KR102575681B1 - 공자극 및 체크포인트 수용체에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 이중특이적, 면역조절 항체에 관한 것이다.

Description

공자극 및 체크포인트 수용체에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2016년 8월 30일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/381,239호, 2017년 2월 7일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/456,033호, 2017년 3월 31일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/479,723호 및 2017년 6월 14일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 제15/623,314호에 대해 우선권을 주장하며, 그 내용은 명시적으로 그 전체가 참조로 완전히 포함된다.

서열 목록

본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었던 서열 목록을 포함하고 본원에 그 전체가 참조로 포함된다. 2017년 8월 29일에 생성된 상기 ASCII 사본은 067461_5198-WO_SL.txt로 명명되고 크기는 26,061,282 킬로바이트이다.

종양-반응성 T 세포는 PD-1 및 CTLA-4와 같은 억제 면역 체크포인트의 상향 조절로 인해 시간이 경과함에 따라 이들의 세포 독성능을 상실한다. 이들이 종양 세포를 계속 살상할 수 있도록 종양 반응성 T 세포의 발현을 활성화하는 2개의 병행 치료 전략이 추구되고 있다.

제1 접근법은 면역조절 자체(PD-1, CTLA-4 등) 또는 그 리간드(PD-L1, PD-L2, CD80, CD86 등)에 결합하는 길항 단일클론 항체로 처치함으로써, 종양 세포 살상으로부터 종양-반응성 T 세포를 억제하는 억제 신호를 제거하는 면역성의 면역조절 차단(blockade)이다. CTLA-1, PD-1(예정 세포사 1), TIM-3(T 세포 면역글로블린 및 뮤신 도메인 3), LAG-3(림프구 활성화 유전자 3), TIGIT(Ig를 가진 T 세포 면역수용체 및 ITIM 도메인), 및 다른 것들과 같은 면역조절 수용체는 T 세포 및 다른 세포 유형의 활성화, 증식 및/또는 이펙터(effector) 활동을 억제한다. 면역조절 수용체가 종양 세포에 대해 내인성 T 세포 반응을 억제한다는 가설에 근거하여, 니볼루맙(nivolumab), 펨블로리쥬맙(pembrolizumab), 이필리뮤맙(ipilimumab) 및 트리메리뮤맙(tremelimumab)을 포함하는, 항-CTLA4 및 항-PD1 항체의 전임상 및 임상 연구는 실제로 면역조절 차단이 내인성 T 세포를 자극하여 종양 세포를 공격하게 하는 인상적인 항-종양 반응를 야기하여, 다양한 악성 종양을 갖는 환자의 일부에서 장기적인 암 치료를 초래한다는 것을 입증하였다. 불행히도, 환자의 일 부분만이 이들 치료법에 반응하며, 반응률은 일반적으로 증상 및 다른 요인에 따라, 범위가 각각의 단일 요법에 대해 10% 내지 30%에 이르거나 때때로 더 높다.

종양-반응성 T 세포의 발현을 활성화하기 위한 제2 접근법은 ICOS와 같은 공자극 단백질에 결합하는 작용 항체로 치료함으로써, 양성 신호를 추가하여 면역 체크포인트의 음성 시그널링을 극복하는 T 세포 공자극이다.

따라서, 본 발명은 공자극 수용체(예를 들어, ICOS, GITR, OX40, 4-1BB)뿐만 아니라 체크포인트 수용체(예를 들어, PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIM-3, BTLA 및 TIGIT)에 결합하는 이중특이적 항체에 관한 것이다.

따라서, 일 양태에서, 본 발명은 인간 공자극 수용체에 1가 결합하고 암의 처치를 위해 T 세포를 활성화시키는데 사용하기 위해 인간 체크포인트 수용체에 1가 결합하는 이중특이적 항체를 제공한다.

일부 양태에서, 공자극 수용체는 ICOS, GITR, OX40 및 4-1BB로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

추가적 양태에서, 체크포인트 수용체는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, LAG-3, TIGIT 및 TIM-3으로 구성되는 그룹으로부터 선택된다.

추가적 양태에서, 항체는 다음으로부터 선택되는 항원 쌍에 결합한다: ICOS 및 PD-1, ICOS 및 CTLA-4, ICOS 및 LAG-3, ICOS 및 TIM-3, ICOS 및 PD-L1, ICOS 및 BTLA, ICOS 및 TIGIT, GITR 및 TIGIT, GITR 및 PD-1, GITR 및 CTLA-4, GITR 및 LAG-3, GITR 및 TIM-3, GITR 및 PD-L1, GITR 및 BTLA, OX40 및 PD-1, OX40 및 TIGIT, OX40 및 CTLA-4, IC OX40 OS 및 LAG-3, OX40 및 TIM-3, OX40 및 PD-L1, OX40 및 BTLA, 4-1BB 및 PD-1, 4-1BB 및 CTLA-4, 4-1BB 및 LAG-3, 4-1BB 및 TIM-3, 4-1BB 및 PD-L1, TIGIT 및 4-1BB 및 4-1BB 및 BTLA.

추가적 양태에서, 이중특이적 항체는 도 2a-2n에 개설된 것들로부터 선택되는 형태(format)를 갖는다.

추가적 양태에서, 본 발명은 이종이량체(heterodimeric) 항체를 제공하며, 이종이량체 항체는: a) 제1 Fc 도메인, 선택적 도메인 링커 및 제1 항원과 결합하는 scFv를 포함하는제1 항원 결합 도메인을 포함하는 제1 중쇄; b) 제2 Fc 도메인, 힌지 도메인, CH1 도메인 및 가변 중쇄 도메인을 포함하는 중쇄 불변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 제2 중쇄; 및 c) 가변 경쇄 도메인 및 경쇄 불변(constant) 도메인을 포함하는 경쇄를 포함하며; 상기 가변 중쇄 도메인 및 상기 가변 경쇄 도메인은 제2 항원에 결합하는 제2 항원 결합 도메인을 형성하며, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인 중 하나는 인간 ICOS에 결합하고 다른 것은 인간 PD-1에 결합한다.

추가적 양태에서, 본 발명은 이종이량체 이중특이적 항체를 제공하며, 이종이량체 이중특이적 항체는: a) 제1 중쇄로서, 상기 제1 중쇄는: i) 제1 변이체 Fc 도메인; 및 ii) 제1 항원에 결합하는 단일 사슬 Fv 영역(scFv)을 포함하며, 상기 scFv 영역은 제1 가변 중쇄, 가변 경쇄 및 하전된 scFv 링커를 포함하되, 상기 하전된 scFv 링커는 상기 제1 가변 중쇄 및 상기 가변 경쇄를 공유결합으로 부착시키는 상기 제1 중쇄; 및 b) VH-CH1-힌지-CH2-CH3 단량체를 포함하는 제2 중쇄로서, VH는 제2 가변 중쇄이고 CH2-CH3는 제2 변이체 Fc 도메인인 상기 제2 중쇄; 및 c) 경쇄를 포함하며; 상기 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N241D를 포함하고, 상기 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 각각 아미노산 치환 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하고; 상기 제1 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 S364K/E357Q를 포함하고, 제2 변이체 Fc 도메인은 아미노산 치환 L368D/K370S를 포함하되, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인 중 하나는 인간 ICOS와 결합하고 다른 것은 인간 PD-1와 결합하고, 넘버링은 카밧(Kabat)의 경우와 같이 EU 인덱스에 따른다.

일부 양태에서, 이종이량체 항체는 M428L/N434S를 각각 포함하는 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인을 갖는다.

추가적 양태에서, 본 발명은 이종이량체 항체를 제공하며, 상기 이종이량체 항체는: a) 제1 중쇄로서, 제1 중쇄는: i) 제1 변이체 Fc 도메인; 및 ii) 제1 항체에 결합하는 단일 사슬 Fv 영역(scFv)을 포함하며, 상기 scFv 영역은 제1 가변 중쇄, 가변 경쇄 및 하전된 scFv 링커를 포함하되, 상기 하전된 scFv 링커는 상기 제1 가변 중쇄 및 상기 가변 경쇄를 공유결합으로 부착하는, 상기 제1 중쇄; 및 b) VH-CH1-힌지-CH2-CH3 단량체를 포함하는 제2 중쇄로서, VH는 제2 가변 중쇄이고 CH2-CH3는 제2 변이체 Fc 도메인인, 상기 제2 중쇄; 및 c) 경쇄를 포함하며; 상기 제1 및 제2 변이체 Fc 도메인은 L368D/K370S:S364K/E357Q; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411E/K360E/Q362E:D401K; 및 T366S/L368A/Y407V:T366W으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 한 세트의 이종이량체화(heterodimerization) 변이체를 포함하고, 상기 제1 및 제2 항원 결합 도메인 중 하나는 인간 ICOS와 결합하고 다른 것은 인간 PD-1와 결합하고, 넘버링은 카밧(Kabat)의 경우와 같이 EU 인덱스에 따른다.

추가적 양태에서, 본 발명은 본 발명의 이종이량체 항체를 인코딩하는 핵산을 포함하는 핵산 조성물, 핵산을 포함하는 발현 벡터 조성물, 및 발현 벡터 조성물을 포함하는 숙주 세포를 제공한다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 암의 치료를 위해 T 세포의 활성화에 사용하기 위해 이종이량체 항체를 제공한다.

도 1은 TCGA(The Cancer Genome Atlas)로부터 컴파일링된 방광암, 유방암, 결장암, 두경부암, 신장암, 폐-아데노암, 폐 편평 상피암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 흑색종암에 대한 PD-1 및 T 세포의 공자극 수용체의 발현 데이터(RNAseq V2 RSEM)를 제시한다. 피어슨 상관 계수의 제곱은 T 세포 공자극 수용체에 대한 PD-1에 대해 계산되었다.
도 2a-도 2n은 본 발명의 이중특이적 항체에 대한 수개의 형태를 도시한다. 첫 번째는 제1 및 제2 항-항원 결합 도메인을 갖는, "병따개" 형태이다. 추가적으로, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 하나의 scFv-mAb, scFv-mAb 이중 scFv 형태가 모두 나타낸다. 도 2j는 2개의 Fab-scFv 팔을 갖는, "중심-scFv2" 형태를 도시하며, 여기서 Fab는 제1 항원과 결합하고 scFv는 제2 항원과 결합한다. 도 2k는 이중특이적 mAb 형태를 도시하며, 제1 Fab 팔은 제1 항원과 결합하고 제2 Fab 팔은 제2 항원과 결합한다. 도 2l은 DVD-IgG 형태를 도시한다(예를 들어, 본원에 참조로 명시적으로 통합되고 아래에 설명되는 바와 같은 미국 특허 번호 제7,612,181호 참조). 도 2m은 트라이던트(trident) 형태를 도시한다(예를 들어, 본원에 참조로 명시적으로 통합되고 아래에 설명되는 바와 같은 WO 2015/184203 참조). 나타낸 모든 scFv 도메인에 대해, 이들은 N- 내지 C-말단 가변 중쇄-(선택적 링커)-가변 경쇄, 또는 그 반대일 수 있다. 게다가, 외팔형 scFv-mAb의 경우, scFv는 중쇄 단량체의 N-말단 또는 경쇄의 N-말단에 부착될 수 있다.
도 3a-3b는 XENP23104, 즉 Fab 측([ICOS]_H0.66_L0)으로서 ICOS 및 scFv(1G6_L1.94_H1.279)로서 PD-1을 갖는 병따개 형태의 서열을 도시하고, 혈청 반감기를 연장하기 위한 M428L/434S 변이체를 포함한다. CDR은 언더라인되고, scFv 링커는 이중 언더라인되고(서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv(GKPGS)₄ 링커이지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이러한 링커는 비하전, 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 그 일부는 도 8에 도시되고), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)을 나타낸다. 게다가, 명명 규칙은 N-말단으로부터 C-말단으로의 scFv의 배향을 예시하며; 본원에서 서열 중 일부는 (N-말단으로부터 C-말단으로) V_H-scFv 링커-V_L로서 배향되는 반면, 일부는 (N-말단으로부터 C-말단으로) V_L-scFv 링커-V_H로 배향되지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 서열은 또한 본원에서 이들의 도시로부터 반대 방위으로 사용될 수 있다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 V_H 및 V_L 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 4a-4f는 (스큐 및 pI 변이체를 포함하는) 이종이량체 변이체 세트의 유용한 쌍을 도시한다. 도 4c및 도 4f 상에, 대응하는 "단량체 2" 변이체가 없는 변이체가 있으며; 이들은 예를 들어, 단량체 상에서 단독으로 사용되거나, 병따개의 Fab 측 상에 포함될 수 있는 pI 변이체이고, 적절히 하전된 scFv 링커는 제2 항원 결합 도메인으로서 scFv를 이용하는 제2 단량체 상에서 사용될 수 있다. 적절히 하전된 링커가 도 8에 나타낸다.
도 5는 등방성 변이체 항체 불변 영역 및 그 각각의 치환의 목록을 도시한다. pI_(-)는 하등(lower) pI 변이체를 나타내는 반면, pI_(+)는 고등(higher) pI 변이체를 나타낸다. 이들은 선택적이고 독립적으로 본 발명의 다른 이종이량체(및 본원에 개설된 바와 같은, 또한 다른 변이체 유형)와 결합될 수 있다.
도 6은 (때때로 "녹아웃(knock outs)" 또는 "KO" 변이체로서 지칭되는) FcγR 결합을 절제하는 유용한 절제 변이체(ablation variant)를 도시한다. 일반적으로, 절제 변이체는 두 단량체 상에서 발견되지만, 일부 경우에서 이들은 하나의 단량체 상에만 있을 수 있다.
도 7a-7b는 본 발명의 2개의 특별히 유용한 구현예를 도시한다. 본 구현예의 "비-Fv" 구성요소(component)가 도 9a에 도시되지만, 도 9의 다른 형태가 또한 사용될 수 있다.
도 8a 및 도 8b는 구성요소로서 하나 이상의 scFv를 이용하는 이종이량체 항체의 pI를 증가 또는 감소시킬시 사용되는 다수의 하전된(charged) scFv 링커를 도시한다. (+H) 양성 링커가 본원에서 특히 사용된다. 단일 전하를 갖는 단일 선행 기술 scFv 링커는 Whitlow 등의 Protein Engineering 6 (8):989-995 (1993)로부터의, "Whitlow"와 같은 참조(reference)이다. 이러한 링커는 scFv에서 응집을 줄이고 단백질 분해 안정성을 향상시키기 위해 사용되었다는 점에 유의해야 한다.
도 9a-9d는 Fv 서열(예를 들어, Fab 측에 대한 scFv 및 vh 및 vl)이 없는, 인간 IgG1에 기초한 수개의 유용한 병따개 형태 백본의 서열을 도시한다. 병따개 백본 1은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)에 기초하고, S364K/E357Q: L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병따개 백본 2는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)에 기초하고, 상이한 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병따개 백본 3은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)에 기초하고, 상이한 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병따개 백본 4는 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)에 기초하고, 상이한 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병따개 백본 5는 인간 IgG1(356D/358L 알로타입)에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 병따개 백본 6은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234VL235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐만 아니라, 두 사슬 상의 N297A 변이체를 포함한다. 병따개 백본 7은 돌연변이가 N297S인 것을 제외하고는 6과 동일하다. 병따개 백본 6 및 7의 대안적인 형태는 두 사슬 모두에서 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 배제할 수 있다. 백본 8은 인간 IgG4에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐만 아니라, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같은 Fab 팔 교환을 제거하는 두 사슬 상의 S228P(EU 넘버링, 이것은 Kabat에서 S241P임) 변이체를 포함한다. 병따개 백본 8의 대안적인 형태는 두 사슬에서 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 배제할 수 있다. 백본 9는 인간 IgG2에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체를 포함한다. 백본 10은 인간 IgG2에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 뿐만 아니라 두 사슬 상의 S267K 변이체를 포함한다.
당업자에 의해 주지되고 아래에 개설되는 바와 같이, 이들 서열은 본원에 개설되는 임의의 vh 및 vl 쌍과 함께 사용될 수 있으며, 하나의 단량체는 scFv(선택적으로, 하전된 scFv 링커를 포함함)를 포함하고 다른 단량체는 Fab 서열(예를 들어, "Fab 측 중쇄"에 부착되는 vh 및 "불변 경쇄"에 부착되는 vl)을 포함한다. 즉, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-LAG-3, 항-TIM-3, 항-TIGIT 및 항-BTLA에 대해 본원에 개설되는 임의의 Fv 서열은 scFv(다시, 선택적으로, 하전된 scFv 링커를 가짐) 또는 Fab로서든, 임의의 조합으로 이들 도 37의 백본에 통합될 수 있다. 도 9a에 나타낸 불변(constant) 경쇄는 도면의 모든 구조에 대해 사용될 수 있지만, 카파(kappa) 불변 경쇄가 또한 치환될 수 있다.
이들 병따개 백본은 도 1의 중심-scFv 형태로 사용되고, 여기서 추가적인, 제1 Fab와 동일한 항원 결합을 갖는 제2 Fab(vh-CH1 및 vl-불편 경쇄)가 "병따개 측" 상의 N-말단에 추가된다는 점에 유의해야 한다.
인용된 서열과 (본원에 정의된 바와 같이) 90, 95, 98 및 99% 동일하고/하거나, (당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이미 모체의 인간 IgG1(또는 백본에 따라, IgG2 또는 IgG4)와 비교하여 다수의 아미노산 변형을 포함하는, 도의 '모체(parent)"와 비교하여) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 서열이 이들 백본 각각 내에 포함된다. 즉, 인용된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 함유되는 스큐, pI 및 절제 변이체에 더하여 추가적인 아미노산 변형(일반적으로 아미노산 치환)을 함유할 수 있다.
도 10a-10e는 항-PD-1 항체의 선택 번호에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열은 도 6a에 도시되는 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267K ')와 함께, 인간 IgG1에 기초하여 생성되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다. CDR은 언더라인된다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 번호 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 11a-11e는 PD-1 ABD의 선택 번호를 도시하며, 추가적인 항-PD-1 ABD는 SEQ 1-2392, 3125-3144, 4697-7594 및 4697-21810으로 열거된다. CDR은 언더라인되고, scFv 링커는 이중 언더라인이고(서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv(GKPGS)₄ 링커이지만 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이러한 링커는 비하전, 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 그 중 일부는 도 8에 도시됨), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)을 나타낸다. 게다가, 명명 규칙은 N-말단으로부터 C-말단으로의 scFv의 배향을 예시하며; 이러한 도면의 서열 중 일부는 (N-말단으로부터 C-말단으로) VH-scFv 링커-VL로 배향되는 반면, 일부는 (N-말단으로부터 C-말단으로) VL-scFv 링커-VH로 배향되지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 서열은 또한 본원에서 이들의 도시로부터 반대 방위으로 사용될 수 있다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 더욱이, 도면의 모든 서열에 대해, 이들 VH 및 VL 서열은 scFv 형태 또는 Fab 형태로 사용될 수 있다.
도 12a-12pp는 CTLA-4 ABD의 선택 번호를 도시하며, 추가적인 항-CTLA-4 ABD는 SEQ ID NO: 2393-2414 및 3737-3816으로 열거된다. CDR은 언더라인되고, scFv 링커는 이중 언더라인되고(서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv(GKPGS)₄ 링커이지만 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이러한 링커는 비하전, 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 그 중 일부는 도 8에 도시됨), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)을 나타낸다. 게다가, 명명 규칙은 N-말단으로부터 C-말단으로의 scFv의 배향을 예시하며; 이러한 도면의 서열 중 일부는(N-말단으로부터 C-말단으로) VH-scFv 링커-VL로서 배향되는 반면, 일부는(N-말단으로부터 C-말단으로) VL-scFv 링커-VH로서 배향되지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 서열은 또한 본원에서 이들의 도시로부터 반대 방위으로 사용될 수 있다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 더욱이, 도면의 모든 서열에 대해, 이들 VH 및 VL 서열은 scFv 형태 또는 Fab 형태로 사용될 수 있다.
도 13a-13n은 LAG-3 ABD의 선택 번호를 도시하며, 추가적인 항-LAG-3 ABD는 SEQ ID NO: 2415-2604 및 3817-3960으로 열거된다. CDR은 언더라인되고, scFv 링커는 이중 언더라인이고(서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv(GKPGS)₄ 링커(SEQ ID NO: XXX)이지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이러한 링커는 비하전, 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 그 중 일부는 도 8에 도시됨), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)을 나타낸다. 게다가, 명명 규칙은 N-말단으로부터 C-말단으로의 scFv의 배향을 예시하며; 이러한 도면의 서열 중 일부는 (N-말단으로부터 C-말단으로) VH-scFv 링커-VL로 배향되는 반면, 일부는 (N-말단으로부터 C-말단으로) VL-scFv 링커-VH로 배향되지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 서열은 또한 본원에서 이들의 도시로부터 반대 방위으로 사용될 수 있다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 더욱이, 도면의 모든 서열에 대해, 이들 VH 및 VL 서열은 scFv 형태 또는 Fab 형태로 사용될 수 있다.
도 14a-14i는 항-TIM-3 항체의 선택 번호에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열은 다른 형태들이 또한 사용될 수 있지만 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267K")와 함께, 인간 IgG1 백본에 기초하여 생성되었다는 점을 유의하는 것이 중요하다. CDR은 언더라인된다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 V_H 및 V_L 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 15a-15c는 항-PD-L1 항체의 선택 번호에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열은 다른 형태들이 또한 사용될 수 있지만, 본원에서 개설된 바와 같은 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267K")와 함께, 인간 IgG1 백본에 기초하여 생성되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다. CDR은 언더라인된다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 16은 프로토타입 항-4-1BB 항체에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열은 다른 형태들이 또한 사용될 수 있지만, 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267K")와 함께, 인간 IgG1 백본에 기초하여 생성되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다. CDR은 언더라인된다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 17은 프로토타입 항-OX40 항체에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열은 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267K")와 함께, 인간 IgG1 백본에 기초하여 생성되었지만, 다른 형태들이 또한 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. CDR은 언더라인된다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 18은 프로토타입 항-GITR 항체에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열은 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267K")와 함께, 인간 IgG1 백본에 기초하여 생성되었지만, 다른 형태가 또한 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. CDR은 언더라인된다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 19a-19g는 프로토타입 항-ICOS 항체에 대한 서열을 도시한다. 이들 서열은 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, "IgG1_PVA_/S267K")와 함께, 인간 IgG1 백본에 기초하여 생성되었지만, 다른 형태가 또한 사용될 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요하다. CDR은 언더라인된다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 X에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다.
도 20a-20g는 예시적 항-ICOS Fab에 대한 서열을 도시한다. CDR은 언더라인되고 슬래시(/)는 변수 영역의 경계(들)을 나타낸다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 X에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 더욱이, 도면의 모든 서열에 대해, 이들 VH 및 VL 서열은 scFv 형태 또는 Fab 형태로 사용될 수 있다. 이러한 서열은 제거된, 중쇄의 C-말단에서 6-히스티딘(His6 또는 HHHHHH) (서열번호 28666) C-말단 태그를 사용하여 생성되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
도 21a-21b는 안정성을 위해 조작되는 변이체 항-ICOS Fab의 DSF에 의해 결정되는 바와 같은 모체 Fab(XENP22050)로부터의 용융 온도(T_m) 및 용융 온도의 변화를 도시한다.
도 22a-22c는 OCTET®에 의해 결정되는 바와 같이 AMC 바이오 센서 상에 캡처되는 인간 ICOS의 뮤린 Fc 융합체에 대한 변이체 항-ICOS Fab의 평형 해리 상수(equilibrium dissociation constant,KD), 결합 속도(association rate,ka), 및 해리 속도(dissociation rate, kd)를 도시한다.
도 23은 OCTET®에 의해 결정되는 바와 같이 SA 바이오 센서 상에 캡처되는 인간 ICOS의 비오틴화된(biotinylated) IgG1 Fc 융합체에 대한 변이체 항-ICOS Fab의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)를 도시한다.
도 24a-24m은 예시적인 항-ICOS scFv에 대한 서열을 도시한다. CDR은 언더라인되고, scFv 링커는 이중 언더라인이고(서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv(GKPGS)4 링커 (서열번호 28849)이지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이러한 링커는 비하전, 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 그 중 일부는 도 24a-24m에 도시됨), 슬래시(/)는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. 명명 규칙은 N-말단으로부터 C-말단으로의 scFv의 배향을 예시하며; 이러한 도면의 서열 중 일부는 (도 24a-24m를 참조하면, N-말단으로부터 C-말단으로) VH-scFv 링커-VL로 배향되는 반면, 일부는 (도 24b를 참조하면, N-말단으로부터 C-말단으로) VL-scFv 링커-VH로 배향되지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 서열은 또한 본원에서 이들의 도시로부터 반대 방위으로 사용될 수 있다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 X에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 상이할 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 넘버링 시스템을 사용하여 VH 및 VL 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 더욱이, 도면의 모든 서열에 대해, 이들 VH 및 VL 서열은 scFv 형태 또는 Fab 형태로 사용될 수 있다. 이들 서열은 제거된, 중쇄의 C-말단에서 폴리히스티딘(His6 또는 HHHHHH) (서열번호 28666) C-말단 태그를 사용하여 생성되었다는 점에 유의하는 것이 중요하다.
도 25는 안정성을 위해 조작되는 변이체 항-ICOS scFv의 DSF에 의해 결정되는 바와 같은 모체 scFv(XENP24352; N-단말로부터 C-단말로 VH-scFv 링커-VL로서 배향됨)로부터의 용융 온도(Tm) 및 용융 온도의 변화를 도시한다.
도 26a-26d는 병따개 형태(Fab-scFv-Fc)의 프로토타입 항-공자극(anti-costim) x 항-체크포인트 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 항체는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄) 전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR는 언더라인되고 슬래시는 변수 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 V_H-scFv 링커-V_L 또는 V_L-scFv 링커-V_H의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설되는 각각의 서열은 M428L/N434S 변이체를 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 보다 긴 반감기를 야기한다.
도 27은 SEB-자극 PBMC 분석에서 프로토타입 공자극/체크포인트 병따개에 의한 사이토카인 분비의 유도를 도시한다.
도 28은 나타낸 시험 물품에 의한 처리 다음에 나이브(naive)(비-SEB 자극) 및 SEB-자극 PBMC에서 IL-2 분비의 유도를 도시한다.
도 29는 종양 TIL이 면역 체크포인트 수용체 및 공자극 수용체를 공동 발현시키기 때문에, 이중특이적 항체가 특이성(specificity)을 증가시키고, 항-종양 활동을 증대시키고 말초 독성을 회피하는 것을 도시하는, 공자극 x 체크포인트 차단 이중특이적 항체의 이점과 연관되는 개략도를 도시한다.
도 30은 이중-양성 세포가 외팔형 항-PD-1 항체(XENP20111) 및 외팔형 항-ICOS 항체(XENP20266)과 비교하여 예시적 항-ICOS X 항-PD-1 항체 (XENP20896)에 의해 선택적으로, 점유되는 것을 도시한다.
도 31a-31b는 인간 PBMC의 SEB 자극 후에 A) PD-1 및 ICOS 이중-양성 T 세포 및 B) PD-1 및 ICOS 이중-음성 T 세포 상의 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체(XENP20896), 외팔형 항-ICOS 항체(XENP20266) 및 외팔형 항-PD-1 항체(XENP20111)의 수용체 점유율을 도시한다.
도 32a-32d는 병따개 형태(FAB-scFv-FC)의 예시적 항-ICOS x 항-PD-1 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄) 전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 변수 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 V_H-scFv 링커-V_L 또는 V_L-scFv 링커-V_H의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설된 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 긴 반감기를 야기한다.
도 33a-33c는 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하는 병따개 형태(FAB-scFv-FC)의 예시적 항-ICOS x 항-PD-1의 아미노산 서열을 도시하며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다. 항체는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄) 전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 변수 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 V_H-scFv 링커-V_L 또는 V_L-scFv 링커-V_H의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다.
도 34a-34c는 OCTET®에 의해 결정되는 바와 같은 AMC 바이오 센서 상에 캡처되는 인간 ICOS의 뮤린 Fc 융합체에 대한 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka), 및 해리 속도(KD)를 도시한다.
도 35는 OCTET®에 의해 결정되는 바와 같은 SA/SAX 바이오 센서 상에 캡처되는 인간 ICOS의 비오틴화된 IgG1 Fc 융합체에 대한 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka), 및 해리 속도(kd)을 도시한다.
도 36a-36b는 A) 및 B)에 도시되는 2개의 분리된 실험의 SEB 자극 PBMC 분석에서 인간 T 세포에 대해 이중특이적인 변이체 항-ICOS x 항-PD-1의 세포면 결합을 도시한다.
도 37은 인간 PBMC의 SEB 자극 이후 PD-1 및 ICOS 이중-양성 T 세포 상의 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체, 외팔형 항-ICOS 항체 및 외팔형 항-PD-1 항체(XENP20111)의 수용체 점유율을 도시한다.
도 38a-38b는 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체가 SEB-자극 PBMC로부터 A) IL-2 및 B) IFNγ 분비를 촉진하는 것을 도시한다.
도 39a-39b는 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체가 SEB-자극 PBMC로부터 A) IL-2 및 B) IFNγ 분비를 촉진하는 것을 도시한다.
도 40a-40b는 인간 PBMC로의 생착(engraftment) 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 A) 7일 및 B) 11일에서 마우스(mice)의 IFNγ의 농도를 도시한다.
도 41a-41b는 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 A) 11일 및 B) 14일에서 유세포 분석(flow cytometry)에 의해 결정되는 바와 같은 마우스의 CD45+ 세포 수를 도시한다.
도 42a-42b는 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 14일에서 유세포 분석에 의해 결정되는 바와 같은 마우스의 A) CD8+ T 세포 수 및 B) CD4+ T 세포 수를 도시한다(**p ≤ 0.01).
도 43은 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 14일까지의 마우스의 체중 변화를 도시한다(**p ≤ 0.01).
도 44a-44b는 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 A) 7일 및 B) 14일에서 마우스의 IFNγ의 농도를 도시한다.
도 45는 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 14일에서 유세포 분석에 의해 결정되는 바와 같은 마우스의 CD45+ 세포 수를 도시한다.
도 46a-46c는 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 14일에서 유세포 분석에 의해 결정되는 바와 같은 마우스의 A) CD8+ T 세포 수 및 B) CD4+ T 세포 수를 도시한다.
도 47a-47b는 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 이후 12일 및 15일까지의 마우스의 체중 변화를 도시한다.
도 48a-48d는 대안적인 항-ICOS ABD를 갖는 병따개 형태(FAB-scFv-FC)의 예시적인 항-ICOS x 항-PD-1 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄) 전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 상이한 배향 (N-말단 내지 C-말단)을 나타내지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 49는 인간 PBMC의 SEB-자극 및 대안적인 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 처치 이후 IL-2에 대한 사이토카인 방출 분석을 도시한다.
도 50은 인간 PBMC의 SEB-자극 및 대안적인 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 처치 후 (2가 항-RSV mAb에 대한 배수 유도(fold induction)로서) IL-2에 대한 사이토카인 방출 분석을 도시한다.
도 51은 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 처리 후 SEB-자극 정제된 CD3+ T 세포에서의 AKT 인산화를 나타낸다.
도 52는 나노스트링(NanoString)에 의해 결정되는 바와 같은 2가 항-RSV에 의한 유도에 대해 지시된 시험 물품에 의한 A) IL-17A, B) IL17F, C) IL-22, D) IL-10, E) IL-9, 및 F) IFNγ 유전자 발현의 배수 유도를 도시한다.
도 53a-53f는 나노스트링에 의해 결정되는 바와 같은 2가 항-RSV mAb로의 처리에 대해 지시된 시험 물품에 의한 선택된 면역 반응 유전자의 발현에서 평균 배수 유도를 도시한다. 셰이딩(shading) 강도는 배수 변화의 크기에 대응한다.
도 54는 인간 PBMC로의 생착 및 지시된 시험 물품에 의한 처치 후 14일에서 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 마우스의 CD45+ 세포 수를 나타낸다.
도 55a-55d는 도 9 및 도 75와 유사하게, 도 2f의 중심-scFv, 도 2j의 중심-scFv2 형태, 도 2k의 이중특이적 mAb, 도 2l의 DVD-Ig 및 도 2m의 트라이던트(Trident) 형태를 포함하는, 다수의 추가적인 형태의 "백본" 부분(예를 들어, Fv 없음)의 서열을 도시한다. 도 2l에서, DVD-Ig® 링커는 WO2007/024,715에서 발견되는 다른 링커와 함께, 이중 언더라인으로 도시되며, 본원에 그 전체가 그리고 특히 이들 서열에 대해 참조로 통합된다. 트라이던트 형태에서, 다른 트라이던트 링커 및 코일-코일 서열은 WO 2015/184203에 도시되며, 본원에 그 전체가 그리고 특히 이들 서열에 대해 참조로 통합된다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 굵게 나타낸 도메인(예를 들어, "VH1", VH2-scFv 링커-VL2 "등)은 슬래시 "/"로 분리되고, 필요에 따라 선택적 도메인 링커를 포함할 수 있다. 이들 백본 모두는 경쇄에 대해 카파(kappa) 불변 영역을 이용하지만, 람다 사슬(lambda chain)이 또한 사용될 수 있다. 도 9 및 도 75에 대해, 이들 백본은 본원에 개설되는 바와 같은 임의의 vh 및 vl 도메인과 결합될 수 있다.
도 56a-56b는 병따개 형태(Fab-scFv-Fc)의 예시적인 항-PD-1 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄) 전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 57a-57c는 중심-scFv 형태에서 예시적인 항-PD-1 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 항체는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄)전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 제1 Fab-Fc 가변 영역 및 두 번째 Fab-scFv-Fc 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 58은 중심-scFv2 형태에서 항-PD-1 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 항체는 Fab 사슬 지정(중쇄 또는 경쇄) 전에, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 59는 이중특이적 mAb 형태에서 예시적인 항-PD-1 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(제1 항원에 대한 중쇄 1 또는 경쇄 1 및 제2 항원에 대한 중쇄 2 또는 경쇄 2) 전에, 대시에 의해 분리되는, 제1 항원에 대한 제1 Fab 가변 영역 및 제2 항원에 대한 제2 Fab 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 60은 DVD-IgG 형태에서 예시적인 항-PD-1 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 항체는 사슬 지정(중쇄 또는 경쇄) 전에, 제1 항원에 대한 제1 가변 영역 및 제2 항원에 대한 제2 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 61a-61b는 트라이던트 형태에서 예시적인 항-PD-1 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(중쇄 또는 경쇄) 전에, 대시에 의해 분리되는, DART를 포함하는 제1 항원의 VL 및 VH 그리고 제2 항원에 대한 Fab 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 62는 SEB-자극 PBMC 분석에서 대안적인 형태의 공자극 x 체크포인트 차단 이중특이적 항체에 의한 사이토카인 분비(IL-2)의 유도를 도시한다.
도 63은 병따개 형태(Fab-scFv-Fc)의 예시적인 항-ICOS x 항-CTLA-4 항체의 아미노선 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄)전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을0 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 64a-64b는 이중특이적 mAb 형태의 예시적인 항-LAG-3 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(제1 항원에 대한 중쇄 1 또는 경쇄 1 및 제2 항원에 대한 중쇄 2 또는 경쇄 2) 전에, 대시에 의해 분리되는, 제1 항원에 대한 제1 Fab 가변 영역 및 제2 항원에 대한 제2 Fab 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 65는 이중특이적 mAb 형태의 예시적인 항-TIM-3 x 항-ICOS 항체의 아미노산 서열을 도시한다. 항체는 사슬 지정(제1 항원에 대한 중쇄 1 또는 경쇄 1 및 제2 항원에 대한 중쇄 2 또는 경쇄 2) 전에, 대시에 의해 분리되는, 제1 항원에 대한 제1 Fab 가변 영역 및 제2 항원에 대한 제2 Fab 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제시킬 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 66a-66c은 병따개 형태(Fab-scFv-Fc) 및 중심-scFv2 형태의 항-ICOS x 항-PD-L1 항체의 아미노선 서열을 도시한다. 병따개는 사슬 지정(Fab-Fc 중쇄, scFv-Fc 중쇄 또는 경쇄) 전에, 대시에 의해 분리되는, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. 중심-scFv2는 사슬 지정(중쇄 또는 경쇄) 전에, 첫 번째 Fab 가변 영역 및 두 번째 scFv 가변 영역을 사용하여 명명된다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. scFv 도메인은 나타낸 바와 같이 VH-scFv 링커-VL 또는 VL-scFv 링커-VH의 상이한 배향(N-말단 내지 C-말단)을 갖지만, 이것은 역전될 수 있다. 게다가, 본원에 개설되는 각각의 서열은 하나 또는 바람직하게는 두 개의 Fc 도메인에서 M428L/N434S 변이체를 포함하거나 배제할 수 있으며, 이는 혈청에서 더 긴 반감기를 야기한다.
도 67은 SEB 자극 PBMC 분석에서 추가적인 공자극 x 체크포인트 차단 이중특이적 항체에 의한 사이토카인 분비(IL-2)의 유도를 도시한다.
도 68a-68g는 예시적인 외팔형 항-ICOS Fab-Fc 항체에 대한 아미노산 서열을 도시한다. CDR은 언더라인되고 슬래시는 가변 영역의 경계(들)을 나타낸다. 이들은 하나의 아미노산 사슬이 Fc 도메인에만 있음에 따라 "외팔(one-arm)" 또는 "외팔형(one armed)" 형태로 지칭되며, 다른 측은 항-ICOS Fab 측에 있다. Fc 도메인은 S364K/E357Q 스큐 변이체뿐만 아니라, 도 68a-68g에 도시되는 pI (-)_등방성_A 변이체를 포함한다. Fab Fc 도메인은 L368D/K370S 스큐 변이체뿐만 아니라 도 68a-68g에 도시되는 pI ISO(+RR) 변이체를 포함한다. 두 개의 Fc 도메인은 절제 변이체(E233P/L234V/L235A/G236del/S267K)를 포함한다.
도 69는 OCTET®에 의해 결정되는 바와 같은 AMC 바이오 센서 상에 캡처되는 인간 ICOS의 뮤린 Fc 융합체에 대한 변이체 외팔형 항-ICOS Fab-Fc 항체의 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka), 및 해리 속도(KD)를 도시한다.
도 70은 2가 및 1가 항-PD-1 항체 및 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 처치 후 SEB-자극 정제된 CD3+ T 세포에서의 AKT 인산화를 도시한다.
도 71은 대안적인 항-ICOS ABD를 갖는 1가 항-ICOS로의 처치 후 정제된 CD3+ T 세포에서의 AKT 인산화를 도시한다.
도 72a-72c는 일부 프로토타입 이중특이적 항체(OX40 X PD-1, GITR X PD-1, 4-1BB X PD-1, CTLA-4 X ICOS)를 도시한다.
도 73a-73h는 일부 프로토타입 mAb(4-1BB, OX40, GITR, ICOS, PD-L1 및 PD-1)를 도시하며, 그 Fv는 본 발명의 다른 Fv와 함께 그리고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또한 트라이던트)로 사용될 수 있다. 일부 추가적인 ICOS X PD-L1 병따개 서열이 또한 나타낸다.
도 74a-74f는 추가적인 PD-1 X ICOS 병따개를 도시하며, 일부 경우에서 PD-1 Fv은 Fab 형태이고 ICOS Fv은 scFv 형태이고 다른 경우에서 역전된다.
도 75a 내지 도 75d는 본 발명의 Fv 서열이 추가되는, 본 발명에서 사용하는 mAb-scFv 백본의 서열을 도시한다. mAb-scFv 백본 1은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 2는 인간 IgG1(356D/358L 알로타입)에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체를 포함한다. 백본 3은 인간 IgG1(356E/358M 알로타입)에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체, 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐만 아니라, 두 사슬 상의 N297A 변이체를 포함한다. 백본 4는 돌연변이가 N297S인 것을 제외하고 3과 동일하다. mAb-scFv 백본 3 및 4에 대한 대안적인 형태는 두 사슬에서 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 배제할 수 있다. 백본 5는 인간 IgG4에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체 및 두 사슬 상의 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 절제 변이체뿐만 아니라, 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이 Fab 팔 교환을 제거하는 두 사슬 상의 S228P(EU 넘버링, 이는 Kabat에서 S241P임) 변이체를 포함한다. 백본 6은 인간 IgG2에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체를 포함한다. 백본 7은 인간 IgG2에 기초하고, S364K/E357Q:L368D/K370S 스큐 변이체, Fab 측 상의 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D pI 변이체뿐만 아니라 두 사슬 상의 S267K 변이체를 포함한다.
당업자에 의해 주지되고 아래에 개설되는 바와 같이, 이들 서열은 본원에 개설되는 임의의 vh 및 vl 쌍과 함께 사용될 수 있으며, 하나의 단량체는 Fab 및 scFv(선택적으로, 하전된 scFv 링커를 포함함) 둘 다를 포함하고 다른 단량체는 Fab 서열(예를 들어, "Fab 측 중쇄"에 부착되는 vh 및 "불변 경쇄"에 부착되는 vl)을 포함한다. 즉, 항-CTLA-4, 항-PD-1, 항-LAG-3, 항-TIM-3, 항-TIGIT, 항-BTLA, 항-ICOS, 항-GITR, 항-OX40 및 항-4-1BB에 대해 본원에서 개설되는 임의의 Fv 서열은, scFv(다시, 선택적으로, 하전된 scFv 링커를 가짐) 또는 Fab로서든, 임의의 조합으로 이러한 도 75a-75d 백본에 통합될 수 있다. 단량체 1 측은 Fab-scFv pI 음성 측이고, (IgG1에 대해 모두), 이종이량체화 변이체 L368D/K370S, 등방성 pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함한다. 단량체 2 측은 scFv pI 양성 측이고, 이종이량체화 변이체 364K/E357Q를 포함한다. 그러나, 다른 스큐 변이체 쌍, 특히 [S364K/E357Q:L368D/K370S];[L368D/K370S:S364K];[L368E/K370S:S364K];[T411T/E360E/Q362E:D401K];[L368D/K370S:S364K/E357L];[K370S:S364K/E357Q], [T366S/L368A/Y407V:T366W] 및 [T366S/L368A/Y407V/Y394C:T366W/S354C]는 치환될 수 있다.
도 75a에 도시되는 불변 경쇄는 또한 도면의 모든 구조에 대해 사용될 수 있지만, 카파 불변 경쇄가 또한 치환될 수 있다.
이들 mAb-scFv 백본은 도 1의 mAb-Fv 형태(하나의 단량체가 C-말단에서 vl 및 C-말단에서 다른 vh를 포함함)뿐만 아니라 cFv-mAb 형태(scFv 도메인이 단량체 중 하나의 C-말단에 추가됨) 둘 다에서 사용된다는 점에 유의해야 한다.
인용된 서열과 (본원에 정의된 바와 같이) 90, 95, 98 및 99% 동일하고/하거나, (당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이미 모체 인간 IgG1(또는 백본에 따라, IgG2 또는 IgG4)과 비교하여 다수의 아미노산 변형을 포함하는, 도의 '모체"와 비교하여) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10의 추가적인 아미노산 치환을 포함하는 서열이 이들 백본 각각 내에 포함된다. 즉, 인용된 백본은 이러한 도면의 백본 내에 포함되는 스큐, pI 및 절제 변이체에 더하여 추가적인 아미노산 변형(일반적으로 아미노산 치환)을 포함할 수 있다.
도 76a-76f는 vh 및 vl 서열로서 인간 PD-1에 결합하는 Fv에 대한 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 공자극 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 ICOS]_H0L0 및 [ICOS]H0.66_L0ABD와 결합될 수 있다.
도 77a-77b는 vh 및 vl 서열로서 인간 ICOS에 결합하는 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 체크포인트 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, PD-1, PD-L1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT 및 BTLA)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1와 결합될 수 있다.
도 78a-78j는 vh 및 vl 서열로서 인간 PD-L1에 결합하는 Fv에 대한 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 공자극 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 ICOS]_H0L0 및 [ICOS]H0.66_L0 ABD와 결합될 수 있다.
도 79a-79b는 vh 및 vl 서열로서 인간 CTLA-4에 결합하는 Fv에 대한 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 공자극 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 ICOS]_H0L0 및 [ICOS]H0.66_L0 ABD와 결합될 수 있다.
도 80a-80c는 vh 및 vl 서열로서 인간 LAG-3에 결합하는 Fv에 대한 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 공자극 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 ICOS]_H0L0 및 [ICOS]H0.66_L0 ABD와 결합될 수 있다.
도 81a-81c는 vh 및 vl 서열로서 인간 TIM-3에 결합하는 Fv에 대한 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 공자극 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 ICOS]_H0L0 및 [ICOS]H0.66_L0 ABD와 결합될 수 있다.
도 82는 vh 및 vl 서열로서 인간 BTLA에 결합하는 Fv에 대한 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 공자극 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 ICOS]_H0L0 및 [ICOS]H0.66_L0 ABD와 결합될 수 있다.
도 83a-83d는 vh 및 vl 서열로서 인간 TIGIT에 결합하는 Fv에 대한 다수의 종래 기술의 서열을 도시한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 Fv 중 임의의 것은 공자극 수용체(예를 들어, 본원에 포함되는 Fv 서열을 포함하는, ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB)에 결합하는 Fv와 결합되고 임의의 형태(병따개, mAb-Fv, mAb-scFv, 중심-scFv, 이중특이적 mAb, 중심-Fv, 외팔형 중심-scFv, 외팔형 scFv-mAb, 이중 scFv, DVD-Ig 또는 트라이던트)일 수 있다. 특히, 이들은 ICOS]_H0L0 및 [ICOS]H0.66_L0 ABD와 결합될 수 있다.
도 84a 내지 도 84c는 다수의 BTLA ABD를 도시하며, 추가적인 항-BTLA ABD는 SEQ ID NO: 3705-3736로서 열거된다. CDR은 언더라인되고, scFv 링커는 이중 언더라인되고(서열에서, scFv 링커는 양으로 하전된 scFv(GKPGS)₄ 링커 (서열번호 26209)이지만, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이러한 링커는 비하전, 또는 음으로 하전된 링커를 포함하는 다른 링커로 대체될 수 있으며, 그 일부는 도 8a-8b에 도시됨), 슬래시는 가변 도메인의 경계(들)을 나타낸다. 상기한 바와 같이, 명명 규칙은 N-말단으로부터 C-말단으로의 scFv의 배향을 예시하며; 이러한 도면에 열거되는 서열에서, 이들은 모두 (N-말단으로부터 C-말단으로) vh-scFv 링커-vl로서 배향되지만, 이들 서열은 또한 반대 방위, (N-말단으로부터 C-말단으로) vl-링커-vh로서 사용될 수 있다. 본원에서 지칭되고 CDR을 포함하는 본원의 모든 서열에 대해 적용되는 바와 같이, CDR 위치의 정확한 식별은 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 넘버링에 따라 약간 다를 수 있고, 따라서 언더라인된 CDR뿐만 아니라 다른 번호 시스템을 사용하여 vh 및 vl 도메인 내에 포함되는 CDR도 본원에 포함된다. 더욱이, 도면의 모든 서열에 대해, 이들 vh 및 vl 서열은 scFv 형태로 또는 Fab 형태로 사용될 수 있다.
도 85는 공자극 및 체크포인트 ABD의 가능한 조합의 행렬이며, 모든 가능한 조합이 가능하다. 박스 내의 "A"는 PD-1 ABD가 1G6_L1.194_H1.279인 것을 의미한다. 박스 내의 "B"는 ICOS ABD가 [ICOS] H.066_L0인 것을 의미한다. 박스 내의 "C"는 PD-1이 쌍의 scFv인 것을 의미한다. 박스 내의 "D"는 CTLA-4 ABD가 Fab이고 [CTLA-4]_H3_L0.22인 것을 의미한다. 박스 내의 "E"는 CTLA-4 ABD가 scFv이고 [CTLA-4]_H3.23_L0.22인 것을 의미한다. 박스 내의 "F"는 LAG-3 ABD가 7G8_H3.30_L1.34인 것을 의미한다. 박스 내의 "G"는 BTLA ABD가 9C6_H1.1_L1인 것을 의미한다. 박스 내의 "H"는 조합이 병따개인 것을 의미한다. 박스 내의 "I"는 조합이 중심-scFv 형태인 것을 의미한다.
도 86은 2개 이상의 ICOS X PD-1 병따개를 도시한다.

