CN111995688A - 靶向cd123和nkg2d配体的双特异嵌合抗原受体及应用 - Google Patents

靶向cd123和nkg2d配体的双特异嵌合抗原受体及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用，具体的公开1.一种同时表达抗CD123单链抗体和天然NKG2D胞外段，可靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体；所述双特异性嵌合抗原受体有并联和串联两种连接方式；一种CAR及其构建体结构、构建体的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组表达载体，并公开了相应表达载体的构建方式及其应用。本发明CAR结构赋予了T细胞更强和持久的增殖能力以及更强的抗肿瘤能力；本发明可以避免多次输注单靶点的CAR‑T细胞，不但减轻了对患者的伤害，也可以减轻其经济压力，具有较大的临床研究及应用价值。

Description

靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤生物免疫治疗领域，涉及一种双特异性嵌合抗原受体(CAR)。具体的，涉及一种同时靶向人CD123和人NKG2DL的、包含抗人CD123scFv和人NKG2D胞外段或其功能性变体的双特异性嵌合抗原受体(CAR)、重组表达载体、该CAR修饰的免疫应答细胞，及其制备方法和应用。
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)疗法是通过基因工程技术在T细胞表面人为表达能识别特定的肿瘤表面抗原的抗原结合域，使T细胞获得抗体的特异识别肿瘤的能力，并通过CAR的胞内段信号区激活T细胞，使CAR-T细胞释放细胞因子、增殖并发挥细胞毒作用，靶向清除恶性肿瘤细胞。临床研究证实这类工程化的T细胞能够在体内扩增，长期存活并形成免疫记忆，对难治性血液肿瘤显示出高效的抗肿瘤活性。
目前CAR-T在治疗急性淋巴细胞白血病和淋巴瘤中已经取得显著成绩，特别是以CD19作为靶抗原的CAR-T细胞免疫治疗。但在实体瘤以及髓系恶性肿瘤的治疗中仍然面临巨大挑战，至今在临床应用上进展缓慢。
近年来，嵌合抗原受体NK细胞即CAR-NK在恶性肿瘤治疗领域也获得较为瞩目的成绩。其作用机制与CAR-T细胞相类似。
CAR-T用于恶性肿瘤免疫治疗仍存在几大挑战：(1)实体瘤以及髓系恶性肿瘤内部为免疫抑制性微环境，可通过髓源性抑制性细胞(MDSC)和M2型巨噬细胞(M2)等免疫抑制细胞来抑制效应T细胞的增殖活性和抗肿瘤活性，从而导致CAR-T治疗效果不佳；因此作用于肿瘤微环境的免疫抑制细胞是提高CAR-T细胞治疗疗效的重要手段之一；(2)从目前的报道来看，多种单靶点CAR-T治疗实体瘤以及髓系恶性肿瘤效果较差，可能是由于肿瘤细胞靶抗原丢失从而逃脱了CAR-T的杀伤；克服这种肿瘤免疫逃逸的常规方法之一就是设计针对细胞膜上的2种或多种抗原的CAR-T细胞。(3)实体瘤以及髓系恶性肿瘤患者一般肿瘤负荷较重，需输入较多的CAR-T细胞才能发挥较明显的直接抗肿瘤作用。由此可知，将CAR-T细胞治疗等免疫疗法用于实体瘤以及髓系恶性肿瘤治疗仍需克服诸多困难。
我们认为，联合靶向人CD123和人NKG2DL双靶点免疫应答细胞(例如联合靶向CD123和NKG2DL的双靶点CAR-T细胞或者联合靶向CD123和NKG2DL双靶点CAR-NK细胞)可能会改善恶性肿瘤的治疗效果。
一方面，该免疫应答细胞可同时靶向肿瘤微环境和肿瘤细胞。肿瘤微环境中的免疫抑制细胞可抑制免疫应答细胞的功能。免疫抑制细胞主要包括MDSC、TAM和Treg等细胞。这些免疫抑制因素之间可以相互促进，例如，MDSC可以将TAM极化为具有免疫抑制功能的M2细胞，并能分泌IL-10和INF-γ招募Treg细胞。研究表明，肿瘤微环境中含量丰富的MDSC在肿瘤逃避免疫监视时起到关键作用。CD123和NKG2DL在MDSC、TAM上均有不同强度的表达，NKG2DL在Treg上也有表达。因此，靶向CD123和NKG2DL可抑制肿瘤微环境中免疫抑制细胞。同时含NKG2D片段的潜在地通过靶向肿瘤新脉管系统上表达的NKG2D配体的抗血管生成活性，通过直接靶向免疫抑制性髓样抑制细胞和调节性T细胞(Tregs)，以及募集髓样细胞和活化的巨噬细胞来调节免疫性肿瘤微环境，调动肿瘤-特异性适应性免疫应答等多重作用。
另一方面，NKG2DL和CD123在肿瘤细胞表面也有不同程度的表达。首先，NKG2DL在正常细胞中不表达或仅低表达，但在多数上皮源性恶性肿瘤细胞上都有着广泛的不同程度的表达，如三阴性乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、白血病、多发性骨髓瘤等，提示NKG2DL是一个有前景的抗肿瘤治疗靶点。许多临床前研究都证实了靶向NKG2DL的CART细胞可识别和杀伤表达NKG2DL的肿瘤细胞的能力。其次CD123也是白血病干细胞主要标记之一，在大多数髓系血液肿瘤干/祖细胞表面高表达，而在正常造血干/祖细胞表面低表达。因此，CD123也是髓系血液肿瘤免疫治疗的很好靶点。目前国际上为数不多的以CD123作为靶点的CART细胞相关研究，体内外试验均提示其具有一定的抗白血病效果。因此我们设计的免疫应答细胞除了可抑制肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，对多种肿瘤细胞本身也有明显的直接杀伤作用，并且对部分髓系血液肿瘤可以进行双靶点的杀伤以减少肿瘤抗原逃逸。
综上所述，我们基于上述机制(靶向肿瘤微环境中的免疫抑制细胞，活化自身免疫功能，同时靶向肿瘤细胞)构建了针对CD123和NKG2DL的双靶点免疫应答细胞，用于恶性肿瘤的治疗。
发明内容
本发明为了克服上述肿瘤生物免疫治疗中面临的问题(即肿瘤微环境中包括T细胞，NK细胞在内的免疫应答细胞识别并杀伤肿瘤的靶向特异性不强并且受到各种抑制，增殖及杀伤能力有限从而抗肿瘤效率低等问题)，提供了一种同时靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体氨基酸构建体或其功能性变体、其编码核苷酸序列、其表达载体、工程化的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞和其应用。
本发明的工程化免疫应答细胞在直接抗肿瘤的同时能够克服免疫抑制性的肿瘤微环境，对部分CD123阳性的髓系血液肿瘤还可以避免肿瘤抗原逃逸导致的肿瘤复发等问题，提高肿瘤的特异性杀伤作用，改善恶性肿瘤的预后。
本发明是基于靶向肿瘤微环境以及肿瘤细胞本身而设计的，用于治疗血液系统恶性肿瘤(包括但不限于急性髓细胞白血病，慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、淋巴瘤)和实体恶性肿瘤(包括但不限于脑胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤)。所述方案如下：
一方面，本发明提供了一种靶向人CD123和人NKG2DL的双靶点嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体。所述CAR构建体包括并联与串联两种结构。所述功能性变体的生产方式包括但不限于氨基酸的修饰、氨基酸的取代、缺失、添加，所述功能性变体为靶向人CD123的抗人CD123scFv氨基酸序列和靶向人NKG2DL的人NKG2D胞外段氨基酸序列的高度同源性的氨基酸序列。所述氨基酸修饰包括但不限于氨基酸侧链的化学修饰、天然或非天然氨基酸取代、突变、缺失、插入或翻译后修饰。
另外，在所述嵌合抗原受体CAR构建体上，可以包括一个用于标记、分选、消除宿主细胞的标签蛋白。标签蛋白可以通过可切割的结构域(可以为2A或弗林蛋白酶)或又一启动子与CAR连接存在于CAR构建体上。所述标签蛋白包括但不限于RQR8、EGFRt、CD20、c-MYC，6×His，GST，Fc，Flag，HA。
所述并联结构的CAR构建体结构依次为(从羧基端到氨基端)第一信号信号肽结构域、第一抗原结合结构域，第一跨膜结构域，第一共刺激信号结构域，第一胞内信号传导结构域，切割蛋白，第二信号肽结构域，第二抗原结合结构域，第二跨膜结构域，第二共刺激信号结构域，第二胞内信号传导结构域。
所述串联结构的CAR构建体结构依次为(从羧基端到氨基端)：信号肽结构域；第一抗原结合结构域；第二抗原结合结构域；跨膜结构域；共刺激信号结构域；胞内信号传导结构域。所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可通过接头(linker)连接而成。
