CN116940670A - 一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用。该新型嵌合受体组合物包括传统的嵌合抗原受体和包括NKG2D、DAP10和/或DAP12的全长序列或者截短片段的NKG2D嵌合受体，简称SNR武装的CAR。所述嵌合受体组合物使常规CAR‑T细胞表达NKG2D胞外区及胞内信号区，扩大CAR‑T抗原识别谱，解决肿瘤异质性，在增强CAR‑T对表达目标靶抗原肿瘤细胞的杀伤能力的同时，实现了较低水平的因子释放，降低因子风暴发生的可能，增加CAR‑T安全性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2021年07月14日提交中国专利局的申请号为202110793058.6、名称为“一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用”的中国专利申请的优先权，并将其全部内容通过引用结合在本申请中。
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种新型嵌合受体组合物、重组载体、细胞及其应用。
传统肿瘤治疗的方法包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等；近些年免疫疗法的发展为肿瘤治疗领域带来深刻的改变，尤其是以CTLA-4、PD-1/PD-L1通路抑制剂为代表的免疫检查点疗法和以CAR-T为代表的过继性细胞疗法。过继性细胞疗法包括TIL、NK、TCR-T、
等。其中靶向CD19的CAR-T疗法在B细胞肿瘤中取得了优秀的临床疗效，并且在2017年有两款CAR-T产品被FDA批准用于B细胞白血病或者淋巴瘤的治疗。
虽然CAR-T在血液瘤中取得了重大进展，但在治疗血液瘤中细胞因子风暴等副作用发生率较高，大部分患者在接受CAR-T治疗过程中需要使用辅助手段降低细胞因子风暴带来的副作用。CAR-T在实体瘤治疗中效果差，其中一个重要原因为肿瘤异质性，CAR-T细胞杀伤实体瘤能力较弱并且无法完全清除肿瘤细胞，另外CAR-T在实体瘤治疗因子风暴发生率及因子风暴水平较血液瘤更高，副作用更严重，获益与临床风险比低影响了临床实体瘤患者对CAR-T治疗的接受度。
现有的解决方案一般采用双靶点等解决肿瘤异质性，在治疗过程中或提前介入，采用抗体对症治疗因子风暴或在CAR-T上设计安全开关，当因子风暴发生或CAR-T过度增殖时，使用抗体中和细胞因子或清除CAR-T细胞，降低CAR-T毒副作用。
NK细胞表面表达NKG2D，通过识别其配体如MICA或MICB等激活下游信号 DAP10及DAP12等从而杀伤靶细胞，T细胞表面本身也表达NKG2D，胞内表达DAP10而不表达DAP12，正常情况下T细胞表面NKG2D识别其配体后无法有效激活胞内信号，从而不能杀伤靶细胞。本发明拟设计在常规CAR-T细胞表达NKG2D胞外区及胞内信号区，扩大CAR-T抗原识别谱的同时，解决肿瘤异质性。
发明内容
为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了一种新型嵌合受体组合物或融合蛋白、重组载体、细胞及其应用，扩大CAR-T抗原识别谱的同时，解决肿瘤异质性，且降低因子风暴发生的可能，增加了CAR-T安全性。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面是提供一种新型嵌合受体组合物或融合蛋白，其包括嵌合抗原受体和包括NKG2D、DAP10和/或DAP12的全长序列或者截短片段的NKG2D嵌合受体。
进一步地，该嵌合受体组合物或融合蛋白包括嵌合抗原受体和NKG2D嵌合受体；该NKG2D嵌合受体包括NKG2D胞外区和DAP12胞内区序列。
进一步地，上述NKG2D嵌合受体还包括一个共刺激分子；该共刺激分子选自：CD28、4-1BB、DAP10、ICOS、OX40和CD40。
进一步地，上述嵌合抗原受体包括：胞外识别区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。
进一步地，上述胞外识别区包括识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的抗体或抗体片段。
进一步地，上述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原选自：CD19、BCMA、CD22、CD20、CD123、CD30、CD38、CD138、CD56、CD7、CLL-1、CD10、CD34、CS1、CD16、CD4、CD5、IL-1-RAP、ITGB7、k-IgG、TAC1、TRBC1、MUC1、NKG2D、PD-L1、CD133、CD177、LeY、CD70、ROR1、AFP、AXL、CD80、CD86、DLL3、DR5、FAP、LMP1、MAGE-A1、MAGE-A4、MG7、MUC16、PMEL、ROR2、VEGFR2、CD171、Claudin 18.2、Claudin 6、EphA2、ErbB、Fra、PSCA、cMet、IL13Ra2、EPCAM、EGFR、PSMA、EGFRvIII、GPC3、CEA、HER2、GD2和 Mesothelin。