I. 명명법

본 발명의 이중특이적 항체는 수개의 상이한 형태로 열거된다. 각각의 폴리펩티드에는 고유의 "XENP" 번호가 부여되지만, 당해 분야에서 주지되는 바와 같이, 더 긴 서열은 더 짧은 서열을 포함할 수 있을 것이다. 예를 들어, 주어진 서열에 대한 병따개 형태의 scFv 측 단량체의 중쇄는 제1 XENP 번호를 갖는 반면, scFv 도메인은 상이한 XENP 번호를 가질 것이다. 일부 분자는 3개의 폴리펩티드를 가짐으로써, 구성 요소를 갖는 XENP 번호가 명칭으로 사용된다. 따라서, 병따개 형태인 분자 XENP는 일반적으로 "XENP23104-HC-Fab", XENP23104 HC-scFv " 및 "XENP23104 LC 또는 등가물로서 지칭되는, 3개의 서열을 포함하지만, 당업자는 서열 정렬을 통해 이들을 쉽게 식별할 수 있을 것이다. 이들 XENP 번호는 서열 목록뿐만 아니라 식별자에 있고, 도면에서 사용된다. 게다가, 3개의 구성요소를 포함하는 하나의 분자는 다중 서열 식별자를 발생시킨다. 예를 들어, Fab 단량체의 목록은 전장 서열, 가변 중쇄 서열 및 가변 중쇄 서열의 3개의 CDR을 갖고; 경쇄는 전장 서열, 가변 경쇄 서열 및 가변 경쇄 서열의 3개의 CDR을 갖고; scFv-Fc 도메인은 전장 서열, scFv 서열, 가변 경쇄 서열, 3개의 경쇄 CDR, scFv 링커, 가변 중쇄 서열 및 3개의 중쇄 CDR을 가지며; scFv 도메인을 갖는 본원의 모든 분자는 단일의 하전된 scFv 링커(+H)를 사용하지만, 다른 것이 사용될 수 있다는 점에 유의한다. 게다가, 특정 가변 도메인의 명칭 명명법은 "Hx.xx_Ly.yy" 타입의 형태를 사용하며, 번호는 특정 가변 사슬 서열에 대한 고유 식별자이다. 따라서, XENP23104(PD-1에 결합함)의 scFv 측의 가변 도메인은 "1G6_L1.194_H1.279"이며, 이는 가변 중쇄 도메인 H1.279가 경쇄 도메인 L1.194과 결합된 것을 나타낸다. 이들 서열이 scFv로 사용되는 경우, 지정 "1G6_ L1.194_H1.279"는 가변 중쇄 도메인 H1.279가 경쇄 도메인 L1.194와 결합되었고 N-말단으로부터 C-말단으로의, vl-링커-vh 방위에 있다는 것을 나타낸다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 동일한 서열을 갖지만 역순인 분자는 "1G6_H1.279_L1.194"로 명명될 것이다. 유사하게, 상이한 구조는 서열 목록 및 도면으로부터 명백히 알 수 있는 바와 같이 중쇄 및 경쇄를 "혼합 및 매칭"시킬 수 있다.

II. 재료의 통합

A. 도면 및 범례

USSN 62/479,723로부터의 도면, 범례 및 서열 그리고 USSN 15/623,314의 도면, 범례 및 서열이 참조로 특별히 통합된다. 게다가, USSN 62/479,723으로부터의 청구범위가 추가로 특별히 통합된다.

B. 서열

표적 항원: 인간 PD-1(sp|Q15116)의 서열은 SEQ ID NO: 26226이다. 인간 PD-1, 세포외 도메인(sp|Q15116|21-170)의 서열은 SEQ ID NO: 26227이다. 필리핀 원숭이(macaca fascicularis) PD-1(tr|B0LAJ3)의 서열은 SEQ ID NO: 26228이다. 필리핀 원숭이 PD-1, 세포외 도메인(예측)(tr|B0LAJ3|21-170)의 서열은 SEQ ID NO: 26229이다. 인간 CTLA-4(sp|P16410)의 서열은 SEQ ID NO: 26230이다. 인간 CTLA-4, 세포외 도메인(sp|P16410|36-161)의 서열은 SEQ ID NO: 26231이다. 필리핀 원숭이 CTLA-4(tr|G7PL88)의 서열은 SEQ ID NO: 26232이다. 필리핀 원숭이 CTLA-4, 세포외 도메인(예측)(tr|G7PL88)의 서열은 SEQ ID NO: 26233이다. 인간 LAG-3(sp|P18627)의 서열은 SEQ ID NO: 26234이다. 인간 LAG-3, 세포외 도메인(sp|P18627|29-450)의 서열은 SEQ ID NO: 26235이다. 필리핀 원숭이 LAG-3(예측)(gi|544467815|ref|XP_005570011.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26236이다. 필리핀 원숭이 LAG-3, 세포외 도메인(예측)(gi|544467815|ref|XP_005570011.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26237이다. 인간 TIM-3(sp|Q8TDQ0)의 서열은 SEQ ID NO: 26238이다. 인간 TIM-3, 세포외 도메인(sp|Q8TDQ0|22-202)의 서열은 SEQ ID NO: 26239이다. 필리핀 원숭이 TIM-3(예측)(gi|355750365|gb|EHH54703.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26240이다. 필리핀 원숭이 TIM-3, 세포외 도메인(예측)(gi|355750365|gb|EHH54703.1|22-203)의 서열은 SEQ ID NO: 26241이다. 인간 PD-L1(sp|Q9NZQ7)의 서열은 SEQ ID NO: 26242이다. 인간 PD-L1, 세포외 도메인(sp|Q9NZQ7|19-238)의 서열은 SEQ ID NO: 26243이다. 필리핀 원숭이 PD-L1(예측)(gb|XP_005581836.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26244이다. 필리핀 원숭이 PD-L1, 세포외 도메인(예측)(gb|XP_005581836.1|19-238)의 서열은 SEQ ID NO: 26245이다. 인간 ICOS(sp|Q9Y6W8)의 서열은 SEQ ID NO: 26246이다. 인간 ICOS, 세포외 도메인(sp|Q9Y6W8|21-140)의 서열은 SEQ ID NO: 26247이다. 필리핀 원숭이 ICOS(gi|544477053|ref|XP_005574075.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26248이다. 필리핀 원숭이 ICOS, 세포외 도메인(예측)(gi|544477053|ref|XP_005574075.1|21-140)의 서열은 SEQ ID NO: 26249이다. 인간 GITR(sp|Q9Y5U5)의 서열은 SEQ ID NO: 26250이다. 인간 GITR, 세포외 도메인(sp|Q9Y5U5|26-162)의 서열은 SEQ ID NO: 26251이다. 필리핀 원숭이 GITR(예측)(ref|XP_005545180.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26252이다. 필리핀 원숭이 GITR, 세포외 도메인(예측)(ref|XP_005545180.1|26-162)은 SEQ ID NO: 26253이다. 인간 OX40(sp|P43489)의 서열은 SEQ ID NO: 26254이다. 인간 OX40, 세포외 도메인(sp|P43489|29-214)의 서열은 SEQ ID NO: 26255이다. 필리핀 원숭이 OX40(예측)(ref|XP_005545179.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26256이다. 필리핀 원숭이 OX40, 세포외 도메인(예측)(ref|XP_005545179.1|29-214)의 서열은 SEQ ID NO: 26257이다. 인간 4-1BB(sp|Q07011)의 서열은 SEQ ID NO: 26258이다. 인간 4-1BB, 세포외 도메인(sp|Q07011|24-186)의 서열은 SEQ ID NO: 26259이다. 필리핀 원숭이 4-1BB(예측)(ref|XP_005544945.1)의 서열은 SEQ ID NO: 26260이다. 필리핀 원숭이 4-1BB, 세포외 도메인(예측)(ref XP_005544945.1|24-186)의 서열은 SEQ ID NO: 26261이다.

ICOS 결합 도메인: 도 19, 도 20a-20g 및 도 24에 나타낸 서열에 더하여, SEQ ID NO:27869-28086은 명칭 명명법에 표시되는 바와 같이 다수의 ICOS Fab 서열(중쇄 VH1-CH1 및 경쇄 VL1-CL)을 포함한다. CDR 및 가변 접합 사이의 접합에 대한 참조는 (본원에 참조뿐만 아니라 범례로 통합되는) USSN 62/479,723의 도 40에 도시되지만, SEQ 목록으로부터 당업자는 접합(예를 들어, 중쇄 CH1은 일반적으로 서열 "ASTK..."로 시작하고 경쇄 불변 도메인은 일반적으로 "RTVA..."로 시작함)에 대해서 뿐만 아니라 CDR을 확인할 수 있을 것이다(넘버링을 위해 및/또는 서열 정렬을 통해 표 1 참조). SEQ ID는 NO:28087-28269는 명칭 명명법에 나타낸 바와 같이 "외팔형 mAb"(도2N; Fab-Fc, Fc만 및 경쇄)에 대한 3개의 서열을 나타낸다. CDR 및 가변 접합 사이의 접합에 대한 참조는 (본원에 참조뿐만 아니라 범례로 통합되는) USSN 62/479,723의 도 41에 도시되지만, SEQ 목록으로부터 당업자는 접합(예를 들어, 중쇄 CH1은 일반적으로 서열 "ASTK..."로 시작하고 경쇄 불변 도메인은 일반적으로 "RTVA..."로 시작함)에 대해서 뿐만 아니라 CDR을 확인할 수 있을 것이다(넘버링을 위해 및/또는 서열 정렬을 통해 표 1 참조). 추가적인 외팔형 ICOS 분자는 도 68a-68g에 나타낸다. SEQ ID NO:28549-28556은 Fv가 또한 ICOS ABD로서 사용될 수 있는 일부 대조군 항체(HC 및 LC)를 도시하며; CDR 및 가변 접합 사이의 접합에 대한 참조는 (본원에 참조뿐만 아니라 범례로 통합되는) USSN 62/479,723의 도 44에 도시되지만, SEQ 목록으로부터 당업자는 접합(예를 들어, 중쇄 CH1은 일반적으로 서열 "ASTK..."로 시작하고 경쇄 불변 도메인은 일반적으로"RTVA..."로 시작함)에 대해서 뿐만 아니라 CDR을 확인할 수 있을 것이다(넘버링을 위해 및/또는 서열 정렬을 통해 표 1 참조). SEQ ID NO:28557-28665는 본 발명의 조합에서 사용하는 일부 ICOS scFv를 도시하며; CDR 및 가변 접합 사이의 접합에 대한 참조는 (본원에 참조뿐만 아니라 범례로 통합되는) USSN 62/479,723의 도 45에 도시되지만, SEQ 목록으로부터 당업자는 scFv가 vh와 vl 도메인 사이에서 하전된 링커(GKPGS)₄를 이용함에 따라, 접합에 대해서 뿐만 아니라 CDR을 확인할 수 있을 것이다(넘버링을 위해 및/또는 서열 정렬을 통해 표 1 참조). 따라서, 체크포인트 수용체에 대해 ABD와 조합하여 사용하기 위해 적합한 ICOS ABD는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-69g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO:27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS] _H0_L0에 나타낸다.

게다가, 적합한 ICOS X PD-1 병따개 서열은 도 3의 것들 뿐만 아니라 SEQ ID NO:28270-28548의 것을 포함하며, 이는 다시 이들 도면을 사용하여 CDR, 접합 등을 도시하는, USSN 62/479,723의 도 42 및 도 43에 도시되는 서열에 대응한다(그 모두는 본원에 참조뿐만 아니라 그 내의 범례 및 서열로 통합됨).

III. 개요

PD-1과 같은 면역 면역조절 억제제에 대해 지향되는 치료용 항체는 암의 처치를 위한 클리닉의 제한된 환경에서 큰 가능성을 보여주고 있다. 암은 환자가 암세포를 주지 및 제거할 수 없는 것으로 간주될 수 있다. 많은 경우에서, 이들 형질 전환된(예를 들어, 암성) 세포는 면역 감시를 방해한다. 억제되지 않은 T-세포 활성을 방지하기 위해 신체에서 T-세포 활성화를 제한하는 자연적인 제어 메카니즘(control mechanism)이 있으며, 이는 암세포에 의해 이용되어 면역 반응을 회피하거나 억제할 수 있다. 암을 주지 및 제거하는 면역 이펙터(effector) 세포-특별히 T 세포-의 능력을 회복시키는 것이 면역요법의 목표이다. 때때로 "면역요법"으로 지칭되는 면역-종양학의 분야는 Yervoy®, Keytruda® 및 Opdivo®와 같은 T-세포 체크포인트 억제 항체의 수개의 최근 승인으로, 빠르게 진화하고 있다. 이들 항체는 일반적으로 이들이 통상적으로 T-세포 면역의 음성 조절인자들(regulators)를 차단하기 때문에 "체크포인트 억제제"로 지칭된다. 그것은 일반적으로 다양한 면역조절 신호인, 공자극 및 공억제 둘 다가 최적의 항원-특이적 면역 반응을 조정하기 위해 사용될 수 있는 것으로 주지된다.

체크포인트 억제제 단일클론 항체는 PD-1과 같은 면역조절 억제제 단백질에 결합하며, 이는 정상 환경 하에서 세포독성 T-세포(CTL)의 활성화를 방지 및 억제한다. 예를 들어, 이들 단백질에 결합하는 항체의 사용을 통해 면역조절 단백질을 억제함으로써, 종양에 대한 증가된 T 세포 반응이 달성될 수 있다. 즉, 이들 암 면역조절 단백질은 면역 반응을 억제하며; 예를 들어, 단백질이 면적조절 단백질에 대한 항체를 사용하여 차단되는 경우, 면역 시스템이 활성화되어, 면역 자극을 초래하여, 암 및 전염병과 같은 질병의 처치를 야기한다. PD-1 단백질 또는 그 결합 파트너, PD-L1에 대한 항체는 T 세포 활성화를 초래한다.

질병과 싸우기 위해 환자의 면역 시스템을 활용하기 위한 현재 관심의 다른 영역은 T-세포 상에서 면역 체크포인트 단백질의 음성 시그널링(the negative signaling)을 극복하기 위해 양성 신호를 추가하는 ICOS(Inducible T cell Co-Stimulator, 또한 CD278로 지칭됨)와 같은 공-자극 단백질에 결합하는 길항 항체를 사용하는 T 세포의 공자극을 수반한다. ICOS는 세포외 (Ig) V-형 도메인을 포함하는 I형 막횡단 단백질이고, B7h 공-자극 분자에 대한 수용체로서 역할을 한다.

최근 연구는 일부 종양 침윤성 림프구(TIL)가 PD-1 및 ICOS를 동시-발현한다는 것을 나타낸다(Gros, J. Clinical Invest. 124 (5):2246 (2014) 참조).

2개의 상이한 표적에 동시에 결합할 수 있는 이중특이적 항체는 TIL 대 말초 T 세포를 표적화하는 선택성을 향상시키는 잠재성을 제공하는 반면, 또한 치료 비용을 감소시킨다. 항체와 세포 표면상의 2개 표적의 2가 상호작용은 - 일부 경우에 - 한 번에 한 표적과의 1가 상호작용에 비해 더 높은 결합 친화력을 초래한다. 이 때문에, 정상적인 2가 항체는 세포 표면 상의 이들의 표적에 대해 높은 결합력을 갖는 경향이 있다. 이중특이적 항체를 사용하여, 두 표적에 대한 동시 결합에 의해 제공되는 더 높은 결합력을 이용하는, 2개의 상이한 표적을 동시에 발현하는 세포에 대한 더 높은 선택성을 생성하는 가능성이 존재한다.

따라서, 본 발명은 2개의 항원을 발현하는 세포에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체, 및 암 그리고 전염병과 같은 질병, 및 증가된 면역 활성이 치료를 초래하는 다른 병태들을 처치하기 위해 T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화시키는 방법을 제공한다.

따라서, 본 발명은 일부 경우에, 단일 세포 상에서 2개의 상이한 면역조절 분자(하나는 체크포인트 수용체 및 다른 하나는 공자극 수용체)에 결합하는 이중특이적 항체를 제공하고 유리하게는 하나의 치료 물질만의 투여를 요구함으로써 다수의 항체를 투여하는 독성 및 비용의 문제를 해결하는 것에 관한 것이다.

이중특이적 항체는 하나의 분자에서 면역성의 면역조절 차단과 공자극을 결합시키는 기회를 제공한다. 그러나, 면역성의 면역조절 + 공자극 단백질의 어떤 조합 또는 어떤 결합 화학량론(1가 + 1가, 1가 + 2가 등)이 효과적인지는 분명하지 않다. 여기서, 우리는 강력한 T 세포 활성화를 유도할 수 있는 공자극 단백질(예컨대, ICOS)에 1가 결합하고 체크포인트 수용체(예컨대, PD-1)에 1가 결합하는 이중특이적 항체를 식별한다.

놀랍게도, 일반적인 통념은 1가 항체가 작용(agonism)을 야기하지 않는다고 하지만, 본 연구는 ICOS 수용체와 본 발명의 1가 이중특이적 항체의 작용의 예기치 않은 결과를 나타낸다. Merchant 등의 PNAS July 23 2013 E2987-E2996, "[w]hile initial screening of bivalent antibodies produced agonists of MET, engineering them into monovalent antibodies produces antagonists instead"를 참조한다. ICOS에 대한 1가 결합만을 갖는 이러한 긍정적인 결과는 공자극 단백질에 대한 적어도 2가 결합이 시그널링을 유발하기 위해 세포 표면 상에 요구되는 레벨의 수용체 클러스터링을 제공하는 것이 필요하다고 생각되기 때문에 예상치 못한 것이다. Fos 등의 J. Immunol. 2008:1969-1977에 의해 나타낸 바와 같이, ICOS 결찰(ligation)은 AKT 인산화를 유도한다. 여기서, 연구는 ICOS 작용의 지표로서 AKT 인산화를 사용하고, 이러한 효과는 "외팔형 ICOS"(실시예 5A(a) 참조) 및 ICOS에 1가로 결합하는 이중특이적 항체 모두에 대해 보여진다. 실시예 7 및 도 70에 나타낸 바와 같이, ICOS에만 1가로 결합하는 외팔형 XENP20266은 (예를 들어, 전통적인 mAb와 같이) ICOS에 2가로 결합하는, XENP16435보다 더 많은 AKT 인산화를 촉진시킨다.

따라서, 본 발명은 인간 ICOS뿐만 아니라 체크포인트 수용체에 대한 결합을 허용하는 이종이량체, 이중특이적 항체를 제공하는 신규한 작제물(construct)에 관한 것이다.

일반적으로 이들 이중특이적 항체는 "항-PD-1 X 항-ICOS"로 명명되거나, 일반적으로 각각의 쌍에 대해 단순하거나 용이하게 (따라서, 상호 교환적으로) "PD-1 X ICOS"로서 명명된다는 점에 유의한다.

본 발명의 이종이량체 이중특이적 면역조절 항체는 다양한 유형의 암을 처치하는데 유용하다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 종양 항원에 결합하는 전통적인 단일클론 항체, 또는 예를 들어, CD3 및 종양 항원(예를 들어, 예컨대 SN 15/141,350에 설명됨)에 결합하는 더 새로운 부류의 이중특이적 항체와 대조적으로, 면역조절 항체는 면역 반응을 증가시키기 위해 사용되지만 일반적으로 이들의 작용이 종양 특이적이지 않다. 즉, 본 발명의 이중특이적 면역조절 항체는 면역 시스템의 억제를 억제하여, 일반적으로 T 세포 활성화를 초래하며, 이는 차례로 암세포에 대한 더 큰 면역 반응, 따라서 치료로 이어진다.

하기 논하는 바와 같이, T 세포 활성화가 측정될 수 있는 다양한 방법이 존재한다. NK 및 T 세포 상의 이중특이적 면역조절 항체의 기능적 효과는 다음 파라미터에서의 변화를 측정함으로서 시험관내에서 (그리고, 하기 더 완전히 설명되는 바와 같이, 일부 경우 생체내에서) 평가될 수 있다: 증식, 사이토카인 방출 및 세포-표면 마커. NK 세포의 경우, 세포 증식, 세포독성(CD107a, 그랜자임(granzyme) 및 퍼포린 발현의 증가에 의한, 또는 표적 세포 사멸을 직접 측정하는 것에 의해 측정되는 표적 세포를 사멸하는 능력), 사이토카인 생산(예를 들어, IFN-γ 및 TNF), 및 세포 표면 수용체 발현(예를 들어, CD25)의 증가는 면역조절, 예를 들어, 암 세포의 증대된 사멸을 나타낸다. T-세포의 경우, 증식의 증가, 활성화의 세포 표면 마커(예를 들어, CD25, CD69, CD137 및 PD1)의 발현의 증가, 세포독성(표적 세포 사멸 능력) 및 사이토카인 생산(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IFN, TNF-α, IL-10, IL-17A)은 면역조절, 예를 들어, 암 세포의 증대된 사멸을 나타낸다. 따라서, 치료의 평가는 다음 중 하나 이상을 평가하는 분석을 사용하여 수행될 수 있다: (i) 면역 반응의 증가, (ii) αβ 및/또는 γδ T 세포의 활성화의 증가, (iii) 세포독성 T 세포 활성의 증가, (iv) NK 및/또는 NKT 세포 활성의 증가, (v) αβ 및/또는 γδ T-세포 억제의 경감, (vi) 전염증성 사이토카인 분비의 증가, (vii) IL-2 분비의 증가, (viii) 인터페론-γ 생산의 증가, (ix) Th1 반응의 증가, (x) Th2 반응의 감소, (xi) 조절 T 세포 중 적어도 하나의 세포 수 및/또는 활성의 감소 또는 제거, (xii) IL-2 분비의 증가.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 피험자(subject)에서 다음 중 하나 이상을 수행하기 위해 이중특이적 면역조절 항체의 사용을 제공한다: (a) 전염증성 사이토카인을 상향 조절하는 것; (b) T-세포 증식 및/또는 팽창을 증가시키는 것; (c) T-세포에 의한 인터페론-γ 또는 TNF-α 생산을 증가시키는 것; (d) IL-2 분비를 증가시키는 것; (e) 항체 반응을 자극하는 것; (f) 암 세포 성장을 억제하는 것; (g) 항원 특이적 T 세포 면역을 촉진시키는 것; (h) CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 촉진시키는 것; (i) T-세포 억제를 경감시키는 것; (j) NK 세포 활성을 촉진시키는 것; (k) 암 세포의 아폽토시스(apoptosis) 또는 용해를 촉진시키는 것; (l) 암 세포 상의 세포독성 또는 세포증식억제 효과.

따라서, 본 발명은 이중특이적 면역조절 항체를 제공한다. 본 발명에 사용될 수 있는 다수의 형태가 있으며, 일반적으로 도 2에 나타낸 바와 같이, 그 중 많은 부분은 (예를 들어, 전부는 아니지만, DVD-Ig로서의) 이종이량체이다.

이종이량체 항체 작제물은 항체의 중쇄의 2개의 Fc 도메인, 예를 들어, "이량체(dime)"로 조립되는 두 개의 "단량체(monomer)"의 자기-조립 성질에 기초한다. 이종이량체 항체는 하기 더 완전히 설명되는 바와 같이 각각의 단량체의 아미노산 서열을 변경함으로써 제조된다. 따라서, 본 발명은 일반적으로, 이종이량체 형성을 촉진시키고/시키거나 동종이량체(homodimer)에 비해 이종이량체의 용이한 정제를 가능하게하기 위해 각각의 사슬 상에서 상이한 불변 영역(constant region)의 아미노산 변이체에 의존하여, 여러 방법으로 2개의 항원을 공동-결합시킬 수 있는, 이종이량체 항체의 생성에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 이중특이적 면역조절 항체를 제공한다. 항체 기술의 지속적인 문제는 2개(또는 그 이상)의 상이한 항원에 동시에 결합하며, 일반적으로 상이한 항원이 근접되는 것을 가능하게하고 새로운 기능 및 새로운 치료법을 야기하는 "이중특이적"항체에 대한 욕망이다. 일반적으로, 이들 항체는 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 숙주 세포(일반적으로, 본 발명에서는, 본원에 개설된 바와 같은 2개의 중쇄 단랑체 및 경쇄에 대한 유전자)에 포함시킴으로써 제조된다. 이것은 일반적으로 2개의 동종이량체(A-A 및 B-B)의 형성뿐만 아니라, 원하는 이종이량체(A-B)를 야기한다. 그러나, 이중특이적 항체의 형성의 주요 장애는 동종이량체 항체로부터 멀리 떨어진 이종이량체 항체를 정제하고/하거나 동종이량체의 형성에 대한 이종이량체의 형성을 바이어싱하는 것이 어렵다는 것이다.

이 문제를 해결하기 위해, 본 발명의 이종이량체를 생성하기 위해 사용될 수있는 다수의 메카니즘이 존재한다. 게다가, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들 메카니즘은 높은 이종이량체를 보장하기 위해 결합될 수 있다. 따라서, 이종이량체 항체의 생산을 초래하는 아미노산 변이체는 "이종이량체화 변이체(heterodimerization variant)"로 지칭된다. 아래에 설명되는 바와 같이, 이종이량체화 변이체는 입체 변이체(예를 들어, 아래에 설명되는 "노브 및 홀" 또는 "스큐" 변이체 및 아래에 설명되는 "하전 쌍" 변이체)뿐만 아니라 "pI 변이체"를 포함할 수 있으며, 이는 이종이량체로부터 멀리 떨어진 동종이량체의 정제를 가능하게 한다.

하나의 메카니즘은 일반적으로 이종이량체 형성을 선호하고 동종이량체 형성을 거부하는 입체적 영향을 생성하는 아미노산 조작(amino acid engineering)이 또한 선택적으로, 사용될 수 있다는 것을 지칭하는, 당해 분야에서는 "노브 및 홀"("KIH")로서 또는 때때로 본원에서는 "스큐(skew)" 변이체로서 일반적으로 지칭되며; 이것은 때때로 Ridgway 등의 Protein Engineering 9 (7):617 (1996); Atwell 등의 J. Mol. Biol. 1997 270:26; 미국 특허 번호 제8,216,805호, 미국 제2012/0149876호에서 설명되는 바와 같이, "노브 및 홀"로서 지칭되며; 그 모두는 그 전체가 본원에 참조로 통합된다. 도면은 "노브 및 홀" 아미노산 치환을 포함하는 다수의 "단량체 A- 단량체 B" 쌍을 식별한다. 게다가, Merchant 등의 Nature Biotech. 16:677 (1998)에 설명되는 바와 같이, 이들 "노브 및 홀" 돌연변이는 구성을 이종이량체화로 스큐하기 위해 이황화 결합과 결합할 수 있다. 본 발명의 사용은 특히 아래에 개설되는 바와 같은 pI 변이체를 포함하는 다른 이종이량체화 변이체와 조합하여, 브리징 이황화물, T366W/S354C와 쌍을 이루는 T366S/L368A/Y407V/Y349C를 갖는 변이체뿐만 아니라, T366W와 쌍을 이루는 T366S/L368A/Y407V이다.

이종이량체 항체의 생성에 사용되는 추가적인 메카니즘은 때때로 Gunasekaran 등의 J. Biol. Chem. 285 (25):19637 (2010)에서 설명되는 바와 같은 "정전기 스티어링(electrostatic steering)" 또는 "하전 쌍(charge pairs)"으로서 지칭되며, 본원에 그 전체가 참조로 통합된다. 이것은 때때로 본원에서 "하전 쌍"으로 지칭된다. 본 구현예에서, 정전기는 구성(formation)을 이종이량체화 쪽으로 스큐하기 위해 사용된다. 당업자가 주지하고 있는 바와 같이, 이들은 또한 pI, 및 따라서 정제에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 일부 경우에서 또한 pI 변이체로 간주 될 수 있다. 그러나, 이들이 이종이량체화를 일으키도록 생성되고 정제 도구로서 사용되지 않았기 때문에, 이들은 "입체적 변이체(steric variants)"로서 분류된다. 이들은 D221R/P228R/K409R(예를 들어, 이들은 단량체 대응 세트임)과 쌍을 이루는 D221E/P228E/L368E 및 C220R/E224R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 C220E/P228E/368E 및 도면에 도시되는 다른 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서, 일부 구현예에서, pI 변이체는 단량체 중 하나 또는 둘 다의 pI를 변경시키고 따라서 A-A, A-B 및 B-B 이량체 단백질의 등전점 정제를 가능하게하기 위해 사용된다.

본 발명에서, 이종이량체 단백질의 용이한 정제를 초래할 수 있는 수개의 기본 메카니즘이 존재하며; 하나는 각각의 단량체가 상이한 pI를 갖도록, pI 변이체의 사용에 의존하며, 따라서 A-A, A-B 및 B-B 이량체 단백질의 등전위 정제를 허용한다. 대안적으로, 일부 스캐폴드(scaffold) 형태, 예컨대, "트리플 F" 또는 "병따개" 형태는 또한 크기에 기초하여 분리를 허용한다. 하기 추가로 개설되는 바와 같이, 그것은 또한 동종이량체에 대한 이종이량체의 구성을 "스큐시키는(skew)" 것이 가능하다. 따라서, 입체적 이종이량체화 변이체 및 pI 또는 하전 쌍 변이체의 조합이 특히 본 발명에서 사용된다. 추가적으로, 하기 보다 자세하게 개설되는 바와 같이, 트리플 F 형태와 같은 scFv(들)을 사용하는 스캐폴드는 하전된 scFv 링커(양성 또는 음성)를 포함할 수 있으며, 이는 정제 목적을 위한 추가적인 pI 부스트(boost)를 제공한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 일부 트리플 F 형태는 방금 하전된 scFv 링커 및 추가적인 pI 조정 없이 유용하지만, 본 발명은 또한 하전된 scFv 링커(및 본원에서 설명되는 Fc, FcRn 및 KO 변이체의 조합)을 갖는 스큐 변이체의 사용을 제공한다.