其中串联结构和并联结构的CAR构建体均有两个抗原结合结构域，其中之一抗原结合结构域为抗CD123scFv，另一抗原结合结构域为人NKG2D胞外段。
抗CD123scFv来源于全人源抗体、鼠源抗体或人源化抗体之一。
在一些实施方案中，抗CD123scFv来源于全人源抗体。
所述抗CD123scFv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成。VH和VL间通过至少一个linker连接。其排列方式可为VH—linker—VL或VL—linker—VH。
所述并联或串联CAR构建体中均可包含多个linker。
在具体实施方案中，所述linker的长度可以为1～25个或更多个氨基酸。linker的示例性实例包括甘氨酸聚合物(G)n，甘氨酸-丝氨酸聚合物(G1-5S1-5)n(其中n为大于1的整数)，甘氨酸-丙氨酸聚合物，丙氨酸-丝氨酸聚合物，以及本领域已知的其它柔性linker或刚性linker。
所述柔性linker包括但不限于下述氨基酸序列：GGG；DGGGS(SEQ ID NO：13)；TGEKP(SEQ ID NO：14)；GGRR(SEQ ID NO：15)；(GGGGS)n，其中n＝1、2、3、4或5(SEQ ID NO：16)；EGKSSGSGSESKVD(SEQ ID NO：17)；KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQ ID NO：18)；GGRRGGGS(SEQ ID NO：19)；LRQRDGERP(SEQ ID NO：20)；LRQKDGGGSERP(SEQ ID NO：21)；LRQKD(GGGS)2ERP(SEQ ID NO：22)。
所述刚性linker包括但不限于(EAAAK)n(SEQ ID NO：23)和(XP)n，其中X可为指定任何氨基酸，1≤n≤10。
所述信号肽结构域可以为人CD8α信号肽、人GM-CSF信号肽、人胰岛素信号肽、人IL-2信号肽、人胰蛋白酶原信号肽等结构。
其中所述跨膜结构域与所述抗原结合结构域之间可直接连接或由铰链结构域连接。
所述跨膜结构域的功能是锚定结合细胞膜。在抗原识别之后，激活信号被跨膜结构域传递到细胞内部。跨膜结构域包括但不限于人CD8α跨膜区、人CD28跨膜区、人CD4跨膜区、人CD28跨膜区、人CD3ζ跨膜区、人CD137/4-1BB跨膜区、人CD134/OX40跨膜区、人ICOS跨膜区、人CD5跨膜区、人CD9跨膜区、人CD16跨膜区、人CD22跨膜区、人CD33跨膜区、人CD37跨膜区、人CD45跨膜区、人CD64跨膜区、人CD80跨膜区、人CD86跨膜区、人CD154跨膜区、人TCRα跨膜区、人TCRβ跨膜区。
所述铰链结构域是将抗原结合结构域连接至跨膜结构域的一段足够柔性的氨基酸结构，允许抗原结合结构域在不同的方向上定向，以利于抗原识别。铰链结构域可以为人CD8α铰链区、人CD28铰链区、人免疫球蛋白恒定区或其变体、人免疫球蛋白铰链区、人IgG4铰链区、人免疫球蛋白CH1/CL区、Fc区、人免疫球蛋白CH2结构域、人免疫球蛋白CH3结构域和/或它们的任何组合。
所述共刺激信号结构域可以为人CD28、人CD137/4-1BB、人CD134/OX40、人CD27、人ICOS、人B7-H3，人2B4、人DAP10，人DNAM1,人DAP12胞内结构域中的至少一种。
所述胞内信号传导结构域可以为人CD3ζ或人FcεRIγ。
所述切割蛋白可以为2A(包括T2A，P2A，E2A，F2A)或弗林蛋白酶。
在一些实施方式中，所述标签蛋白为RQR8。
在一些实施方式中，所述标签蛋白为不存在。
在一些实施方式中，所述铰链结构域为不存在。
在一些实施方式中，所述信号肽结构域包括人IL-2信号肽和人CD8α信号肽结构域。
在一些实施方式中，所述铰链结构域为人CD8α铰链区。
在一些实施方式中，所述跨膜结构域包括人CD28跨膜区和人CD8α跨膜区。
在一些实施方式中，所述共刺激信号结构域包括人CD28共刺激信号结构域和CD137/4-1BB共刺激信号结构域。
在一些实施方式中，所述切割蛋白为T2A。所述标签蛋白为RQR8。
在一些实施方式中，所述抗人CD123scFv氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在一些实施方式中，所述人NKG2D胞外段氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
在一些实施方式中，所述人CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
在一些实施方式中，所述人IL-2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
在一些实施方式中，所述人CD8α跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
在一些实施方式中，所述人CD28跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在一些实施方式中，所述人CD8α铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。
在一些实施方式中，所述人CD137/4-1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQID NO：8所示。
在一些实施方式中，所述人CD28共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
在一些实施方式中，所述T2A氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示。
在一些实施方式中，所述RQR8的氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示。
在一些实施方式中，所述CAR的胞内结构域的共刺激信号结构域包含两种共刺激分子：人CD28和人CD137/4-1BB或人CD28和人OX40或人CD137//4-1BB和人ICOS。
在一些实施方式中，所述胞内信号传导结构域可包含可激活免疫应答细胞(如淋巴谱系的细胞，例如T细胞)的人CD3ζ胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，所述人CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
第二方面，本发明提供了所述靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体的编码核苷酸序列。
具体地，所述编码靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性CAR氨基酸构建体的核苷酸序列选自并联或串联结构：即(从5’端到3’端依次为)SP—CA-1—H—TM—CS—CC—NP—SP—CA-2—H—TM—CS—CC或SP—CA-1—Linker—CA-2—H—TM—CS—CC。
另外，在所述编码靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性CAR氨基酸构建体的核苷酸序列上，可以包括一个编码标签蛋白的核苷酸序列。所述标签蛋白可以通过可切割的结构域(可以为2A或弗林蛋白酶)或又一启动子与CAR连接存在于CAR构建体上。
其中：
所述SP为编码所述信号肽结构域的核苷酸序列。
所述CA-1为编码所述第一抗原结合结构域的核苷酸序列，所述CA-2为编码所述第二抗原结合结构域的核苷酸序列。
所述H为编码所述铰链结构域的核苷酸序列。
所述TM为编码所述跨膜结构域的核苷酸序列。
所述CS为编码所述共刺激信号结构域的核苷酸序列。
所述CC为编码所述胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
所述NP为编码所述切割蛋白的核苷酸序列。
所述Linker为编码所述连接氨基酸的核苷酸序列。
其中所述编码所述第一抗原结合结构域的核苷酸序列CA1和所述编码所述第二抗原结合结构域CA2，其中之一为编码抗人CD123scFv的核苷酸序列，另一为编码人NKG2D胞外段的核苷酸序列。
其中所述Linker为编码式为(GGGGS)n或(EAAAK)n氨基酸序列的核苷酸序列。其中1≤n≤10，优选的3≤n＜8。
在一些实施方式中，所述编码标签蛋白的核苷酸序列不存在。
在一些实施方式中，编码标签蛋白的核苷酸序列为编码RQR8的核苷酸序列。
在一些实施方式中，编码所述铰链结构域的核苷酸序列H不存在。
