacc atcacttgcc gggtgagtca 60 gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca gggaaagttc ctaagctcct 120 gatctatagt gcatccaatt tgcaacctgg agtcccatct cggttcagtg gcagtggatc 180 tgggacagat ttcactctca ctatcaacag cctgcagcct gaagatgttg caacttatta 240 cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct gggaccaaag tggatatcaa 300 ac 302 <210> 9 <211> 341 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 agtctggagc agaactgaaa aagcccgggg agtctctgaa gatctcctgt aagggttctg 60 gatacagttt taccaactac tggatcggct gggcgcgcca gatgcccggg aaaggcctgg 120 agtggatggg gatcatctat cctggtgact ctgataccag atacagtccg tccttccaag 180 gccaggtcac catctctgcc gacaagtccg tcagcaccgc ctacctgcag tggaacagtc 240 tgaaggcctc ggacaccgcc atgtattact gtgcgaccgc taactcctct ttctggaact 300 tcgatctctg gggccgtggc accctggtca ctgtctcctc a 341 <210> 10 <211> 302 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 10 tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggtgagtca 60 gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca ggcaaágttc ctaagctcct 120 gatgtatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct cggttcagtg gcagtggatc 180 tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct gaagatgttg caacttatta 240 cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct gggaccaaag tggatatcaa 300 ac 302 < ? 1 0> 1.1 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp lie Gly Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Ala Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 12 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Phe 20 25 30 Trp lie Gly Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ala Asn Ser Ser Phe rp Asn Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Thr Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 25 . 30 Trp lie Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Met 35 40 45 Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Asn Ser Leu Lys Thr Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Ser Gly Ala Glu Val Lys Thr Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys 1 5 10 15 Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp lie Gly Trp Val Arg 20 25 30 Gln Met Pro Gly Lys Gly . Pro Glu Trp Met Gly lie lie Tyr Pro Gly 35 40 45 Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr Phe 50 55 60 Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Ser Ser Leu 65 70 75 80 Lys Thr Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Asn Pro Ser 85 90 95 Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ser <210> 15 <211> 113 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ser Gly Ala Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Ser Leu Lys lie Ser Cys 1 5 10 15 Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr Trp lie Gly Trp Ala Arg 20 25 30 Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met Gly lie lie Tyr Pro Gly 35 40 45 Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln Gly Gln Val Thr lie 50 55 60 Ser Ala Asp Lys Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Trp Asn Ser Leu 65 70 75 80 Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Asn Ser Ser 85 90 95 <210> 16 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro ly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Tyr 20 25 20 Leu Ala Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg ?he Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Me- 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 17 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg ?he Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Are Ser Asn Trp Leu Mez 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 18 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Le Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 <210> 19 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Ser Val Thr lie Thr Cys 1 5 10 15 Arg Val Ser Gln Gly lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 55 60. Thr Leu Thr lie Asn Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Asp lie Lys 100 » <210> 20 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys 1 5 10 15 Arg Val Ser Gln Gly lie Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys 20 25 30 Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Met Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln 35 40 45 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 50 · 55 60 Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr 65 70 75 80 niy nin Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr Phe Gly. Pro Gly Thr Lys 85 90 95 Val Asp lie Lys 100 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Tvr Trp lie Gly 1 ' 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 23 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Asn Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 24 Ser Phe Trp lie Gly 1 5 <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 26 <2I3> Homo sapiens Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu 5 <210> 27 <211> 5 <212> P T <213> Homo sapiens <400> 27 Ser Tvr Trp lie Gly 1 " 5 <210> 28 <2Í1> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser. ?he Gln -, 5 10 15 Glv <210> 29 <211> 10 <2I2> PRT <2i3> Homo sapiens <400> 29 Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 , 10 <210> 30 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Asn Tyr Trp lie Gly 1 5 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 "GTy <210> 32 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Ala Asn Pro Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 33 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Asn Tyr Trp lie Gly 1 5 <210> 34 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 35 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Ala Asn Ser Ser Phe Trp Asn Phe Asp Leu 1 5 10 <210> 36 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Arg Ala Ser Gln Ser Val JSer Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 37 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 38 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu 1 5 10 <210> 40 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 41 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Gln Gln Arg Ser Asn Trp Leu Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu 5 10 <210> 43 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr 1 5 <210> 44 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Gln