이종이량체 단백질의 정제를 가능하게하기 위해 분리 메카니즘으로서 pI를 이용하는 본 발명에서, 아미노산 변이체가 단량체 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있으며; 즉 단량체들 중 하나의 pI(본원에서 간략화를 위해 "단량체 A"로서 지칭됨)는 단량체 B로부터 멀리 떨어져 조작될 수 있거나, 두 단량체 A 및 B 변화는 단량체 A의 pI가 증가하고 단량체 B의 pI가 감소한 상태로 변화될 수 있다. 아래에서 보다 상세히 개설되는 바와 같이, 어느 하나 또는 두 단량체의 pI 변화는 하전된 잔기(residue)를 제거 또는 추가하거나(예를 들어, 중성 아미노산은 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기에 의해, 예를 들어, 글리신에서 글루탐산으로 대체됨). 하전된 잔기를 양성 또는 음성으로부터 대향 하전으로(아스파라긴산에서 라이신으로) 변화시키거나 하전된 잔기를 중성 잔기로 (예를 들어, 전하의 손실; 라이신에서 세린으로) 변화시킴으로써 수행될 수 있다. 다수의 이들 변이체가 도면에 나타낸다. 게다가, 본원에서 이종이량체 항체의 생성에서 사용아래에 적합한 pI 변이체는 예를 들어, pI가 상당한 면역원성을 도입함 없이 변화되도록 상이한 IgG 이소타입으로부터 pI 변이체를 도입하는, 이소타입(isotypic)인 것들이며; 본원에 그 전체가 본원에 참조로 통합되는 미국 공개 번호 제20140288275호의 도 29를 참조한다.

따라서, 본 발명의 이러한 구현예에서, 이종이량체가 동종이량체로부터 분리될 수 있도록 단량체 중 적어도 하나의 pI에서 충분한 변화를 생성하는 것을 제공한다. 당업자에 의해 주지되고, 아래에 추가로 설명되는 바와 같이, 이는 "와일드형(wild type)" 중쇄 불변 영역 및 그의 pI를 증가 또는 감소시키기 위해조작되었던 변이체 영역을 사용하거나(wt A_-+B 또는 wt A_--B), 하나의 영역을 증가시키고 다른 영역을 감소시킴으로써(A+_-B- 또는 A_-B+) 수행된다.

따라서, 일반적으로, 본 발명의 일부 구현예의 구성요소는 아미노산 치환(pI 변이체" 또는 "pI 치환")를 단량체의 하나 또는 둘 다로 통합함으로써 "pI 이종이량체"(단백질이 항체인 경우 경우, 이들은 "pI 항체"로 지칭됨)를 형성하기 위해 이량체 단백질의 단량체의, 둘 다가 아니면, 적어도 하나의 등전점(pI)을 변경시키도록 지향되는 항체의 불변 영역의 아미노산 변이체이다. 본원에 나타낸 바와 같이, 2개의 동종이량체로부터 이종이량체의 분리는 2개의 단량체의 pI가 0.1 pH 유닛만큼 작게 상이하면 달성될 수 있으며, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 이상 모두가 본 발명에서 사용된다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 양호한 분리를 얻기 위해 각각의 또는 두 단량체(들) 상에 포함될 pI 변이체의 수는 관심있는 scFv 및 Fab의 시작(starting) pI에 부분적으로 의존할 것이다. 즉, 조작할 단량체 또는 "방위"을 (예를 들어, 더 양성적으로 또는 더 음성적으로) 결정하기 위해, 2개의 표적 항원의 Fv 서열은 계산되고 이로부터 결정이 제조된다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 상이한 Fv는 본 발명에서 이용되는 상이한 시작 pI를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에 개설되는 바와 같이, pI는 적어도 약 0.1 로그의 각각의 단량체의 총 pI 차이를 야기하도록 조작되며, 0.2 내지 0.5가 본원에서 개설된 바와 같이 바람직하다. 더욱이, 당업자에 의해 주지되고 본원에 개설되는 바와 같이, 일부 경우에 (형태에 따라), 이종이량체는 크기(예를 들어, 분자량)에 기초하여 동종이량체로부터 분리될 수 있다. 예를 들어, 도 2의 일부 구현예에 나타낸 바와 같이, 일부 형태는 상이한 크기를 갖는 동종이량체 및 이종이량체를 야기한다(예를 들어, 병따개의 경우, 하나의 동종이량체는 "이중 scFv"형태이고, 하나의 동종이량체는 표준 항체이고, 이종이량체는 하나의 Fab 및 하나의 scFv를 갖는다).

pI 변이체가 중쇄(들)의 불변 영역(들)을 사용함으로써, 동종이량체보다 정제된 이종이량체를 획득하기 위해 사용되는 경우, 항체를 포함하는 다중특이적 단백질을 설계 및 정제하는 것에 대한 더 모듈화된 접근법이 제공된다. 따라서, 일부 구현예에서, 이종이량체화 변이체(스큐 및 정제 이종이량체화 변이체를 포함함)가 가변 영역에 포함되지 않음으로써, 각각의 개별 항체가 조작되어야만 한다. 게다가 일부 구현예에서, pI가 상당한 면역원성을 도입함이 없이 변화되도록 상이한 IgG 이소타입으로부터 pI 변이체를 도입함으로써 면역원성이 pI 변이체에서 기인할 가능성이 상당히 감소된다. 따라서, 해결될 추가적인 문제는 높은 인간 서열 내용(sequence content)을 갖는 낮은 pI 불변 도메인의 해명, 예를 들어, 임의의 특정 위치에서의 비-인간 잔기의 최소화 또는 회피이다.

이러한 pI 조작으로 발생할 수 있는 부가적인 이점은 또한 혈청 반감기의 연장 및 증가된 FcRn 결합이다. 즉, USSN 13/194,904(그 전체가 참조로 통합됨)에 설명되는 바와 같이, 항체 불변 도메인(항체 및 Fc 융합체에서 발견되는 것을 포함함)의 pI를 낮추는 것은 생체내(in vivo)의 더 긴 혈청 보유를 초래할 수 있다. 증가된 혈청 반감기에 대한 이들 pI 변이체는 또한 정제를 위해 pI 변화를 촉진시킨다.

게다가, 이종이량체화 변이체의 pI 변이체는 동종이량체가 존재할 때 제거, 최소화 및 구별하는 능력이 중요함에 따라, 이중특이적 항체의 분석 및 품질 제어 과정에 대해 추가적인 이점을 제공한다는 점에 유의해야 한다. 유사하게, 이종이량체 단백질의 생산의 재현성을 신뢰성있게 시험하는 능력이 중요하다.

본 발명의 제1 및 제2 항원은 본원에서 항원-1 및 항원-2로서 각각 지칭되며, 하나는 공자극 수용체이고 하나는 체크포인트 수용체이다. 본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 "트리플 F" 또는 "병따개" 스캐폴드 형태이다. 이러한 구현예에서, 항체의 하나의 중쇄는 단일 사슬 fv(아래에 정의되는 바와 같은, "scfv")를 포함하고 다른 중쇄는 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는, "정규" fab 형태이다. 이러한 구성은 때때로 병따개에 대한 개략적인 시각적 유사성으로 인해, "트리플 F" 형태(scfv-fab-fc) 또는 "병따개" 형태로 본원에 지칭된다(도 2 참조). 두 개의 사슬은 하기 더 완전히 설명되는 바와 같이, 이종이량체 항체의 형성을 촉진하는 불변 영역(예를 들어, Fc 도메인 및/또는 힌지 영역)에서 아미노산 변이체의 사용에 의해 합쳐진다.

현재 "트리플 F" 형태에는 수개의 분명한 장점이 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 2개의 scFv 작제물에 의존하는 항체 유사체(analogs)는 종종 안정성 및 응집 문제를 가지며, 이는 "정규(regular)" 중쇄 및 경쇄 쌍의 추가에 의해 본 발명에서 경감될 수 있다. 게다가, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의존하는 형태와는 대조적으로, 중쇄 및 경쇄의 부정확한 쌍(예:경쇄 2와 쌍을 이루는 중쇄 1 등)에 대한 문제가 없다.

더욱이, 본원에서 개설된 바와 같이, 부가적인 기능을 추가하기 위해, 추가적인 아미노산 변이체가 본 발명의 이중특이적 항체에 도입될 수 있다. 예를 들어, Fc 영역 내의 아미노산 변화는 (하나의 단량체 또는 둘 다에) 추가되어 증가된 ADCC 또는 CDC(예를 들어, Fcγ 수용체에 대한 변경된 결합)를 촉진할 뿐만 아니라 FcRn에 대한 결합을 증가시키고/시키거나 결과적인 분자의 혈청 반감기를 증가시킬 수 있다. 본원에서 추가로 설명되고 당업자에 의해 주지되고 있는 바와 같이, 본원에 개설되는 임의의 및 모든 변이체는 선택적이고 독립적으로 다른 변이체와 결합될 수 있다.

유사하게, 기능적 변이체의 다른 카테고리는 "Fcγ 절제 변이체" 또는 "Fc 녹 아웃(FcKO 또는 KO) 변이체이다. 이들 구현예에서, 일부 치료적 용도를 위해, 추가적인 작용 메카니즘을 회피하기 위해서는, Fcγ 수용체(예를 들어, FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 등)의 하나 이상 또는 모두에 대한 Fc 도메인의 정규 결합(normal binding)을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어, 일반적으로 ADCC 활성을 제거하거나 상당히 감소시키기 위해 FcγRIIIa 결합을 절제하는 것이 바람직하다. 적합한 절제 변이체(ablation variant)가 도 6에 나타낸다.

IV. 정의

본 출원이 더 완벽하게 주지할 수 있도록 하기 위해, 수개의 정의가 아래에 개시된다. 이러한 정의는 문법적 등가물을 포괄하도록 의도된다.

본원에서 "절제(ablation)"는 활성의 감소 또는 제거를 의미한다. 따라서, 예를 들어, "절제 FcγR 결합은"은 Fc 영역 아미노산 변이체가 특정 변이체를 포함하지 않는 Fc 영역과 비교하여 50% 미만의 시작 결합을 갖는 것을 의미하며, 70-80-90-95-98% 미만의 활성 손실이 바람직하고, 일반적으로, 활성은 BIACORE® 분석에서 검출 가능한 결합 수준 아래이다. FcγR의 결합의 절제에서의 특별한 용도가 도 6에 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "ADCC" 또는 "항체 의존 세포-매개 세포독성"은 FcγRs를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포상의 결합된 항체를 주지하고 그 다음 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC는 FcγRIIIa에 대한 결합과 상관되며; FcγRIIIa에 대한 증가된 결합은 ADCC 활성의 증가를 초래한다. 본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 많은 구현예는 ADCC 활성을 완전히 제거한다.

본원에서 사용되는 "ADCP" 또는 항체 의존 세포-매개 식세포 작용(phagocytosis)은 F_cγRs 를 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 주지하고 그 다음 표적 세포의 식세포 작용을 야기하는 세포-매개 반응을 의미한다.

"항원 결합 도메인" 또는 "ABD"는, 폴리펩티드 서열의 일부로서 존재할 때, 본원에서 설명되는 바와 같이 특이적으로 표적 항원에 결합하는 6개의 CDR들(Complementary Determining Regions)의 집합을 의미한다. 따라서, "면역조절 항원 결합 도메인"은 본원에서 개설되는 바와 같이 표적 면역조절 항원에 결합한다. 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 이들 CDR은 일반적으로 제1 세트의 가변 중쇄 CDR(vhCDR 또는 V_HCDR) 및 제2 세트의 가변 경쇄 CDR(vlCDR 또는 V_LCDR)로서 존재하며, 각각은 3개의 CDR: 중쇄의 경우 vhCDR1, vhCDR2, vhCDR3 및 경쇄의 경우 vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3을 포함한다. CDR은 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인 각각에 존재하고, 함께 Fv 영역을 형성한다. 따라서, 일부 경우에, 항원-결합 도메인의 6개의 CDR은 가변 중쇄 및 가변 경쇄에 의해 기여된다. "Fab" 형태에서, 6개 CDR의 세트는 2개의 상이한 폴리펩티드 서열, 가변 중쇄 도메인(vh 또는 V_H; vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3를 포함함) 및 가변 경쇄 도메인(vl 또는 V_L; vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3을 포함함)에 의해 기여되며, vh 도메인의 C-말단은 중쇄의 CH1 도메인의 N-말단에 부착되고 vl 도메인의 C-말단은 불변 경쇄 도메인의 N-말단에 부착된다(따라서, 경쇄를 형성함). scFv 형태에서, vh 및 vl 도메인은 일반적으로 본원에 개설되는 바와 같은 링커의 사용을 통해, 하나의 폴리 펩티드 서열에 공유 결합으로 부착되며, 이는 (N-말단으로부터 시작하는) vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh 일 수 있으며, 일반적으로 (사용되는 형태에 따라, 각각의 측 상에 선택적 도메인 링커를 포함하는) 전자가 선호된다.

본원에서 "변형(modification)"은 폴리펩티드 서열에서 아미노산 치환, 삽입 및/또는 결실 또는 단백질에 화학적으로 링크되는 잔기(moiety)로의 변경을 의미한다. 예를 들어, 변형은 단백질에 부착되는 변경된 탄수화물 또는 PEG 구조일 수 있다. 본원에서 "아미노산 변형"은 폴리펩티드 서열에서의 아미노산 치환, 삽입, 및/또는 결실을 의미한다. 명확성을 위해, 달리 지칭하지 않으면, 아미노산 변형은 항상 DNA에 의해 코딩되는 아미노산, 예를 들어, DNA 및 RNA에서 코돈들(codons)을 갖는 20개의 아미노산에 대한 것이다.

본원에서 "아미노산 치환" 또는 "치환"은 모체 폴리펩티드 서열 내의 특정 위치의 아미노산을 다른 아미노산으로 대체하는 것을 의미한다. 특히, 일부 구현예에서, 치환은 유기체 내 또는 임의의 유기체에서 자연적으로 발생하지 않는, 특정 위치에서 자연적으로 발생하지 않은 아미노산에 대한 것이다. 예를 들어, 치환 E272Y는 변이체, 이 경우 Fc 변이체를 지칭하며, 여기서 272번 위치의 글루탐산이 티로신으로 대체된다. 명확성을 위해, 숙주 유기체 발현 수준을 증가시키기 위해 핵산 코딩 서열을 변화시키지만 시작 아미노산을 변화시키지 않도록 조작되었던 단백질(예를 들어, CGG(아르기닌을 인코딩함)을 CGA(여전히 아르기닌을 인코딩함)로 교화시킴)은 "아미노산 치환"이 아니며; 즉, 동일한 단백질을 인코딩하는 새로운 유전자의 생성에도 불구하고, 단백질이 그것이 시작한 특정 위치에서 동일한 아미노산을 가지면, 이는 아미노산 치환이 아니다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "아미노산 삽입" 또는 "삽입"은 모체 폴리펩티드 서열의 특정 위치에서 아미노산 서열의 추가를 의미한다. 예를 들어, -233E 또는 233E는 233번 위치 이후 및 234번 위치 이전의 글루탐산의 삽입을 지정한다. 또한, -233ADE 또는 A233ADE는 233번 위치 이후 및 234번 위치 이전의 AlaAspGlu의 삽입을 지정한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "아미노산 결실" 또는 "결실"은 모체 폴리펩티드 서열의 특정 위치에의 아미노산 서열의 제거를 의미한다. 예를 들어, E233- 또는 E233 #, E233() 또는 E233del은 233번 위치에서 글루탐산의 결실을 지정한다. 또한, EDA233- 또는 EDA233#은 233번 위치에서 시작하는 서열 GluAspAla의 결실을 지정한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "변이체 단백질" 또는 "단백질 변이체" 또는 "변이체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 단백질과는 상이한 다른 단백질을 의미한다. 단백질 변이체는 단백질 자체, 단백질을 포함하는 조성물, 또는 이를 인코딩하는 아미노 서열(amino sequence)을 지칭할 수 있다. 바람직하게는, 단백질 변이체는 모체 단백질과 비교하여 적어도 하나의 아미노산 변형, 예를 들어, 모체와 비교하여 약 1개 내지 약 70개의 아미노산 변형, 바람직하게는, 약 1개 내지 약 5개 아미노산 변형을 갖는다. 아래에 기술되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 모체 폴리펩티드, 예를 들어, Fc 모체 폴리펩티드는 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터의 Fc 영역과 같은, 인간 와일드형 서열이지만, 변이체를 갖는 인간 서열이 또한 "모체 폴리펩티드"의 역할을 할 수 있으며, 예를 들어, IgG1/2 하이브리드가 포함될 수 있다. 본원의 단백질 변이체 서열은 바람직하게는, 모체 단백질 서열과 적어도 약 80%의 동일성, 가장 바람직하게는 적어도 약 90%의 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95_-98_-99%의 동일성을 보유할 것이다. 변이체 단백질은 변이체 단백질 자체, 단백질 변이체를 포함하는 조성물 또는 이를 인코딩하는 DNA 서열을 지칭할 수 있다.

따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 "항체 변이체" 또는 "변이체 항체"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 항체와 상이한 항체를 의미하며, 본원에서 사용되는 바와 같은 "IgG 변이체" 또는 "변이체 IgG"는 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 IgG(다시 말하면, 많은 경우에, 인간 IgG 서열)와 다른 항체를 의미하고, 본원에 사용되는 바와 같은 "면역글로불린 변이체" 또는 "변이체 면역글로불린"은 적어도 하나의 아미노산 변형에 의해 모체 면역글로불린과는 상이한 다른 면역글로불린 서열을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "Fc 변이체" 또는 "변이체 Fc"는 Fc 도메인에서 아미노산 변형을 포함하는 단백질을 의미한다. 본 발명의 Fc 변이체는 이를 구성하는 아미노산 변형에 따라 정의된다. 따라서, 예를 들어, N434S 또는 434S는 모체 Fc 폴리펩티드에 대해 434 위치에서 치환체 세린을 갖는 Fc 변이체이며, 여기서, 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. 마찬가지로, M428L/N434S는 모체 Fc 폴리펩티드에 대해 치환체 M428L 및 N434S를 갖는 Fc 변이체를 정의한다. WT 아미노산의 동일성(identity)은 불특정될 수 있으며, 이 경우 상술한 변이체는 428L/434S로 지칭된다. 치환체가 제공되는 순서는 임의적이며, 즉, 예를 들어, 428L/434S는 M428L/N434S와 동일한 Fc 변이체 등인 점이 주목된다. 항체와 관련하여 본 발명에서 설명되는 모든 위치에 대해, 달리 지칭하지 않으면, 아미노산 위치 넘버링은 EU 인덱스에 따른다. EU 인덱스 또는 카밧에서와 같은 EU 인덱스 또는 EU 넘버링 방식은 EU 항체의 넘버링을 지칭한다(본원에 전체적으로 참조로 통합되는, Edelman 등의 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63: 78-85). 변형은 첨가, 결실 또는 치환일 수 있다. 치환체는 자연 발생 아미노산 및, 일부 경우에서, 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 그 예는 미국 특허 번호 제6,586,207호; WO 98/48032; WO 03/073238; 미국2004-0214988A1; WO 05/35727A2; WO 05/74524A2; J. W. Chin 등 (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027; J. W. Chin, & P. G Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137; J. W. Chin 등, (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024; 및 L. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10을 포함하며, 모두는 전체적으로 참조로 통합된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "단백질"은 본원에서 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드 및 펩티드를 포함하는, 적어도 2개의 공유결합으로 부착된 아미노산을 의미한다. 펩티딜 그룹은 자연 발생 아미노산 및 펩티드 결합, 또는 합성 펩티도미메틱(peptidomimetic) 구조, 즉 "유사체(analog)", 예컨대 펩토이드를 포함할 수 있다(전체적으로 참조로 통합되는, "Simon 등의 PNAS USA 89 (20):9367 (1992) 참조). 아미노산은 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 자연 발생 또는 합성일 수 있다(예를 들어, DNA에 의해 코딩되는 아미노산이 아님). 예를 들어, 호모-페닐알라닌, 시트룰린, 오르니틴 및 노르로이신은 본 발명의 목적을 위한 합성 아미노산으로 간주되며, D_-및 L_-(R 또는 S) 구성 아미노산 둘 다가 사용될 수 있다. 본 발명의 변이체는 예를 들어, 모두가 전체적으로 참조로 통합되는 Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12): 625-30, 및 Anderson 등의 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2): 7566-71, Zhang 등의 2003, 303(5656): 371-3, 및 Chin 등의 2003, Science 301(5635):964-7에 의해 설명되는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, Schultz 및 동료에 의해 개발된 기술을 사용하여 통합되는 합성 아미노산의 사용을 포함하는 변형을 포함할 수 있다. 게다가, 폴리펩티드는 하나 이상의 측쇄 또는 말단의 합성 유도체화, 글리코실화, 페길화(PEGylation), 원형 치환, 고리화, 다른 분자에 대한 링커, 단백질 또는 단백질 도메인에 대한 융합, 및 펩티드 태그 또는 표지의 첨가를 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "잔기"는 단백질 내의 위치 및 그의 연관 아미노산 동일성을 의미한다. 예를 들어, 아스파라긴 297(또한 Asn297 또는 N297로 지칭됨)은 인간 항체 IgG1의 297번 위치의 잔기이다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "Fab" 또는 "Fab 영역"은 VH, CH1, VL 및 CL 면역글로불린 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. Fab는 이 영역을 별개로, 또는 이 영역을 전장 항체, 항체 단편 또는 Fab 융합 단백질의 상황에서 지칭할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "Fv" 또는 "Fv 단편" 또는 "FV 영역"은 단일 ABD의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이들은 일반적으로 2개의 사슬로 구성되거나, (일반적으로 본원에서 설명되는 바와 같은 링커와) 결합되어 scFv를 형성할 수 있다. 일부 경우에 있어서, 예를 들어, "중심-Fv" 및 "DVD-Ig" 형태에서, scFv 역할을 하는 "여분의" vh 및 vl 도메인이 추가되지만, 여기서 vh 및 vl 도메인은 이들 사이에 scFv 링커를 사용하여 링크되지 않는다.

본원에서의 "단일 사슬 Fv" 또는 "scFv"는 scFv 또는 scFv 도메인을 형성하기 위해, 일반적으로 본원에서 설명되는 바와 같은 scFv 링커를 사용하여, 가변 경쇄 도메인에 공유 결합으로 부착되는 가변 중쇄 도메인을 의미한다. scFv 도메인은 N-말단부터 C-말단으로(vh-링커-vl 또는 vl-링커-vh)의 방위일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "IgG 서브클래스 변형" 또는 "이소타입 변형"은 하나의 IgG 이소타입의 하나의 아미노산을 상이한, 정렬된 IgG 이소타입의 대응하는 아미노산으로 변환시키는 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG1은 EU 위치 296에서 티로신 및 IgG2은 페닐알라닌을 포함하기 때문에, IgG2에서의 F296Y 치환은 IgG 서브클래스 변형으로 간주된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "비-자연 발생 변형"은 이소타입이 아닌 아미노산 변형을 의미한다. 예를 들어, IgG 중 어느 것도 위치 434 위치에서 세린을 포함하지 않기 때문에, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4(또는 그 하이브리드)에서의 치환 434S는 비-자연 발생 변형으로 간주된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "아미노산" 및 "아미노산 동일성"은 DNA 및 RNA에 의해 코딩되는 20개의 자연 발생 아미노산 중 하나를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "이펙터 기능"은 항체 Fc 영역과 Fc 수용체 또는 리간드의 상호작용에서 기인하는 생화학적 이벤트를 의미한다. 이펙터 기능은 ADCC, ADCP 및 CDC를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

본원에 사용되는 바와 같은 "IgG Fc 리간드"는 IgG 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다. Fc 리간드는 FcγRIs, FcγRIIs, FcγRIIIs, FcRn, C1q, C3 만난 결합 렉틴, 만노스 수용체, 포도상구군 단백질 A, 연쇄상구균 단백질 G, 및 바이러스 FcγR을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. Fc 리간드는 또한 FcγRs와 상동적인 Fc 수용체의 패밀리인 Fc 수용체 상동체(FcRH)를 포함한다(전체적으로 참조로 통합되는, Davis 등의, 2002, Immunological Reviews 190: 123-136). Fc 리간드는 Fc와 결합하는 발견되지 않은 분자를 포함할 수 있다. 특정 IgG Fc 리간드는 FcRn 및 Fc 감마 수용체이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "Fc 리간드"는 항체의 Fc 영역에 결합하여 Fc/Fc 리간드 복합체를 형성하는 임의의 유기체로부터의 분자, 바람직하게는 폴리펩타이드를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "Fc 감마 수용체", "FcγR" 또는 "FcgammaR"은 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 FcγR 유전자에 의해 인코딩되는 단백질 패밀리의 임의의 구성원을 의미한다. 인간에서, 이러한 패밀리는 이소형태 FcγRIa, FcγRIb 및 FcγRIc를 포함하는 FcγRI(CD64); 이소형태 FcγRIIa(알로타입 H131 및 R131 포함), FcγRIIb(FcγRIIb-1 및 FcγRIIb-2 포함) 및 FcγRIIc를 포함하는 FcγRII(CD32); 및 이소형태 FcγRIIIa (알로타입 V158 및 F158 포함) 및 FcγRIIIb (알로타입 FcγRIIb-NA1및 FcγRIIb-NA2 포함)을 포함하는 FcγRIII(CD16)(전체적으로 참조로 통합되는, Jefferis 등의, 2002, Immunol Lett 82: 57-65)뿐만 아니라, 임의의 발견되지 않은 인간 FcγRs 또는 FcγR이소형태 또는 알로타입을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. FcγR은 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 마우스 FcγR은 임의의 발견되지 않은 마우스 FcγR 또는 FcγR 이소형태 또는 알로타입뿐만 아니라, FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), FcγRIII(CD16) 및 FcγRIII-2(cd16-2)를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "FcRn" 또는 "신생(neonatal) Fc 수용체"는 IgG 항체 Fc 영역에 결합하고 적어도 부분적으로 FcRn 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 의미한다. FcRn은 인간, 마우스, 래트, 토끼 및 원숭이를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유기체로부터 유래될 수 있다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 기능성 FcRn 단백질은 종종 중쇄 및 경쇄로 지칭되는 2개의 폴리펩티드를 포함한다. 경쇄는 베타-2-마이크로글로불린이고 중쇄는 FcRn 유전자에 의해 인코딩된다. 본원에서 달리 지칭하지 않는 한, FcRn 또는 FcRn 단백질은 FcRn 중쇄와 베타-2-마이크로글로불린의 복합체를 지칭한다. FcRn 수용체에 대한 결합을 증가시키고, 일부 경우에서, 혈청 반감기를 증가시키기 위해 사용되는 다양한 FcRn 변이체가 도 83의 범례에 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "모체 폴리펩티드"는 변이체를 생성하기 위해 후속적으로 변형되는 시작 폴리펩티드를 의미한다. 모체 폴리펩티드는 자연 발생 폴리펩티드, 또는 자연 발생 폴리펩티드의 변이체 또는 조작된 버전일 수 있다. 모체 폴리펩티드는 폴리펩티드 자체, 모체 폴리펩티드를 포함하는 조성물 또는 이를 인코딩하는 아미노산 서열을 지칭할 수 있다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같은 "모체 면역글로불린"은 변이체를 생성하기 위해 변형되는 미변형 면역글로불린 폴리펩티드를 의미하고, 본원에서 사용되는 바와 같은 "모체 항체"는 변이체 항체를 생성하기 위해 변형되는 미변형된 항체를 의미한다. "모체 항체"는 아래에 개설된 바와 같이 공지된 상업적, 재조합적으로 생산된 항체를 포함한다는 점에 유의해야 한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "Fc" 또는 "Fc 영역" 또는 "Fc 도메인"은 제1 불변 영역 면역글로불린 도메인을 제외하는 항체의 불변 영역 및 일부 경우에서, 힌지의 일부를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, Fc는 IgA, IgD 및 IgG의 마지막 2개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, IgE 및 IgM의 마지막 3개의 불변 영역 면역글로불린 도메인, 및 이들 도메인에 대한 가요성 힌지 N-말단을 지칭한다. IgA 및 IgM의 경우, Fc는 J 사슬을 포함할 수 있다. IgG의 경우, Fc 도메인은 면역글로불린 도메인 Cγ2 및 Cγ3(Cγ2 및 Cγ3) 그리고 Cγ1(Cγ1)와 Cγ2(Cγ2) 사이의 하부 힌지 영역을 포함한다. Fc 영역의 경계가 변할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 보통 그 카르복실-말단에 잔기 C226 또는 P230을 포함하도록 정의되며, 여기서 넘버링은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 구현예에서, 아래에 더 완전히 설명되는 바와 같이, 아미노산 변형은 예를 들어, 하나 이상의 ㄹㅊγR수용체 또는 FcRn 수용체에 대한 결합을 변경시키기 위해 Fc 영역에 제조된다.

본원의 "중쇄 불변 영역"은 항체의 CH1-힌지-CH2-CH3 부분을 의미한다.

본원의 "Fc 융합 단백질" 또는 "면역부착소(immunoadhesin)"는 본원에서 설명되는 바와 같이, 표적 단백질에 대한 결합 잔기와 같은, 다른 단백질에 (본원에 기술되는 바와 같은 임의로 링커 잔기를 통해) 일반적으로 연결되는, Fc 영역을 포함하는 단백질을 의미한다. 일부 경우에서, 이종이량체 항체의 하나의 단량체는 항체 중쇄(scFv를 포함하거나 경쇄를 더 포함)를 포함하고 다른 단량체는 변이체 Fc 도메인 및 리간드를 포함하는 Fc 융합체이다. 일부 구현예에서, 이들 "반부 항체-반부 융합 단백질"은 "융합체(Fusionbodies)"로서 지칭된다.

본원에 사용되는 바와 같은 "위치"는 단백질 서열 내의 위치를 의미한다. 위치는 순차적으로, 또는 확립된 형태, 예를 들어 항체 넘버링을 위한 EU 인덱스에 따라 넘버링될 수 있다.

본원에서 사용되는 "표적 항원"은 주어진 항체의 가변 영역에 의해 특이적으로 결합되는 분자를 의미한다. 표적 항원은 단백질, 탄수화물, 지질 또는 다른 화합물일 수 있다. 적합한 표적 항원은 아래에 설명된다.

본 발명의 이종이량체 항체의 단량체의 상황에서의 "꼬임(strandedness)"은 "일치"하는 DNA의 2개의 가닥과 유사하게, 이종이량체화 변이체가 이종이량체를 형성하기 위해 "일치"하는 능력을 보존하도록 각각의 단량체에 통합되는 것을 의미한다. 예를 들어, 일부 pI 변이체가 단량체 A로 조작되면(예를 들어, pI를 더 높게 만듬), 그 다음, 또한 이용될 수 있는 "하전 쌍"인 입체적 변이체는 pI 변이체를 방해하지 않으며, 예를 들어, pI 를 더 높게 만드는 하전 변이체는 두 기능을 보존하기 위해 동일한 "가닥" 또는 "단량체" 상에 놓여진다. 유사하게, 아래에서 더 완전히 개설되는 바와 같은 한 쌍의 세트로된 "스큐(skew)" 변이체에 대해, 당업자는 한 세트의 쌍을 포함하는 어떤 스트랜드(strand) 또는 단량체로 진행할지를 결정할 시에 pI를 고려함으로써, pI 분리는 또한 스큐의 pI를 사용하여 최대화된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "표적 세포"는 표적 항원을 발현하는 세포를 의미한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "가변 영역"은 카파, 람다 및 중쇄 면역글로불린 유전 좌위(genetic loci)를 각각 구성하는 V.카파, V.람다, 및/또는 VH 유전자 중 임의의 것에 의해 실질적으로 인코딩되는 하나 이상의 Ig 도메인을 포함하는 면역글로불린의 영역을 의미한다.

본원에서의 "와일드형 또는 WT"는 대립형질의 변이체를 포함하는, 자연에서 발견되는 아미노산 서열 또는 뉴클리오티드 서열을 의미한다. WT 단백질은 의도적으로 변형되지 않았던 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열을 갖는다.

본 발명의 항체는 일반적으로 단리되거나 재조합된다. 본원에 개시되는 다양한 폴리펩티드를 설명하기 위해 사용될 때, "단리된(Isolated)"은 그것이 발현된 세포 또는 세포 배양으로부터 식별 및 분리되고/되거나 회수되었던 폴리펩티드를 의미한다. 통상적으로, 단리된 폴리펩티드는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다. "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 지칭한다. "재조합"은 항체가 외인성 숙주 세포에서 재조합 핵산 기술을 사용하여 생성되는 것을 의미한다.

단백질 서열에 대한 "퍼센트(%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고 갭을 도입하고, 필요한 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해, 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않은 후, 특정 (모체) 서열에서 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열의 아미노산 잔기의 퍼센트로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 정렬은 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign(DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 본 기술 내의 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장(full length)에 대해 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 하나의 특별한 프로그램은 본원에 참조로 통합되는 미국 공개 번호 제20160244525의 단락[0279] 내지 [0280]에 개설되는 ALIGN-2 프로그램이다.

본 발명의 아미노산 서열("발명 서열")과 모체 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도는 "발명 서열"의 길이, 또는 모체 서열의 길이 중 가장 짧은 것에 의해 분할되는, 2개의 서열의 정렬에서 정확한 일치의 수로써 계산된다. 결과는 동일성퍼센트로 나타낸다.

일부 구현예에서, 2개 이상의 아미노산 서열은 적어도 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 2개 이상의 아미노산 서열은 적어도 95%, 97%, 98%, 99% 또는 심지어 100% 동일하다.

"특이적 결합" 또는 "~에 특이적으로 결합하다" 또는 특정 항원 또는 에피토프(epitope)에 대해 "특이적인"은 비-특이적 상호작용과 어느정도 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은 예를 들어, 일반적으로 결합 활성을 갖지 않는 유사한 구조의 분자인 대조군 분자의 결합과 비교하여 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있다. 예를 들어, 특이적 결합은 표적과 유사한 대조군 분자와의 경쟁에 의해 결정될 수 있다.

특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어, 항원 또는 에피토프에 대해 적어도 약 10^-4 M, 적어도 약 10^-5 M, 적어도 약 10^-6 M, 적어도 약 10^-7 M, 적어도 약 10^-8 M, 적어도 약 10^-9 M, 대안적으로 적어도 약 10^-10 M, 적어도 약 10^-11 M, 적어도 약 10^-12 M 이상의 KD를 갖는 항체에 의해 나타낼 수 있고, 여기서 KD는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 전형적으로, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 항원 또는 에피토프에 대한 대조군 분자에 대해 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000-, 10,000배 이상인 KD를 가질 것이다.

또한, 특정 항원 또는 에피토프에 대한 특이적 결합은 예를 들어, 대조군에 대한 에피토프에 대해 적어도 20-, 50-, 100-, 500-, 1000-, 5,000- 또는 10,000배 이상의 항체 또는 에피토피에 대한 KA 또는 Ka를 갖는 항체에 의해 나타낼 수 있고, 여기서 KA 또는 Ka는 특정 항체-항원 상호작용의 해리 속도를 지칭한다. 결합 친화력은 일반적으로 BIACORE® 분석법을 사용하여 측정된다.

V. 항체

본 발명은 본원에서 설명되는 바와 같은 2개의 상이한 면역조절 항원에 결합하는 이중특이적 면역조절 항체의 생성에 관한 것이다. 아래에 설명되는 바와 같이, 용어 "항체"가 일반적으로 사용된다. 본 발명에서 사용되는 항체는 본원에 설명되는 바와 같은 다수의 형태를 취할 수 있다.

전통적인 항체 구조 단위는 전형적으로 사량체(tetramer)를 포함한다. 각각의 사량체는 전형적으로 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 구성되며, 각각의 쌍은 하나의 "경쇄"(전형적으로 약 25 kDa의 분자량을 가짐) 및 하나의 "중쇄"(전형적으로 약 50 내지 70 kDa의 분자량을 가짐)를 갖는다. 인간 경쇄는 카파 및 람다 경쇄로서 분류된다. 본 발명은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하나, 이에 한정되지 않는 수개의 서브클래스를 갖는, 일반적으로 IgG 클래스에 기초하는 이중특이적 항체에 관한 것이다. 일반적으로 IgG1, IgG2 및 IgG4는 IgG3보다 보다 빈번하게 사용된다. IgG1은 356(D 또는 E) 및 358(L 또는 M)에서 다형성을 갖는 상이한 알로타입을 갖는다는 점에 유의해야 한다. 본원에 도시되는 서열은 356D/358M 알로타입을 사용하며, 그러나, 다른 알로타입도 본원에 포함된다. 즉, 본원에 포함되는 IgG1 Fc 도메인을 포함하는 임의의 서열은 356D/358M 알로타입을 대체하는 356E/358L을 가질 수 있다.

게다가, 본원의 서열의 많은 부분은 세린에 의해 대체되는 위치 220에서 시스테인 중 적어도 하나를 가지며; 일반적으로, 이는 본원에서 도시되는 서열의 대부분에 대해 "scFv 단량체" 측 상에 있지만, 그것은 또한 이황화물 형성을 감소시키기 위해 "Fab 단량체" 측, 또는 둘 다 상에 있을 수 있다. 대체된 이들 시스테인(C220S) 중 하나 또는 둘 다는 본원의 서열 내에 특히 포함된다.

따라서, 본원에 사용되는 바와 같은 "이소타입"은 이들의 불변 영역의 화학적 및 항원 특성에 의해 정의되는 면역 글로불린의 임의의 서브클래스를 의미한다. 치료용 항체는 이소타입 및/또는 서브 클래스의 하이브리드를 또한 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 참조로 통합되는 미국 공개 제2009/0163699호에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 IgG1/G2 하이브리드의 pI 조작을 망라한다.

각 사슬의 아미노-말단 부분은 일반적으로 "Fv 도메인" 또는 "Fv 영역"으로본 기술 및 본원에서 지칭되는, 항원 주지에 주로 관여하는 약 100 내지 110개 이상의 아미노산의 가변 영역을 포함한다. 가변 영역에서, 3개의 루프가 중쇄 및 경쇄의 V 도메인 각각에 대해 수집되어 항원-결합 부위를 형성한다. 루프 각각은 상보성 결정 영역(이하, "CDR"로서 지칭됨)으로 지칭되며, 여기서 아미노산 서열의 변화가 가장 유의하다. "가변"은 가변 영역의 특정 분절이 항체 중의 서열에서 광범위하게 상이하다는 사실을 지칭한다. 가변 영역 내의 가변성은 고르게 분포되지 않는다. 그 대신, V 영역은 각각 9개 내지 15개 이상의 아미노산 길이 이상인 "초가변 영역(hypervariable region)"으로 칭하여지는 극단적 가변성의 더 짧은 영역에 의해 구분되는 15개 내지 30개의 아미노산의 프레임워크 영역(FR)으로 칭하여지는 상대적으로 변하지 않는 스트레치(stretch)로 구성된다.