在一些实施方式中，所述SP为编码人IL-2信号肽的核苷酸序列或编码人CD8α信号肽的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述H为编码人CD8α铰链区的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述TM为编码人CD8α跨膜区的核苷酸序列或编码人CD28跨膜区的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述CS为编码人CD28共刺激信号结构域的核苷酸序列或编码人CD137/4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述CC为编码人CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述NP为编码T2A切割蛋白的核苷酸序列。
在一实施方式中，所述编码抗人CD123scFv的核苷酸序列如SEQ ID NO：24所示。
在一实施方式中，所述编码人NKG2D胞外段的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。
在一实施方式中，所述编码人CD8α铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO：26所示。
在一实施方式中，所述编码人CD8α跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO：27所示。
在一实施方式中，所述编码人CD28跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO：28所示。
在一实施方式中，所述编码人CD28共刺激信号结构域核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。
在一实施方式中，所述编码人CD137/4-1BB共刺激信号结构域的核苷酸序列如SEQIDNO：30所示。
在一实施方式中，所述编码人CD3ζ胞内信号传导结构域的核苷酸序列如SEQ IDNO：31所示。
在一实施方式中，所述编码T2A切割蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：32所示。
在一实施方式中，所述编码RQR8的核苷酸序列如SEQ ID NO：33所示。
第三方面，本发明提供了一种重组表达载体。其包含本发明第二方面所述的核苷酸序列。将所述重组表达载体转染至免疫应答细胞(例如T细胞、NK细胞)，可实现对该免疫应答细胞的靶向CAR修饰。
在一些实施方式中，所述重组表达载体可以是重组DNA或者RNA构建体。
在一些实施方式中，所述重组表达载体为病毒载体。所述病毒载体选自慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体中的一种。
在一些实施方式中，所述重组表达载体也可以使用非病毒载体。
在一些实施方式中，所述重组表达载体为电转导载体。
在一些实施方式中，所述重组表达载体为睡美人转座子载体。
第四方面，本发明提供了一种启动子，用于构建本发明第三方面所述的重组表达载体和启动表达本发明第一方面所述的靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体构建体以及该构建体上可以存在的标签蛋白。所述启动子包括但不限于EF1α启动子，MND启动子，MSCV启动子，CMV启动子。
在一实施方式中，所述启动子为EF1α启动子。
在一实施方式中，所述启动子为MSCV启动子。
第五方面，本发明提供了一种重组病毒，其是能够侵染免疫应答细胞并使其表达本发明第一方面所述靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的病毒。本发明所述的重组病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺联病毒。
在一些实施方式中，所述重组病毒为本发明第三方面所述的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体表达载体与包装辅助质粒pLP1，pLP2，VSVG共转染293T细胞得到的重组慢病毒。
在一些实施方式中，所述重组病毒为本发明第三方面所述的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体表达载体与包装辅助质粒pSPAX2和MD2G共转染293T细胞得到的重组慢病毒。
在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为T淋巴细胞、NK细胞或NKT细胞。
在一实施方式中，所述免疫应答细胞为T淋巴细胞。
第六方面，本发明提供了上述工程化的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞，其可表达本发明第一方面所述的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体，其由本发明第五方面所述的重组病毒转染所得。
在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为T淋巴细胞，NK细胞，NKT细胞等中的任何一种。
在一些实施方式中，所述免疫应答细胞为T淋巴细胞，即CAR-T细胞。
第七方面，本发明提供了第六方面所述的工程化的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞的制备方法，其包括以下步骤：
首先，将人工合成的含有编码靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的核苷酸序列以及RQR8标签蛋白核苷酸序列通过分子克隆方式重组连接到慢病毒载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-GFP+Puro，构建包含编码抗人CD123scFv和编码人NKG2D胞外段的核苷酸序列的全长CAR序列以及编码独立于CAR表达的标签蛋白的核苷酸序列的慢病毒表达载体。然后用所构建的载体质粒转化感受态细胞，通过摇菌、质粒提取等步骤得到扩增的靶向CD123和NKG2DL的双特异性CAR表达质粒。将双特异性CAR表达质粒和病毒包装辅助质粒pLP1，pLP2，VSVG共转染293T细胞得到的重组慢病毒。最后，用重组慢病毒感染从患者采集的免疫细胞，扩大培养后即可得到本发明第五方面所述的工程化免疫应答细胞。
然而可以使用其他适合的病毒载体或非病毒载体递送系统。逆转录病毒基因转移系统同样证明是有效的。
在一些实施方式中，本发明修饰的免疫应答细胞可以是淋巴谱系的细胞。所述淋巴谱系的细胞选自T、B和NK细胞。所述T细胞包括但不限于细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞(包括干细胞样T细胞、中央记忆T细胞)、效应T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞和γδT细胞。
在一优选实施方式中，本发明修饰的免疫应答细胞是T细胞。
在一优选实施方式中，本发明修饰的免疫应答细胞是NK细胞。
第八方面，本发明提供了所述CAR修饰的免疫应答细胞的应用。所述应用包括：将所述双特异性CAR修饰的免疫应答细胞作为恶性肿瘤治疗的药物。具体地，所述恶性肿瘤包括但不限于血液恶性肿瘤(急性髓细胞白血病、慢性粒细胞白血病、骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤等液体肿瘤、淋巴瘤)、实体恶性肿瘤(脑胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤等)。
在一示例性实施例中，所述肿瘤为急性髓细胞白血病。
本发明基于抗人CD123scFv和人NKG2D构建了靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)以及该双特异性CAR的重组表达载体和该双特异性CAR修饰的免疫应答细胞(例如T细胞，靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性CAR-T细胞)。该双特异性CAR结构通过抗CD123scFv及NKG2D特异性识别CD123和NKG2DL后，可激活免疫应答细胞，启动其细胞毒杀伤机制，靶向杀伤MDSC，M2和肿瘤细胞。当骨髓微环境中的MDSC，M2被清除后，免疫抑制性的骨髓微环境得到改善，免疫应答细胞受到的免疫抑制减弱，联合激活的自身免疫可更高效地清除肿瘤细胞。
