KR20220150814A - 키메릭 항원 수용체(car)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포로서, 구체적으로 상기 키메릭 항원 수용체는 BAFF 수용체, BCMA, TACI에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 형질전환된 세포는 전문적 항원표출세포가 항원에 특이적으로 결합할 때, 전문적 항원표출세포의 활성을 유발하는 강화된 키메릭 신호전달 도메인을 제공한다. 이에 대한 예시로, BAFF의 세포외 도메인 한 쌍을 인간 이뮤노글로불린 G₁ 중쇄 불변 영역(IgG₁ heavy chain constant region)에 각각 연결시킨 이합체(dimer)와 전문적 항원표출세포의 신호 전달에 중요한 작용을 하는 TLR-3, TLR-4 및 IgE 수용체 gamma chain (Fcε receptor I gamma chain, FcεRIγ) 또는 IgG 수용체 2A alpha chain (Fcγ receptor 2A alpha chain, FcγR2Aα) 또는 IgE 수용체 beta chain (Fcε receptor I beta chain, FcεRIβ)의 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 소단위(subunit)로하여, 3개의 ITAM을 링커(linker)로 연결시킨 신규 합성 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 재조합 단백질로서, 이를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 전문적 항원표출세포의 경우 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암종 및 자가면역질환에 특이적으로 세포독성을 갖게되므로 암 및 전신 홍반성 루프스 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 이용될 수 있다.

Description

키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포 및 이의 용도{Transformed professional antigen presenting cells specifically binding to antigen containing chimeric antigen receptor(CAR) and uses thereof}

본 발명은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포로서, 구체적으로 상기 키메릭 항원 수용체는 BAFF의 세포외 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체로서, BAFF 수용체(BAFF receptor), B-cell maturation antigen (BCMA), Transmembrane activator and CAML interactor (TACI)에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인을 포함하는, 상기 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

전문적 항원표출세포(professional antigen presenting cell)에는 대식세포(macrophage), 수지상세포(dendritic cell), 미감작 B 세포(naive B cell)가 포함된다(Makala et al., 2004). 대식세포와 수지상세포는 항원을 인식하면 식작용(phagocytosis)에 의해 항원을 잘게 부수고, 대식세포와 수지상세포에서 발현하는 주조직적합성(major histocompatibility complex, MHC) 항원은 항원 결정부(epitope)를 T 세포(T cell)에 전달한다(Kambayashi and Laufer, 2014). 미감작 B 세포(naive B cell)의 경우는 B 세포 수용체(B cell receptor, membrane bound IgM)에 의해 항원을 인식하고, 그 후 항원을 잘게 부수어 미감작 B 세포에서 발현하는 주조직적합성(major histocompatibility complex, MHC) 항원은 항원 결정부(epitope)를 T 세포(T cell)에 전달한다(Kambayashi and Laufer, 2014). 전문적 항원표출세포는 또한 주조직적합성(major histocompatibility complex, MHC) 항원에 의한 항원 결정부 전달과 동시자극신호(co-stimulatory signal) 전달에 의해 미감작 T 세포(naive T cell)를 작동 T 세포(effector T cell)로 활성화시킨다(Kambayashi and Laufer, 2014). 전문적 항원표출세포는 그 외에도 다양한 사이토카인(cytokine)과 케모카인(chemokine)을 분비하여, 염증 반응을 유발하거나 다른 면역세포의 활성을 유발한다(Kambayashi and Laufer, 2014). 따라서, 효과적인 면역 반응은 전문적 항원표출세포의 활성화에 의해 시작되며, 전문적 항원표출세포의 활성화 없이는 효과적인 면역 반응이 유발되지 않는다(Makala et al., 2004).

최근에는 전문적 항원표출세포의 활성을 유발하여 종양을 치료하는 방법이 고안되었다. 즉, 종양 특이적 항원을 암 환자 유래 전문적 항원표출세포에 처리하고, 다시 종양 특이적 항원에 의해 활성화된 전문적 항원표출세포를 암 환자의 몸에 넣어주는 방법이다(van Willigen et al., 2018). 암 환자에 이식된 활성화된 전문적 항원표출세포는 직접적으로 종양 세포를 표적하는 세포독성 T 세포(cytotoxic T lymphocytes, CTL)와 자연살생세포(natural killer cell, NK cell)의 활성을 유발하여, 종양 세포를 죽이게 된다(Galluzzi et al., 2018; Lu et al., 2020).

하지만, 이러한 면역 요법의 가장 큰 해결해야 할 과제는 종양 특이적인 항원이 지금까지 그렇게 많이 발견되지 않았다는 것이다. 따라서, 최근에는 암의 세포 표면에서 발현하는 단백질을 인식하는 항체의 단일사슬 Fv 단편(single-chain variable fragment, scFv) 부분을 CD3 제타(zeta) 또는 다른 단백질의 세포질내 신호전달 도메인(cytoplasmic signaling domain)에 접목시킨 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)를 세포독성 T 세포와 자연살생세포에 발현시켜, 암의 세포 표면에서 발현하는 단백질을 인식하여 전달되는 신호 전달에 의해 세포독성 T 세포와 자연살생세포의 암 특이적 활성을 유발하는 새로운 항암 치료 방법이 도입되었다. 즉, 키메릭 항원 수용체를 T 세포 또는 자연살생세포에 접목시키면, 암특이적 항원을 인식하는 전문적 항원표출세포에 의한 신호 전달과 관계없이 scFv의 특정 항원 인지만으로 T 세포 또는 자연살생세포의 항암 작용을 활성화시킬 수 있으며, 또한 HLA type에 제한적이지 않아 많은 사람들이 보편적으로 사용할 수 있는 보다 효율적인 치료 방법으로 이용할 수 있다. 실제로, 이러한 키메릭 항원 수용체 발현 T 세포나 자연살생세포는 여러 암에서 효능을 보이고 있다(Holzinger et al., 2016; Pettitt et al., 2018; Wang et al., 2020).

한편, B-cell activating factor (BAFF)는 tumor necrosis factor (TNF) 리간드에 속하는 사이토카인이며, BLyS (B-lymphocyte stimulator), TALL-1 (TNF- and ApoL related leukocyte-expressed ligand 1), THANK (TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor-κB and c-Jun NH2-terminal kinase), TNFSF13B (TNFsuperfamily member 13B) 또는 zTNF4로 불리운다(Mackay and Browning, 2002). BAFF는 원래 285개의 아미노산으로 구성된 type 2 막관통 단백질(transmembrane protein)로 동형3합체(homotrimer)로 세포 표면에 발현된 후, 막관통 부분이 잘려져 나가 세포외로 분비된다. BAFF는 대식세포(macrophage), 단핵구세포(monocyte), 수지상세포(dendritic cell)에서 분비된다(Mackay and Browning, 2002). BAFF와 결합하는 수용체는 BAFF 수용체(BAFF receptor), B-cell maturation antigen (BCMA), Transmembrane activator and CAML interactor (TACI) 등이 있다(Mackay and Browning, 2002). BAFF 수용체는 골수내 형질세포(plasma cell)를 제외한 대부분의 사람 B 세포에서 발현되며, BCMA는 주로 항체를 분비하는 사람 세포에서 발현된다(Mackay and Schneider, 2009). 또한 TACI는 대부분의 말초 B 세포에서 발현된다(Mackay and Schneider, 2009). 따라서, BAFF와 BAFF와 결합하는 3가지 수용체인 BAFF 수용체, BCMA, TACI의 상호 작용에 의한 신호 전달은 B 세포 활성에 매우 중요하다고 여겨진다(Mackay and Schneider, 2009).