각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노-말단으로부터 카르복시-말단으로 배열되는, 3개의 초가변 영역("상보성 결정 영역", "CDR") 및 4개의 FR로 구성된다:FR1_-CDR1_-FR2_-CDR2_-FR3_-CDR3_-FR4.

초가변 영역은 일반적으로 경쇄 가변 영역에서 대략 아미노산 잔기 24 내지 34 (LCDR1; "L"은 경쇄를 나타냄), 50 내지 56(LCDR2) 및 89 내지 97(LCDR3) 및 중쇄 가변 영역에서 대략 31 내지 35B(HCDR1; "H"는 중쇄를 나타냄), 50 내지 65(HCDR2) 및 95 내지 102(HCDR3) 로부터의 아미노산 잔기 (Kabat 등의, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 초가변 루프 (예컨대, 경쇄 가변 영역에서 잔기 26-32(LCDR1), 50-52(LCDR2) 및 91-96(LCDR3) 그리고 중쇄 가변 영역에서 26-32(HCDR1), 53-55(HCDR2) 및 96-101(HCDR3))를 형성하는 잔기들 (Chothia 및 Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917)을 포함한다. 본 발명의 특이적 CDR은 하기에 설명된다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, CDR의 정확한 넘버링 및 배치는 상이한 넘버링 시스템 중에서 상이할 수 있다. 그러나, 가변 중쇄 서열 및/또는 가변 경쇄 서열의 개시는 연관된(고유한) CDR의 개시를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 각각의 가변 중쇄 영역의 개시는 vhCDR(예를 들어, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3)의 개시이고 각 가변 경쇄 영역의 개시는 vlCDR(예를 들어, vlCDR1, vlCDR2 및 vlCDR3)의 개시이다.

CDR 넘버링의 유용한 비교는 아래와 같고, Lafranc 등의 Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77(2003)를 참조한다:

표 1.

	카밧+ 초티아	IMGT	카밧	AbM	초티아	컨택	Xencor
vhCDR1	26-35	27-38	31-35	26-35	26-32	30-35	26-35
vhCDR2	50-65	56-65	50-65	50-58	52-55	47-58	54-61
vhCDR3	95-102	105-117	95-102	95-102	95-102	93-101	103-116
vlCDR1	24-34	27-38	24-34	24-34	24-34	30-36	27-38
vlCDR2	50-56	56-65	50-56	50-56	50-56	46-55	56-65
vlCDR3	89-97	105-117	89-97	89-97	89-97	89-96	97-105

본 명세서 전반에 걸쳐, 카밧 넘버링 시스템은 일반적으로 가변 도메인의 잔기(대략, 경쇄 가변 영역의 잔기 1-107번 및 중쇄 가변 영역의 잔기 1-113번)를 지칭할 때 사용되고 Fc 영역의 경우 EU 넘버링 시스템이 사용된다(예를 들어, 전술한 바와 같은 Kabat 등 (1991)). 본 발명은 매우 많은 상이한 CDR 세트를 제공한다. 이 경우에, "완전 CDR 세트"는 3개의 가변 경쇄 및 3개의 가변 중쇄 CDR, 예를 들어 vlCDR1, vlCDR2, vlCDR3, vhCDR1, vhCDR2 및 vhCDR3을 포함한다. 이들은 각각 더 큰 가변 경쇄 또는 가변 중쇄 도메인의 일부일 수 있다. 또한, 본원에서 보다 완전히 개설된 바와 같이, 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인은 중쇄 및 경쇄가 사용될 때(예를 들어, Fab가 사용될 때), 별도의 폴리펩티드 사슬, 또는 scFv 서열의 경우 단일 폴리펩티드 사슬 상에 존재할 수 있다.

CDR은 항원-결합, 또는 보다 구체적으로는 항체의 에피토프 결합 부위의 형성에 기여한다. "에피토프"는 파라토프(paratope)로서 공지된 항체 분자의 가변 영역에서 특이적 항원-결합 부위와 상호작용하는 결정기(determinant)를 지칭한다. 에피토프는 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 그룹이고 보통 특이적 구조 특징뿐만 아니라, 특이적 전하 특징을 갖는다. 단일 항원은 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다.

에피토프는 결합에 직접 수반되는 아미노산 잔기(또한 에피토프의 면역우세 성분으로 칭하여짐) 및 특별히 항원 결합 펩티드에 의해 효과적으로 차단되는 아미노산 잔기와 같은, 결합에 직접 수반되지 않는, 다른 아미노산 잔기를 포함할 수 있으며; 즉, 아미노산 잔기는 특별히 항원결합 펩티드의 풋프린트(footprint) 내에 있다.

에피토프는 입체구조(conformational) 또는 선형일 수 있다. 입체구조적 에피토프는 선형 폴리펩티드 사슬의 상이한 분절로부터 공간적으로 병치된 아미노산에 의해 생산된다. 선형 에피토프는 폴리펩티드 사슬에서 인접한 아미노산 잔기에 의해 생산된 것이다. 입체구조적 및 비-입체구조적 에피토프는 전자에 대한 결합이 변성 용매 존재에서 상실되지만 후자에 대한 결합은 그렇지 않다는 점에서 구별될 수 있다.

에피토프는 전형적으로 독특한 공간 입체구조에서 적어도 3개, 보다 일반적으로 적어도 5개 또는 8개 내지 10개의 아미노산을 포함한다. 동일한 에피토프를 주지하는 항체는 표적 항원에 대한 다른 항체의 결합을 차단하는 하나의 항체의 능력, 예를 들어, "비닝(binning)"을 나타내는 간단한 면역검정법으로 입증될 수 있다. 아래에 약술된 바와 같이, 본 발명은 본원에 열거된 항원 결합 도메인 및 항체를 포함할뿐만 아니라, 열거된 항원 결합 도메인에 의해 결합된 에피토프와 결합하기 위해 경쟁하는 것을 포함한다.

각 사슬의 카르복시-말단 부분은 주로 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 정의한다. 카밧 등은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 수많은 일차 서열을 수집하였다. 서열의 보존 정도에 기초하여, 이들은 개별 일차 염기 서열을 CDR 및 프레임워크로 분류하였고 그 목록을 만들었다(전체적으로 참조로 통합되는, SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. 카 바트(Kabat) 등을 참조).

면역글로불린의 IgG 서브클래스에서, 중쇄에 여러 면역글로불린 도메인이 존재한다. 본원의 "면역글로불린(Ig) 도메인"은 구별된 삼차 구조를 갖는 면역글로불린의 영역을 의미한다. 본 발명에서 흥미로운 것은 불변 중쇄(CH) 도메인 및 힌지 도메인을 포함하는 중쇄 도메인이다. IgG 항체의 상황에서, IgG 이소타입은 각각 3개의 CH 영역을 갖는다. 따라서, IgG의 상황에서 "CH" 도메인은 다음과 같다: "CH1"은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 118-220 위치를 지칭한다. "CH2"는 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 237-340 위치를 지칭하고, "CH3"은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따라 34-447번 위치를 지칭한다. 본원에 도시되고 아래에 설명되는 바와 같이, pI 변이체는 하기에 설명되는, 힌지 영역뿐만 아니라, CH 영역 중 하나 이상에 존재할 수 있다.

중쇄의 또 다른 유형의 Ig 도메인은 힌지 영역이다. 본원에서 "힌지" 또는 "힌지 영역" 또는 "항체 힌지 영역" 또는 "면역글로불린 힌지 영역"은 항체의 제1 및 제2 불변 도메인 사이의 아미노산을 포함하는 가요성 폴리펩티드를 의미한다. 구조적으로, IgG CH1 도메인은 EU 위치 220에서 종료하고, IgG CH2 도메인은 잔기 EU 위치 237에서 시작된다. 따라서 IgG의 경우, 항체 힌지는 본원에서 위치 221(IgG1에서 D221) 내지 236(IgG1에서 G236)을 포함하도록 정의되며, 넘버링은 카밧에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 일부 구현예에서, 예를 들어 Fc 영역의 상황에서, 하부 힌지가 포함되고, "하부 힌지"는 일반적으로 위치 226 또는 230을 지칭한다. 본원에 언급되는 바와 같이, pI 변이체는 또한 힌지 영역에서 형성될 수 있다.

경쇄는 일반적으로 2개의 도메인, 가변 경쇄 도메인(경쇄 CDR 및 Fv 영역을 형성하는 가변 중쇄 도메인과 함께 포함함), 및 불변 경쇄 영역(종종 CL 또는 Cκ로 지칭됨)을 포함한다.

아래에 개설되는 추가적인 치환을 위한 관심있는 다른 영역은 Fc 영역이다.

따라서, 본 발명은 상이한 항체 도메인을 제공한다. 본원에 설명되고 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 본 발명의 이종이량체 항체는 중쇄 및 경쇄 내에 상이한 도메인을 포함하며, 이는 또한 중첩하고 있을 수 있다. 이들 도메인은 Fc 도메인, CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인, 힌지 도메인, 중쇄 불변 도메인(CH1-힌지-Fc 도메인 또는 CH1-힌지-CH2-CH3), 가변 중쇄 도메인, 가변 경쇄 도메인, 경쇄 불변 도메인, Fab 도메인 및 scFv 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

따라서, "Fc 도메인"은 -CH2-CH3 도메인, 및 선택적으로, 힌지 도메인을 포함한다. 본원의 구현예에서, scFv가 Fc 도메인에 부착되는 경우, 이는 Fc 도메인의 힌지의 전부 또는 일부에 부착되는 scFv 작제물의 C-말단이며; 예를 들어, 이는 일반적으로 힌지의 시작 부분인 서열 EPKS에 부착된다. 중쇄는 가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함하며, CH2-CH3를 포함하는 CH1-선택적인 힌지-Fc 도메인을 포함한다. 경쇄는 가변 경쇄 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. scFv는 가변 중쇄, scFv 링커 및 가변 경쇄 도메인을 포함한다. 본원에 개설되는 대부분의 구조 및 서열에서, 가변 경쇄의 C-말단은 scFv 링커의 N-말단에 부착되며, 그의 C-말단은 가변 중쇄(N-vh-링커-vl-C)의 N-말단에 부착되지만 그것은 전환될 수 있다(N-vl-링커-vh-C). 본 발명의 일부 구현예는 자연 발생적인 것은 아니지만, 일반적으로 scFv 링커에 의해 함께 링크되는, 가변 중쇄 도메인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하는 적어도 하나의 scFv 도메인을 포함한다. 본원에 개설된 바와 같이, scFv 도메인은 일반적으로 vh-scFv 링커-v1로서 N-말단으로부터 C-말단으로 배향되이지만, 이것은 형태에 따라 일단 또는 양단에서의 선택적 링커를 사용하여, vl-scFv 링커-vh로, scFv 도메인(또는 Fab로부터의 vh 및 vl 서열을 사용하여 구성된 것들) 중 임의의 것에 대해 역전될 수 있다(일반적으로 도 2 참조).

본원에 나타낸 바와 같이, 일반적으로 재조합 기술에 의해 생성되는, 전통적인 펩티드 결합을 포함하여 사용될 수 있는 다수의 적합한 scFv 링커가 있다. 링커 펩티드는 주로 하기 아미노산 잔기를 포함한다: Gly, Ser, Ala 또는 Thr. 링커 펩티드는 원하는 활성을 보유하도록 서로에 대해 정확한 입체구조를 가정하는 방식으로 2개의 분자를 링크하는데 적합한 길이를 가져야 한다. 일 구현예에서, 링커는 약 1개 내지 50개의 아미노산 길이이며, 바람직하게는 약 1개 내지 30개의 아미노산 길이이다. 일 구현예에서, 1개 내지 20개의 아미노산 길이의 링커가 사용될 수 있으며, 약 5개 내지 약 10개의 아미노산이 일부 구현예에서 사용된다. 유용한 링커는 예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하되, 여기서 n은 적어도 1의 정수(및 일반적으로 3 내지 4)인 글리신-세린 중합체, 글리신-알라닌 중합체, 알라닌-세린 중합체 및 기타 가요성 링커를 포함한다. 대안적으로, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는 다양한 비단백질성 중합체가 링커로서 사용될 수 있으며, 그것은 링커로서의 사용될 수 있다.

다른 링커 서열은 CL/CH1 도메인의 임의의 길이의 임의의 서열을 포함하지만 CL/CH1 도메인의 모든 잔기를 포함하지 않을 수 있으며; 예를 들어, CL/CH1 도메인의 첫 번째 5-12 아미노산 잔기이다. 링커는 면역 글로불린 경쇄, 예를 들어, Cκ 또는 Cλ로부터 유도될 수 있다. 링커는 예를 들어, Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4, Cα1, Cα2, Cδ, Cε, 및 Cμ를 포함하는, 임의의 이소타입의 면역 글로불린 중쇄로부터 유도될 수 있다. 링커 서열은 또한 Ig-유사 단백질(예를 들어, TCR, FcR, KIR), 힌지 영역 유래 서열, 및 다른 단백질의 다른 천연 서열과 같은 다른 단백질로부터 유도될 수 있다.

일부 구현예에서, 링커는 본원에 개설된 바와 같은 임의의 2개의 도메인을 함께 연결시키기 위해 사용되는, "도메인 링커"이다. 임의의 적합한 링커가 사용될 수 있지만, 많은 구현예는 예를 들어, (GS)n, (GSGGS)n, (GGGGS)n 및 (GGGS)n을 포함하되, 여기서 n은 적어도 1의 정수(및 일반적으로 3 내지 4 내지 5)인 글리신-세린 중합체뿐만 아니라 각 도메인이 그의 생물학적 기능을 유지하는 것을 허용하는 충분한 길이 및 가요성을 갖는 2개의 도메인의 재조합 부착을 허용하는 임의의 펩티드 서열을 이용한다. 일부 경우에서, 그리고 "꼬임(strandedness)"에 주의를 기울이면서, 아래에 개설되는 바와 같이, scFv 링커의 일부 구현예에서 사용되는 바와 같은, 하전된 도메인 링커가 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, scFv 링커는 하전된 scFv 링커이며, 그 다수가 도 8에 나타낸다. 따라서, 본 발명은 제1 및 제2 단량체 사이의 pI에서 분리를 용이하게하기 위해 하전된 scFv 링커를 추가로 제공한다. 즉, 양성 또는 음성(또는 상이한 단량체 상에 scFv를 사용하는 스캐폴드(scaffold)의 경우, 둘 다)인, 하전된 scFv 링커를 통합함으로써, 이것은 하전된 링커를 포함하는 단량체가 Fc 도메인에서 추가적인 변화를 만드는 것 없이 pI를 변화시키는 것을 허용한다. 이들 하전된 링커는 표준 링커를 포함하는 scFv로 치환될 수 있다. 다시, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 하전된 scFv 링커는 pI의 원하는 변화에 따라, 정확한 "스트랜드(strand)" 또는 단량체 상에서 사용된다. 예를 들어, 본원에서 설명되는 바와 같이, 트리플 F 형태의 이종이량체 항체를 만들기 위해, 원하는 항원 결합 도메인 각각에 대한 Fv 영역의 원래 pI가 계산되고, 하나가 scFv를 형성하도록 선택되고, pI에 따라, 양성 또는 음성 링커가 선택된다.

하전된 도메인 링커는 또한 본 발명의 단량체의 pI 분리를 증가시키기 위해 사용될 수도 있고, 따라서 도 8에 포함되는 것들이 링커가 이용되는 본원의 임의의 구현예에서 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 항체는 그것이 pI 조작과 같은, 이종이량체를 생성하도록 조작될 수 있는 적어도 하나의 불변 도메인을 포함하는 한, 항체 단편(antibody fragment)이다. 사용될 수 있는 다른 항체 단편은 pI 조작된 본 발명의 CH1, CH2, CH3, 힌지 및 CL 도메인 중 하나 이상을 포함하는 단편을 포함할 수 있다. 특히, 도 1에 도시되는 형태는 단백질이 Fab 또는 scFv로서든, 이종이량체 Fc 도메인 및 적어도 2개의 Fv 영역으로 자기 조립되는 적어도 2개의 연관된 Fc 서열을 갖는 것을 의미하는, 통상적으로 "이종이량체 항체"로 지칭되는, 항체이다.

A. 키메라 및 인간화 항체

일부 구현예에서, 본원의 항체는 상이한 종, 예를 들어, 키메라 항체 및/또는 인간화 항체로부터의 혼합체로부터 유도될 수 있다. 일반적으로, "키메라 항체" 및 "인간화 항체" 둘 다는 하나보다 많은 종으로부터의 영역을 결합하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, "키메라 항체"는 전통적으로 마우스(또는 일부 경우에서, 래트)로부터의 가변 영역(들) 및 인간으로부터의 불변 영역(들)을 포함한다. "인간화 항체"는 일반적으로 인간 항체에서 발견되는 서열에 대해 스왑된 가변-도메인 프레임워크 영역을 갖는 비-인간 항체를 지칭한다. 일반적으로, 인간화 항체에서, CDR을 제외한 전체 항체는 인간 기원의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되거나 그것의 CDR 내에서를 제외하고 그러한 항체와 동일하다. 비-인간 유기체에서 기원한 핵산에 의해 인코딩되는 CDR의 일부 또는 전부는 항체를 생성하기 위해 인간 항체 가변 영역의 베타-시트 프레임워크에 이식되며, 항체의 특이성은 이식된 CDR에 의해 결정된다. 그러한 항체의 생성은 예를 들어, WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321: 522-525, Verhoeyen 등의 1988, Science 239: 1534-1536에서 설명되며, 모두가 전체적으로 참조로 통합된다. 대응하는 공여체 잔기에 대한 선택된 수용체 프레임워크 잔기의 "역돌연변이(backmutation)"는 종종 초기 이식된 구조에서 손실되는 친화성을 회복하기 위해 요구된다(US 5530101; US 5585089; US 5693761; US 5693762; US 6180370; US 5859205; US 5821337; US 6054297; US 6407213, 모두가 전체적으로 참조로 통합됨). 인간화 항체는 최적으로 또한 면역글로불린의 불변 영역의 적어도 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 일부를 포함할 것이고, 따라서 전형적으로 인간 Fc 영역을 포함할 것이다. 인간화 항체는 또한 유전자 조작된 면역계를 갖는 마우스를 사용하여 생성될 수 있다. Roque 등의 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654는 전체적으로 참조로 통합된다. 비-인간 항체를 인간화하여 재형성하기 위한 다양한 기술 및 방법이 당해 분야에 잘 알려져있다(Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science(USA) 및, 그 내에 인용되는 참고문헌을 참조하며, 모두는 전체적으로 참조로 통합됨). 인간화 방법은 Jones 등의 1986, Nature 321:522-525; Riechmann 등의 1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen 등의 1988, Science, 239:1534-1536; Queen 등의 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He 등의 1998, J. Immunol. 160:1029-1035; Carter 등의 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta 등의 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman 등 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor 등의 1998, Protein Eng 11:321-8에서 설명되는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 모두는 전체적으로 참조로 통합된다. 인간화 또는 비인간 항체 가변 영역의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은 전체적으로 참조로 통합되는, 예를 들어 Roguska 등의 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973에 설명되는 바와 같은, 재표면화 방법을 포함할 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 항체는 특정 생식계열 중쇄 면역글로불린 유전자로부터의 중쇄 가변 영역 및/또는 특정 생식계열 경쇄 면역글로불린 유전자로부터의 경쇄 가변 영역을 포함한다. 예를 들어, 이러한 항체는 특정 생식계열 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래되는" 중쇄 또는 경쇄 가변 영역을 포함하는 인간 항체를 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래되는" 인간 항체는 인간 항체의 아미노산 서열을 인간 생식계열 면역글로불린의 아미노산 서열과 비교하고 인간 항체의 서열과 가장 가까운 서열(예를 들어, 가장 높은 %동일성)의 인간 생식계열 면역글로불린 서열을 선별함으로써 식별될 수 있다. 특정 인간 생식계열 면역글로불린 서열의 "산물"인 또는 "이로부터 유래되는" 인간 항체는 예를 들어, 자연 발생 체세포 돌연변이 또는 부위-특이적 돌연변이의 의도적인 도입으로 인해, 생식계열 서열과 비교하여 아미노산 차이를 포함할 수 있다. 그러나, 인간화 항체는 전형적으로 아미노산 서열에서 인간 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열과 적어도 90% 동일하고 다른 종의 생식계열 면역글로불린 아미노산 서열(예를 들어, 마우스 생식계열 서열)과 비교할 때 항체를 인간 서열로부터 유래된 것으로 식별하는 아미노산 잔기를 포함한다. 특정 경우에, 인간화 항체는 아미노산 서열에서 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열과 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99%, 또는 심지어 적어도 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 수 있다. 통상적으로, 특정 인간 생식계열 서열로부터 유래되는 인간화 항체는 인간 생식계열 면역 글로불린 유전자에 의해 인코딩되는 아미노산 서열로부터 10-20개 이하의 아미노산 차이를 표시할 것이다(본원에서 임의의 스큐, pI 및 절제 변이체의 도입 전에; 즉, 변이체의 수는 일반적으로 본 발명의 변이체를 도입하기 전에 낮다). 특정 경우에서, 인간화 항체는 생식계열 면역글로불린 유전자에 의해 인코딩된 아미노산 서열로부터 5개 이하 또는 심지어 4개, 3개, 2개 또는 1개 이하의 아미노산 차이를 표시할 수 있다(다시 말해, 본원에서 임의의 스큐, pI 및 절제 변이체의 도입 전에; 즉, 변이체의 수는 일반적으로 본 발명의 변이체를 도입하기 전에 낮다).

일 구현예에서, 모체 항체는 당해 분야에 공지된 바와 같이 친화성이 성숙되어 있다. 구조-기반의 방법이 예를 들어, USSN 11/004,590에 설명된 바와 같이 인간화 및 친화성 성숙을 위해 이용될 수 있다. 선택 기반 방법은 인간화 및/또는 친화성 성숙 항체 가변 영역에 이용될 수 있으며, 이는 모두 전체적으로 참조로 통합되는 Wu 등의 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca 등 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok 등의 1996, J. Biol. Chem. 271(37):22611-22618; Rader 등의 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:8910-8915; Krauss 등의 2003, Protein Engineering 16(10):753-759에서 설명되는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 인간화 방법은 모두 전적으로 참조로 통합되는, USSN 09/810,510; Tan et 등의 2002, Immunol. 169:1119-1125; De Pascalis 등의 2002, J. Immunol. 169:3076-3084에 설명되는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는, CDR의 일부만의 이식을 수반할 수 있다.

VI. 이종이량체 항체

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 이종이량체 Fc 도메인 및 이종이량체 항체를 형성하기 위해 자기 조립되는, 두 개의 상이한 중쇄 변이체 Fc 서열의 사용에 의존하는 이종이량체 면역조절 항체를 제공한다.

본 발명은 하나보다 많은 면역조절 항원 또는 리간드에 대한 결합을 허용하는, 예를 들어, 이중특이적 결합을 허용하는 이종이량체 항체를 제공하는 신규한 구조에 관한 것이다. 이종이량체 항체 구조는 항체의 중쇄의 2개의 Fc 도메인의 자기-조립 성질, 예를 들어, "이량체"로 조립되는 두 개의 "단량체"에 기초한다. 이종이량체 항체는 아래에서 더 완전히 설명되는 바와 같이 각각의 단량체의 아미노산 서열을 변경함으로써 제조된다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 이종이량체의 형성을 촉진시키고/시키거나 동종이량체에 비해 이종이량체의 정제의 용이성을 가능하게하기 위해 각각의 사슬 상에서 상이한 불변 영역의 아미노산 변이체에 의존하는, 수개의 방법으로 항원을 공동 결합시킬 수 있는 이종이량체 면역조절 항체의 생성에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 이중특이적 항체를 제공한다. 항체 기술의 지속적인 문제는 2개의 상이한 항원에 동시에 결합함으로써, 일반적으로 상이한 항원이 근접되도록 허용하고 새로운 기능과 새로운 치료법을 야기하는 "이중특이적" 항체에 대한 욕망이다. 일반적으로, 이들 항체는 각각의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 숙주 세포에 포함시킴으로써 제조된다. 이것은 일반적으로 원하는 이종이량체(A-B)뿐만 아니라, 두 개의 동종이량체(A-A 및 B-B(경쇄 이종이량체 문제를 포함하지 않음))의 형성을 야기한다. 그러나, 이중특이적 항체의 형성에서 주요 장애는 동종이량체 항체로부터 이종이량체 항체를 정제하고/하거나 동종이량체의 형성에 대한 이종이량체의 형성을 바이어스하는 것의 어렵다는 것이다.

본 발명의 이종이량체를 생성하기 위해 사용될 수 있는 다수의 메카니즘이 있다. 또한, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 이러한 메카니즘은 높은 이종이량체화를 보장하기 위해 결합될 수 있다. 따라서, 이종이량체의 생산을 유도하는 아미노산 변이체는 "이종이량체화 변이체"로 지칭된다. 하기 설명된 바와 같이, 이종이량체화 변이체는 입체 변이체(예를 들어, 하기 설명된 "노브 및 홀" 또는 "스큐"변이체 및 하기 설명되는 "하전 쌍" 변이체)뿐만 아니라 "pI 변이체"를 포함할 수 있으며, 이는 이종이량체로부터 동종이량체의 정제를 허용한다. 본원에 "이종이량체화 변이체"의 설명을 위해 하기와 같이 그 전체가 그리고 특별히 참조로 통합되는, WO2014/145806에서 일반적으로 설명되는 바와 같이, 이종이량체화를 위한 유용한 메카니즘은 "노브 및 홀"("KIH"; 때로는 본원에서 "스큐" 변이체(WO2014/145806의 설명을 참조), WO2014/145806에 설명되는 바와 같은 "정전기 스티어링" 또는 "하전 쌍", WO2014/145806에 설명되는 바와 같은 pI 변이체, 및 WO2014/145806 및 이하에 개설되는 바와 같은 일반적인 추가 Fc 변이체를 포함한다.

본 발명에서, 이종이량체 항체를 용이하게 정제하는 것을 초래할 수 있는 수개의 기본 메카니즘이 있으며; 하나는 pI 변이체의 사용에 의존함으로써, 각각의 단량체가 상이한 pI를 가지며, 따라서 A-A, A-B 및 B-B 이량체 단백질의 등전위 정제를 허용한다. 대안적으로, "트리플 F" 형태와 같은 일부 스캐폴드 형태는 또한 크기 기준으로 분리를 가능하게 한다. 아래에 더 개설되는 바와 같이, 또한 동종이량체에 대해 이종이량체의 형성을 "스큐(slew)"하는 것이 가능하다. 따라서, 입체 이종이량체화 변이체 및 pI 또는 하전 쌍 변이체의 조합이 본 발명에서 사용된다.

일반적으로, 본 발명의 특정 사용의 구현예는 2개의 단량체 간의 pI 차이를 증가시키는, pI 변이체와 결합되는, 동종이량체화 형성보다 이종이량체화 형성을 장려하는, 스큐 변이체를 포함하는 변이체 세트에 의존한다.

또한, 아래에 더 완전히 개설되는 바와 같이, 이종이량체 항체의 형태에 따라, pI 변이체는 단량체의 불변 및/또는 Fc 도메인 내에 포함될 수 있거나, 하전된 링커, 도메인 링커 또는 scFv 링커 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 즉, 트리플 F 형태와 같은 scFv(들)을 이용하는 스캐폴드는 정제 목적을 위해 추가 pI 상승(boost)을 제공하는, 하전된 scFv 링커(양성 또는 음성)를 포함할 수 있다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 일부 트리플 F 형태는 하전된 scFv 링커에만 유용하고 추가적인 pI 조정이 없지만, 본 발명은 또한 단량체, 및/또는 하전된 도메인 링커 중 하나 또는 둘 다 상에 있는 pI 변이체를 제공한다. 또한, 대안적인 기능을 위한 추가적인 아미노산 조작은 또한 pI 변화들, 예컨대, Fc, FcRn 및 KO 변이체를 부여할 수 있다.

이종이량체 단백질의 정제를 가능하게하기 위한 분리 메카니즘으로써 pI를 이용하는 본 발명에서, 아미노산 변이체는 단량체 폴리펩티드 중 하나 또는 둘 다에 도입 될 수 있으며; 즉 단량체 중 하나(본원에서 단순화를 위해 "단량체 A"로 지칭됨)의 pI는 단량체 B로부터 멀리 떨어지게 조작될 수 있거나, 양 단량체 A 및 B 변화는 단량체 A의 pI는 증가하고, 단량체 B의 pI는 감소한 상태로, 변화될 수 있다. 설명된 바와 같이, 단량체 또는 양 단량체의 pI 변화는 하전된 잔기(예를 들어, 중성 아미노산이 양으로 또는 음으로 하전된 아미노산 잔기에 의해 대체되며, 예를 들어, 글리신에서 글루탐산)를 제거 또는 추가하고, 양성 또는 음성으로부터 반대 으로 하전된 잔기(예를 들어, 아스파르트산에서 라이신)를 변경하거나 하전된 잔기를 중성 잔기(예를 들어, 전하 손실; 라이신에서 세린)로 변경하는 것에 의해 수행된다. 다수의 이들 변이체가 도면에 나타낸다.

따라서, 본 발명의 이러한 구현예는 이종이량체가 동종이량체로부터 분리될 수 있도록 단량체 중 적어도 하나에서 pI의 충분한 변화를 생성하는 것을 제공한다. 당업자에 의해 주지되고, 아래에 더 설명되는 바와 같이, 이는 "와일드형" 중쇄 불변 영역 및 그의 pI를 증가 또는 감소시키기 위해(wt A_-+B 또는 wt A_{- -}B) 조작되었던 변이체 영역을 사용하거나, 하나의 영역을 증가시키고 다른 영역을 감소시킴으로써(A+_-B- 또는 A_- B+) 수행된다.

따라서, 일반적으로, 본 발명의 일부 구현예의 구성요소는 아미노산 치환("pI 변이체" 또는 "pI 치환")을 단량체의 하나 또는 둘 다에 통합함으로써 "pI 항체"를 형성하기 위해 이량체 단백질의 단량체 중, 둘 다가 아니면, 적어도 하나의 등전점(pI)을 변경시키도록 지향되는 항체 불변 영역의 아미노산 변이체이다. 본원에 나타낸 바와 같이, 2개의 동종이량체로부터 이종이량체의 분리는 2개의 단량체의 pI가 0.1 pH 단위만큼 작게 상이한 경우 달성될 수 있으며, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 이상 모두가 본 발명에서 사용된다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 양호한 분리를 얻기 위해 각각의 또는 양 단량체(들) 상에 포함되는 pI 변이체의 수는 구성요소의 시작 pI, 예를 들어, 트리플 F 형태에서, 관심있는 scFv 및 Fab의 시작 pI에 부분적으로 의존할 것이다. 즉, 조작할 단량체 또는 "방위"(예를 들어, 더 큰 양성 또는 더 큰 음성)을 결정하기 위해, 2개의 표적 항원의 Fv 서열이 계산되고 이로부터 결정이 제조된다. 당해 분야에 공지된 바와 같이, 상이한 Fv는 본 발명에서 이용되는 상이한 시작 pI를 가질 것이다. 일반적으로, 본원에서 개설된 바와 같이, pI는 적어도 약 0.1 로그의 각각의 단량체의 총 pI 차이를 야기하도록 조작되며, 0.2 내지 0.5가 본원에서 개설된 바와 같이 바람직하다. 더욱이, 당업자에 의해 주지되고 본원에서 개설되는 바와 같이, 일부 경우에서(형태에 따라), 이종이량체는 크기에 기초하여 동종이량체로부터 분리될 수 있다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 예를 들어, 수개의 형태는 크기에 기초하여 이종이량체 및 동종이량체의 분리를 가능하게 한다.

A. 이종이량체화 변이체

본 발명은 동종이량체로부터 이종이량체 형성 및/또는 정제를 가능하게하기 위해 이종이량체 변이체를 이용하는, 다양한 형태의 이종이량체 항체를 포함하는, 이종이량체 단백질을 제공한다. 다수의 이종이량체화 변이체가 도 4에 나타낸다.

다수의 적합한 쌍의 이종이량체화 스큐 변이체 세트가 존재한다. 이들 변이체는 "세트"의 "쌍"으로 나타난다. 즉, 한 세트의 쌍은 제1 단량체에 통합되고 다른 세트의 쌍은 제2 단량체에 통합된다. 이들 세트는 하나의 단량체 상의 잔기와 다른 단량체 상의 잔기 사이에서 일대일 대응을 갖는, "노브 인 홀(knobs in holes)" 변이체로 반드시 작동할 필요가 없다는 점에 유의해야 하며; 즉, 이들 쌍들의 세트는 이종이량체 형성을 촉진하고 동종이량체 형성을 방해하는 2개의 단량체 사이에 계면을 형성하여, 예상되는 50%(25% 동종이량체 A/A:50% 이종이량체A/B:25% 동종이량체B/B) 보다는, 생물학적 조건 하에서 90% 넘도록 자발적으로 형성되는 이종이량체의 퍼센트를 허용한다.

B. 입체 변이체

일부 구현예에서, 이종이량체의 형성은 입체 변이체의 추가에 의해 촉진될 수 있다. 즉, 각각의 중쇄에서 아미노산을 변화시킴으로써, 상이한 중쇄는 동일한 Fc 아미노산 서열을 갖는 동종이량체를 형성하기보다 이종이량체 구조를 형성하는 것과 연관될 가능성이 있다. 적합한 입체 변이체가 도면에 포함된다.

하나의 메카니즘은 당해 분야에서 "이종이량체 형성을 선호하고 동종이량체 형성을 선호하지 않는 입체 영향을 생성하는 아미노산 조작이 또한 선택적으로, 사용되는 것을 지칭하는, 노브 및 홀(knobs and holes)"로서 지칭되며; 이것은 때때로 USSN 61/596,846, Ridgway 등의 Protein Engineering 9(7):617(1996); Atwell 등의 J. Mol. Biol. 1997 270:26; 미국 특허 번호 제8,216,805호에 설명되는 바와 같은 "노브 및 홀"로서 지칭되며, 그 모두는 본원에 그 전체가 참조로 통합된다. 도면은 "노브 및 홀"에 의존하는 다수의 "단량체 A - 단량체 B" 쌍을 식별한다. 게다가, Merchant 등의 Nature Biotech. 16:677(1998)에서 설명되는 바와 같이, 이들 "노브 및 홀" 돌연변이는 이황화물 결합과 결합하여 이종이량체화에 대한 형성을 스큐할 수 있다.

이종이량체의 생성에 사용되는 추가적인 메카니즘은 때때로 Gunasekaran 등의 J. Biol. Chem. 285(25):19637(2010)에 설명되는 바와 같은 "정전기 스티어링"으로서 지칭되며, 이로서 그 전체가 참조로 통합된다. 이것은 때때로 본원에서 "하전 쌍"으로 지칭된다. 이러한 구현예에서, 정전기는 이종이량체화를 향하여 형성을 스큐하기 위해 사용된다. 당업자에 의해 주지될 수 있는 바와 같이, 이들은 또한 pI, 및 따라서 정제에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 일부 경우에 또한 pI 변이체로서 간주될 수 있을 것이다. 그러나, 이들이 이종이량체화를 강제하기 위해 생성되었고 정제 도구로서 사용되지 않기 때문에, 이들은 "입체 변이체"로 분류된다. 이들은 D221R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 D221E/P228E/L368E(예를 들어, 이들은 "단량체 대응 세트") 및 C220R/E224R/P228R/K409R과 쌍을 이루는 C220E/P228E/368E를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 개설되는 pI 변이체 또는 US 2012/0149876의 도 37에 도시되는 다른 입체 변이체와 같은, 임의의 양에서 선택적이고 독립적으로, 다른 변이체와 결합될 수 있는 추가적인 단량체 A 및 단량체 B, 그 도면 및 리간드 및 SEQ ID NO는 본원에서 참조로 명백하게 통합된다.

일부 구현예에서, 본원에서 개설되는 입체 변이체는 선택적이고 독립적으로 임의로 pI 변이체(또는 Fc 변이체, FcRn 변이체등과 같은 다른 변이체)와 하나 또는 두 개의 단량체로 통합될 수 있고, 독립적이고 선택적으로, 본 발명의 단백질로부터 포함되거나 배제될 수 있다.

적합한 스큐 변이체의 목록은 많은 구현예에서 특정 유틸리티의 일부 쌍을 도시하는 도 4에서 발견된다. 많은 구현예에서의 특정 사용은 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q 및 T366S/L368A/Y407V:T366W(선택적으로, 브리징 이황화물, T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C를 포함함)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 세트의 쌍이다. 명명법에 관하여, 쌍 "S364K/E357Q:L368D/K370S"는 단량체 중 하나가 이중 변이체 세트 S364K/E357Q를 갖고 다른 것이 이중 변이체 세트 L368D/K370S를 갖는다는 것을 의미하며; 상술한 바와 같이, 이들 쌍의 "꼬임(strandedness)"은 시작 pI에 의존한다.

C. 이종이량체에 대한 pI(등전점) 변이체

일반적으로, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, pI 변이체에 대한 2개의 일반적인 카테고리가 존재한다: 단백질의 pI를 증가시키는 것(염기성 변화) 및 단백질의 pI를 감소시키는 것(산성 변화). 본원에서 설명되는 바와 같이, 이들 변이체의 모든 조합이 수행될 수 있다: 하나의 단량체는 와일드형, 또는 와일드형으로부터 현저히 상이한 pI를 표시하지 않는 변이체일 수 있고, 다른 하나는 보다 염기성이거나 보다 산성일 수 있다. 대안적으로, 각각의 단량체는 1 내지 보다 염기성으로 및 1 내지 보다 산성으로, 변화된다.

pI 변이체의 바람직한 조합이 도 5에 나타낸다. 본원에 개설되고 도면에 나타낸 바와 같이, 이들 변화는 IgG1에 대해 도시되지만, 모든 이소타입은 이러한 방식뿐만 아니라, 이소타입 하이브리드로 변형될 수 있다. 중쇄 불변 도메인이 IgG2-4로부터 유래하는 경우, R133E 및 R133Q가 또한 사용될 수 있다.