Gln Arg Ser Asp Trp Leu Met Tyr Thr 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> RT <213> Homo sapiens <400> 45 Arg Val Ser Gln Gly lie Ser Ser Tyr Leu 1 5 10. <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 · Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr 1 5 <210> 48 <211> 11 :212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Arg Val Ser Gln Gly lie Ser Ser Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 49 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser 1 5 <210> 50 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe Thr 1 5 <210> 51 <211> 98 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys lie Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp lie Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly lie lie Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr lie Ser Ala Asp Lys Ser lie Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg <210> 52 <211> 94 <212> PRT ' <213> Homo sapiens <400> 52 Glu lie Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Ara Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala rp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala P 3~Arg Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp 85 90 <210> 53 <211> 103 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Asp lie Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Val Ser Gln Gly lie Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Asn Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Gly Gln Arg Thr Tyr Asn Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Thr Lys Val Asp lie Lys 100 <210> 54 <211> 343 <212> ADN <213> Homo sapiens <40O> 54 gaggtgcagc tggtgcagtc tggagcagag gtgaaaaagc ccggggagtc tctgaagatc 60 tcctgtaagg gttctggata cagctttacc agctactgga tcggctgggt gcgccagatg 120 cccgggaaag gcctggagtg gatggggatc atctatcctg gtgactctga taccagatac 180 agcccgtcct tccaaggcca ggtcaccatc tcagccgaca agtccatcag caccgcctac 240 ctgcagtgga gcagcctgaa ggcctcggac accgccatgt attactgtgc gatactggta 300 cttcgatctc tggggccgtg gcaccctggt cactgtctcc tea 343 <210> 55 <211> 283 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 55 gaaattgtgt tgacacagtc tccagccacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agctacttag cctggtacca acagaaacct 120 gcccaggcte ccaggctcct catctatgat gcarccaaca gggccactgg catcccagcc 18TJ ggttcagtg gcagtgggtc tgggacagac ttcactctca ccatcagcag cctagagcct 240 aagattttg cagtttatta ctgtcagcag cgtagcaact ggc 283 210> 56 211> 322 212> ADN 213> Homo sapiens <400> 56 gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 tcacttgcc gggtgagtca gggcattagc agttatttaa attggtatcg gcagaaacca 120 gggaaagttc ctaagctcct gatctatagt gcatccaatt tgcaatctgg agtcccatct 180 ggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ctatcagcag cctgcagcct 240 gaagatgttg caacttatta cggtcaacgg acttacaatg ccccattcac tttcggccct 300 gggaccaaag tggatatcaa ac 322 <210> 57 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 57 tgccaggggg aagaccgatg g 21 <210> 58 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 58 cgggaagatg aagacagatg 20

Claims

REIVINDICACIONES Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende una región variable de cadena pesada de ser humano que comprende las secuencias de FR1, CDR1, FR2 , CDR2, FR3, CDR3 y FR4 y una región variable de cadena ligera de ser humano que comprende las secuencias de FR1, CDR1, FR2, CDR2 , FR3, CDR3 y FR4, en donde : (a) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena pesada de ser humano se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NO: 23, 26, 29, 32 y 35 y modificaciones conservadoras de las mismas ; (b) la secuencia de CDR3 de región variable de cadena ligera de ser humano se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NOs : 38, 41, 44, 47 y 50, y modificaciones conservadoras de las mismas; (c) el anticuerpo humano se une con PSMA humano con una KD de 10~8 M o menos; y (d) el anticuerpo humano media la lisis de células de tumor PSMA+ en un ensáyo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . El anticuerpo aislado de la reivindicación 1, en donde secuencia de CDR2 de región variable de cadena pesada de ser humano se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 22, 25, 28, 31 y 34, y modificaciones conservadoras de las mismas; y las secuencias CDR2 de región variable de cadena ligera de ser humano se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 37, 40, 43, 46 y 49, y modificaciones conservadoras de las mismas. El anticuerpo humano aislado de conformidad con la reivindicación 1 o de conformidad, con la reivindicación 2, en donde la secuencia de CDR1 de región variable de cadena pesada de ser humano se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 21, 24, 27, 30 y 33, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia de CDR1 de región variable de cadena ligera de ser humano se selecciona dentro del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 36, 39, 42, 45 y 48, y modificaciones conservadoras de las mismas. El anticuerpo humano aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que se une a PSMA humano con una KD de 10"9 M o menos. El anticuerpo humano aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde las secuencias de FR1, FR2, FR3 y FR4 de región variable de cadena pesada de ser humano se derivan de las secuencias de línea germinal VHS- de cadena pesada de ser humano. El anticuerpo humano aislado de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde las secuencias de FR1, FR2, FR3 y FR4 de región variable de cadena ligera de ser humano se derivan de las secuencias de linea germinal L6 ó 04/014 de cadena ligera de ser humano. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende una región variable de cadena pesada de ser humano y una región variable de cadena ligera de ser humano, en donde : (a) la región variable de cadena pesada de ser humano comprende . una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo que consiste de secuencias SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, y secuencias que tienen una homología de por lo menos el 80% con SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14 y 15; (b) la región variable de cadena ligera de ser humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada dentro del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20 y secuencias que tienen una homología de por lo menos el 80% con SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, y 20; (c) el anticuerpo humano se une con PSMA de ser humano con una KD de 10-8 M o menos; y (d) el anticuerpo humano _ media la lisis de células tumorales PS A+ en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC] El anticuerpo humano aislado humano de conformidad con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo se une e PSMA humano con una KD de 1CT9 M o menos. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende una región variable de cadena pesada de ser humano derivada de la secuencia de linea germinal VH5-51 de cadena pesada de ser humano ( SEQ ID NO: 54) y una región variable de cadena ligera de ser humano derivado de la secuencia de linea germinal L6 (SEQ ID NO: 55) ó 04/014 (SEQ ID NO: 56) de cadena ligera de ser humano, en donde: (a) la región variable de cadena pesada de ser humano comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 o una secuencia que tiene una homología de por lo menos el 80% con SEQ ID NO: 12; (b) la región variable de cadena ligera de ser humano comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 o una secuencia que tiene una homología de por lo menos el 80% con SEQ ID NO: 17; (c) el anticuerpo humano se une a PSMA humano con una. p.rip 10~9 M o menos: y_ (d) un anticuerpo humano media la lisis de células tumor PSMA+ en un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende regiones variables de cadena pesada de ser humano y cadena ligera de ser humano que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 11 y SEQ ID NO: 16, respectivamente. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende regiones variables de cadena pesada de ser humano y cadena ligera de ser humano que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 12 y SEQ ID NO: 17, respectivamente. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende regiones variables de cadena pesada de ser humano y cadena ligera de ser humano que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 13 y SEQ ID NO: 18, respectivamente. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende regiones variables de cadena pesada de ser humano y de cadena ligera de ser humano que comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 14 y SEQ ID NO: 19, respectivamente. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que comprende regiones variables de cadena pesada de ser humano y de cadena ligera de ser humano que comprenden secuencias de aminoácidos mostradas en SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 20, respectivamente. 15. Un anticuerpo monoclonal humano aislado que compite para unirse con PSMA con el anticuerpo monoclonal humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores . 16. El anticuerpo humano aislado de cualquiera de las reivindicaciones anteriores producido por un hibridoma, en donde el hibridoma se prepara a partir de una célula B obtenida a partir de un animal no humano transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen o transcromosoma de cadena pesada de ser humano y un transgen o transcromosoma de cadena ligera de ser humano, fusionado en una célula inmortalizada. 17. El anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que se une a una célula tumoral seleccionada dentro del grupo que ¦ consiste de células tumorales de vejiga, mama, colón, riñon, ovario, próstata, riñon, células escamosas, pulmón (no de célula pequeña) y cabeza y cuello. 18. El anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una cadena pesada de IgG humana y una cadena ligera kappa humana. 1Q.F.1 anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende una cadena pesada de IgG 1 o IgG 3. 20. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 21. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo humano de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores enlazado a un agente terapéutico. 22. El inmunoconjugado de conformidad con la reivindicación 21, en donde el agente terapéutico es una citotoxina. 23. El inmunocnjugado de conformidad con la reivindicación 21, en donde el agente terapéutico es un radioisótopo. 24. Una composición farmacéutica que comprende el inmunocon ugado de cualquiera de las reivindicaciones 21-23 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 25. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. 26. La molécula de ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 25, en donde la molécula de ácido nucleico se incorpora en un vector de expresión. 27. Un transfectoma que comprende un ácido nucleico aislado de la reivindicación 25 ó de la reivindicación 26. 28. Un animal no humano transgénico que expresa un aü-ó u-er n humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el animal no humano transgénico tiene un genoma que comprende un transgen o un transcromosoma de cadena pesada de ser humano y un transgen o transcromosoma de cadena ligera de ser humano . 29. Un método para inhibir el crecimiento de una célula que expresa PSMA, dicho método comprende la puesta en contacto de la célula con una cantidad efectiva de un anticuerpo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores de tal manera que se inhiba el crecimiento de la célula. 30. Un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad que se caracteriza por el crecimiento de células tumorales que expresan PSMA, dicho método comprende la administración a un sujeto del anticuerpo humano de cualquiera de las reivindicaciones anteriores en una cantidad efectiva para tratar o prevenir la ¦ enfermedad. 3.1. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde la enfermedad es cáncer. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31, en donde el cáncer se selecciona dentro del grupo consiste de cáncer de próstata, cáncer de colón y carcinoma renal . 33. El método de conformidad con la reivindicación 31 , en donde el cáncer es cáncer de próstata. 34. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el anticuerpo humano está conjugado con un agente terapéutico . 35. El método de conformidad con la reivindicación 34, en donde el agente terapéutico es una citotoxina. 36. El método de conformidad con la reivindicación 34, eN donde el agente terapéutico es un radioisótopo.