该双特异性CAR修饰的免疫应答细胞能有效的靶向攻击多种肿瘤细胞和免疫抑制性细胞，可用来制备用于肿瘤生物免疫治疗的生物制剂。
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语为本发明所属领域通常理解的含义。
采用本发明构建的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞，制备工艺较为简单。经体外实验验证，本发明提供的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体T细胞有明显的特异性杀伤肿瘤细胞的作用。经动物实验验证，可有效延长荷瘤小鼠的生存时间。经临床初步验证，本发明提供的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体T细胞对髓系血液肿瘤以及多种实体瘤具有明显的抗肿瘤和改善免疫抑制性微环境的作用，并表现出良好的临床安全性，改善恶性肿瘤患者预后。
本发明提供的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体修饰的免疫应答细胞为恶性肿瘤治疗提供了一种新的方案，具有较大的临床研究及应用价值以及良好的产业前景。
附图说明
图1：实施例1构建包含RQR8标签蛋白靶向CD123和NKG2DL的双特异性CAR的质粒图谱；
图2：慢病毒表达载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-GFP+Puro；
图3：鉴定两种CAR的表达与RQR8标签的表达具有一致性的流式细胞术结果；
图4：过表达细胞系鉴定和123NL-CART的细胞毒性检测及细胞因子释放检测；
图5：肿瘤、MDSC、Treg和M2细胞表面CD123和NKG2DL的表达；
图6：123NL-CART/未转染T细胞对患者肿瘤、MDSC和M2细胞的杀伤率；
图7：不同浓度利妥昔单抗与123NL-CART/未转染T细胞的杀伤作用；
图8：123NL-CART/未转染T细胞治疗的小鼠体内肿瘤负荷变化以及小鼠生存曲线。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的技术方案作更为详细、完整的说明。以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。文中所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1构建靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的表达质粒
本实施例提供了一个同时表达抗人CD123scFv(CSL362-人源化的鼠源抗CD123mAb 7G3)和人NKG2D胞外段的双特异性嵌合抗原受体。本实施例中两个抗原结合域为并联组合。如图1所示，本实施例所提供的双特异性嵌合抗原受体结构包括：依次连接的第一信号肽结构域(人CD8α，CD8αSP)、第一抗原结合结构域(靶向人CD123的抗人CD123scFv，Anti-CD123 scFv)、第一铰链结构域(人CD8α铰链区，CD8αH)、第一跨膜结构域(人CD28跨膜区，CD28 TM)、第一共刺激信号结构域(人CD28共刺激信号结构域，CD28 CS)、第一胞内信号传导结构域(人CD3ζ胞内结构域，CD3ζ)、切割蛋白(T2A)、第二信号肽结构域(人IL-2信号肽，IL-2SP)、第二抗原结合域(靶向人NKG2DL的NKG2D的胞外段，NKG2D)，第二铰链结构域(人CD8α铰链区，CD8αH)、第二跨膜结构域(人CD8α跨膜区，CD8αTM)、第二共刺激信号结构域(人CD137/4-1BB共刺激信号结构域，4-1BB CS)、第二胞内信号传导结构域(人CD3ζ胞内结构域，CD3ζ)。
步骤1靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列及核苷酸序列的检索
从美国国立医学图书馆NCBI的Genbank数据库中搜索到抗人CD123scFv(CSL362-人源化的鼠源抗CD123 mAb 7G3)(SEQ ID NO：1)、人NKG2D胞外段(SEQ ID NO：2)、人CD8α信号肽(SEQ ID NO：3)、人CD8α铰链区(SEQ ID NO：7)、人CD28跨膜区(SEQ ID NO：6)、人CD28共刺激信号结构域(SEQ ID NO：9)、人CD3ζ胞内信号传导结构域(SEQ ID NO：10)、人IL-2信号肽(SEQ ID NO：4)、人CD8α跨膜区(SEQ ID NO：5)以及人CD137/4-1BB共刺激信号结构域(SEQ ID NO：8)的基因序列信息。将以上序列按此结构依次串联：CD8αSP—Anti-CD123scFv—CD8αH—CD28 TM—CD28CS—CD3ζ—T2A—IL-2SP—NKG2D—CD8αH—CD8αTM—41BB—CD3ζ，得到并联组合的双特异性靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的氨基酸序列。
从美国国立医学图书馆NCBI的Genbank数据库中搜索到以上氨基酸序列相对应的核苷酸序列：抗人CD123scFv(CSL362-人源化的鼠源抗CD123 mAb 7G3)(SEQ ID NO：24)、人NKG2D胞外段(SEQ ID NO：25)、人CD8α信号肽(SEQ ID NO：34)、人CD8α铰链区(SEQ ID NO：26)、人CD28跨膜区(SEQ ID NO：28)、人CD28共刺激信号结构域(SEQ ID NO：29)、人CD3ζ胞内信号传导序列(SEQ ID NO：31)、人IL-2信号肽(SEQ ID NO：35)、人CD8α跨膜区(SEQ IDNO：27)以及人CD137/4-1BB共刺激信号结构域(SEQ ID NO：30)。将上述结构按照CD8αSP—Anti-CD123 scFv—CD8αH—CD28 TM—CD28 CS—CD3ζ—T2A—IL-2SP—NKG2D—CD8αH—CD8αTM—41BB CS—CD3ζ依次连接，得到靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的核苷酸序列，将此核苷酸序列标记为CAR-T1。
步骤2靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的表达载体的构建和鉴定
基因合成双特异性靶向人CD123和人NKG2DL的嵌合抗原受体以及RQR8安全开关标签的编码核苷酸序列，通过分子克隆的方式连接到慢病毒载体pCDH-MSCV-MCS-EF1α-GFP+Puro，构建靶向人CD123和人NKG2DL双靶点的载体结构。具体操作步骤如下：
1.通过基因合成方法得到CAR-T1和RQR8安全开关的基因序列，通过PCR(PolymeraseChain Reaction，聚合酶链式反应)扩增CAR-T1和RQR8安全开关的基因序列并在两端分别添加酶切位点XbaⅠ和酶切位点SalⅠ，进行XbaⅠ和SalⅠ的双酶切反应，得到黏性末端基因序列。再将慢病毒载体质粒pCDH-MSCV-MCS-EF1α-GFP+Puro同样进行XbaⅠ和SalⅠ的双酶切反应，得到无EF1α-GFP+Puro的载体酶切后片段。酶切反应条件为：酶切温度为37℃，酶切时间为4小时。酶切体系(总体积50μL)包括：5μL的10×buffer；待酶切物的DNA：2ug；2.5μL的XbaⅠ酶；2.5μL的SalⅠ酶；用去离子水将酶切体系的体积补至50μL。
2.将含有CAR-T1和RQR8安全开关的黏性末端基因序列和无EF1α-GFP+Puro的载体酶切后片段分别利用浓度为1％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳结束后分别将含有CAR-T1和RQR8安全开关的黏性末端基因序列和无EF1α-GFP+Puro的载体酶切后片段的条带切下，并分别放在两个洁净的EP管中纯化回收，得到含有CAR-T1和RQR8安全开关的黏性末端基因序列和无EF1α-GFP+Puro的载体酶切后片段的酶切产物。
3.将含有CAR-T1和RQR8安全开关的黏性末端基因序列和无EF1α-GFP+Puro的载体酶切产物连接得到表达载体。反应体系如下：约0.01pmol的无EF1α-GFP+Puro的载体酶切产物，0.1pmol的含有CAR-T1和RQR8安全开关的黏性末端的酶切产物、1ul的T4 DNA连接酶、2ul的10X T4 DNA连接酶Buffer,添加无菌双蒸水至20ul体系。16℃连接过夜。