进一步地，上述铰链区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80和IgG的至少一种，上述跨膜区的序列来源于CD2、CD27、LFA-1(CD11a/CD18)、CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、CD3ζ和CD3ε的至少一种，上述胞内信号区的序列来源于Toll样受体、CD2、CD27、LFA-1(CD11a/CD18)、CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、DAP10、DAP12、CD3ζ和CD3ε等中的至少一种。
进一步地，上述嵌合受体组合物还包括连接肽，连接上述嵌合抗原受体和嵌合受体；该连接肽为自切割多肽2A肽；该2A肽包括F2A、P2A、T2A和E2A；优选为P2A，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9。
进一步地，上述嵌合受体的氨基酸序列选自以下序列的一条：SEQ IDNO.1～SEQ ID NO.8；优选为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6。
本发明的第二方面是提供编码上述嵌合受体组合物或融合蛋白的核酸。
本发明的第三方面是提供包含上述核酸的载体。
本发明的第四方面是提供表达上述嵌合受体组合物或融合蛋白、含有上述核酸或者上述载体的细胞。
进一步地，上述细胞选自以下细胞中的一种：T细胞、NK细胞、DC细胞和巨噬细胞。
进一步地，上述T细胞选自αβT细胞、γδT细胞或NKT细胞。
本发明的第五方面是提供一种治疗肿瘤的生物制剂，包括上述细胞作为主要活性成分。
本发明的第六方面是提供上述细胞的制备方法，包括将上述载体转染细胞的步骤。
本发明的第七方面是提供上述嵌合受体组合物、核酸、载体或细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明提供的嵌合受体组合物或融合蛋白使常规CAR-T细胞表达NKG2D胞外区及胞内信号区，扩大CAR-T抗原识别谱，解决肿瘤异质性，在增强CAR-T对表达目标靶抗原肿瘤细胞的杀伤能力的同时，实现了较低水平的因子释放，降低因子风暴发 生的可能，增加CAR-T安全性。
图1是本发明一实施例中CLDN18.2和NKG2D Ligands mRNA在胃癌(A)、胰腺癌(B)和食管癌(C)来源PDX模型中的表达情况；
图2是本发明一实施例中CLDN18.2和NKG2D ligands蛋白水平在胃癌组织芯片中的表达情况；
图3是本发明一实施例中序列名称为21007、21067-21074的嵌合受体组合物的结构示意图；
图4显示了本发明一实施例中构建的CAR-T细胞anti-CLDN18.2-CAR及NKG2D的表达结果；
图5显示了本发明一实施例中构建的细胞系293-CLDN18.2高表达CLDN18.2；
图6显示了本发明一实施例中293T表达较高水平的NKG2D配体MICA/B；
图7显示了本发明一实施例中SNR武装的CAR-T细胞对细胞系293-CLDN18.2的杀伤效果；
图8显示了本发明一实施例中与细胞系293-CLDN18.2共孵育，CAR-T的增殖倍数；
图9显示了本发明一实施例中SNR武装的CAR-T细胞对293T细胞的杀伤效果；
图10显示了本发明一实施例中SNR武装的CAR-T细胞在杀伤的靶细胞293-CLDN18.2时有更低的因子分泌水平，其中图A-D分别显示了IL-2、IFN-γ、IL6和TNF-α的分泌水平；
图11显示了本发明一实施例中SNR武装的CAR-T细胞在杀伤表达MICA/B的靶细胞时释放中等水平的细胞因子，其中图A-D分别显示了IFN-γ、TNF-α、IL6和IL-2的分泌水平。
图12是本发明一实施例中SNR武装的CLDN18.2CAR示意图。
图13是本发明一实施例中A431表达ULBP2/5/6结果图。
图14是本发明一实施例中体外杀伤和细胞因子分泌实验结果图；其中C和D图 中的柱子，从左到右的依次为unT、21047、21326、21327、21328、21329。
图15是本发明一实施例中SNR对于CAR-T细胞增殖、记忆表型与耗竭的影响。
图16是本发明一实施例中CLDN18.2均一性表达体内模型药效研究实验结果。
图17是本发明一实施例中A431rechallenge实验。
图18是本发明一实施例中A431肿瘤模型药效实验；其中B图的柱子从做到右依次为PBS、UNT、21047、21327、21328和21329，其中PBS组和横坐标轴重合。