일 구현예에서, 예를 들어, 병따개 형태에서, pI 변이체의 바람직한 조합은 208D/295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1에 상대적인 경우 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함하는 제1 단량체(음성 Fab 측) 및 (GKPGS)₄를 포함하는, 양으로 하전된 scFv 링커를 포함하는 제2 단량체(양성 scFv면)를 포함한다. 그러나, 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 제1 단량체는 위치 208을 포함하는, CH1 도메인을 포함한다. 따라서, CH1 도메인을 포함하지 않는 작제물에서(예를 들어, 이중 scFv 형태에서, 예를 들어, 도메인 중 하나 상의 CH1 도메인을 이용하지 않는 이종이량체 Fc 융합 단백질에 대해), 바람직한 음성 pI 변이체 Fc 세트는 295E/384D/418E/421D 변이체(인간 IgG1에 상대적인 경우 Q295E/N384D/Q418E/N421D)를 포함한다.

따라서, 일부 구현예에서, 하나의 단량체는 도 5로부터 한 세트의 치환을 갖고 다른 단량체는 (형태가 지시하는 바와 같이, 그러한 단량체가 scFv를 포함하기 때문에 하전된 scFv 링커 또는 하전된 도메인 링커의 형태 중 어느 하나의) 하전된 링커를 갖는다.

1. 이소타입 변이체

게다가, 본 발명의 많은 구현예는 특정 위치에서 하나의 IgG 이소타입으로부터 다른 것으로 pI 아미노산의 "이입(importation)"에 의존하며, 따라서 변이체로 도입되는 원치 않는 면역원성의 가능성을 감소시키거나 제거한다. 이들의 번호는 미국 공개 제2014/0370013호에 도시되며, 본원에 참조로 통합된다. 즉, IgG1은 높은 이펙터 기능을 포함하는, 다양한 이유로 치료용 항체를 위한 공통 이소타입이다. 그러나, IgG1의 경쇄 불변 영역은 IgG2의 pI보다 더 높은 pI를 갖는다(8.10 대 7.31). IgG2 잔기를 특정 위치에서 IgG1 백본에 도입함으로써, 결과적인 단량체의 pI는 낮아지거나(증가되고) 추가로 더 긴 혈청 반감기를 나타낸다. 예를 들어, IgG1은 위치 137에서 글리신(pI 5.97)을 갖고, IgG2는 글루타민산(pI 3.22)을 가지며; 글루탐산을 이입하는 것은 단백질의 pI에 영향을 미친다. 아래에 설명되는 바와 같이, 다수의 아미노산 치환이 일반적으로 변이체 항체의 pI에 상당히 영향을 미치기 위해 요구된다. 그러나, 아래에 설명되는 바와 같이, IgG2 분자의 변화조차도 증가된 혈청 반감기를 허용한다는 점에 유의해야 한다.

다른 구현예에서, 비-이소타입 아미노산 변화는 아래에 더 추가로 설명되는 바와 같이, (예를 들어, 더 높은 pI 아미노산을 더 낮은 pI 아미노산으로 변경시킴으로써) 결과적인 단백질의 전체 하전 상태를 감소시키거나, 안정성을 위해 구조 내 수용을 허용하도록 제조된다.

또한, 중쇄 및 경쇄 불변 도메인 둘 다를 pI 조작함으로써, 이종이량체의 각각의 단량체에서의 상당한 변화를 볼 수 있다. 본원에 설명되는 바와 같이, 2개의 단량체의 pI를 적어도 0.5만큼 다르게 하는 것은 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 전기영동, 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 허용할 수 있다.

D. pI 계산

각각의 단량체의 pI는 변이체 중쇄 불변 도메인 및 융합 파트너를 포함하는, 변이체 중쇄 불변 도메인의 pI 및 전체 단량체의 pI에 의존할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, pI의 변화는 변이체 중쇄 불변 도메인에 기초하여 계산되며, 미국 공개 제2014/0370013호를 이용한다. 본원에서 설명되는 바와 같이, 어떤 단량체를 조작할 것인지는 일반적으로 Fv 및 스캐폴드 영역의 본래의 pI에 의해 결정된다. 또는, 각각의 단량체의 pI가 비교될 수 있다.

E. 생체내 결합에서 더 양호한 FcRn을 또한 부여하는 pI 변이체

pI 변이체가 단량체의 pI를 감소시키는 경우, 이들은 생체내 혈청 보유를 향상시키는 추가적인 이점을 가질 수 있다.

아직 검사 중이지만, Fc 영역은 엔도좀의 pH 6에서 FcRn에 대한 결합이 Fc를 격리하기 때문에, 생체내에서 더 긴 반감기를 갖는 것으로 믿어진다(Ghetie 및 Ward, 1997 Immunol Today. 18(12):592-598, 전체적으로 참조로 통합됨). 그 다음, 엔도솜 구획은 Fc를 세포 표면으로 재활용한다. 구획이 세포 외 공간으로 개방되면, 더 높은 pH, ~ 7.4는 혈액으로 다시 Fc 방출을 유도한다. 마우스에 있어서, Dall 'Acqua 등은 pH 6 및 pH 7.4에서 증가된 FcRn 결합을 갖는 Fc 돌연변이가 실제로 감소된 혈청 농도 및 와일드형 Fc와 동일한 반감기를 가졌다는 것을 나타냈다(Dall 'Acqua 등의 2002, J. Immunol. 169:5171-5180, 전체적으로 참조로 통합됨). pH 7.4에서 FcRn에 대한 Fc의 증가된 친화성은 혈액으로 다시 Fc의 방출을 금지하는 것으로 생각된다. 따라서, 생체내에서 Fc의 반감기를 증가시키는 Fc 돌연변이는 더 높은 pH에서 여전히 Fc의 방출을 허용하는 동안 더 낮은 pH에서 FcRn 결합을 이상적으로 증가시킬 것이다. 아미노산 히스티딘은 6.0 내지 7.4의 pH 범상기 그 하전 상태를 변화시킨다. 따라서, Fc/FcRn 복합체의 중요한 위치에서 그의 잔기를 발견하는 것은 놀라운 일이 아니다.

최근, 더 낮은 등전점을 갖는 가변 영역을 지닌 항체가 또한 더 긴 혈청 반감기를 가질 수 있다는 것이 제안되어왔다(Igawa 등의 2010 PEDS. 23(5):385-392, 전체적으로 참조로 통합됨). 그러나, 이것의 메카니즘은 아직도 잘 주지되지 않고 있다. 또한, 가변 영역은 항체마다 다르다. 감소된 pI 및 연장된 반감기를 갖는 불변 영역 변이체는 본원에서 설명되는 바와 같이, 항체의 약동학적 특성을 개선시키기 위해 더욱 모듈식 접근법을 제공할 것이다.

F. 추가 기능을 위한 추가 Fc 변이체

pI 아미노산 변이체에 더하여, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합 변경, FcRn 수용체에 대한 변경된 결합 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 다양한 이유에 대해 이루어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 아미노산 변형이 존재한다.

따라서, 본 발명의 단백질은 pI 변이체 및 입체 변이체를 포함하는, 본원에 개설되는 이종이량체화 변이체를 포함하는, 아미노산 변형을 포함할 수 있다. 각각의 변이체 세트는 독립적으로 그리고 선택적으로, 임의의 특정 이종이량체 단백질로부터 포함하거나 배제될 수 있다.

G. FcγR 변이체

따라서, 하나 이상의 FcγR 수용체에 대한 결합을 변경하기 위해 이루어질 수 있는 다수의 유용한 Fc 치환이 존재한다. 증가된 결합뿐만 아니라 감소된 결합을 야기하는 치환이 유용할 수 있다. 예를 들어, FcγRIIIa 에 대한 증가된 결합이 일반적으로 증가된 ADCC(항체 의존 세포-매개 세포독성; FcγR을 발현하는 비특이적 세포독성 세포가 표적 세포 상의 결합된 항체를 주지하고 그 다음 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개 반응)를 야기하는 것으로 알려져 있다. 유사하게, FcγRIIb(억제 수용체)에 대한 감소된 결합이 일부 상황에서 또한 유익할 수 있다. 본 발명에 사용되는 아미노산 치환은 USSN 11/124,620(특히 도 41), 11/174,287, 11/396,495, 11/538,406에 열거되는 것을 포함하며, 그 모두는 명백하게 그 전체가 그리고 본원에 개시되는 변이체에 대해 특별히 참조로 통합된다. 사용 가능한 특정 변이체는 236A, 239D, 239E, 332E, 332D, 239D/332E, 267D, 267E, 328F, 267E/328F, 236A/332E, 239D/332E/330Y, 239D, 332E/330L, 243A, 243L, 264A, 264V 및 299T를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

게다가, 434S, 434A, 428L, 308F, 259I, 428L/434S, 259I/308F, 436I/428L, 436I 또는 V/434S, 436V/428L 및 259I/308F/428L을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 본원에 그 전체가 참조로 통합되는, USSN 12/341,769에 구체적으로 개시되는 바와 같은, FcRn 수용체에 대한 증가된 결합 및 증가된 혈청 반감기에 사용되는 추가적인 Fc 치환이 존재한다.

H. 절제 변이체

유사하게, 기능적 변이체의 다른 카테고리는 "FcγR 절제 변이체" 또는 "Fc 녹 아웃(FcKO 또는 KO)"변이체이다. 이들 구현예에서, 일부 치료적 용도를 위해, Fcγ 수용체(예를 들어, FcγR1, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa 등) 중 하나 이상 또는 전부에 대한 Fc 도메인의 정상 결합을 감소시키거나 제거하여 추가적인 작용 메카니즘을 회피하는 것이 바람직하다. 즉, 예를 들어, 많은 구현예에서, 특히 Fc 도메인 중 하나가 하나 이상의 Fcγ 수용체 절제 변이체를 포함하도록 ADCC 활성을 제거하거나 특히 감소시키기 위해 FcγRIIIa 결합을 제거하는 것이 바람직한 이중특이적 면역조절 항체의 사용이다. 이러한 절제 변이체는도 6에 도시되고, 각각은 독립적이고 선택적으로, 포함하거나 배제될 수 있으며, 바람직한 양태는 G236R/L328R,E233P/L234V/L235A/G236del/S239K, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G, E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G 및 E233P/L234V/L235A/G236del로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 절제 변이체를 이용한다. 본원에서 참조되는 절제 변이체는 FcγR 결합을 제거하지만 일반적으로 FcRn 결합은 제거하지 않는다는 점에 유의해야 한다.

I. 이종이량체 및 Fc 변이체의 조합

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 모든 지칭된 이종이량체화 변이체(스큐 및/또는 pI 변이체를 포함함)는 이들이 "꼬임(strandedness)" 또는 "단량체 분할"을 유지하는 한, 선택적이고 독립적으로 임의의 방식으로 결합될 수 있다. 게다가, 모든 이러한 변이체는 임의의 이종이량체화 형태로 결합될 수 있다.

pI 변이체의 경우, 특히 사용되는 구현예가 도면에 도시되지만, 다른 조합은 정제를 촉진하기 위해 2개의 단량체 사이의 pI 차이를 변경하는 기본 규칙에 따라, 생성될 수 있다.

게다가, 임의의 이종이량체화 변이체, 스큐 및 pI는 또한 본원에서 일반적으로 개설되는 바와 같이, Fc 절제 변이체, Fc 변이체, FcRn 변이체와 독립적이고 선택적으로, 결합된다.

VII. 발명의 유용한 형태

당업자에 의해 주지되고 하기 더 완전히 설명되는 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 이종이량체 항체는 도 2에 나타낸 바와 같이, 매우 다양한 구성을 취할 수 있다. 일부 도면은 "단일 종결(ended)" 구성을 도시하며, 여기서 분자의 하나의 "팔(arm)"에는 하나의 유형의 특이성이 있고 다른 "팔"에는 다른 특이성이 있습니다. 다른 도면은 "이중 종결" 구성을 도시하며, 여기서, 분자의 상단에 적어도 하나의 유형의 특이성 및 분자의 "하단"에 하나 이상의 상이한 특이성이 있다. 따라서, 본 발명은 상이한 제1 항원 및 제2 항원에 공동 결합하는 신규한 면역글로불린 조성물에 관한 것이다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 본 발명의 이종이량체 형태(도 2 참조)는 상이한 원자가를 가질뿐만 아니라 이중특이적일 수 있다. 즉, 본 발명의 항체는 2가이고 이중특이적일 수 있으며, 여기서, 체크포인트 표적은 제1 ABD에 의해 결합되고 공자극 표적은 제2 ABD에 의해 결합된다(예를 들어, 이종이량체인 병따개 형태 또는 동종이량체인 이중특이적 mAb 참조). 이종이량체 항체는 또한 3가이고 이중특이적일 수 있으며, 여기서, 제1 항원은 2개의 ABD에 의해 결합되고 제2 항원은 제2 ABD에 의해 결합된다(예를 들어, 중심-scFv 형태 및 트라이던트 형태 참조). 이종이량체 항체는 또한 이중특이적이고 4가(예컨대, 중심-scFv2 형태 및 DVD-Ig 형태)일 수 있다.

다시, DVD-Ig 형태 및 중심-scFv2 형태를 제외하고, 항체는 일반적으로 공자극 표적이 1가로 결합되도록 형태화된다.

A. 병따개 형태

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 "트리플 F" 또는 "병따개" 스캐폴드 형태이다. 이러한 구현예에서, 항체의 하나의 중쇄는 단일 사슬 Fv("scFv", 아래에 정의됨)를 포함하고, 다른 중쇄는 가변 중쇄 및 경쇄를 포함하는, "정규" Fab 형태이다. 이러한 구조는 때때로 병따개에 대한 개략적인 시각적 유사성으로 인해, 본원에서 "트리플 F" 형태(scFv-Fab-Fc) 또는 "병따개"형태로 지칭된다. 2개의 사슬은 아래에 더 완전히 설명되는 바와 같이 이종이량체 항체의 형성을 촉진하는 불변 영역(예를 들어, Fc 도메인, CH1 도메인 및/또는 힌지 영역)에서 아미노산 변이체의 사용에 의해 합쳐진다.

현재 "트리플 F" 형태에는 수개의 뚜렷한 장점이 있다. 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 2개의 scFv 작제물에 의존하는 항체 유사체(analogs)는 종종 안정성 및 응집 문제를 가지며, 이는 "정규" 중쇄 및 경쇄 쌍의 추가에 의해 본 발명에서 경감될 수 있다. 게다가, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄에 의존하는 형태와는 대조적으로, 중쇄 및 경쇄의 부정확한 쌍(예를 들어, 경쇄 2와 쌍을 이루는 중쇄 1 등)을 이루는 것은 문제가 없다.

본원에 개설되는 많은 구현예는 일반적으로 scFv를 포함하는 제1 단량체를 포함하는 병따개 형태에 의존하며, scFv 링커(하전됨, 많은 경우지만 모든 경우는 아님)를 사용하여 공유 결합으로 부착되는, 가변 중쇄 도매인 및 가변 경쇄 도메인을 포함하되, 여기서, scFv는 일반적으로 도메인 링커(이는 본원에서 개설된 바와 같이, 비-하전 또는 하전될 수 있거나 외인성 또는 내인성(예를 들어, 네이티브 힌지 도메인의 전부 또는 일부일 수 있음)를 통해 제1 Fc 도메인의 N- 말단에 공유 결합으로 부착된다. 병따개 형태의 제2 단량체는 중쇄이고, 조성물은 경쇄를 더 포함한다.

게다가, 병따개 형태의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 도시되는 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적으로, 절제 변이체(도 6 에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로, 하전된 scFv 링커들(도 8에 도시되는 것을 포함함) 및 pI 변이체를 포함하는 중쇄(도 5에 도시되는 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 병따개 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병따개 형태를 포함한다: a) 하전된 scFv 링커(도 8의 +H 서열이 일부 구현예에서 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본원에 개설되는 바와 같은 하나의 표적에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 단량체("scFv 단량체"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경쇄 도메인으로, 본원에서 개설되는 바와 같은 제2 표적에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체("Fab 단량체"); 및 c) 경쇄. 이러한 특정 구현예에서, 적합한 단량체 Fv 쌍은 (첫 번째 열거되는 Fab, 두 번째 열거되는 scFvs) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM-3, ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40 X OX40 X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, CTLA- 4 x OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, GITR X PD-1, GITR X PDL1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, GITR X TIM-3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 4-1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, TIGIT X PD-1 X 4-1BB, PD-L1 X 4-1BB, CTLA-4 X 4-1BB, LAG-3 X 4-1BB, TIM-3 X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병타개 형태를 포함한다: a) 하전된 scFv 링커(도 8의 +H 서열이 일부 구현예에서 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 본원에 개설되는 바와 같은 하나의 표적에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 단량체("scFv 단량체"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 가변 경쇄 도메인으로, 본원에서 개설되는 바와 같은 제2 표적에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체("Fab 단량체"); 및 c) 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포하하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279을 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, 병타개 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 다음을 포함하는 병따개 형태를 포함한다: a) 하전된 scFv 링커(도 8의 +H 서열이 일부 구현예에서 바람직함), 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 본원에 개설되는 바와 같은 제1 수용체(공자극 또는 체크포인트 수용체)에 결합하는 Fv를 포함하는 제1 단량체("scFv 단량체"); b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 및 가변 경쇄 도메인으로, 본원에서 개설되는 바와 같은 제2 수용체(공자극 또는 체크포인트 수용체의 다른 것)에 결합하는 Fv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체("Fab 단량체"); 및 c) 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD 결합을 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

특히, 도 9는 본 발명에서 사용될 수 있는 Fv 서열을 결여하고 있는 병따개 "백본"서열을 도시한다. 즉, scFv 부분 및 Fab 부분에 대한 Fv 서열은 백본 1 내지 10 중 임의의 것 또는 전부와 함께, ICOS 및 PD-1, ICOS 및 CTLA-4, ICOS 및 LAG-3, ICOS 및 TIM-3, ICOS 및 PD-L1, ICOS 및 BTLA, ICOS 및 TIGIT, GITR 및 TIGIT, GITR 및 PD-1, GITR 및 CTLA-4, GITR 및 LAG-3, GITR 및 TIM-3, GITR 및 PD-L1, GITR 및 BTLA, OX40 및 PD-1, OX40 및 TIGIT, OX40 및 CTLA-4, IC OX40 OS 및 LAG-3, OX40 및 TIM-3, OX40 및 PD-L1, OX40 및 BTLA, 4-1BB 및 PD-1, 4-1BB 및 CTLA- 4, 4-1BB 및 LAG-3, 4-1BB 및 TIM-3, 4-1BB 및 PD-L1, TIGIT 및 4-1BB 및 4-1BB 및 BTLA의 임의의 조합으로부터 사용될 수 있으며, 백본 1은 이들 조합에서 특히 유용하다.

도 9로부터의 병따개 백본 1(선택적으로, 428L/434S 변이체를 포함함)의 경우, 본 발명에서 사용되는 특이적 Fv 조합은 ICOS 및 PD-1, ICOS 및 PD-L1 그리고 ICOS 및 CTLA-4를 포함한다.

도 9로부터의 병따개 백본 1(선택적으로, 428L/434S 변이체를 포함함)의 경우, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b에 나타낸 것뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 9로부터의 병따개 백본 1(선택적으로, 428L/434S 변이체를 포함함)의 경우, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73에 나타낸 것 및 SEQ ID NO:26282-26290에 열거된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 9로부터의 백본 1(선택적으로, 428L/434S 변이체 포함)의 경우, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 나열된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 9로부터의 병따개 백본 1(선택적으로, 428L/434S 변이체 포함)의 경우, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 9로부터의 병따개 백본 1(선택적으로, 428L/434S 변이체 포함)의 경우, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO:3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 병따개 구현예가 아래에 개설된다.

B. mAb-Fv 형태

본 발명에서 특히 사용될 수 있는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 mAb-Fv 형태이다. 이러한 구현예에서, 형태는 하나의 단량체에 "여분의" 가변 중쇄 도메인의 C-말단 부착 및 다른 단량체에 "여분의" 가변 경쇄 도메인의 C-말단 부착의 사용에 의존하며, 따라서 제3 항원 결합 도메인(예를 들어, "여분의" Fv 도메인)을 형성하며, 여기서, 2개의 단량체의 Fab 부분은 하나의 체크포인트 표적에 결합하고 "여분의" Fv 도메인은 공자극 표적에 결합한다.

이러한 구현예에서, 제1 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인 및 제1 Fc 도메인을 포함하는 제1 불변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하며, 제1 가변 도메인은 도메인 링커를 사용하여 제1 Fc 도메인의 C-말단에 공유 결합으로 부착된다(vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vl2). 제2 단량체는 제2 가변 중쇄 도메인, 제2 Fc 도메인을 포함하는 제2 불변 중쇄 도메인, 및 도메인 링커를 사용하여 제2 Fc 도메인의 C-말단에 공유 결합으로 부착되는 제3 가변 중쇄 도메인을 포함한다 (vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vh2). 이러한 구현예는 중쇄와 연관하여 2개의 동일한 Fv를 포함하는 2개의 동일한 Fab을 형성하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 더 이용한다. 두 개의 C-말단에 부착된 가변 도메인은 "여분의" 제3 Fv를 구성한다. 본원의 구현예의 많은 부분에 관해, 이들 구조는 필요에 따라 본원에 기술된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째 나열된 Fab, 두 번째 나열된 "여분의" Fv) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM- ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, OX40 X PD- GITR X PD-1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, CTLA-4 X OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, GITR X TIM-3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, PD-1 X 4-1BB, PD-L1 X 4-1BB, CTLA-4 X 4-1BB, LAG-3 X 4-1BB, TIM-3 X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도면에 나타낸 바와 같을 수 있다.

게다가, mAb-Fv 형태의 Fc 도메인은 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적으로, 절제 변이체(도 6에 도시되는 것을 포함), 선택적으로, 하전된 scFv 링커(도 8에 도시되는 것을 포함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 도시되는 것을 포함)를 포함한다.

일부 구현예에서, mAb-Fv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 mAb-Fv 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인으로, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인으로, 본원에서 개설되는 바와 같은 제1 수용체(공자극 수용체 또는 체크포인트 수용체)에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 수용체(예를 들어, 공자극 또는 체크포인트 수용체 중 다른 것)와 결합하는 Fv(ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이 형태의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서인) ICOS X PD-1, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, ICOS x PD-L1, GITR X PD-1, OX40 X PD-1 및 4-1BB X PD-1이다. 이 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 대한 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279을 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, mAb-Fv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 mAb-Fv 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인으로, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경쇄 도메인으로, 본원에서 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄와 함께, 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv(ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이 형태의 일부 구현예에서 특히 사용되는 것은 (Fab-scFv 순서로) ICOS X PD-1, ICOS x PD-L1, GITR X PD-1, OX40 X PD-1 및 4-1BB X PD-1이다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS]_H0.66_L0뿐만 아니라, 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b에 나타낸 것들 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665이다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78에 나타낸 것들 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432이다.

도75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73에 나타낸 것들 및SEQ ID NO:26282-26290에 나열된 것들이다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, human 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671의 것들이다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73의 것들 및 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것들이다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1과 유사한 mAb-Fv 서열의 경우, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432으로부터 비롯된다.

C. mAb-scFv

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 mAb-scFv 형태이다. 이러한 구현예에서, 형태는 단량체들 중 하나에 대한 scFv의 C-말단 부착의 사용에 의존하여, 따라서 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 두 단량체의 Fab 부분은 하나의 수용체 표적에 결합하고 "여분의" scFv 도메인은 다른 수용체 표적(일반적으로 1가 결합된 공자극 수용체)에 결합한다.

이러한 구현예에서, 제1 단량체는(가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함하는) 제1 중쇄를 포함하며, C-말단 공유 부착된 scFv는 어느 하나의 방위으로 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다(vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vh2-scFv 링커-vl2 또는 vh1-CH1-힌지-CH2-CH3-[선택적 링커]-vl2-scFv 링커-vh2). 이러한 구현예는 중쇄와 연관하여 표적 수용체 중 하나에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 더 이용한다. 본원의 많은 구현예에 대해, 이들 구조는 필요에 따라 본원에 기술된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째 나열된 Fab, 두 번째 나열된 scFvs로) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM-3, ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40 X PD-1, OX40 X PD-L1, OX40 X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, CTLA- GITR X PD-1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, GITR X TIM-3, OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, 3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 4-1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, TIGIT X 4- 1B-1B, PD-1X 4-1BB, PD-L1X 4-1BB, CTLA-4X 4-1BB, LAG-3X 4-1BB, TIM-3X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되거나 도면에 나타낸 바와 같을 수 있다.

게다가, mAb-scFv 형태의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적으로, 절제 변이체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로, 하전된 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 도시되는 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, mAb-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 병따개 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인으로, 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄, 그리고 제2 수용체에 결합하는 scFv를 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인으로, 본원에 개설되는 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 형태로 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 대한 Fab ABD 결합을 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합 되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, mAb-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 mAb-scFv 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인으로, 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 수용체에 결합하는 scFv를 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에서 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1에 있어서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1에 있어서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73의 것들 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 나열된 것들이다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1에 있어서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671의 것을 포함한다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1에 있어서, 인간 OX-40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73에 나타낸 것들 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 나열된 것을 포함한다.

도 75로부터 (선택적으로, M428L/N434S를 포함하는) mAb-scFv 백본 1에 있어서, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함한다.

D. 중심-scFv

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 중심-scFv 형식이다. 이러한 구현예에서, 형태는 삽입된 scFv 도메인의 사용에 의존하여, 따라서 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 하나의 수용체 표적에 결합하고 "여분의" scFv 도메인은 또 다른 수용체 표적에 결합한다(다시, 일반적으로 공자극 수용체는 1가로 결합된다). scFv 도메인은 Fc 도메인과 단량체 중 하나의 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되며, 따라서 제3 항원 결합 도메인을 제공한다.

이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv와 함께, 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인(및 선택적 힌지) 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. scFv는 선택적인 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유 결합으로 부착된다(vh1-CH1-[선택적 링커]-vh2-scFv 링커-vl2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3, 또는 scFv에 대한 반대 방위, vh1-CH1-[선택적 링커]-vl2-scFv 링커-vh2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3). 일부 구현예에서, 선택적인 링커는 그의 힌지 또는 그 단편이다. 다른 단량체는 표준 Fab 면이다(예를 들어, vh1-CH1-힌지-CH2-CH3). 본 구현예는 또한 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 이용하며, 이는 중쇄와 연관하여 체크포인트 억제제에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성한다. 본원의 많은 구현예에 대하여, 이들 구조는 필요에 따라 본원에 기술되는 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째로 나열된 Fab, 두 번째 나열된 scFvs로) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM-3, ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40 X PD-1, OX40 X PD-L1, OX40 X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, CTLA-GITR X PD-1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, GITR X TIM-3, OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, 3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 4-1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, TIGIT X 4- 1B-1B, PD-1 X 4-1BB, PD-L1 X 4-1BB, CTLA-4 X 4-1BB, LAG-3 X 4-1BB, TIM-3 X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 설명되거나 도면에 도시된 바와 같을 수 있다.

게다가, 중심-scFv 형태의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적으로, 제거 변위체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로, 대전된 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 도시되는 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 중심-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 central scFv를 포함한다: a) 스큐 변이체 SS364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제2 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, 중심-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 일부 구현예는 하기를 포함하는 중심 scFv를 포함한다: a) 스큐 변이체 SS364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인 및 제2 수용체에 결합하는 scFv 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째 나열된 Fab, 두 번째 나열된 scFvs로) ICOS X PD-1, PD-1 X ICOS, ICOS X PD-L1, PD-L1 X ICOS, ICOS X CTLA-4 및 CTLA-4 X ICOS를 포함한다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv 서열의 경우, ICOS에 결합하는 적합한 Fv는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv 서열의 경우, PD-L1에 결합하는 적합한 Fv는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv 서열의 경우, GITR에 결합하는 적합한 Fv는 도 18, 도 72 및 도 73의 것들 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv 서열의 경우, OX40에 결합하는 적합한 Fv는 도 17, 도 72 및 도 73 및 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv 서열의 경우, 4-1BB에 결합하는 적합한 Fv는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

E. 중심-scFv2

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 중심-scFv2 형태이며, 이는 이중특이적이고 4가이다. 이러한 구현예에서, 형태는 2개의 삽입된 scFv 도메인의 사용에 의존하여 따라서 제3 및 제4 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 하나의 수용체 표적에 결합하고 "여분의" scFv 도메인은 다른 것에 결합한다. scFv 도메인은 단량체의 Fc 도메인과 CH1-Fv 영역 사이에 삽입된다.

이러한 구현예에서, 두 단량체는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함하는 scFv와 함께, 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인(및 선택적 힌지) 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. scFv는 선택적인 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유 결합으로 부착된다(vh1-CH1-[선택적 링커]-vh2-scFv 링커-vl2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3, 또는 scFv에 대한 반대 방위, vh1-CH1-[선택적 링커]-vl2-scFv 링커-vh2-[힌지를 포함하는 선택적 링커]-CH2-CH3). 일부 구현예에서, 선택적 링커는 힌지 또는그의 단편이다. 이러한 구현예는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 더 이용하며, 이는 중쇄와 연관하여 수용체에 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성한다. 본원의 많은 구현예에 대하여, 이들 구조는 필요에 따라 본원에 기술되는 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째로 나열된 Fab, 두 번째로 나열된 scFvs로) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM-3, ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40 X PD-1, OX40 X PD-L1, OX40 X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, CTLA-GITR X PD-1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, GITR X TIM-3, OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, 3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 4-1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, TIGIT X 4-1B-1B, PD-1 X 4-1BB, PD-L1 X 4-1BB, CTLA-4 X 4-1BB, LAG-3 X 4-1BB, TIM-3 X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되는 바와 같이 또는 도면에 나타낸 바와 같을 것이다.

게다가, 중심-scFv2 형태의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적으로, 제거 변위체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로, 대전된 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 도시되는 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 중심-scFv2 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 중심-scFv를 포함한다: a) 스큐 변이체 SS364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제2 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, 중심-scFv2 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 중심-scFv를 포함한다: a) 스큐 변이체 SS364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv 및 제2 수용체에 결합하는 scFv 도메인을 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은(첫 번째로 나열된 Fab, 두 번째로 나열된 scFv로) ICOS X PD-1, PD-1 X ICOS, ICOS X PD-L1, PD-L1 X ICOS, ICOS X CTLA-4 및 CTLA-4 X ICOS를 포함한다.

도 55의 중심-scFv2 서열을 이용하는 중심-scFv2 서열의 경우, ICOS에 결합하는 적합한 Fv는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv2 서열을 이용하는 중심-scFv2 서열의 경우, PD-L1에 결합하는 적합한 Fv는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv2 서열의 경우, GITR에 결합하는 적합한 Fv는 도 18, 도 72 및 도 73에 나타낸 것 및 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv2 서열의 경우, OX40에 결합하는 적합한 Fv는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

도 55의 중심-scFv 서열을 이용하는 중심-scFv2 서열의 경우, 4-1BB에 결합하는 적합한 Fv는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

F. 외팔형 mAb

상기 설명된 바와 같이, 놀랍고 예상치 못하게, 표적에 대한 단일 ABD를 포함하는 1가 공자극 항체는 T 세포를 활성화시키는 효능을 나타낸다.

따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 (안정성을 위해) 이종이량체 Fc 도메인을 포함하는 도 2n에 나타낸 바와 같은 1가, 단일 특이적 항체를 제공한다. 이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 단지 Fc 도메인을 포함하는 반면, 다른 단량체는 HC(VH1-CH1-힌지-CH2-CH3)이다. 본 구현예는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 더 이용하며, 그것은 중쇄와 연관하여 Fab를 형성한다. 본원의 많은 구현예에 대해, 이들 구조는 필요에 따라 본원에 기술된 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이 구현예에, 적합한 ABD는 ICOS, GITR, OX40 또는 4-1BB와 같은 공자극 수용체와 결합한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시된 바와 같이 또는 도면에 나타낸 바와 같을 수 있다.

게다가, 외팔형 mAb의 Fc 도메인은 스큐 변이체(예를 들어, 도 4 에 나타낸 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적 절제 변이체(도 6 에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고, 중쇄는 pI 변이체(도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 외팔형 scFv-mAb 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하는 제1 (Fc) 단량체, b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하는 제2 단량체, 및 제1 가변 경쇄와 함께, 본원에 개설된 바와 같은 공자극 수용체에 부착하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄를 포함한다.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABDS는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 및 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73의 것 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이 형식에서 OX40에 결합하는 특정 ABD에는 도 17, 도 72 및 도 73 및 SEQ ID NO:26272-26281에 열거된 ABD가 포함된다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형식에서, 사람 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

특정 "외팔형 mAb"가 도면 및 서열 목록에 나타낸다.

G. 이중특이적 mAb

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 이중특이적 mAb 형태이며, 이는 이중특이적이고 4가이다. 이러한 구현예에서, 형태는 이때 재조합되는 별도의 동종이량체 항체의 생성에 의존한다. 이러한 형태에서, 제1 HC-LC 쌍((VH1-CH1-힌지-CH2-CH3 및 VL1-LC) 및 제2 Hc-LC쌍(VH2-CH1-힌지-CH2-CH3 및 VL2-LC), 예를 들어, 2개의 상이한 중쇄 및 2개의 상이한 경쇄가 존재한다. 실시예 5I(d)를 참조한다.

이러한 형태에서, 적합한 쌍은 ICOS 및 PD-1, ICOS 및 CTLA-4, ICOS 및 LAG-3, ICOS 및 TIM-3, ICOS 및 PD-L1, ICOS 및 BTLA, ICOS 및 TIGIT, GITR 및 TIGIT, GITR PDT-1, GITR 및 CTLA-4, GITR 및 LAG-3, GITR 및 TIM-3, GITR 및 PD-L1, GITR 및 BTLA, OX40 및 PD-1, OX40 및 TIGIT, OX40 및 CTLA-4, IC OX40 및 TAG-3, OX40 및 PD-L1, OX40 및 BTLA, 4-1BB 및 PD-1, 4-1BB 및 CTLA-4, 4-1BB 및 LAG-3, 4-1BB 및 TIM-3, 4-1BB 및 PD-L1, TIGIT 및 4-1BB 및 4-1BB 및 BTLA를 포함한다.

이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하고 Fab가 4-1BB에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 및 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73의 것 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 사람 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

H. 중심-Fv 형태

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 도 2에 나타낸 중심-Fv이다. 이러한 구현예에서, 형태는 삽입된 Fv 도메인의 사용에 의존하며, 따라서 "여분의" 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 2개의 단량체의 Fab 부분은 하나의 수용체에 결합하고 "여분의" 중심-Fv 도메인 다른 수용체(일반적으로 공자극 수용체)에 결합한다. Fv 도메인은 단량체의 Fc 도메인과 CH1-Fv 영역 사이에 삽입되며, 따라서 제3 항원 결합 도메인을 제공하며, 여기서 각각의 단량체는 Fv의 구성요소를 포함한다(예를 들어, 하나의 단량체는 가변 중쇄 도메인을 포함하고 다른 단량체는 "여분의" 중심-Fv 도메인의 가변 경쇄 도메인을 포함한다).

이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인 및 추가 가변 경쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다. 추가 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유 결합으로 부착된다(vh1-CH1-[선택적 링커] -vl2-힌지-CH2-CH3). 다른 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인 그리고 추가 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함한다(vh1-CH1-[선택적 링커] -vh2-힌지-CH2-CH3). 추가 가변 경쇄 도메인은 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유 결합으로 부착된다. 이러한 구현예는 중쇄와 연관하여 수용체에 각각 결합하는 2개의 동일한 Fab를 형성하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 이용한다. 추가 가변 중쇄 도메인 및 추가 가변 경쇄 도메인은 제2 수용체에 결합하는 "여분의" 중심-Fv를 형성한다. 본원의 많은 구현예에 대하여, 이들 구조는 필요에 따라 그리고 본원에 설명되는 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째로 나열된 Fab, 두 번째로 나열된 "여분의" 중심-Fv로), ICOS X PD-1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM- ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, OX40 X PD- GITR X PD-1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, CTLA-4 X OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, GITR X TIM-3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, PD-1 X 4-1BB, PD-L1 X 4-1BB, CTLA-4 X 4-1BB, LAG-3 X 4-1BB, TIM-3 X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시되는 바와 같이 또는 도면에 도시되는 바와 같을 수 있다.

게다가, 중심-Fv 형태의 Fc 도메인은 일반적으로 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적 절제 변이체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적 하전 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 중심-Fv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 중심-scFv 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제2 수용체에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, 중심-Fv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 중심-scFv를 포함한다: a) 스큐 변이체 SS364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv 및 제2 수용체에 결합하는 scFv 도메인을 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은(첫 번째로 나열된 Fab, 두 번째로 나열된 scFv로) ICOS X PD-1, PD-1 X ICOS, ICOS X PD-L1, PD-L1 X ICOS, ICOS X CTLA-4 및 CTLA-4 X ICOS를 포함한다.

중심-Fv 형태에 대해, ICOS에 결합하는 적합한 Fv는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

중심-Fv 형태에 대해, PD-L1에 결합하는 적합한 Fv는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

중심-Fv 형태에 대해, GITR에 결합하는 적합한 Fv는 도 18, 도 72 및 도 73에 나타낸 것 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 나열된 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

중심-Fv 형태에 대해, OX40에 결합하는 적합한 Fv는 도 17, 도 72 및 도 73 및 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

중심-Fv 형태의 경우, 4-1BB에 결합하는 적당한 Fv는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

중심-FV 형태에 대해, PD-L1에 결합하는 적합한 Fv는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

I. 외팔형 중심-scFv

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 도 1에 나타낸 외팔형 중심-scFv 형태이다. 이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 Fc 도메인만을 포함하는 반면, 다른 단량체는 Fab 도메인(제1 항원 결합 도메인), scFv 도메인(제2 항원 결합 도메인) 및 Fc 도메인을 포함하며, 여기서 scFv 도메인은 Fc 도메인과 Fc 도메인 사이에 삽입된다. 이러한 형태에서, Fab 부분은 하나의 수용체 표적에 결합하고 scFv는 다른 것에 결합한다.

이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 제1 가변 중쇄 도메인, CH1 도메인 및 Fc 도메인을 포함하는 제1 중쇄를 포함하며, scFv는 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다. scFv는 임의의 배향, VH1-CH1-[선택적 도메인 링커]-VH2-scFv 링커-VL2-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3 또는 VH1-CH1-[선택적 도메인 링커]-VL2-scFv 링커-VH2-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3 중 어느 하나로, 도메인 링커를 사용하여 중쇄 불변 도메인의 CH1 도메인의 C-말단과 제1 Fc 도메인의 N-말단 사이에 공유결합으로 부착된다. 제2 단량체는 Fc 도메인(CH2-CH3)을 포함한다. 이러한 구현예는 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 더 사용하며, 그것은 중쇄와 연관하여 Fab를 형성한다. 본원의 많은 구현예에 대해, 이들 구조는 필요에 따라 그리고 본원에 설명되는 바와 같이, 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은(첫 번째 나열된 Fab, 두 번째 나열된 scFv로) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM-3, ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40 X PD-1, OX40 X PD-L1, OX40 X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, CTLA-4 X OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, GITR X PD-1, GITR X PD-L1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, GITR X TIM-3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 4-1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, TIGIT X 4-1BB, PD-1 X 4-1BB, PD-L1 X 4-1BB, CTLA-4 X 4-1BB, LAG-3 X 4-1BB, TIM-3 X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시된 바와 같이 또는 도면에 도시된 바와 같을 수 있다.