BAFF와 결합하는 3가지 수용체인 BAFF 수용체, BCMA, TACI는 또한, 다양한 암종(malignant cells)에서 과발현이 관찰된다. 특히 BCMA는 다발성 골수종(multiple myeloma)의 표지 인자이며(Carpenter et al., 2013), 유방암(breast cancer), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 만성 B 림프구성백혈병(B cell Chronic lymphocytic leukemia, B-CLL), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 등에서 발견된다(Haiat et al., 2006; Dou et al., 2016; Kampa et al., 2020). 또한, BAFF 수용체는 B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma) 등 다양한 림프종에서 발현하며, 또한, 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL) 등과 같은 백혈병에서도 발현한다. 이 밖에도 BAFF 수용체는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE) 같은 자가면역질환의 B 세포에도 과발현 된다(Haiat et al., 2006; Parameswaran et al., 2010; Takahata et al., 2010; Yang et al., 2014). 한편, TACI는 다발성 골수종(multiple myeloma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma), 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer) 등에서 발견된다(Moreaux et al., 2009; Dou et al., 2016; Kampa et al., 2020).

현재, BCMA 또는 BAFF 수용체를 종양항원으로 인식하는 CAR-T 세포(미국공개특허 제2020-0283534호)나 수용성 TACI 이뮤노글로불린 조성물과 사용 방법(미국등록특허 제08524232호)가 공개되어 있으나, BAFF 수용체, BCMA, TACI가 발현되는 암세포에 대한 결합 특이성을 갖는 BAFF의 세포외 도메인(extracellular domain)을 항원 결합 도메인에 포함하여 면역 항암 치료제로서 이용하는 발명에 대해서는 기재된 바 없다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 전문적 항원표출세포의 기능과 키메릭 항원 수용체의 기능을 접목시킨 새로운 치료 방법을 고안하였다. 즉, 종양 세포 표면 단백질을 리간드(ligand)로 인식할 수 있는 수용체와 리간드를 인식한 후, 키메릭 항원 수용체에 의해 전문적 항원표출세포의 활성을 유발할 수 있는 신규 키메릭 신호전달 도메인을 고안하였고, 이러한 키메릭 신호전달 도메인에 의해 활성화된 전문적 항원표출세포가 암에 대한 세포독성 능력을 가질수 있다는 것을 증명하였다. 즉, 사람의 BAFF 수용체, BCMA, TACI와 BAFF의 결합이 가능하다는 점을 이용하여 BAFF의 세포외 도메인, 톨유사수용체-2(toll-like receptor 2, TLR-2)의 막관통 도메인, TLR-3의 세포 내 도메인, TLR-4의 세포 내 도메인, IgE 수용체 gamma chain (Fcε receptor I gamma chain, FcεRIγ) 또는 IgG 수용체 2A alpha chain (Fcγ receptor 2A alpha chain, FcγR2Aα) 또는 IgE 수용체 beta chain (Fcε receptor I beta chain, FcεRIβ)의 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)를 소단위(subunit)로 하여, 3개의 ITAM을 링커(linker)로 연결시킨 신규 합성 세포 내 신호 전달 도메인과 결합한 재조합 단백질을 발현하는 키메릭 항원 수용체 발현 대식세포를 제작하였다. 이때 대식세포에서 발현하는 BAFF의 세포 외 도메인은 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 인지하여 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 특정 암세포 또는 전신 홍반성 루프스의 B 세포와 결합 시, 이들 대식세포 내부로 활성화 신호를 전달해 줄 수 있고, 결국 이러한 신호는 대식세포를 활성화시켜 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 특정 암세포 또는 전신 홍반성 루프스의 B 세포에 대한 세포독성을 가질 수 있게 한다. 실제로, 상기 대식세포가 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 세포에 특이적으로 세포독성 능력이 있음을 체외 실험을 통해 확인하였다.

미국공개특허 제2020-0283534호 (2020. 09. 10) 미국등록특허 제08524232호(2013. 09. 03)

따라서 본 발명의 목적은 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 형질전환된 세포로서, 상기 키메릭 항원 수용체는 BAFF 수용체, BCMA, TACI에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 세포는 표적화된 효과기 활성을 갖는 항원 특이적 전문적 항원표출세포로서 대식세포, 수지상세포 또는 미감작 B 세포(naive B cell)를 포함하는, 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제 또는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 형질전환된 세포로서, 상기 키메릭 항원 수용체는 BAFF 수용체, BCMA, TACI에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 세포는 표적화된 효과기 활성을 갖는 항원 특이적 전문적 항원표출세포로서 대식세포, 수지상세포 또는 미감작 B 세포(naive B cell)를 포함하는, 형질전환된 세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 포함하는, 세포 치료제 또는 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시 예에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)의 항원 결합 도메인은 상기 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF의 세포외 도메인일 수 있다.

본 발명의 일실시 예에 있어서, 상기 막관통 도메인은 TLR-2일 수 있다.