图19是本发明一实施例中CLDN18.2异质性肿瘤模型药效实验结果。
图20是本发明一实施例中SNR武装的EPCAM CAR与CD19 CAR示意图。
图21显示了本发明一实施例中构建的CAR-T细胞anti-EPCAM-CAR，anti-CD19-CAR及NKG2D的表达结果。
图22是本发明一实施例中EPCAM CAR-T体外杀伤和IFN-γ分泌实验结果图。
图23是本发明一实施例中CD19 CAR-T体外杀伤和IFN-γ分泌实验结果图。
本发明构建了一种嵌合受体组合物或融合蛋白，在传统的嵌合抗原受体表达载体基础上增加包括NKG2D、DAP10和/或DAP12的全长序列或者截短片段的NKG2D嵌合受体，将载体包装为慢病毒，将慢病毒转导细胞制备针对同时靶向CLDN18.2并表达NKG2D的免疫细胞，增加免疫细胞疗法的安全性。
“NKG2D、DAP10和/或DAP12的全长序列”意味着必然包含NKG2D的全长序列，并包含DAP10的全长序列或DAP12的全长序列中的一种或两种。
在一些实施方式中，其包含截短片段的NKG2D嵌合受体，并包含DAP10的全长序列或DAP12的全长序列中的一种或两种。截短片段的NKG2D嵌合受体可以是NKG2D的胞内截短片段(ICD)或胞外截短片段(ECD)。
本发明一实施例提供了一种新型嵌合受体组合物或融合蛋白，其包括嵌合抗原受体和包括NKG2D、DAP10和/或DAP12的全长序列或者截短片段的NKG2D嵌合受体。
在本发明一优选的实施方式中，该嵌合受体组合物或融合蛋白包括嵌合抗原受体和NKG2D嵌合受体；该NKG2D嵌合受体包括NKG2D胞外区和DAP12胞内区序列。
在本发明一优选的实施方式中，上述NKG2D嵌合受体还包括一个共刺激分子；该共刺激分子选自：CD28、4-1BB、DAP10、ICOS、OX40和CD40。
在本发明一优选的实施方式中，上述嵌合抗原受体包括：胞外识别区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。
在本发明一优选的实施方式中，上述胞外识别区包括识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的抗体或抗体片段。
在本发明一优选的实施方式中，上述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原选自但不限于：CD19、BCMA、CD22、CD20、CD123、CD30、CD38、CD138、CD56、CD7、CLL-1、CD10、CD34、CS1、CD16、CD4、CD5、IL-1-RAP、ITGB7、k-IgG、TAC1、TRBC1、MUC1、NKG2D、PD-L1、CD133、CD177、LeY、CD70、ROR1、AFP、AXL、CD80、CD86、DLL3、DR5、FAP、LMP1、MAGE-A1、MAGE-A4、MG7、MUC16、PMEL、ROR2、VEGFR2、CD171、Claudin 18.2、Claudin 6、EphA2、ErbB、Fra、PSCA、cMet、IL13Ra2、EPCAM、EGFR、PSMA、EGFRvIII、GPC3、CEA、HER2、GD2和Mesothelin。
在本发明一优选的实施方式中，上述铰链区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80和IgG的至少一种，上述跨膜区的序列来源于CD2、CD27、LFA-1(CD11a/CD18)、CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、CD3ζ和CD3ε的至少一种，上述胞内信号区的序列来源于Toll样受体、CD2、CD27、LFA-1(CD11a/CD18)、CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、DAP10、DAP12、CD3ζ和CD3ε等中的至少一种。
在本发明一优选的实施方式中，上述嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.19。
在本发明一优选的实施方式中，上述嵌合受体组合物或融合蛋白还包括连接肽，连接上述嵌合抗原受体和嵌合受体；该连接肽为自切割多肽2A肽；该2A肽包括F2A、P2A、T2A和E2A；优选为P2A，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9。
在本发明一优选的实施方式中，上述嵌合受体的氨基酸序列选自以下序列的一条：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；优选为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6。
本发明一实施例提供了编码上述嵌合受体组合物或融合蛋白的核酸。
