CN105658671B - 嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含(i)B细胞成熟抗原(BCMA)结合域，其包含增殖诱导配体(APRIL)的至少一部分；(ii)间隔物域；(iii)跨膜域；和(iv)胞内T细胞信号转导域。本发明还提供表达此类CAR的此类T细胞在浆细胞介导的疾病(如多发性骨髓瘤)的治疗中的用途。

Description

嵌合抗原受体
技术领域
本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其结合B细胞成熟抗原(BCMA)。表达 此类CAR的T细胞在治疗浆细胞疾病(如多发性骨髓瘤)中有用。
发明背景
多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤(骨髓瘤)是一种浆细胞的骨髓恶性肿瘤。异常浆细胞的集 合在骨髓中积累，在那里它们干扰正常血细胞的产生。在美国，骨髓瘤是第 二常见的血液恶性肿瘤(排在非何杰金淋巴瘤后)，并构成血液恶性肿瘤的 13％和所有癌症的1％。该疾病在痛苦和医疗开支方面是难以负担的，因为死 亡之前，其引起病理性骨折，对感染的易感性，肾衰竭然后骨髓衰竭。
不像许多淋巴瘤，骨髓瘤目前是无法治愈的。用于淋巴瘤的标准化疗药 剂对于骨髓瘤基本上无效。另外，由于在浆细胞中CD20表达的丧失，利妥 昔单抗(Rituximab)不能用于针对该疾病。新的药剂，如硼替佐米(Bortezamib) 和来那度胺(Lenolidomide)部分地有效，但是不能导致持久缓解。
因此，需要用于骨髓瘤治疗的可替换药剂，其具有增加的效率和改进的 长期效果。
嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体是一种在它们通常的形式下将单克隆抗体(mAb)的特异性 植入到T细胞的效应功能的蛋白质。它们的通常形式是I型跨膜域蛋白质的形 式，其具有均与传输T细胞存活和活化信号的复合胞内域(compound endodomain)连接的抗原识别氨基端，间隔物，跨膜域(见图3)。
这些分子的最常见的形式使用源自单克隆抗体的单链可变片段(scFv)来 识别靶抗原。scFv通过间隔物和跨膜域融合到信号转导胞内域。响应scFv对 其靶标的识别，此类分子导致T细胞的活化。当T细胞表达此类CAR时，它们 识别并杀死表达靶抗原的细胞。已经开发了几种针对肿瘤相关抗原的CAR， 并且使用此类表达CAR的T细胞的过继性转移方法目前在临床试验中用于多 种癌症的治疗。Carpenter等人(2013,Clin Cancer Res 19(8)2048-60)描述了一 种掺入针对B细胞成熟抗原(BCMA)的scFv的CAR。
BCMA是一种跨膜蛋白，其在成熟的淋巴细胞，即记忆B细胞，浆母细 胞(plasmablast)以及骨髓浆细胞中优先表达。BCMA也表达于多发性骨髓瘤 细胞上。
Carpenter等人证明了经转导以表达抗BCMACAR的T细胞能够特异性杀 死来自骨髓瘤患者的浆细胞瘤的骨髓瘤细胞。
虽然使用抗BCMA抗体的CAR方法显示希望，但是当靶向此抗原时的一 个特别的考虑是骨髓瘤细胞上特别低的BCMA密度，例如与淋巴瘤细胞上的 CD19相比。因此，需要增加抗BCMACAR T细胞的靶细胞识别的敏感性。
附图简述
图1-APRIL和BAFF的配体特异性和功能分配
B细胞活化因子(BAFF，TNFSF13B)与BAFF受体(BAFF-R， TNFRSF13C)，B细胞膜抗原(BCMA，TNFRSF17)和跨膜活化物和钙调节物 和亲环蛋白配体相互作用物(TACI，TNFRSF13B)相互作用，而A增殖诱导配 体(APRIL，TNSF13)与BCMA，TACI和蛋白聚糖相互作用。BAFF-R活化影 响外周B细胞存活，而BCMA可能影响浆细胞存活。APRIL与蛋白聚糖的相互作用涉及含酸性硫酸化糖胺聚糖(acidic sulphated glycol-saminoglycan)侧链 的APRIL氨基端。
图2-骨髓瘤上BCMA的表达数据
通过CD138+磁珠选择从来自39个多发性骨髓瘤患者的骨髓样品分离骨 髓瘤细胞。这些细胞使用缀合有PE的抗BCMA单克隆抗体J6MO(GSK)染色。 使用PE Quantibrite珠(Becton Dickenson)按照制造商的说明定量抗原拷贝数 量。呈现了抗原拷贝数量的盒须图(box and whiskers plot)，以及绘制的范围， 四分位数(interquartile)和中值数值。我们发现范围为348.7-4268.4个BCMA拷 贝每细胞，其中平均值为1181而中值为1084.9。
图3-嵌合抗原受体的标准设计
示出了嵌合抗原受体的典型形式。这些是I型跨膜蛋白。胞外域识别抗 原。这是由附着于间隔物域的抗体衍生单链可变片段(scFv)组成。这接着连 接到跨膜域，其作用为锚定到膜中的分子。最后，这与胞内域连接，所述胞 内域作用为将细胞内信号传输到细胞。这由一个或多个信号转导域组成。
图4-设计生成的不同的基于APRIL的CAR
修改了如图3中所示出的CAR设计，使得scFc被修饰形式的APRIL取代以 作为抗原结合域起作用。截短APRIL使得蛋白聚糖结合性氨基端域缺乏。接 着，将信号肽附接到截短的APRIL氨基端以将该蛋白引导到细胞表面。使用 这种基于APRIL的结合域生成了三种CAR。A.在第一个CAR中，人CD8茎 域(stalk domain)用作间隔物域。B.在第二个CAR中，来自IgG1的铰链用作 间隔物域。C.在第三种CAR中，使用修饰为具有Hombach等人(2010GeneTher.17:1206-1213)描述的pva/a突变以降低Fc受体结合的人IgG的铰链，CH2 和CH3域作为间隔物(此后称为Fc-pvaa)。在所有的CAR中，这些间隔物连接 到CD28跨膜域，接着连接到含有CD28，OX40和CD3-Zeta胞内域融合的三重 胞内域(Pule et al,Moleculartherapy,2005:Volume 12；Issue 5；Pages 933-41)。
图5-以上三种APRIL-CARS的注释的氨基酸序列
A：示出了CD8茎APRIL CAR的注释的氨基酸序列；B：示出了基于APRIL IgG1铰链的CAR的注释的氨基酸序列；C：示出了基于APRIL Fc-pvaa的CAR 的注释的氨基酸序列。
图6-基于不同APRIL的CAR的表达和配体结合
A.在逆转录病毒基因载体中，将受体与标志物基因截短的CD34共表达。 经转导的细胞上标志物基因的表达允许转导的确定。B.使用具有CD8茎间 隔物，IgG1铰链区或Fc间隔物的基于APRIL的CAR转导T细胞。为了检测这 些受体是否能够稳定地在细胞表面上表达，接着使用抗APRIL-生物素/链霉 亲合素APC和抗CD34染色T细胞。进行流式细胞分析。在三种CAR中在细胞 表面上相等检测到APRIL，提示它们相等稳定表达。C.接着，测定了CAR识别TACI和BCMA的能力。使用与小鼠IgG2a Fc融合物融合的重组BCMA或 TACI以及抗小鼠二抗和抗CD34染色经转导的T细胞。所有三种受体形式显示 对BCMA和TACI两者的结合。一个令人惊讶的发现是结合BCMA似乎比结合 TACI更大。另一个令人惊讶的发现是，虽然所有三种CAR相等表达，CD8 茎和IgG1铰链CAR似乎比具有Fc间隔物的CAR在识别BCMA和TACI上更 好。
图7-不同CAR构建体的功能
对于三种不同基于APRIL的CAR进行了功能测定。非转导(NT)，或经转 导以表达不同CAR的正常供体外周血T细胞。使用相等滴度的上清进行转导。 接着，这些T细胞进行CD56消减以去除非特异性NK活性并用作效应物。非 转导(NT)，或经转导以表达BCMA或TACI的SupT1细胞用作靶标。示出的数 据是来自5次独立实验的平均值和标准差。A.使用铬释放测定了对表达 BCMA和TACI的T细胞的特异性杀伤。B.也测定了干扰素-γ释放。将靶标和 效应物以1:1的比率共培养。24小时后，通过ELISA测定上清中的干扰素-γ。 C.通过计数再孵育6天的相同共培养物中的CAR T细胞的数量，也测定了 CAR T细胞的增殖/存活。所有的3种CAR引导针对表达BCMA和TACI的靶标 的反应。对BCMA的反应比对TACI的反应大。
图8-APRIL CAR T细胞对原发性骨髓瘤细胞的杀伤
由于大部分的原发性骨髓瘤细胞在它们的表面上表达低数量的BCMA 分子，研究了是否发生原发性骨髓瘤细胞的杀伤(尽管低密度表达)。选择了 三个病例，其代表了图2中描述的BCMA表达范围：第一个具有暗淡的表达(低 于平均值)；第二个病例具有中间表达(约平均表达)和第三个具有明亮的表达 (高于平均表达)。左边示出了针对所有三个病例的同种型对照的BCMA染色 柱状图。在该测定中，仅测试了CD8茎和铰链APRIL CAR。在左边，示出了 在骨髓瘤细胞和CAR T细胞的1:1共培养后第3天和第6天时，与起始数量相比 骨髓瘤细胞的存活。到第6天，>95％的骨髓瘤细胞被消除，包括那些具有暗 淡BCMA表达的细胞。
图9-共表达基于APRIL的CAR与截短的CD34的载体