본 발명의 일실시 예에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인은 TLR-3, TLR-4, IgE 수용체 gamma chain (Fcε receptor I gamma chain, FcεRIγ), IgG 수용체 2A alpha chain (Fcγ receptor 2A alpha chain, FcγR2Aα), IgE 수용체 beta chain (Fcε receptor I beta chain, FcεRIβ)의 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기"BAFF 수용체", "BCMA", "TACI"는 다양한 암종(malignant cells)과 자가면역질환, 바람직하게는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE)에서 관찰된다. 지금까지 "BAFF 수용체", "BCMA", "TACI"를 발현하는 암종은 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 형질전환된 세포는 전문적 항원표출세포가 항원에 특이적으로 결합할 때, 전문적 항원표출세포의 활성을 유발하는 강화된 키메릭 신호전달 도메인을 제공한다. 이에 대한 예시로, BAFF의 세포외 도메인과 전문적 항원표출세포의 신호 전달에 중요한 작용을 하는 TLR-3, TLR-4 및 IgE 수용체 gamma chain (Fcε receptor I gamma chain, FcεRIγ) 또는 IgG 수용체 2A alpha chain (Fcγ receptor 2A alpha chain, FcγR2Aα) 또는 IgE 수용체 beta chain (Fcε receptor I beta chain, FcεRIβ)의 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 소단위(subunit)로 하여, 3개의 ITAM을 링커(linker)로 연결시킨 신규 합성 세포 내 신호 전달 도메인을 포함하는 재조합 단백질로서, 이를 과발현시킬 수 있는 벡터로 형질전환된 전문적 항원표출세포의 경우 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암종에 특이적으로 세포독성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 의한 키메릭 항원 수용체를 과발현하는 전문적 항원표출세포는 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 암종 및 전신홍반성 루프스 치료를 위한 면역세포 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 구역 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이럴 벡터 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이럴 벡터 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이럴 벡터 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 렌티바이럴 벡터 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 전문적 항원표출세포 표면에 발현하는 키메릭 항원 수용체 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 전문적 항원표출세포 표면에 발현하는 키메릭 항원 수용체 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 전문적 항원표출세포 표면에 발현하는 키메릭 항원 수용체 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 전문적 항원표출세포 표면에 발현하는 키메릭 항원 수용체 중 하나의 형태를 나타낸 모식도이다.
도 13a는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 BAFF 수용체를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 발현하기 위해 BAFF 수용체 cDNA를 레트로바이럴 벡터에 삽입한 모식도이다.
도 13b는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 BCMA를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 발현하기 위해 BCMA cDNA를 레트로바이럴 벡터에 삽입한 모식도이다.
도 13c는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 표적인 TACI를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 발현하기 위해 TACI cDNA를 레트로바이럴 벡터에 삽입한 모식도이다.
도 14a는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 타겟인 BAFF 수용체를 발현하는 CHO 세포(BAFF receptor positive cell)에서 BAFF 수용체의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 14b는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 타겟인 BCMA를 발현하는 CHO 세포(BAFF receptor positive cell)에서 BCMA의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 14c는 본 발명에서 제공하는 키메릭 항원 수용체의 타겟인 TACI를 발현하는 CHO 세포(BAFF receptor positive cell)에서 TACI의 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC)에서의 GFP의 발현 비율을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 16a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 BAFF 수용체를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 16b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 BCMA를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 16c는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 TACI를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 17a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 BAFF 수용체를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 17b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 BCMA를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 17c는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 TACI를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 18a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 BAFF 수용체를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 18b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 BCMA를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 18c는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포가 TACI를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 19a는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 전문적 항원표출세포가 BAFF 수용체를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 19b는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 전문적 항원표출세포가 BCMA를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 19c는 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 렌티바이러스 시스템을 이용하여 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 전문적 항원표출세포가 TACI를 인식하는지 여부를 유세포 분석을 이용해 나타낸 도이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 24시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 48시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 24시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 48시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 24시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 48시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 26은 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 24시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 27은 본 발명의 일 실시예에 따른 공벡터(Mock pAPC) 또는 키메릭 항원 수용체를 형질도입시킨 4종의 키메릭 항원 수용체를 각각 발현시킨 전문적 항원표출세포(BAFF CAR-pAPC) 중 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 전문적 항원표출세포를 작동세포(effector cell)로 하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 Chinese hamster ovary (CHO) 세포에 대한 세포독성을 48시간 후 측정한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

본 발명은 하나의 양태로서, 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 형질전환된 세포로서, 상기 키메릭 항원 수용체는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 세포는 표적화된 효과기 활성을 갖는 항원 특이적 전문적 항원표출세포로서 대식세포, 수지상세포 또는 미감작 B 세포(naive B cell)를 포함하는, 형질전환된 세포를 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 키메릭 항원 수용체 단백질은 기능적 동등물을 포함할 수 있다. '기능적 동등물'이란 아미노산의 부가, 치환, 또는 결실의 결과, 상기 키메릭 항원 수용체 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성'이란 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합할 수 있는 활성을 가진 것을 의미한다.

본 발명은 또한 키메릭 항원 수용체의 단편, 유도체 및 유사체(analogues)를 포함한다. 본원에 사용된, 용어 '단편', '유도체' 및 '유사체'는 본 발명의 키메릭 항원 수용체 단백질과 실질적으로 같은 생물학적 기능 또는 활성을 보유하는 폴리펩티드를 말한다. 본 발명의 단편, 유도체 및 유사체는 (i) 하나 이상의 보존적(conservative) 또는 비보존적 아미노산 잔기(바람직하게는 보존적 아미노산 잔기)가 치환된 폴리펩티드(상기 치환된 아미노산 잔기는 유전 암호에 의해 암호화될 수도, 되지 않을 수도 있다) 또는 (ⅱ) 하나 이상의 아미노산 잔기에서 치환기(들)를 가지는 폴리펩티드, 또는 (ⅲ) 또 다른 화합물(폴리펩티드의 반감기를 연장할 수 있는 화합물, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜)과 결합된 성숙 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드, 또는 (ⅳ) 부가적인 아미노산 서열(예를 들면, 선도 서열, 분비 서열, 상기 폴리펩티드를 정제하는데 사용된 서열, 프로테이노젠(proteinogen) 서열 또는 융합 단백질)과 결합된 상기 폴리펩티드로부터 유래된 폴리펩티드일 수 있다. 본 발명에 정의된 상기 단편, 유도체 및 유사체는 당업자에 잘 알려져 있다.

본 발명에서 "BAFF 수용체", "BCMA", "TACI"는 다양한 암종(malignant cells)과 자가면역질환, 바람직하게는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE)에서 관찰된다. 지금까지 "BAFF 수용체", "BCMA", "TACI"를 발현하는 암종은 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "키메릭 신호전달 도메인"은 원하는 리간드에 결합하여 리간드-수용체 반응을 통해 전문적 항원표출세포의 활성화를 유도하고 해당 리간드를 발현하는 세포를 공격할 수 있도록 하기 위해 전문적 항원표출세포에 발현시키기 위한 융합 단백질을 의미할 수 있다. 곧, 전문적 항원표출세포에 발현 시 리간드에 결합하여 이들 세포들의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 따라서, 본 발명에서 제공하는 신규 키메릭 신호전달 도메인은 모든 항원-항체 반응을 포함한 모든 리간드-수용체 반응을 이용한 전문적 항원표출세포의 활성화를 유도할 수 있는 범용적 의미의 신규 키메릭 신호전달 도메인을 제공한다.

즉, 상기 키메릭 항원 수용체는 전문적 항원표출세포에 발현 시 항원에 결합하여 이들 세포들의 활성화를 유도하는 단백질이라고 볼 수 있다. 이를 통해 면역 반응을 일으키고자 하는 세포에 특이적인 항원을 인식하는 단백질일 수 있으며, 상기 면역 반응을 일으키고자 하는 세포는 특정 조직에 존재하거나 병변을 일으킨 조직을 이루는 세포를 의미할 수 있다.