在本文中，核酸包含其保守置换的变体(例如简并密码子的置换)和互补序列，亦包括通过密码子优化以在期望的宿主细胞中更高效表达的变体。核酸通常是RNA或DNA，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。核酸分子可 以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。当其连入载体时优选采用DNA核酸。
本发明一实施例提供了包含上述核酸的载体。
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；CRISPR/CAS质粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。
本发明一实施例提供了表达上述嵌合受体组合物或融合蛋白、含有上述核酸或者上述载体的细胞。
细胞优选为免疫杀伤性细胞。
在本发明一优选的实施方式中，上述细胞选自以下细胞中的一种：T细胞、NK细胞、DC细胞和巨噬细胞。
T细胞在本发明中可包含本领域所熟知的亚类，例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、MAIT细胞、NKT细胞以及γδT细胞中的一种或多种。在本发明一优选的实施方式中，上述T细胞选自αβT细胞、γδT细胞或NKT细胞。
本发明一实施例提供了一种治疗肿瘤的生物制剂，包括上述细胞作为主要活性成分；优选地还包括药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂。
如本文所用，“药学上可接受载体、稀释剂或赋形剂”包括当与活性组分组合时允许所述组分保持生物学活性并且与受试者的免疫系统不发生反应的任何材料。实例包括但不限于标准药物载剂(诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(诸如油/水乳液))和各种类型的润湿剂中的任一者。用于气雾剂或肠胃外施用的示例性稀释剂是磷酸盐缓冲盐水(PBS) 或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过熟知的常规方法来配制(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版，A.Gennaro编,Mack PublishingCo.,Easton,PA,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Mack Publishing,2005)。
本发明一实施例提供了上述细胞的制备方法，包括将上述载体转染细胞的步骤。
本发明一实施例提供了上述嵌合受体组合物、核酸、载体或细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
在优选的实施方式中，所述抗肿瘤药物用于治疗异质性肿瘤。
在本发明一优选的实施方式中，所述异质性肿瘤中至少包含NKG2DL阳性肿瘤细胞，以及所述嵌合抗原受体所靶向的肿瘤细胞。
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1 CLDN18.2以及NKG2D ligands在胃癌组织表达检测
发明人首先利用PDX数据库(CrownBio)分析了CLDN18.2和NKG2DL mRNA在胃癌、胰腺癌和食管癌来源PDX组织表达情况。结果图1所示，CLDN18.2在胃癌、胰腺癌和食管癌的PDX组织中阳性率为63％、82％和26％；同时大部分组织都最少有一个NKG2D配体或者CLDN18.2的表达。同样，我们检测了胃癌组织芯片(购自中科光华)中CLDN18.2以及NKG2D配体(MICA,MICB,ULBP1～6)的表达。结果与PDX数据库中表达情况相一致，大部分组织都最少有一个NKG2D配体或者CLDN18.2的表达(图2)。以上结果说明使用靶向NKG2DL有可能能够解决CLDN18.2等单靶向产品面对的肿瘤异质性难题。
实施例2 合成自然杀伤受体(Synthetic Natural Killer Receptor,SNR)的设计
本实施例提供了一种新型嵌合受体组合物；该新型嵌合受体组合物(在下文中称为Dual CAR，也称之为SNR，或SNR武装的CAR分子；其对应的CAR-T细胞称为Dual CAR-T或SNR武装的CAR-T)包括氨基酸序列为公开号为CN113621073A，公开日为 2021年11月09日的中国专利申请中的SEQ ID NO.1的anti-CLDN18.2-CAR(传统二代Claudin18.2CAR分子，下文称为21007)，以及如SEQ ID NO.1～8所示的嵌合受体序列(结构序列如图3所示)，具体的氨基酸序列对应下表1中的序列名称为21067～21074的序列。
表1 anti-CLDN18.2-CAR以及嵌合受体组合物的序列信息
如图3所示，上述嵌合受体组合物除21007的嵌合抗原受体，还包括的序列信息如下：
(1)P2A，其氨基酸序列如下：