게다가, 하나의 외팔형 중심-scFv 형태의 Fc 도메인은 일반적 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적 절제 변이체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적 하전 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 도시되는 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 외팔형 중심-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv, 및 다른 수용체에 결합하는 scFv를 구성하는 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K를 포함하는 제2 단량체, 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, 외팔형 중심-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 수용체에 결합하는 Fv 및 제2 수용체에 결합하는 scFv 도메인을 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 FcRn 변이체 M428L/N434S를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73에 나타낸 것 및 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 사람 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

J. 외팔형 scFv-mAb

본 발명에서 특히 사용되는 이종이량체 스캐폴드는 도 2d에 나타낸 외팔형 scFv-mAb이다. 이러한 구현예에서, 하나의 단량체는 Fc 도메인만을 포함하는 반면, 다른 단량체는 일반적으로 링커의 사용을 통해, 중쇄의 N-말단에 부착되는 scFv 도메인을 사용한다: vh1-scFv 링커-vl1-[선택적 도메인 링커]-VH2-CH1-힌지-CH2-CH3 또는 (반대 배향으로) vl1-scFv 링커-vh1-[선택적 도메인 링커]-VH2-CH1-힌지-CH2-CH3. 이러한 형태에서, Fab 부분은 하나의 수용체 표적에 결합하고 scFv는 다른 것에 결합한다. 이러한 구현예는 중쇄와 연관하여 Fab를 형성하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄를 더 이용한다. 본원의 많은 구현예에 대해, 이들 구조는 필요에 따라 그리고 본원에 설명되는 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째 나열된 Fab, 두 번째 나열된 scFv) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM-3, ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40 X PD-1, OX40 X PD-L1, OX40 X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, CTLA- GITR X PD-1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, GITR X TIM-3, OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, 3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 4-1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, TIGIT X 4-1B-1B, PD-1X 4-1BB, PD-L1X 4-1BB, CTLA-4X 4-1BB, LAG-3X 4-1BB, TIM-3X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 개시된 바와 같이 또는 도면에 나타낸 바와 같을 수 있다.

게다가, 외팔형 scFv-mAb의 Fc 도메인은 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적 절제 변이체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로, 하전된 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 외팔형 scFv-mAb 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 경쇄와 함께 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv(ABD)를 형성하는 제2 가변 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, 외팔형 scFv-mAb 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 병따개 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄와 함께 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 중쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73의 것들 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 사람 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

K. scFv-mAb 형태

본 발명에서 특히 사용되는 하나의 이종이량체 스캐폴드는 도 2e에 나타낸 mAb-scFv 형태이다. 이러한 구현예에서, 형태는 단량체들 중 하나에 대한 scFv의 N-말단 부착의 사용에 의존하며, 따라서 제3 항원 결합 도메인을 형성하며, 여기서 두 단량체의 Fab 부분 각각은 하나의 표적에 결합하고, "여분의" scFv 도메인은 상이한 표적에 결합한다.

이러한 구현예에서, 제1 단량체는 (가변 중쇄 도메인 및 불변 도메인을 포함하는) 제1 중쇄를 포함하며, N-말단 공유 결합으로 부착되는 scFv는 어느 한 배향으로 scFv 가변 경쇄 도메인, scFv 링커 및 scFv 가변 중쇄 도메인을 포함한다((vh1-scFv 링커-vl1-[선택적 도메인 링커]- vh2-CH1-힌지-CH2-CH3) 또는 (scFv가 반대 방위으로) ((vl1-scFv 링커-vh1-[선택적 도메인 링커]-vh2-CH1-힌지-CH2-CH3)). 제2 단량체는 중쇄 VH20CH1-힌지-CH2-CH3을 포함한다. 이러한 구현예는 중쇄와 연관하여 표적 항원 중 하나에 결합하는 2개의 동일한 Fab을 형성하는, 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 공통 경쇄를 더 이용한다. 본원의 많은 구현예에 대해, 이들 구조는 필요에 따라 그리고 본원에 설명되는 바와 같이 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체, 추가 Fc 변이체 등을 포함한다. 이러한 구현예에서, 적합한 Fv 쌍은 (첫 번째 나열된 Fab, 두 번째로 나열된 scFv로) ICOS X PD-1, ICOS X PD-L1, ICOS X CTLA-4, ICOS X LAG-3, ICOS X TIM-3, ICOS X BTLA, ICOS X TIGIT, TIGIT X ICOS, PD-1 X ICOS, PD-L1 X ICOS, CTLA-4 X ICOS, LAG-3 X ICOS, TIM-3 X ICOS, BTLA X ICOS, OX40 X TIGIT, OX40 X PD-1, OX40 X PD-L1, OX40 X CTLA-4, OX40 X LAG-3, OX40 X TIM-3, OX40 X BTLA, TIGIT X OX40, PD-1 X OX40, PD-L1 X OX40, CTLA- GITR X PD-1, GITR X CTLA-4, GITR X LAG-3, GITR X TIM-3, OX40, LAG-3 X OX40, TIM-3 X OX40, BTLA X OX40, GITR X TIGIT, 3, GITR X BTLA, TIGIT x GITR, PD-1 X GITR, PD-L1 X GITR, CTLA-4 X GITR, LAG-3 X GITR, TIM-3 X GITR, BTLA X GITR, 4-1BB X TIGIT, 4-1BB X PD-1, 4-1BB X PD-L1, 4-1BB X CTLA-4, 4-1BB X LAG-3, 4-1BB X TIM-3, 4-1BB X BTLA, TIGIT X 4- 1B-1B, PD-1 X 4-1BB, PD-L1 X 4-1BB, CTLA-4 X 4-1BB, LAG-3 X 4-1BB, TIM-3 X 4-1BB 및 BTLA X 4-1BB를 포함한다.

이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록 또는 도면에 설명되는 바와 같을 수 있다.

게다가, scFv-mAb 형태의 Fc 도메인은 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적 절제 변이체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적으로, 하전된 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, mAb-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 병따개 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄와 함께 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

일부 구현예에서, mAb-scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체, 절제 변이체 및 FcRn 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 병따개 형태를 포함한다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 경쇄의 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄 도메인을 포함하는 제1 단량체; b) 스큐 변이체 L368D/K370S, pI 변이체 N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, FcRn 변이체 M428L/N434S 및 제1 가변 경쇄 도메인과 함께, 본원에 개설되는 바와 같은 제1 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv를 구성하는 제1 가변 중쇄 도메인, 그리고 제2 가변 중쇄와 함께 제2 체크포인트 억제제에 결합하는 Fv (ABD)를 형성하는 제2 가변 경쇄를 포함하는 제2 단량체; 및 c) 제1 가변 경쇄 도메인 및 불변 경쇄 도메인을 포함하는 경쇄.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73에 나타낸 것 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이제 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 사람 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

L. 이중 scFv 형태

본 발명은 또한 당해 분야에 공지되고 도 2b에 나타낸 바와 같은 이중 scFv 형태를 제공한다. 이러한 구현예에서, 이종이량체 이중특이적 항체는 2개의 scFv-Fc 단량체((vh-scFv 링커-vl-[선택적 도메인 링커] -CH2-CH3) 형태 또는 (vl-scFv 링커-vh-[선택적 도메인 링커] -CH2-CH3 둘 다)로 구성되거나, 일 방위으로 하나의 단량체 및 타 방위으로 다른 단량체를 갖는다.

이러한 경우, 모든 ABD는 scFv 형태이며, ICOS 및 PD-1, ICOS 및 CTLA-4, ICOS 및 LAG-3, ICOS 및 TIM-3, ICOS 및 PD-L1, ICOS 및 BTLA, GITR 및 PD-1, GITR 및 CTLA-4, GITR 및 LAG-3, GITR 및 TIM-3, GITR 및 PD-L1, GITR 및 BTLA, OX40 및 PD-1, OX40 및 CTLA-4, OX40 및 LAG-3, OX40 및 TIM-3, OX40 및 PD-L1, OX40 및 BTLA, 4-1BB 및 PD-1, 4-1BB 및 CTLA-4, 4-1BB 및 LAG-3, 4-1BB 및 TIM-3, 4-1BB 및 PD-L1 및 4-1BB 및 BTLA의 임의의 조합이 유용하다. 이들 조합에 대한 ABD 서열은 서열 목록에 설명되는 바와 같이 또는 도면에 나타낸 바와 같을 수 있다.

게다가, 이중 scFv 형태의 Fc 도메인은 스큐 변이체(예를 들어, 도 4에 나타낸 바와 같은 한 세트의 아미노산 치환, 특히 유용한 스큐 변이체는 S364K/E357Q:L368D/K370S; L368D/K370S:S364K; L368E/K370S:S364K; T411T/E360E/Q362E:D401K; L368D/K370S:S364K/E357L, K370S:S364K/E357Q, T366S/L368A/Y407V:T366W 및 T366S/L368A/Y407V/Y349C:T366W/S354C로 구성되는 그룹으로부터 선택됨), 선택적 절제 변이체(도 6에 나타낸 것을 포함함), 선택적 하전 scFv 링커(도 8에 나타낸 것을 포함함)를 포함하고 중쇄는 pI 변이체(도 5에 나타낸 것을 포함함)를 포함한다.

일부 구현예에서, 이중 scFv 형태는 스큐 변이체, pI 변이체 및 절제 변이체를 포함한다. 따라서, 일부 구현예는 하기를 포함하는 형태를 갖는다: a) 스큐 변이체 S364K/E357Q, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 수용체에 결합하는 scFv(VH1-scFv 링커-VL1-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3 또는 VL1-scFv 링커-VH1-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3)를 포함하는 제1 단량체 및 b) 스큐 변이체 L368D/K370S, 절제 변이체 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K, 및 제1 수용체에 결합하는 scFv(VH1-scFv 링커-VL1-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3 또는 VL1-scFv 링커-VH1-[선택적 도메인 링커]-CH2-CH3)를 포함하는 제1 단량체. pI 변이체는 본원에서 개설된 바와 같을 수 있지만, 가장 통상적으로 각각의 단량체에 대해 반대 전하의 하전된 scFv 링커일 것이다. FcRn 변이체, 특히 428L/434S가 선택적으로, 포함될 수 있다. 이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 GITR에 결합하는 Fv를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 OX40에 결합하는 Fv를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 ICOS에 결합하는 하고 ABD를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 4-1BB에 결합하는 ABD를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73에 나타낸 것들 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16,도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 서열 번호 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

M. 비 이종이량체 이중특이적 항체

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 본원에 개설되는 Fv 서열은 또한 단일 특이적 항체(예를 들어, "전통적인 단일클론 항체") 또는 비-이종이량체 이중특이적 형태(도 2j, 도 2k 및 도 2l 참조) 둘 다에서 사용될 수 있다.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73의 것들 및 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

적합한 비-이종이량체 이중특이적 형태는 당해 분야에 공지되고, Spiess 등의 Molecular Immunology (67):95-106 (2015) 및 Kontermann, mAbs 4:2, 182-197(2012)에 일반적으로 나타낸 바와 같은 다수의 상이한 형태를 포함하며, 그 둘 다는 참조로 그리고 특히 그 내의 형태에 대한 도면, 범례 및 인용에 대해 명시적으로 포함된다.

N. DVD-Ig 형태

일부 구현예에서, 이중특이적 항체는 일반적으로 미국 특허 번호 제7,612,181호에 설명되는 바와 같은 "이중 가변 도메인-IG" 또는 "DVD-IG^TM"형태이며(도 2l 참조), 본원에 그 전체가 참조로, 그리고 특히 그 내의 도면 및 범례에 대해 명시적으로 통합된다. DVD-Ig 형태에서, 항체는 사가이고 이중특이적이고, 그리고 4개의 사슬을 포함한다: 2개의 동종이량체 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄. 중쇄는 각각 VH1-(선택적 링커)-VH2-CH1-힌지-CH2-CH3 구조를 갖고 2개의 경쇄는 각각 VL1-선택적 링커-VL2-CL 구조를 가지며, VH1 및 VL1은 제1 ABD를 형성하고 VH2 및 VL2는 제2 ABD를 형성하며, 여기서 제1 및 제2 ABD는 공자극 및 체크포인트 수요체에 결합한다. 이러한 구현예에서, 적합한 조합은 ICOS 및 PD-1, ICOS 및 CTLA-4, ICOS 및 LAG-3, ICOS 및 TIM-3, ICOS 및 PD-L1, ICOS 및 BTLA, GITR 및 PD-1, GITR 및 CTLA GITR 및 BMP-1, OX40 및 CTLA-4, OX40 및 LAG-3, OX40 및 TIM-3, OX40 PD-L1, OX40 및 BTLA, 4-1BB 및 PD-1, 4-1BB 및 CTLA-4, 4-1BB 및 LAG-3, 4-1BB 및 TIM-3, 4-1BB 및 PD-L1 및 4-1BB 및 BTLA를 포함한다.

DVD-Ig^TM 및 중심-scFv2는 이중특이적이고 4가인 2개의 형태이고, 따라서 1가 방식으로 공자극 수용체에 결합하지 않는다. 예시적인 DVD-Ig^TM 작제물이 도 61에 도시된다.

이러한 형태의 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서 :

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 H0.66_L0의 ICOS ABD가 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34과 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 GITR에 결합하는 ABD를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 OX40에 결합하는 ABD를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 ICOS에 결합하는 ABD를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279 및 4-1BB에 결합하는 ABD를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b에 나타낸 것 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73의 것 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

O. 트라이던트(Trident) 형태

일부 구현예에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 WO2015/184203에서 일반적으로 설명되는 "트라이던트(Trident)" 형태이며, 본원에 그 전체에서 그리고 특히 도면, 범례, 정의 및 "K-코일" 및 "E-코일" 서열을 포함하는, "이종이량체-촉진 도메인(Heterodimer-Promoting Domains)" 또는 "HPD"에 대해 참조로 통합된다. 트라이던트는 구조의 구성요소로서 이종이량체 구조를 형성하기 위해 연계하는 2개의 상이한 HPD를 사용하는 것에 의존하며, 도 2m을 참조한다. 이러한 구현예에서, 트라이던트 형태는 "전통적인" 중쇄 및 경쇄(예를 들어, VH1-CH1-힌지-CH2-CH3 및 VL1-CL), 제1 "디아 바디형 결합 도메인" 또는 "DART®", VH2-(링커)-VL3-HPD1를 포함하는 제3 사슬 및 제2 DART®, VH3-(링커)-(링커)-VL2-HPD2 포함하는 제4 사슬을 포함한다. VH1 및 VL1은 제1 ABD를 형성하고, VH2 및 VL2는 제2 ABD를 형성하고, VH3 및 VL3은 제3 ABD를 형성한다. 일부 경우에서, 도 2m에 나타낸 바와 같이, 제2 및 제3 ABDS는 예를 들어, 2가적으로, 동일한 항원, 이 경우 일반적으로 체크포인트 수용체와 결합하며, 제1 ABD는 1가로 공자극 수용체와 결합한다. 이러한 구현예에서, 적합한 조합은 ICOS 및 PD-1, ICOS 및 CTLA-4, ICOS 및 LAG-3, ICOS 및 TIM-3, ICOS 및 PD-L1, ICOS 및 BTLA, GITR 및 PD-1, GITR 및 CTLA GITR 및 BMP-1, OX40 및 CTLA-4, OX40 및 LAG-3, OX40 및 TIM-3, OX40 PD-L1, OX40 및 BTLA, 4-1BB 및 PD-1, 4-1BB 및 CTLA-4, 4-1BB 및 LAG-3, 4-1BB 및 TIM-3, 4-1BB 및 PD-L1 및 4-1BB 및 BTLA를 포함한다.

이러한 형태를 갖는 이들 변이체를 갖는 일부 특정 구현예에서:

(1) 형태는 [ICOS] H0.66_L0의 ABD를 갖는 ICOS에 결합하는 Fab ABD를 포함하고;

(2) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv ABD와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(3) 형태는 CTLA-4에 결합하는 ABD H3.23_L0.129를 포함하는 scFv와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(4) 형태는 LAG-3에 결합하는 ABD 7G8_H.303_L1.34와 결합되는 H0.66_L0의 ICOS ABD를 포함하고;

(5) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 GITR에 결합하는 Fab를 포함하고;

(6) 형태는 PD-1에 결합하는 BD1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 OX40에 결합하는 Fab를 포함하고;

(7) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 ICOS에 결합하는 Fab를 포함하고;

(8) 형태는 PD-1에 결합하는 ABD 1G6_L1.194_H1.279를 포함하는 scFv 및 4-1BB에 결합하는 Fab를 포함하고; 그리고

(9) 형태는 ICOS에 결합하는 H0.66_L0의 ABD 및 PD-L1에 결합하는 ABD를 포함한다.

이러한 형태에서, 인간 ICOS에 결합하는 특정 ABD는 [ICOS] H0L0 및 [ICOS] H0.66_L0 그리고 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665에 나타낸 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 GITR에 결합하는 특정 ABD는 도 18, 도 72 및 도 73의 것 그리고 SEQ ID NO:26282-26290에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, OX40에 결합하는 특정 ABD는 도 17, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26272-26281에 열거되는 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 4-1BB에 결합하는 특정 ABD는 도 16, 도 72 및 도 73 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

이러한 형태에서, 인간 PD-L1에 결합하는 특정 ABD는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78 그리고 SEQ ID NO: 3961-4432를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

P. 단일 특이적, 단클론성 항체

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 본원에 개설되는 신규한 Fv 서열은 또한 단일 특이적 항체(예를 들어, "전통적인 단클론성 항체") 또는 비-이종이량체 이중특이적 형태 둘 다로 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 일반적으로 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 불변 영역과 함께, 도면으로부터 6개의 CDR 및/또는 vh 및 v1 서열을 포함하는 단클론성(단일 특이적) 항체를 제공하며, IgG1, IgG2 및 IgG4(S228P 아미노산 치환을 포함하는 IgG4 불변 영역을 포함함)은 일부 구현예에서 특정의 용도를 발견한다. 즉, "H_L"표기를 갖는 본원의 임의의 서열이 인간 IgG1 항체의 불변 영역에 링크될 수 있다.

VIII. 표적 항원에 대한 항원 결합 도메인(ABD)

[541] 본 발명의 이중특이적 항체는 도 2에 일반적으로 나타낸 바와 같이, 2가, 이중특이적 형태 또는 삼가, 이중특이적 형태로, 2개의 상이한 표적 수용체 항원("표적 쌍")에 결합하는 2개의 상이한 항원 결합 도메인(ABD)을 갖는다.

이중특이적 항체는 체크포인트 수용체를 포함하는 제1 표적 항원 및 공자극 수용체를 포함하는 제2 표적 항원에 결합한다. 본원에 개설되는 바와 같은 적합한 체크포인트 수용체는 PD-1, PD-L1, LAG-3, TIM-3, CTLA-4, BTLA 및 TIGIT를 포함한다. 본원에 개설되는 바와 같은 적합한 공자극 수용체는 개설된 바와 같은 ICOS, GITR, OX40 및 4-1BB를 포함한다.

적합한 표적 체크포인트 항원은 인간(때로는 시노(cyno)) PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG-3, TIGIT 및 BTLA(서열 목록의 서열)를 포함한다. 따라서, 적합한 이중특이적 항체는 ICOS 및 PD-1, ICOS 및 CTLA-4, ICOS 및 LAG-3, ICOS 및 TIM-3, ICOS 및 PD-L1, ICOS 및 BTLA, ICOS 및 TIGIT, GITR 및 TIGIT, GITR 및 PD-1, GITR 및 CTLA-4, GITR 및 LAG-3, GITR 및 TIM-3, GITR 및 PD-L1, GITR 및 BTLA, OX40 및 PD-1, OX40 및 TIGIT, OX40 및 CTLA-4, IC OX40 OS 및 LAG-3, OX40 및 TIM-3, OX40 및 PD-L1, OX40 및 BTLA, 4-1BB 및 PD-1, 4-1BB 및 CTLA-4, 4-1BB 및 LAG-3, 4-1BB 및 TIM-3, 4-1BB 및 PD-L1, TIGIT 및 4-1BB 및 4-1BB 및 BTLA를 포함한다.

일반적으로 이들 이중특이적 항체는 "항-PD-1 X 항-CTLA-4", 또는 일반적으로 단순하거나 쉽게(따라서, 교환 가능하게) "PD-1 X CTLA-4"등으로 명명된다는 점에 유의한다. 본원에 명시되지 않은 한, 명칭에서의 항원 목록의 순서는 구조를 부여하지 않으며; 즉, PD-1 X CTLA-4 병따개 항체는 scFv가 PD-1 또는 CTLA-4에 결합하는 scFv를 가질 수 있지만, 동일한 경우, 순서는 나타낸 바와 같이 구조를 규정한다.

본원에서 보다 완전히 개설된 바와 같이, 이들 ABD의 조합은 일반적으로 하나의 ABD가 Fab 형태이고 다른 하나가 scFv 형태인 조합으로, 아래에 개설된 바와 같이, 다양한 형태일 수 있다. 본원에서 설명되고 도2에 나타낸 바와 같이, 일부 형태는 단일 Fab 및 단일 scFv(A, C 및 D)를 사용하고, 일부 형태는 2개의 Fab 및 단일 scFv(E, F, G, H 및 I)를 사용한다.

A. 항원 결합 도메인

본원에서 설명된 바와 같이, 본 발명의 이중특이적 체크포인트 이종이량체 항체는 2 개의 항원 결합 도메인(ABD)을 포함하며, 그 각각은 상이한 체크포인트 단백질에 결합한다. 본원에 개설된 바와 같이, 이들 이종이량체 항체는 이중특이적 및 2가 (각각의 항원은 예를 들어, 도 2a에 나타낸 형태로, 단일 ABD에 의해 결합됨), 이중특이적 및 3가 (예를 들어, 도 2f, g, h, i 또는 m에 도시된 바와 같이, 하나의 항원은 단일 ABD에 의해 결합되고, 나머지는 2개의 ABD에 의해 결합됨), 또는 이중특이적 및 4가 (예를 들어 도 2j 및 2l에 도시된 바와 같이, 2개의 항원이 2개의 ABD에 의해 결합됨)일 수 있다.

게다가, 일반적으로, ABD 중 하나는 vh-scFv 링커-vl 또는 vl-scFv 링커-vh의 N-말단으로부터 C-말단으로의 배향으로, 본원에 개설되는 바와 같은 scFv를 포함한다. 다른 ABD 중 하나 또는 둘 다는 일반적으로 형태에 따라, (일반적으로 중쇄의 구성요소로서) 하나의 단백질 사슬 상의 vh 도메인 및 (일반적으로 경쇄의 구성요소로서) 다른 단백질 사슬 상의 vl을 포함하는 Fab이다. "트라이던트" 형태는 DART®을 사용하며, 이는 배향이 상이하고 일반적으로 링커가 약간 더 길 수 있다는 것을 제외하고 scFv와 유사하다.

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

삭제

본 발명은 아래에 개설된 바와 같이, 다수의 상이한 수용체 단백질에 결합하는 다수의 ABD를 제공한다. 당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 6개의 CDR 또는 vh 및 vl 도메인의 임의의 세트는 scFv 형태 또는 Fab 형태일 수 있으며, 이때, 이는 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 추가되며, 여기서 중쇄 불변 도메인은 (CH1 도메인뿐만 아니라 Fc 도메인 내에 포함하는) 변이체를 포함한다. 서열 목록에 포함되는 scFv 서열은 특정 하전 링커를 이용하지만, 본원에 개설된 바와 같이, 도 8에 나타낸 것을 포함하는, 비하전 또는 다른 하전 링커가 사용될 수 있다.

게다가, 상기 설명된 바와 같이, CDR의 식별을 위해 서열 목록에 사용되는 넘버링은 Kabat이며, 그러나, 상이한 넘버링이 사용될 수 있으며, 이는 표 1에 나타낸 같이 CDR의 아미노산 서열을 변화시킬 것이다.

본원에 열거되는 모든 가변 중쇄 및 경쇄 도메인에 대해, 추가적인 변이체가 이루어질 수 있다. 본원에 개설되는 바와 같이, 일부 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 프레임워크(CDR 제외)가 도면 및 리간드가 본원에 그 전체가 참조로 통합되는 미국 특허 번호 제7,657,380호의 도 1에 열거되는 서열로부터 선택되는 인간 생식계열 서열에 적어도 약 80, 85 또는 90%의 동일성을 보유하는 한, 가변 중쇄 및 경쇄 도메인의 프레임워크 영역에서의 변화뿐만 아니라, 0, 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변형(특별히 사용되는 아미노산 치환을 가짐)을 가질 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원에 설명되는 바와 같은 동일한 CDR은 프레임워크 영역은 미국 특허 번호 제7,657,380호의 도 1에 열거되는 것들로부터 선택되는 인간 생식계열 서열에 적어도 80, 85 또는 90% 동일성을 유지하는 한, 인간 생식계열 서열로부터의 상이한 프레임워크 서열과 결합될 수 있다. 대안적으로, CDR은 프레임워크 영역이 미국 특허 번호 제7,657,380호의 도 1에 열거되는 것들로부터 선택되는 인간 생식계열 서열에 적어도 80, 85 또는 90% 동일성을 유지하는 한, 프레임워크 영역 변화를 가질뿐만 아니라, 아미노산 변화를 가질 수 있다(예를 들어, CDR의 세트에서 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변형(즉, CDR은 6개의 CDR 세트에서 변화의 총 수가 6 아미노산 변형 미만인 한 변형될 수 있으며, CDR의 임의의 조합은 변화되며; 예를 들어, 변화가 vlCDR1에서 1개, vhCDR2에 2개, vhCDR3에서 없음 등일 수 있다).

B. PD-1 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABDS 중 하나는 PD-1에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트는 도 3, 도 10, 도 11, 도 72, 도 73, 도 74, 도 76 그리고 SEQ ID NO: 1-2392, 3125-3144, 4697-7594 및 4697-21810에 도시되고, 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L을 갖는 서열 목록 내 서열을 포함한다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-PD-1 ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 경우, 이들 서열의 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같이 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같은 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. PD-1에 대한 Fv를 포함하는 본원의 많은 구현예에서, PD-1에 결합하는 것은 scFv 단량체이다. 본원에 설명된 바와 같이, PD-1이 항원 중 하나일 때 표적 쌍 중 다른 것은 ICOS(적합한 서열은 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), GITR, OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.

인간 PD-1에 결합하는 특히 유용한 ABD는 1G6_H1.279_L1.194, 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279, 1G6_L1.210_H1.288 및 2E9_H1L1을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

인간 PD-1에 결합하는 추가로 유용한 vh 및 vl 서열은 도 76에 나타낸다.

ABD 내지 PD-1을 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5개의 아미노산 변형을 가질 수 있다.

ABD 내지 PD-1을 형성하는, 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 각각 후자가 많은 구현예에서 사용되는 BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산 변형을 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl에 대해 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

특정의 바람직한 구현예는 도 9의 임의의 병따개 형태 백본 내에 포함되는, scFv 형태로, 1G6_L1.194_H1.279 항-PD-1 Fv을 포함한다.

특정의 바람직한 구현예는 도 55의 임의의 형태의 백본 내에 포함되는, scFv 형태로, 1G6_L1.194_H1.279 항-PD-1 Fv을 포함한다.

특정의 바람직한 구현예는 도 75의 임의의 mAb-scFv 형태 백본 내에 포함되는, scFv 형태로, 1G6_L1.194_H1.279 항-PD-1 Fv을 포함한다.

다른 구현예는 도 2에 나타낸 임의의 형태에서 도 76에 나타낸 바와 같이 (scFv 또는 Fab로서) 항-PD-1 vh 및 vl 도메인 쌍 중 임의의 것을 사용한다.

C. CTLA-4 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 CTLA-4에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트는 SEQ ID NO: 2393-2414 및 3737-3816에 도시될 뿐만 아니라, 일부 구현예에서 특히 관심이 있는 서열은 도 12 및 도 79에 도시되고 또한 식별자 [CTLA-4]_H0.25_L0; [CTLA-4]_H0.26_L0; [CTLA-4]_H0.27_L0; [CTLA-4]_H0.29_L0; [CTLA-4]_H0.38_L0; [CTLA-4]_H0.39_L0; 0[CTLA-4]_H0.40_L0; [CTLA-4]_H0.70_L0; [CTLA-4]_H0_L0.22; [CTLA-4]_H2_L0; [CTLA-4]_H3.21_L0.124; [CTLA-4]_H3.21_L0.129; [CTLA-4]_H3.21_L0.132; [CTLA-4]_H3.23_L0.124; [CTLA-4]_H3.23_L0.129; [CTLA-4]_H3.23_L0.132; [CTLA-4]_H3.25_L0.124; [CTLA-4]_H3.25_L0.129; [CTLA-4]_H3.25_L0.132; [CTLA-4]_H3.4_L0.118; [CTLA-4]_H3.4_L0.119; [CTLA-4]_H3.4_L0.12; [CTLA-4]_H3.4_L0.121; [CTLA-4]_H3.4_L0.122; [CTLA-4]_H3.4_L0.123; [CTLA-4]_H3.4_L0.124; [CTLA-4]_H3.4_L0.125; [CTLA-4]_H3.4_L0.126; [CTLA-4]_H3.4_L0.127; [CTLA-4]_H3.4_L0.128; [CTLA-4]_H3.4_L0.129; [CTLA-4]_H3.4_L0.130; [CTLA-4]_H3.4_L0.131; [CTLA-4]_H3.4_L0.132; [CTLA-4]_H3.5_L2.1; [CTLA-4]_H3.5_L2.2; [CTLA-4]_H3.5_L2.3; [CTLA-4]_H3_L0; [CTLA-4]_H3_L0.22; [CTLA-4]_H3_L0.44; [CTLA-4]_H3_L0.67; 및 [CTLA-4]_H3_L0.74를 갖는 서열 목록 내 서열을 포함한다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-MAdCAM-ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 표시되는 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 개설되는 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같이 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. Fv 내지 CTLA-4를 포함하는 본원의 많은 구현예에서, CTLA-4에 결합하는 것은 scFv 단량체이다.

본원에 설명되는 바와 같이, CTLA-4가 항원 중 하나일 때 표적 쌍 중 다른 것은 ICOS(적합한 서열은 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 및 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것에 도시됨), GITR, OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.

ABD 내지 CTLA-4를 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

ABD 내지 CTLA-4를 형성하는, 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 각각 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변형을 가질 수 있다. 다른 실시에에서, 변이체 vh 및 vl은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

D. TIM-3 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 TIM-3에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트는 도 14 및 도 81a-81c 그리고 SEQ ID NO: 3345-3704, 4585-4696에 나타낸다. 일부 구현예에서 특히 관심이 있는 ABD 서열은 식별자 1D10_H0L0; 1D12_H0L0; 3H3_H1_L2.1; 6C8_H0L0; 6D9_H0_1D12_L0; 7A9_H0L0; 7B11_H0L0; 7B11var_H0L0; 및 7C2_H0L0를 갖는 서열 목록 내 서열을 포함한다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-TIM-3 ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 도시되는 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. Fv 내지 TIM-3를 포함하는 본원의 많은 구현예에서, TIM-3에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에서 설명되는 바와 같이, TIM-3이 항원 중 하나일 때 표적 쌍 중 다른 것은 ICOS(적합한 서열은 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 도시됨), GITR, OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.

ABD 내지 TIM-3를 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

ABD 내지 TIM-3를 형성하는 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변화를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

LAG-3 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 LAG-3에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트는 도 13, 도 80 및 SEQ ID NO: 2415-2604, 3817-3960에 도시되고, 또한 식별자 2A11_H0L0; 2A11_H1.125_L2.113; 2A11_H1.144_L2.142; 2A11_H1_L2.122; 2A11_H1_L2.123; 2A11_H1_L2.124; 2A11_H1_L2.25; 2A11_H1_L2.47; 2A11_H1_L2.50; 2A11_H1_L2.91; 2A11_H1_L2.93; 2A11_H1_L2.97; 2A11_H1L1; 2A11_H1L2; 2A11_H2L2; 2A11_H3L1; 2A11_H3L2; 2A11_H4L1; 2A11_H4L2; 7G8_H0L0; 7G8_H1L1; 7G8_H3.18_L1.11; 7G8_H3.23_L1.11; 7G8_H3.28_L1; 7G8_H3.28_L1.11; 7G8_H3.28_L1.13; 7G8_H3.30_L1.34; 7G8_H3.30_L1.34; 및 7G8_H3L1을 포함한다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-LAG-3 ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 개설되는 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. Fv 내지 LAG-3을 포함하는 본원의 많은 구현예에서, LAG-3에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에서 설명되는 바와 같이, LAG-3이 항원 중 하나일 때 표적 쌍 중 다른 것은 ICOS(적합한 서열은 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b 뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 및 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 도시됨), GITR, OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.

ABD 내지 LAG-3을 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

ABD 내지 LAG-3을 형성하는 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 각각 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변화를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

E. BTLA 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 BTLA에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트는 도 82, 도 84a-84c 및 SEQ ID NO: 3705-3736에 도시되고, 또한 식별자 9C6_H0L0; 9C6_H1.1_L1; 및 9C6_H1.11_L1을 갖는 서열 목록 내 서열을 포함한다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-BTLA ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 개설되는 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같이 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 Fv 내지 BTLA를 포함하는 많은 구현예에서, BTLA에 결합하는 것은 scFv 단량체이다. 본원에서 설명되는 바와 같이, BTLA이 항원 중 하나일 때 표적 쌍 중 다른 것은 ICOS(적합한 서열은 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 도시됨), GITR, OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.

ABD 내지 BTLA를 형성하는, 본원에 개시되는 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

ABD 내지 BTLA를 형성하는, 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 각각 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변화를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

F. TIGIT 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 TIGIT에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6 개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트가 도 8a-8b 및 SEQ ID NO: 4433-4585에 나타낸다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-TIGIT ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 도시되는 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv로서 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 Fv 내지 TIGIT를 포함하는 많은 구현예에서, TIGIT에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에서 설명되는 바와 같이, TIGIT가 항원 중 하나일 때 표적 쌍 중 다른 것은 ICOS(적합한 서열은 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 및 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 도시됨), GITR, OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.

G. PD-L1 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 PD-L1에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트는 도 15a-15c, 도 73 및 도 78, 그리고 SEQ ID NO:3961-4432에 나타낸다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-TIGIT ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 표시되는 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 도시되는 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같이 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 Fv 내지 TIGIT를 포함하는 많은 구현예에서, TIGIT에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에서 설명되는 바와 같이, TIGIT가 항원 중 하나일 때 표적 쌍 중 다른 것은 ICOS(적합한 서열은 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 도시됨), GITR, OX40 및 4-1BB로부터 선택된다.

H. ICOS 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 ICOS에 결합한다. scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트는 ICOS(적합한 서열은 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0을 갖는 것들에 도시됨)로부터 선택된다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-ICOS ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 표시되는 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 개시된 vh 및 vl 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv로서 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 Fv 내지 ICOS를 포함하는 많은 구현예에서, ICOS에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에서 설명된 바와 같이, 항원 중 하나인 ICOS가 PD-1으로부터 선택될 때 표적 쌍 중 다른 것은 도 3, 도 10, 도 11, 도 72, 도 73, 도 74, 도 76 그리고 SEQ ID NO:1-2392, 3125-3144, 4697-7594 및 4697-21810에 도시되고, 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음), CTLA-4(적합한 서열은 도 12, 도 72 및 도 79뿐만 아니라, SEQ ID NO:2393-2414 및 3737-3816(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), TIM-3(적합한 서열은 도 14, 도 81a-81c 및 SEQ ID NO: 3345-3704, 4585-4696(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), LAG-3(적합한 서열은 도 13, 도 80 및 SEQ ID NO: 2415-2604, 3817-3960(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 또는 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), BTLA(적합한 서열은 도 82 및 도 84 그리고 SEQ ID NO:3705-3736(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), 및 TIGIT(적합한 서열은 도 83a-83d 및 SEQ ID NO: 4433-4585(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨)을 포함한다.

ABD 내지 ICOS를 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

ABD 내지 ICOS를 형성하는, 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 각각 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변화를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

특정의 바람직한 구현예는 도 9의 병따개 형태 백본 중 임의의 것 내에 포함되는, Fab 형태에서, [ICOS] H0.66_L0 항-ICOS Fv를 포함한다.

특정의 바람직한 구현예는 도 9의 병따개 형태 백본 중 임의의 것 내에 포함되는, scFv 형태에서, [ICOS]_H0_L0 항-ICOS Fv를 포함한다.

특정의 바람직한 구현예는 도 75의 mAb-scFv 형태 백본 중 임의의 것 내에 포함되는, scFv 형태로, [ICOS]_H0.66_L0 항-ICOS Fv를 포함한다.

특정의 바람직한 구현예는 도 75의 mAb-scFv 형태 백본 중 임의의 것 내에 포함되는, Fab 형태로, [ICOS]_H0.66_L0 항-ICOS Fv를 포함한다.

특정의 바람직한 구현예는 도 55의 임의의 형태 백본 내에 포함되는, Fab 형태로, [ICOS]_H0.66_L0 항-ICOS Fv를 포함한다.

I. GITR 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 GITR에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트뿐만 아니라, scFv 서열 FITR(적합한 서열은 도 18, 도 72 및 도 73, 그리고 SEQ ID NO: 26282-26290에 도시됨).

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-GITR ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 표시되는 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 개시된 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 나타낸 바와 같이 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. Fv 내지 GITR을 포함하는 본원의 구현예 중 다수에서, GITR에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에서 설명된 바와 같이, 항원 중 하나인 GITR가 PD-1으로부터 선택될 때 표적 쌍 중 다른 것은 도 3, 도 10, 도 11, 도 72, 도 73, 도 74, 도 76 및 SEQ ID NO:1-2392, 3125-3144, 4697-7594 및 4697-21810에 도시되고, 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음), CTLA-4(적합한 서열은 도 12, 도 72 및 도 79뿐만 아니라, SEQ ID NO:2393-2414 및 3737-3816(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), TIM-3(적합한 서열은 도 14, 도 81a-81c 및 SEQ ID NO: 3345-3704, 4585-4696(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), LAG-3(적합한 서열은 도 13, 도 80 및 SEQ ID NO: 2415-2604, 3817-3960(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 또는 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), BTLA(적합한 서열은 도 82 및 도 84 그리고 SEQ ID NO:3705-3736(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), 및 TIGIT(적합한 서열은 도 83a-83d 및 SEQ ID NO: 4433-4585 (scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨)를 갖는 서열 목록 내 서열을 포함한다.

ABD 내지 GITR을 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

ABD 내지 GITR을 형성하는, 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 각각 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변화를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

J. OX40 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 OX40에 결합한다. OX40에 대한 scFv 서열뿐만 아니라, 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적합한 세트가 제공된다(적합한 서열은 도 17, 도 72 및 도 73, 그리고 SEQ ID NO:26272-26281에 도시됨).