将表达用于筛选的载体的细胞系与BCMA-Fc或TACI-Fc孵育，并使用抗 CD34和抗人Fc PE和缀合有FITC的mAb两者染色。接着，通过流式细胞术研 究细胞。这示出了相对于标志物基因CD34，BCMA和TACI结合的典型模式。 图10A-显示经典CAR的示意图
B：设计生成的不同基于的APRIL的CAR
将信号肽附接到截短的APRIL的氨基端。这融合到不同的间隔物：修饰 为具有如Hombach等人所述(2010Gene Ther.17:1206-1213)的pvaa突变以降 低Fc受体结合的人IgG1铰链，CH2和CH3域；人CD8α的茎；以及IgG1的铰 链。这些间隔物连接到含有CD28跨膜域，OX40胞内域，和CD3-Zeta胞内域 的三重胞内域。
图11-不同CAR的表达
将受体与使用IRES序列的增强型蓝色荧光蛋白2(eBFP2)共表达。转导原 发性人T细胞并使用抗APRIL-生物素/链霉亲合素APC染色。进行了流式细胞 分析。针对APRIL检测，示出了eBFP2信号。所有三种CAR稳定表达(使用3 种不同的正常供体T细胞进行的3次独立实验的代表性实验)。
图12-铬释放测定
使用未转导(NT)，或经转导以表达不同间隔物CAR的正常供体外周血T 细胞作为效应物，以及未转导(NT)或经转导以表达BCMA或TACI的SupT1细 胞作为靶标。对T细胞进行CD56消减以降低NK活性。这是三次独立实验的 代表，并以一个例子显示。图7A中示出了累积杀伤数据。看到了对表达BCMA 和TACI的T细胞的特异性杀伤，针对阴性靶细胞没有活性。
图13-干扰素-gamma释放
通过ELISA测量了效应物和靶标的1:1共培养物。CD8茎构建体似乎具有 最好的特异性，而铰链构建体导致最多的干扰素释放，证明了一些非特异性 活性。这是三次独立实验的代表，并以一个例子显示。图7B中示出了累积的 干扰素-gamma释放数据。
图14-原发性骨髓瘤上BCMA表达的例子
示出了使用大鼠抗人BCMA mAb Vicly1染色的骨髓瘤样品的四个例子。 第一个小图示出了患有浆细胞白血病(一种异常，晚期和攻击性的骨髓瘤形 式)的患者中明亮的BCMA染色。其它三个病例是临床和形态学上的典型骨髓 瘤。它们示出了通常看到的中等或暗淡染色。叠加了使用同种型对照的染色 (灰色)。存在有图2中示出的累积BCMA表达数据的例子。
图15-具有V5表位标签的ARPIL-CAR的氨基酸序列
A:dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ
B:dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ
C:dAPRIL-HNG-CD28OXZ
本图中的序列与图5中那些具有不同信号肽而没有V5标签的序列不同。 图16-证明APRIL CAR T细胞的体内功能
6只3月龄的雌性NSG小鼠通过尾静脉注射接受1x107个MM1.s.FLuc细 胞。在第8天和第13天，小鼠使用生物发光成像。在第13天成像后，4只小鼠 通过尾静脉注射接受5x106个APRIL CAR T细胞。小鼠在第13天和第18天成 像。接受CAR T细胞的小鼠使用(*)指示。在所有处理的小鼠中到18天可以观 察到骨髓瘤的缓解，而在未处理的小鼠中的疾病进展。
发明简述
B-细胞膜抗原(BCMA)是表达在几乎所有多发性骨髓瘤(MM)上的表面 蛋白。除此之外BCMA仅表达在浆细胞上，因此靶向此抗原可以证明是对骨 髓瘤的有效治疗。然而，当靶向此抗原时，BCMA的低水平表达(见图2)是一 个考虑因素。
令人惊讶地，本发明人发现了，如果在CAR型分子中使用基于A增殖诱 导配体(APRIL)，而不是BCMA结合抗体的结合域，那么表达此类CAR的T 细胞引起表达BCMA的靶细胞的非常有效的杀伤，即使是那些具有低水平表 达的靶细胞。
不希望受理论束缚，本发明人预测这是因为BCMA与APRIL结合中固有 的三重对称性。这意味着CAR和BCMA之间的每次相互作用将涉及3个CAR， 近似T细胞表面上的3个胞内域。由于T细胞的活化由免疫突触中的信号转导 胞内域的紧密靠近触发，本发明的CAR设计是高度灵敏和特异性的。由于在 原发性骨髓瘤细胞上BCMA以非常低的密度表达(见图2和图7)，该受体设计 特别适合这一靶标。
因此，在第一个方面，本发明提供嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(i)B细胞成熟抗原(BCMA)结合域，其包含增殖诱导配体(APRIL)的至少 一部分；
(ii)间隔物域；
(iii)跨膜域；和
(iv)胞内T细胞信号转导域。
BCMA结合域可以包含截短的APRIL，其包含BCMA结合位点但缺少负 责蛋白聚糖结合的APRIL的氨基端部分。此类分子可以包含如SEQ IN No.4 所示的序列。或者，分子可以包含该序列的具有至少80％序列同一性且结合 BCMA的变体。
跨膜域和胞内T细胞信号转导域可以包含如SEQ ID No.7所示的序列或 其具有至少80％序列同一性的变体。
BCMA结合域和跨膜域可以通过间隔物连接。间隔物可以包含以下一 项：人IgG1间隔物，IgG1铰链，或CD8茎。
本发明第一方面的CAR可以包含如SEQ IN No.1，2，3，4，5或6所示的 序列，或其具有80％序列同一性但保留了i)结合BCMA和ii)诱导T细胞信号转 导的能力的变体。
本发明的第一方面的CAR可以作为三聚体结合BCMA。
在第二个方面，本发明提供核酸序列，其编码根据任意前述权利要求的 CAR。
核酸序列可以包含如SEQ IN No.15，16，17，18，19或20所示的序列， 或其具有80％序列同一性的变体。
在第三个方面，本发明提供载体，其包含根据本发明的第二个方面的核 酸序列。
在第四个方面，本发明提供T细胞或NK细胞，其表达根据本发明的第一 个方面的CAR。
在第五个方面，本发明提供用于制备根据本发明的第四个方面的T细胞 或NK细胞的方法，其包含向T细胞或NK细胞引入根据本发明的第二个方面 的核酸的步骤。
在第六个方面，本发明提供药物组合物，其包含根据本发明的第三个方 面的载体或根据本发明的第四个方面的T细胞/NK细胞，以及药学上可接受 载体，稀释剂或赋形剂。
在第七个方面，本发明提供用于治疗浆细胞病症的方法，其包含向受试 者施用根据本发明的第三个方面的载体或根据本发明的第四个方面的T细胞 /NK细胞的步骤。
浆细胞病症可以选自：浆细胞瘤(plasmacytoma)、浆细胞白血病、多发 性骨髓瘤、巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、淀粉样变(amyloidosis)、沃尔 登斯特伦(Waldenstrom)氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、 骨硬化性骨髓瘤(osteosclerotic myeloma)、重链疾病、意义未定的单克隆γ球 蛋白血症(monoclonalgammopathy of undetermined significance)和郁积型多发 性骨髓瘤(smolderingmultiple myeloma)。
浆细胞病症可以是多发性骨髓瘤。
在第八个方面，本发明提供根据本发明的第三个方面的载体或根据本发 明的第四个方面的T细胞/NK细胞，用于治疗浆细胞病症。
在第九个方面，本发明提供根据本发明的第三个方面的载体或根据本发 明的第四个方面的T细胞/NK细胞在制造用于治疗浆细胞病症的药物中的用 途。
发明详述
嵌合抗原受体(CAR)
嵌合抗原受体(也称为嵌合T细胞受体，人工T细胞受体以及嵌合免疫受 体)是工程化的受体，其将任意特异性植入到免疫效应细胞上。在经典的CAR (图3)中，将单克隆抗体的特异性植入T细胞或NK细胞上。可以使用例如逆转 录病毒载体将编码CAR的核酸导入T细胞或NK细胞中。以这种方式，可以生 成大量的癌症特异性T细胞或NK细胞用于过继性细胞转移。这一方法的早期 临床研究已经在一些癌症中显示了效力，主要是当靶向泛B细胞抗原CD19 以治疗B细胞恶性肿瘤时。
CAR的靶抗原结合域通常通过间隔物和跨膜域融合到信号转导胞内域。 当CAR结合靶抗原时，这导致活化信号传输到之上表达它的T细胞。
本发明的CAR包含：
(i)B细胞成熟抗原(BCMA)结合域，其包含增殖诱导配体(APRIL)的至少 一部分，其在下文更为详细讨论；
(ii)间隔物；
(iii)跨膜域；和
(iv)胞内T细胞信号转导域。
本发明的CAR可以包含以下氨基酸序列的一项：