(2)DAP12ICD(胞内区)，其氨基酸序列如下：
(3)DAP10ICD，其氨基酸序列如下：
(4)NKG2DFL(全长序列)，其氨基酸序列如下：
(5)CD8 hinge(铰链区)，其氨基酸序列如下：
(6)CD8 TM(跨膜区)，其氨基酸序列如下：
(7)DAP10FL，其氨基酸序列如下：
(8)DAP12FL，其氨基酸序列如下：
(9)DAP12ECD+TM(胞外区及跨膜区)，其氨基酸序列如下：
(10)T2A，其氨基酸序列如下：
实施例3 合成自然杀伤受体(SNR)武装的CAR分子的质粒构建和病毒包装
本实施例提供表达上述嵌合受体的SNR武装的CAR-T细胞，其构建方法包括如下步骤：
1.表达载体构建：SNR武装的CAR分子和慢病毒载体骨架部分分别由CRO公司使用全基因合成技术构建得到。通过常规分子克隆手段，将SNR武装的CAR片段克隆至慢病毒载体，所构建的质粒名称如上表1所示。各质粒通过对插入片段全序列测通验证证明构建成功。
2.慢病毒包装和滴度测定
第一天：
1)在T75培养瓶中接种293T细胞，数量为5×10
6，培养体积为20ml；
第二天：
2)包病毒前确认293T细胞汇合度在70％-80％左右，并进行等体积换液；
3)转染复合物的配制和转染：
分别配置Tube A和Tube B，体系如下所示，并进行颠倒或者低速振荡混匀；
Tube A：Opti-MEM(2ml)+Lipo3000(55μl)；
Tube B：Opti-MEM(2ml)+P3000(46μl)+辅助质粒18μg+SNR武装的CAR主质粒6μg；
将Tube A加入到Tube B中，振荡混匀，室温孵育15分钟；
将第3步中换过液的培养瓶翻面，使培养基处于培养瓶另一面，将Tube A+B混合物加入，轻摇混匀后，再将培养瓶缓慢翻回正面，后继续培养48h；
第四天：
4)转染完成培养2天后，收集上清，500g离心10min，用0.45μm滤器过滤上清至50ml离心管中，包好封口膜，10000g，4℃离心过夜，可见白色病毒沉淀；弃上清后倒置离心管至上清流尽后用200μl AIM-V培养基溶解沉淀后，取2μl按照后续步骤测定滴度，其余置于-80℃保存。
5)将2μl重悬病毒上清加至198μl 1640培养基中稀释病毒，后在24孔板中按照每孔2×10
5数量Jurkat T细胞分别加入稀释后的病毒2μl、10μl和50μl一共3个孔，并加入终浓度为5μg/ml的Polybrene辅助病毒感染。
第六天：
6)使用Anti-VHH-FITC抗体检测病毒滴度，滴度在2.5×10
7-1.2×10
8之间，可满足常规体外CAR-T构建实验要求。
3.合成自然杀伤受体(SNR)武装的CAR-T细胞的构建
将上述包装的慢病毒感染T细胞，检测T细胞上anti-CLDN18.2-CAR及NKG2D的表达，结果如图4所示。
由图4可知，anti-CLDN18.2-CAR-T细胞有较低水平的NKG2D表达，SNR武装的CAR-T细胞相比anti-CLDN18.2-CAR-T细胞有较高的NKG2D表达水平，同时正常表达anti-CLDN18.2-CAR。说明NKG2D嵌合受体在SNR武装的CAR-T细胞表面成功表达。
实施例4
本实施例验证SNR武装的CAR-T细胞对靶细胞的杀伤效果，具体的步骤和结果如下：
(1)293细胞基础上构建了过表达CLDN18.2抗原的细胞系293-CLDN18.2，该细胞系高表达CLDN18.2(如图5)。
(2)检测细胞系NKG2D配体MICA/B的表达：鉴定了239T细胞系上MICA/B的表达水平，293T细胞系表达较高水平的MICA/B(如图6)。
(3)CAR-T细胞与293-CLDN18.2按2:1及0.5:1的效靶比混合，孵育5h，Annexin V流式检测CAR-T对靶细胞杀伤效果，anti-CLDN18.2-CAR-T及SNR武装的CAR-T相对unT(未转导的T)细胞，对293-CLDN18.2有较强的杀伤效果，其中21069及21072在2:1效靶比时有相对传统CAR-T(21007)更强的杀伤效果(如图7)。此外，将293- CLDN18.2与CAR-T共孵育，21069及21072SNR武装的CAR-T增殖倍数明显高于传统的CAR-T细胞(21007)(如图8)。
CAR-T细胞与293T细胞按2:1及0.5:1的效靶比混合，孵育5h，Annexin V流式检测CAR-T对靶细胞杀伤效果，anti-CLDN18.2-CAR-T及SNR武装的CAR-T相对unT(未转导的T)细胞，对表达MICA/B的靶细胞有较强的杀伤效果，其中21069及21072在2:1效靶比时有相对传统CAR-T更强的杀伤效果(如图9)。
实施例5
本实施例验证SNR武装的CAR-T细胞在杀伤的靶细胞293-CLDN18.2时有更低的因子分泌水平，具体的步骤和结果如下：