4.将连接产物转入DH5α感受态细胞(购买于Takara)中，具体方法如下：
取出保存在-80℃冰箱中的DH5α感受态细胞，并置于冰上解冻。取5ul连接产物加入DH5α感受态细胞中，冰浴30min后，于42℃下热激45s，再冰浴2min，得到转化产物。将转化产物加入500μL未添加氨苄青霉素的SOC培养基中，于37℃、180rpm恒温摇床培养45min，得到发酵液。将发酵液经3000rpm离心5min，弃去上清液，用100ul新鲜LB肉汤培养基重悬。用三区划菌法将重悬液涂抹于含有氨苄青霉素并已涂布X-gal和IPTG的的LB琼脂培养基平板上，将LB琼脂培养基平板置于37℃的细菌培养箱中，过夜培养16～18h,在LB琼脂培养基平板上挑取阳性克隆。
5.鉴定得到的阳性克隆，具体方法如下：
将得到的阳性克隆接种至5ml含氨苄青霉素抗性的LB肉汤培养基中，于37℃、180rpm恒温摇床培养过夜。16～18h取适量菌液进行质粒小提。将提取得到的质粒经XbaⅠ酶和SalⅠ双酶切反应，具体操作参见上述待酶切物的双酶切反应，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳以鉴定目标片段，获得了大小约为(2750)的目的片段。将大小为(7250)bp的凝胶电泳所得产物回收，经测序鉴定可确定该片段与CAR-T1和RQR8安全开关的基因序列完全匹配。
将测序完全匹配的阳性克隆对应的菌液接种至100ml含氨苄青霉素的LB肉汤培养基，于37℃、180rpm恒温摇床培养过夜。16～18h后，用无内毒素质粒大提试剂盒(购买于天根公司)提取菌体的质粒，具体方法按照该试剂盒的说明书进行。
实施例2慢病毒的制备
1.病毒包装：将实施例1中构建所得靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体的表达质粒，以及病毒包装质粒(pLP1，pLP2，VSVG)按7：5：5：3的比例(共24ug)与Lipofilter(汉恒公司)共孵育后共转染至293T细胞(100mm培养皿，融合度50％～70％)。具体的转染操作过程参见汉恒生物LipoFiter转染试剂说明书。转染后6h更换DMEM完全培养基。
2.病毒收获及浓缩：分别在48小时和72小时，收集细胞培养上清液，4℃3000rpm离心15min后取上清经0.45μm滤膜过滤。最后于4℃，25000rpm超速离心2～3小时后弃上清，用新鲜的DMEM培养基重悬沉淀，得到病毒浓缩液(每皿293T细胞所得沉淀加100ul培养基重悬)。将收集的病毒浓缩液转入-80℃保存(避免浓缩病毒液反复冻融)。
实施例3靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体T细胞(命名为123NL-CART)的制备
步骤1获得人外周血T细胞：
1.用含有肝素的真空采血管收集约20ml人外周新鲜血液；
2.取50ml离心管,吸取20ml Ficoll淋巴细胞分离液于离心管中，管倾斜，将采集的外周血于Ficoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上层。500g，4℃离心25min。
3.离心后从管底至液面分四层,依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层(即白膜层)、血浆层。用移液管直接吸去上层的血浆，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中，用PBS将体积补充至45ml，500g 4℃离心10min，重复两次以清洗细胞。
4.用PBS重悬细胞沉淀，并计数，将细胞密度调整至1*107/ml。取2*107个细胞(2ml)加入40μL CD3 Microbeeds(美天旎公司)重悬，4-8℃孵育15min。
5.孵育完成后，加入10ml PBS，300g离心10min。弃上清，再用2ml PBS重悬细胞。
6.将专用LS柱(美天旎公司)置于磁力架(美天旎公司)上，使用2ml PBS冲洗LS柱后，将细胞重悬液加入到LS柱里，使之流尽。用2ml PBS清洗LS柱三次。
7.将LS柱取离磁力架，加入3ml PBS到LS柱中，用活塞将标记后的细胞冲洗出来。冲洗出来的细胞即CD3+T细胞。用X-VIVO15 T细胞专用培养基(Lonza公司)清洗并重悬。
步骤2激活T细胞
将获得T细胞4℃、500g离心10min后弃上清用X-VIVO15培养基重悬，调整密度值1*106/ml。加入细胞因子(终浓度为100U/ml的IL-2)以及CD3/CD28刺激磁珠(Gibco公司)(每1*106个细胞加入25ul刺激磁珠)。活化培养36～48小时后即进行慢病毒转染。
步骤3慢病毒感染T细胞
1.向经磁珠激活36～48小时的T细胞(将细胞密度调整至1*106/ml)中加入病毒浓缩液，将慢病毒以MOI＝20的感染系数进行转染，并加入polyberen(购于Sigma公司，终浓度为7ug/ml)。混匀后置于37℃5％CO2培养箱孵育；4小时后更换新鲜培养基，调整密度值1*106/ml。
2.继续培养10～15天，每天计数观察，根据细胞数量进行补液(含有终浓度为100U/ml的IL-2的X-VIVO15培养基)并扩大培养，保持细胞密度约为1*106/ml。
步骤4慢病毒转染效率检测
我们通过流式细胞术分别检测了RQR8、抗人CD123scFv以及NKG2D的表达，具体操作如下：
1.取转染3天后的T细胞及未经转染的T细胞各三管(每管约2*105个细胞)，500g离心3min，弃上清，用PBS清洗一次，加入200ul PBS重悬细胞。
2.RQR8检测：取123NL-CART和未转染的T细胞分别加入CD34抗体(PE通道，Abcam公司，克隆号：QBEnd/10)，MKG2D抗体(PE通道，BD公司)，混匀室温避光孵育15min。孵育结束后用PBS清洗后用流式细胞仪进行检测(贝克曼库尔特公司)。
3.NKG2D检测：取123NL-CART和未转染的T细胞分别加入NKG2D抗体(PE通道，BD公司)，混匀室温避光孵育15min。孵育结束后用PBS清洗后上机。用流式细胞仪进行检测。
4.抗人CD123scFv检测：加入CD123蛋白(ACRO公司，His Tag，货号：ILA-H52H6)混匀后于4℃孵育40min，用4℃预冷的PBS清洗细胞，并用200ul预冷的PBS重悬细胞。加入抗His抗体(美天旎公司)，于4℃避光孵育15min。孵育结束后用PBS清洗后用流式细胞仪进行检测。
检测结果如图3所示。结果显示，未经转染的T细胞未检测到RQR8、抗人CD123scFv以及NKG2D的表达，而采用慢病毒转染的T细胞均检测到三者的表达。另外，可确定两种CAR的表达与RQR8标签的表达具有一致性。本实施例所制备的123NL-CART转染率约为20％。
实施例4细胞毒性检测及细胞因子释放检测(图4、图5)
为证明实施例3中所制备的靶向人CD123和人NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体T细胞123NL-CART细胞的靶向杀伤能力，我们筛选了20种细胞系CD123和NKG2DL的表达情况。培养多种肿瘤细胞株，通过流式细胞术分别筛选NKG2DL或CD123单独表达，以及两者同时表达或不表达的细胞系。最终确定DAUDI细胞系两者都不表达。为证明123NL-CART细胞的靶点特异性，我们分别在双阴性细胞系DAUDI的背景下，分别构建了单独过表达CD123和NKG2D受体之一MICA的细胞系。经过筛选以及单细胞克隆培养后，过表达细胞系成功建立(图4A)。将123NL-CART/未转染T细胞与筛选出的过表达细胞系分别按1：1、2：1、4：1、8：1的比例共孵育，48小时后采用流式细胞术检测细胞杀伤率，并收集上清，通过ELISA实验检测分泌的细胞因子。结果显示，123NL-CART细胞具有确切的靶点特异性(图4C)，除双阴性细胞系DAUDI组外，相关细胞因子水平明显高于未转染T细胞组(图4B)。
实施例5肿瘤患者标本检测
为了证明同时靶向CD123和NKG2DL杀伤肿瘤并改善免疫微环境的可行性，我们检测了14例急性髓细胞白血病患者骨髓标本，采用流式细胞术检测了肿瘤、MDSC、M2和Treg细胞表面CD123和NKG2DL的表达情况。结果显示大部分患者肿瘤、MDSC和M2细胞表达CD123，而NKG2DL在M2细胞高表达，在MDSC细胞和Treg细胞中低表达，肿瘤细胞低表达(图5)。这说明NKG2DL靶点可能主要针对免疫抑制细胞，而CD123靶点都能靶向。
实施例6原代细胞杀伤实验