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-OX40 ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 개시되는 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv로서 또는 Fab로서 사용되는 이들 서열 및 도면에 도시되는 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. Fv 내지 OX40를 포함하는 본원의 많은 구현예에서, GITR에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에 설명된 바와 같이, 항원 중 하나인 OX40가 PD-1으로부터 선택될 때 표적 쌍 중 다른 것은도 3, 도 10, 도 11, 도 72, 도 73, 도 74, 도 76 그리고 SEQ ID NO:1-2392, 3125-3144, 4697-7594 및 4697-21810에 도시되고, 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음), CTLA-4(적합한 서열은 도 12, 도 72 및 도 79뿐만 아니라, SEQ ID NO:2393-2414 및 3737-3816(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), TIM-3(적합한 서열은 도 14, 도 81a-81c 및 SEQ ID NO: 3345-3704, 4585-4696(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), LAG-3(적합한 서열은 도 13, 도 80 및 SEQ ID NO: 2415-2604, 3817-3960(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 또는 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), BTLA(적합한 서열은 도 82 및 도 84 그리고 SEQ ID NO:3705-3736(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), 및 TIGIT(적합한 서열은 도 83a-83d 및 SEQ ID NO: 4433-4585 (scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨)를 갖는 서열 목록 내 서열을 포함한다.

ABD 내지 OX40을 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

BD 내지 CTLA-4를 형성하는, 본원에 개시되는 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 더하여, 본 발명은 변이체 vh 및 vl 도메인을 제공한다. 일 구현예에서, 변이체 vh 및 vl 도메인은 각각 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 vh 및 vl 도메인으로부터 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변화를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 vl은 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

K. 4-1BB 항원 결합 도메인

일부 구현예에서, ABD 중 하나는 4-1BB에 결합한다. 6개의 CDR 및/또는 vh 및 vl 도메인의 적절한 세트뿐만 아니라, scFv 서열 4-1BB(적합한 서열은 도 16, 도 72 및 도 73, 그리고 SEQ ID NO: 26262-2671에 도시됨).

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 적합한 항-4-1BB ABD는 이들이 언더라인되는 것으로서 또는, 상이한 넘버링 방식이 본원에 설명되는 바와 같이 그리고 표 1에 나타낸 바와 같이 사용되는 경우, 본원에 개시되는 서열 내의 다른 정렬을 사용하여 식별되는 CDR로서, 이들 서열 및 도면에 도시된 바와 같은 6개의 CDR 세트를 포함할 수 있다. 적합한 ABD는 또한 scFv로서 또는 Fab로서 사용되는, 이들 서열 및 도면에 도시된 바와 같이 전체 vh 및 vl 서열을 포함할 수 있다. 본원에서 4-1BB에 대한 Fv를 포함하는 많은 구현예에서, 4-1BB에 결합하는 것은 Fab 단량체이다. 본원에 설명된 바와 같이, 항원 중 하나인 ICOS가 PD-1으로부터 선택될 때 표적 쌍 중 다른 것은 도 3, 도 10, 도 11, 도 72, 도 73, 도 74, 도 76 그리고 SEQ ID NO:1-2392, 3125-3144, 4697-7594 및 4697-21810에 도시되고, 식별자 1G6_H1.279_L1.194; 1G6_H1.280_L1.224; 1G6_L1.194_H1.279; 1G6_L1.210_H1.288; 및 2E9_H1L1(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음), CTLA-4(적합한 서열은 도 12, 도 72 및 도 79뿐만 아니라, SEQ ID NO:2393-2414 및 3737-3816(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), TIM-3(적합한 서열은 도 14, 도 81a-81c 및 SEQ ID NO: 3345-3704, 4585-4696(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), LAG-3(적합한 서열은 도 13, 도 80 및 SEQ ID NO: 2415-2604, 3817-3960(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 또는 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), BTLA(적합한 서열은 도 82 및 도 84 그리고 SEQ ID NO:3705-3736(scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨), 및 TIGIT(적합한 서열은 도 83a-83d 및 SEQ ID NO: 4433-4585 (scFv 서열, CDR 서열 세트 또는 vh 및 vl 서열일 수 있음)에 도시됨)를 갖는 서열 목록 내 서열을 포함한다.

ABD 내지 4-1BB를 형성하는, 서열 목록에 개시되는 모체 CDR 세트에 더하여, 본 발명은 변이체 CDR 세트를 제공한다. 일 구현예에서, 6개의 CDR 세트는 후자가 많은 구현예에서 특히 사용되는, BIACORE®, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance, SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 모체 CDR로부터 1, 2, 3, 4 또는 5 아미노산 변화를 가질 수 있다.

ABD 내지 4-1BB을 형성하는, 본원에 개시된 모체 가변 중쇄 및 가변 경쇄 도메인에 추가하여, 본 발명은 변이체 vh 및 v1 도메인을 제공한다. 하나의 구현예태에서, 변이체 vh 및 v1 도메인은 후자가 특히 많은 구현예에서 사용되는 BIACORE®, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI (biolayer interferometry, 예를 들어, OCTET® 분석) 분석법 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABH가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, vh 및 vl 도메인으로부터 각각 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 아미노산 변화를 가질 수 있다. 다른 구현예에서, 변이체 vh 및 v1은 후자는 많은 구현예에서 특히 사용되는 BIACORE®, 표면 플라스몬 공명 (SPR) 및/또는 BLI(biolayer interferometry, 예를 들어, 옥 테트 분석) 분석 중 적어도 하나에 의해 측정되는 바와 같이, ABD가 표적 항원에 여전히 결합할 수 있는 한, 각각의 모체 vh 또는 vl과 적어도 90, 95, 97, 98 또는 99% 동일하다.

L. 특정 이중특이적 구현예

본 발명은 아래에 개설되는 바와 같은 다수의 특별한 이중특이적 항체를 제공한다.

1. ICOS X PD-1

본 발명은 ICOS 및 PD-1에 각각 1가로, 그리고 본원에 개설되는 바와 같은 일부 경우에, 모두 2가로 결합하는 이중특이적 이종이량체 항체를 제공한다.

일 구현예에서, PD-1은 ABD 1G6_L1.194_H1.279이고 ICOS ABD는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0을 갖는 것들에 도시되는 서열로부터 선택된다.

일 구현예에서, ICOS X PD-1 이중특이적 항체는 XENP 번호 20261, 20730, 20896, 22432-22438, 22731-22748, 227878-22894, 22931-22932, 22950-22961, 23090-23093, 23295-23296, 23301, 23405, 23408, 23410(모두 428L/434S가 없지만, 이들은 이들의 치환을 가질 수 있음); XENP 번호 22730, 22917-22928, 22935-22937, 22974-22979, 22995-22996, 23001, 23103, 23104(모두 428L/434S을 갖지만, 이들은 이들의 치환을 가질 수 없음); XENP 번호 23411, 21828, 21829, 21830, 21831, 22348, 23059(종래 기술의 ICOS 서열을 사용함); XENP 번호 18920, 24125, 24130(추가적인 병따개); XENP 23406, 23407, 24128(ICOS x PD-1 중심-scFv), XENP24123(ICOS x PD-1 중심-scFv2); XENP24134(ICOS x PD-1 이중특이적 mAb) 24122(ICOS x PD-1 DVD-Ig), XENP 24132, 24133(ICOS x PD-1 트라이던트)로부터 선택된다.

2. ICOS X PD-L1

본 구현예에서, ICOS ABD는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 나타낸 서열로부터 선택된다.

3. ICOS X CTLA-4

본 구현예에서, ICOS ABD는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 도시되는 서열로부터 선택된다.

일 구현예에서, [ICOS] H0.66_L0의 Fab ICOS ABD를 갖는 병따개 형태는 특히 도 9로부터의 병따개 백본 1에서, [CTLA-4] _H3.32_L0.129의 scFv CTLA-4 ABD와 쌍을 이룬다.

4. ICOS X LAG-3

본 구현예에서, ICOS ABD는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 나타낸 서열로부터 선택된다.

5. ICOS X TIM-3

본 구현예에서, ICOS ABD는 도 19, 도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b도 20a-20g, 도 24, 도 68a-68g 및 도 77a-77b뿐만 아니라 SEQ ID NO: 27869-28086, 28087-28269, 27193-27335, 28549-28556 및 28557-28665, 그리고 식별자 [ICOS]_H0.66_L0 및 [ICOS]_H0L0를 갖는 것들에 나타낸 서열로부터 선택된다.

M. 동종 항체

본 발명은 또한 본원에 개설되는 항체와 아미노산 서열 동일성을 공유하는 항체를 제공한다.

일 구현예에서, 본원 및 도면에 개설되는 Vh 및 V1 서열의 CDR 중 하나 또는 둘 다에 아미노산 변이체를 갖는 이중특이적 항체가 제조된다. 일 구현예에서, 본원에 개설된 vh 및 vl 사슬의 CDR 중 하나 또는 둘 다에서 1,2,3,4 또는 5개의 아미노산 차이를 갖는 항체가 제공된다. 이들 아미노산 변이체는 하나의 CDR에 있거나 하나보다 많은 CDR 사이에 전개될 수 있다. 이들 아미노산 변이체는 또한 이중특이적 항체의 Fv 중 하나 또는 둘 다에 있을 수 있으며; 예를 들어, ICOS Fv 측(일반적으로 Fab이지만 본원에 개설되는 바와 같은 scFv 일 수 있음) 상의 CDR에 2개의 아미노산 및 PD-1 측 상에 1개 등이 있을 수 있다.

유사하게, 본 발명은 본원에 개설되는 서열, 및 특히 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 도메인에서 적어도 95, 96, 97, 98 또는 99%의 아미노산 동일성을 갖는 항체를 제공한다. 이러한 서열 동일성은 또한 이중특이적 항체의 하나의 Fv 상에 또는 양 Fv 상에 있을 수 있다. 즉, 도면에 개설되는 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 도메인과 95-99% 동일한 이중특이적 항체가 제공된다.

IX. 본 발명의 핵산

본 발명은 본 발명의 이중특이적 항체를 인코딩하는 핵산 조성물(또는, 단일 특이적 항체의 경우, 이들을 또한 인코딩하는 핵산)을 더 제공한다.

당업자에 의해 주지되는 바와 같이, 핵산 조성물은 이종이량체 단백질의 형태 및 스캐폴드에 의존할 것이다. 따라서, 예를 들어, 형태가 3개의 아미노산 서열을 필요로하는 경우, 3개의 핵산 서열은 발현을 위한 하나 이상의 발현 벡터에 통합될 수 있다. 유사하게, 일부 형태(예를 들어, 도 2에 개시된 바와 같은 이중 scFv 형태)의 경우 두 개의 핵산만이 필요하며; 다시, 이들은 하나 또는 두 개의 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 일부 형태는 4개의 아미노산을 필요로 한다(이중특이적 mAb).

당해 분야에 공지되어 있는, 본 발명의 구성요소를 인코딩하는 핵산은 당해 분야에 공지되어 있는 바와 같이, 그리고 본 발명의 이종이량체 항체를 생산하기 위해 사용되는 숙주 세포에 따라 발현 벡터에 통합될 수 있다. 일반적으로, 핵산은 임의의 수의 조절 인자(프로모터, 복제 원점, 선택 가능한 마커, 리보솜 결합 부위, 유도자 등)에 작동 가능하게 링크된다. 발현 벡터는 염색체외 또는 통합 벡터일 수 있다.

그 후, 본 발명의 핵산 및/또는 발현 벡터는 많은 구현예에서 사용되는, 포유류 세포(예를 들어, CHO 세포)와 함께, 포유류, 세균, 효모, 곤충 및/또는 곰팡이 세포를 포함하는, 당해 분야에 잘 알려진 바와 같은 임의의 수의 상이한 유형의 숙주 세포로 형질 전환된다.

일부 구현예에서, 형태에 따라 적용 가능한 경우, 각각의 단량체를 인코딩하는 핵산 및 경쇄를 인코딩하는 선택적 핵산은 일반적으로 상이하거나 동일한 프로모터 제어 하에서, 단일 발현 벡터 내에 각각 포함된다. 본 발명에서 특히 사용되는 구현예에서, 이들 2개 또는 3개의 핵산 각각은 각각 상이한 발현 벡터 상에 포함된다. 본원 및 본원에 참조로 통합되는 62/025,931에 나타낸 바와 같이, 상이한 벡터 비율은 이종이량체 형성을 유도하기 위해 사용될 수 있다. 즉, 놀랍게도, 단백질은 1:1:2의 비율로 (이종이량체 항체를 포함하는 3개의 폴리펩티드를 갖는 본 발명의 많은 구현예의 경우) 제1 단량체:제2 단량체:경쇄를 포함하지만, 이들은 최선의 결과를 제공하는 비율이 아니다.

본 발명의 이종이량체 항체는 당해 분야에 잘 알려진 발현 벡터(들)을 포함하는 숙주 세포를 배양함으로써 제조된다. 일단 제조되면, 이온 교환 크로마토그래피 단계를 포함하는, 전통적인 항체 정제 단계가 수행된다. 본원에서 설명된 바와 같이, 2개의 단량체의 pI가 적어도 0.5만큼 다르게 하는 것은 이온 교환 크로마토그래피 또는 등전점 전기영동, 또는 등전점에 민감한 다른 방법에 의한 분리를 허용할 수 있다. 즉, pI 치환의 포함은 각각의 단량체가 상이한 pI를 갖고 이종이량체가 또한 별개의 pI를 갖도록 각각의 단량체의 등전점(pI)을 번경시킴으로써, "트리플 F" 이종이량체(예를 들어, 음이온 교환 컬럼, 양이온 교환 컬럼)의 등전점 정제를 촉진시킨다. 이들 치환은 또한 정제 후에 임의의 오염된 이중 scFv-Fc 및 mAb 동종이량체(예를 들어, IEF 겔, cIEF 및 분석 IEX 컬럼)의 결정 및 모니터링을 돕는다.

X. 이종이량체 면역조절 항체의 생물학적 및 생화학적 기능

일반적으로, 본 발명의 이중특이적 면역조절 항체는 암을 가진 환자에게 투여되고, 효능은 본원에 설명되는 바와 같은 다수의 방법으로 평가된다. 따라서, 암 부하, 종양의 크기, 전이의 존재 또는 정도의 평가 등과 같은 효능의 표준 분석이 수행될 수 있지만, 면역-종양학 치료가 또한 면역 상태 평가에 기초하여 평가될 수 있다. 이것은 시험관내 및 생체내 분석을 포함하여, 다수의 방식으로 행해질 수 있다. 예를 들어, 종양 부하, 크기, 침윤성, LN 수반, 전이 등과 같은 "구식(old fashioned)" 측정과 함께 면역 상태의 변화(예를 들어, ipi 치료 다음의 ICOS+ CD4+ T 세포의 존재)가 행해질 수 있다. 따라서, 다음 중 일부 또는 전부가 평가될 수 있다: CD4⁺ T 세포 활성화 또는 증식, CD8⁺ T(CTL) 세포 활성화 또는 증식, CD8⁺ T 세포-매개형 세포독성 활성 및/또는 CTL 매개형 세포 고갈, NK 세포 활성 및 NK 매개형 세포 고갈에 대한 PVRIG의 억제 효과, Treg 세포 분화 및 증식 및 Treg- 또는 골수 유도 억제 세포(MDSC)-매개 면역 억제 또는 면역 내성에 대한 PVRIG의 강화 효과, 및/또는 T 또는 다른 면역 세포에 의한 면역 세포, 예를 들어, IL-2, IFN- 또는 TNF-α 생산에 의한 전염증성 사이토카인 생산에 대한 PVRIG의 효과.

일부 구현예에서, 치료의 평가는 예를 들어, CFSE 희석 방법, 면역 이펙터 세포의 Ki67 세포내 염색, 및 3H-티미딘 혼입 방법을 사용하여, 면역 세포 증식을 평가함으로써 수행된다.

일부 구현예에서, 치료의 평가는 다음: CD25, CD69, CD137, ICOS, PD1, GITR, OX40, 및 CD107A의 표면 발현에 의해 측정되는 세포 탈과립 중 하나 이상을 포함하여, 활성화-연관 마커의 유전자 발현의 증가 또는 이의 증가된 단백질 수준을 평가함으로써 수행된다.

일반적으로, 유전자 발현 분석은 당해 분야에 공지된 바와 같이 수행된다.

일반적으로, 단백질 발현 측정은 또한 당해 분야에 공지된 바와 유사하게 수행된다.

일부 구현예에서, 치료의 평가는 효소 활성(프로테아제 활성 포함), 세포막 투과성, 세포 부착성, ATP 생산, 보조효소 생산 및 뉴클레오티드 흡수 활성과 같은 수많은 세포 파라미터를 평가하는 것을 통한 표적 세포 생존능 검출에 의해 측정되는 세포독성 활성을 평가함으로써 수행된다. 이들 분석의 구체적인 예는 트립판 블루 또는 PI 염색법, ⁵¹Cr 또는 ³⁵S 방출법, LDH 활성, MTT 및/또는 WST 분석법, 칼세인-AM 분석법, 발광 기반 분석법, 및 다른 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.

일부 구현예에서, 치료의 평가는 잘 알려진 기술을 사용하여 사이토카인 생성에 의해 측정되는 T 세포의 활성, IFNg, TNFα, GM-CSF, IL2, IL6, IL4, IL5, IL10, IL13를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 사이토카인을 사용하는 배양 상등액에서 세포내 측정을 평가함으로써 시행된다.

따라서, 치료의 평가는 다음 중 하나 이상을 평가하는 분석법을 사용하여 수행될 수 있다: (i) 면역 반응의 증가, (ii) αβ 및/또는 γδ T 세포의 활성화 증가, (iii) 세포독성 T 세포 활성의 증가, (iv) NK 및/또는 NKT 세포 활성의 증가, (v) αβ 및/또는 γδ T-세포 억제의 완화, (vi) 전염증성 사이토카인 분비의 증가, (vii) IL-2 분비의 증가, (viii) 인터페론-γ 생산의 증가, (ix) Th1 반응의 증가, (x) Th2 반응의 감소, (xi) 적어도 하나의 조절 T 세포(Tregs) 중 적어도 하나의 증가 또는 감소 세포수 및/또는 활성.

효능 측정 분석

일부 구현예에서, T 세포 활성화는 당해 분야에 공지된 바와 같은 혼합 림프구 반응(Mixed Lymphocyte Reaction, MLR) 분석을 사용하여 평가된다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 상이한 인자의 인산화 또는 탈인산화에 의해, 또는 다른 번역 후(post translational) 변형을 측정하는 것에 의 해 측정되는 바와 같은 면역 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예시적인 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현 변화에 의해 측정되는 바와 같은 αβ 및/또는 γδ T 세포의 활성화의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접 살상 또는 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예시적인 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은 세포독성 T 세포 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접 살상 또는 사이토카인 분비 또는 예시적인 CD107a 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은 NK 및/또는 NKT 세포 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예시적인 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예시적인 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 일 예에 대해 측정되는 바와 같은 αβ 및/또는 γδ T-세포 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스 또는 다중복합체 비드 기반 방법 또는 세포내 염색 및 FACS 분석 또는 알리스폿(Alispot) 등에 의해 측정되는 바와 같은 전염증성 사이토카인 분비의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 약술된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 ELISA 또는 루미넥스 또는 다중복합체 비드 기반 방법 또는 세포내 염색 및 FACS 분석 또는 알리스폿 등에 의해 측정되는 바와 같은 IL-2 분비의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 ELISA 또는 루미넥스또는 다중복합체 비드 기반 방법 또는 세포내 염색 및 FACS 분석 또는 알리스폿 등에 의해 측정되는 바와 같은 인터페론-γ 생산의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은 Th1 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현 의 변화에 의해 측정된 바와 같은 Th2 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 유동세포계측법 또는 IHC에 의해 측정되는 바와 같은, 적어도 하나의 조절 T-세포(Tregs)의 세포 수 및/또는 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적합한 감소는 아래에 개설된, 증가의 경우와 동일하다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 유동세포계측법 또는 IHC에 의해 측정되는 바와 같은, M2 대식세포 세포 수의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적합한 감소는 아래에 개설된 증가의 경우와 동일하다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은, M2 대식세포 친-종양형성(pro-tumorigenic) 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적합한 감소는 아래에 개설된 증가의 경우와 동일하다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 유동세포계측법 또는 IHC에 의해 측정되는 바와 같은, N2 호중구의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적합한 감소는 아래에 개설된 증가의 경우와 동일하다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은, N2 호중구 친-종양생성 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적합한 감소는 아래에 개설된 증가의 경우와 동일하다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은, T 세포 활성화의 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접 살상 또는 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은, CTL 활성화의 억제의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은 αβ 및/또는 γδ T 세포 고갈의 증가 또는 감소를 측정한다. 반응의 감소는 면역자극 활성을 나타낸다. 적합한 감소는 아래에 개설된 증가의 경우와 동일하다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은 αβ 및/또는 γδ T세포 반응의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD45RA, CCR7 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은 항원-특이적 기억 반응의 자극의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신(Calcine) AM과 같은 세포독성 분석, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드화물 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반 분석에 의해 측정되는 바와 같은 암 세포의 세포사멸 또는 용해의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로는 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신 AM과 같은 세포독성 분석, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드화물 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반 분석에 의해 측정되는 바와 같은 암 세포에 대한 세포독성 또는 세포증식억제 효과의 자극의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신(Calcine) AM과 같은 세포독성 분석, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드화물 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반 분석에 의해 측정되는 바와 같은 암 세포의 직접 살상의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개략되어 있다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식 또는 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 측정되는 바와 같은 Th17 활성의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

일 구현예에서, 신호 경로 분석은 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드화물 염색 등과 같은 예를 들어 MTT, Cr 방출, 칼신 AM과 같은 세포독성 분석, 또는 예를 들어 CFSE 희석 또는 프로피듐 요오드화물 염색 등과 같은 유동세포계측법 기반 분석에 의해 측정되는 바와 같은, 보체 의존성 세포독성 및/또는 항체 의존성 세포-매개 세포독성의 유도의 증가 또는 감소를 측정한다. 활성의 증가는 면역자극 활성을 나타낸다. 활성의 적합한 증가는 아래에 개설된다.

T 세포 활성화는 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접적 살상 또는 사이토카인 분비 또는 증식 또는 예를 들어 CD137, CD107a, PD1 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 예를 들어 측정된다. T-세포의 경우, 증식에서, 활성화의 세포 표면 마커(예를 들어, CD25, CD69, CD137, PD1), 세포독성(표적 세포를 살상하는 능력) 및 사이토카인 생산(예를 들어, IL-2, IL-4, IL-6, IFNγ, TNF-a, IL-10, IL-17A)은 암 세포의 증대된 살상과 일치하는 면역 조절을 나타낼 것이다.

일 구현예에서, NK 세포 활성화는 예를 들어 암 세포와 같은 표적 세포의 직접 살상 또는 사이토카인 분비 또는 예를 들어 CD107a 등과 같은 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 예를 들어 측정된다. NK 세포의 경우, 증식, 세포독성(표적 세포를 살상하고 CD107a, 그랜자임 및 퍼포린 발현을 증가시키는 능력), 사이토카인 생산(예를 들어,IFNγ 및 TNF), 및 세포 표면 수용체 발현(예를 들어, CD25)의 증가는 암 세포의 증대된 살상과 일치하는 면역 조절을 나타낼 것이다.

일 구현예에서, γδ T 세포 활성화는 예를 들어 사이토카인 분비 또는 증식또는 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 예를 들어 측정된다.

일 구현예에서, Th1 세포 활성화는 예를 들어 사이토카인 분비 또는 활성화 마커의 발현의 변화에 의해 예를 들어 측정된다.

적절한 활성 또는 반응의 증가(또는 상기 개설된 바와 같이 절한 감소)는 기준 시료 또는 대조군 시료, 예를 들어, 본 발명의 항-PVRIG 항체를 포함하지 않는 테스트 시료에서의 신호에 대해 적어도 약 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 내지 99% 퍼센트의 증가이다. 유사하게, 기준 또는 대조군 시료과 비교하여 적어도 1, 2, 3, 4 또는 5배의 증가가 효능을 나타낸다.

XI. 치료

일단 제조되면, 본 발명의 조성물은 일반적으로 본 발명의 이중특이적 면역조절 항체의 결합으로 T 세포 활성화의 억제를 억제하는 것에 의해(예를 들어, T 세포가 더 이상 억제되지 않음), 암을 치료함으로써, 다수의 종양학 용도에 사용된다.

따라서, 본 발명의 이종이량체 조성물은 이들 암의 치료에 사용된다.

XII. 생체 내 투여를 위한 항체 조성물

본 발명에 따라 사용되는 항체의 제제는 동결 건조 제제 또는 수용액의 형태로, (일반적으로 Remington's Pharmaceutical Sciences 제16 판, Osol, A. Ed. [1980]에 개설되는 바와 같이) 원하는 정도의 순도를 갖는 항체와 선택적인 약학적 담체, 부형제 또는 안정 화제를 혼합함으로써 보관을 위해 준비된다. 허용되는 담체, 완충제, 부형제 또는 안정제는 사용 된 투용량 및 농도에서 수혜자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 인산염, 구연산염 및 다른 기타 유기산; 아스코르브 산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제(예컨대,옥타데실디메틸벤질 아모니윰 클로라이드; 헥사 메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토니늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라핀 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테 콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저 분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역 글로불린; 친수성 중합체 예커내 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글라이신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신; 단당류, 이당류 및 포도당, 만노오스 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 자당, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온 예컨대 소금; 금속 착물(예를 들어, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비 이온성 계면 활성제 예컨대 TWEENTM, PLURONICSTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)을 포함한다.

투여 방식(modalities)

본 발명의 항체 및 화학 요법제는 공지된 방법, 예컨대, 볼루스로서의 정맥내 투여 또는 기간에 걸친 연속 주입에 따라 대상에게 투여된다.

치료 방식

본 발명의 방법에서, 치료는 질병 또는 병태에 관해 양성 치료 반응을 제공하기 위해 사용된다. "양성 치료 반응"은 질병 또는 병태의 개선, 및/또는 질병 또는 병태와 연관되는 증상의 개선을 의미한다. 예를 들어, 양성 치료 반응은 질병에서 다음 개선 중 하나 이상을 지칭할 것이다: (1) 종양 세포 수의 감소; (2) 종양 세포 죽음의 증가; (3) 종양 세포 생존의 억제; (5) 종양 성장의 억제(즉, 어느 정도 느리게, 바람직하게는 정지); (6) 증가된 환자 생존율; 및 (7) 질병 또는 병태와 연관되는 하나 이상의 증상으로부터의 일부 경감.

주어진 질병 또는 병태에서 양성 치료 반응은 그러한 질병 또는 병태에 특화된 표준화된 반응 기준에 의해 결정될 수 있다. 종양의 반응은 자기 공명 영상(MRI) 스캔, X-방사선 영상, 컴퓨터 단층 촬영(CT) 스캔, 뼈(bone) 스캔 영상, 내시경 검사, 및 골수 천자(BMA) 및 순환계 내의 종양 세포의 카운팅과 같은 종양 생검 샘플링과 같은 스크리닝 기술을 사용하여 종양 형태의 변화(즉, 전체 종양 부담, 종양 크기 등)에 대해 평가될 수 있다.

이러한 양성 치료 반응에 더하여, 치료를 받는 대상은 질병과 연관되는 증상에서 유익한 개선 효과를 경험할 수 있다.

본 발명에 따른 치료는 사용된 약제의 "치료적 유효량"을 포함한다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 효과를 달성하기 위해, 필요한 투여 량 및 기간 동안에서, 효과적인 양을 지칭한다.

치료적 유효량은 개인의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 그리고 개인에서 원하는 반응을 유발하는 약제의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 치료적 유효량은 항체 또는 항체 부분의 임의의 독성 또는 유해한 효과가 치료학적으로 유익한 효과보다 훨씬 중요하다.

종양 치료에 대한 "치료적 유효량"은 또한 질병의 진행을 안정시키는 그것의 능력에 의해 측정될 수 있다. 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 예측하는 동물 모델 시스템에서 평가될 수 있다.

대안적으로, 조성물의 이러한 특성은 숙련된 전문가에게 공지된 시험 관내 검정에 의해 세포 성장을 억제하거나 세포 자멸을 유도하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가될 수 있다. 치료적 화합물의 치료적 유효량은 종양 크기를 감소 시키거나, 그렇지 않으면 대상의 증상을 개선할 수 있다. 당업자는 대상의 크기, 대상 증상의 중증도, 및 특정 조성물 또는 선택된 투여 경로와 같은 요인에 기초하여 그러한 양을 결정할 수 있을 것이다.

투약 용법(Dosage regimen)은 최적의 원하는 반응(예를 들어, 치료적 반응)을 제공하기 위해 조정된다. 예를 들어, 단일 볼러스(bolus)가 투여될 수 있거나, 수회 분할된 투여가 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나 투여는 치료적 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바에 따라 비례하여 감소되거나 증가될 수 있다. 비경구 조성물은 투여의 용이함 및 투여량의 균일성을 위해 투여량 단위 형태로 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 투여량 단위 형태는 치료될 대상에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 제약학적 담체와 연관하여 원하는 치료적 효과를 생성하도록 계산되는 미리 결정된 양의 활성 화합물을 포함한다.

본 발명의 투여량 단위 형태에 대한 명세는 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성될 특정 치료적 효과, 및 (b) 개인의 민감성의 치료를 위한 그러한 활성 화합물을 혼합하는 기술에 고유한 제한에 의해 지시되거나 이에 직접적으로 의존한다.

본 발명에서 사용되는 이중특이적 항체의 효율적인 투여량 및 투약요법은 치료될 질환 또는 상태에 의존하고 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 이중특이적 항제의 치료적 유효량에 대한 예시적, 비제한적 범위는 약 0.1-100 mg/kg이다.

모든 인용된 참고 문헌은 본원에 그 전체가 참조로 통합된다.

본 발명의 특정 구현예가 예시의 목적을 위해 상기 설명되었지만, 다수의 세부 사항의 변형이 첨부된 청구범위에 설명되는 본 발명으로부터 벗어남이 없이 이루어질 수 있음을 당업자는 알 수 있을 것이다.

XIII. 실시예

본 발명을 예시하기 위해 실시예가 아래에 제공된다. 이들 실시예는 본 발명을 임의의 특정 용도 또는 동작 이론에 제한하려는 것이 아니다. 본원에서 설명되는 모든 불변 영역 위치에 대해, 넘버링은 Kabat (Kabat 등의 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, 전체적으로 참조로 통합됨)에서와 같이 EU 인덱스에 따른다. 항체 분야의 당업자는 이러한 협약이 면역 글로불린 군(family)의 보존된 위치에 대한 표준화된 참조를 가능하게하는, 면역 글로불린 서열의 특정 영역에서의 비순차적 넘버링으로 구성된다는 것을 알 수 있을 것이다. 따라서, EU 인덱스에 의해 정의되는 바와 같은 주어진 면역 글로불린의 위치는 반드시 그 순차적 서열에 대응할 필요가 없을 것이다.

일반적이고 구체적인 과학 기술은 미국 특허 공보 제2015/0307629호, 제2014/0288275호 및 WO2014/145806호에서 개설되며, 그 모두는 그 전체가 그리고 특히 본원에 개설되는 기술에 대해 참조로 명백히 통합된다.

A. 실시예 1: 다중 암 유형의 TIL은 PD-1 및 T 세포 공자극 수용체를 공동 발현한다.

PD-1과 다양한 T 세포 공자극 수용체 사이의 잠재적 연관성을 조사하기 위해, Cancer Genome Atlas project(TCGA)의 RNA 서열 데이터가 분석을 위해 사용되었다. V2 RSEM 데이터는 FireBrowse(http://firebrowse.org/)에서 다운로드되었다. 분석은 맞춤형 루틴과 함께 R을 사용하여 수행되었다. PD-1의 발현과 8개의 공자극 수용체 사이의 상관은 계산된 R2 값(피어슨 상관 계수의 제곱)과 함께, 도 1에 나타낸다. 데이터는 D-1 및 수개의 공자극 수용체가 방광암, 유방암, 결장암, 두경부암, 신장암, 폐-아데노암, 폐 편평 상피암, 난소암, 췌장암, 전립선암 및 흑색종암을 포함하는 암에서 공동 발현되었다는 것을 나타낸다. 특히, TIL에 대한 ICOS의 발현은 수개의 다른 공자극보다 PD-1의 그것과 더 잘 연관된다.

B. 실시예 2: 면역 체크포인트 항원 결합 도메인

1. 2A: 항-PD-1 ABD

PD-1에 결합하는 항체의 예는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 2가의 IgG1 형태로 생성되었으며, 그에 대한 예시적인 서열은 도 10에 나타낸다. 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 GIBSON ASSEMBLY® 방법에 의해 포유류 발현 벡터 pTT5에 삽입되었다. 중쇄 VH 유전자는 상기 지칭된 치환으로 인간 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 GIBSON ASSEMBLY®를 통해 삽입되었다. 경쇄 VL 유전자는 인간 Cκ 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 삽입되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 추가적인 PD-1 ABD(상기 항체로부터 유도되는 것을 포함함)는 공자극/체크포인트 이중특이적 항체에서 사용하기 위해 Fab 및 scFv로 포맷팅되었으며, 그에 대한 예시적인 서열이 도 11 및 서열 목록에 각각 나타낸다.

2. 2B: 항-MTLA-4 ABD

CTLA-4에 결합하는 항체는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K치환을 갖는 2가 IgG1 형태로 생성되었다. 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 GIBSON ASSEMBLY® 방법에 의해 포유류 발현 벡터 pTT5에 삽입되었다. 중쇄 VH 유전자는 상기 지칭된 치환으로 인간 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 GIBSON ASSEMBLY®을 통해 삽입되었다. 경쇄 VL 유전자는 인간 Cκ 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 삽입되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 추가적인 CTLA-4 ABD(상기 항체로부터 유도되는 것을 포함함)는 공자극/체크포인트 이중특이적 항체에서 사용하기 위해 Fab 및 scFv로 포맷팅되었으며, 그에 대한 예시적인 서열이 도 12 및 서열 목록에 각각 나타낸다.

3. 2C: 항-LAG-3 ABD

LAG-3에 결합하는 항체의 예는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K치환을 갖는 2가 IgG1 형태로 생성되었다. 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 GIBSON ASSEMBLY® 방법에 의해 포유류 발현 벡터 pTT5에 삽입되었다. 중쇄 VH 유전자는 상기 지칭된 치환으로 인간 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 GIBSON ASSEMBLY®을 통해 삽입되었다. 경쇄 VL 유전자는 인간 Cκ 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 삽입되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 추가적인 LAG-3 ABD(상기 항체로부터 유도되는 것을 포함함)는 공자극/체크포인트 이중특이적 항체에서 사용하기 위해 Fab 및 scFv로 포맷팅되었으며, 그에 대한 예시적인 서열이 도 13 및 서열 목록에 각각 나타낸다.

4. 2D: 항-TIM-3 ABD

TIM-3에 결합하는 항체의 예는E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 2가 IgG1 형태로 생성되었으며, 그에 대한 예시적 서열이 도 14에 나타낸다. 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 GIBSON ASSEMBLY® 방법에 의해 포유류 발현 벡터 pTT5에 삽입되었다. 중쇄 VH 유전자는 상기 지칭된 치환으로 인간 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 GIBSON ASSEMBLY®을 통해 삽입되었다. 경쇄 VL 유전자는 인간 Cκ 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 삽입되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 상기 항체는 공자극/체크포인트 이중특이적 항체에서 사용하기 위해 Fab로 포맷팅되었다.

5. 2E: 항-PD-L1 ABD

PD-L1에 결합하는 항체의 예는E233P/L234V/L235A/G236del/S267K치환을 갖는 2가 IgG1 형태로 생성되었으며, 그에 대한 예시적 서열이 도 15a-15c에 나타낸다. 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 GIBSON ASSEMBLY® 방법에 의해 포유류 발현 벡터 pTT5에 삽입되었다. 중쇄 VH 유전자는 상기 지칭된 치환으로 인간 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 GIBSON ASSEMBLY®을 통해 삽입되었다. 경쇄 VL 유전자는 인간 Cκ 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 삽입되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 상기 항체는 공자극/체크포인트 이중특이적 항체에서 사용하기 위해 Fab 및 scFv로서 포맷팅되었다.

C. 실시예 3: 공자극 수용체 항원 결합 도메인

ICOS, GITR, OX40, 및 4-1BB 결합하는 프로토타입 공자극 수용체 항체는 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환을 갖는 2가 IgG1 형태로 생성되었으며, 그에 대한 서열은 도 16-19에 나타낸다. 가변 영역을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 GIBSON ASSEMBLY® 방법에 의해 포유류 발현 벡터 pTT5에 삽입되었다. 중쇄 VH 유전자는 상기 지칭된 치환으로 인간 IgG1 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 GIBSON ASSEMBLY®을 통해 삽입되었다. 경쇄 VL 유전자는 인간 Cκ 불변 영역을 코딩하는 pTT5로 삽입되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 상기 항체는 공자극/체크포인트 이중특이적 항체에서 사용하기 위해 Fab 및 scFv로서 포맷팅되었다.

D. 실시예 4:안정성과 친화성을 위한 항-ICOS ABD 조작

항-ICOS 항체(XENP16435; 도 19에 도시됨)의 모체 가변 영역은 ICOS x 체크포인트 이중특이적 항체의 구성요소로서 사용하기 위해 조작되었다. 최적의 친화성 및 안정성을 갖도록 조작되는 Fv 변이체의 라이브러리는 Fab- His 및 scFv-His 형태에서 부위 특이적 돌연변이 유발 (QuikChange®, Stratagene, Cedar Creek, Tx.) 또는 추가적인 유전자 합성 및 서브클로닝에 의해 구축되었고 아래에 설명되는 바와 같이 제조되었다.

1. 4A: 항-ICOS Fab

변이체 항-ICOS Fab에 대한 아미노산 서열이 도 20a-20g에 열거된다(폴리히스티딘(His6) 태그는 Fab 중쇄의 C 말단으로부터 제거되었음). Fab 발현에 필요한 2개의 사슬을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 발현 벡터 pTT5로 서브클로닝되었다. Fab 중쇄는 C-말단 폴리히스티딘 태그를 포함하였다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었고 결과적인 단백질은 Ni-NTA 크로마토그래피를 사용하여 상등액으로부터 정제되었다. 결과적인 항-ICOS Fab는 안정성 및 친화성을 특징으로 하였다.

DSF(Differential Scanning Fluorimetry) 실험은 Bio-Rad CFX Connect™ Real-Time PCR Detection System을 사용하여 수행되었다. 단백질은 SYPRO Orange 형광 염료와 혼합되어 PBS로 0.2 mg/mL로 희석되었다. SYPRO 오렌지의 최종 농도는 10X이었다. 25℃에서 초기 10분의 배양 기간 이후, 단백질은 1℃/분의 가열 속도를 사용하여 25℃ 내지 95℃로 가열되었다. 형광 측정은 30초마다 취해졌다. 용융 온도(Tm)는 기기 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 그 결과가 도 21에 나타낸다.