采用实施例4构建的细胞系293-CLDN18.2；将CAR-T细胞与293-CLDN18.2按2:1的效靶比混合，孵育24h，流式检测CAR-T细胞因子释放，使用Biolegend的多因子检测试剂盒，取15μl/样品的效应细胞与靶细胞孵育的上清至新的V型96孔板中，加入混合稀释后的磁珠15μl/样品及15μl/样品的assay buffer，封板膜密封，500rpm室温震荡2h，250g离心5min，去上清，加入200μl/样品的wash buffer，250g离心5min，去上清，加入15μl/样品的检测抗体，500rpm室温震荡1h，加入15μl/样品的SA-PE，500rpm室温震荡30min，250g离心5min，去上清，加入200μl/样品的wash buffer，250g离心5min，去上清，加入150μl/样品的Wash Buffer，上机检测。结果显示anti-CLDN18.2-CAR-T及SNR武装的CAR-T细胞在杀伤293-CLDN18.2靶细胞时，21067、21068、21069、21070、21072等SNR武装的CAR-T有明显更低的IFN-γ、IL2、IL6和TNF-α分泌水平(如图10)。
实施例6
本实施例验证SNR武装的CAR-T细胞在杀伤表达MICA/B的靶细胞时释放中等水平的细胞因子，具体的步骤和结果如下：
将CAR-T细胞与293T按2:1的效靶比混合，孵育24h，流式检测CAR-T细胞因子释放，anti-CLDN18.2-CAR-T细胞及SNR武装的CAR-T细胞在杀伤293T靶细胞时，21068、21069、21070、21072等SNR武装的CAR-T有中等水平的IFN-γ分泌水平，较低的TNF-α、IL2及IL6分泌水平(如图11)。
实施例7 SNR武装CLDN18.2CAR-T细胞的构建
基于上述结果，我们选择了分子21067，21070，21071，21072等分子内的SNR结构进行进一步验证。我们将如上几个SNRs构建至二代CAR分子21047中，形成新的CAR分子21326、21327、21328、21329。其结构和序列如图12和下表所示。参照实施例2中的方法，我们将上述各分子构建为了质粒、慢病毒、以及CAR-T细胞。
实施例8 SNR武装CLDN18.2CAR-T细胞杀伤靶细胞能力检测
为了验证SNR是否能够成功杀伤NKG2DLs阳性细胞，我们利用ULBPs阳性肿瘤细胞A431，检测了SNR带来的杀伤能力。具体的步骤和结果如下：
(1)检测细胞系NKG2D配体ULBP2/5/6的表达：鉴定了A431细胞系上NKG2D配体的表达水平，A431细胞系表达较高水平的ULBP2/5/6(如图13)。
(2)CAR-T细胞与NUGC4以及A431按3:1，1:1,0.3:1的效靶比混合，孵育5h，Annexin V流式检测CAR-T对靶细胞杀伤效果，结果如下图所示，21327与21329在高效靶比时杀伤NUGC4的效率高于21047，此外21047不能杀伤A431,而21326～21329均能够有效杀伤A431。多因子检测表明，杀伤NUGC4时，21047分泌的IFN-γ要高于21326～21329，而在杀伤A431时，21327～21329分泌的IFN-γ水平整体上要低于杀伤NUGC4时的分泌水平(如图14)。该结果说明4种SNR设计均能够靶向和杀伤CLAUDIN18.2与NKG2DLs阳性的细胞，且细胞因子分泌水平较低。
实施例9 SNR提高了CAR-T细胞的增殖能力和记忆水平，同时降低耗竭水平
我们进一步分析了SNR对于CAR-T细胞的体外影响。结果如图15所示，相对于 21047，各分子的增殖速度均明显增快，而同时各耗竭markers(PD1,LAG3,TIM3)的表达明显降低。进一步分析记忆中心记忆细胞的比例，结果显示，21327分子的Tscm细胞比例相对于其它分子的水平明显升高。如上优势可能与SNR中所采用信号域的功能有关。
实施例10 CLDN18.2均一性表达体内模型药效研究
为了研究以上各分子的体内药效，我们构建了NUGC4(CLDN18.2+,NKG2DLs-)的皮下移植瘤模型，并在肿瘤达到100mm
3时进行各CAR-T的给药。研究结果显示，相对于21047，21327能够提前10天左右将肿瘤组织清零，说明其有更好的药效；而21326和21329的药效不及21047；21328由于小鼠提前死亡，其药效无法得出结论(图16中A)。以上结果说明，相对于传统二代CAR-T 21047，21327分子具有更强的清除CLDN18.2均一性表达肿瘤的能力。
进一步分析小鼠体重，21328分子在研究期间体重明显下降，并且发生小鼠死亡，说明其具有较明显的体内毒性。21047分子在研究期间也有一只小鼠发生体重下降，但无小鼠死亡发生。而21326，21327和21329分子在整个研究期间均无明显毒性发生(图16中B)。与之相一致的，我们进一步分析了小鼠血液中细胞因子的表达水平，结果说明，21326，21327和21329分子在体内分泌的IFN-gamma(图16中C)和TNF-alpha(图16中D)的水平更低，这一结果与安全性结果相一致。
综合以上结果说明，21327分子相对于传统二代CAR-T具有更好的药效以及更低的毒性。说明SNR3的设计有效提高了CAR-T的有效性和安全性。