상기 키메릭 항원 수용체(CAR)의 항원 결합 도메인은 상기 BAFF 수용체, BCMA, TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF(B-cell activating factor)의 세포외 도메인일 수 있다. 상기 BAFF단백질은 tumor necrosis factor (TNF) 리간드에 속하는 사이토카인이며, BLyS (B-lymphocyte stimulator), TALL-1 (TNF- and ApoL related leukocyte-expressed ligand 1), THANK (TNF homologue that activates apoptosis, nuclear factor-κB and c-Jun NH2-terminal kinase), TNFSF13B (TNFsuperfamily member 13B) 또는 zTNF4로 불리운다. BAFF는 원래 285개의 아미노산으로 구성된 type 2 막관통 단백질(transmembrane protein)로 동형3합체(homotrimer)로 세포 표면에 발현된 후, 막관통 부분이 잘려져 나가 세포외로 분비된다. BAFF는 대식세포(macrophage), 단핵구세포(monocyte), 수지상세포(dendritic cell)에서 분비된다.

상기 BAFF의 세포외 도메인은 서열번호 1 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항원 결합 도메인은 신호전달을 증폭하기 위해 BAFF의 세포외 도메인 한 쌍을 인간 이뮤노글로불린 G₁ 중쇄 불변 영역(IgG₁ heavy chain constant region)에 각각 연결시킨 이합체(dimer) 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 인간 이뮤노글로불린 G₁ 중쇄 불변 영역(IgG₁ heavy chain constant region)은 서열번호 2 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 세포내 신호전달 도메인은 항원 결합 도메인에 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다. 상기 신호전달 도메인은 TLR-3, TLR-4, 타이로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 또는 이들의 조합일 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 신호전달 도메인은 TLR-3-TLR-4의 구성에 ITAM을 소단위(subunit)로 하여 링커(linker)로 연결시킨 형태일 수 있으며, 상기 ITAM은 한 개 이상이 연결된 형태일 수 있으며, 바람직하게는 3개가 연결된 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 ITAM은 IgE 수용체 gamma chain (Fcε receptor I gamma chain, FcεRIγ), IgG 수용체 2A alpha chain (Fcγ receptor 2A alpha chain, FcγR2Aα) 또는 IgE 수용체 beta chain (Fcε receptor I beta chain, FcεRIβ)의 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 TLR-3은 서열번호 3 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 상기 TLR-4는 서열번호 4 또는 이와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있고; 상기 ITAM은 서열번호 5; 서열번호 6; 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

상기 링커는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열과 실질적으로 동등한 기능을 나타내는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 막관통 도메인 (Transmembrane domain)은 BAFF의 세포외 도메인과 보조자극, 필수 신호전달 도메인을 세포막 사이로 연결하는 부위이며, 세포내 신호 전달 도메인은 항원 결합 도메인의 결합에 의해 면역 세포의 면역반응을 활성화시키는 부위를 의미한다.

본 발명의 키메릭 항원 수용체의 일 구성요소인 막관통 도메인은 CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154 및 TLR-2로 이루어진 군으로부터 선택되는 단백질의 막관통 도메인을 포함하는 것일 수 있다. 바람직하게는, 상기 막통과 도메인은 TLR-2일 수 있고, 이는 서열번호 9 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항원 결합 도메인은 신호 펩타이드를 포함할 수 있으며, 상기 신호 펩타이드는 TLR-4 신호 펩타이드일 수 있으며, 서열번호 10 또는 이와 95% 이상의 상동성을 나타내는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 항원 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다. 본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

본 발명에서는 바람직한 일 예로서, 렌티-바이러스용 벡터를 사용할 수 있으며, 본 발명의 하기 실시예에서는 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP 벡터(렌티-바이러스용 벡터)를 사용하였다(도 5 내지 도 8 참조).

또한, 본 발명의 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 상기 벡터를 통해 세포에 도입하여 세포를 형질전환 시킬 수 있다. 상기 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)와 NK 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, NK 세포, 또는 NKT 세포일 수 있으며, 바람직하게는, 전문적 항원표출세포인 대식세포, 수지상세포, 미감작 B 세포(naive B cell) 일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 상기 세포는 골수, 말초혈액, 말초혈액단핵세포 또는 제대혈로부터 얻거나 제조될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 기술한 벡터를 이용하여 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 키메릭 항원 수용체를 전문적 항원표출세포에 형질전환 시킬 수 있다.

상기와 같이 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입되어 형질전환된 세포는 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 항원으로 인식하고 이와 강하게 결합하는 특징을 가진다.

본 발명에서, "키메릭 항원 수용체 발현 전문적 항원표출세포 (chimeric antigen receptor professional antigen presenting cell, 이하 간략하게 'CAR-pAPC 세포’라 약칭함)" 란 정상의 전문적 항원표출세포를 형질도입 등의 방법으로 본래의 전문적 항원표출세포 표면 수용체가 아닌 암세포에 특이적으로 반응하는 키메라 항원 수용체를 발현하는 전문적 항원표출세포를 의미한다. 이 수용체를 갖는 전문적 항원표출세포는 타겟 세포의 세포자살을 유도하여 세포독성을 나타낸다.

본 발명에 있어, 특히 CAR-pAPC 세포는 전문적 항원표출세포에 본 발명의 키메릭 항원 수용체가 도입된 세포일 수 있다. 상기 세포는 CAR-T 치료제의 기존 장점인 항암 특이적 표적 치료의 장점을 가지며, 특히, 본 발명의 키메라 항원 수용체를 장착시킨 전문적 항원표출세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암세포를 인지하여 효과적으로 파괴할 수 있다.

따라서 본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 세포를 포함하는 세포치료제; 이를 유효성분으로 포함하는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 및 전신 홍반성 루프스의 치료용 약학적 조성물; 및 상기 세포를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암 및 전신 홍반성 루프스를 치료하는 방법이다.

본 발명에 있어 상기 세포는, 상기 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)와 NK 세포, 종양 침윤 림프구, B 세포, NK 세포, 또는 NK-T 세포일 수 있으며, 바람직하게는, 전문적 항원표출세포인 대식세포, 수지상세포, 미감작 B 세포(naive B cell) 일 수 있다. 또는 전구 세포(progenitor cell), 예를 들어, 조혈 줄기세포, 중간엽 간질 세포, 줄기세포, 전분화능 줄기세포, 및 배아 줄기세포일 수 있으며, 이들은 항암치료 등의 세포 요법에 사용될 수 있다. 세포는 공여자로부터 올 수 있거나, 환자로부터 얻어진 세포가 될 수 있다. 세포는 예를 들어, 병에 걸린 세포의 기능을 대체하는 재생에 사용될 수 있다. 세포는 또한 이종 유전자를 발현하도록 변형되어 생물학 제제가, 예를 들어, 병에 걸린 골수 또는 전이성 침착물과 같은 특정 미세 환경으로 전달될 수 있다.

본 발명에서, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 및 전신 홍반성 루프스를 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 및 전신 홍반성 루프스에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 혈액암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 개체란, BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아 피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한 없이 포함된다.