인간 ICOS에 대한 항-ICOS Fab의 일련의 친화력 스크린은 OCTET®, BLl(BioLayer Interferometry)-기반 방법을 사용하여 수행되었다. OCTET®에 대한 실험 단계는 일반적으로 시험 물품의 1가 친화력을 측정하기 위해 다음을 포함하였다: 고정화(리간드 또는 시험 물품을 바이오 센서 상으로 캡처); 회합(리간드- 또는 시험 물품-코팅된 바이오 센서를 대응하는 시험 물품 또는 리간드의 연속 희석을 포함하는 웰로 침지); 및 해리(바이오 센서를 완충액을 포함하는 웰로 복귀). 구체적으로, 항-마우스 Fc(AMC) 바이오 센서는 ICOS의 마우스 IgG2a Fc 융합체를 캡처하기 위해 사용되었고 여러 농도의 시험 물품에 침지되었다. 결과적인 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)이 도 22 내지 도 23에 제시되었다. 결합 친화력 및 운동 속도 상수는 ForteBio OCTET® Data Analysis 소프트웨어(ForteBio)를 사용하는 1:1 결합 모델을 사용하여 처리된 데이터를 분석함으로서 획득되었다. 두 개의 개별적인 실험으로부터의 데이터는 도 22a 내지 도 22c에 도시되었다. 추가 실험에서, 스트렙 타비딘(SA) 바이오 센서가 ICOS-TEV-Fc-Avi를 캡처하기 위해 사용되었고 시험 물품에 침지되었다. 그 데이터가 도 23에 나타낸다. XENP22780, XENP22782, XENP22783 및 XENP22784를 포함하는 다수의 변이체 항-ICOS Fab는 모체 가변 영역 (XENP22050)을 포함하는 Fab과 유사한 친화력 특성을 유지하면서 안정성을 개선하였다.

2. 4B: 항-ICOS scFv

항-ICOS scFv에 대한 아미노산 서열이 도 24에 열거된다(폴리히스티딘 (His6) 태그는 scFv의 C-말단으로부터 제거되었음). scFv를 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 발현 벡터 pTT5로 서브클로닝되었다. scFv는 C-말단 폴리히스티딘 태그를 포함하였다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었고 결과적인 단백질이 Ni-NTA 크로마토그래피를 사용하여 상등액으로부터 정제되었다. 결과적인 항-ICOS scFv는 상기 설명된 바와 같은 DSF 실험에서 안정성을 특징으로 하였다. 그 데이터가 도 25에 나타낸다.

E. 실시예 5: 항-ICOSx 항-PD-1 이중특이적 항체

1. 5A: 프로토타입 공자극/체크포인트 병따개

병따개 형태의 공자극/체크포인트 이중특이적 항체에 대한 개략도가 도 2a로서 같이 나타낸다. 프로토타입 항-GITR mAb (XENP16438), 항-OX40 mAb(XENP16437), 항-4-1BB mAb(XENP14410) 및 항-ICOS mAb(XENP16435) 및 예시적 항-PD-1 scFv (XENP19692) 팔에 기초하여 공자극 수용체 결합 Fab 팔을 갖는 프로토타입 병따개가 SEB 자극 PBMC 분석에서 사이토카인 분비에 대한 효과를 조사하기 위해 생성되었다. 서열이 도 26a-26d에 나타낸다. 병따개 발현에 필요한 3개의 사슬을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 발현 벡터 pTT5로 서브클로닝되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포에 형질 감염되었고 결과적인 단백질이 표준 기술을 사용하여 정제되었다.

a. 5A(a): 프로토타입 항-ICOS x 항-PD-1 병따개는 사이토카인 분비를 향상시킨다.

SEB(Staphylococcal Enterotoxin B)는 T 세포 수용체(TCR)를 통한 활성화에 의해 달성되는 것과 유사한 방식으로 T 세포 활성화 및 증식을 야기하는 초항원이다. SEB로 인간 PBMC를 자극하는 것은 T 세포 활성화 및 증식을 분석하기 위한 공통 방법이다. PBMC는 2일 동안 100 ng/mL SEB로 자극되었다. 세포는 2회 세척되었고 지시된 시험 물품 20 μg/mL와 함께 100 ng/mL SEB로 재자극되었다. 니볼루맙(XENP16432), 제2 2가 항-PD-1 mAb(XENP19686) 및 2가 항-RSV mAb(XENP15074)에 기초한 제1 2가 항-PD-1 항체가 대조군으로 사용되었다. 처리 24시간 후, 상등액이 IL-2에 대해 분석되었다. 도 27에 도시된 데이터는 공자극/체크포인트 병따개 각각이 2가 항-RSV 항체와 비교하여 사이토카인 분비를 증가시켰다는 것을 도시한다. 놀랍게도, XENP22730에 의한 사이토카인 분비의 유도는 2가 항-PD-1 항체 단독 뿐만 아니라 다른 프로토타입 공자극/체크포인트 병따개에 의한 사이토카인 분비보다 크게 우수하며, ICOS 결합의 첨가가 사이토카인 생산을 증가시키고 ICOS가 이중특이적 항체에 대한 다른 공자극 수용체보다 더 양호한 PD-1 파트너인 것을 나타낸다.

다른 실험에서, PBMC는 지시된 시험 물품 20 μg/mL로 3일 동안 0.01 μg/mL로 자극되었다. 대조군으로서, 시험 물품은 또한 나이브(비 SEB 자극) PBMC와 함께 배향되었다. 처리 3일 후, 상등액이 (도 28에 나타낸) T 세포 활성화의 지표로서 IL-2 분비에 대해 평가되었다. 데이터는 항-PD-1 2가 항체 또는 항-ICOS x 항-PD-1 병따개 어느 것도 나이브 세포에서 IL-2 분비를 자극하지 않는다는 것을 나타낸다. 또한, 데이터는 다시 XENP20896가 2가 항-PD-1 항체 단독으로 행하는 것보다 IL-2 분비를 더 증가시키고 XENP20896이 2가의 조합(XENP16432 및 XENP16435)뿐만 아니라 외팔형의 조합(XENP20111 및 XENP20266)이 행하는 것 보다 IL-2 분비를 더 증가시킨다는 것을 나타낸다.

ICOS와 같은 공자극 수용체는 이전에 2가 항체 또는 다량체화된 리간드에 의한 가교결합 후에만 사이토카인 생성을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Viera 등의 2004; Sanmamed 등의 2015). 가교 결합 메카니즘을 고려하여, 공자극 x 체크포인트 차단 이중특이적 항체에서 단일 팔에 의한 1가 ICOS 결합이 사이토카인 생산을 증가시킬 수 있었다는 것은 놀라운 일이다. 또한, 이중특이적 항체가 2가 항-ICOS mAb의 조합(XENP16432 + XENP16435)으로 2가 항-PD-1 mAb보다 사이토카인 분비를 더욱 증진시킬 수 있었다는 점은 주목할 만 하다.

b. 도 5A (b): PD-1 및 ICOS 이중-양성 세포는 프로토타입 항-ICOS x 항-PD-1 병따개에 의해 선택적으로, 점유된다.

면역 체크포인트 수용체 또는 공자극 수용체만을 발현시키는 비-종양 반응성 T 세포에 비해 실시예 1에 도시되는 바와 같은 면역 체크포인트 수용체(예를 들어, PD-1) 및 공자극 수용체를 동시에 발현시키는 종양-반응성 TIL의 선택적 표적화는 (도 29에 나타낸 바와 같이) 말초 독성을 회피하면서 항-종양 활성을 증가시킬 수 있었다.

SEB-자극 PBMC 분석이 T 세포에 대한 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 결합을 조사하기 위해 사용되었다. PBMC는 100 ng/mL SEB(staphylococcal enterotoxin B)로 3일 동안 자극되었으며, 그 이후 PBMC는 4 ℃에서 30분 동안 지시된 시험 물품으로 처리되었다. 그 다음, PBMC는 APC-표지된 외팔형 항-CDOS 항체 및 FITC-표지된 외팔형 항-PD-1 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양되었다. 도 30 및 도 31은 항-ICOS x 항-PD-1 병따개(XENP20896), 외팔형 항-ICOS 항체(XENP20266) 및 외팔형 항-PD-1 항체(XENP20111)의 수용체 점유율을 도시한다.

데이터는 이중-양성 세포(PD-1 및 ICOS 둘 다를 발현시킴)가 도 30에 나타낸 바와 같이 항-ICOS x 항-PD-1 병따개(XENP20896)에 의해 선택적으로, 점유된다는 것을 도시하며, 1가 ICOS 및 PD-1 결합이 선택적 표적화에 대해 유용하다는 것을 나타낸다. 또한, 항-ICOS x 항-PD-1 병따개(예를 들어, XENP20896)는 도 31a에 나타낸 바와 같은 1가, 단일 특이적 외팔형 항-PD-1 및 항-ICOS보다 이중-양성 세포에 더 강력하게 결합한다.

c. 도 5A(c): GVHD 마우스 연구에서 생착을 향상시키는 프로토타입 항-ICOS x 항-PD-1 병따개

프로토타입 항-ICOS x 항-PD-1 병따개가 NSG(NOD-SCID-gamma) 면역 결핍 마우스에서 수행되는 이식편대숙주병(Graft-versus-Host Disease, GVHD) 모델에서 평가되었다. 마우스는 인간 PBMC로 이식되었다. NSG 마우스가 인간 PBMC로 주입되는 경우, 이들은 인간 PBMC에 대한 자가 면역 반응을 일으킨다. 면역 체크포인트 항체(예를 들어, 항-PD-1)를 갖는 인간 PBMC으로 주입되는 NSG 마우스의 처치는 생착을 증대시킨다. 따라서, 증가된 생착이 항체의 효능을 나타낸다.

천만개의 인간 PBMC가 0일 상에서 IV-OSP를 통해 IVG 마우스로 생착된 다음에, 1일, 8일, 15일 및 22일에서 지시된 시험 물품에 의한 투여가 이어진다. 인간 CD45+ 세포 수가 질병의 지표로서 14일에서 측정되었다.

도 41a-41b에 나타낸 데이터는 항-ICOS x 항-PD-1 병따개가 대조군(PBS 및 PBS + PBMC)과 비교하여 인간 PBMC 생착 NSG 마우스에서 CD45+ 세포의 증식을 증대시킨다는 것을 도시한다. 또한, 증대가 2가 항-PD-1 항체로 관측된 것보다 본 발명의 항체를 사용하는 것이 더 크다.

2. 5B: 최적화된 항-ICOS Fab 팔을 갖는 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 제조

실시예 4A에서 설명되는 바와 같이 조작되는 항-ICOS Fab를 포함하는 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개가 일반적으로 상기 설명되는 바와 같이 제조되었다. 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개에 대한 아미노산 서열이 도 32에 열거된다. FcRn pH 6.0 친화력 증대 치환을 갖는 변이체 항-ICOS x 항-PD-1에 대한 아미노산 서열이 도 33에 열거된다.

결과적인 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체는 일반적으로 상기 설명된 바와 같이 OCTET®을 사용하여 인간 및 시노몰구스 ICOS에 대한 친화도를 특징으로 한다. 제1 세트의 실험에서, AMC 바이오 센서는 ICOS의 마우스 IgG2a Fc 융합체를 캡쳐하기 위해 사용되었고 다수의 농도의 시험 물품으로 침지되었다(도 34a-34c에 나타낸 데이터). 추가 실험에서, 스트렙타비딘(SA 또는 SAX) 바이오 센서가 인간 및 시노몰구스 ICOS의 바이오틸레이티드 인간 및 시노몰구스 IgG1 Fc 융합체를 캡처하기 위해 사용되었고 다수의 농도의 시험 물품으로 침지되었다(도 35에 나타낸 데이터).

3. 도 5C: 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 T 세포면 결합

T 세포에 대한 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 결합이 SEB 자극 PBMC 분석에서 측정되었다. 인간 PBMC는 100 ng/mL SEB로 3일 동안 자극되었다. 그 다음, PBMC는 지시된 시험 물품으로 처리되었고 4℃에서 30분 동안 배양되었다. 처리 후, 세포는 FITC-표지된 항-CD3 항체 및 APC-표지된 항-인간 IgG Fc 이차 항체로 배양되었다. CD3+ 세포에 대한 MFI가 도 36a 내지 도 36b에 나타낸다.

4. 5D: T 세포에 대한 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 수용체 점유율

T 세포에 대한 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 수용체 점유율은 SEB-자극 PBMC 분석에서 측정되었다. PBMC는 100 ng/mL SEB(staphylococcal enterotoxin B)로 3 일 동안 자극되었고, 그 이후 PBMC는 4℃에서 30분 동안 지시된 시험 물품으로 처리되었다. 그 다음, PBMC는 APC-표지된 외팔형 항-CDOS 항체 및 FITC- 표지된 외팔형 항-PD-1 항체와 함께 4℃에서 30분 동안 배양되었다. 도 37은 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체, 대응하는 외팔형 항-ICOS 항체 및 PD-1 및 ICOS 이중-양성 T 세포에 대한 외팔형 항-PD-1항체(XENP20111)의 수용체 점유율을 도시한다. 실시예 1A에서 조사된 프로타입 항체와 일치하여, 병따개 각각은 1가의, 단일 특이적 외팔형 항-PD-1 및 외팔형 항-ICOS보다 이중-양성 세포에 더 강력하게 결합한다.

5. 5E: 사이토카인 방출 분석에서 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 시험관내 활성

인간 PBMC는 100 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 세포는 세척되었고 지시된 시험 물품 20 μg/mL와 함께 100 ng/mL SEB로 다시 자극되었다. 처리 24 시간 후, 세포는 IL-2(도 38a) 및 IFNγ(도 38B)에 대해 분석되었다. 데이터는 항-ICOS x 항-PD-1 병따개가 2가 항-PD-1 항체 (XENP16432) 단독, 2가 항-ICOS 항체(XENP16435) 단독 또는 2가 항-PD-1 항체 + 2가 항-ICOS 항체 조합보다 상당히 더 많은 사이토카인 방출을 자극하였다는 것을 나타낸다.

추가 실험에서, 인간 PBMC는 100 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 세포는 세척되었고 지시된 시험 물품 20 μg/mL와 함께 100 ng/mL SEB로 다시 자극되었다. 처리 24시간 후, 세포는 IL-2 (도 39A) 및 IFNγ(도 39b)에 대해 분석되었다.

6. 5F: GVHD 마우스 연구에서 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 생체 내 활성

제1 연구에서, 천만개의 인간 PBMC가 0일에 IV-OSP를 통해 NSG 마우스로 생착된 다음에 1일에 지시된 시험 물품에 의한 투여가 이어진다. IFNγ 수준 및 인간 CD45+, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 수는 7일, 11일 및 14일에 측정되었다. 도 40a 내지 도 40b는 각각 7일 및 11일에 대한 IFNγ 수준을 도시한다. 도 41a 내지 도 41b는 각각 11일 및 14일에 대한 CD45+ 세포 수를 나타낸다. 도 42a 내지 도 42b는 각각 14일에 대한 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 수를 나타낸다. 도 43은 T 세포 팽창 및 IIFNγ 생산으로 인한 GVHD의 악화에서 기인하는 14일까지의 마우스의 체중 변화를 도시한다.

추가적인 변이체 항-ICOS x 항-PD-1 병따개를 사용한 추가 연구에서, 천만개의 인간 PBMC는 0 일째에 IV-OSP를 통해 IVG 마우스로 생착된 다음에 1 일째에 지시된 농도에서 지시된 시험 물품에 의한 투여가 이어진다. IFNγ 수준 및 인간 CD45+, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포 수는 7 일째 및 14 일째에 측정되었다. 도 44a 내지 도 44b는 각각 IFNγ 7 일째 및 14 일째의 IFNγ 수준을 도시한다. 도 45는 14 일째의 CD45+ 세포 수를 도시한다. 도 46a 내지 도 46c는 각각 14 일째의 CD8+ T 세포 수, CD4+ T 세포 수 및 CD8+/CD4+ 비율을 도시한다. 마우스의 체중은 또한 12 일째 및 15 일째에 측정되었고 초기 체중의 퍼센트로서 각각 도 47a 내지 도 47b에 도시되었다.

도면은 항-ICOS x 항-PD-1 병따개가 (CD45+ 세포, CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 증식 및 마우스의 체중 감소에 의해 지시되는 바와 같이) 생착을 증대시킨다는 것을 도시한다. 관찰된 활성은 각각의 변이체의 시험관내 역가(potency)와 상관된다. 또한, XENP20896, XENP22744, XENP23092, XENP22730, XENP23104, XENP22974 및 XENP23411을 포함한 다수의 병따개가 대조군의 2가 항-PD-1 항체(XENP16432)가 수행하는 것보다 훨씬 더 생착을 증대시킨다.

7. 5G: 추가적인 ICOS ABD가 항-ICOS x 항-PD-1 병따개에서 작동한다.

추가적인 항-ICOS x 항-PD-1 병따개가 일반적으로 상기 설명되는 바와 같은 실시예 3에서 설명되는 다른 항-ICOS ABD에 기초한 항-ICOS Fab를 포함하도록 제조되었다. 추가적인 병따개에 대한 서열이 도 48a-48d에 나타낸다.

제1 실험에서, PBMC는 100 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 세포는 2회 세척되었고 지시된 시험 물품(대조군으로서 PBS)의 20 μg/mL와 함께 100 ng/mL SEB로 재자극되었다. 처리 24 시간 후, 상등액이 도 49에 나타낸 바와 같이 IL-2 농도에 대해 분석되었다. 제2 실험에서, PBMC는 10 ng/mL SEB로 자극되었고 3일 동안 지시된 시험 물품(대조군으로서 2가 항-PD-1 XENP16432)의 20 μg/mL로 처리되었다. 상등액이 수집되어 IL-2에 대한 분석되었다. 도 50은 2가 항-RSV mAb에 대한 IL-2의 배 유도(fold induction)를 도시한다.

실시예 5A(a)의 데이터와 일치하여, XENP20896은 IL-2의 분비를 자극하였다. 특히, 대안적인 항-ICOS ABD를 포함하는 추가적인 병따개가 또한 항-ICOS x 항-PD-1 병따개에 의한 사이토카인 분비의 증대가 실시예 4에서 설명되는 모체 항-ICOS ABD로부터 유도되는 ABD에 대해 유일한 것이 아니라는 것을 증명하는 IL-2의 분비를 자극할 수 있었다.

8. 5H: 명확한 ICOS 시그니처가 항-ICOS x 항-PD-1 병따개에 의해 출현된다.

a. 5H(a): 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체가 AKT 인산화를 유도한다

ICOS 결찰은 활성화된 T 세포(Fos, C 등의 2008)에서 AKT 인산화를 유도하고, 따라서, AKT 인산화는 본 발명의 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 ICOS 작용의 지표일 것이다.

인간 PBMC는 100 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 자극 후에, CD3+ 세포는 EasySep^TM Human T Cell Enrichment Kit(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)를 사용하여 분리되었고 그 다음 플레이트 결합된 항-CD3 항체(OKT3; 500 ng/mL)와 함께 지시된 시험 물품으로 처리되었다. 세포는 처리후 30분에 용해되었고 MULTI-SPOT 384-Well Spot plates (Meso Scale Discovery, Rockville, MD) 상에서의 다중 인단백질 분석에 의해 총 AKT 및 인산화 AKT(Ser473)에 대해 분석되었다. 그 데이터가 처리 후 인산화된 AKT의 퍼센트로서 도 51에 나타낸다.

데이터는 음성 대조군 2가 항-PD-1 mAb (XENP16432)에 의한 처리 이후 AKT 인산화가 증가하지 않은 것을 도시한다. 2가 항-ICOS mAb 단독 (XENP16435) 및 XENP16432와 결합한 XENP16435 둘 다는 ICSI 결찰 및 XENP16435에 의한 작용(agonism)을 증명하는 AKT 인산화를 증가시킨다. 놀랍게도, 단지 ICOS의 1가 체결에도 불구하고, 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체에 의한 처리가 XENP16435 단독 및 XENP16432와 결합한 XENP16435에 의한 처리보다 더 많은 AKT 인산화를 유도한다. 양성 AKT 인산화 데이터는 ICOS의 1가 체결에도 불구하고 이중특이적 항체와의 ICOS 활성의 명확한 시그니처를 증명한다.

b. 5H(b): 항-ICOS x 항-PD-1 병따개에 의해 상향 조절된 활성화된 T 헬퍼 세포-연관 유전자

Guedan 등 (2014)은 ICOS 신호 도메인-기반 CAR-T의 활성화 후 활성화된 T 헬퍼 세포(즉, Th1, Th2 및 Th17) 및 조절 T 세포(Tregs)에 대한 유전자 발현 프로파일을 설명한다. 이들은 IL-17A, IL22, IFNγ, TNF, IL-13과 같은 활성화된 T 헬퍼 세포와 관련되는 유전자는 상향 조절된 반면, TGFβ1, SMAD3 및 FOXP3와 같은 Treg-관련 유전자는 변하지 않거나 하향 조절된다는 것을 발견하였다.

본 발명의 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체와 T 세포의 체결이 유사한 시그니쳐를 초래하는지를 조사하기 위해, 우리는 나노스트링(Nanostring) 기술을 사용하였다. PBMC는 100 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 세포는 2회 세척되었고 100 ng/mL SEB로 재자극되었고 24 시간 동안 지시된 시험 물품으로 처리되었다. RNA는 세포로부터 추출되었고 면역 반응을 망라하는 770개의 표적 유전자를 분석하는 nCounter® PanCancer Immune Profiling Panel (NanoString Technologies, Seattle, Washington)에 의해 분석되었다. 도 52는 2가 항-RSV 항체에 대한 다수의 Th-관련 및 Treg-관련 유전자의 발현에서의 평균 배 유도를 도시한다. 도 53a 내지 도 53f는 각각 2가 항-RSV mAb에 의한 유도에 대해 지시된 시험 물품에 의한 IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-10, IL-9 및 IFNγ 유전자 발현의 배 유도를 도시한다.

도 52 내지 도 53에 도시되고 Gueden 등의 관찰과 일치하는 바와 같이, IL-17A, IL-17F, IL-22, IL-9 및 IFNγ와 같은 ICOS와 연관되는 Th-관련 유전자가 2가 항-ICOS mAb와의 처리 및 항-ICOS 및 항-PD-1 mAb의 조합 후 상향 조절된다. 특히, ICOS 신호 전달과 연관되는 Th-관련 유전자의 발현이 항-ICOS x 항 PD-1 항체에 의한 처리 다음에 추가로 상향 조절되며, 다시 말해 명확한 ICOS 공자극 시그니처 및 이중특이적 항체에 의한 항-ICOS 및 항-PD-1 체결의 극적인 시너지를 나타낸다.

9. 5I: 대안적인 형태의 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체

대안적인 형태의 공자극/체크포인트 이중특이적 항체가 항-ICOS x 항-PD-1 병따개의 효과가 병따개 형태에 고유한지 또는 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체에 광범위하게 적용 가능한지 여부를 조사하기 위해 제조되었다.

a. 5I(a):항-PD-1 x 항-ICOS 병따개

항-PD-1 Fab를 갖는 항-PD-1 x 항-ICOS 병따개가 실시예 2A에서 설명되는 바와 같은 항-PD-1 mAbs(예를 들어, XENP16432 및 XENP29120) 및 실시예 4B에서 설명되는 바와 같은 항-ICOS scFv를 인코딩하는 DNA를 사용하여 생성되었다. 병따개는 실시예 5A에서 일반적으로 설명되는 바와 같이 제조되었다. 예시적인 항-PD-1 x 항-ICOS 병따개의 서열은 도 56에 나타낸다.

b. 5I(b): 중심-scFv

중심-scFv 형태에 대한 개략도가 도 55a 내지 도 55b로서 같이 나타낸다. 항-ICOS Fab-Fc 중쇄를 인코딩하는 DNA는 표준 서브클로닝에 의해 실시예 4A에 설명되는 항-ICOS Fab를 발현 벡터 pTT5로 인코딩하는 DNA를 사용하여 생성되었다. 항-ICOS-항-PD-1 Fab-scFv-Fc 중쇄를 인코딩하는 DNA는 유전자 합성 및 표준 서브클로닝에 의해 실시예 4A에 설명되는 항-ICOS Fab 및 실시예 2A에 설명되는 항-PD-1 scFv를 발현 벡터 pTT5로 인코딩하는 DNA를 사용하여 생성되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 예시적인 항-ICOS x 항-PD-1 중심-scFv 항체에 대한 서열이 도 57a-57c에 나타낸다.

c. 5I(c): 중심-scFv2

중심-scFv2 형태에 대한 개략도가 도 55c로서 나타낸다. 항-ICOS-항-PD-1 Fab-scFv-Fc 중쇄를 인코딩하는 DNA는 유전자 합성 및 표준 서브클로닝에 의해 실시예 4A에 설명되는 항-ICOS Fab 및 실시예 2A에 설명되는 항-PD-1 scFv를 발현 벡터 pTT5로 인코딩하는 DNA를 사용하여 생성되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 예시적인 항-ICOS x 항-PD-1 중심-scFv 항체에 대한 서열이 도 58에 나타낸다.

d. 5I(d):이중특이적 mAb

이중특이적 mAb 항체에 대한 개략도가 도 2k로서 나타낸다. 항-ICOS 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA는 실시예에 설명되는 항-ICOS Fab를 인코딩하는 DNA에 기초하여 생성되었고, 항-PD-1 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 DNA는 실시예 2A에 설명되는 항-PD-1 mAb를 인코딩하는 DNA에 기초하여 생성되었다. 중쇄 VH 유전자는 인간 IgG1 불변 영역을 E233P/L234V/L235A/G236del/S267K 치환으로 인코딩하는 pTT5로 GIBSON ASSEMBLY®을 통해 삽입되었다. 경쇄 VL 유전자는 인간 Cκ 불변 영역을 인코딩하는 pTT5로 삽입되었다.

DNA는 단백질 A 친화력(GE Healthcare)에 의해 별도로 발현되고 정제된 2개의 개별 항체로서 발현시키기 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 이들 항체는 CH3:CH3 계면에 이종이량체화-스큐(skewing) 치환을 포함한다. 2-Mercaptoethylamine-HCl(2-MEA)은 2개의 모체 IgG에서 쇄간 이황화 결합의 제어된 감소를 유도하기 위해 사용되었다. 그 다음, 2-MEA는 쇄간 이황화 결합의 재산화가 (이종이량체화 돌연변이에 의해 유도되는) HC-LC 쌍의 재조합을 가능하게 하도록 발생시키기 위해 제거되었다. 최종적으로, 삼중 특이적 항체는 양이온 교환크로마토그래피에 의해 정제되었다. 이러한 방법은 당해 분야에서 통상적이다(예를 들어, Labrijn(2013) PNAS 110 (13):5145-50 또는 Strop 등의 (2012) J Mol Biol 420 (3):204-19 참조). 당해 분야에 공지된 다른 디자인 및 정제의 방법이 이중특이적 mAb 제조, 예를 들어, 공통 경쇄 항체(Merchant (1998) Nat Biotechnol 16 (7):677-81) 또는 이종이량체 Fab 도메인(Lewis 등의 (2014) Nat Biotechnol 32 (2):191-8])을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 항-PD-1 x 항-ICOS 이중특이적 mAb에 대한 서열이 도 59에 나타낸다.

e. 5I(e): DVD-IgG

DVD-IgG 형태에 대한 개략도가 도 55a-55d로서 같이 나타낸다. 항-PD-1-항-ICOS VH-VH-CH1-Fc 중쇄 및 VL-VL-Cκ 경쇄를 인코딩하는 DNA가 유전자 합성 및 표준 서브클로닝의 조합에 의해 실시예 4A에 설명되는 바와 같은 항-ICOS Fab 및 실시예 2A에 설명되는 바와 같은 항-PD-1 scFv를 발편 벡터 pTT5로 인코딩하는 DNA를 사용하여 생성되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 예시적인 항-ICOS x 항-PD-1 DVD-IgG에 대한 서열이 도 60에 나타낸다.

f. 5I(f):트라이던트

트라이던트 형태에 대한 개략도가 도 55a-55d로서 나타낸다. 항-PD-1 VL-VH-Fc 중쇄 및 VL-VH 경쇄를 인코딩하는 DNA는 유전자 합성 및 표준 서브클로닝의 조합에 의해 실시예 4A에 설명되는 항-ICOS Fab 및 실시예 2A에 설명되는 항-PD-1 scFv를 발현 벡터 pTT5로 인코딩하는 DNA를 사용하여 생성되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었다. 예시적인 항-ICOS x 항-PD-1 트라이언트에 대한 서열이 도 61a-61b에 나타낸다.

g. 5I(g): 대안적인 형태의 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체는 사이토카인 분비를 증대시킨다.

인간 PBMC는 200 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 세포는 2회 세척되었고 그 다음, 100 ng/mL SEB로 재자극되었고 지시된 시험 물품의 지시된 농도로 처리되었다. 처리 24 시간 후, 상등액이 IL-2에 대해 분석되었다. 그 데이터가 도 62에 도시되고 대안적인 형태의 이중특이적 항체 각각이 2가 항-RSV(XENP15074) 대조군과 비교하여 IL-2 분비를 증대시키는 것을 보여준다. 특히, 이들 대안적인 형태의 항체 중 다수는 2가 항-PD-1 항체와 비교하여 IL-2 분비를 증대시킨다.

F. 실시예 6: 상이한 면역 체크포인트 항원을 표적화하는 공자극/체크포인트 이중특이적 항체

1. 6A: 항-MTLA-4 x 항-ICOS

항-CTLA-4 x 항-ICOS 뱅따개가 XENP16435로부터 유도되는 항-ICOS Fab 및 실시예 2B에서 설명되는 ABD로부터 유도되는 항-CTLA-4 scFv로 생성되었다. 예시적인 항-ICOS x 항-MTLA-4 병따개에 대한 서열이 도 63에 나타낸다. 이중특이적 mAb는 실시예 5I(c)에서 일반적으로 설명되는 바와 같이 제조되었다.

2. 6B: 항-LAG-3 x 항-ICOS

항-LAG-3 x 항-ICOS 이중특이적 항체가 실시예 2C에 설명되는 ABD로부터 유도되는 항-LAG-3 Fab 및 XENP16435로부터 유래되는 항-ICOS Fab로 생성되었다. 예시적인 항-LAG-3 x 항-ICOS 이중특이적 항체에 대한 서열이 도 64a-64b에 나타낸다. 이중특이적 mAb는 실시예 5I(c)에 일반적으로 설명되는 바와 같이 제조되었다.

3. 6C: 항-TIM-3 x 항-ICOS

항-TIM-3 x 항-ICOS 이중특이적 항체가 실시예 2D에 설명되는 바와 같은 ABD로부터 유도되는 항-TIM-3 Fab 및 XENP16435로부터 유도되는 항-ICOS Fab로 생성되었다. 예시적인 항-TIM-3 x 항-ICOS 이중특이적 항체에 대한 서열은 도 65에 나타낸다. 이중특이적 mAb는 구현예 5I(c)에 일반적으로 서술되는 바와 같이 제조되었다.

4. 6D: 항-PD-L1 x 항-ICOS

항-PD-L1 x 항-ICOS 병따개가 실시예 2E에서 설명되는 ABD로부터 유도되는 항-PD-L1 Fab 및 실시예 4B로부터 유도되는 항-ICOS scFv로 생성되었다. 예시적인 항-PD-L1 x 항-ICOS 이중특이적 항체에 대한 서열이 도 66a-66c에 나타낸다. 병따개는 실시예 5A에서 일반적으로 설명되는 바와 같이 제조되었다.

5. 6E: 추가적인 공자극 x 체크포인트 차단 이중특이적 항체는 사이토카인 분비를 증대시키도록 기능한다.

인간 PBMC는 200 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 세포는 2회 세척되었고 그 다음, 100 ng/mL SEB로 재자극되었고 (상기 설명된 바와 같은) 지시된 시험 물품의 지시된 농도로 처리되었다. 처리 24 시간 후, 상등액이 IL-2에 대하여 분석되었다. 그 데이터가 도 67에 도시되고 추가적인 공자극 x 체크포인트 차단 이중특이적 항체 각각이 2가 항-RSV(XENP15074) 대조군과 비교하여 IL-2 분비를 증대시키는 것을 보여준다. 특히, 다수의 이들 대안적인 체크포인트 차단 항체(모두는 아니지만, 예를 들어, TIM-3 차단)는 2가 항 PD-1 항체(XENP16432)와 비교하여 IL-2 분비를 증대시킨다.

G. 실시예 7: ICOS의 1가 결찰은 2가 가교보다 우수하다.

실시예 5A(a)에서, 놀랍게도, 항-ICOS x 항-PD-1 항체가 사이토카인 생산의 자극에 필요한 것으로 생각된 ICOS와 같은 공자극 수용체의 가교와는 반대되는 ICOS의 1가 결합에도 불구하고 사이토카인 분비를 증대시키도록 작용했음을 발견하였다. 실시예 5H(a)에서, 놀랍게도, 항-ICOS x 항-PD-1 항체가 2가 항-ICOS 항체에 비해 AKT 인산화(ICOS 작용의 시그니처)를 증대시켰음을 발견하였다.이 섹션에서, 우리는 ICOS의 1가 결합이 ICOS의 2가 결합보다 우수한 것으로 나타나는 이러한 추세를 더 조사한다.

1. 7A: 외팔형 항-ICOS Fab-Fc 항체의 제조

예시적인 외팔형 항-ICOS Fab-Fc 항체에 대한 아미노산 서열은 도 68a-68g에 열거된다. 항체 발현에 필요한 3개의 사슬을 인코딩하는 DNA는 유전자 합성에 의해 생성되었고 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 발현 벡터 pTT5로 서브클론되었다. DNA는 발현을 위해 HEK293E 세포로 형질 감염되었고 결과적인 단백질이 표준 기술을 사용하여 정제되었다.

결과적인 외팔형 항-ICOS Fab-Fc 항체는 OCTET®을 사용한 인간 ICOS에 대한 친화도를 특징으로 한다. 항-마우스 Fc(AMC) 바이오 센서는 ICOS의 마우스 IgG2a Fc 융합체를 캡처하기 위해 사용되었고 다수의 농도의 시험 물품으로 침지되었다. 결과적인 평형 해리 상수(KD), 결합 속도(ka) 및 해리 속도(kd)가 도 69에 나타낸다. 결합 친화도 및 운동 속도 상수는 (ForteBio OCTET® 데이터 분석 소프트웨어(ForteBio))를 사용하는 1:1 결합 모델을 사용하여, 처리된 데이터를 분석함으로서 획득된다.

2. 7B: 1가 외팔형 항-ICOS Fab-Fc 항체는 2가 항-ICOS 항체보다 PBMC에서 AKT 활성화를 더 크게 촉진시킨다.

PBMC는 100 ng/mL SEB로 2일 동안 자극되었다. 자극 후, CD3+ T 세포는 EasySep^TM Human T Cell Enrichment Kit(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)를 사용하여 음성 선택에 의해 분리되었고 그 다음 플레이트 결합된 항-CD3 항체(OKT3; 500 ng/mL)와 함께 지시된 시험 물품으로 처리되었다. 세포는 처리 후 30분에 용해되었고, MULTI-SPOT 384-Well Spot plates(Meso Scale Discovery, Rockville, MD) 상에서 다중 인단백질 분석에 의해 총 AKT 및 인산화된 AKT(Ser473)에 대해 분석되었다. 그 데이터가 처리 후 인산화된 AKT의 퍼센트로서 도 70에 나타낸다.

실시예 X와 일치하게, 항-ICOS x 항-PD-1 이중특이적 항체는 2가 항체-ICOS 항체보다 AKT 활성화를 상당히 더 크게 촉진시켰다. 놀랍게도, 1가 외팔형 항-ICOS Fab-Fc 항체는 또한 이중특이적 항체에 비교할 수 있는 수준으로 2가 항-ICOS 항체보다 AKT 활성화를 상당히 더 크게 증대시켰다.

3. 7C: ICOS의 1가 작용제(agonism)는 다수의 항-ICOS ABD와 작용한다.

CD3+ T 세포는 EasySep^TM Human T Cell Enrichment Kit(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)를 사용하여 음성 선택에 의해 분리되었고 그 다음 플레이트 결합된 항-CD3 항체(OKT3; 500 ng/mL)와 함께 지시된 시험 물품으로 처리되었다. 세포는 처리 후 30분에 용해되었고, MULTI-SPOT 384-Well Spot plates(Meso Scale Discovery, Rockville, MD) 상에서 다중 인단백질 분석에 의해 총 AKT 및 인산화된 AKT(Ser473)에 대해 분석되었다. 그 데이터가 도 74에 도시되었고 다양한 항-ICOS ABD를 포함하는 1가 항-ICOS Fab-Fc 항체가 AKT 인산화를 유도할 수 있었다는 것을 나타낸다.

Claims (26)

1. a) 서열번호 26367로 이루어진 제1 단량체;
   b) 서열번호 26362로 이루어진 제2 단량체; 및
   c) 서열번호 26377로 이루어진 경쇄
   를 포함하는,
   이종이량체 항체.
2. 제1항에 따른 이종이량체 항체를 제조하기 위한 핵산 조성물로서,
   a) 제1항에 따르는 제1 단량체를 인코딩하는 제1 핵산;
   b) 제1항에 따르는 제2 단량체를 인코딩하는 제2 핵산; 및
   c) 제1항에 따르는 경쇄를 인코딩하는 제3 핵산을 각각 포함하는, 핵산 조성물.
3. a) 제2항의 제1 핵산을 포함하는 제1 발현 벡터;
   b) 제2항의 제2 핵산을 포함하는 제2 발현 벡터; 및
   c) 제2항의 제3 핵산을 포함하는 제3 발현 벡터를 포함하는,
   제1항에 따른 이종이량체 항체를 제조하기 위한 발현 벡터 조성물.
4. 제3항의 발현 벡터 조성물을 포함하는, 단리된 숙주 세포.
5. 이종이량체 항체가 발현되는 조건 하에 제4항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 및 상기 항체를 회수하는 단계를 포함하는,
   이종이량체 항체를 제조하는 방법.
6. 제1항에 따른 이종이량체 항체를 포함하는 암 치료용 조성물로서,
   상기 조성물은 환자에서 세포독성 T 세포(CTL)를 활성화는 것인, 조성물.
7. 제1항에 따른 이종이량체 항체를 포함하는 암 치료용 조성물로서,
   상기 조성물은 환자에서 IFNγ 수준을 증가시키는 것인, 조성물.
8. 제1항에 따른 이종이량체 항체를 포함하는 암 치료용 조성물로서,
   상기 조성물은 환자에서 IL-2 수준을 증가시키는 것인, 조성물.
9. 삭제
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제