SEQ ID No.1(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRR GRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQET LFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGT FLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMI ARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYT LPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKDP KFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPG PTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAH STLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDP EMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQ GLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.2(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRR GRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQET LFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGT FLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTR GLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMN MTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQE EQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKG HDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.3(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
METDTLLLWVLLLWVPGSTGSVLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRR GRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQET LFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGT FLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKDPKFWVLVVVGGVLACYSL LVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAY RSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAY QQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNE LQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQAL PPR
SEQ ID No.4(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINAT SKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDV TFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDI LSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPAPP VAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEAL HNHYTQKSLSLSPGKKDPKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKR SRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKP PGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNL GRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.5(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINAT SKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDV TFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDI LSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPTTTPAPRPPTPAPTIASQPL SLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIF WVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLP PDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQL YNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMA EAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID No.6(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
MGTSLLCWMALCLLGADHADGKPIPNPLLGLDSTSGGGGSVLHLVPINAT SKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLLYSQVLFQDV TFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSAGVFHLHQGDI LSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKLSGGGSDPAEPKSPDKTHTCPPCPKD PKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRP GPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADA HSTLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRD PEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLY QGLSTATKDTYDALHMQALPPR
本发明的分子可以包含如SEQ IN No.1，2，3，4，5或6示出的序列的变 体，其具有至少80，85，90，95，98或99％的序列同一性，只要所述变体序 列是如本发明的第一方面中定义的分子，即CAR，其包含：
(i)BCMA结合域；
(ii)间隔物域；
(iii)跨膜域；和
(iv)胞内T细胞信号转导域。
两个多肽序列之间的百分比同一性可以通过程序，如BLAST(其在 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov免费可得到)容易地确定。
跨膜域
跨膜域是一种跨越膜的CAR序列。其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜域 可以源自CD28，其给出良好的受体稳定性。跨膜域可以源自任意的I型跨膜 蛋白。跨膜域可以是预测为形成疏水螺旋的合成序列。
胞内T细胞信号转导域(胞内域)
胞内域是CAR的信号传输部分。在抗原识别后，受体聚簇，并且信号传 输到细胞。最普遍使用的胞内域组分是含有3个ITAM的CD3-zeta的胞内域。 这在抗原结合后传输活化信号到T细胞。CD3-zeta可以不提供完全足够的活 化信号，并且可能需要另外的共刺激信号。例如，嵌合CD28和OX40可以与 CD3-Zeta一起使用来传输增殖/存活信号，或全部三种可以一起使用(Pule et al,Molecular therapy,2005:Volume 12；Issue 5；Pages 933-41)。CAR胞内域也 可以个别或组合源自其它信号转导域，源自自然界中找到的信号转导蛋白或由本领域技术人员构建以使得CAR传输合适的信号以用于有效的CAR疗法 的人工信号转导蛋白。
本发明的CAR的胞内域可以包含CD28胞内域和OX40和CD3-Zeta胞内 域。
本发明的CAR的跨膜和胞内T细胞信号转导域(胞内域)可以包含如SEQ ID No.7所示的序列或其具有至少80％序列同一性的变体。
SEQ ID No.7
FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGP TRKHYQPYAPPRDFAAYRSRDQRLPPDAHKPPGGGSFRTPIQEEQADAHS TLAKIRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPE MGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQ GLSTATKDTYDALHMQALPPR