본 발명에 있어 치료 대상이 되는 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 세포로는 전신 홍반성 루프스 및 암종이 있으며, 암의 종류로는 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유전자 합성 방법에 의한 유전자의 클로닝

본 발명의 키메릭 항원 수용체를 제조하기 위해서 BAFF의 세포외 도메인 중 도메인 1과 TLR-2의 막관통 도메인의 서열을 가지며, 서로 다른 세포 내 신호 전달 도메인을 암호화하는 서열을 가진 4종류의 키메릭 항원 수용체 단백질 암호화 서열을 합성하였다. 키메릭 항원 수용체는 BAFF의 세포외 도메인 한 쌍을 각각 인간 이뮤노글로불린 G₁ 중쇄 불변 영역(IgG₁ heavy chain constant region)에 연결시킨 항원 인식 부위, TLR-2의 막관통 도메인, TLR-4 신호 펩타이드를 공통적으로 포함하며. 신호전달 도메인을 각각 다른 4가지 구성으로 하여 제작하였다. 하기 표 1에 상기 4종류의 신호전달 도메인의 구성을 기재하였다.

구분	신호전달 도메인 구성
1	TLR-3 / TLR-4 / linker / FcεR1 γ chain ITAM motif / linker / FcεR1 γ chain ITAM motif / linker / FcεR1 γ chain ITAM motif
2	TLR-3 / TLR-4 / linker / FcγR2A α chain ITAM motif / linker / FcγR2A α chain ITAM motif / linker / FcγR2A α chain ITAM motif
3	TLR-3 / TLR-4 / linker/ FcεR1 β chain ITAM motif/ linker / FcεR1 β chain ITAM motif / linker / FcεR1 β chain ITAM motif
4	TLR-3 / TLR-4 / linker / FcγR2A α chain ITAM motif / linker / FcεR1 β chain ITAM motif / linker / FcεR1 γ chain ITAM motif

상기 제작한 키메릭 항원 수용체를 발현시키는 각 도메인의 cDNA 모식도를 도 1 내지 도 4에 나타내었다. 각 도메인 부분의 단백질 암호화 서열은 유전자 데이터베이스(database)에서 확인하였으며, 유전자 합성의 정확도는 단백질 발현 플라스미드를 제작한 후 시퀀싱을 통해 확인하였다.

실시예 2. 단백질 발현 플라스미드 제조

상기 실시예 1에서 제작한 4종의 키메릭 항원 수용체의 BAFF의 세포외 도메인 중 도메인 1과 대식 세포 신호전달 단백질을 융합시킨 재조합 단백질을 대식 세포에서 발현시키기 위해, 해당 유전자를 렌티바이러스 유래 발현벡터인 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP(System Biosciences)에 제한효소 XbaI과 NotI의 절단 부위를 이용하여 클로닝하였다.

그 결과, 도 9 내지 도 12의 구조로 된 BAFF의 세포외 도메인과 신규 신호 전달 단백질이 융합된 단백질 4종을 발현하는 재조합 벡터를 완성하였다(도 5 내지 도 8 참조).

실시예 3. BAFF 수용체, BCMA , TACI를 발현하는 세포주 제작

BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 세포 표면에 발현하는 세포주를 제작하기 위해서, BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI 유전자 각각을 5′말단에 제한효소 Bgl II 절단 부위 서열과 3′말단에 제한효소 Hind III의 절단 부위 서열을 이용하여 pLNCX2 벡터에 클로닝 하였다(도 13a, 13b 및 13c 참조).

그 후, BAFF 수용체, BCMA, TACI 유전자가 삽입된 pLNCX2 벡터를 Chinese hamster ovary (CHO) 세포(ATCC)에 도입하기 위하여 293GPG 세포를 사용한 레트로바이러스 시스템을 이용하였다. 먼저 293GPG 세포 3Х10⁶개를 10ml의 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액 10ml에 풀어 100π 세포 배양 접시에 접종 후 24시간 동안 배양하였다. 앞서 제작한 재조합 벡터(BAFF-R.pLNCX2 벡터, BCMA.pLNCX2 벡터, TACI.pLNCX2 벡터) (20 μg) 각각을 calcium phosphate 및 HEPES-buffered solution을 이용하여 결정화 시킨 후 앞서 배양한 293GPG 세포의 배양액에 첨가해주었다. 이후 24시간 간격으로 72시간에 걸쳐 배양액을 교체하며 레트로바이러스를 함유한 293GPG 세포의 배양 상층액을 채취 및 보관하였다. 상기 채취한 레트로바이러스 함유 상층액은 초고속 원심분리기를 이용하여 21,000 rpm으로 2시간 동안 원심분리 후 농축 이전 대비 100배로 농축될 수 있도록 10% 송아지 혈청 함유 DMEM (welgene)에 재구성하였다. 농축한 레트로바이러스를 CHO 세포에 형질도입하기 위해 CHO 세포를 24 well 세포 배양 접시에 5Х10⁵/ml의 밀도로 접종하였다. 그 다음 농축된 레트로바이러스에 polybrene을 8 μg/ml만큼 첨가한 혼합액을 배양 중인 CHO 세포의 배양액에 추가한 후 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 새 배양액으로 교체하였으며 유전자가 도입된 세포의 선별을 위해 배양액 교체 후 24시간 후부터는 neomycin 항생제(600 μg/ml)가 첨가된 10% 송아지 혈청 함유 DMEM 배양액을 이용하여 레트로바이러스를 처리해준 CHO 세포를 배양하였다. 14일 간의 neomycin 선별과정을 마친 CHO 세포는 다시 신선한 배양액에 옮겨 1주일간 증식시켰다.

증식 후, 유세포 분석을 이용해 CHO 세포의 BAFF 수용체, BCMA, TACI 발현량을 각각 측정하였으며 재조합 벡터(BAFF-R.pLNCX2 벡터, BCMA.pLNCX2 벡터, TACI.pLNCX2 벡터)를 도입한 각각의 CHO 세포와 공벡터인 pLNCX2를 도입한 CHO 세포(Mock CHO cell)의 BAFF 수용체, BCMA, TACI 발현량을 항 인간 BAFF 수용체 항체(Biolegend), 항 인간 BCMA 수용체 항체(Biolegend), 항 인간 TACI 수용체 항체(Biolegend)를 이용한 유세포분석기를 이용하여 비교한 각각의 결과를 도 14a 내지 14c에 나타내었다.

상기 결과를 근거로 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 강하게 발현하는 CHO 세포주 각각을 표적세포(target cell)로 이용하였으며, BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하지 않는 Mock CHO cell 세포주를 표적세포(target cell)의 음성 대조군으로 사용하였다.

실시예 4. 키메릭 항원 수용체 발현 전문적 항원표출세포 제작

상기 실시예 2를 통해 제작한 재조합 키메릭 항원 수용체 발현 벡터 4종을 전문적 항원표출세포의 일종인 THP-1 세포(사람 대식 세포주)에 도입하기 위하여 293FT 세포(Thermo Fisher Scientific社)를 사용한 렌티 바이러스 시스템을 이용하였다.