我们收集了8例急性髓细胞白血病患者骨髓细胞样本，提取单个核细胞，按1：1的比例与123NL-CART/未转染T细胞共孵育。48小时后采用流式细胞术检测123NL-CART/未转染T细胞对肿瘤、MDSC和M2细胞的杀伤率。我们的数据显示，123NL-CART细胞相比未转染T细胞，对肿瘤、MDSC和M2细胞显示出明显杀伤作用(图6)。
实施例7自杀开关功能验证
实施例3中的123NL-CART选择了RQR8作为标记、分选以及消除细胞(即自杀开关)的标签蛋白，以避免治疗过程中发生严重的副反应或者治疗后残留的免疫应答细胞造成严重的骨髓抑制作用。RQR8是一种短的膜蛋白，可提供两个与利妥昔单抗(RTX)结合的表位。RTX使对人CD20特异性的治疗性单克隆抗体，当RTX与123NL-CART表面的RQR8结合后可通过补体依赖性细胞毒作用(CDC)以及抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)实现对RQR8阳性的细胞耗竭作用。
为验证自杀开关RQR8的有效性，我们加入不同浓度的CD20单抗(RTX)与123NL-CART/未转染T细胞相作用。结果显示，相对于未转染T细胞，CD20单抗在一定浓度范围内，能明显杀伤123NL-CART细胞(图7)。可能由于没有NK细胞参与的ADCC作用，该杀伤作用较弱。该结果初步证明RQR8作为自杀开关是可行的。
实施例8动物实验验证
为进一步论证123NL-CART细胞的体内靶点特异性，我们选用15只重度免疫缺陷NSG小鼠，通过尾静脉分别注射2×106/只带有荧光素酶标记的DAUDI、DAUDI-MICA和DAUDI-CD123细胞建立AML小鼠模型，每组各5只，肿瘤细胞注射后第5天，小鼠接受5×106/只的123NL-CART细胞治疗，此后，通过活体成像技术每周2次监测小鼠体内肿瘤负荷。实验结果显示，相比于未转染T细胞，123NL-CART细胞治疗的小鼠体内肿瘤负荷更低(图8A)，生存时间更长(图8B)。
由以上试验可看出：联合靶向CD123和NKG2DL可以有效克服恶性肿瘤细胞的靶点逃逸以及免疫抑制因素，提高CART细胞治疗的疗效。根据体外细胞系实验显示，CD123和NKG2DL的双靶点CART细胞对表达CD123和NKG2DL的细胞系有较强的杀伤能力，并分泌较高的细胞杀伤相关的细胞因子。体外原代细胞杀伤实验显示123NL-CART可以有效靶向杀伤肿瘤微环境中包括MDSC和M2在内的免疫抑制性细胞。小鼠实验结果显示123NL-CART细胞能更强的杀伤小鼠体内的表达CD123或者NKG2DL的肿瘤细胞系(即DAUDI-MICA和DAUDI-CD123细胞系)，相比于输注了双阴性DAUDI细胞系的小鼠，123NL-CART细胞治疗对输注了DAUDI-MICA和DAUDI-CD123细胞系的小鼠有明显治疗效果，使其获得了更长的生存时间。
因此，本发明所构建的靶向CD123和NKG2DL的嵌合抗原受体以及经本发明所提供的病毒载体感染的得到的靶向CD123和NKG2DL的双特异性免疫应答细胞可以应用于治疗多种恶性肿瘤，包括血液系统肿瘤(急性髓细胞白血病，慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤等液体肿瘤)、实体恶性肿瘤(淋巴瘤、脑胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤等)。特别的，对于部分髓系恶性肿瘤(肿瘤细胞同时及表达CD123和NKG2DL)，该双靶点免疫应答细胞具有更强的直接抗肿瘤活性，能够避免低丰度抗原表达的阳性肿瘤细胞发生抗原逃逸，从而降低了疾病复发的风险。
显然，所描述的实施例仅是本发明的个别实施例，而不是全部实施例。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施，都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 金鑫
<120> 靶向CD123和NKG2D配体的双特异嵌合抗原受体
<130> 2020
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Lys Trp Ala Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asp Ile Ile Pro Ser Asn Gly Ala Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Leu Leu Arg Ala Ser Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp
130 135 140
Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser
145 150 155 160
Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala
180 185 190
Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
195 200 205
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val
210 215 220
Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 2
<211> 137
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly
1 5 10 15
Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe
20 25 30
Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser
35 40 45
Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu
50 55 60
Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro
65 70 75 80
Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn
85 90 95
Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala
100 105 110
Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr
115 120 125
Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 3
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 4
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser
20
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 6
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe
20
<210> 7
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 8
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 9
<211> 46
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp
1 5 10 15
Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr
20 25 30
Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40 45
<210> 10
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 11
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 12
<211> 157
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Gly Thr Ser Leu Leu Cys Trp Met Ala Leu Cys Leu Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asp His Ala Asp Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly
20 25 30
Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser
35 40 45
Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser
50 55 60
Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Pro Ala Pro Arg Pro
65 70 75 80
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
85 90 95
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
100 105 110
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
115 120 125
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg
130 135 140
Asn Arg Arg Arg Val Cys Lys Cys Pro Arg Pro Val Val
145 150 155
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Asp Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Thr Gly Glu Lys Pro
1 5
<210> 15
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Gly Gly Arg Arg
1
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Val Asp
1 5 10
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Gly Gly Arg Arg Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Leu Arg Gln Arg Asp Gly Glu Arg Pro
1 5
<210> 21
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10
<210> 22
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Leu Arg Gln Lys Asp Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Arg Pro
1 5 10 15
<210> 23
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 24
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gaagtgcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaagc ctggcgagag cctgaagatc 60
agctgcaaag gcagcggcta cagcttcacc gactactaca tgaagtgggc cagacagatg 120
cccggcaaag gcctggaatg gatgggcgac atcatcccct ctaacggcgc caccttctac 180
aaccagaaat tcaagggcca agtgaccatc agcgccgaca agagcatcag caccacctac 240
ctgcagtggt ccagcctgaa ggccagcgat accgccatgt actactgcgc cagaagccat 300
ctgctgcggg ccagttggtt cgcctattgg ggacagggca ccatggtcac agttagctct 360
ggtggcggag gatctggcgg aggtggaagc ggcggaggcg gatctgatat cgtgatgaca 420
cagagccccg acagcctggc cgtgtctctt ggagaaagag ccaccatcaa ctgcgagagc 480
agccagagcc tgctgaacag cggcaaccag aagaactacc tgacctggta tcagcagaag 540
cccggccagc ctcctaagcc tctgatctac tgggccagca ccagagaaag cggcgtgccc 600
gatagatttt ctggctctgg cagcggcacc gatttcaccc tgacaatcag ttccctgcag 660
gccgaggatg tggccgtgta ctattgccag aacgactaca gctaccccta cacctttggc 720
cagggcacaa agctggaaat caagcgg 747
<210> 25
<211> 405
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405
<210> 26
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 27
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 28
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ttctgggtgc tggtcgttgt gggcggcgtg ctggcctgct acagcctgct ggtgacagtg 60
gccttc 66
<210> 29
<211> 138
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
atcatctttt gggtgaggag caagcggagc agactgctgc acagcgacta catgaacatg 60
accccccgga ggcctggccc cacccggaag cactaccagc cctacgcccc tcccagggat 120
ttcgccgcct accggagc 138
<210> 30
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 31
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 32
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gagggcagag gaagtcttct aacatgcggt gacgtggagg agaatcccgg ccct 54
<210> 33
<211> 471
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atgggcacca gcctgctgtg ctggatggct ctctgcctgc tgggcgccga ccacgccgac 60
gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggtggcg gaggaagcga gctgcccacc 120
cagggcacct tcagcaacgt gtctaccaat gtgagccccg ccaagcccac caccacagct 180
tgtccttata gtaatccatc cctctgttcc ggaggcggag gatctccagc gccgcgacca 240
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 300
ccagcggcgg gaggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc 360
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 420
tgcaaccaca ggaaccgaag acgtgtttgc aaatgtcccc ggcctgtggt c 471
<210> 34
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccg 63