变体序列可以与SEQ ID No.7具有至少80％，85％，90％，95％，98％或 99％的序列同一性，只要所述序列提供有效的跨膜域和有效的胞内T细胞信 号转导域。
信号肽
本发明的CAR可以包含信号肽，使得当CAR在细胞(如T细胞)内部表达 时，将新生的蛋白引导到内质网，随后到细胞表面，在那里它得到表达。
信号肽的核心可以含有长的疏水氨基酸区段，其具有形成单个alpha螺旋 的趋势。信号肽可以以短的带正电的氨基酸区段开始，这有助于移位期间执 行多肽的合适拓扑学。在信号肽的末端，通常存在由信号肽酶识别并剪切的 氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或移位完成后剪切，以生成游离的信 号肽和成熟蛋白。然后，游离的信号肽由特定的蛋白酶消化。
信号肽可以在分子的氨基端。
本发明的CAR可以具有以下通式：
信号肽-BCMA结合域-间隔物域-跨膜域-胞内T细胞信号转导域。
信号肽可以包含SEQ ID No 8或9或其变体，所述变体具有5，4，3，2或 1个氨基酸突变(插入，取代，或添加)，只要该信号肽仍然能够发挥功能以引 起CAR的细胞表面表达。
SEQ ID No.8:MGTSLLCWMALCLLGADHADG
SEQ ID No.9:METDTLLLWVLLLWVPGSTG
SEQ ID NO.8和SEQ ID No.9的信号肽是紧凑并高度有效的。预测其在 末端甘氨酸之后给出约95％的剪切，给出由信号肽酶的有效移除。
间隔物
本发明的CAR可以包含间隔物序列以连接BCMA结合域与跨膜域，并将 BCMA结合域与胞内域在空间上分开。柔性间隔物允许BCMA结合域以实现 BCMA结合的不同方向取向。
间隔物序列可以例如包含IgG1Fc区，IgG1铰链或CD8茎。或者，接头可 以包含备选接头序列，其与IgG1Fc区，IgG1铰链或CD8茎具有相似的长度和 /或域间隔特性。
间隔物可以是短间隔物，例如包含少于100个，少于80个，少于60个， 或少于45个氨基酸的间隔物。间隔期可以是或者包含IgG1铰链或CD8茎或其 修饰的形式。
可以改变人IgG1间隔物以除去Fc结合基序。
这些间隔物的氨基酸序列的例子如下给出：
SEQ ID No.10(人IgG1的铰链-CH2CH3)
AEPKSPDKTHTCPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMIARTPEVTCVVVDV SHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL NGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKKD
SEQ ID No.11(人CD8茎):
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDI
SEQ ID No.12(人IgG1铰链区):
AEPKSPDKTHTCPPCPKDPK
B细胞膜抗原(BCMA)
本发明的第一个方面的CAR包含结合BCMA的域。
BCMA(也称为TNFRSF17)是一种浆细胞特异性表面抗原，其仅表达于B 谱系造血细胞或树突细胞上。它是TNF受体家族的成员。BCMA不表达于幼 稚B细胞(
Figure BDA0000960729110000131
B cell)上，但在B细胞分化为浆母细胞期间上调，并在记忆B 细胞，浆母细胞和骨髓浆细胞上明亮表达。BCMA也表达于大多数原发性骨 髓瘤细胞上。不像其它CAR靶标，如CD19，BCMA以低密度表达(图2)。
BCMA在互相连接的配体和受体的网络内发挥功能，该网络示意性示于 图1中。两种其它的TNF受体与BCMA共享配体APRIL和BAFF： TACI(TNFRSF13B)，其发现于活化的T细胞和所有的B细胞上，以及 BAFF-R(TNFRSF13C)，其主要表达于B淋巴细胞上。在一些病例中多发性骨 髓瘤细胞表达TACI，在大多数病例中表达BCMA，但从不表达BAFF-R。
APRIL
本发明CAR的BCMA-结合域包含增殖诱导配体(APRIL)的至少一部分。 APRIL也称为TNFSF13。
ARPIL的野生型序列可以在UNIPROT/O75888获得，并示于下文(SEQ ID No.13)。它不是经典的分泌蛋白，因为其不具有信号肽。它具有弗林蛋白酶 (furin)剪切位点“KQKKQK”(在SEQ ID NO.13中下划线标注)。氨基端参与 蛋白聚糖结合。
BCMA结合域可以包含APRIL的BCMA结合位点。BCMA结合域可以包 含APRIL的片段，其包含BCMA结合位点。
BCMA结合域可以包含截短的APRIL，其缺少该分子的氨基端末端。截 短的APRIL可以保留BCMA和TACI结合但是失去蛋白聚糖结合。截短的 APRIL可以在弗林蛋白酶剪切位点处或紧接弗林蛋白酶剪切位点后剪切。截 短的APRIL可以缺少如SEQ ID No.13所示的野生型APRIL分子的氨基端的 116个氨基酸。截短的APRIL可以包含如SEQ ID No.14所示的序列(其对应 SEQ ID No.13中加粗示出的部分)或其变体。这对应于分子中对于BCMA和 TACI结合需要的部分。
SEQ ID No.13
Figure BDA0000960729110000141
SEQ ID No.14
VLHLVPINATSKDDSDVTEVMWQPALRRGRGLQAQGYGVRIQDAGVYLL YSQVLFQDVTFTMGQVVSREGQGRQETLFRCIRSMPSHPDRAYNSCYSA GVFHLHQGDILSVIIPRARAKLNLSPHGTFLGFVKL
本发明的CAR可以包含如SEQ ID No.14所示的截短的ARPIL分子的变 体，其具有至少80％的氨基酸序列同一性并具有相同的或改进的BCMA结合 能力。变体序列可以与SEQID No.14具有至少80％，85％，90％，95％，98％ 或99％的序列同一性。
核酸序列
本发明的第二个方面涉及核酸分子，其编码本发明第一个方面的CAR。
核酸分子可以是或者包含以下序列的一项：
SEQ ID No.15(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCA GGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAG CAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAG GACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTG ACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACA GGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAG AGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGG CGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCT GTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGG CTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCC ACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCTTCCTCTTCCC CCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCCCTGAGGTCAC ATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCA ACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCG CGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCAC CGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAG CCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCC CGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAA AGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCA ACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACG GCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGC AGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACA ACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAAAAGATC CCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAG CTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGG AGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTC GCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAG CCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGC CGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGA GCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAAC GAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAG ACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAAC CCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGA GGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGG GGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCT ACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.16(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCA GGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAG CAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAG GACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTG ACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACA GGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAG AGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGG CGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCT GTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGG CTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGC CCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGC CAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGT GATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATA GCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAG GAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCC CGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAA GCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGG CCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGG AGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAA CGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGA GACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAA CCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGG AGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAG GGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACC TACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.17(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGAGACCGACACCCTGCTGCTGTGGGTGCTGCTGCTGTGGGTGCCA GGCAGCACCGGCAGCGTGCTCCACCTGGTGCCCATCAACGCCACCAG CAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCCAGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGAGAATCCAG GACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCCAGGACGTG ACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAGGGCAGACA GGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCACCCCGACAG AGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCTGCACCAGGG CGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCAAGCTGAACCT GTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGTCTGGAGGCGG CTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTCACACATGCCC ACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGG AGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCT GGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAAC ATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTAT GCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTG CCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAG AGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCC AGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACG ATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAG CCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAA AGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGC GCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACA GCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCT CGCTAA
SEQ ID No.18(dAPRIL-HCH2CH3pvaa-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCC GACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGAC TCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAAC GCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCC AGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGA GAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCC AGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAG GGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCA CCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCT GCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCA AGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGT CTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTC ACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTCCCGTGGCCGGCCCGTCAGTCT TCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCGCCCGGACCC CTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAG GTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAG ACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAG CGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAA GTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGC CCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCC TGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAACCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGAC TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGC AGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCT CTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA AAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCT TGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAG TAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCG CCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACG CGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGG AGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAGTTC AGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCT CTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGA CAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGG AAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGAT GGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGG GCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAG GACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.19(dAPRIL-CD8STK-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCC GACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGAC TCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAAC GCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCC AGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGA GAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCC AGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAG GGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCA CCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCT GCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCA AGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGT CTGGAGGCGGCTCGGATCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCA ACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAG GCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCT GGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGA GGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTC CCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCAC CACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCG ATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAG AGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCAGAGTGAAG TTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCA GCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTT GGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGA AGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAA GATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGA GGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACC AAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCTCCTCGCTAA
SEQ ID No.20(dAPRIL-HNG-CD28OXZ)