먼저, 293FT 세포를 100π 세포 배양 접시에 2.5Х10⁶ 세포가 되도록 접종한 후, 10% 송아지 혈청을 함유한 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 24시간 후, 세포가 접시의 60~70% 정도를 덮을 정도로 자라면, 상기 실시예 2의 4종의 벡터 DNA 각각을 20μg으로 분주하여, 10μg의 psPAX2(Addgene)와 3μg의 pMD2.G(Addgene) 벡터와 함께 Calcium phosphate를 Calcium phosphate 및 Hepes-buffered solution을 이용하여 결정화시킨 후 293FT 세포에 도입하였다. 그 후, 상기 발현 벡터가 도입된 293FT 세포를 48시간 후 24시간 간격으로 바이러스(렌티바이러스)를 포함하는 배양 상층액을 모았다. 모은 상층액을 초고속 원심분리기를 21,000rpm으로 2시간 동안 원심분리하여 바이러스를 농축시켰다. 농축된 바이러스를 polybrene 4μg/ml과 혼합하여 대식 세포주인 THP-1 세포의 배양액에 추가하여 형질도입을 진행하였다. 24시간 간격으로 2회 농축된 바이러스를 넣어준 배양액으로 THP-1 세포의 배양액을 변경하여 형질도입의 효율을 증가시켰다. 마지막 배양액 교체 후, 24시간이 지난 다음, 형질도입한 THP-1 세포의 일부를 형질도입 효율 측정에 사용하였다. 형질도입 효율은 세포 내부의 GFP 발현량을 유세포 분석을 이용해 측정했으며, 4종의 재조합 키메릭 항원 수용체 발현 벡터가 각각 형질도입된 THP-1 세포 (BAFF CAR)를, empty vetor (Mock)를 형질도입한 THP-1 세포의 형질도입 비율과 비교한 결과를 도 15에 나타내었다.

실시예 5. 키메릭 항원 수용체와 BAFF 수용체, BCMA , TACI를 발현하는 사람 세포주의 친화도 측정

상기 제작한 키메릭 항원 수용체가 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 사람 세포주와 친화도가 있는지 확인하기 위하여, 실시예 4에서 제작한 4종의 BAFF CAR-pAPC [3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer), 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer), 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer), 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer)] 발현 전문적 항원표출세포 각각이 BAFF 수용체, BCMA, TACI와 결합하는지 여부를 측정하기 위해, 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG (Acrobiosystems), 수용성 재조합 BCMA IgG (R&D systems), 수용성 재조합 TACI IgG (R&D systems) 각각을 BAFF CAR-pAPC에 처리하여 유세포 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과, 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG, 수용성 재조합 BCMA IgG, 수용성 재조합 TACI IgG 모두는 Mock pAPC와 결합하지 않지만, BAFF CAR-pAPC와 결합하였다. 도 16a 내지 16c는 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포와 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG, 수용성 재조합 BCMA IgG, 수용성 재조합 TACI IgG와의 결합을 나타낸 것이고, 도 17a 내지 17c는 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포와 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG, 수용성 재조합 BCMA IgG, 수용성 재조합 TACI IgG와의 결합을 나타낸 것이고, 도 18a 내지 18c는 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 전문적 항원표출세포와 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG, 수용성 재조합 BCMA IgG, 수용성 재조합 TACI IgG와의 결합을 나타낸 것이고, 도 19a 내지 19c는 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 전문적 항원표출세포와 수용성 재조합 human BAFF 수용체 IgG, 수용성 재조합 BCMA IgG, 수용성 재조합 TACI IgG와의 결합을 나타낸 것이다.

상기 결과를 근거로 제작한 키메릭 항원 수용체를 발현하는 BAFF CAR-pAPC를 작동세포(effector cell)로 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 CHO 세포주를 표적세포(target cell)로, BAFF CAR-pAPC의 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI 특이적 세포독성을 검증하였다.

실시예 6. BAFF 수용체, BCMA , TACI를 발현하는 CHO 세포와의 공배양을 통한 BAFF 수용체, BCMA , TACI 특이적 세포독성 검증

상기 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 THP-1 세포 4종[3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer), 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer), 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer), 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer)]이 BAFF 수용체, BCMA, TACI를 발현하는 CHO 세포를 선택적으로 인지하여 독성을 나타내는지 확인하기 위해 실시예 3에서 선정한 타겟 세포인 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포를, 키메릭 항원 수용체 발현 THP-1 세포 4종 혹은 공벡터를 도입한 THP-1 세포(Mock)와 공배양하였다. 공배양 후, 24시간 혹은 48시간 뒤에 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)를 처리하여 7-AAD의 형광 발현양을 유세포 분석으로 비교하여 각 키메릭 항원 수용체 발현 THP-1 세포의 세포독성을 측정하였다. 7-Aminoactinomycin D (7-AAD)는 세포자살(apoptosis)이 유도된 세포의 DNA와 결합하여 형광을 띠게 된다(Zembruski et al., 2012).

먼저, 24 well 세포 배양 접시의 well에 키메릭 항원 수용체 발현 THP-1 세포 4종 각각을 5Х10⁵로 분주하고, 표적세포인 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포를 1Х10⁵씩 분주하여 effector: target ratio가 5:1로 공배양 진행하였다. 공배양의 well당 부피는 1ml가 되도록 진행하였고, 원심분리기를 이용해 250g에서 4분 동안 원심분리하여 세포 간 간격을 가깝게 만들었다. 그 후, 24시간 또는 48시간 공배양 진행 후 각 well의 세포를 원심분리기를 이용하여 300g, 3분 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤, 7-AAD (Biolegend)로 세포를 염색하였다. 그 후 유세포 분석을 이용하여 7-AAD에 의해 형광을 나타내는 세포의 비율을 측정하여 제작한 키메릭 항원 수용체 발현 THP-1 세포 4종의 세포독성을 정도를 정량화하였다.

그 결과 도 20 및 도 21에서 나타낸 바와 같이, 상기 제작한 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 THP-1 세포를 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포와 공배양 후 24시간이 지났을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)는 7.12% 이하의 세포독성을 보인 반면 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 21.0% 이상의 세포독성을 보임을 확인하였다. 또한, 공배양 48시간 후 공배양한 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포의 세포독성을 확인해 보았을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)의 경우 17.2% 이하의 세포독성을 보인 반면, 3-4-3 BAFF CAR (TLR-3+TLR-4+FcεRIγ ITAM trimer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 45.4% 이상의 세포독성을 보였다.

다른 결과로 도 22 및 도 23에서 나타낸 바와 같이, 상기 제작한 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 THP-1 세포를 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포와 공배양 후 24시간이 지났을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)는 7.12% 이하의 세포독성을 보인 반면 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 23.7% 이상의 세포독성을 보임을 확인하였다. 또한, 공배양 48시간 후 공배양한 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포의 세포독성을 확인해 보았을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)의 경우 17.2% 이하의 세포독성을 보인 반면, 3-4-2A BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2Aα ITAM trimer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 43.0% 이상의 세포독성을 보였다.