<210> 35
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacgaattcc 60

Claims (19)

1.一种同时表达抗CD123单链抗体和天然NKG2D胞外段，可靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体(CAR)氨基酸构建体或其功能性变体；所述双特异性嵌合抗原受体有并联和串联两种连接方式；
其中所述抗CD123单链抗体(抗CD123scFv)的结构是针对包括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面抗原CD123设计的特异性抗原结合域，可特异性与括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面CD123结合；
所述抗CD123scFv由重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)组成，VH和VL间通过至少一个接头(linker)连接，其排列方式可为VH—linker—VL或VL—linker—VH；
所述天然NKG2D胞外段主要表达于NK细胞，NKT细胞，CD8+αβT及部分γδT细胞的膜表面，可与表达于包括MDSC、M2等免疫抑制性细胞和肿瘤细胞表面的NKG2D配体(NKG2DL)相结合。
2.如权利要求1所述双特异性CAR的并联连接方式为：
1)可切割的结构域；
2)第一CAR，所述第一CAR包含(从羧基端到氨基端)：
第一信号肽结构域；
第一抗原结合结构域；
第一跨膜结构域；
第一共刺激信号结构域；和
第一胞内信号传导结构域；
3)第二CAR，所述第二CAR包含(从羧基端到氨基端)：
第二信号肽结构域；
第二抗原结合结构域；
第二跨膜结构域；
第二共刺激信号结构域；和
第二胞内信号传导结构域；
其中所述第一CAR和所述第二CAR通过所述可切割的结构域连接；
所述两个抗原结合结构域，其中之一抗原结合结构域为抗CD123scFv，另一抗原结合结构域为天然NKG2D胞外段。
3.如权利要求1所述双特异性CAR的串联连接方式为(从羧基端到氨基端)：
信号肽结构域；第一抗原结合结构域；第二抗原结合结构域；跨膜结构域；共刺激信号结构域；胞内信号传导结构域；
所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域，其中之一抗原结合结构域为抗CD123scFv，另一抗原结合结构域为天然NKG2D胞外段；所述第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可通过linker连接而成。
4.如权利要求1-3中所述的CAR，
其中抗CD123scFv包含：含有SEQ ID NO：1的氨基酸序列；
其中NKG2D胞外段包含：含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
5.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述信号肽结构域包括但不限于人CD8α信号肽、人IL-2信号肽、人GM-CSF信号肽、人胰岛素信号肽、人胰蛋白酶原信号肽。
所述人CD8α信号肽氨基酸序列包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列。所述人IL-2信号肽包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。
6.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述跨膜结构域与所述抗原结合域之间可直接连接或由铰链结构域连接；
跨膜结构域包括但不限于人CD8α跨膜区、人CD28跨膜区、人CD4跨膜区、人CD28跨膜区、人CD3ζ跨膜区、人CD137/4-1BB跨膜区、人CD134/OX40跨膜区、人ICOS跨膜区、人CD5跨膜区、人CD9跨膜区、人CD16跨膜区、人CD22跨膜区、人CD33跨膜区、人CD37跨膜区、人CD45跨膜区、人CD64跨膜区、人CD80跨膜区、人CD86跨膜区、人CD154跨膜区、人TCRα跨膜区、人TCRβ跨膜区；
所述铰链结构域包括但不限于人CD8α铰链区、人CD28铰链区、人免疫球蛋白恒定区或其变体、人免疫球蛋白铰链区、人IgG4铰链区、人免疫球蛋白CH1/CL区、Fc区、人免疫球蛋白CH2结构域、人免疫球蛋白CH3结构域和/或它们的任何组合；
所述人CD8α跨膜区包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列，所述人CD28跨膜区包含SEQ IDNO：6的氨基酸序列；所述人CD8α铰链区包含SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
7.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述的共刺激信号结构域包括但不限于人CD28、人CD137/4-1BB、人CD134/OX40、人CD27、人ICOS、人B7-H3，人2B4、人DAP10，人DNAM1,人DAP12；所述人CD137/4-1BB共刺激信号序列包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述人CD28共刺激信号序列包含SEQ ID NO：9的氨基酸序列。
8.如权利要求1-4中任一项所述的CAR构建体，其中所述的胞内信号传导结构域包含人CD3ζ或人FcεRIγ；所述人CD3ζ胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO：10的氨基酸序列。
9.如权利要求1-2中任一项所述的CAR构建体，其中所述可切割的结构域可以为2A或弗林蛋白酶，所述2A可以为T2A，P2A，E2A，F2A，所述T2A包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。
10.如权利要求1-2所述的并联的连接方式，所述两个可切割的结构域之间具有至少一个连接子。
11.如权利要求1-10所述嵌合抗原受体CAR构建体上，可以存在一个用于标记、分选、消除宿主细胞的标签蛋白；所述标签蛋白可以通过可切割的结构域(可以为2A或弗林蛋白酶)或又一启动子与CAR连接存在于CAR构建体上；所述标签蛋白包括但不限于RQR8、EGFRt、CD20、c-MYC，6×His，GST，Fc，Flag，HA；其中所述RQR8包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
12.核酸，其包含编码权利要求1-11中任何一项所述的CAR构建体的核苷酸序列。
13.重组表达载体，其包含权利要求12所述的核酸。
14.启动子，用于启动表达构建于权利要求13所述的重组表达载体上的靶向CD123和NKG2DL的双特异性嵌合抗原受体构建体的核苷酸序列以及权利要求11所述可存在于CAR构建体上的标签蛋白的核苷酸序列；所述启动子包括但不限于EF-1α，MND，MSCV，CMV。
15.如权利要求13所述的重组表达载体可以是重组DNA或RNA构建体。
16.如权利要求13所述的重组表达载体可以为病毒载体或非病毒载体；所述的病毒载体包括但不限于慢病毒载体、γ-逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺联病毒载体；所述非病毒载体包括但不限于“睡美人”转座子载体或电转导载体。
17.如权利要求13-16中所述的重组载体的应用，所述应用包括：将表达所述的重组载体转染至宿主免疫应答细胞并作为抗恶性肿瘤的药物。
18.如权利要求17中所述免疫应答细胞包括但不限于T淋巴细胞，NK细胞，NKT细胞。
19.如权利要求18中所述的应用，其特征在于，所述恶性肿瘤包括：血液恶性肿瘤(急性髓细胞白血病，慢性粒细胞白血病，骨髓增生异常综合征、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤等液体肿瘤)、实体恶性肿瘤(包括淋巴瘤、脑胶质细胞瘤、肝细胞癌、乳腺癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、大肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、子宫癌、卵巢癌、宫颈癌、黑色素瘤)。
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