ATGGGCACCTCCCTGCTGTGCTGGATGGCCCTGTGCCTGCTGGGAGCC GACCACGCCGACGGCAAGCCCATTCCCAACCCCCTGCTGGGCCTGGAC TCCACCTCTGGCGGAGGCGGCAGCGTGCTGCACCTGGTGCCCATCAAC GCCACCAGCAAGGACGACTCTGATGTGACCGAGGTGATGTGGCAGCC AGCCCTGAGACGGGGCAGAGGCCTGCAGGCCCAGGGCTACGGCGTGA GAATCCAGGACGCTGGCGTGTACCTGCTGTACTCCCAGGTGCTGTTCC AGGACGTGACCTTCACAATGGGCCAGGTGGTGAGCCGGGAGGGCCAG GGCAGACAGGAGACCCTGTTCCGGTGCATCCGGAGCATGCCCAGCCA CCCCGACAGAGCCTACAACAGCTGCTACAGCGCTGGCGTGTTTCACCT GCACCAGGGCGACATCCTGAGCGTGATCATCCCCAGAGCCAGAGCCA AGCTGAACCTGTCCCCCCACGGCACCTTTCTGGGCTTCGTGAAGCTGT CTGGAGGCGGCTCGGATCCCGCCGAGCCCAAATCTCCTGACAAAACTC ACACATGCCCACCGTGCCCAAAAGATCCCAAATTTTGGGTGCTGGTGG TGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTT TATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGA CTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTA CCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTT TCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTG GCCAAGATCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTA CCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAG AGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGA TGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAAT GAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGAT GAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGG GTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGG CCCTGCCTCCTCGCTAA
由于遗传密码的简并性，核酸序列可以编码与SEQ ID No.15，16，17， 18，19或20编码的氨基酸序列相同的氨基酸序列，但是具有不同的核酸序列。 核酸序列可以与以SEQID No.15，16，17，18，19或20所示的序列具有至少 80，85，90，95，98或99％同一性，只要其编码如本发明的第一个方面中定 义的CAR。
载体
本发明还提供载体，其包含根据本发明的核酸序列。此类载体可以用于 将核酸序列引入宿主细胞中，使得其表达并产生根据本发明的第一个方面的 分子。
载体可以是例如质粒或合成的mRNA或病毒载体，如逆转录病毒载体或 慢病毒载体。
载体可以能够转染或转导效应细胞。
宿主细胞
本发明还提供宿主细胞，其包含根据本发明的核酸。宿主细胞可以能够 表达根据本发明的第一个方面的CAR。
宿主细胞可以是人T细胞或人NK细胞。
可以通过使用编码CAR的核酸转导或转染T细胞制得能够表达根据本发 明的CAR的T细胞。
T细胞可以是离体T细胞。T细胞可以来自外周血单核细胞(PBMC)样品。 在使用编码CAR的核酸转导之前，可以活化和/或扩增T细胞，例如通过使用 抗CD3单克隆抗体处理。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物，其含有本发明的载体或表达CAR的T细胞以 及药物学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂，以及可选地一种或多种另外的 药学上的活性多肽和/或化合物。此类制剂可以是例如以适合用于静脉内输注 的形式。
治疗方法
表达本发明的CAR分子的T细胞能够杀伤癌细胞，如多发性骨髓瘤细胞。 可以从患者自己的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植 物(第二方)的背景中，或来自无关联的供体的外周血(第三方)离体创建表达 CAR的T细胞。或者，CAR T细胞可以源自可诱导祖细胞或胚胎祖细胞向T 细胞的离体分化。在这些情况下，通过许多手段之一引入编码CAR的DNA 或RNA生成CAR T细胞，所述手段包括用病毒载体的转导，使用DNA或RNA转染。
表达本发明的CAR分子的T细胞可以用于癌性疾病，特别是与升高的 BCMA表达相关的浆细胞病症或B细胞病症的治疗。
浆细胞病症包括浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血 症、淀粉样变、沃尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆 细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤(POEMS综合征)和重链疾病及意义未定的单克隆γ 球蛋白血症/郁积型多发性骨髓瘤。
疾病可以是多发性骨髓瘤。
与升高的BCMA表达水平相关的B细胞病症的例子是CLL(慢性淋巴细 胞性白血病)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。本发明的双特异性结合剂也可以用于 自身免疫性疾病，如系统性红斑狼疮(SLE)，多发性硬化症(MS)和类风湿性 关节炎(RA)的治疗。
本发明的方法可以用于治疗癌性疾病，特别是与升高的BCMA表达相关 的浆细胞病症或B细胞病症。
用于疾病治疗的方法涉及本发明的载体或T细胞的治疗用途。在这一方 面，可以将载体或T细胞施用到具有现有的疾病或状况的受试者，以减轻， 降低或改善至少与疾病相关的至少一种症状和/或减缓、降低或阻断疾病的进 展。本发明的方法可以引起或促进T细胞介导的对表达BCMA的细胞(如浆细 胞)的杀伤。
本发明现在将通过实施例进一步描述，所述实施例意图用来帮助本领域 的普通技术人员实施本发明，而不以任意方式意图限制本发明的范围。
实施例
实施例1-BCMA作为骨髓瘤靶标的表征
通过在来自已知具有明显疾病的多发性骨髓瘤患者的新鲜骨髓样品上 进行CD138免疫磁性选择分离原发性骨髓瘤细胞。这些细胞使用缀合到PE的 BCMA特异性J6MOmAb(GSK)染色。同时，使用PE Quantibrite珠子试剂盒 (Becton Dickenson)按照制造商的说明生成了具有已知数量的结合位点的珠 标准品。可以通过将来自骨髓瘤细胞的平均荧光强度与自珠得到的标准曲线 相关得到骨髓瘤细胞的BCMA拷贝数。发现了骨髓瘤细胞表面上的BCMA拷 贝数的范围较低：在348.7-4268.4个BCMA拷贝每个细胞，其中平均值为1181而中值为1084.9(图2)。这比经典的CAR靶标例如CD18和GD2低得相当多。 也使用Vicky-1抗体(Abcam Ab17323)确认了原发性骨髓瘤细胞上BCMA表达 的存在，其例子示于图14中。
实施例2-基于APRIL的CAR的设计和构建
APRIL在其天然形式中是一种分泌的II型蛋白。使用APRIL作为用于CAR的BCMA结合域要求此II型分泌蛋白转变为I型膜结合蛋白，并且对于该蛋白以此形式中是稳定的并保留与BCMA的结合。为了生成候选分子，APRIL的极端氨基端被删除以除去与蛋白聚糖的结合。接着，添加信号肽以将初生蛋白引导到内质网及因此到细胞表面。还有，由于使用的间隔物的性质可以改变CAR的功能，测试了三种不同的间隔物域：生成了包含以下项的基于APRIL的CAR：(i)人IgG1间隔物，经改变以除去Fc结合基序；(ii)CD8茎；和(iii)单独的IgG1铰链(图4中的图画和图5中的氨基酸序列，和还有图15中的氨基酸序列，其与图5中的序列区别在于具有不同的信号肽和V5表位标签)。这些CAR在双顺反子逆转录病毒载体中表达(图6A)，使得标志物蛋白-截短的CD34可以共表达为方便的标志物基因。
实施例3-基于APRIL的CAR的表达和功能
本研究的目的是测试已经构建的基于APRIL的CAR是否在细胞表面上 表达以及APRIL是否已经折叠以形成天然蛋白。使用这些不同的CAR构建体 转导T细胞，并使用商品化的抗APRIL mAb染色以及标志物基因的染色并通 过流式细胞术分析。本实验的结果示于图6B中，其中APRIL结合相对于标志 物基因荧光绘图。这些数据示出了以这种形式，基于APRIL的CAR表达于细 胞表面上且APRIL充分折叠以被抗APRIL mAb识别。
接着，确定了APRIL以这种形式是否能够识别BCMA和TACI。作为与小 鼠IgG2a-Fc的融合物生成了重组BCMA和TACI。将这些重组蛋白与转导的T 细胞孵育。此后，洗涤细胞并使用抗小鼠荧光素缀合的抗体以及与不同荧光 团缀合的检测标志物基因的抗体染色。通过流式细胞术分析细胞，结果示于 图6C中。不同的CAR能够结合BCMA和TACI两者。出乎意料的是，相比TACI， 不同CAR能够更好结合BCMA。还有，出乎意料的是，具有CD8茎或IgG1铰 链间隔物的CAR比具有Fc间隔物的CAR能够更好结合BCMA和TACI。