또 다른 결과로 도 24 및 도 25에서 나타낸 바와 같이, 상기 제작한 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 THP-1 세포를 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포와 공배양 후 24시간이 지났을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)는 7.12% 이하의 세포독성을 보인 반면 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 25.7% 이상의 세포독성을 보임을 확인하였다. 또한, 공배양 48시간 후 공배양한 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포의 세포독성을 확인해 보았을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)의 경우 17.2% 이하의 세포독성을 보인 반면, 3-4-1B BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcεRIβ ITAM trimer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 45.1% 이상의 세포독성을 보였다.

또 다른 결과로, 도 26 및 도 27에 나타낸 바와 같이, 상기 제작한 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 THP-1 세포를 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포와 공배양 후 24시간이 지났을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)는 7.12% 이하의 세포독성을 보인 반면 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 18.8% 이상의 세포독성을 보임을 확인하였다. 또한, 공배양 48시간 후 공배양한 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포의 세포독성을 확인해 보았을 때, 키메릭 항원 수용체를 발현하지 않는 THP-1 세포(Mock pAPC)의 경우 17.2% 이하의 세포독성을 보인 반면, 3-4-ABC BAFF CAR (TLR-3+TLR4+FcγR2A ITAM monomer+FcεRIβ ITAM monomer+FcγR2Aα ITAM monomer) 발현 THP-1 세포는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 각각의 CHO 세포 모두 50.4% 이상의 세포독성을 보였다.

이를 통해 제작한 키메릭 항원 인지 수용체 발현 THP-1 세포가 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI 단백질에 특이적인 세포독성을 보임을 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 키메릭 항원 수용체를 포함한 형질전환된 THP-1 세포가 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI 단백질에 특이적인 세포독성을 보임으로써, 상기 형질전환된 항원 특이적 전문적 항원표출세포를 이용하여 관련된 암 세포 치료가 가능함을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> IMMUNOLOGICAL DESIGNINGLAB CO., LTD <120> BAFF.CAR-MAC <130> KP21-0034-ILDL <160> 20 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 218 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BAFF Extracellular domain <400> 1 Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu 1 5 10 15 Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys 20 25 30 Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe 35 40 45 Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg Asn 50 55 60 Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu 65 70 75 80 Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr 85 90 95 Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu 100 105 110 Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile 115 120 125 Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu 130 135 140 Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val 145 150 155 160 Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn 165 170 175 Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu 180 185 190 Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp 195 200 205 Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 210 215 <210> 2 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 heavy chain constant region <400> 2 Gly Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 165 170 175 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 180 185 190 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 195 200 205 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 210 215 220 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 3 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-3 TIR domain <400> 3 Phe Glu Tyr Ala Ala Tyr Ile Ile His Ala Tyr Lys Asp Lys Asp Trp 1 5 10 15 Val Trp Glu His Phe Ser Ser Met Glu Lys Glu Asp Gln Ser Leu Lys 20 25 30 Phe Cys Leu Glu Glu Arg Asp Phe Glu Ala Gly Val Phe Glu Leu Glu 35 40 45 Ala Ile Val Asn Ser Ile Lys Arg Ser Arg Lys Ile Ile Phe Val Ile 50 55 60 Thr His His Leu Leu Lys Asp Pro Leu Cys Lys Arg Phe Lys Val His 65 70 75 80 His Ala Val Gln Gln Ala Ile Glu Gln Asn Leu Asp Ser Ile Ile Leu 85 90 95 Val Phe Leu Glu Glu Ile Pro Asp Tyr Lys Leu Asn His Ala Leu Cys 100 105 110 Leu Arg Arg Gly Met Phe Lys Ser His Cys Ile Leu Asn Trp Pro Val 115 120 125 Gln Lys Glu Arg Ile Gly Ala Phe Arg His Lys Leu Gln Val Ala 130 135 140 <210> 4 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-4 TIR domain <400> 4 Asn Ile Tyr Asp Ala Phe Val Ile Tyr Ser Ser Gln Asp Glu Asp Trp 1 5 10 15 Val Arg Asn Glu Leu Val Lys Asn Leu Glu Glu Gly Val Pro Pro Phe 20 25 30 Gln Leu Cys Leu His Tyr Arg Asp Phe Ile Pro Gly Val Ala Ile Ala 35 40 45 Ala Asn Ile Ile His Glu Gly Phe His Lys Ser Arg Lys Val Ile Val 50 55 60 Val Val Ser Gln His Phe Ile Gln Ser Arg Trp Cys Ile Phe Glu Tyr 65 70 75 80 Glu Ile Ala Gln Thr Trp Gln Phe Leu Ser Ser Arg Ala Gly Ile Ile 85 90 95 Phe Ile Val Leu Gln Lys Val Glu Lys Thr Leu Leu Arg Gln Gln Val 100 105 110 Glu Leu Tyr Arg Leu Leu Ser Arg Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Glu Asp 115 120 125 Ser Val Leu Gly Arg His Ile Phe Trp Arg Arg Leu Arg Lys Ala Leu 130 135 140 Leu Asp Gly 145 <210> 5 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM of IgE receptor gamma chain <400> 5 Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly Val Tyr Thr Gly Leu Ser 1 5 10 15 Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu Lys His Glu 20 25 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM of IgG receptor 2A alpha chain <400> 6 Asp Gly Gly Tyr Met Thr Leu Asn Pro Arg Ala Pro Thr Asp Asp Asp 1 5 10 15 Lys Asn Ile Tyr Leu Thr Leu 20 <210> 7 <211> 29 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM of IgE receptor beta chain <400> 7 Lys Val Pro Glu Asp Arg Val Tyr Glu Glu Leu Asn Ile Tyr Ser Ala 1 5 10 15 Thr Tyr Ser Glu Leu Glu Asp Pro Gly Glu Met Ser Pro 20 25 <210> 8 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 8 Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 9 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-2 transmembrane domain <400> 9 Ala Leu Val Ser Gly Met Cys Cys Ala Leu Phe Leu Leu Ile Leu Leu 1 5 10 15 Thr Gly Val Leu Cys 20 <210> 10 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-4 Signal peptide <400> 10 Met Met Ser Ala Ser Arg Leu Ala Gly Thr Leu Ile Pro Ala Met Ala 1 5 10 15 Phe Leu Ser Cys Val Arg Pro 20 <210> 11 <211> 654 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BAFF Extracellular domain <400> 11 caggtggccg ccctgcaagg ggacctggcc agcctccggg cagagctgca gggccaccac 60 gcggagaagc tgccagcagg agcaggagcc cccaaggccg gcctggagga agctccagct 120 gtcaccgcgg gactgaaaat ctttgaacca ccagctccag gagaaggcaa ctccagtcag 180 aacagcagaa ataagcgtgc cgttcagggt ccagaagaaa cagtcactca agactgcttg 240 caactgattg cagacagtga aacaccaact atacaaaaag gatcttacac atttgttcca 300 tggcttctca gctttaaaag gggaagtgcc ctagaagaaa aagagaataa aatattggtc 360 aaagaaactg gttacttttt tatatatggt caggttttat atactgataa gacctacgcc 420 atgggacatc taattcagag gaagaaggtc catgtctttg gggatgaatt gagtctggtg 480 actttgtttc gatgtattca aaatatgcct gaaacactac ccaataattc ctgctattca 540 gctggcattg caaaactgga agaaggagat gaactccaac ttgcaatacc aagagaaaat 600 gcacaaatat cactggatgg agatgtcaca ttttttggtg cattgaaact gctg 654 <210> 12 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 heavy chain constant region <400> 12 ggatccgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 60 ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 120 tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 180 aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 240 gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 300 ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 360 aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 420 tcacgagatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 480 cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 540 acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 600 aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 660 aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 702 <210> 13 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-3 TIR domain <400> 13 tttgaatatg cagcatatat aattcatgcc tataaagata aggattgggt ctgggaacat 60 ttctcttcaa tggaaaagga agaccaatct ctcaaatttt gtctggaaga aagggacttt 120 gaggcgggtg tttttgaact agaagcaatt gttaacagca tcaaaagaag cagaaaaatt 180 atttttgtta taacacacca tctattaaaa gacccattat gcaaaagatt caaggtacat 240 catgcagttc aacaagctat tgaacaaaat ctggattcca ttatattggt tttccttgag 300 gagattccag attataaact gaaccatgca ctctgtttgc gaagaggaat gtttaaatct 360 cactgcatct tgaactggcc agttcagaaa gaacggatag gtgcctttcg tcataaattg 420 caagtagca 429 <210> 14 <211> 441 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-4 TIR domain <400> 14 aacatctatg atgcctttgt tatctactca agccaggatg aggactgggt aaggaatgag 60 ctagtaaaga atttagaaga aggggtgcct ccatttcagc tctgccttca ctacagagac 120 tttattcccg gtgtggccat tgctgccaac atcatccatg aaggtttcca taaaagccga 180 aaggtgattg ttgtggtgtc ccagcacttc atccagagcc gctggtgtat ctttgaatat 240 gagattgctc agacctggca gtttctgagc agtcgtgctg gtatcatctt cattgtcctg 300 cagaaggtgg agaagaccct gctcaggcag caggtggagc tgtaccgcct tctcagcagg 360 aacacttacc tggagtggga ggacagtgtc ctggggcggc acatcttctg gagacgactc 420 agaaaagccc tgctggatgg t 441 <210> 15 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM of IgE receptor gamma chain <400> 15 gctataacca gctatgagaa atcagatggt gtttacacgg gcctgagcac caggaaccag 60 gagacttacg agactctgaa gcatgag 87 <210> 16 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM of IgG receptor 2A alpha chain <400> 16 gacggcggct acatgactct gaaccccagg gcacctactg acgatgataa aaacatctac 60 ctgactctt 69 <210> 17 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITAM of IgE receptor beta chain <400> 17 aaggttccag aggatcgtgt ttatgaagaa ttaaacatat attcagctac ttacagtgag 60 ttggaagacc caggggaaat gtctcct 87 <210> 18 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flexible linker <400> 18 ggtggcggtg gctcg 15 <210> 19 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-2 transmembrane domain <400> 19 gcactggtgt ctggcatgtg ctgtgctctg ttcctgctga tcctgctcac cggtgtcctg 60 tgc 63 <210> 20 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hTLR-4 Signal peptide <400> 20 atgatgtctg cctcgcgcct ggctgggact ctgatcccag ccatggcctt cctctcctgc 60 gtgagacca 69