为了进一步研究CLDN18.2阳性肿瘤被清除后，CAR-T细胞对抗CLDN18.2阴性复发的能力。我们使用A431细胞(CLDN18.2-,NKG2DLs+)对21047和21327组肿瘤清除后的小鼠进行了再挑战实验(rechallenge)。研究结果显示，相对于21047，21327分子能够显著抑制A431肿瘤的生长(图17)。以上结果说明，SNR的加入有可能能够抑制CLDN18.2阴性肿瘤的复发。
实施例11 SNR的NKG2DL+肿瘤模型药效实验
为了进一步验证各组SNR抑制肿瘤的能力，我们构建了小鼠皮下A431肿瘤移植模型(CLDN18.2-,NKG2DLs+)，在肿瘤长到60mm
3时进行各CAR-T的给药，结果见图 18。该数据显示21327与21329可以抑制A431的增长，21329抑瘤效果好于21327。21047几乎没有抑瘤效果，同时也说明了21327与21329的SNR结构可以特异性识别NKG2DL，并启动杀伤作用。
实施例12 CLDN18.2异质性肿瘤模型药效实验
为了进一步研究SNR是否能够提高CAR-T对抗异质性肿瘤的能力，我们进一步构建了A431-18.2细胞系，以及将其与A431混合形成A431/A431-18.2肿瘤模型。在肿瘤接种7天左右进行CAR-T给药。结果显示，在异质性肿瘤模型中，传统二代CAR-T分子虽说能够在体内增殖和分泌IFN-gamma，但是其未能明显抑制肿瘤的生长，暗示着CLDN18.2阳性肿瘤细胞被杀死的同时，CLDN18.2阴性部分肿瘤仍能够正常生长。而带有SNR结构的21327分子则有效抑制了混合肿瘤细胞的生长。IFN-γ分泌水平分析结果显示，21047于21327在体内分泌水平并无明显差异(图19)综上结果说明，SNR的加入有效帮助了CAR-T细胞对抗异质性肿瘤组织。
实施例13 SNR武装EPCAM CAR-T与CD19 CAR-T细胞的构建
基于上述结果，我们将21327的SNR构建至二代EPCAM CAR分子(21002)中，形成新的CAR分子22162，同时将21329的SNR构建至二代CD19 CAR分子(21144)中，形成22163(图20)。其序列如下表所示。参照实施例2中的方法，我们将上述各分子构建质粒、慢病毒、以及CAR-T细胞。将上述包装的慢病毒感染T细胞，检测T细胞上anti-EPCAM-CAR，anti-CD19 CAR以及NKG2D的表达，结果如图21所示。
由图21可知，anti-EPCAM-CAR-T细胞有较高水平的NKG2D表达，SNR武装的anti-CD19-CAR-T细胞也有较高的NKG2D表达水平，同时正常表达EPCAM CAR与CD19 CAR。说明NKG2D嵌合受体在SNR武装的CAR-T细胞表面成功表达。
实施例14 SNR武装EpCAM CAR-T细胞细胞因子分泌水平检测
为了验证SNR武装的EpCAM CAR-T细胞杀伤异质性肿瘤的能力，我们研究了其杀伤EpCAM靶点阳性(HCT116)或者靶点阴性细胞(MIA PaCa2)过程中的细胞因子释放水平。
CAR-T细胞与HCT116或MIA PaCa2按1：1的效靶比混合，孵育24h后取上清用ELISA法检测细胞因子分泌水平。IFN-γ检测结果如图22所示，杀伤HCT116时，22162分泌的IFN-γ为50000-60000pg/ml，与传统二代CAR-T分子分泌水平相当。而在杀伤EpCAM靶点阴性细胞MIA PaCa2过程中，SNR提高了CAR-T细胞分泌IFN-γ分泌水平。综上所述，SNR促进了EpCAM CAR-T杀伤EpCAM阴性细胞的能力。
实施例15 SNR武装CD19 CAR-T细胞杀伤靶细胞能力检测
为了验证SNR武装的CD19 CAR-T细胞杀伤异质性肿瘤的能力，我们研究了其杀伤CD19靶点阳性(Raji)或者靶点阴性细胞(MIA PaCa2)过程中的细胞因子释放水平。
CAR-T细胞与Raji或MIA PaCa2按1：1的效靶比混合，孵育24h后取上清用ELISA法检测细胞因子分泌水平。IFN-γ检测结果显示，杀伤Raji时，22163分泌的IFN-γ为30000-40000pg/ml，明显高于传统二代CAR-T分子分泌水平。在杀伤CD19靶点阴性细胞MIA PaCa2过程中，SNR提高了CAR-T细胞分泌IFN-γ分泌水平。综上所述，SNR促进了CD19 CAR-T杀伤CD19阴性细胞的能力。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Claims (17)
- 一种新型嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，包括嵌合抗原受体和包括NKG2D、DAP10和/或DAP12的全长序列或者截短片段的NKG2D嵌合受体。
- 根据权利要求1所述的嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，包括嵌合抗原受体和NKG2D嵌合受体；所述NKG2D嵌合受体包括NKG2D胞外区和DAP12胞内区序列。