实施例4-基于APRIL的嵌合抗原受体针对表达BCMA的细胞有活性
使用不同的APRIL CAR转导来自正常供体的T细胞，并针对野生型，或 经工程化以表达BCMA和TACI的SupT1细胞测试。使用了几种不同的测定以 确定功能。进行了经典的铬释放测定。这里，使用51Cr标记靶细胞(SupT1细 胞)并以不同比率与效应物(经转导的T细胞)混合。通过计算共培养上清中的 51Cr确定靶细胞的裂解(图6A示出了累积数据，来自具有不同效应物：靶标比 率的单个测定的示例数据示于图12中)。
另外，通过ELISA测定了来自T细胞与SupT1细胞1:1培养的上清的干扰 素-gamma(图6B示出了累积数据，来自单个测定的示例数据示于图13中)。与 SupT1细胞共培养一周后也进行了T细胞扩增的测量(图6C)。通过使用计数珠 校准的流式细胞术计数T细胞。这些实验数据显示了基于APRIL的CAR可以 杀伤表达BCMA的靶标。此外，这些数据显示基于CD8茎或IgG1铰链的CAR 表现得比基于Fc-pvaa的CAR更好。
实施例5-基于APRIL的CAR能够杀伤原发性骨髓瘤细胞
以上数据使令人鼓舞的，因为它们证明了原则上，可以制备基于APRIL 的CAR。然而，由于大多数原发性骨髓瘤细胞在它们的表面上表达少量的 BCMA分子，研究了此类基于APRIL的CAR是否能引起原发性骨髓瘤细胞的 杀伤，特别是在具有低密度表达的病例中。选择了三个病例，其代表了图2 中所述的BCNA表达范围：第一个具有暗淡的表达(低于平均值)；第二个病 例具有中间表达(约平均表达)，并且第三个具有明亮的表达(高于平均表达)。 图8在左边示出了针对所有三个病例的同种型对照的BCMA染色柱状图以显 示BCMA表达。由于当比较具有不同间隔物的基于APRIL的CAR时，确定了 具有CD8茎间隔物和IgG1铰链间隔物的CAR比Fc-pvaa间隔的CAR表现得更 好，在本测定中，仅测试了CD8茎和铰链APRIL CAR。在左边，示出了骨髓 瘤细胞和CAR T细胞1:1共培养后第3天和第6天，与起始数量相比骨髓瘤细胞 的存活。到第6天，消除>95％的骨髓瘤细胞，包括那些具有暗淡BCMA表达 的。暗淡BCMA表达的骨髓瘤细胞可以由APRIL CAR靶向，尽管比较高表达 者具有较低的杀伤节奏(tempo)。
实施例6-与Fc间隔物融合的分泌的且截短的APRIL识别BCMA和TACI
为了研究CAR形式中的截短的APRIL(即融合到跨膜域并锚定到细胞膜) 是否能够结合BCMA和TACI，用截短的CD34作为方便的标志物基因与自剪 切性手足口病2A肽以符合读码框方式工程化改造基本的CAR。建立了稳定的 SUPT1细胞系，其表达该构建体。也生成了与人(以及其它物种，未示出)的 Ig Fc域融合的分泌性截短BCMA和TACI融合并产生重组蛋白。显示了 BCMA-Fc和TACI-Fc结合工程化的SUPT1细胞系。发现只有表达CD34标志物 基因的细胞结合BCMA-Fc和TACI-Fc(图9)。
实施例7-基于APRIL的嵌合抗原受体稳定表达在T细胞表面上
CAR间隔物域可以改变灵敏度和特异性。生成了具有下述三种间隔物域 的基于APRIL的CAR的三种形式：(i)人IgG1间隔物，其经改变以除去Fc结合 基序；(ii)CD8茎；和(iii)单独IgG铰链区(图10B)。使用这些不同的CAR转导 原代人T细胞并使用商品化的抗APRIL mAb染色(图11)。
图8-基于APRIL的嵌合抗原受体针对关联(cognate)靶标表达细胞有活性
使用不同的APRIL CAR转导来自正常供体的T细胞并针对野生型，或经 工程化以表达BCMA和TACI的SupT1细胞测试。几种不同的测定用于确定功 能。进行了经典的铬释放测定。这里，使用51Cr标记靶细胞(SupT1细胞)并以 不同比率与效应物(经转导的T细胞)混合。通过计算共培养上清中的51Cr确定 靶细胞的裂解(图12)。
另外，通过ELISA测定了来自T细胞与SupT1细胞1:1培养的上清的干扰 素-gamma(图13)。
与SupT1细胞共培养一周后也进行了T细胞扩增的测量。通过使用计数珠 子校准的流式细胞术计数T细胞。初始数据(未示出)似乎指出基于CD8茎的构 建体比其它构建体导致更多的T细胞增殖。
实施例9-证明APRIL CAR T细胞的体内功能
为了证明APRIL CAR T细胞体内功能，在人/小鼠嵌合模型中测试了 APRIL CAR T细胞。MM1.s(ATCC CRL-2974)是一种人骨髓瘤细胞系，其表 达中等水平的BCMA。本发明人工程化改造该细胞系以表达萤火虫萤光素 酶，以得到细胞系MM1.s.Fluc。
NOD scid gamma(NGS：NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠是深度免疫 受损的小鼠，能够移植几种人细胞系和人外周血淋巴细胞。三月龄的雌性 NGS小鼠通过尾静脉注射接受1x107MM1.s.FLuc细胞，而没有预备疗法 (preparative therapy)。通过系列生物发光成像确定了植入(图16)。在所有小鼠 中观察到了强健的且增加的髓内植入。在第13天，通过尾静脉注射施用5x106个APRIL-HNG-CD28OXZ CAR T细胞。进行了系列生物发光，其显示在所 有治疗的小鼠中MM1.s负担的快速下降(图16)到完全缓解。通过流式细胞术 和免疫组织化学确认了对CAR疗法的此反应。
通过提及将上述说明书中提及的所有出版物收入本文。本发明的描述的 方法和系统的各种修改和变型在不偏离本发明的范围和精神的前提下对于 本领域技术人员会是明显的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案进行 了描述，但是应当理解，如要求保护的发明不应过度限于此类具体实施方案。 实际上，对于分子生物学、细胞免疫学或相关领域的技术人员明显的用于实 施发明的描述的模式的各种修改意图在所附权利要求书的范围内。
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Claims (19)

1.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
(i) 截短的增殖诱导配体(APRIL)，所述截短的APRIL：
(a)结合B细胞成熟抗原(BCMA)，并且
(b)结合跨膜活化物和钙调节物和亲环蛋白配体相互作用物(TACI)；
其中所述截短的APRIL缺少负责蛋白聚糖结合的APRIL的氨基端部分；
(ii) 间隔物域；
(iii) 跨膜域；和
(iv) 胞内T细胞信号转导域。
2.根据权利要求1的CAR，其包含如SEQ ID No. 14所示的序列。
3.根据权利要求1或2的CAR，其中所述跨膜域和所述胞内T细胞信号转导域包含如SEQID No. 7所示的序列。
4.根据权利要求1或2的CAR，其中所述间隔物包含以下一项：人IgG1间隔物；IgG1铰链区；或CD8茎。
5.根据权利要求3的CAR，其中所述间隔物包含以下一项：人IgG1间隔物；IgG1铰链区；或CD8茎。
6.根据权利要求4的CAR，其中所述间隔物包含CD8茎。
7.根据权利要求5的CAR，其中所述间隔物包含CD8茎。
8.根据权利要求1、2和5-7中任一项的CAR，其包含如SEQ IN No. 4，5或6所示的序列。
9.根据权利要求3的CAR，其包含如SEQ IN No. 4，5或6所示的序列。
10.根据权利要求4的CAR，其包含如SEQ IN No. 4，5或6所示的序列。
11.核酸序列，其编码根据前述权利要求中任一项的CAR。
12.根据权利要求11的核酸序列，其包含如SEQ IN No. 18，19或20所示的序列，或SEQIN No. 18，19或20的具有至少80%序列同一性的变体。
13.载体，其包含根据权利要求11或12的核酸序列。
14.T细胞，其表达根据权利要求1至10中任一项的CAR。
15.用于制备根据权利要求14的T细胞的方法，其包括将根据权利要求11或12的核酸导入T细胞的步骤。
16.药物组合物，其包含根据权利要求13的载体或根据权利要求14的T细胞，连同药学上可接受的载体或稀释剂。
17.药物组合物，其包含根据权利要求13的载体或根据权利要求14的T细胞，连同药学上可接受的赋形剂。
18.根据权利要求13的载体或根据权利要求14的T细胞在制造用于治疗浆细胞病症的药物中的用途，其中所述浆细胞病症选自：浆细胞瘤、浆细胞白血病、多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、淀粉样变性、沃尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、孤立性骨浆细胞瘤、髓外浆细胞瘤、骨硬化性骨髓瘤、重链疾病、意义未定的单克隆γ球蛋白血症和郁积型多发性骨髓瘤。
19.根据权利要求18的用途，其中所述浆细胞病症是多发性骨髓瘤。
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