Claims (16)

1. 키메릭 항원 수용체(CAR)를 포함하는 형질전환된 세포로서,
   상기 키메릭 항원 수용체는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 항원 결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함하며, 상기 세포는 표적화된 효과기 활성을 갖는 항원 특이적 전문적 항원표출세포로서 대식세포, 수지상세포 또는 미감작 B 세포(naive B cell)를 포함하는, 형질전환된 세포.
2. 제1항에 있어서,
   상기 항원 결합 도메인은 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI에 특이적으로 결합하는 BAFF(B-cell activating factor)의 세포외 도메인인 것인, 형질전환된 세포.
3. 제2항에 있어서,
   상기 BAFF의 세포외 도메인은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 형질전환된 세포.
4. 제2항에 있어서,
   상기 항원 결합 도메인은 BAFF의 세포외 도메인 한 쌍이 이합체(dimer)의 형태로 각각 인간 이뮤노글로불린 G₁ 중쇄 불변 영역(IgG₁ heavy chain constant region)에 연결된 것을 특징으로 하는 형질전환된 세포.
5. 제4항에 있어서,
   인간 이뮤노글로불린 G₁ 중쇄 불변 영역(IgG₁ heavy chain constant region)은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 형질전환된 세포.
6. 제1항에 있어서,
   상기 세포 내 신호전달 도메인은 TLR-3-TLR-4의 구성에, 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프(immunoreceptortyrosine-based activation motif, ITAM)를 소단위(subunit)로 하여 링커(linker)로 연결시킨 것인, 형질전환된 세포.
7. 제6항에 있어서,
   상기 ITAM은 IgE 수용체 gamma chain (Fcε receptor I gamma chain, FcεRIγ), IgG 수용체 2A alpha chain (Fcγ receptor 2A alpha chain, FcγR2Aα) 또는 IgE 수용체 beta chain (Fcε receptor I beta chain, FcεRIβ)의 면역수용체 타이로신 기반 활성화 모티프인 것인, 형질전환된 세포.
8. 제6항에 있어서,
   상기 ITAM은 링커로 3개를 연결시킨 것인, 형질전환된 세포.
9. 제6항에 있어서,
   상기 TLR-3는 서열번호 3; 및 TLR-4는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 형질전환된 세포.
10. 제6항에 있어서,
    상기 ITAM은 서열번호 5; 서열번호 6; 또는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 형질전환된 세포.
11. 제6항에 있어서,
    상기 링커는 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 형질전환된 세포.
12. 제1항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 TLR-2이며, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 형질전환된 세포.
13. 제1항에 있어서,
    상기 키메릭 항원 수용체는 신호 펩타이드를 포함하며, 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인, 형질전환된 세포.
14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 세포를 유효성분으로 포함하는 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암 또는 전신 홍반성 루프스(systemic lupus erythematosus, SLE)의 치료용 약학적 조성물.
15. 제14항에 있어서,
    상기 BAFF 수용체, BCMA 또는 TACI를 발현하는 암은 급성림프아구성백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL), 만성림프아구성백혈병(chronic lymphoblastic leukemia, CLL), 여포성 림프종(follicular lymphoma), 외투세포림프종(mantle cell lymphoma), B 세포 림프종(B-cell lymphoma), 광범위큰 B 세포 림프종(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL), B 세포 비호지킨림프종(B-cell non-Hodgkin lymphoma), 다발성 골수종(multiple myeloma), T 세포 림프종(T cell lymphoma), 유방암(breast cancer), 갑상선암(thyroid carcinoma) 및 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 세포를 유효성분으로 포함하는 세포 치료제.
    

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