- 根据权利要求2所述的嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，所述NKG2D嵌合受体还包括一个共刺激分子；所述共刺激分子选自：CD28、4-1BB、DAP10、ICOS、OX40和CD40。
- 根据权利要求1所述的嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：胞外识别区、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区。
- 根据权利要求4所述的嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，所述嵌合抗原受体的胞外识别区包括识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的抗体或抗体片段；所述肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原优选选自：CD19、BCMA、CD22、CD20、CD123、CD30、CD38、CD138、CD56、CD7、CLL-1、CD10、CD34、CS1、CD16、CD4、CD5、IL-1-RAP、ITGB7、k-IgG、TAC1、TRBC1、MUC1、NKG2D、PD-L1、CD133、CD177、LeY、CD70、ROR1、AFP、AXL、CD80、CD86、DLL3、DR5、FAP、LMP1、MAGE-A1、MAGE-A4、MG7、MUC16、PMEL、ROR2、VEGFR2、CD171、Claudin 18.2、Claudin 6、EphA2、ErbB、Fra、PSCA、cMet、IL13Ra2、EPCAM、EGFR、PSMA、EGFRvIII、GPC3、CEA、HER2、GD2和Mesothelin。
- 根据权利要求4所述的嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，所述铰链区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80和IgG的至少一种，所述跨膜区的序列来源于CD2、CD27、LFA-1、CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、CD3ζ和CD3ε的至少一种，所述胞内信号区的序列来源于Toll样受体、CD2、CD27、LFA-1、CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、DAP10、DAP12、CD3ζ和CD3ε中的至少一种。
- 根据权利要求1所述的嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，还包括连接肽，连接所述嵌合抗原受体和嵌合受体；该连接肽为自切割多肽2A肽；该2A肽包括F2A、 P2A、T2A和E2A；优选为P2A，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9。
- 根据权利要求1所述的嵌合受体组合物或融合蛋白，其特征在于，所述嵌合受体的氨基酸序列选自以下序列的一条：SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.8；优选为SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.6。
- 一种编码如权利要求1-8任一项所述嵌合受体组合物或融合蛋白的核酸。
- 一种包含如权利要求9所述的核酸的载体。
- 一种表达如权利要求1-8任一项所述嵌合受体组合物或融合蛋白、含有如权利要求10所述核酸或者如权利要求11所述载体的细胞。
- 根据权利要求11所述的细胞，其特征在于，所述细胞选自以下细胞中的一种：T细胞、NK细胞、DC细胞和巨噬细胞；优选为αβT细胞、γδT细胞或NKT细胞。
- 一种治疗肿瘤的生物制剂，其特征在于，包括如权利要求11或12所述的细胞作为主要活性成分。
- 一种如权利要求11或12所述细胞的制备方法，其特征在于，包括将如权利要求11所述载体转染所述细胞的步骤。
- 如权利要求1-8任一项所述的嵌合受体组合物或融合蛋白、如权利要求9所述的核酸、如权利要求10所述的载体或如权利要求11或12所述的细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
- 根据权利要求15所述的应用，所述抗肿瘤药物用于治疗异质性肿瘤。
- 根据权利要求16所述的应用，所述异质性肿瘤中至少包含NKG2DL阳性肿瘤细胞，以及所述嵌合抗原受体所靶向的肿瘤细胞。
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